JP2005098830A

JP2005098830A - 質量分析法によるタンパク質相互作用物質のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2005098830A
Application number: JP2003332756A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hirota; 洋廣田; Miwako Asanuma; 三和子淺沼; Shigeyuki Yokoyama; 茂之横山
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2003-09-25
Publication date: 2005-04-14

Abstract

【課題】
タンパク質の機能解析を始める最初の段階として、アフィニティービーズを用いたプルダウンアッセイ法と質量分析法を組み合わせて、タンパク質と相互作用する物質を効率的にスクリーニングする手法を提供すること。
【解決手段】
（ａ）２種以上の候補化合物の質量分析を行い、各候補化合物のイオン化効率を測定する工程、（ｂ）前記２種以上の候補化合物を含む混合物と目的タンパク質とを接触させる工程、（ｃ）前記目的タンパク質と結合しない（非結合）候補化合物を除去する工程、（ｄ）前記目的タンパク質と候補化合物との複合体を回収する工程、（ｅ）前記複合体の質量分析を行い、前記複合体に含まれる目的タンパク質、及び各候補化合物のイオン化量を測定する工程、そして（ｆ）工程（ａ）及び（ｅ）の結果に基づいて前記複合体に含まれる各候補化合物量又はそれらの比率を計算する工程、を含み、前記目的タンパク質と結合するリガンド化合物を同定する。
【選択図】
図４

Description

本発明は、タンパク質相互作用物質のスクリーニング方法に関し、より詳細には、アフィニティービーズを用いたプルダウンアッセイ法と質量分析法とを組み合わせて、タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法に関する。

現在、種々の生物のゲノム解析から得られた遺伝子情報に基づき、新規遺伝子から機能未知タンパク質の調製が可能になっている。このような機能未知タンパク質の機能を解析する１つの手段として、タンパク質と相互作用する化合物を同定する方法がある。

タンパク質は、タンパク質やＤＮＡ、低分子化合物など様々な化合物と複合体形成等の分子間相互作用を行い、その機能を発現している。よって、機能未知タンパク質の機能を知る手がかりとして、タンパク質と相互作用する化合物を特定する事が重要である。タンパク質の相互作用する相手を効率よく見つけ、さらに相互作用する相手の分子がタンパク質のどの部分に結合するのかがわかれば、そのタンパク質の生物学的意義が理解できるはずである。タンパク質相互作用を解析する手法には、ツーハイブリッド(two-hybrid)法（例えば、非特許文献１参照）やファージディスプレイ法（例えば、非特許文献２参照）、免疫沈降法（例えば、非特許文献３参照）などが挙げられる。それぞれ得意分野があり、各々の目的にあった方法を選択する事が大切である。また、表面プラズモン共鳴法や核磁気共鳴（ＮＭＲ）法などの分析・分光化学的手法で、相互作用の有無を調べたり、結合定数を求めたり、さらに相互作用部位特定が行われている。

このようなタンパク質相互作用解析システムの構築にあたっては、タンパク質と相互作用する可能性のある物質を、非常に数多くの候補物質の中からスクリーニングしなければならないため、解析スピードの高速化が必要となる。また、微量のタンパク質試料を用いて解析することができれば試料調製の手間及びコストが軽減されることから高感度な検出手段が要求される。

質量分析法は、２００２年のノーベル化学賞で認められたタンパク質のイオン化方法の発見と開発により、プロテオミクス研究の様々な分野で利用されているが、タンパク質複合体の分析手段としても極めて有力な方法の１つである。タンパク質と相互作用する物質を探索するためには、まず、タンパク質自身を、結合する候補化合物を選択するためのアフィニティー試薬として使用する。次いで、タンパク質複合体を精製し（プルダウンアッセイ法）、タンパク質に結合した化合物を質量分析する（例えば、特許文献１参照）。ツーハイブリッド法やチップ法に比べて、この方法はタンパク質を比較的自由に修飾することができ、また相互作用の解析を生体内に近い条件で行うことができる。そして１回の操作で多成分の複合体を解析することができるなどのメリットがある。しかしながら、多くの生物学的相互作用は弱い結合であったり、共存する種々の因子によって結合が影響されたりするため、真の結合化合物を見出すのが難しいという問題点がある。特に、質量分析で検出される物質が複数存在し、それらの物質間でイオン化効率に大きな違いがある場合には、検出されたピークの大きさから目的タンパク質との相互作用の強さを正確に解析することが著しく困難である。

