CN115420839A - 标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品 - Google Patents

标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品，涉及生物检测领域，本发明所提供的多个小分子生物标记物，包括丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、肌氨酸和甜菜碱的组合或丝氨酸和肌氨酸的组合，存在于人体肌肉和其他组织的天然化合物，在前列腺癌患者的尿液中水平与健康人群具有显著性差异，可作为诊断前列腺癌的新型、简便、无创的生物标志物，且对早期前列腺腺癌的诊断准确性优于PSA，有利于提高前列腺癌的治疗效果，改善预后。

Description

标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品。
背景技术
前列腺癌(PCA)检测主要基于肌氨酸和一碳代谢通路，进行早期前列腺癌筛查。
前列腺癌患者的生存时间与其肿瘤恶性分期密切相关。由于前期病情隐匿不易察觉，大部分患者因出现远处病灶转移才发现前列腺癌，往往错失了最佳的治疗时机。对高风险人群进行前列腺癌筛查，发现早期前列腺癌患者，对于提高治疗效果，改善预后等具有重要意义。
目前，临床广泛开展血液中前列腺癌特异抗原(Prostate-specific Antigen,PSA)的水平检测，进行PCA的早期筛查诊断，但PSA存在4-10ng/mL的诊断灰区，易出现假阳性或假阴性的结果。基于PSA检测的过度诊断率为0.7％(95％CI：0.3％～1.2％)～6.0％(95％CI：5.4％～6.6％)，并且随着年龄的增长而显著升高。因此，越来越多的学者开始质疑PSA能否作为前列腺癌的标志物。
更为重要的是，已有的诊断方法较难判断癌细胞的生物学特性是侵袭性还是非侵袭性，即使经过一系列的检查，前列腺癌是否会发生转移仍不得而知，这也是长期以来困扰前列腺癌临床诊断的难题。而这往往导致恶性前列腺癌患者丧失了最佳治疗的机会。
肌氨酸是甘氨酸的甲基化衍生物，亦称N－甲基甘氨酸，是肌肉和其他组织自然产生的氨基酸，很少出现在尿液中。2009年，Sreekumar等报道肌氨酸可以作为前列腺癌的标志物，它参与了前列腺癌的进展过程，是细胞恶变和转移过程中含量显著升高的一种代谢物。尿液肌氨酸还可能作为前列腺癌治疗中的特异性指标，能帮助识别侵袭性的肿瘤。2020年，Pavel A等报道血肌氨酸水平可用于PCa的辅助鉴别诊断，其在PCa患者，前列腺内皮瘤(PIN)患者体内水平，显著高于良性前列腺肿大(BPH)患者体内水平，鉴别诊断ROC曲线下面积为0.73～0.83；PSA在PCa患者体内水平显著高于PIN和BPH患者，但在PIN和BPH患者体内无显著性差别。
开发新的PCA诊断标志物，并提高PCA的诊断有效性和准确性是如今亟待解决的问题之一，鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供标志物在预测前列腺癌中的应用及相关产品。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了检测样本中标志物表达水平的试剂在制备早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的产品中的应用，所述标志物包括组合1或组合2：所述组合1包括丝氨酸和肌氨酸；所述组合2包括丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、肌氨酸和甜菜碱。
第二方面，本发明实施例提供了一种早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的试剂盒，其包括如前述实施例所述的检测样本中标志物表达水平的试剂。
第三方面，本发明实施例提供了一种前列腺癌预测模型的训练方法，其包括：获取训练样本的标志物的表达水平及其对应的标注结果；其中，所述标志物为如前述实施例所述的标志物，所述标注结果为代表样本前列腺癌的患病风险、疾病进程和预后风险中的至少一种情况的标签；将训练样本的标志物的表达水平输入预先构建的预测模型中，获得预测结果；所述预先构建的预测模型为能够根据所述标志物的表达水平预测样本前列腺癌患病风险和/或疾病进程的机器学习模型；基于所述标注结果和所述预测结果对预先构建的预测模型进行参数更新。
第四方面，本发明实施例提供了一种前列腺癌预测装置，其包括：获取模块，用于获得待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为如前述实施例所述的标志物；预测模块，用于将获得的标志物的表达水平输入如前述实施例所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果。
第五方面，本发明实施例提供了一种前列腺预测系统，其包括：检测装置和如前述实施例所述的前列腺预测装置；其中，所述检测装置包括能够实施如前述实施例所述的检测样本中标志物表达水平的方法的液相色谱串联质谱仪。
第六方面，本发明实施例提供了一种电子设备，所述电子设备包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述实施例所述的训练方法，或如下前列腺癌预测方法：获取待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为如前述实施例所述的标志物；将获得的标志物的表达水平输入如前述实施例所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果。
第七方面，本发明实施例提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述实施例所述的训练方法，或，如前述实施例中所述的前列腺癌预测方法。
本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的多个小分子生物标记物是存在于人体肌肉和其他组织的天然化合物，在前列腺癌患者的尿液中水平与健康人群具有显著性差异，可作为诊断前列腺癌的新型、简便、无创的生物标志物，且对早期前列腺癌的诊断准确性优于PSA。
