CN110824037A - Mit和/或dit作为甲状腺癌标志物的应用及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用及试剂盒。MIT和DIT为甲状腺激素T4的合成前体物质，在甲状腺组织中表达稳定、恒定存在，具有高度特异性和有效性。本申请首次发现，MIT和DIT的表达量在甲状腺癌症组织和甲状腺正常组织中呈现极显著的差异，MIT和DIT在甲状腺癌症组织中的表达量低于正常组织中表达量的100‑200倍。基于此，MIT和DIT可作为甲状腺癌检测的生物标志物，相应的分析方法均可用于制备甲状腺癌检测试剂盒，为甲状腺癌检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的技术手段。本发明可实现对穿刺针采取的甲状腺癌的样本进行精准分析，并实现本试剂盒的超高效、高灵敏检测目的。

Description

MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物分析技术及医学领域，具体涉及一种特异性针对甲状腺癌的生物标志物、应用和癌检测试剂盒。
背景技术
甲状腺癌是临床上最为常见的内分泌恶性肿瘤，近年来临床发病率呈现明显的升高，以及越来越年轻化的趋势，并且在目前的医学研究中证实，这一病症还会伴随着疾病谱的变化而导致临床发病率的逐渐升高。目前临床上用于诊断甲状腺癌的技术常见有：触诊法、影像学检查法和细胞学检查法等，但仍存在一次确诊率较低，需多次确诊等问题。触诊法无法识别真实的癌症发病情况；影像学检查法仅可获取早期或者晚期的癌症图像并无法对其进行癌症的确诊；细胞学检查法仅从细胞学角度做出诊断，对肿瘤的组织分型有一定的困难，并且仅对多数晚期癌症诊断效果明显。血液中常用的甲状腺激素测试指标(如T3、T4)无法反映癌症发病情况。总体来说，目前用于甲状腺癌诊断的方法较多，但是每种方法都存在一定的局限性，使得甲状腺癌的诊断比较困难。
因此，寻找一种能够用于甲状腺癌临床快速诊断和预后等相关的生物标志物成为实现甲状腺癌精准诊断的关键。
发明内容
发明概述
MIT和DIT为甲状腺激素T4的合成前体物质，在甲状腺组织中表达稳定、恒定存在，具有高度特异性和有效性。本申请首次发现，MIT和DIT的表达量在甲状腺癌症组织和甲状腺正常组织中呈现极显著的差异，MIT和DIT在甲状腺癌症组织中的表达量低于正常组织中表达量的100-200倍。类似的差异现象在甲状腺癌细胞和正常细胞中也被检测到。基于此，MIT和DIT可作为甲状腺癌检测的生物标志物，相应的分析方法均可用于制备甲状腺癌检测试剂盒，为甲状腺癌检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的技术手段。
具体地，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一方面提供了一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用。
优选地，MIT和/或DIT的测定方法包括：首先提取待测组织中的MIT和/或DIT，然后将MIT和/或DIT提取液进行SPTPP衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，得到待测组织中的MIT和/或DIT的含量。
进一步地，待测组织中的MIT和/或DIT的提取方法具体为：
0.1-1mg待测组织样品中加入50μl的甲醇内标溶液，将组织样本进行匀浆破碎，混匀置于低温0℃以下环境，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟；向沉淀中加入50μl的甲醇萃取、离心、收集上清液，重复两次，将所得的上清液混合即得到MIT和/或DIT提取液。
更为优选地，所述甲醇内标溶液为13C6-MIT浓度为100ng/L的甲醇内标溶液。
进一步地，MIT和/或DIT提取液进行SPTPP衍生化的具体方法包括：
向提取液中加入30μl PBS缓冲液，再向体系中加入20μl的SPTPP剂，密封涡旋混匀，40℃反应5分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入衍生反应碱化溶液终止反应，其中，
SPTPP衍生化反应中衍生试剂为30mM SPTPP的DMSO溶液；衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)；衍生反应终止溶液为1M的NaOH水溶液。
进一步地，SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测前还包括：
将碱化后的衍生化MIT和/或DIT进行乙酸乙酯萃取净化：碱化的衍生化肿瘤标志物混合液中加入约等体积的乙酸乙酯，涡旋振荡10-15s，静置直至上层乙酸乙酯与下层水相出现明显分层，弃去上层乙酸乙酯，反复净化2-3次；
