WO2020045497A1 - アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法及び診断用負荷試験剤 - Google Patents

アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法及び診断用負荷試験剤 Download PDF

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WO2020045497A1
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aldosterone
subject
cortisol
minutes
test agent
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PCT/JP2019/033704
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和雄 北村
俊弘 北
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国立大学法人宮崎大学
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic load test agent for discriminating aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, comprising an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient, and aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism using adrenocorticotropic hormone.
  • the number of hypertensive patients in Japan is said to be about 43 million, and hypertension is one of the most common illnesses.
  • it has been a topic that the frequency of primary aldosteronism is high among patients exhibiting such symptoms of hypertension. In reality, it is thought that about 3% of patients may have primary aldosteronism.
  • PA Primary aldosteronism
  • aldosterone-producing adenomas APA
  • IHA idiopathic aldosteronism
  • adrenal vein sampling to distinguish aldosterone-producing adenomas from idiopathic aldosteronism is difficult and burdens not only patients but also medical personnel.
  • An object of the present invention is to provide a test method for distinguishing aldosterone-producing adenoma from idiopathic aldosteronism and a diagnostic load test agent.
  • the adrenocorticotropic hormone (ACTH) loading test (ACTH loading test) is not a standard loading test for diagnosing primary aldosteronism, but it mainly evaluates postoperative effects as a test for aldosterone hypersecretion. It is used as a particularly useful test.
  • aldosterone-producing adenomas aldosterone hypersecretion persists for a long time after ACTH loading as compared with idiopathic aldosteronism, and focused on this.
  • the present invention was completed.
  • the present invention provides the following [1] to [7].
  • [Item 1] A diagnostic load test agent for identifying an aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, which comprises an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient, A diagnostic load test agent characterized by detecting the amount of aldosterone in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the load test agent to the subject.
  • Item 2 Item 2. The diagnostic load test agent according to Item 1, wherein the detection of the amount of aldosterone is represented by an aldosterone / reference hormone ratio.
  • [Item 3] Item 3. The diagnostic load test agent according to Item 2, wherein the reference hormone is cortisol.
  • the aldosterone / cortisol ratio is detected in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent to the subject, and when the aldosterone / cortisol ratio is greater than 1.20, Item 4.
  • the diagnostic load test agent according to any one of Items 1 to 3, wherein the subject is judged to be an aldosterone-producing adenoma.
  • the aldosterone / cortisol ratio is detected in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent to the subject, and when the aldosterone / cortisol ratio is 1.20 or less, Item 5.
  • Item 6 Item 6.
  • Item 7 Item 7.
  • a method for testing the discrimination between an aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism comprising: Measuring a aldosterone level and a reference hormone level in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent containing an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient to the subject; Comparing the aldosterone / reference hormone ratio to a reference value, thereby testing the subject for discrimination between aldosterone-producing adenomas and idiopathic aldosteronism.
  • Item 9 Item 9. The method according to Item 8, wherein the reference hormone is cortisol.
  • Item 10 Item 10. The method according to Item 8 or 9, wherein the subject is identified as an aldosterone-producing adenoma when the aldosterone / cortisol ratio is greater than 1.20.
  • Item 11 Item 10. The method according to Item 8 or 9, wherein the subject is identified as idiopathic aldosteronism when the aldosterone / cortisol ratio is 1.20 or less.
  • Item 12 Item 12. The method according to any one of Items 8 to 11, wherein the sample is obtained 110 to 155 minutes after the administration of the loading test agent to the subject.
  • Item 13 Item 13. The method according to any one of Items 8 to 12, wherein the sample obtained from the subject is blood obtained from a limb vein.
  • aldosterone-producing adenomas and idiopathic aldosteronism can be distinguished from each other by using a body fluid in a minimally invasive manner.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of an adrenocorticotropic hormone load test.
  • FIG. 1A shows plasma aldosterone concentrations over time after loading.
  • FIG. 1B shows the cortisol concentration over time after loading.
  • FIG. 1C shows the ratio of plasma aldosterone concentration to cortisol concentration over time after loading.
  • FIG. 1D shows that aldosterone hypersecretion was suppressed in all patient groups after surgery. It is a graph which shows each ROC curve of the marker of an adrenocorticotropic hormone tolerance test.
  • FIG. 1A shows plasma aldosterone concentrations over time after loading.
  • FIG. 1B shows the cortisol concentration over time after loading.
  • FIG. 1C shows the ratio of plasma aldosterone concentration to cortisol concentration over time after loading.
  • FIG. 1D shows that aldosterone hypersecretion was suppressed in all patient groups after surgery. It is a graph which shows each ROC curve of
  • FIG. 3 is a graph showing a scatter diagram in the test 1 in which a PAC / cortisol ratio of 1.20 at 120 minutes in the adrenocorticotropic hormone load test is set as a cutoff value.
  • FIG. 3A is a graph showing values for all patients.
  • FIG. 3B is an enlarged view up to a PAC / Cortisol ratio of 2.
  • FIG. 7 is a graph showing a scatter diagram in a test 2 in which a PAC / cortisol ratio of 1.20 at 120 minutes is set as a cutoff value in an adrenocorticotropic hormone loading test.
  • Test 2 it is a graph showing a scatter diagram in a state where a PAC / cortisol ratio of 1.20 at 150 minutes is set as a cutoff value in an adrenocorticotropic hormone load test.
  • the present invention relates to a test method for identifying aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism using adrenocorticotropic hormone, or a method for assisting diagnosis. Further, the present invention relates to a diagnostic load test agent for discriminating aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, which comprises an adrenocorticotropin as an active ingredient.
  • Adrenocorticotropic hormone (adrenocorticotropic hormone) is one of the hormones secreted from the anterior pituitary gland and stimulating the adrenal cortex. It functions by binding to MC-2R adrenocorticotropic hormone receptor expressed in the adrenal gland.
  • Adrenocorticotropic hormone is thought to be an intermediary in the production of various living growth steroids and physiologically regulated steroids. For example, it stimulates the secretion of glucocorticoids such as cortisol.
  • the adrenocorticotropic hormone used in the present invention can be, for example, but not limited to, a synthetic adrenocorticotropic hormone such as tetracosactide acetate.
  • a synthetic adrenocorticotropic hormone such as tetracosactide acetate.
  • Courtrosin manufactured by Daiichi Sankyo Co., Ltd.
  • Aldosterone is a type of corticosteroid and is a mineral corticoid (mineral corticoid). Aldosterone is secreted from the globular layer of the adrenal cortex and regulates sodium in plasma, blood pressure and blood volume.
  • reference hormone is not limited, but when adrenal corticotropin is administered to a subject, regardless of the lapse of time, or at least administration of adrenocorticotropic hormone, for each of the subjects. Hormones that can show a substantially constant or constant value in a sample derived from a subject after a lapse of 90 to 180 minutes.
  • a reference hormone such as, but not limited to, cortisol, can be the reference hormone.
  • adrenal vein sampling is very challenging, invasive, and burdensome for both healthcare professionals and patients.
  • adrenal tumors are often cases of small tumors that cannot be detected by abdominal CT, it is difficult to distinguish aldosterone-producing adenomas from other diseases that do not require surgery without sampling adrenal veins.
  • an aldosterone-producing adenoma treatment such as surgery is required, but if it is determined to be idiopathic aldosteronism, drug treatment is performed, and the treatment policy is completely different.
  • Primary aldosteronism has many causes, including adrenocortical hyperplasia and adrenal carcinoma.
  • the disease can be broadly divided into two types, unilateral and bilateral, but in fact, most of the causes of primary aldosteronism are aldosterone-producing adenomas or idiopathic aldosteronism, and adrenal cancer Other causes, including, are rare.
  • Aldosterone-producing adenoma (hereinafter also referred to as APA) is one pathological condition of adrenal tumor.
  • An aldosterone-producing adenoma refers to a condition diagnosed according to the criteria described in, for example, Endocrine Journal 58: 711-721, 2011.
  • Aldosterone-producing adenoma is a disease that can be cured by adrenalectomy in which adenoma is present, but may be treated with antihypertensive drugs as essential hypertension without being diagnosed.
  • the diagnostic load test agent of the present invention comprises administering an adrenocorticotropic hormone to a subject, and detecting an aldosterone-producing adenoma in a simple, low-invasive manner based on an analysis of the concentration of a specific hormone such as aldosterone in blood. can do.