本发明所提供试剂盒仅需检测患者血液或清晨中段尿液，增加前列腺癌的检测准确率，减少活检穿刺给患者带来的痛苦。基于初诊前列腺癌分期偏晚，早期前列腺癌具有隐匿性特点，且早期前列腺癌存在有效的治疗措施，以及国内外研究和文献报道的支持，开展前列腺癌的检查具有重大的意义，可提高前列腺癌的治疗效果，改善预后等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试剂盒检测目标标记物的操作流程图；
图2为各分析物及其内标的LC-MS/MS检测图谱；
图3为基于本发明试剂盒建立预测模型Ⅰ用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图；
图4为基于本发明试剂盒建立预测模型Ⅱ用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图；
图5为基于本发明试剂盒建立预测模型III用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图；
图6为基于本发明试剂盒所检测标志物Sar用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图。
图7为基于本发明试剂盒所检测标志物与PSA联合诊断模型用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图。
图8为基于PSA检测结果用于前列腺癌辅助诊断的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了检测样本中标志物表达水平的试剂在制备早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的产品中的应用，所述标志物包括组合1或组合2：所述组合1包括丝氨酸和肌氨酸；所述组合2包括丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、肌氨酸和甜菜碱。
在一些实施例中，所述组合1还包括胆碱和PSA中的至少一种；所述组合2还包括甘氨酸。
标志物的名称见表1。
表1标志物
代号 英文名称 中文名称
Cho Choline 胆碱
Bet Betaine 甜菜碱
Gly Glycine 甘氨酸
Sar Sarcosine 肌氨酸
Dim Dimethylglycine 二甲基甘氨酸
Ser Serine 丝氨酸
Ala Alanine 丙氨酸
Glu Glutamic acid 谷氨酸
Leu leucine 亮氨酸
Ile Isoleucine 异亮氨酸
Phe Phenylalanine 苯丙氨酸
Cre Creatinine 肌酐
表1所示的标志物的发现过程为：通过研究临床不同阶段的病例组人群和对照组(健康人)人群尿液样本中的多个候选标志物，比较各组间的水平差异，组间比较采用多因素方差分析，P值＜0.05判断具有显著性差异，同时根据各组人群中具有差异性的代谢物的水平，进一步进行相关性分析，筛选出相关的标记物组合胆碱、甜菜碱、甘氨酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，苯丙氨酸、肌酐。通过多因素回归和ROC曲线分析，评价相关标记物组合应用于临床诊断的效能。
本发明实施例提供了一种同时检测人体样本(血液样本和/或尿液样本)中的多个小分子生物标记物的方法及产品，能用于实现对前列腺癌的早期筛查及辅助诊断。根据检测结果，评价患者代谢情况，实现对前列腺癌的早期筛查、辅助鉴别诊断和术后复发情况的监测。在前列腺特异性抗原PSA诊断灰区(4～10ng/mL)时，本申请实施例提出的标志物的应用可以更准确的评估前列腺癌风险情况，判断是否需要进一步做活检穿刺，减少不必要的过度诊疗。所述标记物对前列腺癌和前列腺增生、炎症等良性前列腺疾病具有良好的区分效果。
在一些实施例中，除PSA以外的其他标志物，检测试剂包括：通过以下任意方法进行检测的试剂：HPLC(高效液相色谱)，GC-MS(气相色谱-质谱联用)，LC-MS(液相色谱质谱联用)，GC-MS-MS(高效气相色谱-质谱联用)，LC-MS-MS(高效液相色谱串联质谱法)，LC-NMR(液相色谱-核磁共振谱联用)和LC-MS-NMR。而诊断PSA，检测试剂包括：通过抗原或抗原检测方法检测PSA的试剂。抗原或抗原检测方法是指借助抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位的检测。检测方法包括但不限于：酶联免疫分析法、免疫荧光技术、间接血凝试验和放射免疫测定等。本申请的发明点主要在于找到早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的标志物，不在于检测方法本身。具体方法对应的试剂可通过常规技术知识获得，不再赘述。
在一些实施例中，所述试剂包括通过LC-MS-MS检测标志物表达水平的试剂：质控品、校准品、内标、衍生剂、缓冲液、终止液流动相A和流动相B中的至少一种。
在一些实施例中，所述衍生剂包括含丹磺酰氯的乙腈溶液，其中，丹磺酰氯的浓度为0.1～2mg/mL，具体可以为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL和2mg/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。衍生剂的配制步骤：移取一定体积乙腈溶解衍生试剂瓶中的固体，涡旋混合均匀3min～5min，即得。
在一些实施例中，所述缓冲液包括10～200μM碳酸氢钠溶液，该浓度具体可以为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM和200μM中的至少一种或至少两种之间的范围。
