WO2012157130A1 - 原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び18-オキソコルチゾール（18-oxoF）、18-ヒドロキシコルチゾール（18-OHF）の測定法 - Google Patents

原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び18-オキソコルチゾール（18-oxoF）、18-ヒドロキシコルチゾール（18-OHF）の測定法 Download PDF

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貞嘉 伊藤
玲 森本
公伸 笹野
保宏 中村
幸和 山下
光伸 奥山
誠次郎 本間
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株式会社あすか製薬メディカル
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Definitions

  • the present invention relates to an adenoma identification method for primary aldosteronism and to measure the amount of 18-oxoF, 18-OHF contained in a sample by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • PA primary aldosteronism
  • PA types include aldosterone-producing adenoma (APA), which can be cured by surgery, medical treatment based on idiopathic aldosteronism (bilateral adrenal hyperplasia: IHA), glucocorticoid-reactive aldosteronism (GRA), etc. It is divided roughly. Therefore, it is therapeutically important to simply distinguish APA in clinical tests such as peripheral blood.
  • APA aldosterone-producing adenoma
  • IHA bilateral adrenal hyperplasia
  • GAA glucocorticoid-reactive aldosteronism
  • Diagnosis of primary aldosteronism is carried out based on the "Guide to diagnosis of primary aldosteronism" defined by the Japan Endocrine Society. Ultimately, it is important to distinguish between APA (mainly unilateral lesions) and IHA (bilateral lesions), which are indicated for surgery.
  • APA mainly unilateral lesions
  • IHA bilateral lesions
  • patients who have been screened based on plasma aldosterone / renin activity (PAC / PRA) ratio are first subjected to functional load test such as captopril load test to determine primary aldosteronism.
  • aldosterone and adrenalin in the adrenal vein blood collection are subjected to localization diagnosis of aldosterone hypersecretion based on the values of aldosterone. Is an indication for drug treatment.
  • 18-hydroxysteroid compounds mainly produced from cortisol in vivo mainly 18-oxoF and 18-OHF
  • biomarkers of GRA non-patent document 1
  • AS aldosterone-producing enzyme
  • AS aldosterone-producing enzyme
  • Non-Patent Document 2 measures urinary 18-oxoF of glucocorticoid-reactive aldosteronism (GRA) by a direct method by RIA, but it is reported that the cross-reactivity with aldosterone is 26%.
  • GAA glucocorticoid-reactive aldosteronism
  • 18-oxoF is measured by the ELISA method, but although it is superior to the RIA method, some cross-reactivity with aldosterone and cortisol remains. Moreover, in addition to the specificity of the antibody, deviation of the measured value due to the difference between the kits is also considered.
  • Non-Patent Document 7 attempts to compare the TR-FIA method and the ELISA method, and although it is found to be correlated, 18-oxoF measurement is reported to have 8% cross-reactivity with aldosterone.
  • Non-Patent Document 8 18-OHF in urine is measured, but 18-oxoF is not measured.
  • Non-Patent Document 9 measures 18-OHF and 18-oxoF in urine of patients with bilateral adrenalectomy but does not mention differentiation of adenomas in Cushing's disease.
  • Non-Patent Document 10 differentiation of APA and IHA of primary aldosteronism using 18-OHF was reported, but there is a lot of overlap between the two, and the differentiation can not be said to be sufficient.
  • An object of the present invention is to provide an adenoma differentiation method using 18-oxoF present in peripheral blood of patients with primary aldosteronism. Another object of the present invention is to provide a measurement method by LC-MS including simultaneous measurement of 18-oxoF and 18-OHF contained in a sample. In addition, another object of the present invention is to provide a compound useful for measurement of 18-oxoF, 18-OHF by LC-MS and a reagent for measuring 18-oxoF, 18-OHF characterized by containing the compound. It is to be.
  • the present inventors succeeded in measuring the amounts of 18-oxoF and 18-OHF in a sample at 0.5 pg and 5 pg / assay levels, respectively, using LC-MS.
  • the method of measuring 18-oxoF, 18-OHF of the present invention was completed. That is, the present invention provides a method of reacting 18-oxoF contained in a sample with an alcohol to produce 18-alkoxylation by an alcohol, and further measuring by LC-MS as a fuza phosphate ester. In addition, 18-OHF is directly esterified with fusa phosphate.
  • Another object of the present invention is to provide a compound useful in the measurement of 18-oxoF, 18-OHF by LC-MS, and a measuring reagent comprising the compound.
  • the present inventors focused on 18-oxoF and 18-OHF as markers of the adenomatous differentiation method of primary aldosteronism, and compared those values obtained by the measurement method of the present invention, as a result of APA and IHA. Were found to be effective in the identification of E. coli, and completed the present invention. That is, the present invention provides a method for differentiating APA and IHA of primary aldosteronism based on the amount of 18-oxoF in peripheral blood and a method for providing data for differentiation.
  • a method for measuring 18-oxoF, 18-OHF in a sample by LC-MS which comprises the steps of: 1) reacting the sample with alcohol under acidic conditions; 2) the following formula (I) (Wherein, R 1 is hydrogen atom, halogen atom, C 1-4 alkyl group, C 1-4 alkoxy group, allyl C 1-4 alkoxy group, C 1-4 alkylamino group, di (C 1-4 alkyl) Represents an amino group, a nitro group or a cyano group, and X represents a hydroxy group or a leaving group) Reacting a compound represented by And measuring method.
  • the differentiation method according to [10] wherein the amount of 18-oxoF in the sample is measured by LC-MS, GC-MS, RIA, EIA, CLIA, TR-FIA.
  • the differentiation method according to [10] which comprises measuring the amount of 18-oxoF in a sample using the measurement method according to [1].
  • 18-oxoF itself forms chemical equilibria in a plurality of forms in solution, it is difficult to make measurements based on mass spectrometry, but according to the present invention, 18-oxoF is alkyletherified By making the compound stable and further converting it into a fusalic acid ester, and by directly esterifying 18-OHF with fusalic acid, the measurement sensitivity in LC-MS is increased. It enables quantitative and sensitive analysis of 18-oxoF and 18-OHF in a sample.
