WO2010041459A1 - 薬物代謝物の定量分析方法及び分析装置 - Google Patents
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Definitions
- the present invention relates to a quantitative analysis method and analysis apparatus for drug metabolites.
- the present invention relates to a new quantitative analysis method and analyzer that combine RI quantitative analysis and mass spectrometry.
- the present invention relates to a method for comprehensively analyzing drug metabolites using such a novel quantitative analysis method.
- Metabolomics refers to the analysis of metabolites (metabolomes) including low molecular weight compounds in living organisms, and research is being conducted on the basis that valuable information on biological functions can be obtained.
- MD clinical trials are conducted by administering a single dose to a healthy subject of a test substance at a dose not exceeding 1/100 of the dose estimated to develop a pharmacological action in humans or 100 ⁇ g, whichever is less Refers to clinical trials.
- Japan, on June 3, 2008 “Guidance on Implementation of Microdose Clinical Trials” (Pharmaceutical Diet Examination No.
- Non-patent Document 1 SRM datadependent exclusion measurement
- Non-patent Document 2 a method for exhaustively searching drug metabolites based on measurement data
- a software provided by a mass spectrometer manufacturer such as Metworks (Thermo Fisher Scientific; the company's website: http://www.thermofisher.co.jp/05product1/c_ms/08metworks.htm)
- Metworks Thermo Fisher Scientific; the company's website: http://www.thermofisher.co.jp/05product1/c_ms/08metworks.htm
- AMS accurate mass spectrometer
- LC / MS / MS liquid chromatograph- Tandem mass spectrometry
- PET positron tomography
- RI radioisotope
- the concentration of the metabolite can be determined by measuring the amount of radioactivity of the metabolite.
- radioisotope is RI
- radioisotopically labeled compound is RI labeled compound
- radioisotopically unlabeled compound is RI unlabeled compound
- RI labeled compound or RI When either one of the non-labeled compounds can be selected, the RI-labeled compound, etc.
- the radioisotope quantification device is the RI quantification device (in this case, regardless of the quantification method such as AMS method or ⁇ -ray counting method) ”
- Drug Metabol. Pharmacokin., 18 (6): 390-403 (2003) Drug Metabol. Pharmacokin., 17 (4): 316-339 (2002) Clin Eval., 33 (3): 649-677 (2006)
- LC / MS / MS has a selectivity because ionized molecules to be measured are selected by two-stage mass spectrometry (in this specification, liquid chromatography or liquid chromatography is sometimes referred to as LC and mass spectrometry is sometimes referred to as MS). It is highly quantifiable with high sensitivity and is also used for structural analysis. However, since ionization efficiency varies depending on the compound, in order to quantify based on the data of mass spectrometry, it is necessary to create a calibration curve reflecting the ionization efficiency of each compound using a standard product of each compound.
- the present inventors can easily perform structural analysis and quantification of metabolites and unknown metabolites for which it is difficult to obtain standard products by combining RI quantitative analysis and mass spectrometry.
- the present inventors have found that this can be done and have completed the present invention.
- a series of metabolite groups generated from one unchanged form have a similar fragmentation with a common m / z fragment ion in mass spectrometry.
- the present inventors use the characteristics to perform RI quantitative analysis of metabolites and quantitative analysis of mass chromatograms of mass spectrometry, and correct ionization efficiency in mass spectrometry of metabolites from the relationship between both analysis results.
- the present invention has the following configuration.
- a method for quantitative analysis of metabolites comprising the following steps.
- Step 1) Separation of components in biological samples containing metabolites of RI-labeled compounds Step 2) Step of measuring radioactivity of components obtained by separation in Step 1) Step 3) Separation in Step 1) Process for measuring mass-to-charge ratio of components obtained and measuring mass spectrometric intensity 4) Process for obtaining correction coefficient I relating to ionization efficiency of metabolite from measurement values obtained in steps 2) and 3) Process 5) Process 1 Step 6 of separating a component in a biological sample different from the sample used in Step 1), which may contain an RI-labeled compound or a non-RI-labeled compound of the compound and a metabolite of the compound ) The mass-to-charge ratio of the metabolite obtained by separation in step 5) is measured, and the mass spectrometric strength is measured.
- Step 7) The mass spectrometric strength obtained in step 6) and the correction coefficient I obtained in step 4).
- ⁇ 5> The correction coefficient I calculated by performing steps 1) to 4) in advance is stored in a library, and the steps ⁇ 5> to ⁇ 7> are performed by quoting I from the library.
- ⁇ 4> The method according to any one of the above.
- ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the separation in step 1) is by HPLC.
- ⁇ 7> The above ⁇ 1> to ⁇ 6, wherein the measurement of the mass-to-charge ratio and the measurement of the mass spectrometry intensity in step 3) are performed by LC / MS or LC / MSn (liquid chromatograph-multistage tandem mass spectrometry). > The method in any one of>.
- ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein LC / MSn is LC / MS / MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry).
- ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the metabolite is an unknown compound or a compound having no standard product.
- ⁇ 10> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the metabolite is a metabolite obtained by a pharmacokinetic test.
- ⁇ 11> The method according to ⁇ 10>, wherein the pharmacokinetic test is a microdose test.
- ⁇ 12> The method according to ⁇ 10>, wherein the pharmacokinetic test is a safety testing of drug metabolites.
- ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the separation step of step 1) is performed separately for measuring the radioactivity and for measuring the mass to charge ratio.
- ⁇ 14> An analysis method for comprehensively quantifying metabolites using the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>.
- ⁇ 15> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein the biological sample is animal body fluid or animal cells, tissues and parts of the cells, tissues, or metabolic enzymes derived from animals.
- a metabolite quantification apparatus including the following means.
- UIx correction coefficient I
- Mass spectrometry intensity correction coefficient I obtained by measuring the metabolite obtained by separating components in a biological sample different from the biological sample for obtaining A1 by the mass analysis means of c)
- A1 RIMx / Ix
- RIMx Radioactivity measured using the RI detection means of b) for the metabolite obtained by separating the biological sample containing the metabolite of the RI-labeled compound by the separation means of a)
- the quantitative device according to ⁇ 16>, wherein the concentration Cm1 is obtained.
- Quantitative analysis of an unknown metabolite according to the present invention is performed using a sample containing a metabolite obtained by administering an RI-labeled compound or an RI non-labeled compound (hereinafter referred to as an RI-labeled compound) to an animal,
- a sample containing a metabolite obtained by adding to and reacting with a tissue including components constituting the cell or tissue, for example, a cell membrane, a cytoplasmic fraction, an enzyme, etc., hereinafter also referred to as a cell.
- a tissue including components constituting the cell or tissue, for example, a cell membrane, a cytoplasmic fraction, an enzyme, etc., hereinafter also referred to as a cell.
- the unknown metabolite includes not only a compound whose structure is unknown but also a compound for which a standard product cannot be prepared (difficult to obtain) (hereinafter the same).
- the present invention is a method for obtaining a quantitative value by converting the mass analysis intensity of a metabolite to be measured by using a correction coefficient I relating to ionization efficiency. Specifically, the following two approaches will be described.
- the term “mass spectrometry intensity” or “chromatogram intensity” refers to an index of the abundance in a mass chromatogram of a compound separated by chromatography and identified by mass to charge ratio, for example, It refers to the peak area value or peak area ratio.
- RIMx total RI ⁇ Cx ⁇ Fa / 100 (Formula 1) (Fa: term corrected by the recovery rate, concentration rate, and analysis amount during sample pretreatment)
- Process (2) Calculation of Mass Spectrometry Intensity Ratio (Ix) Pretreatment of the same biological sample used for calculation of unknown metabolite radioactivity in step (1), followed by liquid chromatograph with mass spectrometer (hereinafter LC / MS) To obtain an MS (or MS / MS) chromatogram.
- the measurement is performed by the internal standard method, and the ratio (Ix) of the chromatogram intensity value of the metabolite to be quantified to the chromatogram intensity value of the internal standard substance is obtained.
- an internal standard substance is added to a biological sample containing a metabolite at a constant concentration and separated by HPLC.
- Step (3) Calculation of correction coefficient I A1 (RI / MS ratio)
- the unknown metabolite radioactivity (RIMx) obtained in step (1) is divided by the mass spectrometric intensity ratio (Ix) obtained in step (2).
- a correction coefficient I A1 (RI / MS ratio) is obtained (Formula 2).
- I A1 RIMx / Ix (Formula 2)
- the steps (1) to (3) are the previous steps for the actual sample measurement in the step (4). (Note that the phrase of the previous step means that it is necessary to carry out the step (4) and must be completed before the step (4) is carried out. (The same shall apply hereinafter.)
- a biological sample (actual sample) different from the sample used in) is separated and analyzed in the same manner as in step (2), and the metabolite (unknown metabolite) to be quantified with respect to the chromatogram intensity value of the internal standard substance
- the ratio of the chromatogram intensity values (UIx) is calculated.
- the unknown metabolite in the actual sample can be quantified without creating a calibration curve for the unknown metabolite. That is, even if it is a metabolite for which it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the concentration can be accurately measured from the mass spectrometry intensity.
- Radioactivity (Ru, Rm) of unchanged metabolite and unknown metabolite A biological sample (here, a sample obtained by administering an RI-labeled compound to an animal or adding it to a cell, etc.) is collected, and the sample is desired After the pretreatment, the unchanged form (u) and the unknown metabolite (m) are analyzed by HPLC-RAD, and the amount of each radioactivity (Ru, Rm: here the counting rate cpm) is measured.
- Process (2) Measurement of the mass spectrometric intensity (Mu, Mm) of unchanged metabolite and unknown metabolite Pretreatment of the same biological sample used for measurement of radioactivity of unknown metabolite in step (1), followed by LC / MS analysis An MS (or MS / MS) chromatogram is obtained. From the obtained MS chromatogram, mass analysis intensities (Mu, Mm: peak area values here) of the unchanged substance (u) and the unknown metabolite (m) are obtained.
- the biological sample (actual sample) different from the biological sample used in) is separated and analyzed in the same manner as in step (2), and the mass spectrometric intensity of the metabolite (unknown metabolite) to be quantified (Mm1: here Then, the peak area value) is measured.
- the descriptions of approach 1 and approach 2 are described as typical examples. Therefore, all quantitative analysis methods that can be supported by each mathematical expression are included in the scope of the present invention.
- the measurement value of unchanged substance or metabolite used in the quantitative analysis method of the present invention can be appropriately selected from the unit and measurement (calculation) method (for example, If it is the amount of radioactivity, cpm, dpm, Bq, etc., if it is mass spectrometry intensity, the peak area value, the peak area ratio, etc.).
- those skilled in the art can naturally replace the measured numerical value with another numerical value having an equivalent meaning in the quantitative analysis method of the present invention.
- the previous process steps (1) to (3) and the actual sample measurement step: It is most preferable that the mass spectrometry in 4) is performed with the same apparatus of the same principle.
- mass spectrometry in the previous process and the process for measuring the actual sample is performed between mass spectrometers of different principles or between different mass spectrometers of the same principle, for example, an unchanged substance between measurements It is necessary to appropriately correct the measured value by comparing the ionization efficiency of each other.
- a biological sample As an analysis target sample of the present invention, a biological sample (a sample containing a metabolite obtained by administering a drug to an animal or a sample containing a metabolite obtained by adding a drug to a cell or tissue for reaction treatment) Is preferred, but not limited thereto.
- biological samples obtained from plants and microorganisms and their cells and tissues are also samples to be analyzed.
- An example of a sample containing a metabolite obtained by administering a drug to an animal is an animal body fluid.
- hepatocytes (hepatocytes), tumor cells, etc. can be mentioned as a typical thing of the said cell.
- cells may be freshly collected, cryopreserved, or established, and the same applies to tissues.
- the cells and tissues can be used as parts or components constituting them, for example, cell membranes, microsomal fractions, cytoplasmic fractions, etc. for cells, and sections (tissue slices) for tissues.
- enzymes contained in the parts and components constituting the cells and tissues can also be analyzed. Further, each analysis target may be subjected to some processing such as a homogenate or an extract.
- the metabolite includes a metabolite obtained by an in vivo test performed by adding a drug to a cell or tissue, in addition to a metabolite obtained by an in vivo test performed by administering a drug to an animal, A reaction product obtained by reacting an enzyme such as an expression system enzyme with a drug is also included in the metabolite here.
- a metabolite obtained by a pharmacokinetic test for example, a metabolite obtained by a microdose test or a safety testing of drug metabolites can be used as a suitable analysis target.
- sample to be analyzed containing a metabolite include body fluids of animals such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, spinal fluid, semen, prostate fluid, bile, stool, and the cells, tissues, A biological sample containing a reaction solution of an in vitro test using an enzyme or the like is preferable.
- a biological sample containing a reaction solution of an in vitro test using an enzyme or the like is preferable.
- the relationship between a biological sample containing an unknown metabolite to be analyzed and quantified according to the present invention and the biological sample used in the previous step for quantifying the biological sample will be described below using Approach 1 as an example.
- a biological sample containing an unknown metabolite to be quantified using the present invention and a biological sample containing a metabolite for determining I A1 (RI / MS ratio) in order to calculate the quantitative value (Mx) thereof?
- Different biological samples may be used, for example, humans and non-human animals, animals and animals, animals and animal tissues, samples obtained by administration and addition to animals and cells or enzymes, and from the same animal. Includes those collected over time.
- the present invention When the present invention is applied to plant metabolites, it can be applied to drug metabolism using RI-labeled compounds such as pesticides and fruit-falling agents, and to plant metabolomics using RI-labeled compounds of specific substances.
- mutagen such as environmental hormones
- enzyme substrates acquired by genetic recombination.
- the drug referred to in the present invention is a drug for which the metabolite is desired to be searched, identified, and quantified, and examples thereof include candidate compounds for new drug development and compounds used for research on metabolic mechanisms in living organisms. These drugs are administered to animals as compounds labeled with radioisotopes (RI-labeled compounds) or unlabeled compounds (unlabeled) or added to cells, tissues, enzymes, etc., and their metabolites are analyzed. .
- the drugs of the present invention include agricultural chemicals, dropping agents, mutagens (such as environmental hormones), enzyme substrates that have been acquired by genetic recombination, and the like.
- the meaning of the term unchanged substance or metabolite is the same as the ordinary meaning used by those skilled in the art.
- those having a chemical structure at the time of administration to an animal or addition to a cell or tissue are described as unchanged, and after administration or addition, a part of the chemical structure is oxidized, A compound that has undergone hydrolysis, conjugation, etc. and has become different from the unchanged form is described as a metabolite, but when the unchanged form and metabolite are mixed, the term metabolite is representative of both. May be used.
- the term “component” in a phrase such as “component in a biological sample” may be used as a term representing an unchanged substance and a metabolite.
- the term “unknown metabolite” should be quantified using the quantitative analysis method of the present invention to explain the concept of the present invention even if the chemical structure is known or a standard product is available. It is also attached to those corresponding to metabolites.