在一些实施例中，所述终止液包括含甲酸的甲醇水溶液；在所述终止液中，甲酸的体积分数为0.1％～3％，具体可以为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％和3％中的任意一种或任意两种之间的范围；在所述终止液中，甲醇的体积分数为40％～60％，具体可以为40％、45％、50％、55％和60％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述流动相A包括含甲酸铵的甲酸水，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％，具体可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.3％中的任意一种或任意两种之间的范围；流动相A中，甲酸铵的作用浓度为1～10mM，具体可以为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM和10mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述流动相B包括含甲酸的乙腈溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％，具体可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.3％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述产品还包括限定有检测样本中标志物表达水平的方法(检测方法)的说明书，所述方法包括：采用衍生剂、内标与待测样本混合，进行衍生化反应后，进行LC-MS-MS检测。
具体地，进行衍生化处理时，包括以下步骤：精密吸取校准品，质控品和样本各20微升，分别加入孔板，加入适量的内标准品，缓冲液和衍生化试剂，于60～80℃水浴条件下避光反应30～60分钟(min)，离心后，转移上清，加入200微升终止液，设置进样量1～5微升，进行LC-MS/MS检测。
在一些实施例中，样本前处理步骤中所用衍生剂为含0.1～2mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液，丹磺酰氯的浓度优选为0.3～1mg/mL，最优选为1mg/mL。
在一些实施例中，所述衍生化反应的条件包括：60～80℃，30～60min。可选地，衍生化反应的温度可以为60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃和80℃中的任意一种或任意两种之间的范围；时间可以为30min、35min、40min、45min、50min、55min和60min中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，进行所述衍生化反应后，所述方法还包括：对反应后的产物进行离心，在上清液中添加终止液后，用于LC-MS-MS(高效液相色谱串联质谱法)检测。
优选地，所述LC-MS-MS的色谱洗脱条件包括：
0～3.3min，流动相A的体积百分比从60％～80％降在10％～30％，流动相B的体积百分比从20％～40％增至70％～90％；
3.3～4.1min，流动相A体积百分比由维持在10％～30％，流动相B体积百分比维持在70％～90％；
4.1～4.2min，流动相A体积百分比由10％～30％增至60％～80％，流动相B体积百分比由70％～90％降至20％～40％；
4.2～5.0min，流动相A体积百分比维持在60％～80％，流动相B体积百分比维持在20％～40％。
本发明所采用的液相色谱串联质谱法成功地克服了目前临床定量检测常用技术方法的缺点。该方法具有以下明显的优势：(1)一个试剂盒可以检测多种待测物质，进而同时检测多种疾病，更全面的反映患者的身体状况。(2)检测具有高特异性，每一种物质进入质谱碎片化后，都会产生具有独一无二质荷比的离子碎片，可以被质谱识别并定量。为此，待测物质的检测基本上不受血液中其他物质的干扰，患者检测结果的可信度显著提高。(3)很高的定量准确性，通过加入内标准品的方法，基质效应对定量准确性的影响可以降到最低。(4)单次检测的时间比现有的方法要快至少1倍，可以节省检测时间，提高诊断效率。
在一些实施例中，所述样本包括生物样本或含有所述生物样本的环境样本，所述生物样本选自血清样本、血浆样本和尿液样本中的任意一种。
在一些实施例中，所述检测样本中标志物表达水平的试剂或早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的产品中还包括：用于检测前列腺特异性抗原PSA的试剂。检测PSA的试剂可采用现有公开的所有用于检测PSA的技术手段，例如，抗PSA抗体。
本发明通过检测尿液中系列标志物，与传统的前列腺癌检测指标前列腺癌特异性抗原PSA优势互补，可区分前列腺癌及其它良性前列腺炎症，用以辅助PSA灰区诊断前列腺癌，可使PSA发挥最大的预测作用，排除干扰，精确诊断，减少活体穿刺检查给患者带来的痛苦。
传统血清PSA检测在临床上广泛应用于前列腺癌的早期筛查与监测。临床上需要对PSA异常患者进行穿刺活检取得组织病理学诊断后方可确诊。PSA是前列腺特异性抗原非前列腺癌特异性抗原，诊断结果存在灰区。PSA在诊断前列腺癌灰区为含量4～10ng/mL，在此区间内不能准确区分前列腺增生、前列腺炎和早期前列腺癌。PSA含量4-10ng/mL范围内穿刺活检前列腺癌阳性率不足20％，且确诊需活检数次，对于患者来说这一过程非常痛苦。此外，活检穿刺可能会增加肿瘤转移风险增加感染等并发症的发生。
在一些实施例中，所述产品的类型选自试剂盒、装置和预测模型中的至少一种。
本发明实施例还提供了一种早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的检测样本中标志物表达水平的试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括有前述任意实施例所述的说明书。
在一些实施例中，所述试剂盒内包括系列浓度的校准品，用于绘制校准曲线，所述校准品中各生物标记物的浓度水平为0.05～1500μg/mL，优选使用浓度为300～500μg/ml，更优选为400μg/ml；同时包括多个浓度水平的质控品，质控品的水平覆盖临床检测范围，0.05～1500μg/mL，优选使用低浓度为1～2μg/mL，更优选为1.5μg/ml；优选使用中浓度为30～75μg/ml，更优选为50μg/ml；优选使用高浓度为200～400μg/ml，更优选为300μg/ml。
