JP2013096732A - 分析方法および分析装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】質量分析計を用いた分析方法および分析装置において、薬物と薬物代謝物とが混在する検体中の薬物成分を精度よく測定する。
【解決手段】薬物と、薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、検体における薬物の濃度を分析する分析方法であって、入射電圧を変化させながら、薬物代謝物からの抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング工程Ｓ３０１と、モニタリング工程Ｓ３０１における解離状態に基づいて、入射電圧を選択する選択工程Ｓ３０２と、選択工程Ｓ３０２で選択された入射電圧を検体に印加して、検体における薬物の濃度を測定する濃度測定工程Ｓ３０５と、を含む。
【選択図】図５
【解決手段】薬物と、薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、検体における薬物の濃度を分析する分析方法であって、入射電圧を変化させながら、薬物代謝物からの抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング工程Ｓ３０１と、モニタリング工程Ｓ３０１における解離状態に基づいて、入射電圧を選択する選択工程Ｓ３０２と、選択工程Ｓ３０２で選択された入射電圧を検体に印加して、検体における薬物の濃度を測定する濃度測定工程Ｓ３０５と、を含む。
【選択図】図５
Description
本発明は、質量分析計を用いた分析方法および分析装置に関し、特に、薬物と、薬物が薬物代謝酵素によって代謝された薬物代謝物と、が混在する検体中の薬物成分の分析に用いる分析方法および分析装置に関する。
従来、検体中に存在する薬物成分を分析する技術が知られている。このような検体分析の対象となる薬物の一例として、例えば、ミコフェノール酸（Mycophenolic acid，ＭＰＡ）が挙げられる。ＭＰＡは、細胞の核酸合成を阻害する代謝拮抗薬であるミコフェノール酸モフェチル（Mycophenolate mofetil，ＭＭＦ）が、エステル加水分解酵素によって代謝されたものである。ＭＭＦは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用および免疫抑制作用を有しており、経口吸収されると速やかに活性型のＭＰＡに代謝される。ＭＰＡの９５％以上は、肝臓において、腸肝循環する不活性なミコフェノール酸のグルクロン酸抱合体（Mycophenolic acid glucuronide，ＭＰＡＧ）に代謝される。ＭＰＡからＭＰＡＧへの代謝は、薬物代謝酵素であるＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素によって行われる。より詳細には、薬物代謝酵素であるＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素によって、ＭＰＡに対して抱合体であるグルクロン酸が抱合されることによって、ＭＰＡＧへと代謝される。
臨床現場においては、例えば、血中薬物モニタリング（Therapeutic Drug Monitoring，ＴＤＭ）によって、ＭＰＡの血中濃度の管理が行われている。これは、腎移植におけるＭＰＡの体内動態パラメータ（pharmacokinetics，ＰＫ）と急性拒絶反応の間に優位な関係が認められているためである。
ＭＰＡの定量分析方法としては、抗原抗体反応を用いた免疫学的な方法（例えば、非特許文献１参照）、および、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法（例えば、非特許文献２参照）が知られている。
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法は、検体を高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography，ＨＰＬＣ，ＬＣ)で分離したのち、エレクトロスプレーイオン化法（Electrospray Ionization，ＥＳＩ）でイオン化し、質量分析計（Mass Spectrometer，ＭＳ）に導入して分析を行う分析方法である。
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法は、検体を高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography，ＨＰＬＣ，ＬＣ)で分離したのち、エレクトロスプレーイオン化法（Electrospray Ionization，ＥＳＩ）でイオン化し、質量分析計（Mass Spectrometer，ＭＳ）に導入して分析を行う分析方法である。
さらに近年、多様で不規則な臨床現場のニーズに対応するために、ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法（例えば、特許文献１参照）が用いられている。
ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は、前処理に固相抽出（Solid Phase Extraction，ＳＰＥ）を用いて精製を行ったのち、フローインジェクション分析法（Flow Injection Analysis，ＦＩＡ）で質量分析計（ＭＳ）に導入して分析を行う分析方法である。ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は、自動化装置によって自動化されており、多数の検体を同時並列処理することによってスループットの高速化を実現している。
ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は、前処理に固相抽出（Solid Phase Extraction，ＳＰＥ）を用いて精製を行ったのち、フローインジェクション分析法（Flow Injection Analysis，ＦＩＡ）で質量分析計（ＭＳ）に導入して分析を行う分析方法である。ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は、自動化装置によって自動化されており、多数の検体を同時並列処理することによってスループットの高速化を実現している。
Oellerich M.、他、「Pharmacokinetic and Metabolic Investigations of Mycophenolic Acid in Pediatric Patients After Renal Transplantation: Implications for Therapeutic Drug Monitoring.」、Ther. Drug. Monit. 、（米国）、２０００年、第２２巻、第１号、ｐ２０−２６
R. DiFrancesco 、他、「Simultaneous determination of corisol, dexamethasone, methylprednisolone, prednisone, prednisolone, mycophenolic acid and mycophenolic acid glucuronide in human plasma utilizing liquid chromatography-tandem mass spectrometry」、J. Chromatogr. B 、（オランダ）、２００７年、第８５９巻、第１号、ｐ．４２−５１
Z.Yan、他、「Cone voltage induced in-source dissociation of glucuronides in electrospray and implications in biological analyses」、Rapid Commun. Mass Spectrom. 、（英国）、２００３年、第１７巻、第１３号、ｐ．１４３３−１４４２
一般に、分析対象の検体中には、薬物と、薬物が薬物代謝酵素によって代謝された薬物代謝物と、が混在する。即ち、ＭＭＦが投与された患者の検体中には、薬物としてのＭＰＡと、ＭＰＡが代謝された薬物代謝物としてのＭＰＡＧと、が存在する。
特許文献１に記載のＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法で検体中のＭＰＡの測定を行った場合、ＭＰＡと、その代謝物であるＭＰＡＧと、が同時に質量分析計に導入されることになる。また、質量分析計において、イオン化部（大気圧状態）から質量分析部（真空状態）へと検体を導入するために印加する入射電圧によって、ＭＰＡＧからグルクロン酸が解離してＭＰＡが生成される。このため、質量分析部の検出器に到達するＭＰＡは、「本来の検体中に存在するＭＰＡ」と、「入射電圧によってＭＰＡＧから生成されたＭＰＡ」と、が混在することになる。このため、特許文献１に記載の方法では、ＭＰＡの定量精度および信頼性が低いという問題点がある。