米国特許出願公開第２００３／０１６６００７号明細書フィールズ・エス(Fields, S.)、ソング・オー(Song, O)、「ネイチャー(Nature)」、１９８９年、第３４０巻、ｐ．２４５スミス・ジー・ピー(Smith, G.P.)、「サイエンス(Science)」、１９８５年、６月１４日、第２２８巻、ｐ．１３１５−１３１７フィジキー・イー・エム(Phizicky, E.M.)、フィールズ・エス(Fields, S.)、「マイクロバイオロジカル・レビュー(Microbiol. Rev.)」、１９９５年３月、第５９巻、ｐ．９４−１２３

本発明は、タンパク質の機能解析を始める最初の段階として、アフィニティービーズを用いたプルダウンアッセイ法と質量分析法を組み合わせて、タンパク質と相互作用する物質を効率的にスクリーニングする手法を提供することを目的とする。

本発明の方法によれば、プルダウンアッセイでタンパク質と候補化合物との複合体を得た後、質量分析装置で相互作用を検出する。質量分析装置での検出時には、通常、複合体は解離してしまっているが、得られたマススペクトルを解析することによって、両者が相互作用している事を検出する事が可能である。その際、あらかじめ測定しておいた候補化合物のイオン化効率を用いて質量分析により得られた各化合物のイオン化量を補正することにより、タンパク質と相互作用する物質を効率的にスクリーニングできることが分かった。

すなわち、本発明の第１の視点において、目的タンパク質と結合するリガンド化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）２種以上の候補化合物の質量分析を行い、各候補化合物のイオン化効率を測定する工程、
（ｂ）前記２種以上の候補化合物を含む混合物と目的タンパク質とを接触させる工程、
（ｃ）前記目的タンパク質と結合しない（非結合）候補化合物を除去する工程、
（ｄ）前記目的タンパク質と候補化合物との複合体を回収する工程、
（ｅ）前記複合体の質量分析を行い、前記複合体に含まれる目的タンパク質、及び各候補化合物のイオン化量を測定する工程、そして
（ｆ）工程（ａ）及び（ｅ）の結果に基づいて前記複合体に含まれる各候補化合物量又はそれらの比率を計算する工程、を含み、前記目的タンパク質と結合するリガンド化合物を同定することを特徴とするスクリーニング方法が提供される。

本発明の好ましい実施形態において、前記混合物中の候補化合物の濃度を変えて前記工程（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すことを特徴とする。また、前記混合物は、質量分析における内部標準物質を含み、そのイオン化量に基づいて、工程（ｅ）における前記各候補化合物のイオン化量を補正することを特徴とする。

本発明のさらに好ましい実施形態において、前記目的タンパク質は、抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、核酸、及びレクチンからなる群より選択される何れかとの融合タンパク質として調製されることを特徴とする。特に好ましくは、前記目的タンパク質はヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、又はストレプトアビジン結合ペプチド（Streptag（商標）等）との融合タンパク質として調製され、中でも好ましくはヒスチジンタグとの融合タンパク質として調製される。

本発明のさらになお好ましい実施形態において、前記工程（ｄ）で回収された複合体を、さらに逆相クロマトグラフィーで分離し、溶出された複数のフラクションについて質量分析することを特徴とする。本実施形態においては、工程（ｅ）で測定された目的タンパク質のイオン化量に基づいて、各候補化合物のイオン化量を補正することが好ましい。