在一些实施例中，所述试剂盒内包括内标准品，所述内标准品包括甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，苯丙氨酸和肌酐的同位素标记标准物质，各同位素标记标准物质的浓度水平独立地为0.05～1500μg/mL。
本发明实施例还提供了一种前列腺癌预测模型的训练方法，其包括：
获取训练样本的标志物的表达水平及其对应的标注结果；其中，所述标志物为如前述任意实施例所述的标志物；
将训练样本的标志物的表达水平输入预先构建的预测模型中，获得预测结果；所述预先构建的预测模型为能够根据所述标志物的表达水平预测样本前列腺癌患病风险和/或疾病进程的机器学习模型；
基于所述标注结果和所述预测结果对预先构建的预测模型进行参数更新。
需要说明的是，所述标注结果和所述预测结果独立地为代表样本前列腺癌的患病风险、疾病进程和预后风险中的至少一种情况的标签。所述标签可以为字符或字符串。
在一些实施例中，训练样本集的数量大于等于10、20、30、40或50，可基于实际情况选择。训练后，可通过测试集验证模型的有效性。训练集和测试集中均包含前列腺癌患病人群和健康人群。
优选地，所述机器学习模型包括逻辑回归模型。所述逻辑回归模型可以为多因素二元逻辑回归模型，所述逻辑回归模型选择变量的方法选自：向前LR、向后LR、向前条件和向后条件中的任意一种。
本发明实施例还提供了一种前列腺癌预测装置，其包括：
获取模块，用于获得待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为如前述任意实施例所述的标志物；
预测模块，用于将获得的标志物的表达水平输入如前述任意实施例所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果。
在一些实施例中，所述预测模型通过计算公式获得预测结果；组合1的公式选自：Y＝-(0.08～0.09)Ala-(0.7～0.8)Ser+(2～2.5)Ile-(0.1～0.5)Sar+(0.1～0.5)Bet+(12～14)；或Y＝-(0.06～0.08)Ala+(0.1～0.5)Gly-(0.8～1)Ser+(2～2.2)Sar-(0.1～0.5)ILe+(0.1～0.5)Bet+(14～15)；
组合2的公式选自：Y＝(0.4～0.8)Ser+(0.1～0.5)Sar+(14～15)或Y＝(0.5～0.9)Ser+(0.1～0.5)Sar-(4～5)Cho+(0.6～1)PSA+(18～19)；其中，Ala、Ser、Ile、Sar、Bet、Cho和PSA为对应标志物的含量或水平。
在一些实施例中，组合1的公式选自：Y＝-0.086Ala-0.713Ser+2.384Ile-0.230Sar+0.233Bet+13.312；或Y＝-0.072Ala+0.22Gly-0.978Ser+2.007Sar-0.254ILe+0.252Bet+14.396；组合2的公式选自：Y＝0.608Ser+0.251Sar+14.859或Y＝0.724Ser+0.372Sar-4.528Cho+0.843PSA+18.384。
可选地，上述模块可以软件或固件(Firmware)的形式存储于存储器中或固化于本申请提供的电子设备的操作系统(Operating System，OS)中，并可由电子设备中的处理器执行。同时，执行上述模块所需的数据、程序的代码等可以存储在存储器中。
本发明实施例还提供了一种前列腺预测系统，其包括：检测装置和如前述任意实施例所述的前列腺预测装置；其中，所述检测装置包括能够实施如前述任意实施例所述的检测样本中标志物表达水平的方法的液相色谱串联质谱仪。
本文中“能够实施如前述任意实施例所述的检测样本中标志物表达水平的方法的液相色谱串联质谱仪”可以理解为液相色谱串联质谱仪的性能足够实施前述任意实施例所述的检测样本中标志物表达水平的方法，比如WatersTM TQD System(TQD)系统、ShimadzuLC-8030TM三重四极杆LC/MS/MS系统、API2000TM系统(MS2)、API 3200TM系统和/或AppliedBiosystems公司的API 4000TM三重四极杆质谱仪；还可以理解为，所述系统中含有将质谱仪中的参数设定为能够实施上述方法的程序，使得液相色谱串联质谱仪能够自动或半自动地实施上述检测标志物的方法。
本发明实施例还提供了一种电子设备，所述电子设备包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述任意实施例所述的训练方法，或如下前列腺癌预测方法：获取待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为如前述任意实施例所述的标志物；
将获得的标志物的表达水平输入如前述任意实施例所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果。
该电子设备可以包括存储器、处理器、总线和通信接口，该存储器、处理器和通信接口相互之间直接或间接地电性连接，以实现数据的传输或交互。例如，这些元件相互之间可通过一条或多条总线或信号线实现电性连接。处理器可以处理与目标识别有关的信息和/或数据，以执行本申请中描述的一个或多个功能。
存储器可以是但不限于，随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)，只读存储器(Read Only Memory，ROM)，可编程只读存储器(Programmable Read-Only Memory，PROM)，可擦除只读存储器(Erasable Programmable Read-Only Memory，EPROM)，电可擦除只读存储器(Electric Erasable Programmable Read-Only Memory，EEPROM)等。
