CN117491639A - 原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统 - Google Patents
原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统,通过采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠进行样本前处理,并优化工艺条件,再经液相色谱‑串联质谱一次性精确检测样本中的醛固酮等5种标志物含量,找到最合适的筛查切点值20.4;判断为阳性时,再根据标志物检测值进行PA的确诊和分型,从而实现同一平台、同时检测醛固酮等5种标志物含量,集筛查、确诊和分型诊断功能为一体,为临床医生制定有效的治疗方案提供可靠的实验室检查依据。
Description
本申请为申请号为202210819638.2,申请日为2022年7月13日,发明名称为“原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统”的分案申请。
技术领域
本发明涉及医学诊断领域,具体的说是涉及到原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统。
背景技术
原发性醛固酮增多症(Primary Aldosteronism,PA)是由于肾上腺自主分泌过多醛固酮,而导致体内潴钠排钾,血容量增多,肾素-血管紧张素系统活性受到抑制,临床上表现为高血压伴或不伴低血钾。根据国内最新研究显示PA在新诊断高血压中的发生率超过4%,在难治性高血压人群中为17~23%。与原发性高血压患者相比,PA患者发生动脉粥样硬化、心肌梗死、周围血管疾病、中风和慢性肾脏损害的风险更高,且容易漏诊和误诊,因此早期诊断、早期治疗至关重要。醛固酮瘤(APA)和双侧特发性醛固酮增多症(IHA)是PA最常见的两种形式,前者可通过肾上腺手术治愈,并改善动脉高血压;对于拒绝或不适合手术的患者,药物干预是一种有效的选择。
PA的诊断包括筛查、确诊和分型诊断。醛固酮/肾素活性(ARR)是PA的首选筛查指标。对于筛查阳性患者可以通过口服高钠饮食、氟氢可的松试验(FST)、生理盐水试验(SIT)或卡托普利试验(CCT)进行确诊,并通过肾上腺CT、肾上腺静脉取血(adrenal venoussampling,AVS)等方式区分单侧优势或双侧均势PA。其中,有以下几方面的原因会对PA的准确诊断存在干扰:
1)检测方法:
醛固酮/肾素活性(ARR)的检测是目前常用的PA生化检测指标,但是不同的检测方法会影响ARR检测值的准确性,尤其是醛固酮的定量结果,贯穿于筛查、诊断和分型诊断的全流程,目前醛固酮的测量主要有放射免疫法或化学发光法,虽然该方法快速且易于执行,但是这些方法均具有交叉反应性和实验室间可比性差等缺点。除了检验方法没有可比性和缺乏标准化之外,在肾功能损害的情况下,使用免疫法会导致醛固酮检测结果明显高估,IA显示中位阳性偏倚为127%,推测是因为抗体与未清除的醛固酮代谢物交叉反应。这种作用不仅限于终末期肾衰竭,而且在轻度或中度肾功能不全的患者中也以分级的方式发生。因此常常出现检测结果与临床表现不一致的现象,影响了临床医生对继发性高血压的病因筛查与鉴别诊断,甚至导致PA患者的误诊或漏诊。
2)治疗药物干扰
根据国内外指南推荐,醛固酮/肾素活性检测是筛查原发性醛固酮增多症的首选生化指标,但是人体的肾素-血管紧张素-醛固酮系统极易受到饮食、药物的影响,在进行筛查时需要停用常规降压药(如钙离子拮抗剂、血管紧张素酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、利尿剂等)4-6周,造成筛查结果的假阳性或假阴性,给临床开展筛查项目造成一定的困难。这在本申请人的在先申请的发明专利2021106374412中得到解决,如何来排除假阳性以及假阴性的药物干扰。
3)鉴别诊断
在内分泌性高血压的鉴别诊断中,往往也存在其他盐皮质激素过量而导致的高血压,与原发性醛固酮增多症存在相似临床症状,这在一定程度上给临床诊断带来了一定的干扰和困难。例如由遗传性或获得性(甘草摄入)11-βHSD酶抑制所引起的其他盐皮质激素增多引起的低肾素高血压;甘草消耗过量导致的假性醛固酮增多症;库欣综合征;DOC分泌瘤等。这些临床症状与PA相似,但并不是PA,从而为准确诊断PA造成了很多干扰。
因此急需找到更为准确的PA诊断、筛查、分型方面的试剂盒以及一体化的系统。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统,通过表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠对样本中待测物进行提取,再经液相色谱-串联质谱技术一次性检测样本中的醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮5种标志物含量,计算ARR值,并结合ARR的切点值20.4,和影响ARR的高血压治疗药物浓度来判断;判断为阳性时,再根据标志物的检测值进行PA分型,从而实现同一平台、同时检测醛固酮等5种标志物含量,建立PA筛查与确诊的临床切点,进行PA的准确诊断和分型,使继发于原醛的高血压患者在早期就能得到甄别与确诊,为临床医生制定有效的治疗干预措施治疗提供可靠的实验室检查依据。
一方面,本发明提供了一种原发性醛固酮增多症检测试剂盒,所述试剂盒包括活化剂、平衡液、淋洗液和洗脱液;所述活化剂为含有磁珠的溶液,所述磁珠的表面键合亲水亲脂平衡聚合物。所述磁珠用于吸附样品中的标志物,所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮中的任意一种或多种。
本发明通过对系列特异性标志物的准确血液含量的检测,为随后的筛查以及分型提供良好的基础。为了实现准确检测,首先需要对样本中的标志物进行准确提取,再配合后续的精确检测,才能真正反应血液样本中各个标志物的真实含量。
本发明所述标志物包括醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮共5种标志物。现有的原发性醛固酮增多症检测试剂盒最多只能通过检测3种标志物来进行原发性醛固酮增多症的诊断,本发明首次开创了通过5种标志物一步法检测来实现更准确的原发性醛固酮增多症的筛选、确诊和分型。