特許文献１に記載のＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法で検体中のＭＰＡの測定を行った場合、ＭＰＡと、その代謝物であるＭＰＡＧと、が同時に質量分析計に導入されることになる。また、質量分析計において、イオン化部（大気圧状態）から質量分析部（真空状態）へと検体を導入するために印加する入射電圧によって、ＭＰＡＧからグルクロン酸が解離してＭＰＡが生成される。このため、質量分析部の検出器に到達するＭＰＡは、「本来の検体中に存在するＭＰＡ」と、「入射電圧によってＭＰＡＧから生成されたＭＰＡ」と、が混在することになる。このため、特許文献１に記載の方法では、ＭＰＡの定量精度および信頼性が低いという問題点がある。
非特許文献３には、質量分析部への導入の際に生じるＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離の度合いは、入射電圧によって変動することが記載されており、入射電圧の値を適宜選択することによってＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離を抑え、検体中に本来存在するＭＰＡの定量を可能としている。しかしながら、選択した入射電圧の値によっては、本来の検体中に存在するＭＰＡの質量分析部への導入効率が低下する可能性がある。前記のようにＭＰＡの質量分析部への導入効率が低下したとしても、検体中の濃度がμｇ／ｍＬオーダのタンパク質結合型ＭＰＡを分析する場合には影響はない。一方、検体中の濃度がｎｇ／ｍＬオーダの遊離型ＭＰＡを分析する場合には、前記の理由によりＭＰＡの質量分析部への導入効率が低下すると、イオン強度が足りず、必要な検出限界値が得られないという問題点がある。
また、質量分析計の使用に伴って、質量分析部の導入部分に設けられているカーテンプレートが検体によって汚染される。この汚染度合いによって、入射電圧が一定であっても、ＭＰＡＧに加えられるエネルギ量は変動し、ＭＰＡＧからグルクロン酸が解離する度合いも変動する。このため、初期に設定した一定の入射電圧の設定値で分析を続けると、ＭＰＡの定量精度および信頼性が低くなってしまうという問題点がある。
非特許文献２に記載のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法では、原理的にＭＰＡ、ＭＰＡＧおよび内部標準物質が分離されるので、これらが同時に質量分析部に導入されることはない。また、質量分析部への導入時にＭＰＡＧからグルクロン酸が解離してＭＰＡが生成されたとしても、本来のＭＰＡとは見分けがつき、ＭＰＡの定量に支障をきたすことはない。しかしながら、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法は、クロマトグラフィによる分離操作を必要とするために煩雑であり、スループットが低い。また、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ法では、一度に多くの検体を分析することができないという問題点がある。
非特許文献１に記載の抗原抗体反応を用いた免疫学的な方法では、原理的に薬物代謝物（例えば、ミコフェノール酸アシルグルクロン酸抱合体（ＭＰＡ−ＡｃｙｌＧ））との交差反応によってＭＰＡの定量値が高値を示すという問題点がある。
そこで、本発明は、前記した従来技術による問題点を鑑みてなされたものであり、質量分析計を用いた分析方法および分析装置において、薬物と薬物代謝物とが混在する検体中の薬物成分を精度よく測定する分析方法および分析装置を提供することを目的とする。
このような課題を解決するために、本発明は、薬物と、前記薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、前記検体における前記薬物の濃度を分析する分析方法であって、前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング工程と、前記モニタリング工程における解離状態に基づいて、前記入射電圧を選択する選択工程と、前記選択工程で選択された前記入射電圧を前記検体に印加して、前記検体における前記薬物の濃度を測定する濃度測定工程と、を含むことを特徴する分析方法である。
また、本発明は、薬物と、前記薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、前記検体における前記薬物の濃度を分析する分析装置であって、前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング手段と、前記モニタリング手段によってモニタリングされた解離状態に基づいて、前記入射電圧を選択する選択手段と、前記選択手段で選択された前記入射電圧を前記検体に印加して、前記検体における前記薬物の濃度を測定する検体測定手段と、を備えることを特徴する分析装置である。
本発明によれば、質量分析計を用いた分析方法および分析装置において、薬物と薬物代謝物とが混在する検体中の薬物成分を精度よく測定する分析方法および分析装置を提供することができる。
以下、本発明を実施するための形態（以下「実施形態」という）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。なお、各図において、共通する部分には同一の符号を付し重複した説明を省略する。なお、本実施形態は、本発明の適用形態の一例を示したものであって、本発明の利用はこれに限定されるものではない。
本実施形態では、検体中の薬物を定量する方法の一例であるＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いた分析装置１００について説明する。ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は、前処理に固相抽出（ＳＰＥ）を用いて検体の精製を行ったのち、フローインジェクション分析法（ＦＩＡ）で精製した前処理検体を質量分析計（ＭＳ）に導入し、定量を行う方法である。ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いることによって、多様で不規則な臨床現場のニーズに臨機応変に対応することができる。また、ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法は自動化されており、多数の検体を同時並列処理することでスループットの高速化を実現している。
本実施形態では、検体中の分析対象となる薬物としてＭＰＡ、ＭＰＡが代謝された薬物代謝物としてＭＰＡＧ、ＭＰＡの代謝酵素（薬物代謝酵素）としてＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素を例にし、ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いてＭＰＡの正確な定量を行うための方法について記載する。なお、本実施形態に示す方法は、ＭＰＡに限らず、薬物代謝酵素によって代謝された薬物代謝物の存在下で、検体中の薬物を測定する場合も適応可能である。薬物代謝酵素としては、前記ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素の他、例えば、シトクロムＰ４５０、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなどの酸化還元酵素、ＵＤＰ−スルホン酸転移酵素、糖転移酵素、グルタチオンレダクターゼなどの抱合酵素あるいは加水分解酵素などがある。
≪分析装置１００の構成≫
図１は、本実施形態に係るＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いた分析装置１００の構成を示す斜視図である。
分析装置１００は、検体搬送機構１０１、試薬保管部１０２、固相抽出カートリッジディスク１０３、試薬プローブ１０４、検体プローブ１０５、固相抽出カートリッジ保管部１０６、固相抽出カートリッジプローブ１０７、前処理検体プローブ１０８、圧力負荷部１０９、イオン化部１１０、質量分析部１１１および制御部１１２を備えている。
図１は、本実施形態に係るＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いた分析装置１００の構成を示す斜視図である。
分析装置１００は、検体搬送機構１０１、試薬保管部１０２、固相抽出カートリッジディスク１０３、試薬プローブ１０４、検体プローブ１０５、固相抽出カートリッジ保管部１０６、固相抽出カートリッジプローブ１０７、前処理検体プローブ１０８、圧力負荷部１０９、イオン化部１１０、質量分析部１１１および制御部１１２を備えている。
検体搬送機構１０１は、分析対象となる検体を検体プローブ１０５の稼働範囲まで搬送する。試薬保管部１０２は、分析に必要な各種試薬を保管する。固相抽出カートリッジディスク１０３は、検体から特定の成分を精製する固相抽出材（例えば、逆相固相抽出材である日立ハイテクノロジーズ社製「ＮＯＢＩＡＳ ＲＰ−ＳＧ１」）が充填された固相抽出カートリッジを保持し、無限軌道上で搬送する。試薬プローブ１０４は、試薬保管部１０２に保管された試薬を固相抽出カートリッジに吸引・吐出する。検体プローブ１０５は、検体搬送機構１０１で移送されてきた検体を固相抽出カートリッジディスク１０３に保持された固相抽出カートリッジに吸引・吐出する。固相抽出カートリッジ保管部１０６は、分析に用いる空の固相抽出カートリッジを保管する。固相抽出カートリッジプローブ１０７は、固相抽出カートリッジ保管部１０６に保管されている空の固相抽出カートリッジを、固相抽出カートリッジディスク１０３に移送する。
