CN112946150A - 一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及试剂盒 - Google Patents
一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5‑羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及其试剂盒。该方法包括下述步骤1)配制样本稀释工作液；2)在避光条件下，取尿液样本并向其中加入EDTA、Na2S2O3，然后加入乙酸进行酸化，混匀得到待测尿液样本；3)取待测尿液样本、校准品、尿液质控品与样本稀释液工作液混合，封膜，涡旋、离心，取上清液采用液相色谱‑质谱进行检测。在检测随机尿液制备而成的尿液样本时，仅需10微升尿液样本就可以一次性定量高香草酸、香草扁桃酸、5‑羟基吲哚乙酸及肌酐，且前处理方法简单快捷，节省了操作时间，根据这些指标能够有效的筛查和诊断人体中的神经母细胞瘤、类癌，辅助筛查嗜铬细胞瘤等。
Description
技术领域
本发明属于药物检测领域，具体涉及一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及其试剂盒。
背景技术
神经母细胞瘤(Neuro blastoma，NB)属于内分泌性肿瘤，是儿童时期非中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性实体性肿瘤，约占全部儿童肿瘤的8％-10％。其典型临床表现为发热、凸眼、眼周瘀斑、骨痛和腹部肿物等[1]；少部分NB患儿是以其它系统典型病症为首发表现的，如急性小脑共济失调、过敏性紫癜和原发性血小板减少性紫癜等，称为副肿瘤综合征。
嗜铬细胞瘤是一类起源于神经外胚层嗜铬组织的内分泌肿瘤，其主要特征是分泌大量的儿茶酚胺，典型的临床症状为“头痛、心悸和出汗”以及继发性高血压[2-3]。患者会因为长期的高血压导致严重的心、脑、肾损伤或者因突发急性严重高血压导致死亡[4]。
儿茶酚胺是一类由神经组织(包括大脑)和肾上腺制成的化学物质[2]。主要类型有多巴胺(Dopamine，DA)，去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)和肾上腺素(Epinephrine，EP)。其代谢物主要有变肾上腺素(Metanephrine，MN)、去甲变肾上腺素(Normetanephrine，NMN)、高香草酸(Homovanillic acid，HVA)和香草扁桃酸(Vanillmandelic acid，VMA)。高浓度的儿茶酚胺及其代谢物可能意味着内分泌肿瘤的存在[2]。其中，香草扁桃酸和高香草酸的测定，用于筛查儿童神经母细胞瘤和其他神经嵴肿瘤，并监测接受过这些肿瘤治疗的儿童。超过90％的神经母细胞瘤患者香草扁桃酸和高香草酸升高。
香草扁桃酸和高香草酸在分泌儿茶酚胺的肿瘤(如神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤和其他神经嵴肿瘤)患者中通常会升高。香草扁桃酸和高香草酸水平也可用于监测患上述疾病而接受治疗的患者。儿茶酚胺代谢紊乱时高香草酸水平也可能改变；单胺氧化酶A缺乏症可导致尿高香草酸值下降。目前尿液中的高香草酸和香草扁桃酸的检测是筛查神经母细胞瘤的金标准。
5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)是血清素的主要代谢物，通过尿液排出。肠道类癌和神经内分泌肿瘤可产生过量的5-羟吲哚乙酸，尤其是在类癌综合征患者中。类癌综合征的特征是类癌肿瘤、脸红、心脏病和肝肿大。24小时尿标本中5-HIAA的测定具有较高的特异性，可诊断类癌。
目前，高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸的检测方法的主要为免疫组化学检查、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。免疫法通过显微镜下观察细胞形状及排列进行鉴别诊断。高效液相色谱法由于其方法本身和检测器的限制，仅能够针对一种或几种分析物的测定，且方法本身的检测限较高，无法对含量极低的分析物进行准确定量。而液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)可以同时对尿液中不同分析物进行精准的定量，满足对临床和健康方面对神经母细胞瘤等内分泌疾病的筛查，具有高通量、快速、低成本的特点[5-9]。因此在临床和健康筛查及科研领域具有极高的应用价值。
基于尿液样本采集方便，成本低，故开发一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及其试剂盒具有重要的现实意义。
参考文献：
[1]Nakala K,Ito Y,Magadi W etal.Childhood cancar incidence andsurvival in Japan and England:A population-based sturd(1993-2010).Cancer Sci,2018,109:422-434.