- Separation of metabolites performed by the quantitative analysis method of the present invention is a method capable of separating metabolites from other components in a state applicable to RI quantitative analysis and mass spectrometry, which are steps subsequent to the separation step. Any of them may be used, and various known chromatography (GLC, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc.) can be used depending on the characteristics of the metabolite to be separated. Of these, HPLC is desirable.
- the metabolites can be separated in a state applicable to the RI quantitative analysis and mass spectrometry processes that follow the separation process, which means that the RI quantitative analysis and mass analysis can be performed with the desired accuracy.
- the separated substance is not required until it can be used as it is for an RI quantitative device or a mass spectrometer.
- the composition of the solvent of the fraction may be changed to one suitable for RI quantitative analysis or mass spectrometry.
- an HPLC separation apparatus is attached as a part of an existing RI quantification apparatus or mass spectrometry apparatus.
- a separate 1 from the RI detection section of the RI quantification apparatus and the mass detection section of the mass spectrometry apparatus Two separators may be used.
- the separation device is a common device for both analyses, and the metabolite exiting the separation device passes through the branch tube and one is introduced into the RI detector and the other is introduced into the mass analyzer for measurement. Good.
- the separation steps are provided without being shared, the separation conditions are not necessarily the same as long as the metabolites separated in each separation step can be associated with each other.
- RI-labeled compound examples of the radioisotope nuclide used for labeling of the RI-labeled compound used in the present invention include those that can tolerate damage to the administered animal such as 3 H and 14 C.
- the dose of the RI-labeled compound to the animal can be appropriately selected depending on the purpose of the test. For in vivo studies, generally less than the maximum non-toxic dose is sufficient, and for MD clinical studies, as described above, a dose not exceeding 1/100 of the dose estimated to develop a pharmacological action in humans or 100 ⁇ g The smaller dose is applicable.
- the addition amount can be appropriately selected according to the purpose of the test.
- the RI quantification apparatus used in the present invention may be any apparatus as long as it can quantitatively analyze the RI-labeled compound separated by the chromatography, and includes an RI quantification apparatus as an HPLC detector.
- Specific examples of the RI quantification apparatus include an apparatus corresponding to the liquid scintillation method and an apparatus corresponding to AMS.
- Mass spectrometer Any mass spectrometer can be used for the present invention as long as it can measure the mass-to-charge ratio of the components separated by the chromatography and perform quantitative analysis based on the mass spectrometric intensity of the compound identified by the mass-to-charge ratio. It is better, but one that can perform precise analysis is more desirable, for example, LC / MS / MS Precursor ion scan method of triple stage quadorupole mass spectrometer, Multiple Reaction Monitoring method, parallel scan method of LC LTQ Orbitrap (registered trademark) .
- LC / MS or LC / MS / MS Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometry
- LC / MSn Liquid Chromatograph-Multi-Stage Tandem Mass Spectrometry
- MSn may be used as a general term for multi-stage tandem mass spectrometry including MS / MS.
- a compound that can be prepared as a standard product and a compound that cannot be prepared may coexist.
- the metabolite can be comprehensively analyzed quantitatively by employing the quantitative analysis method of the present invention and measuring only the compounds for which a standard product cannot be prepared using the quantitative analysis method of the present invention.
- Approach 2 it is only necessary to create a calibration curve for the unchanged substance, and it is also possible to create a calibration curve with metabolites instead of the unchanged substance.
- approach 2 is a method of quantifying the concentration of other metabolites, particularly unknown metabolites, using a substance that serves as a reference with which a calibration curve can be created.
- a reference substance an unmodified substance is the most preferable example, but other metabolites for which a standard product is readily available also correspond to the reference substance in this approach.
- the quantitative analysis method of the present invention is suitable for qualitative and quantitative analysis of compounds without standard products (difficult to obtain), and is used for comprehensive analysis of metabolites in vivo such as MD clinical tests and metabolomics. It is done.
- the analysis apparatus of the present invention may be an apparatus having the following means a) to d): a) Separation means for separating metabolites in the sample, b) RI detection means for measuring the radioactivity of the metabolite separated by the separation means, c) a mass spectrometric means for measuring a mass-to-charge ratio of the metabolite separated by the separating means and measuring a mass spectrometric intensity of the metabolite; d) Arithmetic processing means for obtaining the metabolite concentration Mx or Cm1 using the correction coefficient I relating to the ionization efficiency of the metabolite
- a mass spectrometer with an RI detector which includes an RI detector attached to an existing mass spectrometer LC / MS / MS so that the RI of a metabolite component after HPLC separation can be determined
- a sample that does not contain a biological sample-derived component when the sensitivity of a measurement target includes a biological sample-derived component (eg, protein, nucleic acid, medium, etc.)
- a biological sample-derived component eg, protein, nucleic acid, medium, etc.
- a standard sample in which a drug or a standard product is dissolved in a solvent such as a buffer solution is known to increase or decrease, and is called a matrix effect. It is.
- This matrix effect is considered to be caused by the influence of the biological sample-derived component coexisting with the measurement object on the ionization of the measurement object.
- the matrix effect is added to a standard sample for preparing a calibration curve.
- a measure for reducing the matrix effect can be appropriately taken with reference to the description in JP-T-2004-510916, JP-A-2008-014746, and the like.
- 14 C-TB administration, blood collection and urine collection 14 C-TB was orally administered to SD male rats (1 animal) at 3 mg / kg.
- 14 C-TB blood was collected from the abdominal aorta using a vacuum blood collection tube containing sodium heparin (manufactured by Terumo), and centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) to obtain plasma.
- urine accumulation was collected from immediately after 14 C-TB administration (0 hour) to 4 hours later.
- acetonitrile was added to make a total volume of 10 mL to obtain a measurement object extract.
- the measurement object extract was concentrated to dryness under reduced pressure, redissolved with 150 ⁇ L of 30% ethanol, and further centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was used as an extraction sample.
- the extracted sample was analyzed by HPLC-RAD under the conditions described below.
- the urine obtained in the operation (1) is not subjected to pretreatment such as extraction in the plasma, but is centrifuged as it is (3,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a supernatant, which is used as an analysis sample. .
- the analytical sample was analyzed by HPLC-RAD under the conditions described below.
- HPLC-RAD conditions HPLC: Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) Column: Inertsil ODS-3 (particle size: 5 ⁇ m, column size: 4.6 mm ID ⁇ 150 mm) (manufactured by GL Sciences) Mobile phase A: 0.1% acetic acid aqueous solution mobile phase B: acetonitrile mobile phase mixing time and mixing ratio (B%): 0 minute (0%) ⁇ 40 minutes (40%) ⁇ 41 minutes (90%) ⁇ 50 ( 90%) Flow rate: 1.0 mL / min Analysis time: 50 minutes Column temperature: 40 ° C RAD: Radiomatic 625TR (manufactured by Perkin Elma) Cell volume: 500 ⁇ L Scintillator: FLO-SCINTII (Perkin Elma) Scintillator flow rate: 3.0 mL / min Split ratio: 100% Update time: 6 seconds
- Operation (4) Mass analysis of unchanged TB substance and TB metabolite by LC / MS / MS (measurement of peak area ratio Ix) Operation plasma 0.05mL or urinary 0.05mL obtained in (1), respectively (including hydroxy torr pig bromide -d 9 and carboxymethyl Torr pig bromide -d 9 each 20 ng / mL) in acetonitrile 0.05mL methanol and internal standard 0 .15 mL was added and stirred sufficiently, followed by centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes). The obtained centrifugal supernatant was analyzed by LC / MS / MS. LC / MS / MS analysis conditions are shown below.
- Example 2 Quantification of plasma sample using correction factor I A1 (RI / MS ratio (A)) Rats were orally administered with 14 C-TB, and the unchanged TB and metabolite in plasma obtained over time after administration were determined by LC / Quantification of the unchanged TB substance and TB metabolite was performed from the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (A)) obtained by analysis by MS / MS and the result (1) of Example 1.
- correction factor I A1 RI / MS ratio (A)
- Example 3 Confirmation of quantification by correction factor I A1 (RI / MS ratio (A)) (plasma sample) The quantitative value calculated in Example 2 was compared with the RI quantitative value of the actual sample by HPLC-RAD analysis, and the validity of the quantitative value by the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (A)) was confirmed.
- the TB unchanged form and TB metabolite calculated from the amount of radioactivity measured by HPLC-RAD and the TB unchanged form calculated using the concentration of the TB metabolite and the correction factor I A1 (RI / MS ratio (A))
- the concentration of TB metabolite was related to the recovery rate column in Tables 5 and 6. There was no significant difference between the two quantitative values.
- the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (A)) of the present invention is used, even if it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the LC / MS / MS
- the measurement object can be quantified from the peak area ratio (UIx).
- Example 4 Quantification of urine sample with correction factor I A1 (RI / MS ratio (B)) Rats were orally administered with 14 C-TB, and the TB metabolites in the urine collected immediately after administration (0 hour) to 24 hours later were analyzed by LC / The TB metabolite was quantified from the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (B)) obtained by analysis by MS / MS and the result (2) of Example 1.
- Example 5 Confirmation of validity of quantification using correction factor I A1 (RI / MS ratio (B)) (urine sample)
- the quantitative value obtained in Example 4 was compared with the quantitative value obtained by HPLC-RAD analysis, and the validity of the quantitative value using the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (B)) was confirmed.
- the concentration of TB metabolite calculated from the amount of radioactivity measured by HPLC-RAD in this example and the concentration of TB metabolite calculated using the correction factor I A1 (RI / MS ratio (B)) are shown in Table 13- There was a relationship in the column of 18 recovery rates. There was no significant difference between the two quantitative values. From the above, using the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (B)) of the present invention, even if it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the LC / MS / MS The measurement object can be quantified from the peak area ratio.
- Example 6 Performs RI quantitative analysis and mass spectrometry of the quantitative 14 C-TB and its metabolites using a correction coefficient I A2, calculated the ionization efficiency of the unchanged drug and metabolites, the metabolite of ionization efficiency / unchanged ionization efficiency The ratio was determined. Operation (1) Analysis of radioactivity of unknown metabolites (HPLC-RAD), measurement of mass spectrometry intensity Human or rat liver microsomes having the composition shown in Table 19 were mixed with 14 C-TB solution and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
- the correction coefficient I A2 (fm / fu) can also be calculated using Examples 2 and 4 (I A1 (RI / MS ratio)).
- the ratio to unchanged product is shown below.
- the correction coefficient I A2 (fm / fu) of the present invention is used, even if it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the LC / MS / MS peak area ratio is obtained.
- the measurement object can be quantified. In particular, it is an extremely simple quantitative analysis method because unknown metabolites can be quantified using only a calibration curve of unchanged substance.
- the correction coefficient I A2 (fm / fu) can also be calculated using Examples 2 and 4 (I A1 (RI / MS ratio)).
- the ratio to unchanged product is shown below.
- the correction coefficient I A2 (fm / fu) of the present invention is used, even if it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the LC / MS / MS peak area ratio is obtained.
- the measurement object can be quantified. In particular, it is an extremely simple quantitative analysis method because unknown metabolites can be quantified using only a calibration curve of unchanged substance.
- Example 7 Calculation of correction factor I A1 (RI / MS ratio) Rats were orally administered with 14 C-tolbutamide (TB), and the urinary TB metabolites obtained after the administration were analyzed with a high performance liquid chromatograph (HPLC-RAD) with a radioactivity detector. ) And LC / MS / MS, and the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio) of the present invention was calculated.
- Operation (2) Measurement of total radioactivity 10 mL of the scintillator was added to 1 mL of the urine sample obtained in operation (1), and the total radioactivity was measured by the LSC.
- RI / MS ratio Calculation of RI / MS ratio of urine sample
- the amount of radioactivity (RIMx) of TB metabolite (HTB) obtained from the HPLC-RAD chromatogram was calculated as the peak area ratio of TB metabolite (HTB) of the corresponding LC / MS / MS.
- Ix Dividing by (Ix), the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio) of the TB metabolite (HTB) was determined. The results are shown in Table 20.
- the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio) of this result will be referred to as RI / MS ratio (C).
- Example 8 Quantification of plasma samples by correction factor I A1 (RI / MS ratio (C)) Rats were orally administered with 14 C-TB, and the TB metabolites in plasma obtained over time after the administration were analyzed by LC / MS / MS Then, the TB metabolite was quantified from the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (C)) calculated in Example 7.
- a hydroxytolbutamide methanol solution (1-30000 pg / mL) and 0.06 mL of an internal standard substance acetonitrile solution (including 20 ng / mL of hydroxytolbutamide-d9) were added to 0.02 mL of blank plasma and sufficiently stirred. Thereafter, centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) was performed. Each obtained supernatant was analyzed by LC / MS / MS. LC / MS / MS analysis conditions are shown below.
- Example 9 Validity of quantification by RI / MS ratio (plasma sample) The quantitative value calculated in Example 8 was compared with the actual quantitative value by LC-MS / MS analysis using a standard product, and the validity of the quantitative value by the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (C)) was confirmed.
- the concentrations of TB unchanged metabolite and TB metabolite calculated using the concentration of TB metabolite quantified by the standard product in this example and the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (C)) are shown in Table 22 It was related to the rate column. There was no significant difference between the two quantitative values. As described above, when the correction coefficient I A1 (RI / MS ratio (C)) of the present invention is used, even if it is difficult to obtain a standard product or a metabolite whose ionization efficiency is unknown, the LC / MS / MS The measurement object can be quantified from the peak area ratio (UIx).
- UIx peak area ratio
- the quantitative analysis method of the present invention even in the analysis of metabolites, both structural analysis and quantification can be performed even for metabolites without standard products or unknown metabolites, and comprehensive analysis of metabolites is possible. Became possible.
- the quantitative analysis method of the present invention can be applied to MD clinical trials, and can be expected to contribute to safe drug development and cost and time saving for drug development.