  • 18-oxoF and 18-OHF in a sample can be measured up to 0.5 and 5 pg / assay (lower limit of quantification), respectively. This allows measurement in peripheral blood and allows differentiation of primary aldosteronism adenomas.
  • the sample is subjected to simple purification means such as extraction with a solvent, solid phase extraction, centrifugation etc., and then reaction with alcohol under acidic conditions or direct ester derivatization
  • simple purification means such as extraction with a solvent, solid phase extraction, centrifugation etc.
  • reaction with alcohol under acidic conditions or direct ester derivatization The reaction is performed with a reagent and can be performed extremely easily.
  • FIG. 1 is a precursor ion mass spectrum of cortisol-18-ethoxy-21-fuzarinyl ester.
  • FIG. 2 is a product ion mass spectrum of cortisol-18-ethoxy-21-fuzarinyl ester.
  • FIG. 3 shows a calibration curve of 0.5 to 1000 pg / tube (5 to 10000 pg / mL) when 18-oxoF standard is 18-ethoxy-21-fuzarinyl esterified.
  • FIG. 4 is a precursor ion mass spectrum of cortisol-18-hydroxy-21-fuzarinyl ester.
  • FIG. 5 is a product ion mass spectrum of cortisol-18-hydroxy-21-fuzarinyl ester.
  • FIG. 6 shows a calibration curve from 5 to 20000 pg / tube (50 to 200,000 pg / mL) when 21-fusarinyl esterification of 18-OHF standard is performed.
  • 18-OHF is 18-Hydroxycortisol: 18-oxoF refers to 18-oxocortisol: Point to These compounds are metabolites produced from cortisol by CYP11B1 and CYP11B2 involved in aldosterone biosynthesis.
  • measurement of 18-oxoF and 18-OHF can be performed using LC-MS, GC-MS, RIA, EIA, CLIA, TR-FIA, etc., but microquantitability is possible, sensitivity, LC-MS is most suitable because of its high degree of specificity and its ability to perform simultaneous measurements.
  • LC-MS represents an analysis method performed using an apparatus combining liquid chromatography and a mass spectrometer, and among them, a tandem mass spectrometer in which a plurality of mass separation units are combined It is preferred to use (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer: LC-MS / MS).
  • ionization in LC-MS for example, APCI, ESI, APPI and the like can be mentioned, and among them, ESI is preferably used.
  • the mass separation method includes, for example, magnetic field type, quadrupole type, time-of-flight type, etc. In the present invention, a quadrupole type with good quantitative property, wide dynamic range and good linearity is used.
  • the detection of ions in the quantification selectively detects only the target ion, selected ion monitoring (SIM), or one of the ion species generated in the first mass separation unit.
  • SIM selected ion monitoring
  • Examples include Selected Reaction Monitoring (SRM), which is selected as a precursor ion, and the second mass separation unit detects a product ion generated by the decomposition of the precursor ion.
  • SRM Selected Reaction Monitoring
  • measurement by SRM is preferred, which increases the S / N (signal / noise) ratio by increasing the selectivity and reducing the noise.
  • the “alcohol” in the present invention represents a linear or branched alcohol, and examples thereof include methanol, ethanol, n-propanol, n-butanol and the like, and more suitable are: Ethanol and methanol.
  • R 1 is hydrogen atom, halogen atom, C 1-4 alkyl group, C 1-4 alkoxy group, allyl C 1-4 alkoxy group, C 1-4 alkylamino group, di (C 1-4 alkyl) Represents an amino group, a nitro group or a cyano group, and X represents a hydroxy group or a leaving group
  • R 1 represents a hydrogen atom, a halogen atom, a C 1-4 alkyl group, a C 1-4 alkoxy group, an allyl C 1-4 alkoxy group or a di (C 1-4 alkyl) amino group
  • R 1 represents a butyl group is preferable.
  • X in the compound shown by the said Formula (I) represents a hydroxyl group or a leaving group.
  • leaving group means a group capable of reacting with hydroxyl group to replace the hydroxyl group, and there is no particular limitation in the present invention, but for example, halogen group (fluoro, chloro, bromo, iodo) And lower alkylcarbonyloxy groups and dicarboxylic acid imide groups.
  • X is preferably a hydroxy group.
  • the lower alkyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl and t-butyl. , N-pentyl, n-hexyl and the like.
  • the position of substitution of -COX in the compound represented by the formula (I) used in the measurement method of the present invention is not particularly limited, but is more preferably the 2-position of the pyridine ring.
  • Particularly preferred compounds of the formula (I) are fusaric acid.
  • R 1 is hydrogen atom, halogen atom, C 1-4 alkyl group, C 1-4 alkoxy group, allyl C 1-4 alkoxy group, C 1-4 alkylamino group, di (C 1-4 alkyl)
  • R 2 represents an amino group, a nitro group or a cyano group, and R 2 represents a C 1-4 alkyl group.
  • R 1 in the compound represented by is a hydrogen atom, a halogen atom, a C 1-4 alkyl group, a C 1-4 alkoxy group, an allyl C 1-4 alkoxy group or a di (C 1-4 alkyl) amino group
  • R 1 represents a butyl group are preferable.
  • R2 represents an ethyl group or a methyl group are preferable.
  • Particularly preferred compounds of the formula (II) are cortisol-18-methoxy-21-fusanilyl ester or cortisol-18-ethoxy-21-fusanilyl ester produced from 18-oxoF, methanol or ethanol, and fusolic acid It is.
  • Particularly preferred compounds of the formula (III) are cortisol-18-hydroxy-21-fusanilyl esters produced from 18-OHF and fusolic acid.
  • a "sample” may be from any of biological, environmental or industrial products.
  • biological samples include blood of animals including humans, saliva, tears, urine, feces, bile, tissues, cultured cells, preparations obtained from cell cultures or organs, or extracts from plants, etc. Can be mentioned.
  • samples derived from environment soil, sewage, waste water, river water, seawater etc. are mentioned, for example.
  • samples derived from industrial products include foodstuffs, medicines and the like.