处理器可以是一种集成电路芯片，具有信号处理能力。该处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(Central Processing Unit，CPU)、网络处理器(Network Processor，NP)等；还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processing，DSP)、专用集成电路(Application Specific Integrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field－Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
在实际应用中，该电子设备可以是服务器、云平台、手机、平板电脑、笔记本电脑、超级移动个人计算机(ultra-mobile personal computer，UMPC)、手持计算机、上网本、个人数字助理(personal digital assistant，PDA)、可穿戴电子设备、虚拟现实设备等设备，因此本申请实施例对电子设备的种类不做限制。
本发明实施例还提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述任意实施例所述的训练方法，或，如前述任意实施例中所述的前列腺癌预测方法。
本文中的“计算机可读介质”包括：U盘、移动硬盘、只读存储器、随机存取存储器、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
本发明的检验原理：采用柱前衍生法处理样本后，进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析，待测物经色谱分离后，导入质谱仪，在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下，聚焦进入三重四级杆质量分析器。在第一级四级杆(Q1)中，带电离子按质荷比分离，筛选出母离子，随后进入第二极四级杆(Q2)中，在碰撞气体和碰撞能量的作用下，碎裂形成碎片离子，产生的碎片离子进入到第三极四级杆(Q3)，按质荷比分离，筛选出目标子离子，最终进入检测器，产生信号。将校准品中甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，苯丙氨酸、肌酐与相应内标的峰面积比值与标示浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。将实际样本中的待测物与内标的峰面积比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出待测物浓度。
本发明所提供的多个小分子生物标记物是存在于人体肌肉和其他组织的天然化合物，在前列腺癌患者的尿液中水平与健康人群具有显著性差异，可作为诊断前列腺癌的新型、简便、无创的生物标志物，且对早期前列腺腺癌的诊断准确性优于PSA。本发明所提供试剂盒仅需检测患者血液或清晨中段尿液，增加前列腺癌的检测准确率，减少活检穿刺给患者带来的痛苦。基于我国初诊前列腺癌分期偏晚，早期前列腺癌具有隐匿性特点，且早期前列腺癌存在有效的治疗措施，以及国内外研究和文献报道的支持，开展前列腺癌的检查具有重大的意义，可提高前列腺癌的治疗效果，改善预后等。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
材料
化学对照品：包括胆碱、甜菜碱、甘氨酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，苯丙氨酸和肌酐的化学标准物质和同位素标记标准物质，具体参见表2。
表2.化学对照品结构
Figure BDA0003843698530000071
Figure BDA0003843698530000081
衍生剂：丹磺酰氯。
缓冲液：100μM碳酸氢钠。
其他试剂：流动相A为0.1％甲酸水含2mM甲酸铵，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液。
实施例1
一、早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的试剂盒。
表3.试剂盒的组成
Figure BDA0003843698530000082
Figure BDA0003843698530000091
二、早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的检测方法所用的仪器和用具如下。
本实施例的试剂盒是由试剂和仪器组成的完整系统的一部分。以下仪器为本试剂盒检测需要的仪器：
1、串联质谱系统-Waters公司的Waters TQDTM三重四极杆质谱仪。
2、还需要其它用具：(1)手动或自动移液器(10–1000μL)，(2)移液吸头，(3)用于测量mL容量试剂的移液器或带刻度量筒，(4)试剂库，(5)化学通风橱，(6)低温高速离心机。
三、本实施例的检测方法包括如下步骤，见图1。
步骤1、血清或尿液样本采集及制备
样本采集时应空腹，并严格登记，标记无误，确保每个样本的信息准确。血清样本采集时，用不含任何添加剂或促凝剂的采血管取血，采血后2小时内，于1000～1200g离心15分钟，收集上清液。尿液样本应采集清晨中段尿液，装于无菌尿杯中，在1h内于4℃，2000～4000g离心并将尿沉渣、细胞碎片去除，转移一定量上清液，按照9:1比例添加样本稳定剂，混匀后可运输或储存。
步骤2、检测样本的制备
检测前溶液准备
衍生试剂配制：移取16mL乙腈溶解衍生试剂瓶中的固体，涡旋混合均匀3min～5min，即得；
检测样本制备
加校准品溶液：精密移取20μL内标工作液，分别加入到96孔V型板的待用孔中，然后分别加入20μL校准品溶液1～6，分别加入80μL缓冲液和80μL衍生化试剂，涡旋混匀；
加质控品溶液：精密移取20μL内标工作液，分别加入到96孔V型板的待用孔中，然后分别加入20μL低值和高值质控品溶液，在分别加入80μL缓冲液和80μL衍生化试剂，涡旋混匀；
加血清或尿液样本：精密移取20μL内标工作液，分别加入到96孔V型板的待用孔中，然后精密移取20μL的血清或尿液样本，分别加入80μL缓冲液和80μL衍生化试剂，涡旋混匀；
衍生化反应：将96孔V型板放置于60℃水浴锅中避光反应30min；