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Abstract
薬物代謝物の構造解析と定量分析の両方が可能であり、しかも標準品がない化合物や未知の化合物を含めて網羅的に分析できる方法および装置の提供。 代謝物のRI定量分析と質量分析のマスクロマトグラムの定量分析を行い両分析結果の関係から、代謝物についての質量分析におけるイオン化効率を補正することにより、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物について、質量分析により網羅的に代謝物を定量する方法及び本方法を実現するための装置を提供する。
Description
本発明は、薬物代謝物の定量分析方法及び分析装置に関する。特にRI定量分析と質量分析とを組み合わせた新たな定量分析方法及び分析装置に関する。さらに、このような新規な定量分析方法を用いて薬物代謝物を網羅的に分析する方法に関する。
近年、メタボロミクスやマイクロドーズ(MD)臨床試験など生体内における代謝物の網羅的な分析が非常に重要となっている。
メタボロミクスとは、生体中の低分子化合物をはじめとする代謝物(メタボローム)の分析を行うことをいい、生体機能に関する価値ある情報が得られるとして研究がさかんに行われている。
MD臨床試験とは、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の1/100を超えない用量又は100μgのいずれか少ない用量の被験物質を、健康な被験者に単回投与することにより行われる臨床試験をいう。本試験に関して日本では、平成20年6月3日に「マイクロドーズ臨床試験の実施に関するガイダンス」(薬食審査発第063001号)が、厚生労働省医薬食品局審査管理課長より各都道府県衛生主管部(局)長宛てに通知された。該ガイダンスは、厚生労働大臣の検討会報告書「有効で安全な医薬品を迅速に提供するための検討会報告書(平成19年7月)」を受けて取りまとめられた指針であって、その目的は被験物質のヒトにおける薬物動態に関する情報を医薬品の臨床開発の初期段階に得ることとしている。そして、具体的には被験物質の吸収や血中動態、排泄特性、ヒトにおける代謝プロファイル等を明らかにすること、等と記載されている。
さらに、平成20年2月にアメリカ食品医薬局(U.S. Food and Drug Administration;FDA)から’Safety Testing of Drug Metabolites(STDM)’のガイダンスが発令された。これによれば、新薬の研究開発の初期に、候補化合物の代謝物でヒトに特有の代謝物、又は、動物よりヒトで多くかつ未変化体のAUC(area under the blood concentration time curve;薬物血中濃度-時間曲線下面積)で10%以上の代謝物、全てについて代謝物の4種類の毒性試験が必要であるとされている。
以上のように、生体内の薬物代謝物を分析する方法においては公知の代謝物のみならず、未知の代謝物についても、単なる存在の検出だけでなく、構造解析と定量分析が必要であり、しかも生体内における非常に微量な複数の未知代謝物の測定をより正確に、高感度で網羅的に分析できる方法の実用化が期待されている。
メタボロミクスとは、生体中の低分子化合物をはじめとする代謝物(メタボローム)の分析を行うことをいい、生体機能に関する価値ある情報が得られるとして研究がさかんに行われている。
MD臨床試験とは、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の1/100を超えない用量又は100μgのいずれか少ない用量の被験物質を、健康な被験者に単回投与することにより行われる臨床試験をいう。本試験に関して日本では、平成20年6月3日に「マイクロドーズ臨床試験の実施に関するガイダンス」(薬食審査発第063001号)が、厚生労働省医薬食品局審査管理課長より各都道府県衛生主管部(局)長宛てに通知された。該ガイダンスは、厚生労働大臣の検討会報告書「有効で安全な医薬品を迅速に提供するための検討会報告書(平成19年7月)」を受けて取りまとめられた指針であって、その目的は被験物質のヒトにおける薬物動態に関する情報を医薬品の臨床開発の初期段階に得ることとしている。そして、具体的には被験物質の吸収や血中動態、排泄特性、ヒトにおける代謝プロファイル等を明らかにすること、等と記載されている。
さらに、平成20年2月にアメリカ食品医薬局(U.S. Food and Drug Administration;FDA)から’Safety Testing of Drug Metabolites(STDM)’のガイダンスが発令された。これによれば、新薬の研究開発の初期に、候補化合物の代謝物でヒトに特有の代謝物、又は、動物よりヒトで多くかつ未変化体のAUC(area under the blood concentration time curve;薬物血中濃度-時間曲線下面積)で10%以上の代謝物、全てについて代謝物の4種類の毒性試験が必要であるとされている。
以上のように、生体内の薬物代謝物を分析する方法においては公知の代謝物のみならず、未知の代謝物についても、単なる存在の検出だけでなく、構造解析と定量分析が必要であり、しかも生体内における非常に微量な複数の未知代謝物の測定をより正確に、高感度で網羅的に分析できる方法の実用化が期待されている。
現在、薬物代謝物の網羅的分析方法としては、本発明者らによるSRM datadependent exclusion measurement(非特許文献1)や測定データに基づき薬物代謝物を網羅的に検索し構造解析する方法(非特許文献2)、又は、質量分析機器メーカーが質量分析装置に付属するソフト、例えばMetworks(Thermo Fisher Scientific社;同社のホームページ:http://www.thermofisher.co.jp/05product1/c_ms/08metworks.htm)を用いて行う網羅的薬物代謝物の検索などが知られている。
これらの方法は、ミクロソームやヘパトサイトおよび組織スライス又はホモジネートを使ったin vitro代謝試験、動物の薬物動態試験および臨床試験での薬物代謝物を網羅的に検索し構造解析する際に使用されている。
また、MD臨床試験での薬物の血漿中濃度は、一般に数100pg/mLから数pg/mLであり、現在、定量機器はAMS(加速器質量分析装置)、LC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)、PET(ポジトロン断層法)が使用されている(非特許文献3)が、これらの中で、MD試験で薬物代謝物の構造解析ができるのはLC/MS/MSのみである。
このほかに、薬物代謝物の定量機器として、液体シンチレーション法に対応した放射性同位体(RI)標識化合物定量装置があげられる。これは、HPLCとRI(β線計数)検出器を組み合わせた装置であって、RI標識化合物を投与して得られる該RI標識化合物の代謝物を分離して得られるクロマトグラムのRIピーク強度から該代謝物の放射能量を測定することにより、該代謝物の濃度を求めることができる。
なお、本明細書では、「放射性同位体をRI」と、「放射性同位体標識化合物をRI標識化合物」と、「放射性同位体非標識化合物をRI非標識化合物」と、「RI標識化合物又はRI非標識化合物のいずれか一方を選択できる場合、RI標識化合物等」と、「放射性同位体定量装置をRI定量装置(この場合、AMS法やβ線計数法など定量方法のいかんを問わない)」と、それぞれいうことがある。
Drug Metabol. Pharmacokin., 18(6):390-403 (2003) Drug Metabol. Pharmacokin., 17(4):316-339 (2002) Clin Eval., 33(3):649-677 (2006)
これらの方法は、ミクロソームやヘパトサイトおよび組織スライス又はホモジネートを使ったin vitro代謝試験、動物の薬物動態試験および臨床試験での薬物代謝物を網羅的に検索し構造解析する際に使用されている。
また、MD臨床試験での薬物の血漿中濃度は、一般に数100pg/mLから数pg/mLであり、現在、定量機器はAMS(加速器質量分析装置)、LC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)、PET(ポジトロン断層法)が使用されている(非特許文献3)が、これらの中で、MD試験で薬物代謝物の構造解析ができるのはLC/MS/MSのみである。
このほかに、薬物代謝物の定量機器として、液体シンチレーション法に対応した放射性同位体(RI)標識化合物定量装置があげられる。これは、HPLCとRI(β線計数)検出器を組み合わせた装置であって、RI標識化合物を投与して得られる該RI標識化合物の代謝物を分離して得られるクロマトグラムのRIピーク強度から該代謝物の放射能量を測定することにより、該代謝物の濃度を求めることができる。
なお、本明細書では、「放射性同位体をRI」と、「放射性同位体標識化合物をRI標識化合物」と、「放射性同位体非標識化合物をRI非標識化合物」と、「RI標識化合物又はRI非標識化合物のいずれか一方を選択できる場合、RI標識化合物等」と、「放射性同位体定量装置をRI定量装置(この場合、AMS法やβ線計数法など定量方法のいかんを問わない)」と、それぞれいうことがある。
Drug Metabol. Pharmacokin., 18(6):390-403 (2003) Drug Metabol. Pharmacokin., 17(4):316-339 (2002) Clin Eval., 33(3):649-677 (2006)
上記従来の分析方法には、次のような問題があった。
LC/MS/MSは、イオン化された測定対象分子を2段階質量分析(本明細書において、液体クロマトグラフあるいは液体クロマトグラフィーをLC、質量分析をMSということがある)で選別するため選択性が高く、高感度に定量することができ、構造解析にも用いられている。しかし、イオン化効率は化合物によって異なるため、質量分析のデータに基づき定量するためには、化合物それぞれの標準品を用いて化合物それぞれのイオン化効率が反映された検量線を作成する必要がある。従って、LC/MS/MSを利用した定量分析には標準品が必要であるため、標準品が準備できない化合物や未知の代謝物の定量は出来ず、薬物代謝物の網羅的分析(定量)には向かないことになる。
一方、RI定量装置による定量は、代謝物量を放射能量として得ることができるため絶対的な濃度が得られるというメリットはあるものの、定量感度はLC/MSに比べて低く、また、代謝物の構造解析(定性)はできないため、こちらも薬物代謝物の網羅的な分析には向かないことになる。
このように、薬物代謝物の構造解析と定量分析の両方が可能であり、しかも標準品がない化合物や未知の化合物を含めて網羅的に分析できる方法および装置はこれまでに存在しなかった。
LC/MS/MSは、イオン化された測定対象分子を2段階質量分析(本明細書において、液体クロマトグラフあるいは液体クロマトグラフィーをLC、質量分析をMSということがある)で選別するため選択性が高く、高感度に定量することができ、構造解析にも用いられている。しかし、イオン化効率は化合物によって異なるため、質量分析のデータに基づき定量するためには、化合物それぞれの標準品を用いて化合物それぞれのイオン化効率が反映された検量線を作成する必要がある。従って、LC/MS/MSを利用した定量分析には標準品が必要であるため、標準品が準備できない化合物や未知の代謝物の定量は出来ず、薬物代謝物の網羅的分析(定量)には向かないことになる。
一方、RI定量装置による定量は、代謝物量を放射能量として得ることができるため絶対的な濃度が得られるというメリットはあるものの、定量感度はLC/MSに比べて低く、また、代謝物の構造解析(定性)はできないため、こちらも薬物代謝物の網羅的な分析には向かないことになる。
このように、薬物代謝物の構造解析と定量分析の両方が可能であり、しかも標準品がない化合物や未知の化合物を含めて網羅的に分析できる方法および装置はこれまでに存在しなかった。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、RI定量分析と質量分析を組み合わせることで、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物の構造解析と定量が簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
一般に、一つの未変化体から生成される一連の代謝物群は、質量分析において共通のm/zフラグメントイオンを有し類似のフラグメンテーションをする。本発明者らは、その特徴を利用して代謝物のRI定量分析と質量分析のマスクロマトグラムの定量分析を行い両分析結果の関係から、代謝物についての質量分析におけるイオン化効率を補正することにより、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物について、質量分析により網羅的に代謝物を定量する方法を確立した。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
<1>以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程1)RI標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程2)工程1)で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程3)工程1)で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程4)工程2)及び3)で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを求める工程
工程5)工程1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程1)で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程6)工程5)で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程7)工程6)で得られた質量分析強度と工程4)で求めた補正係数Iを使用して、工程5)で分離された代謝物の濃度を定量する工程
<2>工程5)により分離された代謝物の濃度Mxを、以下の補正係数IA1を用いて下記式(A1)により求める、前記<1>に記載の定量分析方法。
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:工程2)により得られる代謝物の放射能量
Ix:工程3)により得られる代謝物の質量分析強度
工程5)により分離された代謝物の濃度Mx=UIx×IA1×R ・・・式(A1)
UIx:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量
<3>工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1を、以下の補正係数IA2を用いて下記式(A2)により求める、前記<1>に記載の定量分析方法。
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:工程3)により得られる代謝物(m)の質量分析強度
Mu:工程3)により得られる未変化体(u)の質量分析強度
Rm:工程2)により得られる代謝物(m)の放射能量
Ru:工程2)により得られる未変化体(u)の放射能量
工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1=Mm1×IA2×Ccal・・・式(A2)
Mm1:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu)
<4>質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である前記<1>又は<2>に記載の定量分析方法。
<5>工程1)~4)があらかじめ行われて算出された補正係数Iがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりIを引用して、工程5)~7)を行う前記<1>~<4>のいずれかに記載の方法。
<6>工程1)の分離がHPLCによるものである前記<1>~<5>のいずれかに記載の方法。
<7>工程3)の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がLC/MS又はLC/MSn(液体クロマトグラフ-多段階タンデム質量分析)により行われるものである前記<1>~<6>のいずれかに記載の方法。
<8>LC/MSnがLC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)である前記<1>~<7>のいずれかに記載の方法。
<9>代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である前記<1>~<8>のいずれかに記載の方法。
<10>代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である前記<1>~<9>のいずれかに記載の方法。
<11>薬物動態試験がマイクロドーズ試験である前記<10>に記載の方法。
<12>薬物動態試験が代謝物安全性試験(Safety Testing of Drug Metabolites)である前記<10>に記載の方法。
<13>工程1)の分離工程が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる前記<1>~<12>のいずれかに記載の方法。
<14>前記<1>~<13>のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
<15>生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、前記<1>~<14>のいずれかに記載の方法。
<16>以下の手段を含む代謝物の定量装置。
a)生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
b)前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するRI検出手段
c)前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
d)代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを使用して代謝物の濃度Mx又はCm1を求めるための演算処理手段
<17>d)の演算処理手段が、Mx=UIx×IA1×Rの数式により代謝物の濃度Mxを求めるものである前記<16>に記載の定量装置。
UIx:補正係数IA1を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:該RI標識化合物の代謝物を含む生物試料をa)の分離手段により分離して得られる代謝物についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ix:RIMxを求める代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量
<18>d)の演算処理手段が、Cm1=Mm1×IA2×Ccalの数式により代謝物の濃度Cm1を求めるものである前記<16>に記載の定量装置。
Mm1:補正係数IA2を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:a)の分離手段により分離して得られる代謝物(m)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Mu:a)の分離手段により分離して得られる未変化体(u)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Rm:Mmを求める代謝物(m)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ru:Muを求める未変化体(u)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu)
<19>さらにe)補正係数Iを保存しておくライブラリを有する前記<16>~<18>のいずれかに記載の定量装置。
<20>a)の分離手段が高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である前記<16>~<19>のいずれかに記載の定量装置。
一般に、一つの未変化体から生成される一連の代謝物群は、質量分析において共通のm/zフラグメントイオンを有し類似のフラグメンテーションをする。本発明者らは、その特徴を利用して代謝物のRI定量分析と質量分析のマスクロマトグラムの定量分析を行い両分析結果の関係から、代謝物についての質量分析におけるイオン化効率を補正することにより、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物について、質量分析により網羅的に代謝物を定量する方法を確立した。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
<1>以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程1)RI標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程2)工程1)で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程3)工程1)で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程4)工程2)及び3)で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを求める工程
工程5)工程1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程1)で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程6)工程5)で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程7)工程6)で得られた質量分析強度と工程4)で求めた補正係数Iを使用して、工程5)で分離された代謝物の濃度を定量する工程