  • samples of biological origin include blood, saliva, urine, feces, bile, tissues and cell culture fluid of animals including human
  • samples of environmental origin include sewage, drainage and rivers. Water is mentioned, and as a sample of industrial origin, medicines are mentioned.
  • the blood of the animal is, but not limited to, blood derived from adrenal vein blood, peripheral blood, and more preferably peripheral blood.
  • peripheral blood is not limited, it is preferable from the legs and arms.
  • the measuring method of the present invention is specifically described below.
  • Preparation of sample The sample is subjected to extraction with an organic solvent, if necessary, followed by solid phase extraction, for example, an Oasis HLB (registered trademark) cartridge manufactured by Waters, a Bond Elut C 18 (registered trademark) cartridge manufactured by Varian, a GL
  • Oasis HLB registered trademark
  • Bond Elut C 18 registered trademark
  • Varian a GL
  • a general preparation method such as separation and purification using an InertSep Pharma (registered trademark) cartridge manufactured by Science Co., Ltd. can be appropriately selected and prepared, and can be subjected to the following alkoxylation and fusa phosphate formation reaction.
  • Alkoxylation Reaction The sample prepared above is reacted with an alcohol under acidic conditions to alkoxylate the 18-position of 18-oxoF contained in the sample.
  • the acid used for this reaction include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, p-toluenesulfonic acid and the like, among which hydrochloric acid is desirable.
  • the alcohol methanol, ethanol, n-propanol, n-butanol and the like can be used, among which methanol and ethanol are preferable.
  • the amount of acid and alcohol used in this reaction is not particularly limited, but 1 mL or 0.5 g of a mixed solution of acid and alcohol prepared so that the proportion of acid in alcohol is around 5% It is suitable to add to the prepared sample in the range of 0.01 to 1 mL, more preferably in the range of 0.1 to 0.5 mL.
  • the reaction temperature may generally be in the range of -5 ° C to 80 ° C, preferably a temperature in the range of 10 ° C to 30 ° C.
  • the reaction time may be usually in the range of 5 to 240 minutes, preferably in the range of 15 minutes to 90 minutes.
  • This reaction is generally carried out by using the above alkoxylated or non-directly alkoxylated sample in the presence of a suitable base such as, for example, sodium hydride, potassium carbonate, triethylamine, pyridine, etc.
  • a suitable base such as, for example, sodium hydride, potassium carbonate, triethylamine, pyridine, etc.
  • Ethers such as dioxane, tetrahydrofuran, dimethoxyethane; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene etc .
  • amides such as dimethylformamide, dimethylacetamide; acetonitrile
  • inert organic solvents such as dimethylsulfoxide) or water with it It can be carried out by dissolving or suspending in a mixed solvent.
  • the reaction temperature may generally be in the range of -5 ° C to 80 ° C, preferably in the range of 10 ° C to 60 ° C.
  • the reaction time can be usually in the range of 5 to 240 minutes, and preferably in the range of 15 to 90 minutes.
  • the use ratio of the compound of the formula (I) to the amount of the sample is not particularly limited, but generally, at least 0.2 mg of the compound of the formula (I) per mL of the sample Preferably, it can be used in the range of 1 to 5 mg.
  • the amount of the base used in the above-mentioned ester derivatization reaction is not particularly limited, but in general, the amount of the base can be at least 0.1 mmol, preferably 0.1 to 0.5 mmol, per mL of the sample. .
  • the compound of the formula (I) can be prepared, for example, as 1,1-carbonyldiimidazole, 1,1- It is desirable to convert the hydroxy group into a leaving group such as active amide by treating with thionyldiimidazole or the like.
  • the compound of formula (I) is previously treated with, for example, imidazole and DBU (1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene) etc. It can also be converted to other leaving groups of
  • ester derivatization reaction is performed as described above, post-treatment is performed by a conventional method, and measurement by LC-MS is performed as follows.
  • LC-MS measurement The measurement of the preparation prepared in the above reaction by LC-MS can be carried out by general LC, for example, LC 1100 such as HP 1100 made by Hewlett Packard, ACQUITY UPLC (registered trademark) made by Waters, and further Waters It can carry out using MS such as manufactured and general MS, for example, QUATTRO II (registered trademark), QUATTRO MICRO (registered trademark) manufactured by Micromass, API 5000 (registered trademark) manufactured by Applied Biosystems.
  • LC 1100 such as HP 1100 made by Hewlett Packard
  • ACQUITY UPLC registered trademark
  • MS such as manufactured and general MS, for example, QUATTRO II (registered trademark), QUATTRO MICRO (registered trademark) manufactured by Micromass, API 5000 (registered trademark) manufactured by Applied Biosystems.
  • Primary aldosteronism adenoma (APA) differentiation method After adjusting the sample by the method described above using the patient's blood, 18-oxoF and / or 18-OHF are measured and set cutoff value, sensitivity, specificity The degree of primary aldosteronism adenoma (APA) can be differentiated based on the degree.
  • the cutoff value means a value determined to be an APA when this value is exceeded.
  • the cutoff value of 18-oxoF in peripheral blood is 1.0 to 10.0 ng / dL, 3.0 to 6.0 ng / dL, preferably 4.0 to 5.5 ng / dL, more preferably 4.5 to 5.0 ng / dL.
  • the cutoff value of 18-OHF in peripheral blood is 125.0 to 350.0 ng / dL, 175.0 to 300.0 ng / dL, preferably 200.0 to 275.0 ng / dL, more preferably 225.0 to 250.0 ng / dL. If the amount of 18-oxoF or 18-OHF in peripheral blood exceeds the cut-off value, the subject can be differentiated as APA.
  • Sensitivity means the percentage of positive results obtained from subjects with APA.
  • the sensitivity suitable for discrimination is 65.0% or more, 70.0% or more, preferably 75.0% or more, more preferably 80.0% or more.
  • specificity is meant the percentage of negative results obtained from subjects with IHA.
  • the specificity suitable for differentiation is 80.0% or more, 85.0% or more, preferably 90.0% or more, more preferably 95.0% or more.
  • the adrenal gland having the adenoma can be removed by surgery.
