CN109811033A - Acox1作为检测靶点在制备icp辅助诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ACOX1作为检测靶点在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。ACOX1作为检测靶点在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。ACOX1在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用。发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的ACOX1，发现其是与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的脂类代谢分子，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

Description

ACOX1作为检测靶点在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用

发明领域

本发明属于代谢组学及生殖医学领域，涉及ACOX1作为检测靶点在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。

背景技术

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠期严重危害母婴健康的并发症，这是一种以瘙痒、血清肝酶和胆汁酸升高为特征的妊娠相关综合征，其发病率可高达12.0％，可引起胎儿宫内窘迫、自发性早产、死胎等不良妊娠结局，增加围产儿发病率和死亡率。ICP对妊娠最大的危害是发生难以预测的胎儿突然死亡，有研究指出围产儿的死亡率约为正常妊娠者的6-10倍。如能早期发现ICP并进行干预可有效降低该病所造成的母婴并发症，降低该病给母婴和其家庭带来的疾病痛苦和经济压力。然而目前为止临床上ICP的监测手段非常有限，只能基于胆汁酸的筛查，其敏感度及特异性较低。因而，研究ICP早期发生的敏感分子事件，并筛选易感生物标志物(susceptiblebiomarker)可为ICP的早期诊断和实施干预提供有效手段，对于促进人类母婴健康具有重大的科学意义。

代谢组学(Metabolomics)是一门新兴的组学技术。其研究的是代谢物，被称为最接近表型的组学，被认为是对基因组、蛋白组执行结果的全面诠释。近年来代谢组学成功应用于各类疾病的早期预测，成为转化医学疾病敏感预测标志物筛选的备受关注的组学平台，代谢组学用于妊娠期相关疾病的诊断及发病机制研究已成为一个热门的新兴领域。代谢组学可以从全新角度揭示ICP的机制并寻找敏感的早期敏感生物标志物。

然而，目前还没有用于ICP辅助诊断的较为稳定的代谢生物标志物的报道，若能筛选出ICP特异或异常表达的代谢物质作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将极大改善我国ICP的诊断现状。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆代谢标志物。

本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆脂类代谢标志物在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第三个目的是提供用于ICP辅助诊断的试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

ACOX1(过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1)作为检测靶点在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。

ACOX1在ICP辅助诊断试剂盒中的应用。

一种ICP辅助诊断试剂盒，该试剂盒包括检测血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1的试剂。

本发明的发明点在于发现ACOX1可以作为ICP辅助诊断相关的血清/血浆脂类代谢标志物。

具体地说，ACOX1作为血清/血浆脂类代谢标志物通过以下方法筛选得到：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的组织标本及血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)ICP患者胎盘组织代谢组学分析：选择ICP病例、与 ICP病例年龄匹配的健康女性对照，检测ICP病例及对照胎盘组织代谢组学，分析ICP病例和健康女性对照间代谢物共性和特性，筛选差异表达代谢物。(3)ICP患者血清/血浆中ACOX1 脂类代谢标志物检测：血清/血浆代谢分子ACOX1在ICP患者中进行定量分析。

本发明的有益效果：

本发明提供的血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1作为ICP诊断的标志物的优越性在于：

本发明以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液及组织样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)，并采用了代谢组学、酶联免疫吸附实验方法，通过研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照组织/血清中代谢物的变化，发现ACOX1是与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的脂类代谢分子，多因素Logistic回归分析结果表明，ACOX1与ICP的发病存在着显著关联，其ROC如附图，AUC为0.852,为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

本发明初期采用代谢组学研究的方法获取疾病特异和异常表达的代谢物ACOX1，并应用酶联免疫吸附实验方法在ICP大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1 在ICP诊断的应用前景，阐述异常表达的ACOX1对于ICP进展的影响，揭示其对ICP的诊断价值。因此，本发明获得了ICP发病特异性血清/血浆脂类代谢标志物；通过血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1和诊断试剂盒的研制和应用，可使得ICP的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确诊断ICP及采取治疗措施奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1血清ACOX1对ICP的诊断价值

具体实施方式

实施例1研究样本的收集和资料整理

发明人于2017年3月至2018年10月从南京医科大学附属无锡妇幼保健院收集了大量ICP患者及健康对照孕妇的外周血样品及组织样本(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了112例符合下列标准的样本作为代谢组学检测和后续酶联免疫吸附实验验证的实验样品：

(1)纳入病例组：ICP诊断标准参照ICP患者诊疗指南(第一版)，具体标准如下：1)妊娠中晚期出现皮肤瘙痒，或伴有不同程度的黄疸；2)实验室检查：血清总胆汁酸(TBA)增高(>40μmol/L)，或伴转氨酶(ALT及AST)轻到中度升高，可伴胆红素升高；3)妊娠是引起皮肤瘙痒和生化异常的唯一原因；4)患者一般情况良好，无明显呕吐、食欲不佳、虚弱及其他疾病症状；5)分娩后上述症状、体征、血清生化指标迅速恢复正常。收集临床资料完整的ICP患者53例。