<2>工程5)により分離された代謝物の濃度Mxを、以下の補正係数IA1を用いて下記式(A1)により求める、前記<1>に記載の定量分析方法。
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:工程2)により得られる代謝物の放射能量
Ix:工程3)により得られる代謝物の質量分析強度
工程5)により分離された代謝物の濃度Mx=UIx×IA1×R ・・・式(A1)
UIx:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量
<3>工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1を、以下の補正係数IA2を用いて下記式(A2)により求める、前記<1>に記載の定量分析方法。
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:工程3)により得られる代謝物(m)の質量分析強度
Mu:工程3)により得られる未変化体(u)の質量分析強度
Rm:工程2)により得られる代謝物(m)の放射能量
Ru:工程2)により得られる未変化体(u)の放射能量
工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1=Mm1×IA2×Ccal・・・式(A2)
Mm1:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu)
<4>質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である前記<1>又は<2>に記載の定量分析方法。
<5>工程1)~4)があらかじめ行われて算出された補正係数Iがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりIを引用して、工程5)~7)を行う前記<1>~<4>のいずれかに記載の方法。
<6>工程1)の分離がHPLCによるものである前記<1>~<5>のいずれかに記載の方法。
<7>工程3)の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がLC/MS又はLC/MSn(液体クロマトグラフ-多段階タンデム質量分析)により行われるものである前記<1>~<6>のいずれかに記載の方法。
<8>LC/MSnがLC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)である前記<1>~<7>のいずれかに記載の方法。
<9>代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である前記<1>~<8>のいずれかに記載の方法。
<10>代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である前記<1>~<9>のいずれかに記載の方法。
<11>薬物動態試験がマイクロドーズ試験である前記<10>に記載の方法。
<12>薬物動態試験が代謝物安全性試験(Safety Testing of Drug Metabolites)である前記<10>に記載の方法。
<13>工程1)の分離工程が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる前記<1>~<12>のいずれかに記載の方法。
<14>前記<1>~<13>のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
<15>生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、前記<1>~<14>のいずれかに記載の方法。
<16>以下の手段を含む代謝物の定量装置。
a)生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
b)前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するRI検出手段
c)前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
d)代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを使用して代謝物の濃度Mx又はCm1を求めるための演算処理手段
<17>d)の演算処理手段が、Mx=UIx×IA1×Rの数式により代謝物の濃度Mxを求めるものである前記<16>に記載の定量装置。
UIx:補正係数IA1を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:該RI標識化合物の代謝物を含む生物試料をa)の分離手段により分離して得られる代謝物についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ix:RIMxを求める代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量
<18>d)の演算処理手段が、Cm1=Mm1×IA2×Ccalの数式により代謝物の濃度Cm1を求めるものである前記<16>に記載の定量装置。
Mm1:補正係数IA2を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:a)の分離手段により分離して得られる代謝物(m)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Mu:a)の分離手段により分離して得られる未変化体(u)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Rm:Mmを求める代謝物(m)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ru:Muを求める未変化体(u)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu)
<19>さらにe)補正係数Iを保存しておくライブラリを有する前記<16>~<18>のいずれかに記載の定量装置。
<20>a)の分離手段が高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である前記<16>~<19>のいずれかに記載の定量装置。
本発明の定量分析方法によれば、代謝物の分析において、標準品の入手が困難な代謝物や未知の代謝物であっても、構造解析と定量の両方を行うことができ、代謝物の網羅的分析が可能となった。
(測定原理)
本発明による未知代謝物の定量分析は、RI標識化合物又はRI非標識化合物(以下、RI標識化合物等)を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、RI標識化合物等を細胞や組織(該細胞や組織を構成する成分、例えば、細胞膜や細胞質画分、更には酵素なども含む。以下、細胞等ということがある)に添加し、反応させて得られる代謝物を含む試料(以下、本明細書において、これらを生物試料という)を用い、以下の各工程を経て行われる。なお、本発明において未知代謝物とは、構造が未知である化合物のみならず、標準品が準備できない(入手困難な)化合物も含む(以下、同様)。本発明は、イオン化効率に関する補正係数Iを用いることにより、測定したい代謝物の質量分析強度を換算して定量値を得る方法である。具体的に以下の2つのアプローチを挙げて説明する。
なお、本明細書において「質量分析強度」あるいは「クロマトグラム強度」の語は、クロマトグラフィーにより分離され、質量分析において質量電荷比により同定された化合物の、マスクロマトグラムにおける存在量の指標、例えばピーク面積値又はピーク面積比等を指している。そして「質量分析強度比」あるいは「クロマトグラム強度比」と表記した場合には内標準法による比率を、「質量分析強度値」あるいは「クロマトグラム強度値」と表記した場合には、測定された強度それ自体を指している。また同様の意味で「ピーク面積比」あるいは「ピーク面積値」と表記する場合もある。
本発明による未知代謝物の定量分析は、RI標識化合物又はRI非標識化合物(以下、RI標識化合物等)を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、RI標識化合物等を細胞や組織(該細胞や組織を構成する成分、例えば、細胞膜や細胞質画分、更には酵素なども含む。以下、細胞等ということがある)に添加し、反応させて得られる代謝物を含む試料(以下、本明細書において、これらを生物試料という)を用い、以下の各工程を経て行われる。なお、本発明において未知代謝物とは、構造が未知である化合物のみならず、標準品が準備できない(入手困難な)化合物も含む(以下、同様)。本発明は、イオン化効率に関する補正係数Iを用いることにより、測定したい代謝物の質量分析強度を換算して定量値を得る方法である。具体的に以下の2つのアプローチを挙げて説明する。
なお、本明細書において「質量分析強度」あるいは「クロマトグラム強度」の語は、クロマトグラフィーにより分離され、質量分析において質量電荷比により同定された化合物の、マスクロマトグラムにおける存在量の指標、例えばピーク面積値又はピーク面積比等を指している。そして「質量分析強度比」あるいは「クロマトグラム強度比」と表記した場合には内標準法による比率を、「質量分析強度値」あるいは「クロマトグラム強度値」と表記した場合には、測定された強度それ自体を指している。また同様の意味で「ピーク面積比」あるいは「ピーク面積値」と表記する場合もある。
<未知代謝物濃度(Mx)の定量分析方法:アプローチ1>
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例の操作等に即して記載する。
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例の操作等に即して記載する。
工程(1)
未知代謝物放射能量(RIMx:dpm/mL)の算出
生物試料(ここではRI標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料)を採取した後、液体シンチレーションカウンター(以下、LSC)を用いて総放射能量を測定する(総RI:ここではdpm)。別途同一の生物試料を所望により前処理した後、放射能検出器付液体クロマトグラフ(以下、HPLC-RAD)により分析し、定量対象とする代謝物(未知代謝物)のクロマトグラム上の%存在量(Cx)を算出する。次いで、該未知代謝物の放射能量(RIMx:dpm/mL)を以下の式により算出する(式1)。
RIMx=総RI×Cx×Fa/100・・・(式1)
(Fa:試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項)
未知代謝物放射能量(RIMx:dpm/mL)の算出
生物試料(ここではRI標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料)を採取した後、液体シンチレーションカウンター(以下、LSC)を用いて総放射能量を測定する(総RI:ここではdpm)。別途同一の生物試料を所望により前処理した後、放射能検出器付液体クロマトグラフ(以下、HPLC-RAD)により分析し、定量対象とする代謝物(未知代謝物)のクロマトグラム上の%存在量(Cx)を算出する。次いで、該未知代謝物の放射能量(RIMx:dpm/mL)を以下の式により算出する(式1)。
RIMx=総RI×Cx×Fa/100・・・(式1)
(Fa:試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項)
工程(2)
質量分析強度比(Ix)の算出
工程(1)で未知代謝物放射能量の算出に用いたのと同一の生物試料を前処理したのち、質量分析装置付液体クロマトグラフ(以下、LC/MS)により分析し、MS(もしくはMS/MS)クロマトグラムを得る。測定は内標準法により行い、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物のクロマトグラム強度値の比(Ix)を得る。
なお、前記内標準法により測定を行う場合は、あらかじめ、代謝物を含む生物試料に内標準物質を一定濃度になるように添加して、HPLCで分離することになる。
質量分析強度比(Ix)の算出
工程(1)で未知代謝物放射能量の算出に用いたのと同一の生物試料を前処理したのち、質量分析装置付液体クロマトグラフ(以下、LC/MS)により分析し、MS(もしくはMS/MS)クロマトグラムを得る。測定は内標準法により行い、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物のクロマトグラム強度値の比(Ix)を得る。
なお、前記内標準法により測定を行う場合は、あらかじめ、代謝物を含む生物試料に内標準物質を一定濃度になるように添加して、HPLCで分離することになる。
工程(3)
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
工程(1)にて得られた未知代謝物放射能量(RIMx)を工程(2)にて得られた質量分析強度比(Ix)で除して、補正係数IA1(RI/MS比)を得る(式2)。
IA1=RIMx/Ix・・・(式2)
以上、工程(1)~(3)が、工程(4)における実試料測定のための前工程である。
(なお、前工程の語句の意味するところは、工程(4)を実施する際に必要になる程度の意味であって、工程(4)を実施する前に完了していなければならないなどの限定を付すものではない。以下同様。)
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
工程(1)にて得られた未知代謝物放射能量(RIMx)を工程(2)にて得られた質量分析強度比(Ix)で除して、補正係数IA1(RI/MS比)を得る(式2)。
IA1=RIMx/Ix・・・(式2)
以上、工程(1)~(3)が、工程(4)における実試料測定のための前工程である。
(なお、前工程の語句の意味するところは、工程(4)を実施する際に必要になる程度の意味であって、工程(4)を実施する前に完了していなければならないなどの限定を付すものではない。以下同様。)
工程(4)
LC/MSによる実試料中の未知代謝物濃度(Mx)の定量
工程(1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程(1)で使用した試料とは別異の生物試料(実試料)について、工程(2)と同様に分離・分析し、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物(未知代謝物)のクロマトグラム強度値の比(UIx)を算出する。得られたクロマトグラム強度値の比に工程(3)にて得られたIA1(RI/MS比)を乗じて放射能量を算出し、さらにRI標識化合物の比放射能量(R)を乗じることで未知代謝物の定量値(ng/mL、pg/mL等)を算出する(式3)。
Mx=UIx×IA1×R・・・(式3)
LC/MSによる実試料中の未知代謝物濃度(Mx)の定量
工程(1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程(1)で使用した試料とは別異の生物試料(実試料)について、工程(2)と同様に分離・分析し、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物(未知代謝物)のクロマトグラム強度値の比(UIx)を算出する。得られたクロマトグラム強度値の比に工程(3)にて得られたIA1(RI/MS比)を乗じて放射能量を算出し、さらにRI標識化合物の比放射能量(R)を乗じることで未知代謝物の定量値(ng/mL、pg/mL等)を算出する(式3)。
Mx=UIx×IA1×R・・・(式3)
このようにすることにより、実試料中の未知代謝物について、該未知代謝物について検量線を作成することなく、定量することができる。すなわち、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率が不明な代謝物であっても質量分析強度から、正確に濃度を測定することができる。
<未知代謝物濃度(Cm1)の定量分析方法:アプローチ2>
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例6の操作等に即して記載する。
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例6の操作等に即して記載する。
工程(1)
未変化体と未知代謝物の放射能量(Ru、Rm)の測定
生物試料(ここではRI標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料)を採取し、該試料を所望により前処理した後、HPLC-RADにより未変化体(u)及び未知代謝物(m)を分析し、それぞれの放射能量(Ru、Rm:ここでは計数率cpm)を測定する。
未変化体と未知代謝物の放射能量(Ru、Rm)の測定
生物試料(ここではRI標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料)を採取し、該試料を所望により前処理した後、HPLC-RADにより未変化体(u)及び未知代謝物(m)を分析し、それぞれの放射能量(Ru、Rm:ここでは計数率cpm)を測定する。
工程(2)
未変化体と未知代謝物の質量分析強度(Mu、Mm)の測定
工程(1)で未知代謝物放射能量の測定に用いたのと同一の生物試料を前処理したのちLC/MSにより分析しMS(もしくはMS/MS)クロマトグラムを得る。得られたMSクロマトグラムから未変化体(u)及び未知代謝物(m)それぞれの質量分析強度(Mu、Mm:ここではピーク面積値)を得る。
未変化体と未知代謝物の質量分析強度(Mu、Mm)の測定
工程(1)で未知代謝物放射能量の測定に用いたのと同一の生物試料を前処理したのちLC/MSにより分析しMS(もしくはMS/MS)クロマトグラムを得る。得られたMSクロマトグラムから未変化体(u)及び未知代謝物(m)それぞれの質量分析強度(Mu、Mm:ここではピーク面積値)を得る。
工程(3)
未変化体と未知代謝物のイオン化効率の比(補正係数IA2:fm/fu)の算出
工程(1)、(2)の測定結果に基づき、未知代謝物(m)と未変化体(u)の放射能量の比(Rm/Ru)及び質量分析強度の比(Mm/Mu)を得、質量分析強度の比を放射能量の比で除して未知代謝物(m)のイオン化効率fmと未変化体(u)のイオン化効率fuの比(補正係数IA2:fm/fu)を算出する(式4)。
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)・・・(式4)
以上、工程(1)~(3)が、工程(4)における実試料測定のための前工程である。
未変化体と未知代謝物のイオン化効率の比(補正係数IA2:fm/fu)の算出
工程(1)、(2)の測定結果に基づき、未知代謝物(m)と未変化体(u)の放射能量の比(Rm/Ru)及び質量分析強度の比(Mm/Mu)を得、質量分析強度の比を放射能量の比で除して未知代謝物(m)のイオン化効率fmと未変化体(u)のイオン化効率fuの比(補正係数IA2:fm/fu)を算出する(式4)。
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)・・・(式4)
以上、工程(1)~(3)が、工程(4)における実試料測定のための前工程である。
工程(4)
LC/MSによる実試料中の未知代謝物濃度(Cm1)の定量
工程(1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程(1)で使用した生物試料とは別異の生物試料(実試料)について、工程(2)と同様に分離・分析し、定量対象とする代謝物(未知代謝物)の質量分析強度(Mm1:ここではピーク面積値)を測定する。Mm1に、IA2(fm/fu)及び検量線から得ることができる係数Ccal((未変化体濃度:Cu)/(未変化体質量分析強度:Mu))を乗じることで未知代謝物(m1)の濃度(Cm1)を算出する(式5)。
Cm1=Mm1×IA2×Ccal・・・(式5)
LC/MSによる実試料中の未知代謝物濃度(Cm1)の定量
工程(1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程(1)で使用した生物試料とは別異の生物試料(実試料)について、工程(2)と同様に分離・分析し、定量対象とする代謝物(未知代謝物)の質量分析強度(Mm1:ここではピーク面積値)を測定する。Mm1に、IA2(fm/fu)及び検量線から得ることができる係数Ccal((未変化体濃度:Cu)/(未変化体質量分析強度:Mu))を乗じることで未知代謝物(m1)の濃度(Cm1)を算出する(式5)。
Cm1=Mm1×IA2×Ccal・・・(式5)
上記算出の工程を展開すると以下である。
Cu(未変化体濃度)=Mu×fu×F
(Mu:未変化体の質量分析強度)
(fu:未変化体のイオン化効率)
(F:試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項)
Cm1=Mm1×fm×F
=Mm1×(fm/fu)×fu×F
=Mm1×(fm/fu)×(Cu/Mu)
=(fm/fu)×Mm1×Cu/Mu
(Mm1:実試料中の未知代謝物の質量分析強度)
(fm:未知代謝物のイオン化効率)
Cu(未変化体濃度)=Mu×fu×F
(Mu:未変化体の質量分析強度)
(fu:未変化体のイオン化効率)
(F:試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項)
Cm1=Mm1×fm×F
=Mm1×(fm/fu)×fu×F
=Mm1×(fm/fu)×(Cu/Mu)
=(fm/fu)×Mm1×Cu/Mu
(Mm1:実試料中の未知代謝物の質量分析強度)
(fm:未知代謝物のイオン化効率)
このようにすることにより、実試料中の未知代謝物について、該未知代謝物の検量線を作成することなく、定量することができる。すなわち、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率が不明な代謝物であっても質量分析強度から、正確に濃度を測定することができる。本アプローチ2によれば、生物試料中の未変化体及び代謝物の濃度を未変化体の検量線のみで定量することができる。