再将净化后的衍生化MIT和/或DIT进行酸化处理：向净化后的衍生产物混合物加入HCl水溶液，震荡混匀，所述HCl水溶液为5M的HCl水溶液，加入的体积为NaOH水溶液体积的1/4；
最后，将酸化后的衍生化MIT和/或DIT进行乙酸乙酯萃取：向酸化后的衍生产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋震荡10-15s，静置直至上层乙酸乙酯与下层水相出现明显分层，收集上层乙酸乙酯，反复萃取2-3次，将收集的乙酸乙酯萃物进行微弱氮吹干，50μL甲醇定容，再经UPLC-MS/MS分析。
进一步地，SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测具体方法包括：
取衍生化MIT和/或DIT和MIT和/或DIT标准样衍生化制备的标准曲线溶液，通过UPLC-MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测组织样本中MIT和/或DIT的浓度。
本发明的另一方面提供了一种甲状腺癌检测试剂盒，其包括MIT和/或DIT的检测试剂。
本发明的又一方面提供了一种试剂盒，用于甲状腺癌的预后评估，其包括MIT和/或DIT的检测试剂。
优选地，试剂盒中所述MIT和/或DIT的检测试剂包括：磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)、SPTPP的DMSO溶液、13C6-MIT的甲醇内标溶液、衍生反应碱化溶液和衍生反应酸化溶液。
本发明的有益效果如下：
本发明首次发现，甲状腺癌患者的癌组织中MIT和DIT与正常组织相比呈现出极显著的下调趋势，且该物质在甲状腺组织样本中稳定、恒定的存在，具有高度的特异性和有效性，因此可以作为甲状腺肿瘤检测的生物标志物。
本发明中MIT和/或DIT的测定方法也具备独创性，申请人已进行相关专利申请(公开号：CN108169383A)。该方法具有组织样本用量低，衍生产物稳定性好，在数日内分析不会对定量产生差异(图2)，衍生产物可长期保存于-20℃，且前处理简单方便、测定准确、特异性强等优点；其相应的检测该物质的试剂和方法如SPTPP试剂可用于制备甲状腺肿瘤检测试剂盒，为肿瘤检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的思路和手段。该方法通过开发的MIT和DIT超高灵敏衍生试剂进行对MIT和DIT衍生化，结合超高效液相色谱串联四级杆质谱仪(UPLC-MS/MS)对其进行超高灵敏检测，从而实现微量(0.1-1mg)组织即可精准检测甲状腺癌的生物标志物MTI和DIT，弥补了传统方法的灵敏度低、样本消耗量大及分析耗时长等缺点，为医学检测和病情诊断提供依据。
本发明可实现对穿刺针采取的甲状腺癌的样本进行精准分析，并实现本试剂盒的超高效、高灵敏检测目的。
附图说明
图1为MIT和DIT在标准样品和甲状腺组织中衍生化的MRM色谱图；
图2为MIT和DIT衍生产物5日内稳定性结果图；
图3为DIT衍生产物在甲状腺细胞和癌细胞含量对比结果图；
图4为MIT衍生产物在甲状腺正常组织和癌组织含量对比结果图；
图5为DIT衍生产物在甲状腺正常组织和癌组织含量对比结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述、实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行、清楚完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂未注明成产厂商者，均可使用市售购买获得的常规产品。所用仪器设备和耗材经过简单调试均可使用市售购买的常见的仪器和耗材产品。
以下分别以检测甲状腺正常组织和甲状腺癌组织中的甲状腺肿瘤标志物浓度为例对本发明的技术方案进行更为详细的说明。
实施例1：甲状腺正常细胞和甲状腺癌细胞中肿瘤标志物浓度的测定
1、仪器与试剂：
超高效液相色谱串联质谱联用仪(Waters公司)，包括ACQUITY超高效液相系统，Xevo TQ-XS四级杆质谱；高速冷冻离心机；分析天平；氮吹仪；涡旋振荡器。
甲醇(LC/MS级)、Milli-Q水。
2、甲状腺正常细胞和甲状腺癌细胞的预处理
(1)准确称取0.1-1mg待测甲状腺正常细胞和甲状腺癌细胞样本，加入50μl的甲醇内标溶液，将组织样本进行匀浆破碎，混匀置于低温0℃以下环境，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟。向沉淀中加入50μl的甲醇萃取、离心、收集上清液，重复两次，将所得的上清液混合即得到肿瘤标志物提取液。