  • the kit used for the method of the present invention describes compounds of formula (I), (II), (III), buffer, acid, base, alcohol, 18-oxoF, 18-OHF, syringe, measurement procedure It can include at least one selected from a document. Furthermore, in the case of the identification method, a document describing the judgment criteria can be included.
  • the cartridge is sequentially washed with 3 mL of purified water, 1 mL of 5% hydrochloric acid solution and 3 mL of purified water, and the target compound is eluted with acetonitrile: purified water (80:20, v / v), and the eluate is removed under reduced pressure.
  • the solution was concentrated to dryness to obtain a crudely purified product.
  • it was separated by preparative thin layer chromatography (chloroform: acetone: acetonitrile (100: 30: 10)), the Rf 0.63 site silica gel was peeled off, and eluted with ethyl acetate.
  • the eluate was concentrated to dryness to give cortisol-18-ethoxy-21-fuzarinyl ester.
  • Cortisol-18-ethoxy-21-picolinyl ester was synthesized based on the description of Patent Document 1 using 18-oxoF.
  • cortisol-18-ethoxy-21-fuzarinyl ester has a larger S / N ratio and higher sensitivity than the non-derivative 18-oxoF and cortisol-18-ethoxy-21-picolinyl ester. It turned out that it can measure.
  • the content was determined by LC-MS / MS measurement after processing according to the following 4-3) to 4-4).
  • the calibration curve is to be measured in the range of 0.5 to 1000 pg / tube (5 to 10000 pg / mL) for 18-oxoF and 5 to 20000 pg / tube (50 to 200,000 pg / mL) for 18-OHF.
  • the relationship between the peak area value / internal standard substance peak area value ratio and the concentration showed a good linearity as a correlation coefficient of 0.99 or more (FIGS. 3 and 6).
  • the cartridge is washed successively with acetonitrile: 1 mL of purified water (30: 70), 1 mL of 5% aqueous sodium bicarbonate solution and 3 mL of acetonitrile: purified water (30: 70), and then the target substance is eluted with 2 mL of acetonitrile and the elution
  • the solution was concentrated to dryness under reduced pressure.
  • the residue was dissolved in 0.1 mL of acetonitrile: purified water (40:60), and 0.01 mL of this was subjected to LC-MS / MS measurement under the conditions shown in Tables 4 and 5 below. The results are shown in Tables 6, 7, 8 and 9 below.
  • the concentration of 18-oxoF in peripheral blood of healthy adults is in the range of approximately 1 pg / ml to 33 pg / ml, and the concentration of 18-OHF is in the range of approximately 259 pg / ml to 1242 pg / ml It became clear.
  • Peripheral blood was collected from the arms of 75 APA patients and 115 IHA patients, and the amounts of 18-oxoF and 18-OHF were measured in the same manner as in Example 5.
  • ROC analysis was performed based on the 18-oxoF and 18-OHF levels of the APA patient group and the 18-oxoF and 18-OHF levels of the IHA patient group to determine the cutoff value, sensitivity, and specificity. .
  • the cutoff value of 18-oxoF was 4.8 ng / dL (48 pg / ml), the sensitivity at that time was 82.7%, and the specificity was 95.7%.
  • the cutoff value of 18-OHF was 234 ng / dL (2340 pg / ml), the sensitivity at that time was 69.3%, and the specificity was 93.0%.
  • the method of the present invention it is possible to detect the presence or absence of 18-oxoF or 18-OHF in a sample, or to measure the amount of 18-oxoF or 18-OHF.
  • the present invention can be used, for example, in the fields of medicine, pharmacy, biochemistry, public health and the like.

Abstract

　本発明は、原発性アルドステロン症患者の末梢血に存在する18-oxoFを用いた腺腫鑑別法を提供する。また、試料中の18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定方法及び化合物を提供する。より詳しくは、試料中18-oxoFをアルコキシ化した後、又は直接、18-OHFと下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体を測定する方法及び該エステル誘導体を提供する。（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）

Description

原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び18-オキソコルチゾール（18-oxoF）、18-ヒドロキシコルチゾール（18-OHF）の測定法
　本発明は、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法に関する、及び試料中に含まれる18-oxoF、18-OHFの量を液体クロマトグラフィー質量分析法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：LC-MS）により測定する方法及びその測定に用いる化合物に関する。
　日本人の高血圧患者の推定数は、4000万人以上とされ、薬物療法で治療されるのが主であるが、二次性高血圧が10％強含まれる。原発性アルドステロン症（PA）については、近年、高血圧症全体の中のPAの比率が5～10％程度との報告が相次いでなされ、PA推定患者数は少なくとも200万人とされる。PAは、同等の血圧の本態性高血圧に比較して、脳卒中、心筋梗塞、心不全、心房細動や腎障害等を有意に高頻度に引き起こす。PAの病型分類では、手術によって治癒も可能なアルドステロン産生腺腫（APA）や薬物療法が原則の特発性アルドステロン症（両側副腎過形成：IHA）、糖質コルチコイド反応性アルドステロン症（GRA）等に大別される。そのため、APAを末梢血等の臨床検査で簡便に鑑別することは治療上重要である。