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[8]M.Peitzsch et al.,‘Simultaneous liquid chromatography tandem massspectrometric determination of urinary free metanephrines and catecholamines,with comparisons of free and deconjugated metabolites’,Clin.Chim.Acta,vol.418,pp.50–58,Mar.2013.
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发明内容
本发明的目的是提供一种快速同时检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及其专用试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所提供的一种快速同时检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法，包括下述步骤
1)配制样本稀释工作液：将内标稀释液母液使用超纯水稀释50倍即可；
2)样本预处理：在避光条件下，取尿液样本并向其中加入EDTA溶液、Na2S2O3溶液以及乙酸进行酸化，混合均匀得到待测尿液样本；
3)样本处理：取待测尿液样本、校准品、尿液质控品各10μL，加入至各自对应的96深孔板内，然后每孔分别加入190μL样本稀释工作液，封膜，涡旋、离心，取上清液采用液相色谱-质谱进行检测；
其中，所述内标稀释液母液为含氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品和氘代肌酐标准品的甲醇溶液；其中，氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品和氘代5-羟基吲哚乙酸标准品的浓度均为100μg/ml，氘代肌酐标准品的浓度为1ug/ml。
具体的，所述氘代香草扁桃酸标准品为香草扁桃酸-D3、氘代高香草酸标准品为高香草酸-D5、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品为5-羟基吲哚乙酸-D5、氘代肌酐标准品为肌酐-D3。
所述校准品为人工尿液样品；其组成为人工尿液、香草扁桃酸标准品、高香草酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品、肌酐标准品。
高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的校准品为若干个人工尿液样品，每个人工尿液样品中都同时含有高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品，并且若干个人工尿液样品中的各标准品形成梯度浓度；高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的校准品用于绘制标准曲线，以便于定量分析检测，其中各标准品形成梯度浓度，例如在7个人工尿液样品中高香草酸标准品以2倍、5倍或10倍的梯度浓度存在于各人工尿液样本，梯度浓度可以使成倍的浓度递增或递减，也可以是等比或其他方式递增或递减，梯度浓度的范围以最低浓度和最高浓度能够覆盖有效范围为准，在此不做具体限定；本申请中，若干个人工尿液样品，其具体数量可以根据所需要的浓度梯度范围而定；对于相同的浓度梯度范围，人工尿液样品数量越多，即相邻浓度梯度的差越小，或者说单位梯度内人工尿液样品数量越多，则制备的标准曲线越准确，可以理解，标准曲线是以各浓度梯度的人工尿液样品的检测值为点进行拟合得到的曲线，检测值越多拟合曲线就越接近真实情况，但是相应的成本也会增加，因此一般本申请6-8个浓度梯度的人工尿液样品即可满足检测需求。
如可设置Cal1-Cal7七个人工尿液样品；其中Cal1人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为0.5μg/ml、香草扁桃酸的浓度为0.5μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为0.5μg/ml、肌酐的浓度为0.1mg/ml；Cal2人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为1.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为1.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为1.0μg/ml、肌酐的浓度为0.2mg/ml；Cal3人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为2.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为2.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为2.0μg/ml、肌酐的浓度为0.4mg/ml；Cal4人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为5.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为5.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为5.0μg/ml、肌酐的浓度为1.0mg/ml；Cal5人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为10.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为10.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为10.0μg/ml、肌酐的浓度为2.0mg/ml；Cal6人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为25.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为25.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为25.0μg/ml、肌酐的浓度为5mg/ml；Cal7人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为50.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为50.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为50.0μg/ml、肌酐的浓度为10.0mg/ml。
所述尿液质控品，包括高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为正常浓度的人工尿液样品和高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为异常浓度的人工尿液样品。
所述正常浓度和异常浓度均为向人工尿液中额外添加标准品后使其浓度达到正常人群和患病人群中相应指标的的检测平均浓度。