前処理検体プローブ１０８は、固相抽出カートリッジで精製した前処理溶液を吸引・吐出して、イオン化部１１０に導入する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジディスク１０３に保持された固相抽出カートリッジに空気圧力を負荷する。イオン化部１１０は、導入された前処理溶液をイオン化する。質量分析部１１１は、イオン化部１１０でイオン化された薬物を分析する。制御部１１２は、装置各部の動作を制御し、かつモニタ機能および記憶機能を有する。
なお、固相抽出カートリッジディスク１０３の上方部は、無限軌道上に複数の固相抽出カートリッジを収容するディスクが備えられている。また、固相抽出カートリッジディスク１０３の下方部には、無限軌道上に複数の受容器を収容できるディスクを備えている。この上下２対からなるディスクは、同形状である必要はなく、回転軸も同位置でなくてもよい。固相抽出カートリッジディスク１０３の２つのディスクは、上方向からみると交差する構成になっているので、受容器へ前処理検体プローブ１０８がアクセスする際に上方のディスクが干渉することがない構成になっている。
また、試薬保管部１０２には、メタノール（和光純薬工業株式会社製 ＃１３８−１４５２１）、蒸留水（和光純薬工業株式会社製 ＃０４６−１６９７１）、ＭＰＡの内部標準物質としてＭＰＡ−ｄ３（Mycophenolic acid-d3）（Toronto Research Chemicals Inc製 ＃Ｍ８３１５０２）、および後述する各種薬物が保管されている。ＭＰＡ−ｄ３は、メタノールで希釈することで２０００ｎｇ／ｍＬに調製されている。
≪分析装置１００による分析処理≫
次に、分析装置１００による分析処理の手順について、図２を用いて説明する。
図２は、本実施形態に係る分析装置１００による分析処理の手順を示すフローチャートである。
分析装置１００による分析処理は、検体搬送工程Ｓ２０１、検体前処理工程Ｓ２０２、前処理検体搬送工程Ｓ２０３、イオン化工程Ｓ２０４、質量分析工程Ｓ２０５からなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。以下、各工程の詳細な手順について説明する。
次に、分析装置１００による分析処理の手順について、図２を用いて説明する。
図２は、本実施形態に係る分析装置１００による分析処理の手順を示すフローチャートである。
分析装置１００による分析処理は、検体搬送工程Ｓ２０１、検体前処理工程Ｓ２０２、前処理検体搬送工程Ｓ２０３、イオン化工程Ｓ２０４、質量分析工程Ｓ２０５からなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。以下、各工程の詳細な手順について説明する。
＜検体搬送工程Ｓ２０１＞
検体搬送工程Ｓ２０１では、検体搬送機構１０１で移送されてきた検体を、検体プローブ１０５の駆動範囲まで移動させる。検体としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液および細胞組織などの生体由来サンプルを用いる。
検体搬送工程Ｓ２０１では、検体搬送機構１０１で移送されてきた検体を、検体プローブ１０５の駆動範囲まで移動させる。検体としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液および細胞組織などの生体由来サンプルを用いる。
＜検体前処理工程Ｓ２０２＞
検体前処理工程Ｓ２０２では、固相抽出カートリッジディスク１０３上で検体の前処理を行う。検体前処理工程Ｓ２０２は、固相抽出カートリッジ搬送工程Ｓ２０２１、コンディショニング工程Ｓ２０２２、平衡化工程Ｓ２０２３、検体添加工程Ｓ２０２４、洗浄工程Ｓ２０２５、溶出工程Ｓ２０２６からなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。
検体前処理工程Ｓ２０２では、固相抽出カートリッジディスク１０３上で検体の前処理を行う。検体前処理工程Ｓ２０２は、固相抽出カートリッジ搬送工程Ｓ２０２１、コンディショニング工程Ｓ２０２２、平衡化工程Ｓ２０２３、検体添加工程Ｓ２０２４、洗浄工程Ｓ２０２５、溶出工程Ｓ２０２６からなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。
＜固相抽出カートリッジ搬送工程Ｓ２０２１＞
固相抽出カートリッジ保管部１０６に保管されている空の固相抽出カートリッジを、固相抽出カートリッジプローブ１０７によって固相抽出カートリッジディスク１０３に移送する。
固相抽出カートリッジ保管部１０６に保管されている空の固相抽出カートリッジを、固相抽出カートリッジプローブ１０７によって固相抽出カートリッジディスク１０３に移送する。
＜コンディショニング工程Ｓ２０２２＞
まず、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲に搬送する。次に、試薬プローブ１０４が試薬保管部１０２に保管されたメタノール２００μＬを吸引し、固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
まず、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲に搬送する。次に、試薬プローブ１０４が試薬保管部１０２に保管されたメタノール２００μＬを吸引し、固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
ここで、圧力負荷部１０９の構成について図３を用いて説明する。
図３は、本実施形態に係る分析装置１００の圧力負荷部１０９の構成を模式的に示す説明図である。
圧力負荷部１０９は、気体の吸引および加圧を行うシリンジポンプ１０９２、シリンジポンプ１０９２に吸引する気体中の夾雑物を取り除くエアフィルタ１０９５、加圧された気体を固相抽出カートリッジ１０９１に送り込む接合部１０９７、シリンジポンプ１０９２・エアフィルタ１０９５・接合部１０９７間の流路の切り換えを制御する３方電磁弁１０９６、３方電磁弁１０９６と接合部１０９７との間に位置して接合部１０９７へ送り込まれる気体の流量を計測する流量計１０９３、および３方電磁弁１０９６と接合部１０９７との間に位置して接合部１０９７へ送り込まれる気体の圧力を計測する圧力計１０９４によって構成される。
図３は、本実施形態に係る分析装置１００の圧力負荷部１０９の構成を模式的に示す説明図である。
圧力負荷部１０９は、気体の吸引および加圧を行うシリンジポンプ１０９２、シリンジポンプ１０９２に吸引する気体中の夾雑物を取り除くエアフィルタ１０９５、加圧された気体を固相抽出カートリッジ１０９１に送り込む接合部１０９７、シリンジポンプ１０９２・エアフィルタ１０９５・接合部１０９７間の流路の切り換えを制御する３方電磁弁１０９６、３方電磁弁１０９６と接合部１０９７との間に位置して接合部１０９７へ送り込まれる気体の流量を計測する流量計１０９３、および３方電磁弁１０９６と接合部１０９７との間に位置して接合部１０９７へ送り込まれる気体の圧力を計測する圧力計１０９４によって構成される。
圧力負荷部１０９の動作としては、まず、シリンジポンプ１０９２とエアフィルタ１０９５側の３方電磁弁１０９６が開き、接合部１０９７側の３方電磁弁１０９６が閉じた状態でシリンジポンプ１０９２を印圧方向に吸引する。次に、シリンジポンプ１０９２と接合部１０９７側の３方電磁弁１０９６が開き、エアフィルタ１０９５側の３方電磁弁１０９６が閉じた状態でシリンジポンプ１０９２を加圧することによって、接合部１０９７へ気体が押し出され、固相抽出カートリッジ１０９１の加圧が行われる。
図２の説明に戻り、平衡化工程Ｓ２０２３について説明する。
＜平衡化工程Ｓ２０２３＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。次に、試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管された蒸留水２００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
＜平衡化工程Ｓ２０２３＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。次に、試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管された蒸留水２００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