　原発性アルドステロン症の診断は、日本内分泌学会が定めた「原発性アルドステロン症診断の手引き」に基づいて実施される。最終的には、手術適応となるAPA（主に片側病変）とIHA（両側病変）との鑑別が重要となる。本ガイドラインではまず血漿アルドステロン／レニン活性（PAC/PRA）比からスクリーニングされた患者にカプトプリル負荷試験等の機能性負荷試験を実施し、原発性アルドステロン症と確定する。この後、副腎部CT撮影により手術療法を検討し、副腎静脈採血（AVS）のアルドステロン、コルチゾール値からアルドステロン過剰分泌の局在診断を行い、片側病変の場合には手術となり、両側病変の場合には薬物療法の適応となる。
　確定診断に関しては、施設によって異なる数種の機能性負荷試験が実地医家には煩雑であり敬遠されることも多い。また、IHAに合併する非機能性副腎腺腫の存在やCT陰性の微小の腺腫の存在でCT等の画像診断の正診率が60％程度であるため、手術治療する場合、正診率が高いAVSが必要だが、AVSは患者の負担や医師の高度な技術が必要になることから、実施施設が限定され、より簡便な腺腫鑑別法が従来より期待されていた。
　これまでに生体内でコルチゾールから生成される18水酸化ステロイド化合物、主に18-oxoFや18-OHFが、GRAのバイオマーカーとして報告され（非特許文献1）、またAPA患者の尿中（非特許文献2）及び血漿（非特許文献3）でも高値を示すとの報告がなされている。また、18-oxoFの生成にはアルドステロン生成酵素（AS：CYP11B2）が必要とされ、ASは副腎腺腫で過剰発現しているとの報告（非特許文献4）もあることから、生成した18-oxoFはこのような腺腫鑑別に用いられる可能性がある。また、最近、副腎静脈血中の18-oxoFがAPAとIHAの鑑別に有用であるとの報告（非特許文献5）がなされたが、副腎静脈採血には医師の熟練を要する等の問題もあり、実施施設が限定される。
　18-oxoFや18-OHFの測定には、これまで、LC-MS、ガスクロマトグラフィー質量分析法（Gas Chromatography -Mass Spectrometry：GC-MS）、ラジオイムノアッセイ法（Radioimmunoassay：RIA）、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay：EIA）、化学発光免疫測定法（Chemiluminescent Immunoassay：CLIA）、時間分解蛍光免疫測定法（Time-Resolved Fluoroimmunoassay：TR-FIA）等が用いられている。このうち、RIAやEIA等といった免疫反応を利用した測定は、試料中に測定対象化合物と構造が類似した代謝物が多量に存在しているため、交差反応により定量値が大きく変動する。非特許文献2には、グルココルチコイド反応性アルドステロン症（GRA）の尿中18-oxoFをRIAによる直接法で測定しているが、アルドステロンとの交差性が26％と報告されている。非特許文献6では、ELISA法で18-oxoFを測定しているが、RIA法よりは優れるものの、アルドステロンやコルチゾールとの交差性は若干残っている。また、抗体の特異性に加えて、キット間差による測定値の乖離も考えられる。非特許文献7では、TR-FIA法とELISA法の比較が試みられており、相関を認めるものの18-oxoFの測定では、アルドステロンとの交差性が8％あると報告されている。
　GC-MS法による測定もこれまでに試みられている。非特許文献8では、尿中18-OHFは測定しているが、18-oxoFは測定していない。非特許文献9では、両側副腎切除患者の尿中18-OHF、18-oxoFを測定しているが、クッシング症を対象としたもので腺腫鑑別には言及していない。非特許文献10では、18-OHFを用いた原発性アルドステロン症のAPAとIHAの鑑別について報告したが、両者の重なりが多く、鑑別が十分とはいえない。
　これまでのところ、18-oxoFを用いたLC-MSによる測定法及び鑑別法は、報告されていない。本発明者らは、これまで、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、複数のステロイドをLC-MSにより数pgのレベルで同時測定できることを見出している（特許文献1）。また、18-oxoFと類似の構造を持つアルドステロンについても、本発明者らは、試料中のアルドステロンを試料操作の過程において、酸性条件下、アルコールと反応させ、アルドステロンを18-アルコキシの状態に収束させ、次いで21位水酸基をピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、LC-MSを用いて試料中のアルドステロンの量を数pg／アッセイのレベルで測定することに成功している（特許文献2）。
特開2007-132741号公報 特開2010-078590号公報
Kidney Int.、46、1550（1994） J. Clin. Endocrinol. Metab.、59、1022（1984） Clin. Endocrinol.、40、583（1994） J.Clin.Endocrinol. Metab.、86、4326（2001） 第18回日本ステロイドホルモン学会、37（2010） J.Steroid Biochem. Biochem. Mol.、43、523（1992） J.Steroid Biochem. Biochem. Mol.、82、83（2002） J.Clin.Endocrinol. Metab.、76、873（1993） Clin. Endocrinol.、66、659（2007） 第84回日本内分泌学会、286（2011）
　本発明の目的は、原発性アルドステロン症患者の末梢血に存在する18-oxoFを用いた腺腫鑑別法を提供することである。
　本発明の別の目的は、試料中に含まれる18-oxoF、18-OHFの同時測定も含めたLC-MSによる測定法を提供することである。
　また、本発明の別の目的は、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定で有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする18-oxoF、18-OHF測定用試薬を提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、LC-MSを用いて、試料中の18-oxoF、18-OHFの量をそれぞれ0.5pg、5pg／アッセイのレベルで測定することに成功し、本発明の18-oxoF、18-OHFの測定方法を完成させた。
　すなわち、本発明は、試料中に含まれる18-oxoFを酸性条件下、アルコールを反応させて18-アルコキシ化し、更にフザリン酸エステル体としてLC-MSで測定する方法を提供するものである。なお、18-OHFは直接フザリン酸エステル化する。
　また、本発明は、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定において有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする測定用試薬を提供することである。
　本発明者らは、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法のマーカーとして、18-oxoF、18-OHFに着目し、本発明の測定方法で得られたそれらの値を比較検討した結果、APAとIHAの鑑別に有効であることを発見し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、末梢血中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症のAPAとIHAを鑑別する方法および鑑別のためのデータを提供する方法を提供するものである。
　本発明を具体的に示すと以下の通りである。
［１］　試料中の18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定法であって、試料の処理において、
１）　酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２）　下記式（I）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、測定法。
［２］　R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表す、［１］に記載の測定法。
［３］　COXの置換位置がピリジン環の2位である、［１］又は［２］に記載の測定法。
［４］　アルコールがエタノール又はメタノールである、［１］～［３］のいずれか1つに記載の測定法。
［５］　試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、［１］～［４］のいずれか1つに記載の測定法。
［６］　下記式（II）及び（III）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、R2はC1-4アルキル基を表す。）
　で示される化合物。
［７］　R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表し、R2がエチル基又はメチル基を表す、［６］に記載の化合物。
［８］　ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している、［６］又は［７］に記載の化合物。
［９］　式（ＩＩ）及び（III）で示される化合物を含むことを特徴とする、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定用キット。
［１０］　試料中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症の副腎腺腫を鑑別する方法。