本発明の１つの実施形態において、前記質量分析がエレクトロスプレーイオン化法により行われることを特徴とする。

本発明の方法は、より緻密な機能解析を進める前段階としての、スクリーニングとして有効であり、タグ付きリコンビナントタンパク質さえ調製できれば、数μｇのタンパク質を用いての多検体スクリーニングが可能である。例えば、数百ｐｍｏｌのタンパク質試料と、その３倍モルのスクリーニング対象化合物を用いて、プルダウンアッセイから質量分析までのすべての工程をわずか１〜２時間で行うことができる。

（定義）
本明細書において、用語「リガンド」、「リガンド化合物」、「化合物」、「候補化合物」とは相互に転用可能であって、ペプチド、核酸、多糖、低分子有機化合物、天然物、その他の分子を意味するがこれらに限定されない。

「質量分析を行う」又は「質量分析による解析」とは、タンパク質又は候補化合物を同定するために用いる情報を生成するために質量分析装置による測定を行うことをいう。これらの情報には、例えば、タンパク質又は候補化合物の分子量又は質量、イオン化量、純度等を含む。

本明細書において、用語「イオン化量」とは、質量分析装置のイオン源でイオン化された試料が検出部で検出される値（ピーク強度又はピーク面積）をいう。「イオン化効率」とは、前記イオン化量を化合物の単位量、例えば、モル数で割ったものであり、一定量の化合物当たりのイオン化量のことをいう。

用語「接触」とは、分子同士が相互作用することであり、例えば、水溶液中で目的タンパク質と候補化合物とを混合することによりそれらの分子間で衝突が起こることによって相互作用が生ずる。

「結合」とは、「接触」よりも安定な２つの分子間の相互作用のことをいう。これは、生理的条件下における静電的、疎水的、イオン的、共有結合、及び／又は水素結合による相互作用によって形成される。

「複合体」とは、互いに親和性を持った少なくとも２つの分子間で形成される相互作用であり、例えば、抗原と抗体、アビジンとビオチン、受容体とリガンド、及び酵素と基質などの結合物をいう。

（目的タンパク質）
本明細書において「目的タンパク質」とは、当該タンパク質の機能を探索するために、それと相互作用する物質を同定するためのタンパク質又はそのドメインである。タンパク質分子間又はタンパク質とペプチドや他の低分子との間の相互作用は、タンパク質が分子機能、生物機能を果たす第一歩であり、例えば生体内における物質代謝やシグナル伝達において重要な役割を果たしている。具体的には、ホルモンとその受容体、細胞増殖因子とその受容体、遺伝子の発現調節因子間の相互作用等が挙げられるがこれらに限定されない。ハイスループットなスクリーニングが可能になると、上記のような機能が明らかでないタンパク質の機能解明や、相互作用するタンパク質が不明の生理活性化合物のスクリーニング等の研究が促進される（廣田洋、伊藤隆司、実験医学、第１９巻（８）、958-962、2001年参照）。

本発明において、シグナル伝達とは、細胞が外界からいろいろなシグナル（ホルモン、増殖因子、サイトカイン等）をそれぞれに特異的な受容体を介して受け取り、細胞内の多数の複雑な反応を経由して核へ伝えて、増殖、分化、移動、細胞死（アポトーシス）などを開始することをいう。細胞内でシグナルが受け渡される経路をシグナル伝達経路といい、シグナルの種類、細胞の型や状態等によって異なる。シグナル伝達経路の入口となる受容体は大別して３型ある。イオンチャネル型は主として神経細胞のシナプス部分にあって、神経伝達物質が結合するとイオンチャネルが短時間開閉して興奮を伝える。Ｇタンパク質共役型はホルモンの受容体に多く、受容体からのシグナルが三量体型Ｇタンパク質を経由してｃＡＭＰやＩＰ_３等のセカンドメッセンジャーの増加を引き起こす。酵素結合型には受容体自体がプロテインキナーゼであるもの(受容体型チロシンキナーゼ)とシグナル分子が結合するとチロシンキナーゼを活性化するもの（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系）とがあり、前者は主に増殖因子の、後者は（狭義の）サイトカインの受容体である。タンパク質のリン酸化という情報は、ＳＨ２ドメインをもついろいろなプロテインキナーゼ等によって認識され、シグナルが先へ伝えられる。最後に活性化されたプロテインキナーゼが核内に移行して転写因子をリン酸化（あるいは細胞質内でリン酸化された転写因子が核内に移行）して特定の遺伝子の転写を促進する。