＜検体添加工程Ｓ２０２４＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを検体プローブ１０５の駆動範囲まで搬送する。次に、検体プローブ１０５を用いて、検体搬送機構１０１に保管された検体１００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管されたＭＰＡ−ｄ３ ５μＬを固相抽出カートリッジに添加する。そして、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを検体プローブ１０５の駆動範囲まで搬送する。次に、検体プローブ１０５を用いて、検体搬送機構１０１に保管された検体１００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。つづいて、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管されたＭＰＡ−ｄ３ ５μＬを固相抽出カートリッジに添加する。そして、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
＜洗浄工程Ｓ２０２５＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管された蒸留水２００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。次に、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管された蒸留水２００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。次に、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
＜溶出工程Ｓ２０２６＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管されたメタノール１００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。次に、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧によって固相抽出カートリッジを上方から下方に通液したメタノール溶出液は、前処理検体として固相抽出カートリッジディスク１０３の下方部のディスクに収容されている受容器で受けられる。
以上のような工程により、検体の前処理が完了する。
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管されたメタノール１００μＬを固相抽出カートリッジに添加する。次に、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧によって固相抽出カートリッジを上方から下方に通液したメタノール溶出液は、前処理検体として固相抽出カートリッジディスク１０３の下方部のディスクに収容されている受容器で受けられる。
以上のような工程により、検体の前処理が完了する。
＜前処理検体搬送工程Ｓ２０３＞
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、受容器に収容された前処理検体を前処理検体プローブ１０８の駆動範囲まで搬送する。前処理検体プローブ１０８は、前処理検体１０μＬを吸引してイオン化部１１０へ導入する。
固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、受容器に収容された前処理検体を前処理検体プローブ１０８の駆動範囲まで搬送する。前処理検体プローブ１０８は、前処理検体１０μＬを吸引してイオン化部１１０へ導入する。
＜イオン化工程Ｓ２０４および質量分析工程Ｓ２０５＞
イオン化工程Ｓ２０４においては、イオン化部１１０で前処理検体中の成分をイオン化し、質量分析部１１１に前処理検体のイオンを導入する。質量分析工程Ｓ２０５においては、質量分析部１１１において前処理検体中のＭＰＡ濃度を分析する。
イオン化工程Ｓ２０４においては、イオン化部１１０で前処理検体中の成分をイオン化し、質量分析部１１１に前処理検体のイオンを導入する。質量分析工程Ｓ２０５においては、質量分析部１１１において前処理検体中のＭＰＡ濃度を分析する。
図４は、本実施形態に係る分析装置１００のイオン化部１１０および質量分析部１１１の構成を模式的に示す説明図である。
質量分析部１１１は、スキマー１１１１、前段の四重極質量分析計１１１２、衝突室１１１３、後段の四重極質量分析計１１１４およびイオン検出器１１１５によって構成される。質量分析部１１１は、三連四重極型質量分析計を用いており、分析モードはＳＲＭ（Selected Reaction Monitoring）が用いられる。ＳＲＭでは、イオン化部１１０で検体をイオン化して、特定の質量対電荷比（質量／電荷比、ｍ／ｚ）のイオン種を前段の四重極質量分析計１１１２で親イオンとして選択し、この親イオンを衝突室１１１３で解裂させて解裂イオンを生成し、特定の質量対電荷比（質量／電荷比、ｍ／ｚ）の解裂イオンを後段の四重極質量分析計１１１４でプロダクトイオンとして選択し、イオン検出器１１１５で検出する。
なお、極質量分析計としては、四重極型質量分析計の他、イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計およびフーリエ変換イオンサイクロン共鳴型質量分析計や、それらを２段に組合せＭＳ／ＭＳを行う質量分析計を用いてもよい。
質量分析部１１１は、スキマー１１１１、前段の四重極質量分析計１１１２、衝突室１１１３、後段の四重極質量分析計１１１４およびイオン検出器１１１５によって構成される。質量分析部１１１は、三連四重極型質量分析計を用いており、分析モードはＳＲＭ（Selected Reaction Monitoring）が用いられる。ＳＲＭでは、イオン化部１１０で検体をイオン化して、特定の質量対電荷比（質量／電荷比、ｍ／ｚ）のイオン種を前段の四重極質量分析計１１１２で親イオンとして選択し、この親イオンを衝突室１１１３で解裂させて解裂イオンを生成し、特定の質量対電荷比（質量／電荷比、ｍ／ｚ）の解裂イオンを後段の四重極質量分析計１１１４でプロダクトイオンとして選択し、イオン検出器１１１５で検出する。
なお、極質量分析計としては、四重極型質量分析計の他、イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計およびフーリエ変換イオンサイクロン共鳴型質量分析計や、それらを２段に組合せＭＳ／ＭＳを行う質量分析計を用いてもよい。
≪質量分析部１１１における定量≫
次に、質量分析部１１１におけるＭＰＡの定量方法について説明する。通常、ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いた場合には、患者検体中のＭＰＡとＭＰＡＧが同時に質量分析部１１１に導入される。ここで、イオン化部１１０（大気圧状態）から質量分析部１１１（真空状態）へ導入する際に、検体に対して入射電圧（Declistering Potential，ＤＰ）が印加される。この入射電圧ＤＰのエネルギによって、ＭＰＡＧからグルクロン酸が解離して二次的にＭＰＡが生成される。このため、ＭＰＡＧから生成したＭＰＡ（解離ＭＰＡ）と患者検体中に本来から存在するＭＰＡとが混在した状態で、質量分析部１１１の検出器に検体が到達することになる。この状態で定量を行うと、定量の精度および信頼性が低くなってしまう。
次に、質量分析部１１１におけるＭＰＡの定量方法について説明する。通常、ＳＰＥ／ＦＩＡ−ＭＳ法を用いた場合には、患者検体中のＭＰＡとＭＰＡＧが同時に質量分析部１１１に導入される。ここで、イオン化部１１０（大気圧状態）から質量分析部１１１（真空状態）へ導入する際に、検体に対して入射電圧（Declistering Potential，ＤＰ）が印加される。この入射電圧ＤＰのエネルギによって、ＭＰＡＧからグルクロン酸が解離して二次的にＭＰＡが生成される。このため、ＭＰＡＧから生成したＭＰＡ（解離ＭＰＡ）と患者検体中に本来から存在するＭＰＡとが混在した状態で、質量分析部１１１の検出器に検体が到達することになる。この状態で定量を行うと、定量の精度および信頼性が低くなってしまう。
また、質量分析部１１１への導入部分にはカーテンプレートが設けられているが、このカーテンプレートの汚染度合いによって、一定の入射電圧ＤＰであってもＭＰＡＧに加わるエネルギ量は変動し、ＭＰＡＧから解離するグルクロン酸の比率も変動する。このため、初期に設定した一定の入射電圧ＤＰの設定値で分析を続けると、ＭＰＡの定量の精度および信頼性が低くなってしまう。
このため、本実施形態に係る分析装置１００では、図５に示すような処理によって質量分析部１１１への導入時における入射電圧ＤＰを調整して、ＭＰＡの定量精度を向上させている。なお、図５に示す入射電圧調整処理は、例えば、ユーザが設定した所定の時間間隔で自動的に行ってもよいし、カーテンプレートの洗浄を行った後に自動的に行ってもよい。また、ユーザがカーテンプレートの汚染度合いを目視して必要に応じて手動で入射電圧調整処理を開始させてもよい。
図５は、本実施形態に係る分析装置１００による入射電圧調整処理の手順を示すフローチャートである。
分析装置１００による入射電圧調整処理は、モニタリング工程Ｓ３０１、入射電圧選択工程Ｓ３０２、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３、評価工程Ｓ３０４、検体ＭＰＡ濃度測定工程Ｓ３０５からからなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。以下、各工程の詳細な手順について説明する。