终止反应：将反应后的96孔V型板取出放置室温，于4000g离心5min后，转移100μL上清至另一个96孔V型板中，加入200μL终止液，用96孔板膜封紧后涡旋振荡2min；
检测：将96孔板置于LC-MS/MS中，进行检测。
步骤3：LC-MS/MS检测
LC-MS/MS检测条件：
表4质谱检测通道及参数
Figure BDA0003843698530000101
表5液相色谱条件
Figure BDA0003843698530000102
Figure BDA0003843698530000111
启动质谱控制程序：启动相应质谱控制程序，创建工作列表，并使用如上表中工作参数运行测试并采集分析物和内标的色谱峰，系统自动计算所采集色谱峰的面积以及分析物和内标峰面积的比值。
每次进行受试者样品检测时一块96孔板中均应包括有：空白对照；校准样本；低、中、高质控样本；待测血清或尿液样本。上述各个物质处理方法应严格按照步骤2检测样本制备所描述，再进入串联质谱系统的自动进样器，运行，出结果。
步骤4、结果计算
将每个样品中的各种分析物的相对浓度使用回归分析法进行分析，带入建模公式得到结果。
步骤5、结果分析
计算待测物浓度：将校准品中各分析物与相应内标的峰面积比值与标示浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。将实际样本中的各分析物与内标的峰面积比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出待测物浓度。
结合产品临床诊断参考阈值，判定样本为阳性，阴性或临界状态。
实施例2
实施例1的试剂盒及其检测方法检测的各分析物及其内标的LC-MS/MS检测图谱见附图2。
线性范围评价：
在可呈线性范围内，各分析物检测结果与浓度水平的线性关系良好，相关系数r＞0.99，结果如下。
Figure BDA0003843698530000112
Figure BDA0003843698530000121
重现性测试结果如下。
Figure BDA0003843698530000122
Figure BDA0003843698530000131
Figure BDA0003843698530000132
Figure BDA0003843698530000141
Figure BDA0003843698530000142
Figure BDA0003843698530000151
Figure BDA0003843698530000152
Figure BDA0003843698530000161
Figure BDA0003843698530000162
Figure BDA0003843698530000171
Figure BDA0003843698530000172
Figure BDA0003843698530000181
实施例3：辅助鉴别诊断
收集77例不同疾病进展阶段的前列腺癌患者，以及107例其他非前列腺癌男性患者，包括前列腺增生或前列腺炎，其他恶性肿瘤如膀胱癌或肾癌，以及经临床健康体检确认为正常男性患者的尿液样本。
基于实施例1提供的试剂盒和检测方法，检测其中胆碱、甜菜碱、甘氨酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，苯丙氨酸和肌酐的表达水平，采用t检验，判断各指标水平是否具有组间差异。结果如下表：
Figure BDA0003843698530000182
Figure BDA0003843698530000191
选择组间差异显著或具有一定差异的指标，作为协变量，以临床诊断结局为因变量，进行多因素的二元Logistic回归分析，评价各标记物与诊断结局的相关性，构建预测模型。通过ROC分析，通过约登指数计算确定产品临床诊断的参考阈值，考察灵敏度和特异性，比较不同预测模型的诊断效能。
收集患者PSA检查结果，与上述标记物，一起作为协变量，以临床诊断结局为因变量，进行多因素的二元Logistic回归分析，构建预测模型。通过ROC分析，考察灵敏度和特异性，评价与PSA联合诊断效能。同时与PSA单独诊断效能进行比较，评价优劣。
模型Ⅰ：采用多因素二元Logistic回归分析，向后条件输入法建模，得到回归方程：Y＝-0.086Ala-0.713Ser+2.384Ile-0.230Sar+0.233Bet+13.312。公式中，Ala为丙氨酸的表达水平(相对含量)；Ser为丝氨酸的表达水平；Ile为异亮氨酸的表达水平；Sar为肌氨酸的表达水平；Bet为甜菜碱的表达水平，后续以此类推。
回归结果表明，丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、肌氨酸、甜菜碱与前列腺癌发生具有显著相关性，其中Sar和Bet对前列腺癌的疾病进展具有促进趋势，Sar每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加2.38倍(OR值为10.844，P值＜0.001)，Bet每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.23倍(OR值分别为1.26，P值均＜0.01)，影响具有统计学意义，具体见下表。
Figure BDA0003843698530000192
Figure BDA0003843698530000201
基于模型预测值，进行ROC曲线分析，见图3，根据约登指数最佳计算的诊断标准值为0.296，诊断敏感性为93.5％，特异性为94.4％，ROC曲线下面积AUC为0.992(95％置信限：0.966～0.999)。
Figure BDA0003843698530000202
模型Ⅱ：采用多因素二元Logistic回归分析，向前条件输入法建模，得到回归方程：Y＝-0.072Ala+0.22Gly-0.978Ser+2.007Sar-0.254ILe+0.252Bet+14.396。