ＳＨドメインとは、Ｓｒｃ相同領域のことである。プロトオンコジーンの一つＳｒｃ遺伝子産物(Src)は、チロシンキナーゼ活性をもち、Ｓｒｃ自体のチロシンもリン酸化される。他のチロシンキナーゼ活性をもつがん遺伝子産物やシグナル伝達経路にかかわる因子の研究過程で、Ｓｒｃタンパク質と構造が類似していて、タンパク質分子間の相互作用に重要な働きをする領域（ドメイン）が発見され、Ｓｒｃ相同領域（ＳＨ１〜３）と呼ばれるようになった。そのうちＳＨ１ドメインはチロシンキナーゼ領域である。ＳＨ２ドメインは近隣のタンパク質のリン酸化されたチロシンを認識して結合する。また、ＳＨ３ドメインはプロリンに富むペプチドを認識して相互作用することが知られている。

本発明の方法を用いることによって、このようなタンパク質と相互作用する物質を極めて効率的に解析することができる。特定のタンパク質又はそのドメインと結合する新規な化合物を見出し、又は既知の化合物の新規な相互作用を同定することによって、これらのシグナル伝達機構を調節する薬剤の開発や病気の治療方法につながる。

（プルダウンアッセイ）
目的タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法としてプルダウンアッセイがある。この方法は、免疫沈降法に類似する方法であって、例えば、ＧＳＴ−プルダウンアッセイではＧＳＴ融合タンパク質を試料（例えば細胞破砕液）と共にＧＳＴ結合成分（例えば、グルタチオンビーズ）とインキュベートする工程を含み、ＧＳＴ融合タンパク質に結合するタンパク質を引っ張り出す（pull down）方法として知られている。

本発明において、この方法は３つの基本的な工程からなる。第１に、２種以上の候補化合物を含む混合物と目的タンパク質とを接触させる工程である。スクリーニングの対象となる候補化合物は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であっても良い。混合物中に含まれる候補化合物の種類は特に限定されないが、それぞれの質量分析によるピークが同定できることが必要である。これらの候補化合物を目的タンパク質と接触させる。通常は生体内に近い条件、例えば、２０〜４０℃で５分〜数時間、好ましくは１０分〜１時間程度インキュベートする。

第２に、前記目的タンパク質と結合しない候補化合物を除去する。通常は、目的タンパク質を固相の担体に吸着させ、適当な洗浄液で洗浄することにより非結合の候補化合物と分離する。担体としては、固体または不溶性材料（例えば、ろ過、沈殿、磁性分離などによりタンパク質混合物から分離することができる材料）であって、タンパク質の非特異的な吸着が少ない物が好ましく、例としては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、テフロン（登録商標）、孔調節ガラス）、薄膜（例えば、セルロース、ニトロセルロースポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ガラス繊維、及びテフロン（登録商標）製）のような平坦担体、ガラスプレート、金属プレート、シリコンウエハ、マイクロタイタープレート等を含む。

タンパク質を固相担体に吸着させるためには種々の方法がある。例えば、目的タンパク質に対する抗体を固定化したビーズなどを用いても良い。好ましくは、目的タンパク質は、抗体、抗体のフラグメント、比較的低分子量のペプチド（オリゴペプチド）、立体構造を有する高分子量ポリペプチド（タンパク質）、ペプチド様物質、多糖、アプタマー、脂質、核酸、レクチン、又はこれらの組合せを含む融合タンパク質として調製される。これらのタンパク質は、目的タンパク質を固相担体に吸着させて単離操作を容易にするために役立ち、特に好ましくは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン(ＴｒｘＡ)、セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag（商標））、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。

グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとＧＳＴとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターpGEX Vectorsはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。ＧＳＴのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、ＭＢＰとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗ＭＢＰ抗体を使用することもできる。チオレドキシン(ＴｒｘＡ)は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond（商標）Resin（ Invitorogen社製)等が市販されている。セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)は、Clostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えばStrep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin（商標）やStreptavidine（商標）に選択的に結合させて精製することができる。ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドをいう。このヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。

これらのタンパク質は遺伝子組み換え技術を用いて組換え細胞内で発現させ、当業者に公知の方法に従って精製される。あるいは、無細胞タンパク質合成系により、鋳型ＤＮＡから所望の融合タンパク質を合成することもできる。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系であり、上記細胞抽出液としては、リボゾーム、ｔ−ＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む、従来より公知の真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。好ましくは小麦胚芽や大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）又は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い合成量を得る点において好ましい。この大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌A19（rna, met）, BL21, BL21 star, BL21 codon plus株等から公知の方法（Pratt, J.M. et al., Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggins, S.J.編、IRL Press, Oxford参照）に従って調製でき、又はPromega社、Novagen社又はRoche社から市販されるものを使用してもよい。無細胞タンパク質合成系には、バッチ法、フロー法の他、従来公知の技術がいずれも適用可能であり、例えば限外濾過膜法や透析膜法、樹脂に翻訳鋳型を固定化したカラムクロマト法等（Spirin, A.ら、Meth. In Enzymol. ２１７巻、１２３〜１４２頁、１９９３年参照）を挙げることができる。

第３に、前記目的タンパク質と候補化合物との複合体を回収する。固相担体から前記複合体を脱着させる場合は、複合体を形成するタンパク質とリガンドとの結合を壊さないような緩和な条件で行うことが必要である。例えば、ヒスチジンタグを用いた場合にはイミダゾールバッファーを、ＧＳＴ融合タンパク質の場合はグルタチオンを用いて前記複合体を溶出することができる。

（質量分析法）
質量分析法（ＭＳ）は、イオン化された分析物を気相で測定する方法であり、イオン源、イオン化された分析物の質量対電荷比(m/z)を測定する質量分析部、及びそれぞれのm/z値におけるイオンの数を記録するイオン検出部からなる。タンパク質やペプチド等の試料をイオン化するために最も一般的に用いられる技術として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）及びマトリクス支援レーザー脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）がある。ＥＳＩは溶液状の試料から分析物をイオン化させる方法であり、クロマトグラフィーや電気泳動などの分離手段と組み合わせて分析することができる。ＭＡＬＤＩは、乾燥した結晶性のマトリクスからなる試料をレーザーパルスによって昇華及びイオン化する。

質量分析部は、この分析法の中心となる技術であって、選択された質量対電荷比(m/z)内においてイオンを分離する。分析データの感度や分解能、質量の正確さやマススペクトルデータから得られる情報の豊富さに重要な役割を果たしている。イオンの分離方法としては、現在、６種類の基本的なタイプに分類することができ、それらは、磁場型、電場型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、四重極型、及びフーリエ変換サイクロトロン型である。これらはそれぞれ長所と短所があり、単独で又は互いに連結して用いることができる。

ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩは通常、それぞれ四重極及びＴＯＦ質量分析部が用いられる。質量分析の途中で試料を断片化し、断片化されたイオンを分析するタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）分析法も用いられている。本発明の方法を実施するためには上記いずれの質量分析法を用いてもよく、当業者であればこれらと実質的に同一か又は類似の方法により本発明の方法を実施することができるであろう。

（データ解析）
マススペクトルデータ処理の際、次の点に考慮してデータ処理を行う。
１）スペクトル間の補正
質量分析測定を行う際のサンプル導入、イオン化装置、検出器等の測定間誤差を補正するためサンプル中に一定量の内部標準物質を入れる。内部標準物質としてはマススペクトル上で検出できるものであればどのようなものでもよいが、例えば、ｉＰＤ１、レセルピン、ロイシンエンケファリンなどがあげられる。