(2)衍生化反应：取衍生反应缓冲溶液30μl于2mL棕色瓶，加入步骤(1)提取的肿瘤标志物提取液，加入20μl，30mM的衍生试剂，密封涡旋混匀，置于40℃烘箱中进行衍生化反应20分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入600μl衍生反应终止溶液，终止反应后，用0.8mL乙酸乙酯对产物其进行净化萃取2次，弃掉乙酸乙酯，向净化后的衍生产物中加入200μl的酸化溶液进行酸化，用0.8mL乙酸乙酯萃取2次，收集的上层的乙酸乙酯萃取液，微弱氮气吹至近干，加入50μl甲醇润洗内壁，涡旋震荡，将甲醇转移至内衬管，待UPLC-MS/MS检测。
3、超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行(UPLC-MS/MS)检测：
优选的，UPLC-MS/MS检测条件为：(1)色谱柱为Poroshell HPH-C18，柱长100mm；流动相梯度采用甲醇(A)和超纯水(B)，其梯度变化为0-1min，30％A；1-15min，30％-60％A；15-17min，60％-75％A；17-18min，75％-100％A；18-26min，100％A；26.1-30min，30％A；流动相流速为0.3mL/min；柱温为35℃，进样量为2-10μl。(2)质谱条件：离子源为：ESI源；数据扫描方式：正离子模式；脱溶剂气温度为500℃；毛细管电压为3kV；脱溶剂气流量为1000L/Hr；源温度为150℃；测定方式：选择反应监测方式(MRM)，主要质谱参数见表1。
表1主要质谱参数表
Figure BDA0002248006090000061
4、标准曲线和最低检出限：
(1)取不同浓度的甲状腺肿瘤标志物MIT、DIT标准溶液50μl，分别加入50μl甲醇混合内标标准溶液，涡旋震荡混匀，再分别加入30μl衍生反应缓冲溶液和20μl衍生试剂，用盖子密封置于40℃烘箱中进行衍生化反应5分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入600μl终止溶液，终止反应后，用0.8mL乙酸乙酯对产物其进行净化萃取2次，弃掉乙酸乙酯，向净化后的衍生产物中加入200ul的酸化溶液进行酸化，用0.8mL乙酸乙酯萃取2次，收集的上层的乙酸乙酯萃取液，微弱氮气吹至近干，加入50μl甲醇润洗内壁，涡旋震荡，将甲醇转移至内衬管，甲状腺肿瘤标志物衍生物混合标准工作溶液的浓度分别为：5.00ng/L、50.00ng/L、200ng/L、500ng/L、1000ng/L和3000ng/L；
(2)优选的，甲状腺肿瘤标志物MIT、DIT混合衍生标准工作溶液，2μl进样量进行UPLC-MS/MS分析，甲状腺组织样品中MIT和DITUPLC-MS/MS分析过程中的出峰时间与标准样品一直，参见图1，并对各标样峰面积与内标峰面积的比值(Y)和其浓度(X)进行线性回归分析，获得标准曲线。结果表明，在5ng/L～3000ng/L范围内物质的浓度与所测得相对内标的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数(γ2)均大于0.99。依据信噪比(S/N)计算得甲状腺肿瘤标志物(LOD)详见表2。
表2本发明方法血清游离态甲状腺激素相关代谢物标准曲线参数
序号 甲状腺肿瘤标志物 线性方程 相关系数(γ<sup>2</sup>) 检出限(pg/mL)
1 MIT Y＝98.71X-1.84 0.9999 0.07
2 DIT Y＝155.24X-0.09 0.9999 0.14
实施例2：甲状腺正常组织和甲状腺癌组织中肿瘤标志物浓度的测定
1、仪器与试剂：
同实施例1。
2、甲状腺正常组织和甲状腺癌组织的预处理
(1)准确称取0.1-1mg待测甲状腺正常组织和甲状腺癌组织样本，加入50μl的甲醇内标溶液，将组织样本进行匀浆破碎，混匀置于低温0℃以下环境，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟。向沉淀中加入50μl的甲醇萃取、离心、收集上清液，重复两次，将所得的上清液混合即得到肿瘤标志物提取液。
(2)衍生化反应：取衍生反应缓冲溶液30μl于2mL棕色瓶，加入步骤(1)提取的肿瘤标志物提取液，加入20μl，30mM的衍生试剂，密封涡旋混匀，置于40℃烘箱中进行衍生化反应20分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入600μl衍生反应终止溶液，终止反应后，用0.8mL乙酸乙酯对产物其进行净化萃取2次，弃掉乙酸乙酯，向净化后的衍生产物中加入200μl的酸化溶液进行酸化，用0.8mL乙酸乙酯萃取2次，收集的上层的乙酸乙酯萃取液，微弱氮气吹至近干，加入50μl甲醇润洗内壁，涡旋震荡，将甲醇转移至内衬管，待UPLC-MS/MS检测。
3、超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行(UPLC-MS/MS)检测：
同实施例1。