［１１］　試料中の18-oxoFの量をLC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIAにより測定する、［１０］に記載の鑑別法。
［１２］　［１］に記載の測定法を用いて、試料中の18-oxoFの量を測定することを含む、［１０］に記載の鑑別法。
　18-oxoFそれ自身は、溶液中で複数の形状で化学平衡を形成しているため、質量分析に基づく測定を行うことは困難であるが、本発明によれば、18-oxoFをアルキルエーテル化することによって化合物が安定し、さらにフザリン酸エステル体とすることによって、また、18-OHFは直接フザリン酸エステル化することによって、LC-MSにおける測定感度が上昇するため、本発明の方法により、試料中の18-oxoF、18-OHFの定量的な高感度分析が可能になる。
　本発明によれば、試料中の18-oxoF、18-OHFをそれぞれ0.5、5 pg／アッセイ（定量下限値）まで測定することができる。これにより、末梢血での測定が可能になり、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別が可能になる。
　また、本発明の測定方法における操作は、試料を溶媒による抽出、固相抽出、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、酸性条件下にてアルコールと反応を行うか又は直接エステル誘導体化試薬で反応を行うというもので、極めて容易に行うことができる。
図1はコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルの前駆イオンマススペクトルである。 図2はコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルのプロダクトイオンマススペクトルである。 図3は18-oxoF標準品を18-エトキシ-21-フザリニルエステル化したときの0.5～1000 pg/tube（5～10000 pg/mL）までの検量線を示す。 図4はコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルの前駆イオンマススペクトルである。 図5はコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルのプロダクトイオンマススペクトルである。 図6は18-OHF標準品を21-フザリニルエステル化したときの5～20000 pg／tube（50～200000 pg/mL）までの検量線を示す。
　本発明において、18-OHFは18-Hydroxycortisol：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　を指し、18-oxoFは18-oxocortisol：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 を指す。これらの化合物は、アルドステロン生合成時に関与するCYP11B1、CYP11B2によりコルチゾールから生成される代謝産物である。
　本発明において18-oxoF、18-OHFの測定は、LC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIA等を用いて、測定できるが、微量定量が可能であること、感度、特異度が高いこと、また、同時測定が出来ることから、LC-MSが最も適している。
　本発明において、「LC-MS」とは、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分離部が複数結合したタンデム型の質量分析計（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer：LC-MS/MS）を用いることが好ましい。LC-MSにおけるイオン化は、例えば、APCI、ESI、APPI等が挙げられるが、中でも、ESIを用いることが好ましい。また、質量分離法は、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良い四重極型を使用することが好ましい。さらに、定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング（Selected Ion Monitoring：SIM）や、１つ目の質量分離部で生成したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分離部で、その前駆イオンの分解によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring：SRM）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってS/N（シグナル／ノイズ）比が向上するSRMによる測定が好ましい。
　本発明における「アルコール」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルコールを表し、例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール、n-ブタノール等を挙げることができるが、より適しているのは、エタノール及びメタノールである。
　本発明の測定方法においては、使用する下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物において、R1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合が好適である。
　また、本発明の測定方法において、上記式（I）で示される化合物におけるXはヒドロキシ基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わることのできる基を意味し、本発明において特に制限はないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。本発明において、Xは、ヒドロキシ基であることが好ましい。
　なお、上記低級アルキル基は、炭素数が1～6の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等を挙げることができる。
　さらに、本発明の測定方法において使用される、前記式（I）で示される化合物における-COXの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の2位である。
　特に好ましい式（I）の化合物は、フザリン酸である。
　なお、前記式（I）の化合物はそのほとんどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既存の方法により容易に合成することができる。
　さらに、本明細書において、下記式（II）及び（III）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、R2はC1-4アルキル基を表す。）
で示される化合物におけるR1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合の化合物が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合の化合物が好適である。また、R2はエチル基又はメチル基を表す場合の化合物が好ましい。さらに、特に制限されるものではないが、ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している場合の化合物が好ましい。
　特に好ましい式（II）の化合物は、18-oxoF、メタノール又はエタノール、及びフザリン酸から生成されるコルチゾール-18-メトキシ-21-フザニリルエステル又はコルチゾール-18-エトキシ-21-フザニリルエステルである。
　特に好ましい式（III）の化合物は、18-OHF及びフザリン酸から生成されるコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザニリルエステルである。
　本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、尿、糞、胆汁、組織、培養細胞、細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品、医薬品等が挙げられる。この中、好ましくは、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液等が挙げられ、環境由来の試料としては、汚水、排水及び河川水が挙げられ、工業由来の試料としては、医薬品が挙げられる。
　動物の血液は、限定されないが、副腎静脈血由来、末梢血由来、より好ましくは末梢血由来の血液である。末梢血の採血部位は、限定されないが、脚や腕などからが好ましい。
　本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
　試料の調製
　試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、固相抽出、例えば、ウォーターズ社製Oasis HLB（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Bond Elut C18（登録商標）カートリッジ、ジーエルサイエンス社製InertSep Pharma（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のアルコキシ化及びフザリン酸エステル体化反応に供することができる。
　アルコキシ化反応
　上記で調製した試料に対し、酸性条件下でアルコールを反応させて、試料中に含まれる18-oxoFの18位をアルコキシ化する。