  • Idiopathic aldosteronism (hereinafter also referred to as IHA) refers to a condition diagnosed according to the criteria described in, for example, Endocrine Journal 58: 711-721, 2011. It is a particularly common clinical condition among primary aldosteronism.
  • an adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulation test (ACTH load test) is considered to be insufficient for a confirmation test of primary aldosteronism.
  • an adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulation test (ACTH load test) is mainly performed on a subject with primary aldosteronism, and aldosterone-producing adenoma (APA) and idiopathic aldosterone Diseases can be easily and efficiently identified.
  • the captopril tolerance test (CCT) the furosemide standing test (FUT), and the saline tolerance test
  • a sample derived from the subject of an aldosterone-producing adenoma has a high aldosterone value, It was found that the value decreased in cases of sexual aldosteronism.
  • the reference hormone shows a constant value for each of the subjects, regardless of the passage of time. Therefore, for example, by detecting the aldosterone / reference hormone ratio after a certain period of time from administration, it becomes possible to more clearly distinguish aldosterone-producing adenoma from idiopathic aldosteronism.
  • collection of a sample derived from a subject from the subject is not limited, but is performed at least once after 90 to 180 minutes have elapsed after administration of the adrenocorticotropic hormone to the subject.
  • the collection of a body fluid, typically blood, from a subject is not limited, but is preferably performed after administration of adrenocorticotropic hormone to the subject, preferably after 100 to 160 minutes, more preferably , After 110 to 155 minutes, still more preferably after 120 minutes ⁇ 1 minute, and most preferably after 120 minutes. In some cases, it is also preferable to perform the process up to 150 minutes ⁇ 1 minute.
  • At least one time at different timings together with the sample at other time points such as 30 minutes and / or 60 minutes after administration of the corticotropin to the subject, for example, two times or more in total
  • sampling is performed at least once at different timings, that is, at least four times in total, and the diagnosis is assisted in addition to those findings.
  • the dose of adrenocorticotropic hormone may be 0.1 to 1 mg, preferably 0.25 to 0.5 mg.
  • the intravenous injection is preferably a short-time administration that does not take a long time, and more preferably about 1 minute from the start of administration to the end of administration.
  • the term “after 90 to 180 minutes” refers to the time elapsed from the end of administration.
  • the subject at the time of administration is not limited, but is preferably in a state of rest.
  • it can be administered by intravenous injection after resting in a supine position for about 15 to 60 minutes, preferably for about 20 to 40 minutes.
  • the subject refers to a mammal to be used for discrimination between an aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, and is not limited, but is preferably monkey, dog, cat, mouse, or human. is there. In the present invention, although not limited, it is preferable that a subject diagnosed with primary aldosteronism be a detection target.
  • a sample derived from a subject refers to a body fluid derived from the subject, and refers to a body fluid itself, a concentrated solution, a diluted solution, or other appropriately processed liquid.
  • the body fluid refers to, for example, but is not limited to, blood (whole blood, plasma, serum) and urine.
  • the bodily fluid is blood.
  • the collection amount of body fluid such as blood is 100 ⁇ l to 100 ml, preferably 500 ⁇ l to 100 ml, and more preferably 1 ml to 50 ml.
  • blood is obtained from a limb vein.
  • the limb vein is a leg or arm vein, and particularly preferably a brachial vein.
  • blood collection from a vein other than a limb vein is not excluded, but blood collection from a limb vein is more effective because the method of the present invention can be carried out simply and quickly with little invasiveness.
  • the treatment of the body fluid more specifically refers to pretreatment such as concentration, dilution, fractionation, desalting, addition of a preservative such as glycerin, a stabilizer such as a protease inhibitor, addition of a preservative, and the like. .
  • pretreatment such as concentration, dilution, fractionation, desalting, addition of a preservative such as glycerin, a stabilizer such as a protease inhibitor, addition of a preservative, and the like.
  • a preservative such as glycerin
  • a stabilizer such as a protease inhibitor
  • addition of a preservative and the like.
  • This includes returning to room temperature after refrigeration or freezing, and performing appropriate processing before or after refrigeration or freezing.
  • an anticoagulant treatment can be performed as an appropriate treatment. It is also possible to combine these processes.
  • the plasma can be separated by centrifugation or the like and used for the test.
  • Concentration is preferably adjusted so that, for example, when the body fluid is blood, the final total protein amount in the sample is about 1 g / dL to 5 g / dL, more preferably about 2 g / dL to 3 g / dL.
  • This concentrated liquid can be used for measurement as it is, but it can also be used after further diluting and adjusting the total protein amount.
  • Concentration can also be performed using Vivaspin (registered trademark, manufactured by Sartorius Japan KK), Amicon Ultra (manufactured by Merck Millipore), etc. according to the manufacturer's instructions.
  • Vivaspin registered trademark, manufactured by Sartorius Japan KK
  • Amicon Ultra manufactured by Merck Millipore
  • Dilution can be performed using distilled water or buffer, and can be used for sample preparation.
  • the amount of a reference hormone such as aldosterone or cortisol in a sample can be represented by the mass, volume, concentration, etc., contained in the sample. Furthermore, it can also be represented by fluorescence intensity, absorbance, and the like.
  • the method for detecting aldosterone in the present invention is not particularly limited as long as it is a method for detecting the amount of hormone contained in a sample derived from a subject, and examples thereof include a method for detection by a radioimmunoassay or an enzyme immunoassay using an antibody. be able to.
  • an antibody that can recognize an antigen specific to a reference hormone such as aldosterone or cortisol.
  • a reference hormone such as aldosterone or cortisol.
  • Such an antibody can be prepared by administering to a chicken, rat, mouse, rabbit, or the like, a complex of a corresponding reference hormone such as aldosterone or cortisol and a carrier protein as an antigen, and immunizing the same.
  • An antigen may be immobilized on a column, and an antibody obtained by purifying a polyclonal antibody obtained from an immunized animal may be prepared. Methods for making monoclonal antibodies are also known to those skilled in the art.
  • ELISA may be used as the enzyme immunoassay.
  • a sample such as aldosterone or cortisol is treated with a primary antibody and an HRP-labeled secondary antibody in a 96-well plate to produce a target hormone such as aldosterone or cortisol.
  • a sandwich method or the like it is also possible to use a sandwich method or the like.
  • the amount of aldosterone in the sample derived from the subject is determined by radioimmunoassay or enzyme immunoassay, and after detecting its abundance, Hormone abundance can be compared.
  • the reference hormone is not particularly limited, but cortisol can be preferably used.
  • the abundance of aldosterone and a reference hormone such as cortisol in a sample derived from a subject be represented by a relative ratio.
  • the amount ratio of aldosterone to the reference hormone in the sample derived from the subject is detected, and if the aldosterone is significantly increased as compared to the reference hormone, the subject may be determined to be an aldosterone-producing adenoma. it can.
  • cortisol can be used as the reference hormone. Therefore, the amount ratio of aldosterone to cortisol is detected, and if aldosterone is significantly increased as compared to cortisol, the subject can be determined to be an aldosterone-producing adenoma. For example, when the aldosterone / cortisol relative ratio is 1.20 or less, it can be determined that the aldosterone is not an aldosterone-producing adenoma. That is, for example, when this value is 1.20 or less, it can be determined that the possibility of idiopathic aldosteronism is high.
  • the subject can be determined to be an aldosterone-producing adenoma.
  • the method of measuring each hormone uses the method described in detail in the Examples.
  • the diagnostic load test agent of the present invention is a diagnostic load test agent for identifying aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, which contains an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient. It can be used as a test method for identifying aldosteronism, or a method for assisting diagnosis.
  • the diagnostic load test agent of the present invention contains an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient. Further, a sugar alcohol such as mannitol can be included as an additive.
  • the method of using the diagnostic load test agent of the present invention conforms to the contents described in the test method for discriminating between aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism, or the method for assisting diagnosis.
  • the kit of the present invention is a test or diagnostic kit for discriminating aldosterone-producing adenoma from idiopathic aldosteronism, and is characterized by containing adrenocorticotropic hormone.
  • the kit of the present invention preferably includes, but is not limited to, a lysate for use at the time of use, a needle, instructions, and the like, in addition to corticotropin.