综合实施例1和实施例2中的检测结果，甲状腺原代细胞中DIT的含量均值为0.035ng/g，甲状腺癌细胞中DIT的含量均值为0.010ng/g。结果表明，甲状腺原代细胞中DIT的含量显著高于甲状腺癌细胞。甲状腺正常组织中MIT含量均值为4.2μg/g，DIT的含量均值为3.4μg/g(图4，5)。甲状腺癌组织中MIT含量均值为220pg/g，DIT的含量均值为367pg/g(图4，5)，通过对比甲状腺正常组织和甲状腺癌症组织中的MIT和DIT可知，甲状腺肿瘤标志物MIT和DIT在甲状腺癌组织中的表达量比正常组织低100-200倍(图3，4)。因此，本发明中的甲状腺肿瘤标志物MIT和DIT可作为甲状腺癌组织的高灵敏标志物。结合，甲状腺肿瘤标志物MIT和DIT衍生检测法，本试剂盒可实现超微量(0.1-1mg)组织样本精确检测，为甲状腺癌症的诊断提供依据。
综上所述，仅为本发明具体实施方式，但本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用。
2.如权利要求1所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，MIT和/或DIT含量的测定方法包括：首先提取待测甲状腺组织中的MIT和/或DIT，然后将MIT和/或DIT提取液进行SPTPP衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，得到待测组织中的MIT和/或DIT的含量。
3.如权利要求2所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，所述待测甲状腺组织中的MIT和/或DIT的提取方法包括：
0.1-1mg待测组织样品中加入50μl的甲醇内标溶液，将组织样本进行匀浆破碎，混匀置于0℃以下环境，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟；向沉淀中加入50μl的甲醇萃取、离心、收集上清液，重复两次，将所得的上清液混合即得到MIT和/或DIT提取液；所述甲醇内标溶液为13C6-MIT浓度为100ng/L的甲醇内标溶液。
4.如权利要求2所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，所述将MIT和/或DIT提取液进行SPTPP衍生化的方法包括：
向提取液中加入30μl PBS缓冲液，再向体系中加入20μl的SPTPP剂，密封涡旋混匀，40℃反应5分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入衍生反应碱化溶液终止反应。
5.如权利要求4所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，SPTPP衍生化反应中衍生试剂为30mM SPTPP的DMSO溶液；衍生反应缓冲溶液为0.1M的pH8.0磷酸缓冲液；衍生反应终止溶液为1M的NaOH水溶液。
6.如权利要求2所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测前还包括：
将碱化后的衍生化MIT和/或DIT进行乙酸乙酯萃取净化：碱化的衍生化肿瘤标志物混合液中加入约等体积的乙酸乙酯，涡旋振荡10-15s，静置直至上层乙酸乙酯与下层水相出现明显分层，弃去上层乙酸乙酯，反复净化2-3次；
再将净化后的衍生化MIT和/或DIT进行酸化处理：向净化后的衍生产物混合物加入HCl水溶液，震荡混匀，所述HCl水溶液为5M的HCl水溶液，加入的体积为NaOH水溶液体积的1/4；
最后，将酸化后的衍生化MIT和/或DIT进行乙酸乙酯萃取：向酸化后的衍生产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋震荡10-15s，静置直至上层乙酸乙酯与下层水相出现明显分层，收集上层乙酸乙酯，反复萃取2-3次，将收集的乙酸乙酯萃物进行微弱氮吹干，50μL甲醇定容，再经UPLC-MS/MS分析。
7.如权利要求2所述的一种MIT和/或DIT作为甲状腺癌标志物的应用，其特征在于，SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测方法包括：
取衍生化MIT和/或DIT和MIT和/或DIT标准样衍生化制备的标准曲线溶液，通过UPLC-MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测组织样本中MIT和/或DIT的浓度。
8.一种试剂盒，其用于甲状腺癌检测，其特征在于，包括MIT和/或DIT的检测试剂。
9.一种试剂盒，其用于甲状腺癌的预后评估，其特征在于，包括MIT和/或DIT的检测试剂。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述MIT和/或DIT的检测试剂包括：pH8.0的磷酸缓冲液、SPTPP的DMSO溶液、13C6-MIT的甲醇内标溶液、衍生反应碱化溶液和衍生反应酸化溶液。
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