分析装置１００による入射電圧調整処理は、モニタリング工程Ｓ３０１、入射電圧選択工程Ｓ３０２、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３、評価工程Ｓ３０４、検体ＭＰＡ濃度測定工程Ｓ３０５からからなり、分析装置１００は、前記した順番で各工程を行う。以下、各工程の詳細な手順について説明する。
＜モニタリング工程Ｓ３０１＞
まず、分析装置１００は、入射電圧ＤＰを連続的に変化させながらＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離度合い（グルクロン酸の解離率）をモニタリングする。本実施形態では、ＭＰＡを分析対象とする。即ち、モニタリング対象物質（ＭＰＡＧ）中のＭＰＡ量が増加すれば、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が上昇し、ＭＰＡ量が減少すれば、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が低下していることがわかる。
まず、分析装置１００は、入射電圧ＤＰを連続的に変化させながらＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離度合い（グルクロン酸の解離率）をモニタリングする。本実施形態では、ＭＰＡを分析対象とする。即ち、モニタリング対象物質（ＭＰＡＧ）中のＭＰＡ量が増加すれば、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が上昇し、ＭＰＡ量が減少すれば、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が低下していることがわかる。
標準物質としては、ＭＰＡＧ（Mycophenolic acid β-D-Glucuronide）（Toronto Research Chemicals Inc製 ＃Ｍ８３１５２２）のメタノール溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ）を用いる。ＭＰＡＧのメタノール溶液は、試薬保管部１０２に保管されている。分析装置１００は、試薬保管部１０２を回転させて、前処理検体プローブ１０８の駆動範囲に搬送し、前処理検体プローブ１０８がＭＰＡＧのメタノール溶液１００μＬを吸引して、イオン化部１１０に移送する。
イオン化部１１０は、ＭＰＡＧメタノール溶液をイオン化して質量分析部１１１にイオンを導入する。このとき、入射電圧ＤＰを、−４０Ｖから０Ｖまで１Ｖ間隔で１００ｍｓｅｃごとに変化させながら分析を行う。そして、入射電圧ＤＰの変化とＭＰＡイオン量との相関を用いて、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率をモニタリングする。
表１は、ＭＰＡを分析対象としたモニタリング時のＭＳ分析条件パラメータの一例を示す表である。表１に示すような分析条件パラメータは、後述する制御部１１２の内部データベース１１２５（図６参照）に格納されている。表１に示した例では、ＭＰＡ（分子量（Molecular Weight，ＭＷ）：３２０．３）について、分析モード：ＳＲＭ、トランジッション：ＭＰＡのＱ１／Ｑ３（Ｑ１：前段の四重極質量分析計１１１２で選択する親イオンの質量対電荷比、Ｑ３：後段の四重極質量分析計１１１４で選択するプロダクトイオンの質量対電荷比）３１９．３／１９１．３、ＥＰ（Entrance Potential）：−５Ｖ、ＣＥ（Collision Energy）：−５０Ｖ、ＣＸＰ（Collision Cell Exit Potential）：０Ｖ、ＣＵＲ（Curtain Gas）：１０Ｌ／ｍｉｎ、ＣＡＤ（Collision Gas）：３Ｌ／ｍｉｎ、ＩＳ（IonSpray Voltage）：−４５００Ｖ、ＴＥＭ（Temperature）：６００℃、ＧＳ１（Nebulizer Gas）：３０Ｌ／ｍｉｎ、ＧＳ２（Turbo Gas）：３０Ｌ／ｍｉｎに設定されている。
このように測定されたＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率は、制御部１１２によって処理される。
図６は、本実施形態に係る分析装置１００の制御部１１２の構成を模式的に示す説明図である。制御部１１２は、ユーザ入力部１１２１、コントロール部１１２０を構成する分析制御部１１２２およびデータ照合部１１２３、分析データ記憶部１１２４、内部データベース１１２５、装置インターフェース１１２６、データ処理部１１２７を備えている。制御部１１２は、装置インターフェース１１２６を介して、分析装置１００の他の構成部と接続されている。
図６は、本実施形態に係る分析装置１００の制御部１１２の構成を模式的に示す説明図である。制御部１１２は、ユーザ入力部１１２１、コントロール部１１２０を構成する分析制御部１１２２およびデータ照合部１１２３、分析データ記憶部１１２４、内部データベース１１２５、装置インターフェース１１２６、データ処理部１１２７を備えている。制御部１１２は、装置インターフェース１１２６を介して、分析装置１００の他の構成部と接続されている。
分析データ記憶部１１２４には、質量分析部１１１で取得された各成分イオンの質量対電荷比ｍ／ｚおよびイオン種の強度などの情報が自動格納される。分析データ記憶部１１２４に格納された各イオン種の質量対電荷比ｍ／ｚおよび強度は、分析制御部１１２２によって読み出され、データ処理部１１２７によってこれらのデータを互いに関連付けするデータ処理が行われる。図５のモニタリング工程Ｓ３０１で取得された各入射電圧ＤＰおよびＭＰＡイオンのスペクトルデータ（ピーク面積）についても、分析データ記憶部１１２４に自動的に格納され、データ処理部１１２７によって相関関係を取るデータ処理が行われる。
＜入射電圧選択工程Ｓ３０２＞
図４の説明に戻り、次に、分析装置１００は、制御部１１２のデータ処理部１１２７によって、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が低い最適な入射電圧ＤＰの値を選択する。具体的には、分析装置１００は、モニタリング工程Ｓ３０１で取得した入射電圧ＤＰとＭＰＡイオンのピーク面積の相関データを用いて、ＭＰＡのピーク面積が最小になる入射電圧ＤＰの値を選択する。
図４の説明に戻り、次に、分析装置１００は、制御部１１２のデータ処理部１１２７によって、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率が低い最適な入射電圧ＤＰの値を選択する。具体的には、分析装置１００は、モニタリング工程Ｓ３０１で取得した入射電圧ＤＰとＭＰＡイオンのピーク面積の相関データを用いて、ＭＰＡのピーク面積が最小になる入射電圧ＤＰの値を選択する。
図７は、入射電圧とＭＰＡイオンのピーク面積の相関データの一例を示すグラフである。図７のグラフにおいて、縦軸はＭＰＡイオンのピーク面積、横軸は入射電圧ＤＰを示す。なお、モニタリング工程Ｓ３０１では入射電圧ＤＰを−４０Ｖから０Ｖの範囲で測定を行っているが、参考のため図７にはこの範囲以外のデータについても示している。ＭＰＡイオンのピーク面積値は、入射電圧ＤＰが−５０Ｖで最大、入射電圧ＤＰが−５Ｖで最小となっている。即ち、入射電圧ＤＰを−５Ｖと選択することによって、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率を最小とすることができる。即ち、入射電圧ＤＰによってＭＰＡＧから生成されたＭＰＡを最小とすることができる。
なお、図７には、入射電圧ＤＰが−１００Ｖ付近にもＭＰＡイオンのピーク面積が小さくなる点が出現している。しかしながら、−１００Ｖのような高い電位差を印加すると、質量分析部１１１への導入効率が低下する。このため、本実施形態では、質量分析部１１１への導入効率を考慮して、入射電圧ＤＰの測定範囲を０Ｖに近い範囲（−４０Ｖ〜０Ｖ）に設定し、その範囲内におけるＭＰＡイオンのピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの値を選択するようになっている。
データ処理部１１２７によって選択された入射電圧ＤＰの値（図示の例では−５Ｖ）は、コントロール部１１２０を介して、内部データベース１１２５に格納されている分析条件パラメータの入射電圧ＤＰの値を書き換える。なお、本実施形態では、内部データベース１１２５に格納されている分析条件パラメータの値を自動的に書き換えるものとしたが、モニタリング工程Ｓ３０１で得られた入射電圧ＤＰとＭＰＡイオンのピーク面積の相関データをユーザが目視で確認した後、入射電圧ＤＰの値を手動で書き換えてもよい。また、コントロール部１１２０のデータ照合部１１２３によって、選択した入射電圧ＤＰの値をユーザ入力部１１２１を介してユーザに示し、この入射電圧ＤＰでの分析を行うか否かの指定を促すようにしてもよい。