针对醛固酮、血管紧张素Ⅰ的检测,本课题组原先是采用分别前处理、单独进样的方式进行;在进行醛固酮、血管紧张素I及血管紧张素II三个指标的同步检测时,是采用96孔SPE板(Agela PEP 96Well Microplates)进行固相萃取柱萃取。在SPE板经活化及平衡后,将待测生物样品溶液上样至SPE板,固定相选择性提取吸附目标成分,通过淋洗将部分干扰成分洗掉,再利用与固定相结合能力更强的洗脱剂将目标组分从萃取柱洗脱,达到分离和净化的目的,其缺点是操作过程步骤较繁琐、耗时较长,包括活化、上样、淋洗、洗脱等步骤,单批样本处理耗时两小时左右,而且由于生物样本基质差异性,样本孔间提取效率差异较大,所有指标均需使用同位素内标进行校准;另外由于生物样本基质特异性,部分样本(尤其是溶血、脂血等样本)可能引致SPE柱堵塞,导致整批样本的前处理效率降低以及堵塞样本的复测。为了更进一步实现原醛病人分型诊断而增加新的检测指标18羟皮质酮及皮质醇后,由于18羟皮质酮的含量及质谱响应均较低,对前处理过程富集效率和净化效果提出了更高的要求。
因此,考虑采用分散固相萃取法进行样本处理,分散固相萃取将具有特定吸附选择性的固体吸附材料分散于生物样品溶液中,震荡混匀使样品溶液中的目标成分在液相和选择性吸附的固相之间达到平衡,根据固体吸附材料的选择性达到选择性吸附提取目标物的目的,其最主要的缺点是将固相与溶液分离的过程比较复杂。
为了进一步解决分散固相萃取法存在的固相与溶液分离过程太复杂的问题,本发明最终采用了具有特异提取吸附特性的磁珠来改进分散固相萃取的分离过程。通过磁珠特异性吸附待测目标物后,利用磁珠提取仪进行磁珠的提取及转移,快速高效地实现活化、淋洗、上样、洗脱、排废等步骤,克服前述萃取柱萃取和分散固相萃取缺点的同时,极大提高前处理自动化效率,有效减低了生物样本基质特异性可能引致的SPE柱堵塞等问题,降低生物样本质谱检测过程的基质效应,使样本前处理时间从两小时缩短到10分钟,还能提升低含量指标(醛固酮、18羟皮质酮)的提取效果,提高检测灵敏度。
另外对于固相萃取法来说,固定相表面键合不同特性的聚合物填料,对目标待测物的吸附和提取效果也存在较大影响。根据对于5种不同标志物分项单独进行检测的文献查询结果(混合型阴离子交换聚合物SPE可被用于血管紧张素检测的样本前处理过程),本发明先是比较了亲水亲脂平衡聚合物(Agela PEP 96Well Microplates)以及混合型阴离子交换聚合物(Agela Cleanert PAX 96Wellplates)填料键合的固相萃取柱,发现表面键合亲水亲脂平衡聚合物的固相萃取柱,对于5种标志物的提取效果均不低于混合型阴离子交换聚合物的固相萃取柱,尤其是对于含量较低的醛固酮和18羟皮质酮有较好的富集效果。同时还比较了表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠、键合混合型阴离子交换聚合物的磁珠、和键合混合型阳离子交换聚合物的磁珠,发现表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠对提高5种标志物的吸附效果具有明显优势。纠其原因,可能是亲水亲脂平衡聚合物不仅能够实现对大极性化合物的吸附,同时也能够对小极性化合物进行有效提取吸附,但阴离子及阳离子聚合物的吸附选择性更强,只能选择性实现对大极性阴离子或阳离子的吸附,难以同时兼顾对小极性化合物的吸附,导致醛固酮、18羟皮质酮等小分子的提取效率低下,无法达到临床检测的灵敏度要求。
采用磁珠方法,在表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠对5种标志物进行吸附之后,磁珠提取仪即可将吸附标志物的磁珠从生物样本基质中提取出来,有效剥离生物样本中的干扰成分。因此在经过磁珠提取富集之后,与固相萃取柱相比,磁珠提取的洗脱液中的成分更干净,检测过程中标志物受到的干扰影响更小,质谱离子化效率更高,能够达到更好的检测灵敏度。而且前处理过程可以实现高度自动化,单批样本前处理仅耗时10分钟左右。
综上,针对样本中5种标志物的提取,本发明采用一种新型的磁珠提取法,可以更加充分高效地一次性提取血液样本中的标志物。通过对磁珠进行筛选和前处理,采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物材料的磁珠,能够选择性吸附样本中理化特性差异巨大的5种标志物,从而实现其高效提取和精准检测。
进一步地,所述洗脱液为含有50%甲醇的水溶液。
表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠一次性完全吸附这些标志物后,需先进行洗涤,再对吸附的目的标志物进行洗脱,从而在血液样品的提取过程中得到各个标志物的含量。
本发明经研究证明,当在采用含有50%甲醇的水溶液作为洗脱液时,能实现对5种标志物的高效洗脱,从而提高检测结果的灵敏度,并可同时有效避免过高浓度的有机相含量引致的溶剂效应。
进一步地,所述淋洗液包括淋洗液1和淋洗液2,淋洗液1为10%甲醇水溶液,淋洗液2为异辛烷;活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液;所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒,颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A。
进一步地,还包括平衡液和液相色谱流动相,所述平衡液为1%甲酸水溶液;所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为含有流动相添加剂的水溶液,流动相B为含有流动相添加剂的甲醇溶液(含5%异丙醇),所述流动相添加剂为1mM氟化铵。
平衡液可以简单、快速地包裹表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠,从而完成磁珠活性的改良,而且此平衡液还可以包裹样品中的标志物,从而更加增加了磁珠与标志物的结合,极大地提高了磁珠的富集效果。
流动相中加入添加剂1mM氟化铵,能显著提高样品中标志物的检测灵敏度,尤其是低含量指标醛固酮的离子化效率。
另一方面,本发明提供了一种检测血液中的标志物的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理样品,吸附待测物;
(2)用洗脱液洗脱待测物,液相色谱串联质谱分析待测物中的标志物的含量;所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮中的任意一种或多种。
本发明采用高效液相色谱-串联质谱技术进行5种标志物的检测,高效液相色谱-串联质谱技术具有高灵敏度、高特异性等优势,可以实现在同一标准下多种临床指标的联合检测,减少了因不同检测系统之间差异造成的结果偏差,极大地提高了继发性高血压等内分泌相关疾病诊断的敏感性和特异性。
进一步地,步骤(1)所述样品需先经添加血管紧张素转换酶抑制剂(PMSF)的生成缓冲液在酸性条件进行孵育,孵育结束后加入反应终止液终止孵育,再采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理孵育后样品;所述生成缓冲液的pH值为5.5左右。
