CN104634907A - 一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明生物检测技术领域，具体涉及氨基酸分子组合作为胃癌标志物的用途。本发明公开了一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物在制备胃癌检测试剂盒中的用途，所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的组合。本发明所述氨基酸组合作为胃癌标志物，具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明所采用检测样品为尿液，避免采用组织、血液样品时带给患者肉体痛苦。因此，无论是从患者的依从性还是从检测结果的正确率看，本发明所述氨基酸组合作为胃癌标志物，特别是早期胃癌标志物具有很好的临床应用价值。

Description

一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物的用途

技术领域

本发明生物检测技术领域，具体涉及一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物的用途。

背景技术

胃癌作为全球最常见的第二大恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，占消化道恶性肿瘤死亡原因的第一位。我国胃癌的发病率约为20/10万，每年新发胃癌患者40万人，死亡人数30万人，且青年人患胃癌的比例在增加，15%患者为40岁以下年轻人。大多数胃癌患者多伴有非特异性上消化道不适症状，故对有症状的人群进行大规模筛查才能提高胃癌的检出率，提高筛查效率。然而有研究提示即使在日本其早期胃癌发现率在40%，仅少部分为利用纤维胃镜和放射学检查的大规模筛选时发现，目前绝大多数医院主要依赖于X线，B型超声、内窥镜检查以及活组织病理学检查等对肿瘤进行诊断。以上检查有些对患者创伤较大，对仪器设备要求高，难以用于大规模肿瘤检查或健康体检。

而适用于大规模肿瘤检测的胃癌最常用的血清肿瘤标记物主要有CA199、CA724和癌胚抗原CEA等，可检测到大约15～50％的任何阶段的胃癌，对于早期胃癌的检测率则降至大约2～11％。这些标志物存在灵敏度和特异度难以统一等问题，难以成为理想的肿瘤标记物而用于临床检测或大规模人群筛查。这现状给肿瘤的早期分子检测、疗效及预后评价、复发及转移监测和生物治疗等方面造成一定的困难因此。因此需要新的适用于大规模筛选、非侵入性检测的胃癌检测标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于大规模筛选、非侵入性检测的胃癌检测标志物，以克服现有临床检测肿瘤标记物如CA125、CA199、CA724、AFP、CEA等标志物存在灵敏度和特异度难以统一等问题。

为达此目的，本发明公开了一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物在制备胃癌检测试剂盒中的用途，所述氨基酸分子组合为含丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的组合。

在一些实施方式里，所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

在一些实施方式里，所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

在一些实施方式里，所述胃癌检测试剂盒所适用的检测样品为受检者的尿液样本。

在一些实施方式里，所述受试者为肝肾功能正常的人，以减少因肝肾功能异常导致尿液目标分子含量波动，影响结果。

在一些实施方式里，所述尿液样品取自受试者清晨空腹中段尿液，以有利于检测。

在一些实施方式里，所述胃癌为早期胃癌。

在一些实施方式里，所述胃癌检测试剂盒适用于色谱法、质谱法、色谱－质谱联用法、毛细管电泳法，其中色谱法为气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)，色谱－质谱联用法为气相色谱－质谱联用法（GC/MS）、液相色谱－质谱联用法(LC/MS)、高效液相色谱－质谱联用法（HPLC/MS）、气相色谱－串联质谱联用法(GC/MS-MS)、液相色谱－串联质谱联用法（LC-MS/MS）、高效液相色谱－串联质谱联用法（HPLC/MS-MS）。

另一方面，本发明还公开了一类用于检测诊断胃癌的生物标志物，其特征在于所述生物标志物为一类氨基酸分子组合，为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的组合。

在一些实施方式里，所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

在一些实施方式里，所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

另一方面，本发明还公开了一种胃癌检测方法，其通过检测方法对受检者的尿液样本进行上述氨基酸分子组合的定量检测，当受试者所述生物标志物含量高于上述生物标志物的诊断实验临界值时，受试者即可被诊断为胃癌患者。

