CN112268961A - 一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法 - Google Patents

一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甾体激素类代谢物的定性、定量分析方法。本发明基于组合衍生化和LC‑HRMS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定性分析；基于组合衍生化与2D LC‑MS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定量分析。本发明所述定性、定量分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。

Description

一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法
技术领域
本发明涉及代谢物分析技术领域，具体涉及一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。
背景技术
目前临床上测量激素物质的含量水平的分析方法依赖于免疫分析，即包括放射免疫分析法，通过放射性标记抗原与标准品抗原或样本中未被标记的抗原对限定的特异性抗体的竞争结合反应。或者非同位素标记的免疫分析技术，化学发光、电化学发光、酶放大化学发光、荧光免疫、金属免疫分析等。但这些方法具有不确定的特异性，而其对于一些化合物灵敏度也不符合要求，并且每一次测定需要用血200μL，只能得到单一物质的含量，对于结构较为相似的物质，并且在低浓度的范围内，缺乏分析精度，容易造成诊断错误，例如在儿科诊断的过程中，常由于分析物含量较低，无法提供诊断依据。或测量绝经前后期的女性睾酮含量时，免疫分析法无法测定睾酮的准确含量等，同时免疫分析测定时样本未经过一定步骤的前处理，导致测量值受到基质效应以及人为测定的影响较大，这种误差也无法通过内标进行校正。若生物样本的激素物质浓度超过检测试剂盒测量范围，便无法准确测定物质含量。
发明内容
本发明的解决的技术问题在于提供一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。本发明所述分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。
为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：
1)以水解酶对样品水解，利用反相碳18固相萃取96孔板(Waters Sep-Pak tC18100mg)提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品；
3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q ExactiveOrbitrap型质谱，利用ddms2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；
4)推算分子组成；
选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物，将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；
选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物，将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。
优选的是，步骤1)所述样品包括尿液、血液。
优选的是，步骤3)标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比为1:1。
优选的是，步骤3)所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及 177.1419。
优选的是，步骤4)所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，符合不饱和度公式Ω≥9.5+N，N为自然数。
优选的是，步骤4)所述环戊烷多氢菲与Dns试剂结合的基本结构包含： 29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式Ω≥13.5+N，N为自然数。
本发明还提供了一种甾体激素类代谢物的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)以水解酶对样品水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
(2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(1)得到的待测样品分别进行衍生化，得到吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品；
(3)将步骤(2)得到的吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品进行二维液相分析：
所述二维液相分析的两个色谱柱为安捷伦高分辨碳18色谱柱，连接方式为平行柱分析；所述二维液相分析的流动相分别是：流动相A和流动相 B，所述流动相A为含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的甲醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液；
(a)取10μL丹磺酰氯类衍生化样品，0～3min以100％的水相A为流动相以0.5ml/min的速度进行上样，流动相直接流进废液
(b)取10μL吉拉德试剂P类衍生化样品，流速0.5mL/min，按照以下条件进行上样分析：
0～2min，流动相A的比例为85～78％；
2～4min，流动相A的比例为78～75％％；
4～6min，流动相A的比例为75～70％；
6～7min，流动相A的比例为70～70％；
7～8min，流动相A的比例为70～65％；
8～10min，流动相A的比例为65～60％；
10～12min，流动相A的比例为60～60％；
12～12.1min，流动相A的比例为60～85％；
12.1～12.5min，流动相A的比例为85～85％；
12.5～12.6min，流动相A的比例为85～25％；
12.6～13min，流动相A的比例为25～25％；
13～17min，流动相A的比例为25～23％；
17～18min，流动相A的比例为23～20％；
18～19min，流动相A的比例为20～18％；
19～20min，流动相A的比例为18～16％；
20～20.5min，流动相A的比例为16～10％；