孵育过程中,在肾素活性的催化下,血浆样本中的血管紧张素原会转化成为血管紧张素I,并由于血管紧张素转换酶抑制剂PMSF的加入,阻断了血管紧张素I向血管紧张素II的转化,通过血管紧张素I的含量变化来计算肾素活性。
孵育过程样品pH值必须控制在合适范围,否则会严重影响肾素的催化活性,导致孵育后生成的血管紧张素I出现较大偏差。在非理想pH条件下,测得的肾素活性偏低,在采用醛固酮/肾素活性计算ARR时,导致假阳性结果。
在一些方式中,所述生成缓冲液的pH为5.4-5.6。
在一些方式中,所述孵育后样品的pH与样品配制的缓冲液、生成缓冲液、反应终止液、稀释液等等的pH相关。
进一步地,步骤(1)为用活化剂和平衡液依次处理的磁珠吸附样本,经淋洗液冲洗后再用洗脱液洗脱待测物;所述活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液,所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒,颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A;所述平衡液为1%甲酸水溶液;所述淋洗液包括淋洗液1和淋洗液2,淋洗液1为10%甲醇水溶液,淋洗液2为异辛烷。
进一步地,步骤(2)所述洗脱液为含有50%甲醇的水溶液;所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为含有流动相添加剂的水溶液,流动相B为含有流动相添加剂的甲醇溶液(含5%异丙醇),所述流动相添加剂为1mM氟化铵。
再一方面,本发明提供了一种原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统,所述系统包括标志物检测模块、数据输入/输出界面和数据分析模块;所述标志物检测模块用如上所述方法得到标志物的检测值,数据输入/输出界面用于输入至少一种标志物的检测值,数据分析模块用于分析标志物的检测值,所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮中的任意一种或多种;待数据分析模块分析后,数据输入/输出界面用于输出原发性醛固酮增多症的筛查和分型结果。
在现有的PA诊断过程中,醛固酮的定量检测贯穿于筛查、确诊和分型诊断。其中醛固酮和肾素活性是筛查PA的首选生化指标,确诊试验中主要依赖于醛固酮的定量结果,而分型诊断更是依赖于醛固酮和皮质醇的可靠测定。目前采用的是化学发光法或放射免疫法,尚无同一检测系统能在一个标准下同时检测。
本发明提供的系统通过高效液相色谱串联质谱同时检测5种标志物,然后完成PA筛查、确诊和分型诊断,整个过程更加高效,在诊断和鉴别原发性醛固酮增多症时具有灵敏度高、特异性好、可定量和定性干扰药物等优点,筛查、分型结果更加准确可靠。
进一步地,所述原发性醛固酮增多症的筛查和分型是指所述原发性醛固酮增多症的筛查和分型是指先根据醛固酮、肾素活性来计算ARR,并结合ARR的切点值20.4,和影响ARR的高血压治疗药物浓度来判断;判断为阳性时,再根据醛固酮、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮的检测值进行分型,所述肾素活性为单位时间内血管紧张素I的产生量。
现有技术中,ARR的切点值普遍认为是在30,而采用本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型系统时,需将ARR的切点值调整至20.4,研究证明,当ARR的切点值为20.4时,筛查、确诊和分型结果的灵敏度和特异性更高,分别为94.4%(95%CI:72.7~99.9)和87.2%(95% CI:72.6~95.7),Youden指数达到最大值(YI=0.82),曲线下面积(AUC)达0.956。
这主要是因为ARR值与醛固酮和肾素活性的检测灵敏度直接相关,过去醛固酮的检测普遍是通过化学免疫法进行检测,检测值偏高,从而导致ARR值的计算结果大于实际值,需要设置切点值为30才能较准确判断原发性醛固酮增多症是阳性还是阴性,而采用本发明提供的样品前处理(键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠提取)和检测方法(高效液相色谱串联质谱)时,检测结果能够更精准地反应醛固酮的试剂含量,因此ARR过去的切点值30已不能符合本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统,需将ARR的切点值调整至20.4,这样才能使筛查和分型结果的灵敏度更高,诊断结果更准确。
在一些方式中,所述ARR的计算公式为:ARR=醛固酮的浓度/肾素活性(血管紧张素Ⅰ产生速率);所述肾素活性,是通过检测孵育前样本和孵育后样本的血管紧张素Ⅰ浓度,按照公式计算:血管紧张素Ⅰ产生速率=(孵育后血管紧张素Ⅰ浓度-孵育前血管紧张素Ⅰ浓度)/孵育时间。
在一些方式中,由于孵育前血管紧张素Ⅰ浓度值非常低,基本可忽略不计。
在一些方式中,所述的结合影响ARR的高血压治疗药物浓度来判断,是为了排除药物干扰。临床上用于治疗高血压的药物有上百种,对PA的筛查与诊断会产生干扰的药物有血管紧张素转换酶(ACE)抑制药(如培哚普利、卡托普利等)、血管紧张素Ⅱ受体阻断药(如氯沙坦、坎地沙坦等)、钙离子拮抗剂、β首体阻滞剂、利尿剂等,这在本申请人的在先申请的发明专利2021106374412中得到解决,如何来排除假阳性以及假阴性的药物干扰。本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统需要结合发明专利2021106374412提供的方法来排除药物干扰。
再一方面,本发明提供了磁珠用于同时提取样本中的5种标志物的用途,所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇和18-羟皮质酮,所述磁珠的表面键合亲水亲脂平衡聚合物(博蕴生物HLB磁珠)。所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒,颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A。
本发明构建的原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统,具有以下有益效果:
1、通过表面键合亲水亲脂平衡聚合物硅胶的磁珠处理样本,更加完全地吸附样本中的5种标志物,从而实现准确提取和精准检测;
2、筛选和优化了磁珠提取工艺,通过调整样品pH,在洗脱液、液相色谱流动相中添加甲酸,并选取合适的活化剂、平衡液、淋洗液,极大地提高了磁珠富集和提取效果,实现对5种标志物的高效提取,从而时提取得到标志物的量更加接近样本中的真实含量,提高检测结果的准确性;