　この反応に用いる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、p-トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩酸が望ましい。また、アルコールは、メタノール、エタノール、n-プロパノール、n-ブタノール等が使用できるが、中でもメタノール及びエタノールが好適である。本反応に使用する酸とアルコールの量は特に制限されるものではないが、アルコール中に酸の割合が5％前後になるように調製した酸とアルコールの混合溶液を、試料1 mL又は0.5 gにつき0.01乃至1 mLの範囲内、より好ましくは0.1乃至0.5 mLの範囲内で調製試料中に加えることが適している。反応温度は、通常、-5℃乃至80℃の範囲内とすることができるが、好ましくは10℃乃至30℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5乃至240分の範囲内とすることができ、好ましくは15分乃至90分の範囲内の時間が適している。
　エステル誘導体化反応
　上記でアルコキシ化した後、更に、試料中に含まれる18-OHF及び／又は18位がアルコキシ化された18-oxoFの21位を前記式（I）の化合物とエステル化反応させる。
　この反応は、一般に、上記でアルコキシ化した試料又は直接アルコキシ化していない試料を、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて不活性有機溶媒（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒）又はそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁することによって行うことができる。
　反応温度は、通常、-5℃乃至80℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは10℃乃至60℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5乃至240分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは15分乃至90分の範囲内の時間が適している。
　上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（I）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料1 mLあたり前記式（I）の化合物を少なくとも0.2 mg、好ましくは1乃至5 mgの範囲内で用いることができる。
　また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料1 mLあたり塩基を少なくとも0.1 mmol、好ましくは0.1乃至0.5 mmolの範囲内とすることができる。
　なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるXがヒドロキシ基を表す場合は、この式（I）の化合物を予め、例えば、1,1-カルボニルジイミダゾール、1,1-チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒドロキシ基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。
　また、Xがハロゲン基を表す場合、式（I）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びDBU（1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ-7-エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
　以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、以下のようにしてLC-MSによる測定を行う。
　LC-MS測定
　上記反応において調製した調製物のLC-MSによる測定は、一般的なLC、例えば、ヒューレット・パッカード社製HP 1100、ウォーターズ社製ACQUITY UPLC（登録商標）等のLC、さらにウォーターズ社製及び一般的なMS、例えば、マイクロマス社製QUATTRO II（登録商標）、QUATTRO MICRO（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製API 5000（登録商標）等のMSを用いて行うことができる。
　原発性アルドステロン症腺腫（ＡＰＡ）鑑別法
　患者の血液を用いて、上記の方法により、試料を調整した後、18-oxoF及び／または18-OHFを測定し、設定したカットオフ値、感度、特異度を基に原発性アルドステロン症の腺腫（ＡＰＡ）を鑑別することができる。
　カットオフ値とは、この値を超えた場合APAと判断する値を意味する。18-oxoF の末梢血液におけるカットオフ値は、1.0～10.0ng/dL、3.0～6.0ng/dL、好ましくは、4.0～5.5ng/dL、より好ましくは、4.5～5.0 ng/dLである。
18-OHFの末梢血液におけるカットオフ値は、125.0～350.0ng/dL、175.0～300.0ng/dL、好ましくは、200.0～275.0ng/dL、より好ましくは、225.0～250.0 ng/dLである。
末梢血液における18-oxoFまたは18-OHF量がカットオフ値を超えた場合、対象はＡＰＡであると鑑別することができる。
　感度とは、APAをもった対象から得られる陽性結果の百分率を意味する。鑑別に適した感度は、65.0％以上、70.0％以上、好ましくは75.0％以上、より好ましくは80.0％以上である。
　特異度とは、IHAをもった対象から得られる陰性結果の百分率を意味する。鑑別に適した特異度は、80.0％以上、85.0％以上、好ましくは90.0％以上、より好ましくは95.0％以上である。
　本発明の鑑別方法を用い、患者が片方の副腎腺腫であると鑑別された場合、腺腫を有する副腎を手術により取り除く処置を行うことができる。
　本発明の方法のために用いるキットは、式（I）、（II）、（III）の化合物、緩衝液、酸、塩基、アルコール、18-oxoF、18-OHF、注射器、測定手順を記載した文書から選択される少なくとも１つを含むことができる。さらに、鑑別方法の場合、判定基準を記載した文書を含むことができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルの合成
　18-oxoF 400 μg（東北薬科大学山下教授より提供、J.Steroid Biochem,、22、141(1985)に基づき合成）をエタノール：塩酸（5：1、v/v）0.25 mLに溶解し、30分間室温で放置した。これに、精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLで抽出し、抽出物を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣にフザリン酸100 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物200 mg及び4-ジメチルアミノピリジン50 mgのテトラヒドロフラン1 mL溶液を100 μL及びトリエチルアミン40 μL加え、室温で60分静置した。反応後、5% 重曹水1 mLを加え、あらかじめメタノール6 mL、精製水6 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジに負荷した。そのカートリッジを精製水3 mL、5% 塩酸溶液1 mL、精製水3 mLで順次洗浄し、アセトニトリル：精製水（80:20、v/v）で目的化合物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固し、粗精製物を得た。次いで、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：アセトン：アセトニトリル（100:30:10））で分離し、Rf 0.63部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルを得た。
　得られたコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルの液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計（LC-TOF-MS）データを下記表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
コルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルの合成
　18-OHF 1 mg （STERALOIDS社から購入）をアセトニトリル0.2 mLに溶解し、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg及び4-ジメチルアミノピリジン10 mgのアセトニトリル1 mL溶液を120 μL及びトリエチルアミン50 μL加え、室温で45分静置した。反応液に精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLによる抽出を2回行い、抽出液を減圧下で濃縮・乾固した。得られた残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン：アセトニトリル（4:1:1））で分離し、Rf 0.2部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルを得た。
　得られたコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルのLC-TOF-MSデータを下記表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
LC-MS/MSでの検出感度の比較