正常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为1.2-1.8μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、肌酐标准品浓度为0.88-1.32mg/ml；
异常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为12-18μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为11.2-16.8μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为20-30μg/ml、肌酐标准品浓度为1.68-2.52mg/ml；
其中，正常浓度人工尿液样品是比对健康人群而言，其正常尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；异常浓度人工尿液样品是比对患病人群的尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；一般来说，作为尿液高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐质控品，正常浓度人工尿液样品和异常浓度人工尿液样品中，各标准品都采用其平均浓度，例如本申请的一种实现方式中，正常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品的浓度为1.5μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为3.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为3.0μg/ml、肌酐标准品浓度为1.1mg/ml；异常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品的浓度为15μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为14μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为25μg/ml、肌酐标准品浓度为2.1mg/ml。
本发明中所述人工尿液的配制方法如下：
称取氯化钠4.6g，硫酸钠2.3g，柠檬酸钠0.65g，草酸钠0.02g，磷酸二氢钾2.8g，磷酸氢二钠1.4g，氯化钾1.6g，氯化铵1g，尿素25g，抗坏血酸1g，加入7.5ml50％乙酸，用纯水定容至1L即可。
上述方法步骤2)中，对尿液样本没有严格的要求，既可以是24小时尿液样本类型，也可以是随机尿液样本类型。当样本类型为随机尿液时，定量时需要使用尿肌酐值归一化。
上述方法步骤2)中所述EDTA溶液和Na2S2O3溶液在加入尿液样本后的最终浓度均为25mg/mL；
所述尿液样本、EDTA溶液、Na2S2O3溶液、乙酸的配比依次为10mL：100μL：100μL：80μL。
上述方法步骤2)中样本预处理后，若不直接进行测定，可混匀后于4℃条件下储存，使用前20000g，4℃离心10min即可。
上述方法步骤3)中，所述涡旋的时间可为1分钟；所述离心的条件为：4000rpm，4℃离心1分钟。
上述方法步骤3)中，所述液相色谱-质谱的条件如下：
色谱条件：
流动相，包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由去离子水和甲酸组成，两者体积比为1000:1；
所述流动相B由甲醇和甲酸组成，两者体积比为1000:1；
超高效液相色谱：Waters ACQUITY i-class UPLC液相系统
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(2.1mm×50mm)
柱温：45℃样品池温度：8℃进样体积：5.0μL；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序如下：
质谱条件：
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI+
离子源参数：Capillary Voltage(毛细管电压)：1.2kV；DesolvationTemperature(脱溶剂温度)：550℃；Cone Gas(锥孔气流速)：150L/Hour；Desolvation Gas(脱溶剂气流速)：900L/Hour
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI-
离子源参数：Capillary Voltage(毛细管电压)：1.2kV；DesolvationTemperature(脱溶剂温度)：550℃；Cone Gas(锥孔气流速)：150L/Hour；Desolvation Gas(脱溶剂气流速)：900L/Hour
扫描方式：多重反应监测(MRM)。
本发明方法测定的人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的质谱信息如下：
高香草酸：保留时间为1.86分钟；定量离子对(M/Z)181.0742>122.0678；
香草扁桃酸：保留时间为0.83分钟；定量离子对(M/Z)197.0742>138；
5-羟基吲哚乙酸：保留时间为1.65分钟；定量离子对(M/Z)190.1481>146.03；
肌酐：保留时间为0.26分钟；定量离子对(M/Z)113.96>43.91。
所述方法还进一步包括对高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸进行定量的步骤。
具体如下：
肌酐归一化法的计算方法如下：把肌酐作为待测目标物之一，得到香草扁桃酸、高香草酸及5羟基吲哚乙酸的浓度值后，与肌酐值做比，进行归一化计算。
本发明还提供了一种快速同时检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括独立包装的下述组分：
(a)校准品；
(b)尿液质控品；
(c)仪器质控品；
(d)内标稀释液母液；
其中，所述校准品为人工尿液样品；一共有七支，依序为Cal1-Cal7，每支规格为50μL；
其中Cal1人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为0.5μg/ml、香草扁桃酸的浓度为0.5μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为0.5μg/ml、肌酐的浓度为0.1mg/ml；Cal2人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为1.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为1.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为1.0μg/ml、肌酐的浓度为0.2mg/ml；Cal3人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为2.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为2.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为2.0μg/ml、肌酐的浓度为0.4mg/ml；Cal4人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为5.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为5.