  • a diagnostic load test agent for identifying an aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism which comprises an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient
  • Item 2 Item 2. The diagnostic load test agent according to Item 1, wherein the detection of the amount of aldosterone is represented by an aldosterone / reference hormone ratio.
  • Item 3 Item 3. The diagnostic load test agent according to Item 2, wherein the criterion is cortisol.
  • the aldosterone / cortisol ratio is detected in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent to the subject, and when the aldosterone / cortisol ratio is greater than 1.20, Item 4.
  • the diagnostic load test agent according to any one of Items 1 to 3, wherein the subject is judged to be an aldosterone-producing adenoma.
  • the aldosterone / cortisol ratio is detected in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent to the subject, and when the aldosterone / cortisol ratio is 1.20 or less, Item 5.
  • Item 6 Item 6.
  • Item 7 Item 7.
  • a method for testing the discrimination between an aldosterone-producing adenoma and idiopathic aldosteronism comprising: Measuring a aldosterone level and a reference hormone level in a sample obtained from the subject 90 to 180 minutes after administration of the loading test agent containing an adrenocorticotropic hormone as an active ingredient to the subject; Comparing the aldosterone / reference hormone ratio to a reference value, thereby testing the subject for discrimination between aldosterone-producing adenomas and idiopathic aldosteronism.
  • Item 9 Item 9. The method according to Item 8, wherein the reference hormone is cortisol.
  • Item 10 Item 9. The method according to Item 7 or 8, wherein the subject is identified as an aldosterone-producing adenoma when the aldosterone / cortisol ratio is greater than 1.20.
  • Item 11 Item 10. The method according to Item 8 or 9, wherein the subject is identified as idiopathic aldosteronism when the aldosterone / cortisol ratio is 1.20 or less.
  • Item 12 Item 12. The method according to any one of Items 8 to 11, wherein the sample is obtained 110 to 155 minutes after the administration of the loading test agent to the subject.
  • Item 13 Item 13. The method according to any one of Items 8 to 12, wherein the sample obtained from the subject is blood obtained from a limb vein.
  • the amount of aldosterone may be plasma aldosterone concentration.
  • the plasma aldosterone concentration was measured by a radioimmunoassay using a SPAC-S aldosterone kit (manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) in accordance with the manufacturer's instructions (fifth edition, revised November 2014). It can be the required measurement.
  • the amount of cortisol may be the concentration of cortisol in plasma.
  • the plasma cortisol concentration was determined by using Chemil Mic Cortisol II (Siemens Healthcare Diagnostics Co., Ltd.) and Chemilmi ADVIA Centaur XPT Chemilmi Analyzer fully automatic chemiluminescence immunoassay (Siemens Healthcare Diagnostics Co., Ltd.).
  • the luminescence immunoassay can be a measurement value that is determined according to the manufacturer's instructions for use (Revised June 2016, 8th edition) and the instruction manual for the instrument.
  • aldosterone and cortisol blood (plasma) concentrations were measured and determined as follows.
  • blood obtained from a subject was immediately transferred to a tube containing EDTA-2Na, centrifuged, and stored at ⁇ 20 ° C. until measurement. The measurement was performed within one week after blood collection. No dilution of the sample was performed during the measurement.
  • the standard aldosterone solution or the plasma of the subject returned to room temperature was placed in the aldosterone antibody tube included in the kit.
  • the standard aldosterone solution was placed in a standard curve antibody tube, and the test subject's plasma was placed in an unknown sample antibody tube.
  • 500 ⁇ l of aldosterone iodide reagent was added to each tube, and shaken at room temperature (25 ° C.) for 3 hours. After shaking, the supernatant was aspirated, and the radioactivity of the antibody tube was measured with a ⁇ -counter (ARC950: manufactured by Hitachi, Ltd.). The aldosterone concentration was determined by comparing the obtained standard curve with the value obtained from the plasma of the subject.
  • the measurement of plasma cortisol concentration can be performed by using a commercially available kit (Chemil Micortisol II: Siemens Healthcare Diagnostics Co., Ltd.) and a chemilumi ADVIA Centaur XPT Chemilmi Analyzer fully automatic chemiluminescence immunoassay (Siemens Healthcare Diagnostics Co., Ltd.) ) Was carried out by a chemiluminescence immunoassay according to the manufacturer's instructions for use (Revised June 2016, 8th edition) and the instruction manual for the instrument.
  • blood obtained from a subject was immediately transferred to a tube containing EDTA-2Na, centrifuged, and stored at ⁇ 20 ° C. until measurement. The measurement was performed within one week after blood collection.
  • the instrument was filled with the reagents in the kit, and then with 20 ⁇ l of the plasma of the subject, and the cortisol concentration was determined.
  • Captopril load test The patient was rested in a supine position for 60 minutes before taking Captopril 25 mg. Blood samples were collected before and after taking captopril. A ratio of plasma aldosterone concentration (PAC) / plasma renin activity (PRA) of 20 or more 60 minutes after administration of captopril was defined as positive. Basal sampling of PAC and PRA in CCT was used for this analysis as the basal value for the patient.
  • PAC plasma aldosterone concentration
  • PRA plasma renin activity
  • adrenocorticotropic hormone stimulation test After resting in a supine position for 30 minutes, the patient was administered 250 ⁇ g of synthetic adrenocorticotropic hormone (Courtrosin; Daiichi Sankyo Co., Ltd.) by intravenous injection. Blood samples were taken from the arm as before normal blood collection, before loading and at 30, 60, and 120 minutes after loading. In addition, some patients were collected up to 150 minutes later. At the peak aldosterone concentration following injection of adrenocorticotropic hormone, a PAC to cortisol ratio of 0.85 or more (PACmax / cortisol) was considered positive. That is, it was determined that the possibility of primary aldosteronism was high.
  • synthetic adrenocorticotropic hormone Cosmetic adrenocorticotropic hormone
  • Adrenal vein sampling was performed by a specialist radiologist. In order to confirm the exact localization of the microcatheter tip to the right adrenal vein, CT imaging was performed during surgery in all patients. After collecting the basal sample from both bilateral adrenal veins, 250 ⁇ g of corticotropin was administered by intravenous injection, and after waiting for 30 minutes, the second sampling from the adrenal vein was performed. According to JES guidelines, adrenal venous cortisol concentrations of 200 ⁇ g / dL or more after adrenocorticotropic hormone stimulation were considered to be evidence of proper catheterization for AVS.
  • Adrenal venous aldosterone concentrations of 1400 ng / dL or higher after adrenocorticotropic hormone stimulation were considered evidence of aldosterone hypersecretion.
  • the localization of aldosterone hypersecretion in the adrenal vein has been the primary criterion for the diagnosis of the type, ie aldosterone-producing adenoma or idiopathic aldosteronism.
  • the diagnosis of idiopathic aldosteronism includes lateralized ratio (comparison of aldosterone / cortisol ratio on both sides of the adrenal vein; high side / low side less than 2.6) and contralateral ratio (low side adrenal vein / lower vena cava) Aldosterone / cortisol ratio at the top of the graph; 1.0 or more).
  • Test 1 [Target patients] From July 2011 to March 2018, local diagnosis was performed by sampling adrenal veins, and after confirmatory tests, medical records of patients diagnosed with primary aldosteronism were selected and analyzed. Forty subjects meeting the criteria were enrolled in the study. This is a study on subjects who have already had a definitive diagnosis and has been approved by the Miyazaki University Ethics Committee. Contrast-enhanced CT imaging was performed on all subjects. All patients diagnosed with unilateral PA underwent laparoscopic adrenalectomy and were finally diagnosed as aldosterone-producing adenoma by pathological diagnosis. In addition, re-examination by an adrenocorticotropic hormone tolerance test after the operation confirms normalization of aldosterone secretion.
  • the PACmax / cortisol ratio was significantly higher in the APA group (Table 1).
  • ROC curve analysis was performed and AUCs were compared (Table 2).
  • the adrenocorticotropic hormone tolerance test of the present invention showed a higher ability to discriminate PA subtypes.
  • Table 2 summarizes some markers, including those already known.
  • the PAC / cortisol ratio at 120 minutes showed a very high AUC (0.956) among the labels.