　18-oxoF、コルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステル及びコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルについて、LC-MS/MSでの検出感度を比較した。
　コルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステルは、18-oxoFを用い特許文献１の記載に基づいて合成した。
　化合物それぞれ5 pgを含有するアセトニトリル溶液をLC-MS/MSで測定して、得られたクロマトグラムより、S/N比を算出した。その結果を下記表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　上記測定結果より、コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルは、非誘導体である18-oxoF及びコルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステルよりもS/N比が大きく、より高感度で測定できることが判明した。
　18-oxoF及び18-OHF測定の再現性
　以下に述べる方法で、18-oxoF及び18-OHF測定の日内再現性を確認した。また、日を替えて同様の試験を3日間行い、日差再現性の確認をした。
4-1）検量線の作製
　18-oxoF及び18-OHFの濃度を求める際に、次のようにして検量線を作製した。すなわち、18-oxoF（0、0.5、2、10、50、200、1000 pg／50 μL）及び18-OHF（0、5、20、100、500、2000、10000 pg／50 μL）のエタノール溶液に、内標準物質としてアルドステロン－2H7エタノール溶液（100 pg／50 μL）及びコルチゾール－2H4エタノール溶液（200 pg／50 μL）を添加した。そこへ精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
　下記4-3）から4-4）に従い処理をしてLC-MS/MS測定により含有量を求めた。検量線は、18-oxoFについては0.5～1000 pg/tube（5～10000 pg/ｍL）及び18-OHFについては5～20000 pg/tube（50～200000 pg/ｍL）の範囲において、測定対象物ピーク面積値／内標準物質ピーク面積値比と濃度との関係が、相関係数0.99以上と良好な直線性を示した（図3及び6）。
4-2）試料の調製
　標準品として下記表6，7，8及び9に示した濃度の18-oxoF及び18-OHFのエタノール溶液50 μLに内標準としてアルドステロン－2H7（100 pg/ 50 μL）及びコルチゾール－2H4エタノール溶液（200 pg/50 μL）を添加した。以下、4-1）と同様に操作した。
4-3）エトキシ化
　残留物にエタノール：濃塩酸（5：1、v/v）を0.25 mL加え、よく振り混ぜた後、室温で30分間放置した。反応後、5％ 重曹水1 mL、酢酸エチル3 mLを加え、10分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
4-4）フザリン酸エステル誘導体化
　上記で得られた残留物に、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg、4-ジメチルアミノピリジン10 mg及びトリエチルアミン20 μLを含むアセトニトリル1 mL溶液の50 μLを加え、混合し、50℃で15分放置した。反応後、これにアセトニトリル0.25 mL及び5％塩酸0.75 mLを加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジをアセトニトリル：精製水（30：70）1 mL、5％重曹水1 mL及びアセトニトリル：精製水（30：70）3 mLで順に洗浄後、アセトニトリル2 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣をアセトニトリル：精製水（40：60）0.1 mLで溶解し、そのうち0.01 mLを下記表4及び5に示した条件でLC-MS/MS測定に供した。その結果を下記表6、7、8及び9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 上記の結果より、18-oxoFは0.5～1000 pg/tube（5～10000 pg/mL）まで再現性良く測定できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 上記の結果より、18-OHFは5～20000 pg/tube（50～200000 pg/mL）まで再現性良く測定できることが確認された。
健康成人血清中の18-oxoF、18-OHF測定
5-1）：試料の調製
健常者16例の腕より末梢血液を採取し、血清0.1 mLを得た。これに内標準物質としてアルドステロン-2H7（100 pg/50 μL)及びコルチゾール-2H4（200 pg/50 μL）を添加し、アセトニトリル 0.25 mLを加えて振とうした後、3000rpm 5分間遠心分離した。その上清に精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
　その後、上記実施例4の4-3）及び4-4）記載の方法でエトキシ化及びフザリン酸エステル誘導体化を行った。なお、検量線は上記実施例4-1）と同様の方法で作製した。
5-2）：LC-MS/MS測定
上記5-1）で得たアセトニトリル：精製水（40：60）溶液0.1 mLのうち、その0.01 mLを上記表3及び4で示した条件に則りLC-MS/MS測定し、血清中の18-oxoF、18-OHF濃度を求めた。その結果を下記表10に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 健常成人の末梢血液中の18-oxoFの濃度は、およそ1 pg/ml～33 pg/mlの範囲にあり、18-OHFの濃度は、およそ259 pg/ml～1242 pg/mlの範囲にあることが明らかになった。
原発性アルドステロン症腺腫鑑別法
　75人のAPA患者及び115人のIHA患者の腕から末梢血液を採取し、実施例５と同様にして、18-oxoF及び18-OHF量を測定した。
　上記APA患者群の18-oxoF量及び18-OHF量、IHA患者群の18-oxoF量及び18-OHF量に基にして、ROC解析を実施し、カットオフ値、感度、特異度を求めた。
　18-oxoFのカットオフ値は4.8ng/dL（48pg/ml）、そのときの感度は82.7％、特異度は95.7％であった。また、18-OHFのカットオフ値は234 ng/dL（2340pg/ml）、そのときの感度は69.3％、特異度は93.0％であった。
　これらの結果より、18-oxoF量に基づき、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別を実施するのがより適切であることが判明した。そして、末梢血液中の18-oxoF量が4.8ng/dL（48ｐｇ/ｍｌ）を越える場合、患者をAPAであると鑑別できた。
　本発明の方法によれば、試料中の18-oxoF、18-OHFの有無を検出したり、18-oxoF、18-OHFの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生などの分野で利用できる。

Claims (12)

  1. 試料中の18-oxoF及び／又は18-OHFのLC-MSによる測定法であって、試料の処理において、
    １）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、及び／又は、
    ２）下記式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、R1は、水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
    で示される化合物を試料に反応させる工程、
    を含むことを特徴とする測定法。
  2. R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表す、請求項１に記載の測定法。
  3. COXの置換位置がピリジン環の2位である、請求項１又は２に記載の測定法。
  4. アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１～３のいずれか1項に記載の測定法。
  5. 試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか1項に記載の測定法。
  6. 下記式（II）及び（III）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、R2はC1-4アルキル基を表す。）
    で示される化合物。
  7. R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表し、R2がエチル基又はメチル基を表す、請求項６に記載の化合物。
  8. ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している、請求項６又は７に記載の化合物。
  9. 請求項６の式（II）及び（III）で示される化合物を含むことを特徴とする、18-oxoF、18-OHFの測定用キット。
  10. 試料中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症の副腎腺腫を鑑別する方法。
  11. 試料中の18-oxoFの量をLC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIAにより測定する、請求項１０に記載の鑑別法。
  12. 請求項１に記載の測定法を用いて、試料中の18-oxoFの量を測定することを含む、請求項１０に記載の鑑別法。
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