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为5.0μg/ml、肌酐的浓度为1.0mg/ml；Cal5人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为10.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为10.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为10.0μg/ml、肌酐的浓度为2.0mg/ml；Cal6人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为25.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为25.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为25.0μg/ml、肌酐的浓度为5mg/ml；Cal7人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为50.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为50.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为50.0μg/ml、肌酐的浓度为10.0mg/ml。
所述尿液质控品，包括高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为正常浓度的人工尿液样品和高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为异常浓度的人工尿液样品。规格为200μL/支。
所谓正常浓度和异常浓度均为额外添加标准品后使其浓度达到正常人群和患病人群中相应指标的的检测平均浓度。
正常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为1.2-1.8μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、肌酐标准品浓度为0.88-1.32mg/ml；
异常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为12-18μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为11.2-16.8μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为20-30μg/ml、肌酐标准品浓度为1.68-2.52mg/ml；
其中，正常浓度人工尿液样品是比对健康人群而言，其正常尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；异常浓度人工尿液样品是比对患病人群的尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；一般来说，作为尿液高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐质控品，正常浓度人工尿液样品和异常浓度人工尿液样品中，各标准品都采用其平均浓度，例如本申请的一种实现方式中，正常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品的浓度为1.5μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为3.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为3.0μg/ml、肌酐标准品浓度为1.1mg/ml；异常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品的浓度为15μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为14μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为25μg/ml、肌酐标准品浓度为2.1mg/ml。
所述仪器质控品为含香草扁桃酸、高香草酸及5-羟基吲哚乙酸的溶液；其中香草扁桃酸、高香草酸及5-羟基吲哚乙酸浓度均为2μg/ml，所述溶液中的溶剂为含体积分数0.1％甲酸和1mg/ml抗坏血酸的20％甲醇-水溶液。其规格可为150μL/支。
上述仪器质控品用于评估仪器检测运行是否平稳，即检测质控品中各个分析物浓度的波动范围，可用变异系数CV表示，CV＝标准偏差/均值，CV％≤15％表示方法稳定，数据采集可靠。
所述内标稀释液母液为含氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品和氘代肌酐标准品的甲醇溶液；其中，氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品和氘代5-羟基吲哚乙酸标准品的浓度均为100μg/ml，氘代肌酐标准品的浓度为1ug/ml。其规格可为2mL/支。
具体的，所述氘代香草扁桃酸标准品为香草扁桃酸-D3、氘代高香草酸标准品为高香草酸-D5、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品为5-羟基吲哚乙酸-D5、氘代肌酐标准品为肌酐-D3。
进一步的，所述试剂盒中还可包括(e)流动相添加剂，其为甲酸。规格可为1.5mL/支。
进一步的，本发明所述的试剂盒中还包括96孔板(如350μL 96孔板)、热封铝膜和操作说明书中的至少一种。
需要说明的是，350μL 96孔板和热封铝膜可以选择性的加入试剂盒中，以方便检测使用，也可以单独另行购置。
操作说明书实际上就是按照本发明记载的方法和实施例中记载的内容所编写的试验操作步骤。
本发明还保护上述试剂盒的应用。
所述应用为下述至少一种：
1)所述试剂盒在同时检测高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐中的应用；
2)所述试剂盒在辅助筛查内分泌疾病和/或类癌综合征中的应用。
其中，所述内分泌疾病主要为内分泌肿瘤，优选的为神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤。
本发明还保护上述试剂盒中所述校准品和/或所述尿液质控品和/或所述仪器质控品和/或所述内标稀释液母液在制备辅助筛查内分泌疾病和/或类癌综合征的试剂盒中的应用或在制备同时检测高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种基于液相色谱串联质谱法的高通量、快速且精准的检测人尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及试剂盒。采用该试剂盒对尿液样本前处理过程简单，处理后的尿液直接稀释即可进行测定，在样本分析阶段使用液相色谱串联质谱分析技术，能够快速、同时定量尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐，具有高通量、高时效的特点。另外，无需采用额外的方法去检测肌酐。弥补了现有技术无法同时测定尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的不足。