２）プルダウンアッセイ時の操作誤差
溶出してきたタンパク質の分子量関連イオンを基準にして、サンプル毎にピーク面積値の補正を行う。

３）各ペプチドにおけるイオン化効率の違い
通常、物質のイオン化効率は、その性質に大きく由来し、それぞれにおいて異なるため、同じ濃度の複数の候補化合物を混合しても、それぞれ同じイオン量は得られない。また、候補化合物を混合することで、イオン化の抑制が起こることもある。これらにより、実際はタンパク質と相互作用していない候補化合物においても、それ自身のイオン化効率が良い場合、マススペクトル上でイオンが強く観測されてしまう。その為、その候補化合物とタンパク質との相互作用があると判断するおそれがある。そこで、各候補化合物のイオン化効率をあらかじめ測定しておき、この値に基づいて、プルダウンアッセイ後に検出される各候補化合物のイオン化量を補正する。各候補化合物のイオン化効率は、それぞれ単独で、又は２種以上の候補化合物の混合物を質量分析することにより測定することができる。イオン化効率は、候補化合物間の相対的な比率で表すこともできる。
上記１）〜３）の補正は、それぞれ単独で、あるいは任意に組み合わせて行うこともできるが、好ましくは上記１）〜３）の補正をすべて組み合わせて行う。例えば、図５を参照して説明すると、図５（Ａ）は、ヒスチジンタグＳＨ２ドメインと３種類のペプチドを用いて行ったスクリーニングの結果を補正なしで示した結果である。低濃度のペプチド混合物を用いた場合にはＳＨ３Ｌペプチドがより多く結合し、ペプチド混合物の濃度が大きくなるに従ってｐＴｙｒペプチドの見かけの結合量が増えてくることがわかる。ところが、内部標準物質とイオン化効率で補正した場合（Ｃ）及びさらにタンパク質量の補正を行った場合（Ｄ）にはｐＴｙｒペプチドの結合量のみが用量依存的に増加しており、ＳＨ２ドメインに対する真のリガンド化合物であることが強く推測される。

以下の実施例では、ドメインタンパク質ＳＨ２、ＳＨ３と、それに対するスクリーニング対象化合物（候補化合物）として相互作用既知のペプチド混合物とを用いたモデルシステムにより本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。

［実施例１］試料調製
プルダウンアッセイに用いるタンパク質は、ヒスチジンタグ付きタンパク質として調製した。ＳＨ３ドメインとしては、ヒトホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（PI3K）のｐ８５αサブユニット（Ｎ末端の１〜８５アミノ酸残基、分子量９．６ｋＤａ）を、ＳＨ２ドメインとしてはヒトＧｒｂ２タンパク質のＳＨ２ドメイン（Ｎ末端から５５〜１６０アミノ酸残基、分子量１１．８ｋＤａ）をそれぞれコードする塩基配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、発現ベクターｐＥＴ１９ｂ（Novagen社）に組み込んだ。ヒスチジンタグ付きＳＨ２及びＳＨ３のアミノ酸配列は以下のとおりである。

ヒスタグ付きSH3 PI3K 1-85（配列番号１）
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMLEMSAEGYQYRALYDYKKEREEDIDLHLGDILTVNKGSLVALGFSDGQEARPEEIGWLNGYNETTGERGDFPGTYVEYIGRKKISPP
ヒスタグ付きSH2 Grb2 55-160（配列番号２）
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMLEMKPHPWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIEQVPQQPTY

このようにして構築した発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で培養を行った。培養液の光学密度(OD₆₀₀)が０．６〜０．７付近に達した時に、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、ヒスチジンタグタンパク質の発現を誘導した。誘導開始６時間後の培地から約０．８グラムの菌体を回収した。この菌体を２ｍｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐＨ７．５）に懸濁し、さらに７ｍｌのCelLytic B BACTERIAL CELL LYSIS EXTRACTION REAGENT (SIGMA)と７μｌの５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを加え、室温で２０分間振とうすることで菌体を可溶化した。可溶化液を４℃で２０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離し、可溶性画分を回収した。