図８は、入射電圧とＭＰＡイオンのピーク面積の相関データの他の例を示すグラフである。前記したように、質量分析部１１１導入部分のカーテンプレートが汚染度合いによってＭＰＡＧからグルクロン酸が解離する度合いが変動し、最適な入射電圧ＤＰの値（ＭＰＡイオンのピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰ）も変動する。図８は、図７に示したグラフと異なる日時において同様の条件で測定したデータである。図８に示す相関データでは、入射電圧ＤＰが−６０Ｖで最大のピーク面積値、入射電圧ＤＰが−１５Ｖで最小のピーク面積値を示している。この場合、入射電圧ＤＰを−１５Ｖと選択することによって、ＭＰＡＧからのグルクロン酸の解離率を最小とすることができる。即ち、入射電圧ＤＰによってＭＰＡＧから生成されたＭＰＡを最小とすることができる。このように、測定日時によって最適な入射電圧ＤＰの値は変動することがわかる。
なお、このような相関データの変化は、カーテンプレートの汚染度合いによって入射電圧ＤＰが一定であってもＭＰＡＧに加えられるエネルギ量は変動しＭＰＡＧからグルクロン酸が解離する度合いも変動することに起因する。即ち、カーテンプレートの汚染度合いが進行することにより、ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰが減少する（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの絶対値が大きくなる）方向にシフトする。
このため、この変化を、質量分析部１１１のカーテンプレートの洗浄を行うタイミングを規定するために用いてもよい。具体的には、例えば、測定された相関データの値（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰ）と、洗浄直後における相関データの値（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰ）とが所定の割合ずれた場合には、カーテンプレートの洗浄を行うようにする。これにより、適切なタイミングでカーテンプレートの洗浄を行うことができる。
または、ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの値が所定値以下となる（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの値の絶対値が所定値以上となる）場合には、カーテンプレートの洗浄を行うようにしてもよい。入射電圧ＤＰの値の絶対値が大きくなると、即ち、高い電位差を印加すると、質量分析部１１１への導入効率が低下するためである。
このため、この変化を、質量分析部１１１のカーテンプレートの洗浄を行うタイミングを規定するために用いてもよい。具体的には、例えば、測定された相関データの値（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰ）と、洗浄直後における相関データの値（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰ）とが所定の割合ずれた場合には、カーテンプレートの洗浄を行うようにする。これにより、適切なタイミングでカーテンプレートの洗浄を行うことができる。
または、ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの値が所定値以下となる（ピーク面積が最小となる入射電圧ＤＰの値の絶対値が所定値以上となる）場合には、カーテンプレートの洗浄を行うようにしてもよい。入射電圧ＤＰの値の絶対値が大きくなると、即ち、高い電位差を印加すると、質量分析部１１１への導入効率が低下するためである。
＜キャリブレータ測定工程Ｓ３０３＞
図４の説明に戻り、つづいて、分析装置１００は、入射電圧選択工程Ｓ３０２で選択した入射電圧ＤＰの値を用いて、ＭＰＡのキャリブレータを測定する。質量分析での定量分析では、一般的に、同位体標識法を用いることによって相対定量解析を行うことができる。定量分析の手順は、まず、いくつかの既知濃度の標準物質、および一定の既知濃度の同位体標識を施した標準物質を混合して分析する。次に、標準物質および同位体標識を施した標準物質由来のイオンの質量対電荷比ｍ／ｚに対して、イオン強度の時間変化（マススペクトグラム）を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。そして標準物質の濃度、および標準物質と同位体標識を施した標準物質のピーク面積の比との関係から、検量線を作成する。つづいて、濃度が不明の標準物質を含む検体に、既知濃度の同位体標識を施した標準物質を添加した後に分析し、マスクロマトグラムのピーク面積比を求める。
図４の説明に戻り、つづいて、分析装置１００は、入射電圧選択工程Ｓ３０２で選択した入射電圧ＤＰの値を用いて、ＭＰＡのキャリブレータを測定する。質量分析での定量分析では、一般的に、同位体標識法を用いることによって相対定量解析を行うことができる。定量分析の手順は、まず、いくつかの既知濃度の標準物質、および一定の既知濃度の同位体標識を施した標準物質を混合して分析する。次に、標準物質および同位体標識を施した標準物質由来のイオンの質量対電荷比ｍ／ｚに対して、イオン強度の時間変化（マススペクトグラム）を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。そして標準物質の濃度、および標準物質と同位体標識を施した標準物質のピーク面積の比との関係から、検量線を作成する。つづいて、濃度が不明の標準物質を含む検体に、既知濃度の同位体標識を施した標準物質を添加した後に分析し、マスクロマトグラムのピーク面積比を求める。
そして、作成された検量線に基づいて、マスクロマトグラムのピーク面積比に対応する標準物質の濃度を決定する。同位体標識を施した標準物質は、未標識成分と同時に検出されるが、検出イオンの質量対電荷比ｍ／ｚが所定の値だけ異なるので、そのイオンペアについてマスクロマトグラムのピーク面積を比較することにより、各成分の濃度比を決定することができる。
本実施形態では、ＭＰＡのキャリブレータとして、ＭＰＡを血清に溶解させた擬似検体を用いる。疑似検体のＭＰＡ濃度は、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬとしている。擬似検体は、試薬保管部１０２に保管されている。まず、試薬保管部１０２を回転させて前処理検体プローブ１０８の駆動範囲に疑似検体を搬送する。次に、前処理検体プローブ１０８によって、各濃度の疑似検体をそれぞれ１００μＬ吸引して、固相抽出カートリッジに添加する。このとき、固相抽出カートリッジは、図２に示した固相抽出カートリッジ搬送工程Ｓ２０２１、コンディショニング工程Ｓ２０２２および平衡化工程Ｓ２０２３を完了した状態にしておく。
次に、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させて、固相抽出カートリッジを試薬プローブ１０４の駆動範囲まで搬送する。つづいて、試薬プローブ１０４を用いて、試薬保管部１０２に保管された内部標準物質ＭＰＡ−ｄ３ ５μＬを固相抽出カートリッジに添加する。そして、固相抽出カートリッジディスク１０３を回転させることによって、固相抽出カートリッジを圧力負荷部１０９の駆動範囲に搬送する。圧力負荷部１０９は、固相抽出カートリッジに対して加圧を行う。加圧後、固相抽出カートリッジ内の溶出液を廃液タンク（図示省略）に排出する。
その後、図２に示した洗浄工程Ｓ２０２５、溶出工程Ｓ２０２６、イオン化工程Ｓ２０４および質量分析工程Ｓ２０５を行う。質量分析部１１１で測定されたＭＰＡイオンおよびＭＰＡ−ｄ３のピーク強度データは、分析制御部１１２２を介してデータ処理部１１２７によって読み出される。データ処理部１１２７は、既知であるキャリブレータの濃度とＭＰＡイオンのピーク面積／ＭＰＡ−ｄ３のピーク面積の相関データ（検量線）を生成して、分析データ記憶部１１２４に格納する。
表２は、キャリブレータ測定時のＭＳ分析条件パラメータの一例を示す表である。ＭＰＡ（ＭＷ：３２０．３）については分析モード；ＳＲＭ、トランジッション（Ｑ１／Ｑ３）：３１９．３／１９１．３、ＤＰ：−５Ｖ、ＥＰ：−５Ｖ、ＣＥ：−５０Ｖ、ＣＸＰ：０Ｖ、ＣＵＲ：１０Ｌ／ｍｉｎ、ＣＡＤ：３Ｌ／ｍｉｎ、ＩＳ：−４５００Ｖ、ＴＥＭ：６００℃、ＧＳ１：３０Ｌ／ｍｉｎ、ＧＳ２：３０Ｌ／ｍｉｎに設定した。また、ＭＰＡ−ｄ３（ＭＷ：３２３．３）については、トランジッション（Ｑ１／Ｑ３）：３２２．３／１９４．３、ＤＰ：−５Ｖ、ＥＰ：−５Ｖ、ＣＥ：−５０Ｖ、ＣＸＰ：０Ｖ、ＣＵＲ：１０Ｌ／ｍｉｎ、ＣＡＤ：３Ｌ／ｍｉｎ、ＩＳ：−４５００Ｖ、ＴＥＭ：６００℃、ＧＳ１：３０Ｌ／ｍｉｎ、ＧＳ２：３０Ｌ／ｍｉｎに設定した。
ここで、入射電圧ＤＰは、入射電圧選択工程Ｓ３０２で選択されたＭＰＡのピーク面積が最小になる入射電圧ＤＰである。ここでは、相関データが図７の状態であるものとして、−５Ｖに設定されている。なお、相関データが図８の場合には、入射電圧ＤＰは−１５Ｖとなる。
ここで、入射電圧ＤＰは、入射電圧選択工程Ｓ３０２で選択されたＭＰＡのピーク面積が最小になる入射電圧ＤＰである。ここでは、相関データが図７の状態であるものとして、−５Ｖに設定されている。なお、相関データが図８の場合には、入射電圧ＤＰは−１５Ｖとなる。
＜評価工程Ｓ３０４＞