  • the ROC curves for the markers of the adrenocorticotropic hormone tolerance test are shown in FIG. 2, where the ROC curves for the PAC / cortisol ratio after 120 minutes exceeded all other markers at all points.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ROC curve analysis was used to set a cutoff value for the 1.20 PAC / cortisol ratio at 120 minutes in the corticotropin tolerance test.
  • 21 out of 22 had an excess of 1.20 (sensitivity 95.5%)
  • 16 out of 18 had an average of 1.20 or less (specificity 88.9%).
  • FIG. 3 shows that
  • markers and cutoff values that are more useful than the prior art ie, a PAC / cortisol ratio of 1.20 at AST of 120 minutes, were found to be sufficiently sensitive (95.5%) to measure APA. was identified.
  • AST is a convenient and safe test, and pre-selection of APA patients using AST before AVS is versatile and beneficial in clinical practice.
  • APA is known to show a higher response to ACTH stimulation than IHA, but in fact, also in this example, the APA group showed a significantly higher response than the IHA group (FIG. 1).
  • the APA group responded to ACTH stimulation for a long time and maintained a high level of PAC at 120 minutes (the average difference between 0 and 120 minutes was 22.0 ng / mL).
  • the IHA group returned to near basal levels after 120 minutes (the average difference between 0 and 120 minutes was 8.5 ng / mL).
  • the PAC / cortisol ratio of the IHA group showed the lowest value at 120 minutes and the lowest variance (FIG. 1). This showed that the PAC / cortisol ratio could be selected in 120 minutes as a marker for the PA subtype. That is, PA patients with a PAC / cortisol value of 1.20 or less are very likely to have idiopathic aldosteronism and can be excluded from AVS.
  • Test 2 [Target patients] From August 2018 to May 2019, localization by adrenal vein sampling was performed, and after confirmation tests, medical records of patients diagnosed with primary aldosteronism were selected as targets, and the AST described above was selected. The efficacy of a PAC / cortisol ratio of 1.20 at 1.20 was verified. Fourteen subjects meeting the criteria were included in the study. Contrast-enhanced CT imaging was performed on all subjects. All patients diagnosed as unilateral PA underwent laparoscopic adrenalectomy, and pathological diagnosis ultimately diagnosed three cases of aldosterone-producing adenoma and one case of unilateral hyperplasia. In addition, re-examination by an adrenocorticotropic hormone tolerance test after the operation confirms normalization of aldosterone secretion.
  • the cut-off value of the 1.20 PAC / cortisol ratio at 120 minutes in the adrenocorticotropic hormone loading test was used.
  • three cases were aldosterone-producing adenomas, but three of the three cases exceeded 1.20 (sensitivity 100%).
  • One case was unilateral hyperplasia and was excluded from the study.
  • idiopathic aldosteronism 8 out of 10 cases had 1.20 or less (specificity 80%).
  • Tests 1 and 2 show that markers and cut-off values more useful than the prior art, i.e., a PAC / cortisol ratio of 1.20 at AST of 120 minutes, are sufficiently sensitive (96.0%) to measure APA. ).
  • AST is a convenient and safe test, and pre-selection of APA patients using AST before AVS is versatile and beneficial in clinical practice.
  • APA is known to show a higher response to ACTH stimulation than IHA, but in fact, also in this example, the APA group showed a significantly higher response than the IHA group.
  • the APA group responded to ACTH stimulation for a long time and maintained a high level of PAC at 120 minutes (the average difference between 0 and 120 minutes was 22.0 ng / mL).
  • the IHA group returned to near basal levels after 120 minutes (the average difference between 0 and 120 minutes was 8.5 ng / mL).
  • the PAC / Cortisol ratio of the IHA group showed the lowest value at 120 minutes, and the lowest variance. This showed that the PAC / cortisol ratio could be selected in 120 minutes as a marker for the PA subtype. That is, PA patients with a PAC / cortisol value of 1.20 or less are very likely to have idiopathic aldosteronism and can be excluded from AVS.

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Abstract

簡易で侵襲性が低いアルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の、診断用負荷試験剤及び試験方法を提供する。　副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤であって、負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン値を測定することを特徴とする、診断用負荷試験剤を提供する。さらには、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法を提供する。

Description

アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法及び診断用負荷試験剤
　本発明は、副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤、及び副腎皮質刺激ホルモンを用いた、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法に関する。
　日本の高血圧患者数は、約４３００万人といわれており、高血圧は最も患者数の多い一般的な病気の１つである。近年、このような高血圧の症状を呈する患者のうち、原発性アルドステロン症の頻度が多いことが話題となっている。現実的には３％程度の患者が原発性アルドステロン症の可能性があると考えられる。