本发明的检测方法用于液相色谱串联质谱检测，在检测随机尿液制备而成的尿液样本时，仅需10μL尿液样本就可以一次性定量高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐，且前处理方法简单快捷，节省了操作时间，根据这些指标能够有效的筛查和诊断人体中的神经母细胞瘤，类癌，辅助筛查嗜铬细胞瘤等。
附图说明
图1为实施例1校准品中香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、人尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐快速检测试剂盒
本实施例提供的试剂盒的快速检测指标包括：香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)和肌酐(Cr)，其中肌酐用量作为随机尿的归一化。
该快速检测试剂盒内容包括：
该试剂盒中Set A于常温保存，Set B于-18℃以下温度保存。
其中，校准品：校准品一共有七支，依序为Cal1-Cal7，每支50μL，校准品为人工尿液样品；其中Cal1人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为0.5μg/ml、香草扁桃酸的浓度为0.5μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为0.5μg/ml、肌酐的浓度为0.1mg/ml；Cal2人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为1.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为1.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为1.0μg/ml、肌酐的浓度为0.2mg/ml；Cal3人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为2.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为2.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为2.0μg/ml、肌酐的浓度为0.4mg/ml；Cal4人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为5.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为5.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为5.0μg/ml、肌酐的浓度为1.0mg/ml；Cal5人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为10.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为10.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为10.0μg/ml、肌酐的浓度为2.0mg/ml；Cal6人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为25.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为25.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为25.0μg/ml、肌酐的浓度为5mg/ml；Cal7人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为50.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为50.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为50.0μg/ml、肌酐的浓度为10.0mg/ml。
高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的校准品为若干个人工尿液样品，每个人工尿液样品中都同时含有高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品，并且若干个人工尿液样品中的个标准品形成梯度浓度；高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的校准品用于绘制标准曲线，以便于定量分析检测，其中各标准品形成梯度浓度，例如在7个人工尿液样品中高香草酸标准品以2倍、5倍或10倍的梯度浓度存在于各人工尿液样本，梯度浓度可以使成倍的浓度递增或递减，也可以是等比或其他方式递增或递减，梯度浓度的范围以最低浓度和最高浓度能够覆盖有效范围为准，在此不做具体限定；本申请中，若干个人工尿液样品，其具体数量可以根据所需要的浓度梯度范围而定；对于相同的浓度梯度范围，人工尿液样品数量越多，即相邻浓度梯度的差越小，或者说单位梯度内人工尿液样品数量越多，则制备的标准曲线越准确，可以理解，标准曲线是以各浓度梯度的人工尿液样品的检测值为点进行拟合得到的曲线，检测值越多拟合曲线就越接近真实情况，但是相应的成本也会增加，因此一般本申请6-8个浓度梯度的人工尿液样品即可满足检测需求。
尿液质控品：包括高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为正常浓度的人工尿液质控品和高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐为异常浓度的人工尿液质控品；
所述正常浓度和异常浓度均为额外添加上述4种标准品后使其浓度达到正常人群和患病人群中相应指标的的检测平均浓度。
正常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品浓度为1.2-1.8μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、肌酐标准品浓度为0.88-1.32mg/ml；
异常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品浓度为12-18μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为11.2-16.8μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为20-30μg/ml、肌酐标准品浓度为1.68-2.52mg/ml；
其中，正常浓度人工尿液质控品是比对健康人群而言，其正常尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；异常浓度人工尿液样品是比对患病人群的尿液中的高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的浓度；一般来说，作为尿液高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐质控品，正常浓度人工尿液质控品和异常浓度人工尿液质控品中，各标准品都采用其平均浓度，例如本申请的一种实现方式中，正常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品的浓度为1.5μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为3.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为3.0μg/ml、肌酐标准品浓度为1.1mg/ml；异常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品的浓度为15μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为14μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为25μg/ml、肌酐标准品浓度为2.1mg/ml。