遠心分離で得られた可溶性画分を０．２２μｍフィルターでろ過し、HisTrap^TM Chelating column １ｍｌ(Amersham Pharmacia Biotech)に吸着させた。洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄し、その後、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び５００ｍＭイミダゾール）で目的のヒスチジンタグタンパク質をカラムから溶出させた。溶出したヒスチジンタグタンパク質は緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮａＣｌ）に透析した後、Resource Q1 column (Amersham Pharmacia Biotech) と緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０〜７００ｍＭのＮａＣｌグラジエント）で精製を行った。

候補化合物としては、以下の３種類のペプチドをペプチド自動合成装置、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）を用いてＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ法で合成した。ＳＨ３ドメインと相互作用するものとして、プロリンを含む９残基ペプチド（ＳＨ３Ｌと略）を、ＳＨ２ドメインに対しては、リン酸化チロシンを含む１３残基ペプチド(ｐＴｙｒと略)を用いた。さらにネガティブコントロールとしてｐＴｙｒが脱リン酸化されたペプチド（Ｔｙｒと略）を用いた。

ＳＨ３Ｌ；RKLPPRPAF（配列番号３；９アミノ酸残基, 1080.656 Da）
ｐＴｙｒ；PVPEpYINQSVPKR（配列番号４：１３アミノ酸残基、1064-1076 of EGFR, 1605.792 Da）
Ｔｙｒ；PVPEYINQSVPKR（配列番号５；１３アミノ酸残基、1064-1076 of EGFR, 1526.756 Da）

［実施例２］スクリーニング
（１）プルダウンアッセイ
１５０ｐｍｏｌのタグ付きタンパク質に対し、添加するペプチド混合物の量を７５、１５０、及び３００ｐｍｏｌと変化させて、プルダウンアッセイを行った。

ヒスチジンタグタンパク質を用いた系
３０％Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲルのスラリー１０μｌを８連ＰＣＲチューブに分注した。これに１５０ｐｍｏｌ量のHis-tagタンパク質と７５、１５０、及び３００ｐｍｏｌの各濃度のペプチド混合物を加え、室温で３０分〜６０分インキュベートした。その後、ゲルを遠心して沈殿させ、上澄みを除去した。続いて、１００μｌの洗浄バッファー（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）を加え、ゲルを洗浄して過剰のペプチドを除去した。この操作を２回行った。最後に、１０μｌの溶出バッファー（５００ｍＭイミダゾールを含む洗浄バッファー）を加え、タンパク質‐ペプチド複合体をゲルから溶出した。

（２）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定
プルダウンアッセイで得られた溶出液をZipTip c18で脱塩し、２０μｌの５０％アセトニトリル、０．１％酢酸溶液で溶出した。この溶出液に等量の２μＭのｉＰＤ１（内部標準物質）を加え、２μｌをマニュアルインジェクターを用いてＬＣ−ＥＳＩ−質量分析装置；ＱＳＴＡＲ(ESI-q-TOF、Applied Biosystems社）にインジェクトし、ＥＳＩ−ＭＳで測定を行った。ＨＰＬＣ条件は流速;１５μｌ／ｍｉｎ、アイソクラティック、使用溶媒は５０％アセトニトリル、０．１％酢酸、サンプルインジェクト量は２μｌ、ＭＳ測定条件は質量範囲; m/z ２００〜２０００、ポジティブモードで行った。

なお、あらかじめ等モル濃度になるよう調製したペプチド混合物のマススペクトルを測定し、各々のイオン化効率を求めた。すなわち、ＳＨ３Ｌ、Ｔｙｒ、ｐＴｙｒはそれぞれ２μＭ、内部標準は１μＭになるように、５０％アセトニトリル、０．１％酢酸溶液を作製し、上記と同様の方法によりＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定を行った。その結果図１に示したようなペプチド混合物のマススペクトルが得られた。各ペプチドのマススペクトルからピーク面積値の平均を求め（ｎ＝４）、イオン化効率を計算すると、ＳＨ３Ｌ：Ｔｙｒ：ｐＴｙｒ＝１１：１．５：１となることがわかった（図２）。