在一些实施方式里，当上述生物标记物质的诊断实验临界值分别为：丙氨酸17.548666ug/ml、甘氨酸29.763330ug/ml、缬氨酸3.564666ug/ml、丝氨酸30.145000ug/ml、异亮氨酸1.750666ug/ml、苏氨酸7.965666ug/ml、脯氨酸0.557333ug/ml、甲硫氨酸1.251000ug/ml、酪氨酸7.152999ug/ml、色氨酸9.665667ug/ml。

在一些实施方式里，所述受试者为肝肾功能正常的人，以减少因胃肠功能异常导致尿液目标分子含量波动，影响结果。

在一些实施方式里，所述尿液样品取自清晨空腹中段尿液，以有利于检测。

在一些实施方式里，所述检测方法可选用色谱法、质谱法、色谱－质谱联用法、毛细管电泳法，其中色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法，色谱－质谱联用法为气相色谱－质谱联用法（GC/MS）、液相色谱－质谱联用法(LC/MS)、高效液相色谱－质谱联用法（HPLC/MS）、气相色谱－串联质谱联用法(GC/MS-MS)、液相色谱－串联质谱联用法（LC-MS/MS）、高效液相色谱－串联质谱联用法（HPLC/MS-MS），优选气相色谱－质谱法。

在一些实施方式里，所述胃癌为早期胃癌。

本发明所述氨基酸组合作为胃癌标志物，具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明所采用检测样品为尿液，避免采用组织、血液样品时带给患者肉体痛苦。因此，无论是从患者的依从性还是从检测结果的正确率看，本发明所述氨基酸组合作为胃癌标志物具有很好的临床应用价值。

附图说明

图1.各生物标记物混合标准品分离色谱图。

图2.各生物标记物分子质谱图。

图3.两个样品色谱图面积对比。

图4.各生物标记物诊断胃癌ROC曲线。

图5.各生物标记物诊断早期胃癌ROC曲线。

图6.10种氨基酸联合检测ROC曲线图。

图7.8种氨基酸联合检测ROC曲线图。

实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1：仪器、试剂、样品准备及预处理。

试剂与仪器：L-2-氯苯丙氨酸、氯甲酸乙酯、吡啶、无水乙醇、氢氧化钠、氯仿、无水硫酸钠、丙氨酸（Alanine，Ala）、甘氨酸（Glycine，Gly）、缬氨酸（Valine，Val）、丝氨酸（Serine，Ser）、异亮氨酸（Isoleucine,Iso）、苏氨酸（Threonine,Thr）、脯氨酸（Proline,Pro）、甲硫氨酸（Methionine,Met）、酪氨酸（Tyrosine,Tyr）、色氨酸（Trytophan,Try）等试剂均为分析纯，由上海国药化学试剂公司生产。KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产）。LD5-2A型台式离心机（北京京立离心机有限公司）。气相色谱质谱仪TurboMass（美国Agilent公司7890A GC/5975C MS）自带NIST2011谱库和化学软件工作站。

受检者样品：随机采集尿样200份，其中89份为健康人，111份为因患胃癌要求手术治疗的入院患者（其中33份为早期胃癌）。所有受试者肝肾功能均正常，尿样均取自清晨空腹中段尿液。胃癌受试者均经电子胃镜检查或手术切除病理检查证实。

样品预处理：将样本由低温冰箱取出自然升至室温后，进行10000rpmX20min，离心。吸取上清样品300ul，加蒸馏水300ul、内标物（0.1mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）100ul、无水乙醇40ul、吡啶100ul，加盖子进行酯化羧基反应。加氯甲酸乙酯（ECF）50ul，加盖振荡10S，进行氨基反应。超声加速反应1min，加入氯仿300ul提取。振荡30S后3000rpm X5min,离心。加入100ul7mol/L的NaOH，调节pH＝9～10，再加入氯甲酸乙酯（ECF）50ul，加盖、振荡10S，超声加速反应1min，进行二次反应。振荡30S后，3000rpm×10min，离心。吸去上层水层，氯仿层加入少量无水硫酸钠用于脱水，可上机检测。