回归结果表明，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、肌氨酸、异亮氨酸、甜菜碱与前列腺癌发生具有显著相关性，其中Sar，Gly和Bet对前列腺癌的疾病进展具有促进趋势，Sar每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加2.01倍(OR值为7.438，P值＜0.001),Gly每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.22倍(OR值为1.247，P值均＜0.02)，Bet每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.25倍(OR值分别为1.29，P值均＜0.02)，影响具有统计学意义，具体见下表：
Figure BDA0003843698530000203
基于模型预测值，进行ROC曲线分析，见图4，根据约登指数最佳计算的诊断标准值为0.336，诊断敏感性90.9％，特异性为90.7％，ROC曲线下面积AUC为0.977(95％置信限：0.960～0.994)。
Figure BDA0003843698530000204
Figure BDA0003843698530000211
模型III：
采用多因素二元Logistic回归分析，向前LR步进法建模，得到回归方程：Y＝0.608Ser+0.251Sar+14.859。
回归结果表明，丝氨酸、肌氨酸与前列腺癌发生具有显著相关性，其中Sar和Ser对前列腺癌的疾病进展具有促进趋势，Ser每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.251倍(OR值为1.544，P值＜0.001)，Sar每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.608倍(OR值为1.278，P值均＜0.001)，影响具有统计学意义，具体见下表：
Figure BDA0003843698530000212
基于模型预测值，进行ROC曲线分析，见图5，根据约登指数最佳计算的诊断标准值为0.330，诊断敏感性88.3％，特异性为89.7％，ROC曲线下面积AUC为0.951(95％置信限：0.909～0.977)。
Figure BDA0003843698530000213
肌氨酸单一指标诊断效能：
采用肌氨酸单一指标进行前列腺癌辅助诊断的ROC分析，见图6，敏感性80.5％，特异性为67.3％，ROC曲线下面积AUC为0.753(95％置信限：0.684～0.814)。表明肌氨酸对前列腺癌具有一定诊断效能，但准确度和灵敏度劣于上述标记物组合。
与PSA联合诊断模型：
采用多因素二元Logistic回归分析，向前LR步进法建模，得到回归方程：Y＝0.724Ser+0.372Sar-4.528Cho+0.843PSA+18.384。
回归结果表明，丝氨酸、肌氨酸与前列腺癌发生具有显著相关性，其中Sar和Ser对前列腺癌的疾病进展具有促进趋势，Ser每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.724倍(OR值为1.685，P值＜0.001),Sar每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.372倍(OR值为1.289，P值＜0.01)，PSA每增加一个单位，前列腺癌患病概率增加0.843倍(OR值为2.323，P值＜0.001)，影响具有统计学意义，具体见下表：
Figure BDA0003843698530000214
基于模型预测值，进行ROC曲线分析，见图7，根据约登指数最佳计算的诊断标准值为0.30，诊断敏感性98.7％，特异性为96.2％，ROC曲线下面积AUC为0.994(95％置信限：0.969～1.000)。
PSA单一指标诊断效能：
采用PSA单一指标进行前列腺癌辅助诊断的ROC分析，见图8，敏感性71.1％，特异性为93.3％，ROC曲线下面积AUC为0.872(95％置信限：0.823～0.923)。
实施例4
收集400例目标人群样本，包括200例前列腺癌患者及200例对照人群尿液样本，采用试剂盒检测其中相关标记物水平，采用实施例3所建立预测模型I，获得预测结果，分别与临床专家诊断意见进行一致性检验，验证模型诊断效能。
以临床参考标准判断结果为标准，计算考核试剂的假阳性(b)，假阴性(c)，真阳性(a)和真阴性(d)的例数，统计结果如下表5。
表5考核试剂与临床参考标准结果定性分析四格表
Figure BDA0003843698530000221
根据上表中数据，使用Medcalc检验考核试剂诊断灵敏度，特异度，ROC曲线下面积AUC，总符合率，阳性符合率和阴性符合率，分别如下。
表6考核试剂诊断检验结果
检验项目 结果 95％置信区间
灵敏度 91.5％ 86.7％～94.9％
特异度 82.5％ 76.5％～87.5％
AUC 0.87 0.83～0.90
总符合率 87.0％ 83.3％0～90.1％
阳性符合率 83.9％ 79.4％～87.6％
阴性符合率 90.6％ 85.9％～93.9％
根据检验结果，总符合率95％置信区间的下限为83.3％，可满足临床使用需求(＞80％)，灵敏度95％置信区间的下限为86.7％，可满足临床使用需求(＞85％)，特异度95％置信区间的下限为76.5％，可满足临床使用需求(＞75％)，判断考核试剂诊断效能可满足临床使用需求。
根据定性分析四格表，进行Kappa一致性检验，检验结果显示Kappa系数K值为0.76，95％置信区间为(0.70～0.84)。根据K＞0.7,判定两系统一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测样本中标志物表达水平的试剂在制备早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述标志物包括组合1或组合2：所述组合1包括丝氨酸和肌氨酸；所述组合2包括丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、肌氨酸和甜菜碱。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合1还包括：胆碱和PSA中的至少一种；
优选地，所述组合2还包括甘氨酸。