(2)纳入正常对照组：无妊娠并发症及合并症，剖宫产指征为臀位、骨盆异常和社会因素等，收集临床资料完整的正常孕妇59例。

(3)两组排除标准：1)患其它肝胆疾病；2)有其它妊娠并发症如妊娠期高血压疾病或有不能用ICP解释的血、尿或生化异常；3)有全身疾病如糖尿病、高血压、精神及神经疾病等；4)患有遗传性或免疫性疾病；5)有输血、移植或免疫治疗史者；6)有口服避孕药史者。

本研究共采用112例符合标准的样本进行研究，并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。

实施例2ICP患者差异代谢谱分析

将上述符合条件的4例ICP病例和4例健康对照经代谢组学检测获得相关结果。具体实验方法如下：

1.1仪器

UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive三重四极杆串联质谱仪；TraceFinder 3.1(Thermo Fisher Scientific)；Simca P 13.0(瑞典Umetrics公司)；XW-80A 漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；电子天平(MettlerAE240型)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂

500种代谢物标准品(≥98.0％，Sigma–Aldrich，St.Louis,MO,USA)；甲醇、乙腈(≥99.9％， Merck，German)；甲酸(≥98.0％，Sigma–Aldrich，St.Louis,MO,USA)；正己烷(色谱级，≥98.0％，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；氯仿(≥99.9％，阿法埃莎(中国)化学有限公司)；超纯水(PURELAB Ultra纯水仪，英国ELGA公司)；液氮(≥99.9％，南京大学应用物理研究所)。

1.3标准品溶液的制备和标准品库建立

准确称取各代谢物标准品适量，以甲醇，正己烷或者氯仿溶解，得到浓度为1mg/mL的标准品贮备液，贮备液经过稀释得到100μg/mL的标准品工作液。将所有溶解的单个标准品贮备液混成1μg/mL混合标准品贮备液，混合标准品贮备液经过稀释得到100ng/mL的混合标准品工作液，并于-20℃冰箱中保存。依据1.4，1.5方法采集保留时间建立标准品库。

1.3组织前处理

取50mg组织、加入150μL水，10μL内标A，加入10μL内标B，加入10μL内标C，加入甲醇40μL，涡旋30s，沉淀蛋白，冷冻离心机中40 16000g离心15min，将上清液转移至1.5ml 进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪(Labconco,USA)中浓缩至干，用10μL 超纯水复溶，待分析。

1.4超高效液相色谱串联质谱分析

1.4.1色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm ThermoScientific,Germany)，流动相A为乙腈(含0.1％甲酸)和流动相B为超纯水(含0.1％甲酸)，流速为 0.40ml/min，采用梯度洗脱的方式，流动相梯度变化见Table 1.1，柱温：400，进样量：5μL。

Table 1.1流动相梯度

1.4.2质谱条件：采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃,加热器温度：425℃,鞘气气流： 50AU,辅助气气流：13AU,反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70to 1050m/z；分辨率：70000。

1.5物质鉴定

采用TraceFinder 3.1(Thermo Fisher Scientific)软件通过与代谢物标准品精确分子量和保留时间比较，对代谢物进行定性，并相对定量。

1.6数据分析

采用Simca P 13.0(瑞典Umetrics公司)进行正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)。

1.7代谢组学分析结果

在178个代谢物中，我们通过代谢组学筛选到11个差异，基于KEGG通路的代谢组学结果分析，锁定脂质代谢改变这一通路。通过对Fatty acid degradation通路中的代谢酶进行分析发现， ACOX1发生显著上升。

实施例3定量分析确定ICP特异性血清/血浆ACOX1代谢分子

通过酶联免疫吸附实验检测两组血清/血浆样本中脂类代谢标志物ACOX1的表达水平，并分析比较其差异。具体方法为：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍(48T的20倍)浓缩洗涤液用蒸馏水30倍(48T的20倍)稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.统计分析方法

运用student t检验比较人口学特征，TAB(μmol/L)水平和血清/血浆样本中脂类代谢标志物ACOX1平均表达水平在研究对象组间分布的差异。

统计学分析均应用SPSS16.0统计学分析软件完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。结果见表1。

根据ELISA检测，本发明人检测到在“ICP病例”组(53例)和“健康女性对照”组(59例) 的血清中脂类代谢标志物ACOX1表达存在显著差异(P<0.01)。多因素Logistic回归分析结果表明，ACOX1与ICP的发病存在着显著关联，其ROC如附图，AUC为0.852，ACOX1 是与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的脂类代谢分子,能够用于制备ICP辅助诊断试剂。

表1.ICP患者与正常对照ACOX1检测结果比较

**P<0.01。

Claims (3)

1.ACOX1作为检测靶点在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂中的应用。

2.ACOX1在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用。

3.一种妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括检测血清/血浆脂类代谢标志物ACOX1的试剂。