上記アプローチ1の各パラメータをアプローチ2のパラメータに対照させて整理すると以下になる。
(アプローチ1)
Mx=UIx×IA1×R
をアプローチ2のパラメータに対照させると、
Cm1=Mm1×(Rm/Mm)×uの分子量/uの放射比活性
(アプローチ2)
Cm1=Mm1×(fm/fu)×Cu/Mu
このようにアプローチ1もアプローチ2も未知代謝物の質量分析強度に、イオン化効率を補正する係数を使用して濃度換算し、未知代謝物を定量することができる。
(アプローチ1)
Mx=UIx×IA1×R
をアプローチ2のパラメータに対照させると、
Cm1=Mm1×(Rm/Mm)×uの分子量/uの放射比活性
(アプローチ2)
Cm1=Mm1×(fm/fu)×Cu/Mu
このようにアプローチ1もアプローチ2も未知代謝物の質量分析強度に、イオン化効率を補正する係数を使用して濃度換算し、未知代謝物を定量することができる。
先述したように、上記アプローチ1、アプローチ2の各記載は典型例として記載したものである。従って、各数式によって裏付けることが可能な定量分析方法はすべて本発明の範囲に含まれる。
上記のように各数式によって裏付けられることを限度として、本発明の定量分析方法に用いる未変化体や代謝物の測定数値は、単位や測定(算出)方法を適宜選択することができる(例えば、放射能量であれば、cpm、dpm、Bqなど、質量分析強度であれば、ピーク面積値やピーク面積比など)。また前記測定数値は、本発明の定量分析方法において等価の意味を持つ別の数値に置き換えることも、当業者であれば当然に行い得る。
なお、本発明の定量分析方法の精度を担保する上で、アプローチ1,2のいずれにおいても、前工程:すなわち工程(1)~(3)と、実試料測定のための工程:すなわち工程(4)における、質量分析は同一原理の同一装置で行うことが最も好ましい。前工程と実試料測定のための工程における質量分析を、別の原理の質量分析装置間で、あるいは同一原理であるが別の質量分析装置間で行う場合には、例えば測定間における未変化体のイオン化効率を比較するなどして、適切に測定値の補正を行う必要がある。
上記のように各数式によって裏付けられることを限度として、本発明の定量分析方法に用いる未変化体や代謝物の測定数値は、単位や測定(算出)方法を適宜選択することができる(例えば、放射能量であれば、cpm、dpm、Bqなど、質量分析強度であれば、ピーク面積値やピーク面積比など)。また前記測定数値は、本発明の定量分析方法において等価の意味を持つ別の数値に置き換えることも、当業者であれば当然に行い得る。
なお、本発明の定量分析方法の精度を担保する上で、アプローチ1,2のいずれにおいても、前工程:すなわち工程(1)~(3)と、実試料測定のための工程:すなわち工程(4)における、質量分析は同一原理の同一装置で行うことが最も好ましい。前工程と実試料測定のための工程における質量分析を、別の原理の質量分析装置間で、あるいは同一原理であるが別の質量分析装置間で行う場合には、例えば測定間における未変化体のイオン化効率を比較するなどして、適切に測定値の補正を行う必要がある。
(対象試料)
本発明の分析対象試料としては、生物試料(薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、薬物を細胞や組織に添加して反応処理して得られる代謝物を含む試料)が好適であるが、これに限定されない。前記動物以外に植物や微生物及びそれらの細胞や組織から得られる生物試料も本発明の分析対象試料である。
薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料の代表的なものとして、動物の体液を挙げることができる。また、前記細胞の代表的なものとして、肝細胞(ヘパトサイト)や腫瘍細胞などを挙げることができる。これら細胞は新鮮採取されたものや凍結保存されたもの、さらには株化されたものであってもかまわず、この点は組織についても同様である。さらに該細胞や組織は、それらを構成する部分・成分、例えば、細胞であれば、細胞膜、ミクロソーム画分、細胞質画分など、組織であれば切片(組織スライス)などが使用可能である。またさらに前記細胞や組織を構成する部分・成分中に含有されている酵素なども本発明の分析対象となりうる。また、前記各分析対象は、ホモジネートや抽出物など、何らかの処理が施されたものであってもよい。
本発明の分析対象試料としては、生物試料(薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、薬物を細胞や組織に添加して反応処理して得られる代謝物を含む試料)が好適であるが、これに限定されない。前記動物以外に植物や微生物及びそれらの細胞や組織から得られる生物試料も本発明の分析対象試料である。
薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料の代表的なものとして、動物の体液を挙げることができる。また、前記細胞の代表的なものとして、肝細胞(ヘパトサイト)や腫瘍細胞などを挙げることができる。これら細胞は新鮮採取されたものや凍結保存されたもの、さらには株化されたものであってもかまわず、この点は組織についても同様である。さらに該細胞や組織は、それらを構成する部分・成分、例えば、細胞であれば、細胞膜、ミクロソーム画分、細胞質画分など、組織であれば切片(組織スライス)などが使用可能である。またさらに前記細胞や組織を構成する部分・成分中に含有されている酵素なども本発明の分析対象となりうる。また、前記各分析対象は、ホモジネートや抽出物など、何らかの処理が施されたものであってもよい。
本発明において、代謝物とは、薬物を動物に投与して行うin vivo試験により得られる代謝物のほか、薬物を細胞、組織に添加して行うin vitro試験により得られる代謝物も含み、また、発現系酵素などの酵素と薬物を反応させた反応産物もここでいう代謝物に含まれる。このように本発明では、薬物動態試験により得られる代謝物、例えば、マイクロドーズ試験や代謝物安全性試験(Safety Testing of Drug Metabolites)により得られる代謝物を好適な分析対象とすることができる。上記、代謝物が含まれる分析対象試料の具体例としては、全血、血清、血漿、尿、唾液、髄液、精液、前立腺液、胆汁、糞便などの動物の体液や、前記細胞、組織、酵素等によるin vitro試験の反応液を含む生物試料が好適である。本発明により分析して定量したい未知代謝物を含む生物試料と、該生物試料の定量を行うための前工程で使用する生物試料の関係をアプローチ1を例に説明すると以下になる。本発明を用いた定量の対象となる未知代謝物を含む生物試料と、その定量値(Mx)を算出するためにIA1(RI/MS比)を求めるための代謝物を含む生物試料とは、異なる生物試料どうしであればよく、例えば、ヒトとヒト以外の動物、動物と動物、動物と動物の組織、動物と細胞もしくは酵素に投与・添加して得られる試料などのほか、同一動物から経時的に採取されたもの等も含む。
本発明を、植物の代謝物へ応用する場合には、農薬、落果剤等のRI標識化合物を使用した薬物代謝、特定物質のRI標識化合物を使用した植物のメタボロミクスに応用でき、微生物の代謝物へ応用する場合には、変異原物質(環境ホルモンなど)や遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質などの分析に応用することができる。
本発明を、植物の代謝物へ応用する場合には、農薬、落果剤等のRI標識化合物を使用した薬物代謝、特定物質のRI標識化合物を使用した植物のメタボロミクスに応用でき、微生物の代謝物へ応用する場合には、変異原物質(環境ホルモンなど)や遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質などの分析に応用することができる。
(薬物)
本発明でいう薬物とは、その代謝物を探索・同定・定量等をしたい薬物であり、新規医薬開発の候補化合物や、生物体内での代謝メカニズム研究に使用される化合物が挙げられる。これらの薬物は、放射性同位体により標識した化合物(RI標識化合物)あるいは非標識の化合物(非標識体)として動物に投与又は細胞、組織、酵素等に添加されて、その代謝物が分析される。前記したように本発明の薬物には、農薬、落下剤、変異原物質(環境ホルモンなど)、遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質等も含まれる。
本明細書において、未変化体あるいは代謝物の語の意味するところは、当業者が使用する通常の意味と同様である。表記の原則としては、動物に投与又は、細胞、組織に添加する時点の化学構造を有しているものを未変化体と表記し、投与又は添加された後に化学構造の一部が、酸化、加水分解、抱合などを受け未変化体と相違するに至った化合物を代謝物と表記しているが、未変化体及び代謝物が混在する場合などには両者を代表する語として代謝物の語を使用していることがある。また同様に「生物試料中の成分」などの語句中の「成分」の語も、未変化体及び代謝物を代表する語として使用していることがある。
また、未知代謝物の語は、化学構造が既知であったり、標準品が入手できるものであっても、本発明の概念を説明する上で、本発明の定量分析方法を使用して定量しようとする代謝物に相当するものにも付している。
本発明でいう薬物とは、その代謝物を探索・同定・定量等をしたい薬物であり、新規医薬開発の候補化合物や、生物体内での代謝メカニズム研究に使用される化合物が挙げられる。これらの薬物は、放射性同位体により標識した化合物(RI標識化合物)あるいは非標識の化合物(非標識体)として動物に投与又は細胞、組織、酵素等に添加されて、その代謝物が分析される。前記したように本発明の薬物には、農薬、落下剤、変異原物質(環境ホルモンなど)、遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質等も含まれる。
本明細書において、未変化体あるいは代謝物の語の意味するところは、当業者が使用する通常の意味と同様である。表記の原則としては、動物に投与又は、細胞、組織に添加する時点の化学構造を有しているものを未変化体と表記し、投与又は添加された後に化学構造の一部が、酸化、加水分解、抱合などを受け未変化体と相違するに至った化合物を代謝物と表記しているが、未変化体及び代謝物が混在する場合などには両者を代表する語として代謝物の語を使用していることがある。また同様に「生物試料中の成分」などの語句中の「成分」の語も、未変化体及び代謝物を代表する語として使用していることがある。
また、未知代謝物の語は、化学構造が既知であったり、標準品が入手できるものであっても、本発明の概念を説明する上で、本発明の定量分析方法を使用して定量しようとする代謝物に相当するものにも付している。
(ライブラリ)
上記測定原理の説明で用いたアプローチ1のIA1(RI/MS比)やアプローチ2のIA2(fm/fu)は、あらかじめ求めておき、これをデータとしてライブラリに保存しておき、未知代謝物を定量する際にライブラリより該当データを引用して算出に用いることもできる。
上記測定原理の説明で用いたアプローチ1のIA1(RI/MS比)やアプローチ2のIA2(fm/fu)は、あらかじめ求めておき、これをデータとしてライブラリに保存しておき、未知代謝物を定量する際にライブラリより該当データを引用して算出に用いることもできる。
(代謝物の分離)
本発明の定量分析方法で行われる代謝物の分離は、該分離工程に続く工程であるRI定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を他の成分と分離できる方法であればいずれでもよく、分離したい代謝物の特性に応じて、公知の各種クトマトグラフィー(GLC、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など)が使用できる。そのうちでもHPLCが望ましい。ここで、該分離工程に続く工程であるRI定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を分離できる、とは所望の精度でRI定量分析や質量分析ができる程度に測定対象外の物質と分離されていることを意味し、分離されたものが、そのままRI定量装置や質量分析装置に供しうることまでは要求しない。例えば、一旦フラクショネーションした後、該フラクションの溶媒の組成をRI定量分析や質量分析に適合するものに変更させる等をしてもよい。HPLCによる分離装置は、既存のRI定量装置や質量分析装置における一部分として付帯されている場合が多いが、本発明では、RI定量装置のRI検出部、質量分析装置の質量検出部とは別に1つの分離装置が用いられてもよい。つまり、分離装置は両分析に共通の装置であって、分離装置を出た代謝物が分岐管を通って一方はRI検出部へ、もう一方は質量分析部へと導入されて測定されてもよい。分離工程を共通させずに、それぞれに設ける場合は、各分離工程で分離される代謝物の対応付けができるのであれば、分離条件を必ずしも同一にする必要はない。
本発明の定量分析方法で行われる代謝物の分離は、該分離工程に続く工程であるRI定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を他の成分と分離できる方法であればいずれでもよく、分離したい代謝物の特性に応じて、公知の各種クトマトグラフィー(GLC、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など)が使用できる。そのうちでもHPLCが望ましい。ここで、該分離工程に続く工程であるRI定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を分離できる、とは所望の精度でRI定量分析や質量分析ができる程度に測定対象外の物質と分離されていることを意味し、分離されたものが、そのままRI定量装置や質量分析装置に供しうることまでは要求しない。例えば、一旦フラクショネーションした後、該フラクションの溶媒の組成をRI定量分析や質量分析に適合するものに変更させる等をしてもよい。HPLCによる分離装置は、既存のRI定量装置や質量分析装置における一部分として付帯されている場合が多いが、本発明では、RI定量装置のRI検出部、質量分析装置の質量検出部とは別に1つの分離装置が用いられてもよい。つまり、分離装置は両分析に共通の装置であって、分離装置を出た代謝物が分岐管を通って一方はRI検出部へ、もう一方は質量分析部へと導入されて測定されてもよい。分離工程を共通させずに、それぞれに設ける場合は、各分離工程で分離される代謝物の対応付けができるのであれば、分離条件を必ずしも同一にする必要はない。
(RI標識化合物)
本発明に用いられるRI標識化合物の標識に用いられる放射性同位元素の核種としては3H、14Cなど投与される動物に対する障害が許容されるものが挙げられる。
RI標識化合物の動物への投与量は、試験の目的に応じて適宜選択可能である。in vivo試験の場合、一般に最高無毒性用量以下であればよく、MD臨床試験であれば前述のとおり、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の1/100を超えない用量又は100μgのいずれか少ない用量が該当する。
また、RI標識化合物を組織、細胞、又は代謝酵素に添加して行うin vitro試験の場合も、試験の目的に応じて添加量を適宜選択可能である。
本発明に用いられるRI標識化合物の標識に用いられる放射性同位元素の核種としては3H、14Cなど投与される動物に対する障害が許容されるものが挙げられる。
RI標識化合物の動物への投与量は、試験の目的に応じて適宜選択可能である。in vivo試験の場合、一般に最高無毒性用量以下であればよく、MD臨床試験であれば前述のとおり、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の1/100を超えない用量又は100μgのいずれか少ない用量が該当する。
また、RI標識化合物を組織、細胞、又は代謝酵素に添加して行うin vitro試験の場合も、試験の目的に応じて添加量を適宜選択可能である。
(RI定量装置)
本発明に用いられるRI定量装置は、前記クロマトグラフィーにより分離されたRI標識化合物を定量分析できるものであればいずれでもよく、HPLCの検出器としてのRI定量装置が挙げられる。RI定量装置の具体的な例としては、液体シンチレーション法に対応する装置、AMSに対応する装置を挙げることができる。
本発明に用いられるRI定量装置は、前記クロマトグラフィーにより分離されたRI標識化合物を定量分析できるものであればいずれでもよく、HPLCの検出器としてのRI定量装置が挙げられる。RI定量装置の具体的な例としては、液体シンチレーション法に対応する装置、AMSに対応する装置を挙げることができる。
(質量分析装置)
本発明に用いられる質量分析装置は、前記クロマトグラフィーにより分離された成分の質量電荷比を測定し、質量電荷比で同定された化合物の質量分析強度に基づき定量分析ができるものであればいずれでもよいが、精密分析ができるものがより望ましく、例えばtriple stage quadorupole mass spectrometerのLC/MS/MS Precursor ion scan方式やMultiple Reaction Monitoring方式、LC LTQ Orbitrap(登録商標)のパラレルスキャン方式のものが挙げられる。MD臨床試験での被験薬物の血漿中濃度は一般に数100pg/mLから数pg/mLであることを考慮すれば、定量限界は1pg/mL程度あることが望ましい。
またLC/MSあるいはLC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)、LC/MSn(液体クロマトグラフ-多段階タンデム質量分析)のような多段階の質量分析を所望の定量感度や化学構造解析の精度に照らして適宜選択することができる。本明細書において、MSnの語は、MS/MSを含む多段階タンデム質量分析の総称として使用することがある。
本発明に用いられる質量分析装置は、前記クロマトグラフィーにより分離された成分の質量電荷比を測定し、質量電荷比で同定された化合物の質量分析強度に基づき定量分析ができるものであればいずれでもよいが、精密分析ができるものがより望ましく、例えばtriple stage quadorupole mass spectrometerのLC/MS/MS Precursor ion scan方式やMultiple Reaction Monitoring方式、LC LTQ Orbitrap(登録商標)のパラレルスキャン方式のものが挙げられる。MD臨床試験での被験薬物の血漿中濃度は一般に数100pg/mLから数pg/mLであることを考慮すれば、定量限界は1pg/mL程度あることが望ましい。
またLC/MSあるいはLC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)、LC/MSn(液体クロマトグラフ-多段階タンデム質量分析)のような多段階の質量分析を所望の定量感度や化学構造解析の精度に照らして適宜選択することができる。本明細書において、MSnの語は、MS/MSを含む多段階タンデム質量分析の総称として使用することがある。
本発明により試料中の代謝物を測定する場合、標準品が準備できる化合物と準備できない化合物が混在することがあるが、この場合、標準品が準備できる化合物については、従来の検量線を作成して定量する方法を採用し、標準品が準備できない化合物についてのみ本発明の定量分析方法を用いて測定することにより、代謝物を網羅的に定量分析することができる。また、代謝物すべてについて、本発明の定量分析方法を用いて測定することにより代謝物を網羅的に定量分析することもできる。アプローチ2で分析を行う場合には、未変化体の検量線を作成するのみでよく、また、前記未変化体に代えて代謝物で検量線を作成することも可能である。つまり、アプローチ2は、検量線を作成できる基準となる物質を用いて他の代謝物、特に未知の代謝物の濃度を定量する方法である。そのような基準となる物質としては、未変化体が最も好ましい例として挙げられるが、他に標準品の入手が容易な代謝物も本アプローチにおける基準となる物質に相当する。
(用途)
本発明の定量分析方法は、標準品の無い(入手することが困難な)化合物の定性及び定量分析に適しており、MD臨床試験やメタボロミクスなどの生体内における代謝物の網羅的な分析に用いられる。
本発明の定量分析方法は、標準品の無い(入手することが困難な)化合物の定性及び定量分析に適しており、MD臨床試験やメタボロミクスなどの生体内における代謝物の網羅的な分析に用いられる。
(分析装置)
本発明の分析装置は、以下のa)~d)の手段を有する装置であればよく、
a)試料中の代謝物を分離するための分離手段、
b)前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するRI検出手段、
c)前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段、
d)代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを使用して代謝物の濃度Mx又はCm1を求めるための演算処理手段
これらは既存のRI定量装置と質量分析装置と演算装置を組み合わせて作製することができる。例えば、既存の質量分析装置LC/MS/MSにRI検出器を付帯してHPLC分離後の代謝物成分のRIの定量ができるようにした、RI検出器付質量分析装置が該当する。
本発明の分析装置は、以下のa)~d)の手段を有する装置であればよく、
a)試料中の代謝物を分離するための分離手段、
b)前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するRI検出手段、
c)前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段、
d)代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを使用して代謝物の濃度Mx又はCm1を求めるための演算処理手段
これらは既存のRI定量装置と質量分析装置と演算装置を組み合わせて作製することができる。例えば、既存の質量分析装置LC/MS/MSにRI検出器を付帯してHPLC分離後の代謝物成分のRIの定量ができるようにした、RI検出器付質量分析装置が該当する。