3、建立PA的筛查和分型诊断系统,在诊断和鉴别原发性醛固酮增多症时具有灵敏度高、特异性好、可定量和定性干扰药物等优点,筛查、确诊和分型结果更加准确可靠;
4、将ARR的切点值调整至20.4,使筛查和分型结果的灵敏度和特异性更高,分别为94.4%(95% CI:72.7~99.9)和87.2%(95% CI:72.6~95.7),Youden指数达到最大值(YI=0.82),曲线下面积(AUC)达0.956;
5、使继发于原醛的高血压患者在早期就能得到甄别与确诊,为临床医生制定有效的治疗干预措施治疗提供可靠的实验室检查依据。
详细说明
(1)诊断或者检测
这里的诊断或者检测是指对于样本中的生物标志物进行检测或者化验,或者目的生物标志物的含量,例如绝对含量或者相对含量,然后通过目标标志物是否存在或者数量的多少来说明提供样本的个体是否可能具有或患某种疾病,或者具有某种疾病的可能性。这里的诊断与检测的含义可以互换。这种检测的结果或者诊断的结果是不能直接作为患病的直接结果,而是一种中间结果,如果获得直接的结果,还需通过病理学或者解剖学等其它辅助手段才能确认患有某种疾病。例如,本发明提供了多种与原发性醛固酮增多症具有关联性的新的生物标志物,这些标志物的含量变化与是否患有原发性醛固酮增多症具有直接的关联性。
(2)标志物或生物标志物与PA的联系
标志物和生物标志物在本发明中具有相同的含义。这里的联系是指某种生物标志物在样本中出现或者含量的变化与特定疾病具有直接的关联性,例如含量的相对升高或者降低,表示这种患有这种疾病的可能性相对健康人员更高。
如果样本中多个不同的标志物同时出现或者含量的相对变化,表示这种患有这种疾病的可能性相对健康人员也更高。也就是说标志物种类中,某一些标志物与患病的关联性强,有些标志物与患病的关联性弱,或者有些甚至与某种特定的疾病无关联。对于那些关联性强的标志物中的一种或者多种,可以作为诊断疾病的标志物,与那些关联性弱的标志物可以与强的标志物组合来诊断某种疾病,增加检测结果的准确性。
针对本发明发现的血浆中的系列标志物与PA有着密切联系,可以通过高效液相串联质谱一次性检测该系列标志物,共同用于PA的筛查、确诊和分型诊断。
附图说明
图1为实施例1提供的样本中5种标志物的检测图谱;
图2为实施例10中的ARR切点值为20.4时的ROC曲线图。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明,下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。这些说明仅仅是表明本发明是如何实现的,并不能限定本发明的具体范围。本发明的范围在权利要求中限定。
实施例1:各个标志物的准确检测
一、配制溶液
校准品及质控品混合工作液的配制如表1所示:
表1、校准品及质控品混合工作液的配制
校准品的配制及浓度梯度如表2所示:
表2、标准品的配制
注:校准品配制基质为含有4% BSA的PBS(1X)缓冲溶液,2-8℃储存。
质控品的配制如表3所示:
表3、质控品的配制
注:质控品基质为血浆,配置完成后马上分装,并冷冻。
内标工作液的配制如表4所示:
表4、内标工作液的配制
其它溶液的配制:
苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液的配制:取0.174g PMSF加入10mL甲醇中,配制成为100mM的PMSF甲醇溶液,储存条件为2-8℃。
生成缓冲液:12.11g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和7.4g乙二胺四乙酸EDTA到100mL容量瓶中,加入去离子水到90mL,超声30min至溶解均匀。加入去离子水到刻度线,混匀。转移到聚丙烯材质的储存容器。用乙酸调节PH到5.45-5.60之间,-20℃储存。
生成缓冲液A:在检测分析当天配置,将100μL的100mM PMSF(血管紧张素转换酶抑制剂)溶液加入到10mL生成缓冲液中配制成为生成缓冲液A(pH值5.4-5.6)。
含内标的反应终止液:将1mL内标工作液与9mL水以及250μL甲酸混合成为含内标的反应终止液。
二、样品前处理
1.样本解冻:待测血浆样本及质控样本置于冰水(0℃)解冻至融化。
2.取样:96孔板中加入50μL生成缓冲液A,取400μL的校准品、质控品及待测样本质控样本至步骤(1)中准备好的两块板中,其余样本立即冷冻。
3.样本孵育:将步骤2中的样本用硅胶垫封好,短暂涡旋,然后放入37℃水浴3小时,3小时后,加入400μL含内标的反应终止液,并在4℃4000rpm离心1分钟,取上清液800μL,加入磁珠自动化提取仪,准备进行样本提取。
4.磁珠提取:采用磁珠提取仪适配96孔板中各列的添加试剂如表5所示:
表5、磁珠提取仪适配96孔板中各列的添加试剂
第1(7)列 | 第2(8)列 | 第2(9)列 | 第4(10)列 | 第5(11)列 | 第6(12)列 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
其中,磁珠为表面键合亲水亲脂平衡聚合物硅胶的磁珠磁珠(博蕴生物,货号BNMA7300001-0;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A),活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液,平衡液为含有1%甲酸的水溶液;淋洗液1为含有10%甲醇的水溶液,淋洗液2为异辛烷,洗脱液为含有50%甲醇的水溶液。
5.磁珠提取仪的样本前处理步骤如表6所示,每批次样本的前处理时间约十分钟。
表6、磁珠提取仪的样本前处理步骤
序号 | 指令 | 96孔板列 | 混合时间(S) | 溶剂量(ul) | 吸磁时间(S) |
1 | 活化 | 1(7) | 60 | 300 | 30 |
2 | 活化 | 2(8) | 60 | 300 | 30 |
3 | 上样 | 3(9) | 90 | 800 | 30 |
4 | 淋洗 | 4(10) | 60 | 300 | 30 |
5 | 淋洗 | 5(11) | 60 | 300 | 30 |
6 | 洗脱 | 6(12) | 60 | 100 | 30 |
7 | 排废 | 1(7) | 10 | 100 | 0 |
6.磁珠提取仪提取完成后,可将96孔板第6列及第12列的待测溶液转移至96孔上样板,上机检测。目前采用的磁珠提取仪单次可容纳两块96孔板平行操作,因此前处理通量为32样本/批次;也可以采用96通道磁珠提取仪,提取步骤维持不变。
三、样品的检测
进行液相色谱串联质谱分析时,液相色谱采用梯度洗脱,反相色谱法建立待测物的分离条件如下:色谱柱为Phenomenex C8色谱柱,流速为0.4mL/min,柱温为40℃;其中流动相A相为含有1mM氟化铵的水溶液,流动相B相为含有1mM氟化铵的甲醇溶液(含5%异丙醇),流动相A和流动相B的体积比为90~5%:10~95%。梯度洗脱程序如表7所示,