仪器质控品：150μL/支，其中香草扁桃酸、高香草酸及5-羟基吲哚乙酸浓度均为2μg/ml，溶剂为含体积分数0.1％甲酸和1mg/ml抗坏血酸的20％甲醇-水溶液。
内标稀释液母液：含氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品和氘代肌酐标准品的甲醇溶液，规格为2mL/支，其中氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品浓度均为100μg/ml，氘代肌酐标准品浓度为1μg/ml，溶剂是甲醇。
流动相添加剂：甲酸；
利用上述试剂盒检测尿液中目标物质的主要步骤如下：
(1)工作液配置：将内标稀释液母液使用超纯水稀释50倍，配制样本稀释工作液；
(2)样本收集保存：避光，取尿液样本10mL，分别加入100μL 25mg/mL的EDTA溶液、100μL 25mg/mL的Na2S2O3溶液，再加入80μL乙酸酸化。涡旋混匀储存于4℃，待用；使用前20000g，4℃离心10min；
(3)样本处理：取待测尿液样本、7种校准品、正常浓度的人工尿液质控品、异常浓度的人工尿液质控品各10μL至对应的96深孔板内，然后每孔分别加入190μL样本稀释液工作液。封膜，涡旋1分钟，4000rpm，4℃离心1分钟，待检测。
(4)质谱上机检测：
配制流动相A：500mL去离子水+0.5mL流动相添加剂(甲酸)
配制流动相B：500mL甲醇+0.5mL流动相添加剂(甲酸)
取仪器质控品100μL，加100μL去离子水，混合均匀，上机检测系统的适配性。
(5)色谱条件：
超高效液相色谱：Waters ACQUITY i-class UPLC液相系统
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(2.1mm×50mm)
柱温：45℃样品池温度：8℃进样体积：5.0μL
洗脱梯度表：
(6)质谱条件：
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI+
离子源参数：Capillary Voltage(毛细管电压)：1.2kV；DesolvationTemperature(脱溶剂温度)：550℃；Cone Gas(锥孔气流速)：150L/Hour；Desolvation Gas(脱溶剂气流速)：900L/Hour
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI-
离子源参数：Capillary Voltage(毛细管电压)：1.2kV；DesolvationTemperature(脱溶剂温度)：550℃；Cone Gas(锥孔气流速)：150L/Hour；Desolvation Gas(脱溶剂气流速)：900L/Hour
扫描方式：多重反应监测(MRM)
离子对信息：*为定量离子对
(7)定量结果报告：根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度。
根据本发明，只要使用本发明的试剂盒进行检测即可实现本发明的目的，上述步骤的具体操作应全部都在避光条件下进行，尽可能避免分析物在光照下的降解。
本发明提供的试剂盒中，还可以进一步包含甲醇、水和色谱柱等，本领域技术人员会对此类耗材进行选择，在此不再多加赘述。
具体测定实例：
对采集的183例健康人群尿液样本进行了尿液中香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的检测。
首先对质控品进行了检测，以评估方法是否稳定，即检测质控品中各个分析物浓度的波动范围，用变异系数CV表示，CV＝标准偏差/均值，CV％≤15％表示方法稳定，数据采集可靠。在一天内对质控品进行批次1、批次2、批间检测，计算各分析物浓度的CV值，结果如表1所示。图1为校准品中香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的色谱图。
表1质控品中香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸和肌酐的CV％
| 分析化合物 | 批次1(n＝12) | 批次2(n＝12) | 批间(n＝24) |
| 香草扁桃酸 | 6.66％ | 6.56％ | 6.07％ |
| 高香草酸 | 8.54％ | 2.64％ | 4.34％ |
| 5-羟基吲哚乙酸 | 7.15％ | 6.94％ | 3.60％ |
| 肌酐 | 4.49％ | 2.47％ | 3.34％ |
注：n为重复次数。每15个样本后接1个质控样本。
表1结果显示，各分析物的CV值都小于15％，表明本发的测定方法稳定，采集数据良好，可以用于上述物质检测。
按照本实施例提供的试剂盒的使用方法，对183例尿液样本进行了检测，结果见表2。
表2 183例人尿液样本中香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸检测值(经肌酐归一化)(单位：mg/g)
| 香草扁桃酸 | 高香草酸 | 5-羟基吲哚乙酸 | |
| 尿液样本 | 5.26±2.05 | 3.76±2.46 | 3.28±2.15 |
其中，肌酐归一化法的计算方法如下：把肌酐作为待测目标物之一，得到香草扁桃酸、高香草酸及5羟基吲哚乙酸的浓度值后，与肌酐值做比，进行归一化计算。由于采集尿液样本为随机尿液，将样本检测的各个分析物的浓度值与尿液中肌酐的浓度值做比值后即可得到香草扁桃酸、高香草酸、5-羟基吲哚乙酸的肌酐归一化结果。该结果符合临床对健康人群的参考范围要求。
Claims (10)
1.一种快速同时检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法，包括下述步骤：
1)配制样本稀释工作液：将内标稀释液母液使用超纯水稀释得到；
2)样本预处理：在避光条件下，取尿液样本并向其中加入EDTA溶液、Na2S2O3溶液以及乙酸进行酸化，混合均匀得到待测尿液样本；
3)样本处理：取待测尿液样本、校准品、尿液质控品各10μL，加入至各自对应的96深孔板内，然后每孔分别加入190μL样本稀释工作液，封膜，涡旋、离心，取上清液采用液相色谱-质谱进行检测；
其中，所述内标稀释液母液为含氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品和氘代肌酐标准品的甲醇溶液；
所述校准品为人工尿液样品；其组成为人工尿液、香草扁桃酸标准品、高香草酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品；
所述尿液质控品，包括高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品为正常浓度的人工尿液样品和高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品为异常浓度的人工尿液样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤1)中，所述稀释的倍数为50倍；