　原発性アルドステロン症（ＰＡ）は、コルチコイドホルモンであるアルドステロンの過剰産生を特徴とする。アルドステロンによって腎臓におけるナトリウム及び水分保持及びカリウム排出の増大が引き起こされ、動脈性高血圧に繋がる。
　原発性アルドステロン症の原因のほとんどがアルドステロン産生腺腫（ＡＰＡ）か特発性アルドステロン症（ＩＨＡ）であり、副腎癌を含め他の原因はまれである。アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症とでは、治療方針が全く異なるため、その鑑別診断は非常に重要である。
　しかしながら、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症を識別するための副腎静脈サンプリングは、難易度が高く、患者のみならず、医療関係者の負担が大きい。
Williams textbook of endocrinology． (11th ed.). Philadelphia: Saunders/Elsevier. 2008. ISBN 978-1-4160-2911-3.
　本発明は、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法及び診断用負荷試験剤を提供することを目的とする。
　副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）負荷試験（ＡＣＴＨ負荷試験）は、原発性アルドステロン症診断の為の標準的な負荷試験ではないが、アルドステロン過剰分泌を調べる試験として、主に手術後の効果を評価することに有益な検査として用いられている。
　本発明者らは、アルドステロン産生腺腫では、特発性アルドステロン症と比較して、ＡＣＴＨ負荷後にアルドステロン過剰分泌が長時間持続することを発見し、これに着目し、特にアルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法及び診断用負荷試験剤を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［７］を提供する。
［項１］
　副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤であって、
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量を検出することを特徴とする、診断用負荷試験剤。
［項２］
　さらに、前記アルドステロン量の検出が、アルドステロン／基準ホルモン比によって表されることを特徴とする、項１記載の診断用負荷試験剤。
［項３］
　上記基準ホルモンが、コルチゾールである、項２記載の診断用負荷試験剤。
［項４］
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体をアルドステロン産生腺腫と判断する、項１～３のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項５］
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体を特発性アルドステロン症と判断する、項１～４のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項６］
　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０～１５５分後に得られるものである、項１～５のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項７］
　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、項１～６のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
　さらには、本発明では、以下の方法を提供する。
［項８］
　アルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験するための方法であって、
副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量と基準ホルモン量を測定する工程；
アルドステロン／基準ホルモン比を基準値と比較する工程を含み、これにより、該被検体のアルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験する方法。
［項９］
　上記基準ホルモンが、コルチゾールであることを特徴とする、項８記載の方法。
［項１０］
　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体がアルドステロン産生腺腫と識別する項８又は９に記載の方法。
［項１１］
　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体が突発性アルドステロン症と識別する項８又は９に記載の方法。
［項１２］
　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０～１５５分後に得られるものである、項８～１１のいずれか１項記載の方法。
［項１３］
　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、項８～１２のいずれか１項記載の方法。
　本発明により、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症とを、体液を用いて、低侵襲の方法で識別することができる。
図１は、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験の結果を示すグラフである。図１Ａは、負荷後の経時的な血漿アルドステロン濃度を示す。図１Ｂは、負荷後の経時的なコルチゾール濃度を示す。図１Ｃは、負荷後の経時的な血漿アルドステロン濃度とコルチゾール濃度の比を示す。図１Ｄは、手術後に、すべての患者群で、アルドステロン過剰分泌が抑えられたことを示す図である。 副腎皮質刺激ホルモン負荷試験のマーカーの各ＲＯＣ曲線を示すグラフである。 図３は、試験１において、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１２０分におけるＰＡＣ／コルチゾール比１．２０をカットオフ値として設定した状態での散布図を示すグラフである。図３Ａは、すべての患者についての値を示すグラフである。図３Ｂは、ＰＡＣ／コルチゾール比２までの拡大図である。 試験２において、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１２０分におけるＰＡＣ／コルチゾール比１．２０をカットオフ値として設定した状態での散布図を示すグラフである。 試験２において、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１５０分におけるＰＡＣ／コルチゾール比１．２０をカットオフ値として設定した状態での散布図を示すグラフである。
　本発明は、副腎皮質刺激ホルモンを用いた、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法、又は診断の補助の為の方法に関する。さらに、本発明は、副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤に関する。
（副腎皮質刺激ホルモン）
　副腎皮質刺激ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ、副腎皮質刺激ホルモン）は、下垂体前葉から分泌され、副腎皮質を刺激するホルモンのひとつである。副腎で発現するＭＣ－２Ｒ副腎皮質刺激ホルモンレセプターに結合することで機能を発揮する。
　副腎皮質刺激ホルモンは、様々な生体成長ステロイドおよび生理学的制御ステロイドの産生における介在物質であると考えられている。例えば、コルチゾール等のグルココルチコイドの分泌を刺激する。
　本発明で用いられる副腎皮質刺激ホルモンは、例えば、テトラコサクチド酢酸塩などの合成副腎皮質刺激ホルモンであり得るが、これに限定されない。テトラコサクチド酢酸塩の市販品として、コートロシン（第一三共株式会社製）が例示される。
（アルドステロン）
　アルドステロンは、副腎皮質ホルモンの１種であり、鉱質コルチコイド（ミネラルコルチコイド）である。アルドステロンは、副腎皮質の球状層から分泌され、血漿中のナトリウムや、血圧及び血液量の調節を行う。
（基準ホルモン）
　本明細書で、「基準ホルモン」というときには、限定はされないが、副腎皮質刺激ホルモンを被検体に投与した場合に、被検体のそれぞれについて、時間経過に関係なく、あるいは、少なくとも副腎皮質刺激ホルモン投与後９０～１８０分経過後の間に、被検体由来試料中で、ほぼ一定、又は一定の値を示し得るホルモンを示す。限定はされないが、コルチゾールなど、が基準ホルモンとなり得る。
（原発性アルドステロン症）
　日本内分泌学会のガイドラインに従って、アルドステロン・レニン同時測定（血漿アルドステロン濃度（ＰＡＣ）／血漿レニン活性（ＰＲＡ）比）（ＡＲＲ）で、この比が２０（アルドステロンの単位ｎｇ／ｄＬ）または２００（アルドステロンの単位ｐｇ／ｍＬ）以上の場合、原発性アルドステロン症と判断される。本発明では、限定はされないが、原発性アルドステロン症と診断をされた対象を主な被検体とすることができる。これまでは、原発性アルドステロン症と診断を受けた被検体は、腹部ＣＴによる副腎腫瘍の確認を行い、さらに副腎静脈サンプリングにて手術療法の適否を判断していた。しかしながら、副腎静脈サンプリングは非常に難易度が高く、侵襲的であり、医療従事者にも、患者にも負担の大きい手法である。一方で、副腎腫瘍は、腹部ＣＴによる検出では見出せない微小腫瘍による症例も多い為、副腎静脈サンプリングを行わずに、アルドステロン産生腺腫と手術の必要のない他の疾患とを鑑別することは、困難であった。すなわち、もし、アルドステロン産生腺腫であれば、手術等の処置が必要となるが、特発性アルドステロン症と判断される場合には、薬物療法が施され、その治療方針は全く異なる。
　原発性アルドステロン症は、副腎皮質過形成症及び副腎癌腫等を含む多くの原因がある。この疾患は、大きく、片側性病変と両側性病変の２つに分類する場合もあるが、実際には、原発性アルドステロン症の原因のほとんどがアルドステロン産生腺腫か特発性アルドステロン症であり、副腎癌を含め他の原因はまれである。
（アルドステロン産生腺腫）
　アルドステロン産生腺腫（以下、ＡＰＡともいう）は、副腎腫瘍の１つの病態である。アルドステロン産生腺腫とは、例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　５８：７１１－７２１，　２０１１に記載の基準によって診断される病態をいう。アルドステロン産生腺腫は、腺腫の存在する副腎摘除で治癒が期待できる疾患であるが、診断されないまま本態性高血圧として降圧薬による治療を受けている場合もある。本発明の診断用負荷試験剤は、副腎皮質刺激ホルモンを被検体に投与し、血中のアルドステロン等の特定ホルモン濃度の分析に基づいて、簡易に侵襲性が低い態様で、アルドステロン産生腺腫を検出することができる。