20.5～20.6min，流动相A的比例为10～100％；
20.6～21min，流动相A的比例为100～100％；
流动相开始运行梯度的最开始1min，流动相直接进废液；1min以后，流动相进质谱；
(4)二维液相分析后，采用全反应检测的质谱采集模式对所测样本进行采集；所述全反应检测的条件为：
Figure BDA0002122013520000041
(5)将采集得到的数据进行定量分析，得到甾体激素类代谢物定量结果。
优选的是，步骤(3)所述色谱柱的尺寸为1.8μm，2.1mm×50mm。
本发明提供了一种甾体激素类代谢物的定性、定量分析方法。本发明利用衍生化试剂及其同位素衍生化试剂，针对不同种甾体激素的官能团进行衍生化，提高了质谱检测的响应灵敏度，并根据了两类衍生物极性的不同，将测定的分析时间进一步缩短。本发明所述分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。试验结果表明，本发明的方法能在21min内绝对定量50种甾体激素，并相对定量19种结构已知甾体激素，根据高分辨的甾体激素衍生物识别策略，相对定量疑似甾体激素共 62种，其结构有待进一步确证。
附图说明
图1为本发明提供的衍生化反应示意图；
图2为本发明实施例1提供的甾体激素类代谢物定性分析方法流程图；
图3为本发明实施例1提供的50种甾体激素结构式；
图4为本发明实施例2提供的2D柱切换流程示意图。
图5生物样本中甾体激素类代谢物分析过程
具体实施方式
本发明提供了一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：
1)以水解酶对样品水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
2)采用吉拉德试剂P(GP)与丹磺酰氯(Dns)对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P (GP-d5)与氘代丹磺酰氯(Dns-d6)对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品(反应如图1所示)；
3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q ExactiveOrbitrap型质谱，利用ddMS2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；
4)推算分子组成；
选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物，将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；
选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min 内的物质作为第二甾体激素待识别物，将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。
本发明利用水解酶将样品中结合型的甾体激素水解为游离型，利用沃特世碳18固相萃取96孔板对样品中甾体激素进行提取，挥干后得待测样品。在本发明中，所述样品包括尿液、血液。在本发明中，所述水解酶包括β-葡萄糖醛酸酶(来源于罗曼蜗牛，Type H-2)。在本发明中，所述水解酶优选采用醋酸钠作为溶剂。在本发明中，所述水解的条件优选为：37℃孵育一晚。本发明在所述提取前，优选用甲醇淋洗沃特世碳18固相萃取96 孔板。在本发明中，所述提取用洗脱溶液优选为甲醇。
得到待测样品后，本发明采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品。本发明对所述衍生化方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规衍生化操作方法即可。本发明所述衍生化反应如图1所示。
得到标记的衍生化样品后，本发明将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q Exactive Orbitrap型质谱，利用ddms2数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰。在本发明中，标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比优选为1:1。在本发明中，所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及177.1419。在本发明中，所述ddms2数据采集模式指LC-HRMS/MS的分析方法，即通过Thermo Obitrap仪器获取其高分辨的质谱数据。
筛选出含报告离子的母离子峰后，本发明推算分子组成：选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物，将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物，将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。在本发明中，所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，符合不饱和度公式Ω≥9.5+N，N为自然数。在本发明中，所述环戊烷多氢菲与Dns试剂结合的基本结构包含：29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式Ω≥13.5+N， N为自然数。本发明对所述甾体激素标准物质的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规甾体激素标准物质市售产品即可。
本发明还提供了一种甾体激素类代谢物的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)以水解酶对样品水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
(2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(1)得到的待测样品分别进行衍生化，得到吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品；
(3)将步骤(2)得到的吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品进行二维液相分析：
所述二维液相分析的两个色谱柱为安捷伦高分辨碳18色谱柱，连接方式为平行柱分析；所述二维液相分析的流动相分别是：流动相A和流动相 B，所述流动相A为含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的甲醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液；