(質量分析におけるマトリックス効果の軽減)
質量分析において、測定対象物(薬物の未変化体あるいは代謝物)の感度が、生物試料由来成分(例えば、タンパク質、核酸、培地など)を含む試料の場合に、生物試料由来成分を含まない試料(例えば、薬物や標準品が緩衝液などの溶媒に溶解されている標準試料)の場合と比較して、増大したり減少したりする現象が知られており、マトリックス効果(matrix effect)と呼ばれている。このマトリックス効果は、測定対象物と共存する生物試料由来成分が、測定対象物のイオン化に影響をあたえることにより生ずると考えられており、例えば、検量線作成のための標準試料に、測定対象物を含まない生物試料由来成分(ブランク試料)を共存させるなどして、標準試料と実試料の組成を近づけることで軽減できる場合がある。本発明の方法においても、例えば、特表2004-510961、特開2008-014746などの記載を参照して適宜にマトリックス効果を軽減するための措置を行うことができる。
質量分析において、測定対象物(薬物の未変化体あるいは代謝物)の感度が、生物試料由来成分(例えば、タンパク質、核酸、培地など)を含む試料の場合に、生物試料由来成分を含まない試料(例えば、薬物や標準品が緩衝液などの溶媒に溶解されている標準試料)の場合と比較して、増大したり減少したりする現象が知られており、マトリックス効果(matrix effect)と呼ばれている。このマトリックス効果は、測定対象物と共存する生物試料由来成分が、測定対象物のイオン化に影響をあたえることにより生ずると考えられており、例えば、検量線作成のための標準試料に、測定対象物を含まない生物試料由来成分(ブランク試料)を共存させるなどして、標準試料と実試料の組成を近づけることで軽減できる場合がある。本発明の方法においても、例えば、特表2004-510961、特開2008-014746などの記載を参照して適宜にマトリックス効果を軽減するための措置を行うことができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例1〕
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
ラットに14C-トルブタミド(TB)を経口投与し、投与後に得た血漿及び尿中のTB未変化体及びTB代謝物をHPLC-RAD及びLC/MS/MSにより分析し、本発明の補正係数IA1(RI/MS比)を算出した。
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
ラットに14C-トルブタミド(TB)を経口投与し、投与後に得た血漿及び尿中のTB未変化体及びTB代謝物をHPLC-RAD及びLC/MS/MSにより分析し、本発明の補正係数IA1(RI/MS比)を算出した。
操作(1)
14C-TB投与と採血、採尿
SD系雄性ラット(1匹)に14C-TBを3mg/kgで経口投与した。14C-TB投与4時間後、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。また、14C-TB投与直後(0時間)から4時間後までの蓄尿を採取した。
14C-TB投与と採血、採尿
SD系雄性ラット(1匹)に14C-TBを3mg/kgで経口投与した。14C-TB投与4時間後、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。また、14C-TB投与直後(0時間)から4時間後までの蓄尿を採取した。
操作(2)
総放射能量(総RI)の測定
操作(1)で得た血漿0.05mLに、2mLの組織溶解剤(SOLUENE-350、パーキンエルマ社製)を加えた後、10mLのシンチレーター(HIONIC-FLUOR、パーキンエルマ社製)を加え、液体シンチレーションカウンタ(LSC)(2500TR、パーキンエルマ社製)により総放射能量を測定した。
また、操作(1)で得た尿試料0.05mLに、10mLの前記シンチレーターを加え、前記LSCにより総放射能量を測定した。
総放射能量(総RI)の測定
操作(1)で得た血漿0.05mLに、2mLの組織溶解剤(SOLUENE-350、パーキンエルマ社製)を加えた後、10mLのシンチレーター(HIONIC-FLUOR、パーキンエルマ社製)を加え、液体シンチレーションカウンタ(LSC)(2500TR、パーキンエルマ社製)により総放射能量を測定した。
また、操作(1)で得た尿試料0.05mLに、10mLの前記シンチレーターを加え、前記LSCにより総放射能量を測定した。
操作(3)
HPLC-RADによるTB未変化体及びTB代謝物の放射能量(RIMx)測定
操作(1)で得た血漿1mLに、3倍量のアセトニトリルを加え、十分攪拌した後、遠心分離(3,000rpm、4℃、10分)して上清を採取し、TB未変化体及びTB代謝物(測定対象物群)を抽出した。次いで抽出残渣に対し、先と同容量(3mL)のアセトニトリルを加え、前記と同様に攪拌と遠心分離までの操作を2回繰り返して更に測定対象物群を抽出した。抽出採取して得られた3回分の遠心上清を合わせた後、アセトニトリルを加えて総量を10mLにし測定対象物抽出液とした。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、30%エタノール150μLにより再溶解した後、さらに遠心分離(3,000rpm、4℃、5分)し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
また、操作(1)で得た尿は、上記血漿における抽出等の前処理をせず、そのままを遠心分離(3,000rpm、4℃、10分)して上清を得、分析試料とした。該分析試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
HPLC-RADによるTB未変化体及びTB代謝物の放射能量(RIMx)測定
操作(1)で得た血漿1mLに、3倍量のアセトニトリルを加え、十分攪拌した後、遠心分離(3,000rpm、4℃、10分)して上清を採取し、TB未変化体及びTB代謝物(測定対象物群)を抽出した。次いで抽出残渣に対し、先と同容量(3mL)のアセトニトリルを加え、前記と同様に攪拌と遠心分離までの操作を2回繰り返して更に測定対象物群を抽出した。抽出採取して得られた3回分の遠心上清を合わせた後、アセトニトリルを加えて総量を10mLにし測定対象物抽出液とした。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、30%エタノール150μLにより再溶解した後、さらに遠心分離(3,000rpm、4℃、5分)し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
また、操作(1)で得た尿は、上記血漿における抽出等の前処理をせず、そのままを遠心分離(3,000rpm、4℃、10分)して上清を得、分析試料とした。該分析試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
[HPLC-RAD条件]
HPLC:Prominence(島津製作所社製)
カラム:Inertsil ODS-3(粒子径:5μm、カラムサイズ:4.6mmI.D.×150mm)(GLサイエンス社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→40分(40%)→41分(90%)→50(90%)
流速:1.0mL/分
分析時間:50分
カラム温度:40℃
RAD:Radiomatic625TR(パーキンエルマ社製)
セル容量:500μL
シンチレーター:FLO-SCINTII(パーキンエルマ社製)
シンチレーター流量:3.0mL/分
スプリット比:100%
アップデート時間:6秒
HPLC:Prominence(島津製作所社製)
カラム:Inertsil ODS-3(粒子径:5μm、カラムサイズ:4.6mmI.D.×150mm)(GLサイエンス社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→40分(40%)→41分(90%)→50(90%)
流速:1.0mL/分
分析時間:50分
カラム温度:40℃
RAD:Radiomatic625TR(パーキンエルマ社製)
セル容量:500μL
シンチレーター:FLO-SCINTII(パーキンエルマ社製)
シンチレーター流量:3.0mL/分
スプリット比:100%
アップデート時間:6秒
操作(4)
LC/MS/MSによるTB未変化体及びTB代謝物の質量分析(ピーク面積比Ixの測定)
操作(1)で得た血漿0.05mLもしくは尿0.05mLに、それぞれ0.05mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9及びカルボキシトルブタミド-d9各20ng/mLを含む)0.15mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
LC/MS/MSによるTB未変化体及びTB代謝物の質量分析(ピーク面積比Ixの測定)
操作(1)で得た血漿0.05mLもしくは尿0.05mLに、それぞれ0.05mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9及びカルボキシトルブタミド-d9各20ng/mLを含む)0.15mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
[LC/MS/MS条件]
HPLC:ACQUITY UltraPerformanceLC(ウォーターズ社製)
カラム:ACQUITY UPLC BEH-C18(粒子径:1.7μm、カラムサイズ:2.1mmI.D.×50mm)(ウォーターズ社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→2.5分(40%)→3分(90%)→3.5分(90%)→3.6分(0%)→4分(0%)
流速:0.8mL/分
分析時間:4分
カラム温度:40℃
MS/MS:4000QTrap(アプライドバイオシステムズ社製)
イオン化法:ESI(電子スプレーイオン化法)
イオン極性:Negative
検出モード:MRM(Multiple Reaction Monitoring)
ターボガス温度:650℃
イオンスプレー電圧:4500V
モニターイオン(Q1(MS1)→Q3(MS2))
トルブタミド(TB) m/z=269.0→169.7
ヒドロキシトルブタミド(HTB) m/z=285.0→185.7
カルボキシトルブタミド(CTB) m/z=299.0→199.6
IS(ヒドロキシトルブタミド-d9)m/z=294.9→185.7
IS(カルボキシトルブタミド-d9)m/z=308.1→199.6
M1 m/z=213.0→169.8
M2 m/z=285.0→169.8
M3 m/z=285.0→169.8
M4 m/z=285.0→169.8
なお、操作(3)で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作(4)で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。
HPLC:ACQUITY UltraPerformanceLC(ウォーターズ社製)
カラム:ACQUITY UPLC BEH-C18(粒子径:1.7μm、カラムサイズ:2.1mmI.D.×50mm)(ウォーターズ社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→2.5分(40%)→3分(90%)→3.5分(90%)→3.6分(0%)→4分(0%)
流速:0.8mL/分
分析時間:4分
カラム温度:40℃
MS/MS:4000QTrap(アプライドバイオシステムズ社製)
イオン化法:ESI(電子スプレーイオン化法)
イオン極性:Negative
検出モード:MRM(Multiple Reaction Monitoring)
ターボガス温度:650℃
イオンスプレー電圧:4500V
モニターイオン(Q1(MS1)→Q3(MS2))
トルブタミド(TB) m/z=269.0→169.7
ヒドロキシトルブタミド(HTB) m/z=285.0→185.7
カルボキシトルブタミド(CTB) m/z=299.0→199.6
IS(ヒドロキシトルブタミド-d9)m/z=294.9→185.7
IS(カルボキシトルブタミド-d9)m/z=308.1→199.6
M1 m/z=213.0→169.8
M2 m/z=285.0→169.8
M3 m/z=285.0→169.8
M4 m/z=285.0→169.8
なお、操作(3)で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作(4)で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。
結果(1)
血漿試料のIA1(RI/MS比)の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれの放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれのピーク面積比(Ix)で除し、TB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれの補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表1に示した。
なお、以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(A)と表記する。
血漿試料のIA1(RI/MS比)の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれの放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれのピーク面積比(Ix)で除し、TB未変化体及びTB代謝物(HTB)それぞれの補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表1に示した。
なお、以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(A)と表記する。
結果(2)
尿試料のIA1(RI/MS比)の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB未変化体、TB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれの放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB未変化体及びTB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれのピーク面積比(Ix)で除し、TB未変化体及びTB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれの補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表2に示した。なお以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(B)と表記する。
尿試料のIA1(RI/MS比)の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB未変化体、TB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれの放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB未変化体及びTB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれのピーク面積比(Ix)で除し、TB未変化体及びTB代謝物(HTB、CTB)、TB未知代謝物(M1、M2、M3、M4)それぞれの補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表2に示した。なお以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(B)と表記する。
〔実施例2〕
補正係数IA1(RI/MS比(A))による血漿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のTB未変化体及びTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))からTB未変化体及びTB代謝物の定量を実施した。
補正係数IA1(RI/MS比(A))による血漿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のTB未変化体及びTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))からTB未変化体及びTB代謝物の定量を実施した。
操作(1)
14C-TB投与と採血
SD系雄性ラット(各時点n=3:合計15匹)に1mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与1、2、4、8、24時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。
14C-TB投与と採血
SD系雄性ラット(各時点n=3:合計15匹)に1mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与1、2、4、8、24時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。
操作(2)
TB未変化体及びTB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIxの測定)
実施例1の操作(4)と同一の操作により実施した。
TB未変化体及びTB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIxの測定)
実施例1の操作(4)と同一の操作により実施した。
操作(3)
実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果について実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いてTB未変化体及びTB代謝物の定量を行った。ここで、
TBの放射比活性=22.9GBq/mmol
TBの分子量=270
HTBの分子量=286
として計算した。結果を表3、4に示した。
実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果について実施例1の結果(1)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いてTB未変化体及びTB代謝物の定量を行った。ここで、
TBの放射比活性=22.9GBq/mmol
TBの分子量=270
HTBの分子量=286
として計算した。結果を表3、4に示した。
〔実施例3〕
補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性確認(血漿試料)
実施例2で算出した定量値とHPLC-RAD分析による実試料のRI定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性を確認した。
補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性確認(血漿試料)
実施例2で算出した定量値とHPLC-RAD分析による実試料のRI定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性を確認した。
操作(1)
14C-TB投与と採血
実施例2の血漿試料を使用した。
14C-TB投与と採血
実施例2の血漿試料を使用した。
操作(2)
総放射能量の測定
実施例1の操作(2)と同一の操作で実施した。
総放射能量の測定
実施例1の操作(2)と同一の操作で実施した。
操作(3)
TB未変化体及びTB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(RIMx)測定
実施例1の操作(3)と同一の操作で実施した。
TB未変化体及びTB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(RIMx)測定
実施例1の操作(3)と同一の操作で実施した。
結果(1)
補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性確認(血漿試料)
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いて算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表5、6に示した。
補正係数IA1(RI/MS比(A))による定量の妥当性確認(血漿試料)
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いて算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表5、6に示した。
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いて算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度は、表5、6の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比(UIx)から測定対象の定量が可能である。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(A))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比(UIx)から測定対象の定量が可能である。
〔実施例4〕
補正係数IA1(RI/MS比(B))による尿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿中のTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))からTB代謝物の定量を実施した。