实施例2：仪器扫描方法设定。

扫描方式为全离子扫描结合选择离子（SIM离子）监测扫描。SIM离子设定为丙氨酸44m/z,甘氨酸102m/z,缬氨酸144m/z,丝氨酸132m/z,异亮氨酸158m/z,苏氨酸101m/z,脯氨酸142m/z,甲硫氨酸61m/z,酪氨酸107m/z,色氨酸130m/z,2-氯苯丙氨酸102m/z.样品首先在气相色谱毛细管柱（Agilent J&WDB-5MS,30m×0.25mm×0.25μm）上分离。并采用程序升温气相色谱技术，起始温度为80℃，以10℃/min速率升至140℃，再以4℃/min速率升至280℃，并保持2min。分离过程中逐渐增加柱温，使所有组分都能在各自的最佳温度下洗脱。质谱仪电子轰击能量为70eV，离子源温度为200℃，进样口温度为260℃，载体气为氦气，柱流速为1ml/min。所有数据在质荷比30－550m/z下收集。每次进样扫描停留时间为100ms，溶剂延迟时间为3.5min。检测到的样品中物质使用标准物质质谱图定性。样品中物质的浓度使用外标法定量。

实施例3：标准品质谱图及标准曲线的建立。

配制10种生物标记物标准品混合溶液，依次稀释成10个浓度梯度，按照实施例1方法预处理，实施例2方法进样，结果如表1。各生物标记物标准曲线线性良好，以此作为定量基础。各生物标记物保留时间见图1(序号分别为1：丙氨酸；2：甘氨酸；3：缬氨酸；4：丝氨酸；5：异亮氨酸；6：苏氨酸；7：脯氨酸；8：甲硫氨酸；9：酪氨酸；10：色氨酸;内标：2-氯苯丙氨酸)，相应质谱图见2，以此作为定性基础。

表1各目标分子保留时间（RT）、标准曲线线性范围（Linear range）及线性拟合度（r²）

实施例4：受检者尿液检测

将200份尿液样品按照实施例1的方法进行处理，依实施例2方法进样，得到各个样品的色谱图。通过锋面积的对比可以初步判定健康对照和胃癌组生物标记物的含量差异,在保留时间8min－13min处的放大，上方曲线为健康对照，下方曲线为其中一胃癌患者，在8.6min处锋面积差异显著，该锋经过质谱图鉴定为甘氨酸。提示该生物标记物在鉴别胃癌和健康人方面意义显著。（图3）。随后依据实施例3得到的质谱图进行定性，标准曲线进行定量，数据处理平台为仪器自带化学软件工作站。综合各样品目标化合物含量后，用spss19进行统计分析，其结果样品中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸10种小分子在胃癌组与健康对照组中存在显著性差异，其平均值与标准差见表2，而且在早期胃癌组和健康对照组中，这些小分子化合物含量亦差异显著（表3）。这表明尿液中10种氨基酸分子生物标记物含量不仅可以作为胃癌的生物标记，还能在胃癌早期预警中扮演重要角色。

表2.胃癌组和健康对照组尿液中生物标记物检测值统计(ug/ml)

表3.早期胃癌与健康对照组尿液生物标记物检测值统计(ug/ml)

利用ROC曲线分析以及曲线下面积（AUC）算法分别求出样品中10种生物标记物单个变量在鉴别胃癌与非癌，特别是早期胃癌（33例）与健康受试者的ROC曲线见图4、5，相应的ROC曲线下面积见表4。同时依据各自的Youden指数确定最佳界值，大于该值者为阳性，并得到相应的灵敏度，特异度。结果如表5。

表4各生物标记物分子ROC曲线下面积

表5.