(a)取10μL丹磺酰氯类衍生化样品，0～3min以100％的水相A为流动相以0.5ml/min的速度进行上样，流动相直接流进废液，在本发明中，由于Dns类物质极性较弱，在反相柱上100％的水相A不会将待测物质洗脱，只会将过量的衍生化试剂Dns以及高极性的基质物质除去。
(b)取10μL吉拉德试剂P类衍生化样品，流速0.5mL/min，按照以下条件进行上样分析：
0～2min，流动相A的比例为85～78％；
2～4min，流动相A的比例为78～75％％；
4～6min，流动相A的比例为75～70％；
6～7min，流动相A的比例为70～70％；
7～8min，流动相A的比例为70～65％；
8～10min，流动相A的比例为65～60％；
10～12min，流动相A的比例为60～60％；
12～12.1min，流动相A的比例为60～85％；
12.1～12.5min，流动相A的比例为85～85％；
12.5～12.6min，流动相A的比例为85～25％；
12.6～13min，流动相A的比例为25～25％；
13～17min，流动相A的比例为25～23％；
17～18min，流动相A的比例为23～20％；
18～19min，流动相A的比例为20～18％；
19～20min，流动相A的比例为18～16％；
20～20.5min，流动相A的比例为16～10％；
20.5～20.6min，流动相A的比例为10～100％；
20.6～21min，流动相A的比例为100～100％；
流动相开始运行梯度的最开始1min，流动相直接进废液，目的是除去过量的GP衍生化试剂，以及基质中极性较强的干扰物质；1min以后，流动相进质谱；
(4)二维液相分析后，采用全反应检测的质谱采集模式；所述全反应检测的条件为：
Figure BDA0002122013520000081
(5)将采集得到的数据进行定量分析，能在更短的时间内得到多种甾体激素的定量结果，方法简单，迅速。。
在本发明中，步骤(3)所述色谱柱的尺寸为1.8μm，2.1mm×50mm。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种甾体激素类代谢物的定性、定量分析方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
使用仪器：Q Exactive；戴安液相；Q Trap 5500；Waters 2D UPLC I Class
操作流程图(如图2所示)。
样品前处理：取500μL的尿液样本，加入500μL由醋酸钠配置好的酶解液，37℃下孵育一晚，用1ml甲醇、1mL纯水依次淋洗沃特世碳18固相萃取96孔板，后1mL尿液上样，用2ml甲醇洗脱。挥干溶液，得到样品。
组合式衍生化：分别用GP试剂和Dns试剂进行衍生化(轻标)，并利用d5-GP与d6-Dns进行衍生化(重标)，作为标记对比。
系统混合：直接将衍生化好后的轻标和重标样品1:1混合。
LC-HRMS/MS分析：采用高分辨Q Exactive Orbitrap型质谱，利用 ddms2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，通过特定的报告离子80.0495及85.0809 (GP类衍生物)171.1043及177.1419(Dns类衍生物)筛选出含报告离子的母离子峰。选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，即含有24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，并且符合不饱和度公式(Ω≥9.5+N，N为自然数)，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物；选取分子组成在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，即是含有29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式(Ω≥13.5+N，N为自然数)，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物。
识别分析：将所述第一、二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时对比与标准物质的色谱行为，确定第一、二甾体激素待识别物的分子组成。
利用上述方法，本发明发现100余种内源性甾体激素类代谢物，其中 72个化合物结构涉及KEGG数据库的甾体激素代谢途径，采用标准品对50 个代谢物的结构进行了分析确认(确认结构的代谢物如图3所示)。其余62 个疑似甾体激素类代谢物，未见文献报道，其结构尚需进一步确认(相关数据见表1及表2)。
表1甾体激素类代谢物离子对及KEGG数据库编号
Figure BDA0002122013520000101
表2疑似甾体激素类代谢物离子对及结构式信息
Figure BDA0002122013520000102
Figure BDA0002122013520000111
Figure BDA0002122013520000121
实施例2
基于组合衍生化与2D LC-MS/MS对甾体激素类代谢物进行定量分析 (方法学验证内容参见表3)，流程图如图4所示，将两种衍生化反应后的衍生物利用极性差异分别上样于同一色谱柱，利用流动相除去过量的衍生化试剂，分析衍生化样品。具体如下：
试剂：甾体激素标准物质、丹磺酰氯(Dns)、吉拉德试剂P(GP)、氘代丹磺酰氯(Dns-d6)、氘代吉拉德试剂P(GP-d5)、甲醇、乙腈、甲酸铵、氟化铵等。
仪器：AB 5500质谱仪；waters ACQUITY UPLC I-class二维液相
操作步骤：
将制备好的衍生化样品Dns类以及GP类分别放在两个液相小瓶中，二维液相两个色谱柱均为安捷伦高分辨碳18色谱柱(1.8μm,2.1mm×50 mm)，连接方式为平行柱分析，即一根色谱柱分析时，另一根色谱柱进行流动相的平衡阶段。
流动相分别是：
流动相A(含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液)；
流动相B(含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的1甲醇：乙腈(1:1)的混合溶液)。
进样器吸取Dns类样品10μL，以0.5ml/min：0～3min(100～100％A)，这个阶段是用100％的水相A去上样，将Dns类样品加载到色谱柱前段，这段时间的流动相不进质谱，直接流进废液。