補正係数IA1(RI/MS比(B))による尿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿中のTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))からTB代謝物の定量を実施した。
操作(1)
14C-TB投与と採尿
SD系雄性ラット(1時点n=3:合計3匹)に1mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿を採取した。
14C-TB投与と採尿
SD系雄性ラット(1時点n=3:合計3匹)に1mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿を採取した。
操作(2)
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIxの測定)
実施例1の操作(4)と同一の操作により実施した。
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIxの測定)
実施例1の操作(4)と同一の操作により実施した。
操作(3)
実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果から実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いてTB代謝物の定量を行った。結果を表7-12に示した。各TB代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。
実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果から実施例1の結果(2)で求めた補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いてTB代謝物の定量を行った。結果を表7-12に示した。各TB代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。
〔実施例5〕
補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性確認(尿試料)
実施例4で得た定量値とHPLC-RAD分析による定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性を確認した。
補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性確認(尿試料)
実施例4で得た定量値とHPLC-RAD分析による定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性を確認した。
操作(1)
14C-TB投与と採尿
実施例4の尿試料を使用した。
14C-TB投与と採尿
実施例4の尿試料を使用した。
操作(2)
総放射能量の測定
実施例1の操作(2)と同一の操作で実施した。
総放射能量の測定
実施例1の操作(2)と同一の操作で実施した。
操作(3)
TB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(総RI)測定
実施例1の操作(3)と同一の操作で実施した。
TB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(総RI)測定
実施例1の操作(3)と同一の操作で実施した。
結果(1)
補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性確認(尿試料)
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB代謝物の濃度と、補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いて算出したTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表13-18に示した。各TB代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。
補正係数IA1(RI/MS比(B))による定量の妥当性確認(尿試料)
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB代謝物の濃度と、補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いて算出したTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表13-18に示した。各TB代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。
本実施例でHPLC-RADにより測定された放射能量から算出したTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いて算出したTB代謝物の濃度は、表13-18の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(B))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。
〔実施例6〕
補正係数IA2を用いた定量
14C-TB及びその代謝物のRI定量分析と質量分析を行い、未変化体及び代謝物のイオン化効率を求め、代謝物のイオン化効率/未変化体イオン化効率の比を求めた。
操作(1)
未知代謝物放射能量の分析(HPLC-RAD)、質量分析強度の測定
表19の組成でヒト又はラットの肝ミクロソームと14C-TB溶液を混合し、37℃で 5分間インキュベーションした。次いで、50mMグルタチオン溶液(100μL)及び20U/mLグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ溶液(20μL)を添加して混和後、37℃で60分間インキュベーションした後、氷冷下、アセトニトリル(900μL)を添加して反応を停止した。遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)により不溶物を除去し、上清を半量ずつに分けて各々減圧下で濃縮乾固した。50%エタノール(250μL)に溶解し、不溶物を遠心分離後(3,000rpm、4℃、10分)、上清をLC/MS/MS装置(LC-LTQ Orbitrap XL:サーモフィッシャーサイエンティフィク社製)及び放射能検出器(β-RAM:IN/US システムズ社製)で分析した。
補正係数IA2を用いた定量
14C-TB及びその代謝物のRI定量分析と質量分析を行い、未変化体及び代謝物のイオン化効率を求め、代謝物のイオン化効率/未変化体イオン化効率の比を求めた。
操作(1)
未知代謝物放射能量の分析(HPLC-RAD)、質量分析強度の測定
表19の組成でヒト又はラットの肝ミクロソームと14C-TB溶液を混合し、37℃で 5分間インキュベーションした。次いで、50mMグルタチオン溶液(100μL)及び20U/mLグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ溶液(20μL)を添加して混和後、37℃で60分間インキュベーションした後、氷冷下、アセトニトリル(900μL)を添加して反応を停止した。遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)により不溶物を除去し、上清を半量ずつに分けて各々減圧下で濃縮乾固した。50%エタノール(250μL)に溶解し、不溶物を遠心分離後(3,000rpm、4℃、10分)、上清をLC/MS/MS装置(LC-LTQ Orbitrap XL:サーモフィッシャーサイエンティフィク社製)及び放射能検出器(β-RAM:IN/US システムズ社製)で分析した。
[LC条件]
カラム:Inertsil ODS‐3(粒子径:5μm、カラムサイズ:4.6mmI.D.×150mm)(GLサイエンス社製)
流速:1mL/分(radiodetector/MS(4:1)となるように分岐させる)
移動相A:酢酸/アセトニトリル/H2O(0.1:5:95)
移動相B:H2O/アセトニトリル(5:95)
カラム:Inertsil ODS‐3(粒子径:5μm、カラムサイズ:4.6mmI.D.×150mm)(GLサイエンス社製)
流速:1mL/分(radiodetector/MS(4:1)となるように分岐させる)
移動相A:酢酸/アセトニトリル/H2O(0.1:5:95)
移動相B:H2O/アセトニトリル(5:95)
[LC/MS/MS測定]
Fullscan-datadependentexclusionを測定後、フルスキャン時に測定した精密質量から代謝物を網羅的に検索した。代謝物のMS/MSリスト(代謝物の質量及び保持時間を入力した表)を利用してMS/MS測定し、フラグメントから代謝物を推定した。
Fullscan-datadependentexclusionを測定後、フルスキャン時に測定した精密質量から代謝物を網羅的に検索した。代謝物のMS/MSリスト(代謝物の質量及び保持時間を入力した表)を利用してMS/MS測定し、フラグメントから代謝物を推定した。
操作(2)
HPLC-RAD、LC/MS/MS測定結果の比較
1.ラットミクロソーム
HPLC-RADより得られたクロマトグラムより3つのピークが検出された(RT=18.48、24.48、39.42分)。LC/MS測定(Positiveionmode)より、未変化体(m/z271)、水酸化体(4-ヒドロキシトルブタミド、m/z287)及びスルホンアミド体(m/z172)が、放射能のピークと一致する保持時間(各々RT=39.75、24.92、18.87分)に検出された。また、LC/MS測定では、他に3種の水酸化体(m/z287)と二種のグルタチオン抱合体(m/z576)が検出された。
HPLC-RAD、LC/MS/MS測定結果の比較
1.ラットミクロソーム
HPLC-RADより得られたクロマトグラムより3つのピークが検出された(RT=18.48、24.48、39.42分)。LC/MS測定(Positiveionmode)より、未変化体(m/z271)、水酸化体(4-ヒドロキシトルブタミド、m/z287)及びスルホンアミド体(m/z172)が、放射能のピークと一致する保持時間(各々RT=39.75、24.92、18.87分)に検出された。また、LC/MS測定では、他に3種の水酸化体(m/z287)と二種のグルタチオン抱合体(m/z576)が検出された。
2.ヒトミクロソーム
放射能測定より得られたクロマトグラムより2つのピークが検出された(RT=24.48、39.48分)。LC/MS測定(Positiveionmode)より、未変化体(m/z271)及び水酸化体(4-ヒドロキシトルブタミド,m/z287)が、放射能のピークと一致する保持時間(各々RT=24.91、39.81分)に検出された。また、LC/MS測定では、他に3種の水酸化体(m/z287)と2種のグルタチオン抱合体(m/z576)が検出された。
放射能測定より得られたクロマトグラムより2つのピークが検出された(RT=24.48、39.48分)。LC/MS測定(Positiveionmode)より、未変化体(m/z271)及び水酸化体(4-ヒドロキシトルブタミド,m/z287)が、放射能のピークと一致する保持時間(各々RT=24.91、39.81分)に検出された。また、LC/MS測定では、他に3種の水酸化体(m/z287)と2種のグルタチオン抱合体(m/z576)が検出された。
操作(3)
補正係数IA2(fm/fu)の算出
1.ラットミクロソーム
放射能測定で観測された3本のピークの面積値(未変化体:Ru、水酸化体:Rm-OH、スルホンアミド体:Rm-s)を以下に示した。
Ru=4467.2cpm
Rm-OH=844.8cpm
Rm-s=332.8cpm
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Rm-OH/Ru=0.1891
Rm-s/Ru=0.0745
放射能ピークに対応するMSクロマトグラムの面積値(未変化体:Mu、水酸化体:Mm-OH、スルホンアミド体:Mm-s)を以下に示した。ただし、MSクロマトグラムは、各々の精密質量から5ppmのtoleranceで求めた。
Mu=769748409
Mm-OH=109203438
Mm-s=29856
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Mm-OH/Mu=0.1419
Mm-s/Mu=0.000038786
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-OH/Mu=0.1419)/(Rm-OH/Ru=0.1891)=0.75
水酸化体(m-OH)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の0.75倍であった。
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-s/Mu=0.000038786)/(Rm-s/Ru=0.0745)=5.2×10-4
スルホンアミド体(m-s)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の5.2×10-4倍であった。
補正係数IA2(fm/fu)の算出
1.ラットミクロソーム
放射能測定で観測された3本のピークの面積値(未変化体:Ru、水酸化体:Rm-OH、スルホンアミド体:Rm-s)を以下に示した。
Ru=4467.2cpm
Rm-OH=844.8cpm
Rm-s=332.8cpm
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Rm-OH/Ru=0.1891
Rm-s/Ru=0.0745
放射能ピークに対応するMSクロマトグラムの面積値(未変化体:Mu、水酸化体:Mm-OH、スルホンアミド体:Mm-s)を以下に示した。ただし、MSクロマトグラムは、各々の精密質量から5ppmのtoleranceで求めた。
Mu=769748409
Mm-OH=109203438
Mm-s=29856
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Mm-OH/Mu=0.1419
Mm-s/Mu=0.000038786
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-OH/Mu=0.1419)/(Rm-OH/Ru=0.1891)=0.75
水酸化体(m-OH)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の0.75倍であった。
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-s/Mu=0.000038786)/(Rm-s/Ru=0.0745)=5.2×10-4
スルホンアミド体(m-s)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の5.2×10-4倍であった。
上記で求められたイオン化効率を下記式に代入することにより、水酸化体(m-OH)あるいはスルホンアミド体(m-s)を定量することが可能である。
水酸化体濃度=0.75×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×水酸化体のMSピーク面積値
スルホンアミド体濃度=5.2×10-4×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×スルホンアミド体のMSピーク面積値
*(TB濃度/TBのMSピーク面積値)は、検量線から求めることができる値である。
水酸化体濃度=0.75×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×水酸化体のMSピーク面積値
スルホンアミド体濃度=5.2×10-4×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×スルホンアミド体のMSピーク面積値
*(TB濃度/TBのMSピーク面積値)は、検量線から求めることができる値である。
なお、補正係数IA2(fm/fu)は、実施例2、4(IA1(RI/MS比))を用いても、算出することができる。
Ru/Mu=4467.2/769748409=5.803×10-6
Rm-OH/Mm-OH=844.8/109203438=7.736×10-6
Rm-s/Mm-s=332.8/29856=1.115×10-2
未変化体に対する比を以下に示した。
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-OH/Mm-OH)=0.75
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-s/Mm-s)=5.2×10-4
Ru/Mu=4467.2/769748409=5.803×10-6
Rm-OH/Mm-OH=844.8/109203438=7.736×10-6
Rm-s/Mm-s=332.8/29856=1.115×10-2
未変化体に対する比を以下に示した。
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-OH/Mm-OH)=0.75
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-s/Mm-s)=5.2×10-4
以上より、本発明の補正係数IA2(fm/fu)を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。特に未変化体の検量線のみで未知代謝物の定量ができるので極めて簡便な定量分析方法である。
2.ヒトミクロソーム
放射能測定で観測された2本のピークの面積値(未変化体:Ru、水酸化体:Rm-OH)を以下に示した。
Ru=5324.8cpm
Rm-OH=883.2cpm
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Rm-OH/Ru=0.1659
放射能ピークに対応するMSクロマトグラムの面積値(未変化体:Mu、水酸化体:Mm-OH)を以下に示した。ただし、MSクロマトグラムは、各々の精密質量から5ppmのtoleranceで求めた。
Mu=904228118
Mm-OH=123876568
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Mm-OH/Mu=0.1370
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-OH/Mu=0.1370)/(Rm-OH/Ru=0.1659)=0.826
水酸化体(m-OH)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の0.826倍である。
放射能測定で観測された2本のピークの面積値(未変化体:Ru、水酸化体:Rm-OH)を以下に示した。
Ru=5324.8cpm
Rm-OH=883.2cpm
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Rm-OH/Ru=0.1659
放射能ピークに対応するMSクロマトグラムの面積値(未変化体:Mu、水酸化体:Mm-OH)を以下に示した。ただし、MSクロマトグラムは、各々の精密質量から5ppmのtoleranceで求めた。
Mu=904228118
Mm-OH=123876568
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Mm-OH/Mu=0.1370
補正係数IA2(fm/fu)=(Mm-OH/Mu=0.1370)/(Rm-OH/Ru=0.1659)=0.826
水酸化体(m-OH)のイオン化効率は未変化体(u)のイオン化効率の0.826倍である。
前記ラットミクロソームの場合と同様に本発明の定量分析方法により、水酸化体(m-OH)を定量することが可能である。
水酸化体濃度=0.826×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×水酸化体のMSピーク面積値
*(TB濃度/TBのMSピーク面積値)は、検量線から求めることができる値である。
水酸化体濃度=0.826×(TB濃度/TBのMSピーク面積値)×水酸化体のMSピーク面積値
*(TB濃度/TBのMSピーク面積値)は、検量線から求めることができる値である。
なお、補正係数IA2(fm/fu)は、実施例2、4(IA1(RI/MS比))を用いても、算出することができる。
Ru/Mu=5324.8/904228118=5.888×10-6
Rm-OH/Mm-OH=883.2/123876568=7.129×10-6
未変化体に対する比を以下に示めした。
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-OH/Mm-OH)=0.826
Ru/Mu=5324.8/904228118=5.888×10-6
Rm-OH/Mm-OH=883.2/123876568=7.129×10-6
未変化体に対する比を以下に示めした。
補正係数IA2(fm/fu)=(Ru/Mu)/(Rm-OH/Mm-OH)=0.826
以上より、本発明の補正係数IA2(fm/fu)を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。特に未変化体の検量線のみで未知代謝物の定量ができるので極めて簡便な定量分析方法である。
〔実施例7〕
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
ラットに14C-トルブタミド(TB)を経口投与し、投与後に得た尿中のTB代謝物を放射能検出器付高速液体クロマトグラフ(HPLC-RAD)及びLC/MS/MSにより分析し、本発明の補正係数IA1(RI/MS比)を算出した。
補正係数IA1(RI/MS比)の算出
ラットに14C-トルブタミド(TB)を経口投与し、投与後に得た尿中のTB代謝物を放射能検出器付高速液体クロマトグラフ(HPLC-RAD)及びLC/MS/MSにより分析し、本発明の補正係数IA1(RI/MS比)を算出した。