其中，所述内标稀释液母液中所述氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品和氘代5-羟基吲哚乙酸标准品的浓度均为100μg/ml，氘代肌酐标准品的浓度为1ug/ml；
所述氘代香草扁桃酸标准品为香草扁桃酸-D3、氘代高香草酸标准品为高香草酸-D5、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品为5-羟基吲哚乙酸-D5、氘代肌酐标准品为肌酐-D3。
所述校准品为Cal1-Cal7七个人工尿液样品；其中Cal1人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为0.5μg/ml、香草扁桃酸的浓度为0.5μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为0.5μg/ml、肌酐的浓度为0.1mg/ml；Cal2人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为1.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为1.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为1.0μg/ml、肌酐的浓度为0.2mg/ml；Cal3人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为2.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为2.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为2.0μg/ml、肌酐的浓度为0.4mg/ml；Cal4人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为5.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为5.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为5.0μg/ml、肌酐的浓度为1.0mg/ml；Cal5人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为10.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为10.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为10.0μg/ml、肌酐的浓度为2.0mg/ml；Cal6人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为25.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为25.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为25.0μg/ml、肌酐的浓度为5mg/ml；Cal7人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为50.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为50.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为50.0μg/ml、肌酐的浓度为10.0mg/ml；
所述正常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为1.2-1.8μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、肌酐标准品浓度为0.88-1.32mg/ml；
所述异常浓度人工尿液样品中，高香草酸标准品浓度为12-18μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为11.2-16.8μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为20-30μg/ml、肌酐标准品浓度为1.68-2.52mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中所述EDTA和Na2S2O3在加入尿液样本后的最终浓度均为25mg/mL；
所述尿液样本、EDTA溶液、Na2S2O3溶液、乙酸的配比依次为10mL：100μL：100μL：80μL；
所述步骤3)中，所述涡旋的时间为1分钟；所述离心的条件为：4000rpm，4℃离心1分钟。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述液相色谱-质谱的条件如下：
液相色谱条件：
流动相，包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由去离子水和甲酸组成，两者体积比为1000:1；
所述流动相B由甲醇和甲酸组成，两者体积比为1000:1；
超高效液相色谱：Waters ACQUITY i-class UPLC液相系统
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序如下：
质谱条件：
扫描方式：多重反应监测MRM；
所述高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的质谱信息如下：
高香草酸：保留时间为1.86分钟；定量离子对(M/Z)181.0742>122.0678；
香草扁桃酸：保留时间为0.83分钟；定量离子对(M/Z)197.0742>138；
5-羟基吲哚乙酸：保留时间为1.65分钟；定量离子对(M/Z)190.1481>146.03；
肌酐：保留时间为0.26分钟；定量离子对(M/Z)113.96>43.91。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述液相色谱条件中，色谱柱：ACQUITYUPLC HSS T3 1.8um，规格：2.1mm×50mm；柱温：45℃；样品池温度：8℃进样体积：5.0μL；
所述质谱条件为：
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI+
离子源参数：毛细管电压：1.2kV；脱溶剂温度：550℃；锥孔气流速：150L/Hour；脱溶剂气流速：900L/Hour；
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI-
离子源参数：毛细管电压：1.2kV；脱溶剂温度：550℃；锥孔气流速：150L/Hour；脱溶剂气流速：900L/Hour。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括采用肌酐归一化法对高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸进行定量的步骤；
计算方法如下：把肌酐作为待测目标物之一，得到香草扁桃酸、高香草酸及5羟基吲哚乙酸的浓度值后，与肌酐值做比，进行归一化计算。
7.一种快速同时检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的试剂盒，包括独立包装的下述组分：
(a)校准品；