表7、梯度洗脱程序
时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 0.4 | 80 | 20 |
0.3 | 0.4 | 80 | 20 |
0.6 | 0.4 | 50 | 50 |
3.3 | 0.4 | 50 | 50 |
3.4 | 0.4 | 5 | 95 |
4.2 | 0.4 | 5 | 95 |
4.3 | 0.4 | 80 | 20 |
4.8 | 0.4 | 80 | 20 |
进行质谱检测时,采用三重四极杆质谱仪检测定量,仪器型号为凯莱谱自主研发的CalQuant-S,采用电喷雾离子源的正、负离子模式(ESI+)和多反应监测MRM模式进行质谱检测,相应的质谱检测方法设置如表8所示,质谱条件如表9所示:
表8、质谱检测方法
Q1 | Q3 | DWELL | ID | DP | CE | CXP |
433.1 | 619.2 | 30 | 血管紧张素Ⅰ-1 | 139 | 30 | 8 |
433.1 | 647.4 | 5 | 血管紧张素Ⅰ-2 | 145 | 25 | 7 |
437.3 | 660.5 | 30 | 血管紧张素Ⅰ-IS-2 | 120 | 24 | 16 |
437.3 | 631.1 | 5 | 血管紧张素Ⅰ-IS-2 | 130 | 30 | 10 |
523.9 | 263.4 | 30 | 血管紧张素II-1 | 140 | 31 | 7 |
523.9 | 784.3 | 5 | 血管紧张素II-2 | 140 | 28 | 8 |
527.3 | 263.3 | 30 | 血管紧张素II-IS-1 | 140 | 31 | 7 |
527.3 | 791.4 | 5 | 血管紧张素II-IS-2 | 140 | 28 | 7 |
363.3 | 121.1 | 10 | 18-羟皮质酮-1 | 140 | 40 | 10 |
363.3 | 269.2 | 10 | 18-羟皮质酮-2 | 140 | 38 | 10 |
367.2 | 121.1 | 10 | 18-羟皮质酮-IS-1 | 140 | 40 | 10 |
367.2 | 273.2 | 10 | 18-羟皮质酮-IS-2 | 140 | 38 | 10 |
359.2 | 188.9 | 25 | 醛固酮-NEG-1 | -125 | -26 | -8 |
359.2 | 331.3 | 10 | 醛固酮-NEG-2 | -125 | -23 | -8 |
367.2 | 194.2 | 25 | 醛固酮-NEG-IS-1 | -125 | -26 | -8 |
367.2 | 339.4 | 10 | 醛固酮-NEG-IS-2 | -125 | -23 | -8 |
363.2 | 309.2 | 30 | 皮质醇-1 | 175 | 25 | 8 |
363.2 | 121.2 | 15 | 皮质醇-2 | 175 | 32 | 8 |
367.2 | 313.3 | 30 | 皮质醇-IS-1 | 175 | 25 | 8 |
367.2 | 121.2 | 15 | 皮质醇-IS-2 | 175 | 32 | 8 |
表9、质谱条件
采用内标法建立标准曲线,线性关系验证记录如表10所示,计量单位为ng/mL。
表10、标准曲线验证结果
化合物 | 回归方程 | 权重 | 相关系数r | 临床线性范围 |
血管紧张素I | Y=0.00957X+0.000836 | 1/X2 | 0.997 | 0.3-100ng/mL |
血管紧张素II | Y=0.0000762593X+0.00303 | 1/X2 | 0.996 | 15-5000pg/mL |
醛固酮 | Y=0.00250X-0.03029 | 1/X2 | 0.997 | 15-5000pg/mL |
皮质醇 | Y=0.04826X+0.13974 | 1/X2 | 0.998 | 1.5-500ng/mL |
18-羟皮质酮 | Y=0.000956X-0.07801 | 1/X2 | 0.999 | 12~4000pg/mL |
以含有4% BSA的PBS缓冲溶液基质配制标曲,与待测样品同步处理进行检测,检测图谱如图1所示,由上之下依次为血管紧张素I(Ang I)、血管紧张素II(Ang II)、18羟皮质酮(18-OH CORT)、醛固酮(Aldo)和皮质醇(Cortisol)。由图1可见,按照本实施例提供的方法,可以同时准确检测5种标志物。
经准确度和精密度验证(表11),在浓度范围内,检测的线性关系良好。
表11、方法验证的准确度和精密度
实施例2:键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠及固相萃取柱的提取效果比对
本实施例采用实施例1提供的方法进行标准曲线最低浓度点(S1)样本的配制、提取和检测,其中提取方法分别采用三种不同的方法:1、表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠提取(HLB磁珠,博蕴生物,博蕴生物,货号BNMA7300001-0;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A);2、采用填充亲水亲脂平衡聚合物的SPE板PEP 96 WellMicroplates提取;3、采用填充亲水亲脂平衡聚合物的SPE板PEP 96 Waters Oasis HLB提取;洗脱后再进行液相色谱串联质谱分析,考察处理后的样本的检测结果,测得S1样品中5种标志物的峰面积如表12所示。
表12、不同处理方法对标志物提取效果的影响
由表12可以看出,采用不同的样品处理方法,会影响到样品中5种标志物的提取结果,同样都是嵌合亲水亲脂平衡聚合物,磁珠对5种标志物的提取效果明显优于SPE板。同时比较了两种亲水亲脂平衡聚合物的SPE板,其效果也有所差别,SPE板PEP 96 WellMicroplates更优于Waters Oasis HLB 96 Wellplates;而HLB磁珠的提取效果与这两种SPE相比,对5种标志物的提取都有显著提升。
另外,固相萃取存在的前述易堵塞、操作繁琐、基质效应过强等特性;而采用磁珠方法,在表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠对5种标志物进行吸附之后,磁珠提取仪即可将吸附标志物的磁珠从生物样本基质中提取出来,有效剥离生物样本中的干扰成分。因此在经过磁珠提取富集之后,与固相萃取柱相比,磁珠提取的洗脱液中的成分更干净,检测过程中标志物受到的干扰影响更小,质谱离子化效率更高,能够达到更好的检测灵敏度。