（特発性アルドステロン症）
　特発性アルドステロン症（以下、ＩＨＡともいう）は、例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　５８：７１１－７２１，　２０１１に記載の基準によって診断される病態をいう。原発性アルドステロン症の中で、臨床上、特に良く見られる病態である。
［副腎皮質刺激ホルモンを用いた、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験方法、又は診断の補助の為の方法］
（負荷試験）
　通常、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）刺激試験（ＡＣＴＨ負荷試験）は、原発性アルドステロン症の確認試験には不十分であるとされている。本発明の方法においては、主に、原発性アルドステロン症とされた被験体に対して、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）刺激試験（ＡＣＴＨ負荷試験）を行い、アルドステロン産生腺腫（ＡＰＡ）と特発性アルドステロン症の識別を簡易に効率的に行うことができる。測定に有用である確定診断のために、現在は、カプトプリル負荷試験（ＣＣＴ）、フロセミド立位試験（ＦＵＴ）、および生理食塩水負荷試験を含む３種類の確認試験のうち少なくとも２種類が推奨されている。
　一方、本発明では、副腎皮質刺激ホルモンを、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン産生腺腫の被検体由来試料では、アルドステロン値が高値になり、特発性アルドステロン症場合には、値が低下することを見出した。
　従って、本願発明の方法を用いることによって、特に他の追加の負荷試験を行っても行わなくても、副腎皮質刺激ホルモンの投与から一定期間経過した後に、具体的には、９０～１８０分経過後に、被検体から得られる試料のアルドステロン量を測定することによって、簡易に迅速に、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別が可能となる。
　さらに、一方では、基準ホルモンは、被検体のそれぞれについて、時間経過に関係なく、一定の値を示すことを見出した。従って、例えば、投与から一定期間経過後に、アルドステロン／基準ホルモン比を検出することで、より明瞭にアルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症を識別することが可能となる。
（測定方法等）
　本発明における、被検体からの被検体由来試料の採取は、限定はされないが、副腎皮質刺激ホルモンを、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に少なくとも１回行う。本発明における、被検体からの体液、代表的には、血液の採取は、限定はされないが、副腎皮質刺激ホルモンを、被検体に投与後、好ましくは、１００～１６０分経過後、さらに好ましくは、１１０～１５５分経過後、さらにより好ましくは、１２０分±１分経過後、最も好ましくは、１２０分経過後に行う。場合によっては、１５０分±１分経過後まで行うことも好ましい。但し、さらに、例えば、副腎皮質刺激ホルモンを、被検体に投与後、３０分後、及び／又は６０分後などの他の時点でのサンプルとともに、異なるタイミングで少なくとも１回ずつの合計２回以上、好ましくは、異なるタイミングで少なくとも１回ずつの合計４回以上サンプリングを行い、それらの知見と併せて診断を補助することも好ましい。
　ここで、副腎皮質刺激ホルモンの投与量は、０．１～１ｍｇ、好ましくは、０．２５～０．５ｍｇであり得る。
　例えば、副腎皮質刺激ホルモンを、５％ブドウ糖注射液、生理食塩液、注射用水に溶解し、筋注又は静注することで行うことで、投与することができる。ここで、静注は、好ましくは、時間をかけない短時間投与であり、より好ましくは、投与開始から投与終了まで１分程度である。なお、被検体由来試料の採取で、９０～１８０分経過後という時には、投与終了後を起点とした時間経過を指す。
　投与時に被検体は、限定はされないが、安静の状態であることが好ましい。例えば、仰臥位１５分～６０分程度、好ましくは、２０分～４０分程度安静にした状態の後、静脈注射を行い投与することができる。
　本明細書において、被検体とは、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の対象となる哺乳動物を指し、限定はされないが、好ましくは、サル、イヌ、ネコ、マウス、あるいはヒトである。本発明においては、限定はされないが、原発性アルドステロン症と診断された被検体を検出対象とすることが好ましい。
　被検体由来試料とは、被検体に由来する体液を指し、体液そのものの他、体液の濃縮液、希釈液、あるいはその他の適宜の処理済みの液体を指す。ここで、体液は、限定はされないが、例えば、血液（全血、血漿、血清）、尿、を指す。好ましくは、体液は、血液である。ここで、血液などの体液の採取量は、１００μｌ～１００ｍｌ、好ましくは、５００μｌ～１００ｍｌ、さらに好ましくは、１ｍｌ～５０ｍｌである。限定はされないが、血液は、肢静脈から得られることが好ましい。肢静脈は、足や腕の静脈であり、特には、腕静脈であることが簡易で好ましい。
　従来の副腎静脈サンプリングにおいては、副腎静脈から血液を採取する必要があり、左右にある副腎のどちら側からアルドステロンが多量に含まれているかを調べることによって、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別していたが、本発明の方法によれば、このような左右の副腎からのアルドステロン量を区別することなく、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別が可能となる。
　本発明においては、肢静脈以外からの採血を排除するものではないが、肢静脈からの採血は、本発明の方法を簡易に迅速に侵襲性が少なく行う為に、より有効である。
　ここで、体液の処理は、より詳細には、濃縮、希釈、分画、脱塩等の前処理、グリセリン等の保存剤、プロテアーゼ阻害剤等の安定化剤、防腐剤を加えることなどを指す。冷蔵または冷凍処理した後に常温に戻すこと、冷蔵または冷凍処理前後のいずれかで適宜の処理を行うことなども含まれる。さらに、例えば体液が血液の場合には、適宜の処理として抗凝血剤処理を行うこともできる。これらの処理を組み合わせることも可能である。遠心分離操作などで、血漿を分別し、試験に供することもできる。
　濃縮は、例えば、体液が血液の場合、試料中の最終的な総タンパク量が１ｇ／ｄＬ～５ｇ／ｄＬ、より好ましくは２ｇ／ｄＬ～３ｇ／ｄＬ程度となるように調製することが好ましい。この濃縮液をそのまま測定に供することも可能であるが、さらに総タンパク質量を希釈して調整して測定に供することもできる。
　濃縮は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標、サルトリウス・ジャパン株式会社製）、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）などを使用して、製造者の指示に従って使用することもできる。
　希釈は、蒸留水や緩衝液を用いて行うことができ、試料の調整にも利用することができる。
　試料中のアルドステロン又はコルチゾールなどの基準ホルモンの量は、試料中に含まれる質量、容量、濃度などで表わすことができる。さらには、蛍光強度、吸光度等で表わすことも可能である。
　本発明におけるアルドステロンの検出方法は、被検体由来試料中に含まれるホルモン量を検出する方法であれば特に制限されるものではないが、抗体を用いたラジオイムノアッセイまたはエンザイムイムノアッセイで検出する方法を挙げることができる。
　ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイによる方法としては、アルドステロン又はコルチゾールなどの基準ホルモンに特有の抗原を認識することができる抗体を用いることが望ましい。具体的には、これらの抗原決定基を特異的に認識する抗体が挙げられる。このような抗体は、対応するアルドステロン又はコルチゾールなどの基準ホルモンとキャリアータンパク質との複合体を抗原として、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ等に投与し、免疫することにより作製することができる。抗原をカラムに固定し、免疫動物より得られたポリクローナル抗体を精製した抗体を作製してもよい。モノクローナル抗体の作成方法も当業者に公知である。
　エンザイムイムノアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。ＥＬＩＳＡ法では、検体を９６穴プレート中で、上述の一次抗体、及び、ＨＲＰ標識二次抗体で処理することで、目的のアルドステロン又はコルチゾールなどのホルモンをＨＲＰの酵素活性に由来する発色または化学発光で検出する。サンドイッチ法などを用いることも可能である。
　被検体の代謝状態の変動による結果のばらつきを補正するため、被検体由来試料中のアルドステロン量は、ラジオイムノアッセイ、或いは、エンザイムイムノアッセイでその存在量を検出した後、同じく被検体由来試料中の基準のホルモンの存在量と比較することができる。基準ホルモンとしては、特に限定はされないが、コルチゾールが好ましく用いられ得る。
　被検体由来試料中のアルドステロンと、コルチゾールなどの基準ホルモンの存在量を、相対比で表すことが特に好ましい。
　そして、例えば、被検体由来試料におけるアルドステロンと基準ホルモンの量比を検出し、基準ホルモンに比べて、アルドステロンが有意に増加している場合には、被検体は、アルドステロン産生腺腫と判断することができる。
　ここで、基準ホルモンとしては、例えばコルチゾールを用いることができる。従って、アルドステロンとコルチゾールの量比を検出し、コルチゾールに比べて、アルドステロンが有意に増加している場合には、被検体は、アルドステロン産生腺腫と判断することができる。例えば、アルドステロン／コルチゾール相対比で、１．２０以下である場合には、アルドステロン産生腺腫ではないと判断し得る。すなわち、例えば、ここで、この値が１．２０以下である場合には、特発性アルドステロン症の可能性が高いと判断できる。アルドステロン／コルチゾール相対比で、１．２０超過、好ましくは、アルドステロン／コルチゾール相対比で、１．２１以上である場合には、被検体をアルドステロン産生腺腫と判断し得る。ここで、それぞれのホルモンの測定方法は、実施例に詳述した方法を用いる。
　［診断用負荷試験剤］
　本発明の診断用負荷試験剤は、副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤であり、上記のようなアルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の試験方法、又は診断の補助の為の方法に用い得る。
　本発明の診断用負荷試験剤には、有効成分として、副腎皮質刺激ホルモンを含む。さらに、添加剤として、マンニトール等の糖アルコールを含むこともできる。