つづいて、評価工程Ｓ３０４では、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３で取得した検量線が、定量分析に用いるために許容範囲内か否かを評価する。これは、選択した入射電圧ＤＰの値によっては、本来の検体中に存在するＭＰＡの質量分析計への導入効率が低下する場合があるためである。ＭＰＡの質量分析計への導入効率が低下したとしても、検体中の濃度がμｇ／ｍＬオーダのタンパク質結合型ＭＰＡの分析には影響はない。しかし、検体中の濃度がｎｇ／ｍＬオーダの遊離型ＭＰＡの分析にはイオン強度が足りなくなり、必要な検出限界値が得られない可能性がある。このような可能性を考慮して、分析装置１００は、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３で得られた検量線の評価を行う。
つづいて、評価工程Ｓ３０４では、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３で取得した検量線が、定量分析に用いるために許容範囲内か否かを評価する。これは、選択した入射電圧ＤＰの値によっては、本来の検体中に存在するＭＰＡの質量分析計への導入効率が低下する場合があるためである。ＭＰＡの質量分析計への導入効率が低下したとしても、検体中の濃度がμｇ／ｍＬオーダのタンパク質結合型ＭＰＡの分析には影響はない。しかし、検体中の濃度がｎｇ／ｍＬオーダの遊離型ＭＰＡの分析にはイオン強度が足りなくなり、必要な検出限界値が得られない可能性がある。このような可能性を考慮して、分析装置１００は、キャリブレータ測定工程Ｓ３０３で得られた検量線の評価を行う。
具体的には、検量線の最低濃度（１ｎｇ／ｍＬ）のピーク面積をシグナル（Ｓ）、ブランクであるメタノールを８回測定したピーク面積の標準偏差（σ）をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出し、その値を指標として許容範囲内か判断する。Ｓ／Ｎ≧１０の場合には許容範囲内と判断し、今回取得した検量線を用いて、内部データベース１１２５に格納されている既存の検量線を書き換える。一方、Ｓ／Ｎ値＜１０の場合には、許容範囲外と判断し、装置洗浄等を行った後に再度モニタリング工程Ｓ３０１から処理を行う。
本実施形態では、内部データベース１１２５に格納されている既存の検量線に対して自動的に書き換えを行うものとしたが、例えば、ユーザが１ｎｇ／ｍＬのＭＰＡイオンのピーク形状を目視で確認した後、検量線の書き換えを行ってもよい。この場合は、取得した検量線で分析を継続するか否かの指定を、ユーザ入力部１１２１を介して行う。
＜検体ＭＰＡ濃度測定工程Ｓ３０５＞
検体ＭＰＡ濃度測定工程Ｓ３０５では、図２に示した処理によって検体の分析（ＭＰＡ濃度測定）を行う。このとき、制御部１１２は、内部データベース１１２５に格納されている検量線基づいて、得られた検体中のＭＰＡのピーク面積と内部標準物質であるＭＰＡ−ｄ３のピーク面積との比に対応するＭＰＡ濃度を測定する。
検体ＭＰＡ濃度測定工程Ｓ３０５では、図２に示した処理によって検体の分析（ＭＰＡ濃度測定）を行う。このとき、制御部１１２は、内部データベース１１２５に格納されている検量線基づいて、得られた検体中のＭＰＡのピーク面積と内部標準物質であるＭＰＡ−ｄ３のピーク面積との比に対応するＭＰＡ濃度を測定する。
＜変形例＞
なお、本実施形態に係る分析装置１００は、前記実施形態の構成に限定されるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲内で種々の変更が可能である。
前述した説明では、モニタリング工程Ｓ３０１において、ＭＰＡ（薬物）を分析対象としてモニタリングを行ったが、他の物質、例えば、ＭＰＡＧ（薬物代謝物）を分析対象としてモニタリングを行ってもよい。
なお、本実施形態に係る分析装置１００は、前記実施形態の構成に限定されるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲内で種々の変更が可能である。
前述した説明では、モニタリング工程Ｓ３０１において、ＭＰＡ（薬物）を分析対象としてモニタリングを行ったが、他の物質、例えば、ＭＰＡＧ（薬物代謝物）を分析対象としてモニタリングを行ってもよい。
表３は、ＭＰＡＧを分析対象としたモニタリング時のＭＳ分析条件パラメータの一例を示す表である。ＭＰＡＧ（ＭＷ：４９６．３）を分析対象とする場合は、分析モード：ＳＲＭ、トランジッション（Ｑ１／Ｑ３）：４９５．３／１９１．３、ＥＰ：−５Ｖ、ＣＥ：−５０Ｖ、ＣＸＰ：０Ｖ、ＣＵＲ：１０Ｌ／ｍｉｎ、ＣＡＤ：３Ｌ／ｍｉｎ、ＩＳ：−４５００Ｖ、ＴＥＭ：６００℃、ＧＳ１：３０Ｌ／ｍｉｎ、ＧＳ２：３０Ｌ／ｍｉｎに設定されている。
モニタリング工程Ｓ３０１では、前記したＭＰＡを分析対象とする場合と同様に、入射電圧ＤＰを−４０Ｖから０Ｖまで１Ｖ間隔で１００ｍｓｅｃごとに変化させながら分析を行う。そして、入射電圧選択工程Ｓ３０２では、入射電圧ＤＰとＭＰＡＧイオンのピーク面積の相関データを分析して、ＭＰＡＧのピーク面積が最大になる入射電圧ＤＰの値を選択する。これは、測定されるＭＰＡＧ量が多いほどグルクロン酸の解離が生じていないことを示すためである。その後の工程は、前述したＭＰＡを分析対象とする場合（図５参照）と同様に行えばよい。
さらに、モニタリング工程Ｓ３０１において、グルクロン酸（抱合体）を分析対象としてもよい。この場合、入射電圧選択工程Ｓ３０２においては、グルクロン酸イオンのピーク面積が最小になる入射電圧ＤＰの値を選択する。
≪まとめ≫
以上説明したように、実施形態にかかる分析装置１００は、薬物（ＭＰＡ）が薬物代謝物（ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素）によって所定の抱合体（グルクロン酸）と抱合された薬物代謝物（ＭＰＡＧ）と、薬物（ＭＰＡ）と、が混在する検体中の薬物濃度（ＭＰＡ濃度）を質量分析計を用いて分析する際に、連続的に変化する電圧（入射電圧ＤＰ）を検体に印加して、薬物代謝物からの抱合体の解離状態をモニタリングする。そして、モニタリングされた解離状態に基づいて、検体に印加する電圧（入射電圧ＤＰ）の最適値を選択し、選択された値の電圧（入射電圧ＤＰ）を検体に印加して、検体中の薬物の濃度を測定する。電圧（入射電圧ＤＰ）の最適値としては、薬物代謝物からの抱合体の解離率が最も低い電圧の値を選択する。これにより、測定過程で電圧印加が必要な質量分析計を用いた分析装置１００においても、電圧印加に伴う抱合体の解離を最小限に抑えて、薬物と薬物代謝物とが混在する検体中の薬物成分を精度よく測定することができる。
以上説明したように、実施形態にかかる分析装置１００は、薬物（ＭＰＡ）が薬物代謝物（ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素）によって所定の抱合体（グルクロン酸）と抱合された薬物代謝物（ＭＰＡＧ）と、薬物（ＭＰＡ）と、が混在する検体中の薬物濃度（ＭＰＡ濃度）を質量分析計を用いて分析する際に、連続的に変化する電圧（入射電圧ＤＰ）を検体に印加して、薬物代謝物からの抱合体の解離状態をモニタリングする。そして、モニタリングされた解離状態に基づいて、検体に印加する電圧（入射電圧ＤＰ）の最適値を選択し、選択された値の電圧（入射電圧ＤＰ）を検体に印加して、検体中の薬物の濃度を測定する。電圧（入射電圧ＤＰ）の最適値としては、薬物代謝物からの抱合体の解離率が最も低い電圧の値を選択する。これにより、測定過程で電圧印加が必要な質量分析計を用いた分析装置１００においても、電圧印加に伴う抱合体の解離を最小限に抑えて、薬物と薬物代謝物とが混在する検体中の薬物成分を精度よく測定することができる。
また、分析装置１００は、選択した値の電圧（入射電圧ＤＰ）を薬物のキャリブレータに印加して、キャリブレータ中の薬物の濃度を測定し、選択された電圧（入射電圧ＤＰ）の値を評価するので、モニタリング時における抱合体の解離状態が、通常の計測時と著しく異なっていた場合でも適切な電圧値を再設定して、測定精度をさらに向上させることができる。
また、分析装置１００は、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素以外の他の薬物代謝酵素によって代謝された薬物の分析にも用いることができるので、多岐にわたる用途に利用することができる。即ち、分析措置１００の分析対象である薬物はミコフェノール酸（薬物代謝物がミコフェノール酸のグルクロン酸抱合体であり、抱合体がグルクロン酸である）に限られるものではない。
また、分析装置１００は、モニタリングにおける測定対象物質を、薬物、薬物代謝物、抱合体のいずれかとすることができるので、測定環境に応じて適切な物質を測定対象として選択することができる。
また、分析装置１００は、モニタリングにおける測定対象物質を、薬物、薬物代謝物、抱合体のいずれかとすることができるので、測定環境に応じて適切な物質を測定対象として選択することができる。
本発明は、質量分析計を用いて分析を行う分析装置に有効であり、特に、濃度測定対象の薬物がミコフェノール酸（ＭＰＡ）であり、薬物代謝酵素がＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素であり、薬物代謝物がミコフェノール酸のグルクロン酸抱合体（ＭＰＡＧ）である場合に適している。
１００ 分析装置
１０１ 検体搬送機構
１０２ 試薬保管部
１０３ 固相抽出カートリッジディスク
１０４ 試薬プローブ
１０５ 検体プローブ
１０６ 固相抽出カートリッジ保管部