实施例3:键合不同聚合物材料的磁珠对标志物提取效果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行标准曲线最低浓度点(S1)样本的配制、提取和检测。根据对于五种不同标志物分项单独进行检测的文献查询结果:混合型阴离子交换聚合物SPE可被用于血管紧张素检测的样本前处理过程,因此本实施例进一步比较了混合型阴离子交换聚合物(Agela Cleanert PAX 96 Wellplates)填料键合的固相萃取柱,以及表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠(HLB磁珠,博蕴生物,货号BNMA7300001-0;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A)、键合混合型阴离子交换聚合物的磁珠(MAX磁珠,博蕴生物,货号BNMA1430-SY;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A)、和键合混合型阳离子交换聚合物的磁珠(MCX磁珠,博蕴生物,货号BNMA8300001-0-P;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A),4种方式进行5种标志物的吸附提取,洗脱后再进行液相色谱串联质谱分析,考察处理后的样本的检测结果,测得S1样品中5种标志物的峰面积如表13所示。
表13、磁珠键合不同材料对标志物提取效果的影响
由表13可以看出,同样是键合阴离子聚合物,MAX磁珠的提取效果也明显优于Agela Cleanert PAX 96 Wellplates固相萃取柱;同时,磁珠表面键合不同的材料,其对样品中5种标志物的提取效果存在较大影响,比较亲水亲脂平衡聚合物、混合型阴离子交换聚合物和混合型阳离子交换聚合物三种填料键合的磁珠,其中亲水亲脂平衡聚合物键合的磁珠,能够显著提高部分低含量指标(醛固酮、18羟皮质酮)的提取效果,对这5种理化特性差异较大的标志物的提取富集效果达到较好的均衡。纠其原因,可能是亲水亲脂平衡聚合物不仅能够实现对大极性化合物的吸附,也可以有效吸附小极性化合物;但阴离子及阳离子聚合物的吸附选择性更强,只能选择性实现对大极性阴离子或阳离子的吸附,难以同时兼顾对小极性化合物的吸附,导致醛固酮、18羟皮质酮等小分子的提取效率低下,无法达到临床检测的灵敏度要求。
实施例4:磁珠及固相萃取柱提取操作过程的对比
采用传统的固相萃取柱对生物样本进行前处理时,先对96孔SPE板(Agela PEP 96Well Microplates)进行固相萃取柱萃取进行活化及平衡,再将待测生物样品溶液上样至SPE板,PEP填料选择性提取吸附目标化合物,通过淋洗将部分无机盐等杂质成分从SPE柱洗掉,再利用与固定相结合能力更强的洗脱剂将目标组分从萃取柱洗脱,再将洗脱液用氮气吹干后复溶上样,进行样本检测。其操作过程手动步骤多,而且操作繁琐,耗时较长,处理一批样本约需要两个小时。而且由于生物样本基质差异性,样本孔间提取效率差异较大,所有指标均需使用同位素内标进行校准;另外由于生物样本基质特异性,部分样本(尤其是溶血、脂血等样本)可能引致SPE柱堵塞,导致整批样本的前处理效率降低以及堵塞样本的复测。
采用磁珠提取仪适配96孔板中各列的添加试剂如表14(同前述表5)所示:
表14、磁珠提取仪适配96孔板中各列的添加试剂
第1(7)列 | 第2(8)列 | 第2(9)列 | 第4(10)列 | 第5(11)列 | 第6(12)列 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
活化剂 | 平衡液 | 样本 | 淋洗液1 | 淋洗液2 | 洗脱液 |
其中,磁珠为表面键合亲水亲脂平衡聚合物硅胶的磁珠(HLB磁珠,博蕴生物,货号BNMA7300001-0;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A),活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液,平衡液为含有1%甲酸的水溶液;淋洗液1为含有10%甲醇的水溶液,淋洗液2为异辛烷,洗脱液为含有50%甲醇的水溶液。
磁珠提取仪的样本前处理步骤如表15(同表6)所示,每批次样本的前处理时间约十分钟。
表15、磁珠提取仪的样本前处理步骤
磁珠提取仪提取完成后,可将96孔板第6列及第12列的待测溶液转移至96孔上样板,上机检测。目前采用的磁珠提取仪单次可容纳两块96孔板平行操作,因此前处理通量为32样本/批次;也可以采用96通道磁珠提取仪,提取效率维持不变,10分钟可实现对96样本的前处理。极大地提高了前处理效率,实现临床样本前处理地高度自动化。
实施例5:生成缓冲液的不同pH对提取标志物效果的影响
孵育过程中,在肾素活性的催化下,血浆样本中的血管紧张素原会转化成为血管紧张素I,并由于血管紧张素转换酶抑制剂的加入,使得血管紧张素I含量升高,因此孵育过程会直接影响样品中血管紧张素I的含量。本实施例采用实施例1提供的方法进行低、中、高质控样品的配制、提取和检测,其中,孵育前样品中加入的生成缓冲液的pH分别4.0、5.0、5.5、6.0、7.4,孵育后样品再经表面键合亲水亲脂平衡聚合物硅胶的磁珠(HLB磁珠,博蕴生物,货号BNMA7300001-0;颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A)吸附提取,洗脱后再进行液相色谱串联质谱分析,考察不同pH的孵育后样品的检测结果,测得低、中、高质控样品中孵育后血管紧张素I峰面积如表16所示。
表16、孵育过程不同pH对标志物(血管紧张素I)的影响
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由表16可以看出,孵育过程生成缓冲液的pH值必须控制在合适范围,否则会严重影响肾素的催化活性,导致孵育后生成的血管紧张素I出现较大偏差。在非理想pH条件下,测得的肾素活性偏低,再采用醛固酮/肾素活性计算ARR时,易导致ARR偏高,造成假阳性结果。
实施例6:不同洗脱剂添加剂对标志物洗脱效果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行标准曲线最低浓度点(S1)样本的配制、提取和检测,其中,通过在洗脱剂中添加不同添加剂,从而配制不同的洗脱剂对磁珠样品进行洗脱,洗脱后再进行液相色谱串联质谱分析,考察不同洗脱剂洗脱后的样品检测结果,测得S1样品中5种标志物的峰面积如表17所示。
表17、不同洗脱剂对标志物提取效果的影响
由表17可见,直接采用甲醇作为洗脱剂,各指标检测峰形不佳,存在严重的溶剂效应;采用75%甲醇水溶液洗脱时情况有所改善,但采用50%甲醇水溶液能够有效改善峰形;采用25%甲醇时洗脱效率不足;洗脱剂中加酸之后,醛固酮的离子化效率明显被抑制,峰面积减小,影响检测灵敏度。