进样器吸取GP类样品10μL， 0.5mL/min:0-2min(85-78％A),2-4min(78-75％A),4-6min(75-70％A),6-7min(70 -70％A),7-8min(70-65％A),8-10min(65-60％A),10-12min(60-60％A),12-12.1mi n(60-85％A),12.1-12.5min(85-85％A),12.5-12.6min(85-25％A)12.6-13min(25-2 5％),13-17min(25-23％A),17-18min(23-20％A),18-19min(20-18％A),19-20min( 18-16％A),20-20.5min(16-10％A),20.5-20.6(10-100％A),20.6-21(100-100％A)
吸取GP类样品，流动相开始运行梯度的最开始1min，流动相不进质谱，直接切入废液。
质谱采集模式：MRM(多反应监测)，其相关的质谱数据参数如下
Figure BDA0002122013520000131
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
表3：定量方法学验证内容
Figure BDA0002122013520000141
Figure DEST_PATH_IMAGE001

Claims (8)

1.一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：
1)以水解酶对样品水解，利用反相碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品；
3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q ExactiveOrbitrap型质谱，利用数据依赖性二级质谱扫描ddMS2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；
4)推算分子组成；
选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物；将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；
选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物；将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。
2.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤1)所述样品包括尿液、血液。
3.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤3)标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤3)所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及177.1419。
5.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤4)所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，符合不饱和度公式Ω≥9.5+N，N为自然数。
6.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤4)所述环戊烷多氢菲与Dns试剂结合的基本结构包含：29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式Ω≥13.5+N，N为自然数。
7.一种甾体激素类代谢物的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)以水解酶对样品水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
(2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(1)得到的待测样品分别进行衍生化，得到吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品；
(3)将步骤(2)得到的吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品进行二维液相分析：
所述二维液相分析的两个色谱柱为安捷伦高分辨碳18色谱柱，连接方式为平行柱分析；所述二维液相分析的流动相分别是：流动相A和流动相B；所述流动相A为含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的甲醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液；
(a)取10μL丹磺酰氯类衍生化样品，0～3min以100％的水相A为流动相以0.5ml/min的速度进行上样，流动相直接流进废液；
(b)取10μL吉拉德试剂P类衍生化样品，流速0.5mL/min，按照以下条件进行上样分析：
0～2min，流动相A的比例为85～78％；
2～4min，流动相A的比例为78～75％％；
4～6min，流动相A的比例为75～70％；
6～7min，流动相A的比例为70～70％；
7～8min，流动相A的比例为70～65％；
8～10min，流动相A的比例为65～60％；
10～12min，流动相A的比例为60～60％；
12～12.1min，流动相A的比例为60～85％；
12.1～12.5min，流动相A的比例为85～85％；
12.5～12.6min，流动相A的比例为85～25％；
12.6～13min，流动相A的比例为25～25％；
13～17min，流动相A的比例为25～23％；
17～18min，流动相A的比例为23～20％；
18～19min，流动相A的比例为20～18％；
19～20min，流动相A的比例为18～16％；
20～20.5min，流动相A的比例为16～10％；
20.5～20.6min，流动相A的比例为10～100％；
20.6～21min，流动相A的比例为100～100％；
流动相开始运行梯度的最初1min，流动相直接进入废液；1min以后，流动相开始进质谱；
(4)二维液相分析后，采用多反应监测的质谱采集模式对样品进行采集；所述全反应检测的条件为：
Figure FDA0002122013510000031
(5)将采集得到的数据进行定量分析，得到甾体激素类代谢物定量结果。
8.根据权利要求7所述的定量分析方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱柱的尺寸为1.8μm，2.1mm×50mm。
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