　本発明の診断用負荷試験剤の使用方法としては、前述のアルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の試験方法、又は診断の補助の為の方法に記載した内容に準ずる。
［副腎皮質刺激ホルモンを用いた、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験用キット］
　本発明のキットは、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の試験用又は診断用のキットであり、副腎皮質刺激ホルモンを含むことを特徴とする。本発明のキットには、限定はされないが、副腎皮質刺激ホルモン以外に、用時調製用溶解液、針、指示書等を含むことが好ましい。
　本発明においては、以下の態様があり得る。
［項１］
　副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の診断用負荷試験剤であって、
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量を検出することを特徴とする、診断用負荷試験剤。
［項２］
　さらに、前記アルドステロン量の検出が、アルドステロン／基準ホルモン比によって表されることを特徴とする、項１記載の診断用負荷試験剤。
［項３］
　上記基準が、コルチゾールである、項２記載の診断用負荷試験剤。
［項４］
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体をアルドステロン産生腺腫と判断する、項１～３のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項５］
　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体を特発性アルドステロン症と判断する、項１～４のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項６］
　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０分～１５５分後に得られるものである、項１～５のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
［項７］
　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、項１～６のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
　さらには、本発明では、以下の方法を提供する。
［項８］
　アルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験するための方法であって、
副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量と基準ホルモン量を測定する工程；
アルドステロン／基準ホルモン比を基準値と比較する工程を含み、これにより、該被検体のアルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験する方法。
［項９］
　上記基準ホルモンが、コルチゾールであることを特徴とする、項８記載の方法。
［項１０］
　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体がアルドステロン産生腺腫と識別する項７又は８に記載の方法。
［項１１］
　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体が突発性アルドステロン症と識別する項８又は９に記載の方法。
［項１２］
　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０～１５５分後に得られるものである、項８～１１のいずれか１項記載の方法。
［項１３］
　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、項８～１２のいずれか１項記載の方法。
　ここで、上記項１～１３のいずれにおいても、アルドステロンの量は、血漿中アルドステロン濃度であり得る。血漿中アルドステロン濃度は、スパック－Ｓアルドステロンキット（富士レビオ株式会社製）を用いたラジオイムノアッセイによる測定方法により、製造者の使用指示（２０１４年１１月改定第５版）に忠実に従い行う測定方法に従って求められる測定値であり得る。
　ここで、上記項１～１３のいずれにおいても、コルチゾールの量は、血漿中コルチゾールの濃度であり得る。血漿中コルチゾール濃度は、ケミルミコルチゾールＩＩ（シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社）及びケミルミ　ＡＤＶＩＡ　Ｃｅｎｔａｕｒ　ＸＰＴケミルミアナライザー全自動化学発光免疫測定装置（シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社）を用いて、化学発光イムノアッセイにより、製造者の使用指示（２０１６年６月改定第８版）と機器の取扱い説明書に忠実に従って求められる測定値であり得る。
　次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［ホルモンの血漿中濃度測定］
　以下の実施例において、アルドステロン及びコルチゾール血液中（血漿中）濃度を、以下のように測定して求めた。
（血漿中アルドステロンの測定）
　血漿中アルドステロン濃度の測定は、市販のキット（スパック－Ｓアルドステロンキット；富士レビオ株式会社製）を用いて、ラジオイムノアッセイにより、製造者の使用指示（２０１４年１１月改定第５版）に忠実に従い、行った。
　まず、被検体から得た血液を、ただちにＥＤＴＡ－２Ｎａ入りチューブに移し、遠心分離を行い、測定時まで－２０℃で保存した。測定は、血液採取から、１週間以内に行った。測定に際し、試料の希釈は行わなかった。
　次に、キットに含まれるアルドステロン抗体チューブに、標準アルドステロン溶液、又は室温に戻した被検体の血漿を１００μｌとった。ここで、標準アルドステロン溶液は標準曲線用抗体チューブに、被検体の血漿は未知検体用抗体チューブに入れた。次に、それぞれのチューブに、ヨウ化アルドステロン試薬５００μｌを加え、室温（２５℃）で３時間振盪した。振盪後、上清を吸引した後、抗体チューブの放射能をγ－カウンター（ＡＲＣ９５０：株式会社日立製作所製）で測定した。得られた標準曲線と被検体の血漿から得られた値を照合することで、アルドステロン濃度を求めた。
（血漿中コルチゾールの測定）
　血漿中コルチゾール濃度の測定は、市販のキット（ケミルミコルチゾールＩＩ：シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社）及びケミルミ　ＡＤＶＩＡ　Ｃｅｎｔａｕｒ　ＸＰＴケミルミアナライザー全自動化学発光免疫測定装置（シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社）を用いて、化学発光イムノアッセイにより、製造者の使用指示（２０１６年６月改定第８版）と機器の取扱い説明書に忠実に従い、行った。
　まず、被検体から得た血液を、ただちにＥＤＴＡ－２Ｎａ入りチューブに移し、遠心分離を行い、測定時まで－２０℃で保存した。測定は、血液採取から、１週間以内に行った。
　次に、機器にキット中の試薬を充填し、次に被検体の血漿２０μｌを充填し、コルチゾール濃度を求めた。
［原発性アルドステロン症における診断の手順］
　血漿アルドステロン濃度（ＰＡＣ）／血漿レニン活性（ＰＲＡ）比が２０以上で手術予定の患者が対象である。検査前に降圧薬としてＣａチャネル拮抗および／またはα遮断薬を投与した。必要に応じて経口カリウム補給を行った。患者は病院で塩化ナトリウム１０ｇ／日を摂取していた。確認試験のための基礎血液採取はすべて、一夜絶食後の８：００～８：３０ＡＭに行った。
［カプトプリル負荷試験］
　患者は仰臥位で６０分間安静にした後、カプトプリル２５ｍｇを服用した。カプトプリル服用前後に血液検体を採取した。カプトプリル投与６０分後の血漿アルドステロン濃度（ＰＡＣ）／血漿レニン活性（ＰＲＡ）比２０以上を陽性とした。ＣＣＴにおけるＰＡＣおよびＰＲＡの基礎サンプリングを当該患者の基礎値としてこの分析に用いた。
［フロセミド立位負荷試験：ＦＵＴ］
　仰臥位で３０分間安静にした後、患者に１ｍｇ／ｋｇのフロセミド（６０ｍｇまで）を静脈内注射し、２時間立位で維持した。フロセミド負荷後１２０分で２．０ｎｇ／ｍｌ／ｈｒ以下のＰＲＡ値を陽性とした。
［副腎皮質刺激ホルモン刺激試験］
　仰臥位で３０分間安静にした後、患者は２５０μｇの合成副腎皮質刺激ホルモン（コートロシン；第一三共株式会社製）を静脈内注射により投与された。血液サンプルを、通常の採血と同様に腕から、負荷前および負荷後３０分後、６０分後、および１２０分後に採取した。さらに、追加で、一部の患者に対して１５０分後まで採取した。副腎皮質刺激ホルモン注射後のアルドステロンのピーク濃度の時点で、０．８５以上のＰＡＣとコルチゾールの比（ＰＡＣｍａｘ／コルチゾール）を陽性とした。すなわち、原発性アルドステロン症の可能性が高いと判断された。
［参考試験］
（副腎静脈サンプリング）
　副腎静脈サンプリング（ＡＶＳ）は、専門の放射線科医によって実施された。マイクロカテーテル先端の右副腎静脈への正確な局在を確認するため、全患者において手術中にＣＴ撮影を実施した。両側副腎静脈からの基礎サンプル採取後、２５０μｇの副腎皮質刺激ホルモンを静脈内注射により投与し、３０分間待った後、副腎静脈から２回目のサンプル採取を行った。ＪＥＳのガイドラインによると、副腎皮質刺激ホルモン刺激後の２００μｇ／ｄＬ以上の副腎静脈コルチゾール濃度は、ＡＶＳに対する適切なカテーテル留置の証拠と考えられた。副腎皮質刺激ホルモン刺激後の１４００ｎｇ／ｄＬ以上の副腎静脈アルドステロン濃度は、アルドステロン過剰分泌の証拠と考えられた。副腎静脈のアルドステロン過剰分泌の局在は、病型、すなわちアルドステロン産生腺腫又は特発性アルドステロン症の診断のための主要な基準とした。さらに、特発性アルドステロン症の診断には、ｌａｔｅｒａｌｉｚｅｄ　ｒａｔｉｏ（副腎静脈の両側におけるアルドステロン／コルチゾール比の比較；高値側／低値側２．６未満）およびｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ　ｒａｔｉｏ（低値側副腎静脈／下大静脈の上側におけるアルドステロン／コルチゾール比の比較；１．０以上）を用いた。
（試験１）
［対象患者］
　２０１１年７月から２０１８年３月までに、副腎静脈サンプリングによる局在診断までを行い、確認検査をした上で、原発性アルドステロン症と診断された患者の医療記録を対象として選び、分析した。条件を満たす４０名の対象者を本試験に組み入れた。本研究は、既に確定診断を行った対象についての研究であり、宮崎大学倫理委員会によって承認されたものである。全対象者に造影ＣＴ画像検査を実施した。片側性ＰＡと診断された患者は全て腹腔鏡下副腎摘出術を受け、病理学的診断により最終的にアルドステロン産生腺腫と診断された。また、術後に副腎皮質刺激ホルモン負荷試験にて再検査を行い、アルドステロン分泌の正常化を確認している。