实施例7:不同流动相添加剂对液相色谱串联质谱检测结果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行标准曲线最低浓度点(S1)样本的配制、提取和检测,其中流动相A为水溶液,流动相B相为甲醇溶液(含5%异丙醇),作为基础流动相,通过在流动相A和流动相B中添加不同的流动相添加剂,从而配制不同的流动相进行液相色谱串联质谱检测,考察不同流动相检测样品的检测结果,测得S1样品中5种标志物的峰面积如表18所示。
表18、不同流动相添加剂对标志物提取效果的影响
/>
由表18可见,相比与不含有流动相添加剂的情况,在流动相A和流动相B中都添加1mM氟化铵能够有效提升检测灵敏度;但是添加不同种类的流动相添加剂,样品检测结果存在较大差异,与添加0.03%甲酸相比,添加1mM氟化铵,虽然Ang I的响应会有所减低,但也能进一步提高其他4种指标的检测灵敏度,尤其是含量较低的醛固酮,使5种标志物的检测灵敏度更能满足临床需求。
实施例8:选择负离子和正离子模式对检测醛固酮的影响
本实施例经研究证明,5种标志物的质谱检测过程中,血管紧张素I、血管紧张素II、皮质醇、18羟皮质酮都应选择正离子模式进行检测,而醛固酮需要选择负离子模式进行检测,其原因是因为选择正离子模式时,在实际样本中,醛固酮的检测峰旁边会存在同分异构体可的松的峰图存在较大干扰,CV%大于15%;而采用负离子模式进行检测时,检测结果更加稳定且准确,CV%小于8.33%。
实施例9:原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和分型系统
本实施例通过原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和分型系统进行原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和分型,具体方法如下:
(1)通过标志物检测模块采用如实施例1提供的方法一次性检测获得5种标志物的检测值;
(2)通过数据分析模块,根据醛固酮、血管紧张素Ⅰ的检测值计算ARR,ARR的计算公式为:ARR=醛固酮的浓度/血管紧张素Ⅰ产生速率;所述血管紧张素Ⅰ产生速率,是通过检测孵育前样本和孵育后样本的血管紧张素Ⅰ浓度,按照公式计算:血管紧张素Ⅰ产生速率=(孵育后血管紧张素Ⅰ浓度-孵育前血管紧张素Ⅰ浓度)/孵育时间,其中孵育前血管紧张素Ⅰ浓度非常低,基本可忽略不计。
(3)结合ARR的切点值20.4,和影响ARR的高血压治疗药物浓度(具体参考在先申请的发明专利2021106374412)来判断阳性还是阴性,当ARR的检测结果小于20.4时,如果同时测得患者体内含有能使ARR下降的药物,则可判断为假阴性,需要进一步确诊实验或者进行停药检查;当ARR的检测结果小于20.4时,如果同时测得患者体内含有能使ARR上升的药物,则可判断为阴性;当ARR的检测结果大于20.4时,如果同时测得患者体内含有能使ARR上升的药物,则可判断为假阳性,需要进一步确诊实验或者进行停药检查;当ARR的检测结果大于20.4时,如果同时测得患者体内含有能使ARR下降的药物,则可判断为阳性。
(4)当判断为阳性时,再根据醛固酮、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮的检测值进行PA分型,具体分型诊断方法如下:
a、AVS(肾上腺静脉采血):SI(肾上腺静脉与下腔静脉皮质醇比值)≥2:1插管成功;LI(优势侧醛固酮皮质醇比值与非优势侧醛固酮皮质醇比值之比)≥2:1插有优势分泌;CI(非优势侧醛固酮皮质醇比值与下腔静脉醛固酮皮质醇比值之比)<1:1对侧被抑制;
b、18-羟皮质酮(18-OHB):醛固酮瘤患者晨8:00卧位血浆18-OHB水平通常>100ng/dl,而特醛症患者通常<100ng/dl;
c、结合血管紧张素Ⅱ的检测值,进行原发性和继发性高血压分型诊断。
实施例10:ARR切点值的选择
本实施例选取行继发性高血压筛查的患者61例,其中20例被诊断为PA。
1.纳入标准
将立位PAC>15ng/dL;立位ARR>30且CCT后醛固酮抑制率<30%的患者纳入PA组。筛查前要求停止使用利尿剂、醛固酮受体拮抗剂至少4周,血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、钙离子拮抗剂(CCB)、β受体阻滞剂等降压药物至少2周,采血前尽量将血钾纠正至正常范围。入组人群于次日上午05:00后保持立位2小时后于07:00采集立位血液样本。
2.AVS评判标准
采用非促肾上腺皮质激素刺激的双侧同步取血,通过实施例1提供的方法检测样本中的5种标志物含量,以肾上腺静脉皮质醇与下腔静脉皮质醇的比值定义为选择指数(selectivity index,SI),SI>2认定取血成功。将优势侧醛固酮/皮质醇的比值(标准化醛固酮值)与对侧标准化醛固酮值的比值定义为单侧指数(lateralized index,LI),当LI>2时认为存在单侧优势分泌,LI<2时则认为无明显单侧优势分泌。
3.标本采集:所有样品采集均要求受试者过夜禁食隔夜空腹8h以上,并保证样品转移、离心和分离在1h内完成,以避免可能影响的分析前因素。所有样品分析前于-80℃保存待测。
4、ARR的计算:通过实施例1提供的方法检测样本中的5种标志物含量,根据ARR的计算公式为:ARR=醛固酮的浓度/肾素活性(血管紧张素Ⅰ产生速率);所述肾素活性,是通过检测孵育前样本和孵育后样本的血管紧张素Ⅰ浓度,按照公式计算:血管紧张素Ⅰ产生速率=(孵育后血管紧张素Ⅰ浓度-孵育前血管紧张素Ⅰ浓度)/孵育时间,其中孵育前血管紧张素Ⅰ浓度非常低,基本可忽略不计。采用实施例8提供的原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统进行原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型。
5.统计学方法分析:
应用R语言软件处理数据。根据ARR值与是否PA患者之间的相关性分析,分析结果见表19。
表19、ARR值与是否PA患者之间检测结果比较
由表19可以看出,当ARR切点值为20.4时,检测敏感性、灵敏度、95%CI都处于较高水平,相对于其他切点值具有明显优势。对于本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和分型系统,ARR是阴性还是阳性的判断,灵敏度的影响是最为关键的,只有灵敏度高了,才能有效防止漏检,即使出现假阳性,还可以通过后续的根据醛固酮、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮的检测值进行PA分型来进一步确认;而若灵敏度不够,使本来阳性的患者被误判为阴性,从而不再进行后续的分型诊断,则非常容易造成漏检。因此ARR的切点值采用20.4,能有效防止漏检。