3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述检测样本中标志物表达水平的试剂包括：通过HPLC，GC-MS，LC-MS，GC-MS-MS，LC-MS-MS，LC-NMR、LC-MS-NMR以及抗体或抗原检测方法中的至少一种方法检测标志物的试剂；
优选地，所述试剂包括通过LC-MS-MS检测标志物表达水平的试剂：质控品、校准品、内标、衍生剂、缓冲液、终止液、流动相A和流动相B中的至少一种；
优选地，所述衍生剂包括含丹磺酰氯的乙腈溶液，其中，丹磺酰氯的浓度为0.1～2mg/mL；
优选地，所述缓冲液包括10～200μM碳酸氢钠溶液；
优选地，所述终止液包括含甲酸的甲醇水溶液；在所述终止液中，甲酸的体积分数为0.1％～3％，甲醇的体积分数为40％～60％；
优选地，所述流动相A包括含甲酸铵的甲酸水，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％，甲酸铵的作用浓度为1～10mM；
优选地，所述流动相B包括含甲酸的乙腈溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品还包括限定有检测样本中标志物表达水平的方法的说明书，所述方法包括：采用衍生剂、内标与待测样本混合，进行衍生化反应后，进行LC-MS-MS检测；
优选地，所述衍生化反应的条件包括：60～80℃，30～60min；
优选地，进行所述衍生化反应后，所述方法还包括：对反应后的产物进行离心，在上清液中添加终止液后，用于LC-MS-MS检测；
优选地，所述LC-MS-MS的色谱洗脱条件包括：
0～3.3min，流动相A的体积百分比从60％～80％降在10％～30％，流动相B的体积百分比从20％～40％增至70％～90％；
3.3～4.1min，流动相A体积百分比由维持在10％～30％，流动相B体积百分比维持在70％～90％；
4.1～4.2min，流动相A体积百分比由10％～30％增至60％～80％，流动相B体积百分比由70％～90％降至20％～40％；
4.2～5.0min，流动相A体积百分比维持在60％～80％，流动相B体积百分比维持在20％～40％；
优选地，所述样本包括生物样本或含有所述生物样本的环境样本，所述生物样本选自血清样本、血浆样本和尿液样本中的任意一种；
优选地，所述检测样本中标志物表达水平的试剂还包括：用于检测前列腺特异性抗原PSA的试剂；
优选地，所述用于检测前列腺特异性抗原PSA的试剂包括抗PSA抗体；
优选地，所述产品的类型选自试剂盒、装置和预测模型中的至少一种。
5.一种早期筛查和/或辅助鉴别诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1～4任一项所述的检测样本中标志物表达水平的试剂；
优选地，所述产品还包括有权利要求4所述的说明书。
6.一种前列腺癌预测模型的训练方法，其特征在于，其包括：
获取训练样本的标志物的表达水平及其对应的标注结果；其中，所述标志物为权利要求1～2任一项所述的标志物，所述标注结果为代表样本前列腺癌的患病风险、疾病进程和预后风险中的至少一种情况的标签；
将训练样本的标志物的表达水平输入预先构建的预测模型中，获得预测结果；所述预先构建的预测模型为能够根据所述标志物的表达水平预测样本前列腺癌患病风险和/或疾病进程的机器学习模型；
基于所述标注结果和所述预测结果对预先构建的预测模型进行参数更新；
优选地，所述机器学习模型包括逻辑回归模型；
优选地，所述逻辑回归模型为多因素二元逻辑回归模型；
优选地，所述逻辑回归模型选择变量的方法选自：向前LR、向后LR、向前条件和向后条件中的任意一种。
7.一种前列腺癌预测装置，其特征在于，其包括：
获取模块，用于获得待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为权利要求1～2任一项所述的标志物；
预测模块，用于将获得的标志物的表达水平输入权利要求6所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果；
优选地，所述预测模型通过计算公式获得预测结果；组合1的公式选自：Y＝-(0.08～0.09)Ala-(0.7～0.8)Ser+(2～2.5)Ile-(0.1～0.5)Sar+(0.1～0.5)Bet+(12～14)；或Y＝-(0.06～0.08)Ala+(0.1～0.5)Gly-(0.8～1)Ser+(2～2.2)Sar-(0.1～0.5)ILe+(0.1～0.5)Bet+(14～15)；组合2的公式选自：Y＝(0.4～0.8)Ser+(0.1～0.5)Sar+(14～15)或Y＝(0.5～0.9)Ser+(0.1～0.5)Sar-(4～5)Cho+(0.6～1)PSA+(18～19)；其中，Ala、Ser、Ile、Sar、Bet、Cho和PSA为对应标志物的含量或水平；
优选地，组合1的公式选自：Y＝-0.086Ala-0.713Ser+2.384Ile-0.230Sar+0.233Bet+13.312；或Y＝-0.072Ala+0.22Gly-0.978Ser+2.007Sar-0.254ILe+0.252Bet+14.396；组合2的公式选自：Y＝0.608Ser+0.251Sar+14.859或Y＝0.724Ser+0.372Sar-4.528Cho+0.843PSA+18.384。
8.一种前列腺预测系统，其特征在于，其包括：检测装置和权利要求7所述的前列腺预测装置；其中，所述检测装置包括能够实施权利要求4所述的检测样本中标志物表达水平的方法的液相色谱串联质谱仪。
9.一种电子设备，其特征在于，所述电子设备包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现权利要求6所述的训练方法或如下前列腺癌预测方法：
获取待测样本的标志物的表达水平，所述标志物为权利要求1～2任一项所述的标志物；
将获得的标志物的表达水平输入权利要求6所述的训练方法训练好的预测模型中，获得预测结果。
10.一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时实现权利要求6所述的训练方法或权利要求9中所述的前列腺癌预测方法。
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