上述结果表明本发明所述方法，通过检测尿液的10种关键小分子，不但具有鉴别胃癌与非癌的功效，还能区分开早期胃癌与健康受试者，具有很好的灵敏度和特异性。

实施例5.胃癌生物标记物组合

联合指标

利用SPSS19对10个指标建立Logistic回归模型，其Logistic回归预测方程为p=1/[1+e^{-(0.069ala-0.005gly-0.211val+0.425iso+0.062ser+0.182thr+0.968pro+0.956met-0.220tyr-0.021try-3.384)}],p为依据每个受检者10项指标计算得到的预测概率。计算所有受检者预测概率值，并以该值建立联合指标ROC曲线（图6），ROC曲线下面积为0.882，显示了联合检测的优势，依据Youden指数最大值(0.6)确定其最佳界值点对应的灵敏度为0.775，特异度0.826，其相应诊断界值为p=0.5436609.即当受检者预测概率值P>0.5436609时，认为该受检者患有胃癌，其灵敏度为0.775，特异度0.826。

指标组合

对指标进行组合，取不同联合指标数下的最优组合（以ROC曲线下面积最大值和Youden指数确定）。可以看出随着指标数目的增加，ROC曲线下面积数值随之增加，当3个指标联合时，ROC值已上升至0.864，继续联合指标，当8个指标联合时，曲线下面积已达最大0.882，继续增加指标数目，该值不再增加（表6）。结合Youden指数，在Threonine(Thr)、Alanine(Ala)、Tyrosine(Tyr)、Ser(Serine)、Methionine(Met)、Proline(Pro)、Glycine(Gly)、Valine(Val)8项指标联合时，Youden指数达最大0.612，对应灵敏度为0.775，特异度0.837，为最优组合。

对应Logistic回归预测方程为

p=1/[1+e^{-(0.069ala-0.005gly-0.144val+0.067ser+0.180thr+1.001pro+1.001met-0.230tyr-3.371)}],

p为依据每个受检者8项指标计算得到的预测概率。该方法相应诊断界值为p=0.5419057，即当受检者预测概率值P>0.5436609时，认为该受检者患有胃癌，其灵敏度为0.775，特异度0.837.对这一组合指标绘制ROC曲线（图7），并和所有联合指标ROC曲线（图6）、单指标ROC曲线对比（图4）。可以看出，8指标联合ROC曲线下面积显著高于单指标，显示了联合诊断的价值。而8指标联合检测和10指标联合检测相比曲线下面积一致，而前者Youden指数大于后者，提示8指标联合为最优组合。

表6

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (10)

1.一类氨基酸分子组合作为胃癌标志物在制备胃癌检测试剂盒中的用途，所述氨基酸分子组合为含丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的组合。

2.如权利要求1所述用途，其特征在于所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

3.如权利要求1所述用途，其特征在于所述氨基酸分子组合为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸的组合。

4.如权利要求1所述用途，其特征在于所述胃癌检测试剂盒所适用的检测样品为受检者的尿液样本。

5.如权利要求4所述用途，其特征在于所述受试者为肝肾功能正常的人。

6.如权利要求4所述用途，其特征在于所述尿液样品取自受试者清晨空腹中段尿液。

7.如权利要求1所述用途，其特征在于所述胃癌检测试剂盒适用于色谱法、质谱法、色谱－质谱联用法、毛细管电泳法。

8.如权利要求7所述用途，其特征在于，其中色谱法为气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法。

9.如权利要求8所述用途，其特征在于，所述色谱－质谱联用法为气相色谱－质谱联用法、液相色谱－质谱联用法、高效液相色谱－质谱联用法、气相色谱－串联质谱联用法、液相色谱－串联质谱联用法或高效液相色谱－串联质谱联用法。

10.一类用于检测诊断胃癌的生物标志物，其特征在于所述生物标志物为一类氨基酸分子组合，其为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的组合。