(b)尿液质控品；
(c)仪器质控品；
(d)内标稀释液母液；
其中，所述校准品为人工尿液样品；其组成为人工尿液、香草扁桃酸标准品、高香草酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品；
所述尿液质控品，包括高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品为正常浓度的人工尿液样品和高香草酸标准品、香草扁桃酸标准品、5-羟基吲哚乙酸标准品和肌酐标准品为异常浓度的人工尿液样品；所述正常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品浓度为1.2-1.8μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为2.4-3.6μg/ml、肌酐标准品浓度为0.88-1.32mg/ml；
所述异常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品浓度为12-18μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为11.2-16.8μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准品浓度为20-30μg/ml、肌酐标准品浓度为1.68-2.52mg/ml；
所述仪器质控品为含香草扁桃酸、高香草酸及5-羟基吲哚乙酸的溶液；其中香草扁桃酸、高香草酸及5-羟基吲哚乙酸浓度均为2μg/ml，所述溶液中的溶剂为含体积分数0.1％甲酸和1mg/ml抗坏血酸的20％甲醇-水溶液；
所述内标稀释液母液为含氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品、氘代5-羟基吲哚乙酸标准品和氘代肌酐标准品的甲醇溶液；其中，氘代香草扁桃酸标准品、氘代高香草酸标准品和氘代5-羟基吲哚乙酸标准品的浓度均为100μg/ml，氘代肌酐标准品的浓度为1ug/ml。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述校准品共有七支，依序为Cal1-Cal7，每支规格为50μL；
其中Cal1人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为0.5μg/ml、香草扁桃酸的浓度为0.5μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为0.5μg/ml、肌酐的浓度为0.1mg/ml；Cal2人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为1.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为1.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为1.0μg/ml、肌酐的浓度为0.2mg/ml；Cal3人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为2.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为2.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为2.0μg/ml、肌酐的浓度为0.4mg/ml；Cal4人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为5.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为5.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为5.0μg/ml、肌酐的浓度为1.0mg/ml；Cal5人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为10.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为10.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为10.0μg/ml、肌酐的浓度为2.0mg/ml；Cal6人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为25.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为25.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为25.0μg/ml、肌酐的浓度为5mg/ml；Cal7人工尿液样品中高香草酸标准品的浓度为50.0μg/ml、香草扁桃酸的浓度为50.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸的浓度为50.0μg/ml、肌酐的浓度为10.0mg/ml；
所述尿液质控品中，所述正常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品的浓度为1.5μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为3.0μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为3.0μg/ml、肌酐标准品浓度为1.1mg/ml；所述异常浓度人工尿液质控品中，高香草酸标准品的浓度为15μg/ml、香草扁桃酸标准品浓度为14μg/ml、5-羟基吲哚乙酸标准浓度为25μg/ml、肌酐标准品浓度为2.1mg/ml；规格为200μL/支；
所述仪器质控品的规格为150μL/支；
所述内标稀释液母液的规格为2mL/支；
所述试剂盒中还包括(e)流动相添加剂，其为甲酸；规格为1.5mL/支；
和/或，所述试剂盒中还包括96孔板、热封铝膜和操作说明书中的至少一种。
9.权利要求7或8所述试剂盒在下述至少一方面中的的应用：
1)所述试剂盒在同时检测高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐中的应用；
2)所述试剂盒在辅助筛查内分泌疾病和/或类癌综合征中的应用。
10.权利要求7或8所述试剂盒中的所述校准品和/或所述尿液质控品和/或所述仪器质控品和/或所述内标稀释液母液在制备试剂盒中的应用，
所述试剂盒为辅助筛查内分泌疾病和/或类癌综合征的试剂盒；或所述试剂盒为同时检测高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的试剂盒。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN116148387A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-05-23 | 杭州佰辰医疗器械有限公司 | 一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒 |
| CN117288820A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-26 | 天津大学 | 一种基于物联网通信的三工电化学传感系统及方法 |
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