［統計解析］
　ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２２（ＩＢＭ　Ｊａｐａｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて統計解析を行った。すべての変数について正規分布を確認した後、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の差の有意性を、対応のないｔ検定またはカイ二乗検定によって評価した。変数間の関係は単純な相関解析を用いて解析した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算して、サブタイプを検出するための最良のマーカーを決定した。平均値±標準偏差で表し、統計的有意性の基準はＰ＜０．０５とした。
　この結果として、患者のベースライン特性および確認試験の要約を表１に示す。
　術後アルドステロン産生腺腫と確認された患者は、特発性アルドステロン症患者よりも重度の低カリウム血症を伴い、血漿アルドステロン濃度（ＰＡＣ）、ＰＡＣ／血漿レニン活性（ＰＲＡ）比および副腎腫瘍の発生率はＡＰＡ群で有意に高く、ＦＵＴ負荷後のＰＲＡはＡＰＡ群で有意に低かった。副腎皮質刺激ホルモン負荷試験の結果を図１に示した。ＰＡＣおよびＰＡＣ／コルチゾール比は、ＡＰＡ群の副腎皮質刺激ホルモン負荷試験の各ポイントで有意に高かった。ＰＡＣｍａｘ／コルチゾール比はＡＰＡ群で有意に高かった（表１）。アルドステロン産生腺腫を検出するための最良の予測因子を決定するために、ＲＯＣ曲線分析を行い、ＡＵＣを比較した（表２）。血清カリウム、副腎腫瘍、およびＣＣＴやＦＵＴなどの推奨される確認検査は、ＰＡのサブタイプを区別する能力が低かった。対照的に、本発明の副腎皮質刺激ホルモン負荷試験はＰＡのサブタイプを識別するより高い能力を示した。
　既に知られているマーカーを含むいくつかのマーカーを表２にまとめた。特に１２０分でのＰＡＣ／コルチゾール比は標識の中で非常に高いＡＵＣ（０．９５６）を示した。副腎皮質刺激ホルモン負荷試験のマーカーの各ＲＯＣ曲線を図２に示し、１２０分後のＰＡＣ／コルチゾール比のＲＯＣ曲線はすべての点で他のマーカーを上回った。
　ＲＯＣ曲線分析を用いて、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１２０分における１．２０ＰＡＣ／コルチゾール比のカットオフ値を設定した。アルドステロン産生腺腫患者では、２２例中２１例が１．２０超過（感度９５．５％）、特発性アルドステロン症患者では、１８例中１６例が１．２０以下（特異度８８．９％）であった（図３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このように、実施例において、従来技術より有用なマーカーおよびカットオフ値、すなわち、ＡＳＴにおける１２０分でのＰＡＣ／コルチゾール比１．２０を、ＡＰＡの測定に十分に高い感度（９５．５％）で同定した。
　ＡＳＴは便利で安全な検査であり、ＡＶＳ前にＡＳＴを使用するＡＰＡ患者の事前選択は、臨床現場で汎用性があり、有益である。ＡＰＡはＩＨＡよりもＡＣＴＨ刺激に対して高い反応を示すことが知られているが、実際に、本実施例においても、ＡＰＡ群はＩＨＡ群よりも有意に高い反応を示した（図１）。
　さらに、ＡＰＡ群はＡＣＴＨ刺激に対して長期間反応し、１２０分で高レベルのＰＡＣを維持した（０分と１２０分の間の平均差は２２．０ｎｇ／ｍＬであった）。対照的に、ＩＨＡ群は１２０分後にほぼ基礎レベルに戻った（０分と１２０分の間の平均差は８．５ｎｇ／ｍＬであった）。コルチゾールの血清濃度は１２０分で最高値を示し、それらはＡＰＡ群よりもＩＨＡ群でわずかに高かった（２８．３対２５．８ｇ／Ｄｌ、Ｐ＝０．０７６，１２０分）。
　したがって、ＩＨＡ群のＰＡＣ／コルチゾール比は１２０分で最も低い値を示し、分散が最も低かった（図１）。これによって、ＰＡのサブタイプのマーカーとして、１２０分でＰＡＣ／コルチゾール比を選択することができることがわかった。すなわち、ＰＡＣ／コルチゾール値が１．２０以下のＰＡ患者は、特発性アルドステロン症である可能性が極めて高いため、ＡＶＳから除外できる。
（試験２）
［対象患者］
　２０１８年８月から２０１９年５月までに、副腎静脈サンプリングによる局在診断までを行い、確認検査をした上で、原発性アルドステロン症と診断された患者の医療記録を対象として選び、前述したＡＳＴにおける１２０分のＰＡＣ／コルチゾール比１．２０の有効性を検証した。条件を満たす１４名の対象者を本試験に組み入れた。全対象者に造影ＣＴ画像検査を実施した。片側性ＰＡと診断された患者は全て腹腔鏡下副腎摘出術を受け、病理学的診断により最終的に３例がアルドステロン産生腺腫、１例が片側性過形成と診断された。また、術後に副腎皮質刺激ホルモン負荷試験にて再検査を行い、アルドステロン分泌の正常化を確認している。
　前述した試験結果に従って、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１２０分における１．２０ＰＡＣ／コルチゾール比のカットオフ値を使用した。片側性病変では３例がアルドステロン産生腺腫であったが、３例中３例が１．２０超過（感度１００％）であった。１例は片側性過形成であったため、本検討から除外した。特発性アルドステロン症では、１０例中８例が１．２０以下（特異度８０％）であった。
　同様に、副腎皮質刺激ホルモン負荷試験で１２０分における１．２０ＰＡＣ／コルチゾール比のカットオフ値が１５０分でも有効かどうかを検討した。１４名中９名には１５０分での採取を実施した。アルドステロン産生腺腫では、２例中２例が１．２０超過（感度１００％）、特発性アルドステロン症では、６例中６例が１．２０以下（特異度８０％）であった。特記すべきは、１２０分において１．２０を超過していた２例が１．２０以下となった（図５）。
　試験１及び試験２の内容をまとめると、アルドステロン産生腺腫患者では、２５例中２４例が１．２０超過（感度９６．０％）、特発性アルドステロン症患者では、２８例中２４例が１．２０以下（特異度８５．７％）であった。
　試験１及び試験２を総合すると、従来技術より有用なマーカーおよびカットオフ値、すなわち、ＡＳＴにおける１２０分でのＰＡＣ／コルチゾール比１．２０を、ＡＰＡの測定に十分に高い感度（９６．０％）で同定した。
　ＡＳＴは便利で安全な検査であり、ＡＶＳ前にＡＳＴを使用するＡＰＡ患者の事前選択は、臨床現場で汎用性があり、有益である。ＡＰＡはＩＨＡよりもＡＣＴＨ刺激に対して高い反応を示すことが知られているが、実際に、本実施例においても、ＡＰＡ群はＩＨＡ群よりも有意に高い反応を示した。
　さらに、ＡＰＡ群はＡＣＴＨ刺激に対して長期間反応し、１２０分で高レベルのＰＡＣを維持した（０分と１２０分の間の平均差は２２．０ｎｇ／ｍＬであった）。対照的に、ＩＨＡ群は１２０分後にほぼ基礎レベルに戻った（０分と１２０分の間の平均差は８．５ｎｇ／ｍＬであった）。コルチゾールの血清濃度は１２０分で最高値を示し、それらはＡＰＡ群よりもＩＨＡ群でわずかに高かった（２８．３対２５．８ｇ／Ｄｌ、Ｐ＝０．０７６、１２０分）。
　したがって、ＩＨＡ群のＰＡＣ／コルチゾール比は１２０分で最も低い値を示し、分散が最も低かった。これによって、ＰＡのサブタイプのマーカーとして、１２０分でＰＡＣ／コルチゾール比を選択することができることがわかった。すなわち、ＰＡＣ／コルチゾール値が１．２０以下のＰＡ患者は、特発性アルドステロン症である可能性が極めて高いため、ＡＶＳから除外できる。
 

Claims (13)

  1. 　副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする、アルドステロン産生腺腫と特発性アルドステロン症の識別の為の、診断用負荷試験剤であって、
    　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量を検出することを特徴とする、診断用負荷試験剤。
  2. 　前記アルドステロン量の検出が、アルドステロン／基準ホルモン比によって表されることを特徴とする、請求項１記載の診断用負荷試験剤。
  3. 　前記基準ホルモンが、コルチゾールである、請求項１又は２記載の診断用負荷試験剤。
  4. 　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体をアルドステロン産生腺腫と判断する、請求項３記載の診断用負荷試験剤。
  5. 　前記負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン／コルチゾール比を検出し、該アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体を特発性アルドステロン症と判断する、請求項３記載の診断用負荷試験剤。
  6. 　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０～１５５分後に得られるものである、請求項１～５のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
  7. 　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、請求項１～６のいずれか１項記載の診断用負荷試験剤。
  8. 　アルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験するための方法であって、
    副腎皮質刺激ホルモンを有効成分とする負荷試験剤を、被検体に投与後、９０～１８０分経過後に被検体から得られる試料において、アルドステロン量と基準ホルモン量を測定する工程；
    アルドステロン／基準ホルモン比を基準値と比較する工程を含み、これにより、該被検体のアルドステロン産生腺腫と突発性アルドステロン症の識別を試験する方法。
  9. 　前記基準ホルモンが、コルチゾールであることを特徴とする、請求項８記載の方法。
  10. 　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０超過である場合に、該被検体がアルドステロン産生腺腫と識別する請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記アルドステロン／コルチゾール比が１．２０以下である場合に、該被検体が突発性アルドステロン症と識別する請求項８又は９に記載の方法。
  12. 　前記試料が、前記負荷試験剤を、被検体に投与後、１１０～１６０分後に得られるものである、請求項８～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記被検体から得られた試料が、肢静脈から得られた血液である、請求項８～１２のいずれか１項記載の方法。
     
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