同时,ARR LC-MS/MS>20.4时,Youden指数也达到最大值(YI=0.82),说明对原发性醛固酮增多症的筛查效果最好,最接近真实情况。
采用ARR切点值为20.4进行分析,结果如表20所示:
表20、ARR>20.4的分析结果
由表19和20可见,ARR LC-MS/MS>20.4时,Youden指数达到最大值(YI=0.82),灵敏度和特异度分别为94.4%(95% CI:72.7~99.9)和87.2%(95% CI:72.6~95.7),曲线下面积(AUC)达0.956(图2)。
在现有技术中,ARR的切点值普遍认为是在30,但采用本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统时,需将ARR的切点值调整至20.4。这主要是因为ARR值与醛固酮和肾素活性的检测灵敏度直接相关,过去醛固酮的检测普遍是通过化学免疫法进行检测,检测值偏高,从而导致ARR值的计算结果大于实际值,需要设置切点值为30才能较准确判断原发性醛固酮增多症是阳性还是阴性,而采用本发明提供的样品前处理(键合亲水亲脂平衡聚合物硅胶的磁珠提取)和检测方法(高效液相色谱串联质谱)时,检测结果能够更精准地反应醛固酮的试剂含量,因此ARR过去的切点值30已不能符合本发明提供的原发性醛固酮增多症的筛查和分型系统,需将ARR的切点值调整至20.4,这样才能使筛查和分型结果的灵敏度更高,诊断结果更准确。
虽然本发明披露如上,但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种更动与修改,因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种试剂盒用于制备原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型试剂盒的用途,其特征在于,所述试剂盒包括活化剂、淋洗液和洗脱液;所述活化剂为含有磁珠的溶液,所述磁珠的表面键合亲水亲脂平衡聚合物;所述磁珠用于吸附样品中的标志物,所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇和18-羟皮质酮。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述洗脱液为含50%甲醇的水溶液。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述淋洗液包括淋洗液1和淋洗液2,淋洗液1为10%甲醇水溶液,淋洗液2为异辛烷;活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液;所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒,颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述试剂盒还包括平衡液和液相色谱流动相,所述平衡液为1%甲酸水溶液;所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为含有流动相添加剂的水溶液,流动相B为含有流动相添加剂的甲醇溶液(含5%异丙醇),所述流动相添加剂为1mM氟化铵。
5.一种检测血液中的标志物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理样品,吸附待测物;
(2)用洗脱液洗脱待测物,液相色谱串联质谱分析待测物中的标志物的含量;所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇和18-羟皮质酮。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)为:所述样品需先经添加血管紧张素转换酶抑制剂(PMSF)的生成缓冲液在酸性条件进行孵育,孵育结束后加入反应终止液终止孵育,再采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理孵育后样品;所述生成缓冲液的pH值为5-6。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)为用活化剂和平衡液依次处理的磁珠吸附样本,再经淋洗液冲洗;所述活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液,所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒,颗粒度30-50μm,比表面积约600m2/g,孔径约为80A;所述平衡液为1%甲酸水溶液;所述淋洗液包括淋洗液1和淋洗液2,淋洗液1为10%甲醇水溶液,淋洗液2为异辛烷。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述洗脱液为含有50%甲醇的水溶液;所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为含有流动相添加剂的水溶液,流动相B为含有流动相添加剂的甲醇溶液(含5%异丙醇),所述流动相添加剂为1mM氟化铵。
9.一种原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型诊断系统,其特征在于,所述系统包括标志物检测模块、数据输入/输出界面和数据分析模块;所述标志物检测模块用如权利要求5~8任一项所述方法得到标志物的检测值,数据输入/输出界面用于输入至少一种标志物的检测值,数据分析模块用于分析标志物的检测值,所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮中的任意一种或多种;待数据分析模块分析后,数据输入/输出界面用于输出原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型诊断结果。
10.如权利要求9所述的系统,其特征在于,所述原发性醛固酮增多症的筛查、确诊和分型诊断是指先根据醛固酮和肾素活性计算ARR,并结合ARR的切点值20.4,和影响ARR的高血压治疗药物浓度来判断;判断为阳性时,再根据醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18-羟皮质酮的检测值进行确诊和分型;所述肾素活性为单位时间内血管紧张素I的产生量。
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