１０７ 固相抽出カートリッジプローブ
１０８ 前処理検体プローブ
１０９ 圧力負荷部
１０９１ 固相抽出カートリッジ
１０９２ シリンジポンプ
１０９３ 流量計
１０９４ 圧力計
１０９５ エアフィルタ
１０９６ ３方電磁弁
１０９７ 接合部
１１０ イオン化部
１１１ 質量分析部
１１１１ スキマー
１１１２ 四重極質量分析計
１１１３ 衝突室
１１１４ 四重極質量分析計
１１１５ イオン検出器
１１２ 制御部
１１２０ コントロール部
１１２１ ユーザ入力部
１１２２ 分析制御部
１１２３ データ照合部
１１２４ 分析データ記憶部
１１２５ 内部データベース
１１２６ 装置インターフェース
１１２７ データ処理部
ＤＰ 入射電圧
１０１ 検体搬送機構
１０２ 試薬保管部
１０３ 固相抽出カートリッジディスク
１０４ 試薬プローブ
１０５ 検体プローブ
１０６ 固相抽出カートリッジ保管部
１０７ 固相抽出カートリッジプローブ
１０８ 前処理検体プローブ
１０９ 圧力負荷部
１０９１ 固相抽出カートリッジ
１０９２ シリンジポンプ
１０９３ 流量計
１０９４ 圧力計
１０９５ エアフィルタ
１０９６ ３方電磁弁
１０９７ 接合部
１１０ イオン化部
１１１ 質量分析部
１１１１ スキマー
１１１２ 四重極質量分析計
１１１３ 衝突室
１１１４ 四重極質量分析計
１１１５ イオン検出器
１１２ 制御部
１１２０ コントロール部
１１２１ ユーザ入力部
１１２２ 分析制御部
１１２３ データ照合部
１１２４ 分析データ記憶部
１１２５ 内部データベース
１１２６ 装置インターフェース
１１２７ データ処理部
ＤＰ 入射電圧
Claims (12)
- 薬物と、前記薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、前記検体における前記薬物の濃度を分析する分析方法であって、
前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング工程と、
前記モニタリング工程における解離状態に基づいて、前記入射電圧を選択する選択工程と、
前記選択工程で選択された前記入射電圧を前記検体に印加して、前記検体における前記薬物の濃度を測定する濃度測定工程と、を含む
ことを特徴する分析方法。 - 前記選択工程は、
前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離率が最も低い前記入射電圧を選択する
ことを特徴とする請求項１に記載の分析方法。 - 前記モニタリング工程は、
前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物から解離した前記薬物の量を前記質量分析部で測定することによって前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングする
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分析方法。 - 前記モニタリング工程は、
前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物の量を前記質量分析部で測定することによって前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングする
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分析方法。 - 前記モニタリング工程は、
前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物から解離した前記抱合体の量を前記質量分析部で測定することによって前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングする
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分析方法。 - 前記選択工程で選択された前記入射電圧を前記薬物のキャリブレータに印加して、前記薬物のキャリブレータにおける前記薬物の濃度を測定するキャリブレータ測定工程と、
前記キャリブレータ測定工程の測定結果に基づいて、所定の分析精度を満たすか否かを評価する評価工程と、をさらに含み、
前記評価工程において、前記所定の分析精度を満たすと評価された場合、前記濃度測定工程を行う
ことを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の分析方法。 - 前記評価工程において、前記所定の分析精度を満たさないと評価された場合、前記質量分析部の清掃が必要であると評価する
ことを特徴とする請求項６に記載の分析方法。 - 前記薬物はミコフェノール酸であり、
前記薬物代謝酵素はＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素であり、
前記薬物代謝物はミコフェノール酸のグルクロン酸抱合体であり、
前記抱合体はグルクロン酸である
ことを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の分析方法。 - 前記薬物代謝酵素は、シトクロムＰ４５０、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、酸化還元酵素、ＵＤＰ−スルホン酸転移酵素、糖転移酵素、グルタチオンレダクターゼなどの抱合酵素、加水分解酵素のいずれかである
ことを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の分析方法。 - 前記選択工程で選択された前記入射電圧の値と、前記質量分析部の清掃後に最初に選択された前記入射電圧の値と、の差が所定値よりも大きい場合、前記質量分析部の清掃が必要であると評価する
ことを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の分析方法。 - 前記選択工程で選択された前記入射電圧の値の絶対値が所定値よりも大きい場合、前記質量分析部の清掃が必要であると評価する
ことを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の分析方法。 - 薬物と、前記薬物が薬物代謝酵素により抱合体と抱合して代謝された薬物代謝物と、が混在する検体に入射電圧を印加して質量分析部に導入し、前記検体における前記薬物の濃度を分析する分析装置であって、
前記入射電圧を変化させながら、前記薬物代謝物からの前記抱合体の解離状態をモニタリングするモニタリング手段と、
前記モニタリング手段によってモニタリングされた解離状態に基づいて、前記入射電圧を選択する選択手段と、
前記選択手段で選択された前記入射電圧を前記検体に印加して、前記検体における前記薬物の濃度を測定する検体測定手段と、を備える
ことを特徴する分析装置。
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| JP2011237116A JP5827545B2 (ja) | 2011-10-28 | 2011-10-28 | 分析方法および分析装置 |
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2011
- 2011-10-28 JP JP2011237116A patent/JP5827545B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPN6015012752; 栗原 祐子、他４名: '「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるヒト血漿中のワルファリンとその代謝物の同時定量と光学異性体の分割定量」' 医療薬学 Ｖｏｌ． ３４， Ｎｏ． ３, 20080310, ｐ． ２８１-２８８, 日本医療薬学会 * |
| JPN6015012754; Ｋｅｖｉｎ Ｗｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．: '"Ａ ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｉｇｈ-ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＡＤＭＥ ｓｃｒｅ' Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｖｏｌ． ２０， Ｎｏ． １０, 20060530, ｐ． １４９７-１５０３, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ． * |
| JPN6015012757; 内藤 隆文: '「代謝拮抗型免疫抑制薬の体内動態情報に基づく個別化投与設計法の基盤構築に関する臨床薬学研究」' 薬学雑誌 Ｖｏｌ． １３０， Ｎｏ． １２, 201012, ｐ． １６９５-１７００, 社団法人日本薬学会 * |
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|---|---|
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