操作(1)
14C-TB投与と採尿
SD系雄性ラット(合計1匹)に0.00167mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿を採取した。
14C-TB投与と採尿
SD系雄性ラット(合計1匹)に0.00167mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与直後(0時間)から24時間後までの蓄尿を採取した。
操作(2)
総放射能量の測定
操作(1)で得た尿試料1mLに、10mLの前記シンチレーターを加え、前記LSCにより総放射能量を測定した。
総放射能量の測定
操作(1)で得た尿試料1mLに、10mLの前記シンチレーターを加え、前記LSCにより総放射能量を測定した。
操作(3)
TB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(RIMx)測定
操作(1)で得た尿5mLをあらかじめメタノール4mLおよび水4mLでプレコンディショニングした固相カラム(OASIS HLB,ウォーターズ社製)にアプライし、水3mLで洗った後、メタノール4mLで2回溶出し、TB代謝物を抽出した。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、30%エタノール200μLにより再溶解した後、さらに遠心分離(3,000rpm、4℃、5分)し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
TB代謝物のHPLC-RADによる放射能量(RIMx)測定
操作(1)で得た尿5mLをあらかじめメタノール4mLおよび水4mLでプレコンディショニングした固相カラム(OASIS HLB,ウォーターズ社製)にアプライし、水3mLで洗った後、メタノール4mLで2回溶出し、TB代謝物を抽出した。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、30%エタノール200μLにより再溶解した後、さらに遠心分離(3,000rpm、4℃、5分)し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりHPLC-RADで分析した。
[HPLC-RAD条件]
実施例1と同じ条件で行った。
実施例1と同じ条件で行った。
操作(4)
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(Ixの測定)
操作(1)で得た尿0.02mLに、それぞれ0.02mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(Ixの測定)
操作(1)で得た尿0.02mLに、それぞれ0.02mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
[LC/MS/MS条件]
HPLC:ACQUITY UltraPerformanceLC(ウォーターズ社製)
カラム:ACQUITY UPLC BEH-C18(粒子径:1.7μm、カラムサイズ:2.1mmI.D.×50mm)(ウォーターズ社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→2.5分(40%)→3分(90%)→3.5分(90%)→3.6分(0%)→4分(0%)
流速:0.8mL/分、分析時間:4分、カラム温度:40℃
MS/MS:API4000(アプライドバイオシステムズ社製)
イオン化法:ESI(電子スプレーイオン化法)
イオン極性:Negative
検出モード:MRM(Multiple Reaction Monitoring)
ターボガス温度:650℃
イオンスプレー電圧:4500V
モニターイオン(Q1(MS1)→Q3(MS2))
ヒドロキシトルブタミド(HTB) m/z=285.0→185.7
IS(ヒドロキシトルブタミド-d9)m/z=294.9→185.7
なお、操作(3)で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作(4)で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。
HPLC:ACQUITY UltraPerformanceLC(ウォーターズ社製)
カラム:ACQUITY UPLC BEH-C18(粒子径:1.7μm、カラムサイズ:2.1mmI.D.×50mm)(ウォーターズ社製)
移動相A:0.1%酢酸水溶液
移動相B:アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率(B%):0分(0%)→2.5分(40%)→3分(90%)→3.5分(90%)→3.6分(0%)→4分(0%)
流速:0.8mL/分、分析時間:4分、カラム温度:40℃
MS/MS:API4000(アプライドバイオシステムズ社製)
イオン化法:ESI(電子スプレーイオン化法)
イオン極性:Negative
検出モード:MRM(Multiple Reaction Monitoring)
ターボガス温度:650℃
イオンスプレー電圧:4500V
モニターイオン(Q1(MS1)→Q3(MS2))
ヒドロキシトルブタミド(HTB) m/z=285.0→185.7
IS(ヒドロキシトルブタミド-d9)m/z=294.9→185.7
なお、操作(3)で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作(4)で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。
結果(1)
尿試料のRI/MS比の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB代謝物(HTB)の放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB代謝物(HTB)のピーク面積比(Ix)で除し、TB代謝物(HTB)の補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表20に示した。なお以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(C)と表記する。
尿試料のRI/MS比の算出
HPLC-RADクロマトグラムから得られたTB代謝物(HTB)の放射能量(RIMx)を、対応するLC/MS/MSのTB代謝物(HTB)のピーク面積比(Ix)で除し、TB代謝物(HTB)の補正係数IA1(RI/MS比)を求めた。結果を表20に示した。なお以降、本結果の補正係数IA1(RI/MS比)をRI/MS比(C)と表記する。
〔実施例8〕
補正係数IA1(RI/MS比(C))による血漿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例7で算出した補正係数IA1(RI/MS比(C))からTB代謝物の定量を実施した。
補正係数IA1(RI/MS比(C))による血漿試料の定量
ラットに14C-TBを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のTB代謝物をLC/MS/MSにより分析し、実施例7で算出した補正係数IA1(RI/MS比(C))からTB代謝物の定量を実施した。
操作(1)
14C-TB投与と採血
SD系雄性ラット(各時点n=3:合計15匹)に0.00167mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与1、2、4、8時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。
操作(2)
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIx)
操作(1)で得た血漿0.02mLに、それぞれ0.02mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。
また、ブランク血漿0.02mLに0.02mLのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液(1-30000pg/mL)及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。それぞれ得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
14C-TB投与と採血
SD系雄性ラット(各時点n=3:合計15匹)に0.00167mg/kgの14C-TBを経口投与した。14C-TB投与1、2、4、8時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管(テルモ社製)を用いて血液を採取し、遠心分離(3,000rpm、4℃、15分)して血漿を得た。
操作(2)
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析(UIx)
操作(1)で得た血漿0.02mLに、それぞれ0.02mLメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。
また、ブランク血漿0.02mLに0.02mLのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液(1-30000pg/mL)及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。それぞれ得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
[LC/MS/MS条件]
実施例7と同じ条件で行った。
実施例7と同じ条件で行った。
操作(3)
実施例7の補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果について実施例7の補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いてTB代謝物の定量を行った。ここで、
(TBの放射比活性)=22.9GBq/mmol
(HTBの分子量)=286
として計算した。結果を表21に示した。
実施例7の補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量
本実施例の操作(2)の測定結果について実施例7の補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いてTB代謝物の定量を行った。ここで、
(TBの放射比活性)=22.9GBq/mmol
(HTBの分子量)=286
として計算した。結果を表21に示した。
〔実施例9〕
RI/MS比による定量の妥当性確認(血漿試料)
実施例8で算出した定量値と標準品を用いたLC-MS/MS分析による実定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量の妥当性を確認した。
RI/MS比による定量の妥当性確認(血漿試料)
実施例8で算出した定量値と標準品を用いたLC-MS/MS分析による実定量値を比較し、補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量の妥当性を確認した。
操作(1)
14C-TB投与と採血
実施例8の血漿試料を使用した。
14C-TB投与と採血
実施例8の血漿試料を使用した。
操作(2)
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析
ブランク血漿0.02mLに0.02mLのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液(1-30000pg/mL)及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。血漿試料は実施例8に従って前処理した。
それぞれ得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
TB代謝物のLC/MS/MSによる質量分析
ブランク血漿0.02mLに0.02mLのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液(1-30000pg/mL)及び内標準物質のアセトニトリル溶液(ヒドロキシトルブタミド-d9 20ng/mLを含む)0.06mLを加えて十分攪拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)した。血漿試料は実施例8に従って前処理した。
それぞれ得られた遠心上清をLC/MS/MSで分析した。LC/MS/MS分析条件を以下に示す。
結果(1)
補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量の妥当性確認(血漿試料)
本実施例で標準品により定量されたTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いて算出したTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表22に示した。
補正係数IA1(RI/MS比(C))による定量の妥当性確認(血漿試料)
本実施例で標準品により定量されたTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いて算出したTB代謝物の濃度(Mx)を比較した。結果を表22に示した。
本実施例で標準品により定量されたTB代謝物の濃度と補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いて算出したTB未変化体及びTB代謝物の濃度は、表22の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比(UIx)から測定対象の定量が可能である。
以上より、本発明の補正係数IA1(RI/MS比(C))を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもLC/MS/MSのピーク面積比(UIx)から測定対象の定量が可能である。
本発明の定量分析方法によれば、代謝物の分析において、標準品の無い代謝物や未知の代謝物であっても、構造解析と定量の両方を行うことができ、代謝物の網羅的分析が可能となった。本発明定量分析方法は、MD臨床試験に適用することができ、安全な医薬品開発及び医薬品開発にかかる費用と時間の節約に貢献することが期待できる。
Claims (20)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程1)RI標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程2)工程1)で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程3)工程1)で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程4)工程2)及び3)で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを求める工程
工程5)工程1)のRI標識化合物又は該化合物のRI非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程1)で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程6)工程5)で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程7)工程6)で得た質量分析強度と工程4)で求めた補正係数Iを使用して、工程5)で分離された代謝物の濃度を定量する工程 - 工程5)により分離された代謝物の濃度Mxを、以下の補正係数IA1を用いて下記式(A1)により求める、請求項1に記載の定量分析方法。
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:工程2)により得られる代謝物の放射能量
Ix:工程3)により得られる代謝物の質量分析強度
工程5)により分離された代謝物の濃度Mx=UIx×IA1×R・・・式(A1)
UIx:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量 - 工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1を、以下の補正係数IA2を用いて下記式(A2)により求める、請求項1に記載の定量分析方法。
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:工程3)により得られる代謝物(m)の質量分析強度
Mu:工程3)により得られる未変化体(u)の質量分析強度
Rm:工程2)により得られる代謝物(m)の放射能量
Ru:工程2)により得られる未変化体(u)の放射能量
工程5)により分離された代謝物の濃度Cm1=Mm1×IA2×Ccal・・・式(A2)
Mm1:工程5)により分離された代謝物の質量分析強度
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu) - 質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である請求項1又は2に記載の定量分析方法。
- 工程1)~4)があらかじめ行われて算出された補正係数Iがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりIを引用して、工程5)~7)を行う請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 工程1)の分離がHPLCによるものである請求項1~5のいずれかに記載の方法。
- 工程3)の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がLC/MS又はLC/MSn(液体クロマトグラフ-多段階タンデム質量分析)により行われるものである請求項1~6のいずれかに記載の方法。
- LC/MSnがLC/MS/MS(液体クロマトグラフ-タンデム質量分析)である請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である請求項1~8のいずれかに記載の方法。
- 代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 薬物動態試験がマイクロドーズ試験である請求項10に記載の方法。
- 薬物動態試験が代謝物安全性試験(Safety Testing of Drug Metabolites)である請求項10に記載の方法。
- 工程1)の分離が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる請求項1~12のいずれかに記載の方法。
- 請求項1~13のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
- 生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、請求項1~14のいずれかに記載の方法。
- 以下の手段を含む代謝物の定量装置。
a)生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
b)前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するRI検出手段
c)前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
d)代謝物のイオン化効率に関する補正係数Iを使用して代謝物の濃度を求めるための演算処理手段 - d)の演算処理手段が、Mx=UIx×IA1×Rの数式により代謝物の濃度Mxを求めるものである請求項16に記載の定量装置。
UIx:補正係数IA1を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA1=RIMx/Ix
RIMx:該RI標識化合物の代謝物を含む生物試料をa)の分離手段により分離して得られる代謝物についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ix:RIMxを求める代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
R:RI標識化合物の比放射能量 - d)の演算処理手段が、Cm1=Mm1×IA2×Ccalの数式により代謝物の濃度Cm1を求めるものである請求項16に記載の定量装置。
Mm1:補正係数IA2を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてc)の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数IA2=fm/fu
fm/fu=(Mm/Mu)/(Rm/Ru)
fm/fu:未変化体(u)と代謝物(m)それぞれのイオン化効率の比
Mm:a)の分離手段により分離して得られる代謝物(m)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Mu:a)の分離手段により分離して得られる未変化体(u)についてc)の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Rm:Mmを求める代謝物(m)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ru:Muを求める未変化体(u)についてb)のRI検出手段を用いて測定した放射能量
Ccal:未変化体(u)の検量線より得られる、未変化体濃度(Cu)/未変化体質量分析強度(Mu) - さらにe)補正係数Iを保存しておくライブラリを有する請求項16~18のいずれかに記載の定量装置。
- a)の分離手段が高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である請求項16~19のいずれかに記載の定量装置。
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