（３）データ解析
得られたマススペクトルのデータ処理は次の手順で行った。図３（Ａ）は、ヒスチジンタグＳＨ２ドメインとペプチド混合物を用いてプルダウンアッセイを行い、溶出した試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ測定結果をＴＩＣ(total ion chromatogram)で表したものである。各ピークは左からそれぞれ７５、１５０、及び３００ｐｍｏｌのペプチド混合物を用いた場合の結果である。このＴＩＣの各ピークから、各々のイオンピークのクロマトグラムを抽出した。そのいくつかの例を図３（Ｂ）に示した（ａ）はＳＨ３Ｌ（Ｍ＋３Ｈ）^３＋のピーク面積(XIC of m/z 361.2)、（ｂ）はＴｙｒ（Ｍ＋２Ｈ）^２＋のピーク面積(XIC of m/z 509.6)、（ｃ）はｐＴｙｒ（Ｍ＋２Ｈ）^２＋のピーク面積(XIC of m/z 803.9)である。ＸＩＣ(extracted ion chromatogram)の抽出条件は、幅０．５ａｍｕである。
得られたイオンピーククロマトグラムより、Ｔｙｒ、ＳＨ３Ｌの場合は２価と３価のイオン量の和を求め、ｐＴｙｒの場合は、２価イオンのみの量を求めた（ｐＴｙｒは２価イオンしか検出されなかったため）。続いて、以下のように補正を行い、その相対値を図４に示した。
補正値＝各々のイオン量／（内部標準量×タンパク質イオン量×イオン化効率）

図４（Ａ）は、目的タンパク質としてヒスチジンタグＳＨ２を用いた場合の、図４（Ｂ）は、ヒスチジンタグＳＨ３についての補正後のスクリーニング結果をそれぞれ示した。図４（Ａ）よりＳＨ２ドメインに結合するペプチドは、３種類の中でｐＴｙｒが最も多く、ペプチド混合物の量に従って増加することがわかる。一方、図４（Ｂ）より、ＳＨ３ドメインに結合するペプチドはＳＨ３Ｌが最も多いことがわかる。参考のため、ヒスチジンタグＳＨ２ドメインを用いて行った実験結果について、マススペクトルデータの補正をしない場合と、種々の補正を行った場合とを比較した結果を図５に示した。

［参考例］表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いた相互作用の確認
スクリーニングで相互作用が示されたペプチドとタンパク質において、実際に有意な相互作用があるかどうかを確認するため、ＳＰＲを用いて相互作用の確認を行った。表面プラズモン共鳴センサーとしてBIACORE-3000 (Biacore社）を用い、ヒスチジンタグタンパク質（ＳＨ２およびＳＨ３）と各ペプチドとの相互作用を確認した。

ヒスチジンタグＳＨ２及びＳＨ３をＮｉ−ＮＴＡセンサーチップに固定化し、各ペプチドとの結合の有無を調べたところ、ＳＨ２ドメインに対してはｐＴｙｒが、ＳＨ３ドメインに対してはＳＨ３Ｌが、相互作用していることが確認された。また、他のペプチドとの結合は見られず、ヒスチジンタグタンパク質の固定されていないブランクフローセルでも相互作用は見られなかった。

図６は、ヒスチジンタグＳＨ２とｐＴｙｒペプチドとの相互作用の解析例を示す。流したペプチドの（ｐＴｙｒ）の濃度は下から０．５、１、５、１０、及び２０μＭで、それぞれのセンサーグラムを重ねて表示した。さらに、濃度依存的な実験からＫｄ値を求めたところ、ＳＨ２ドメインについては０．９μＭ、ＳＨ３ドメインについては１．３μＭであった。

実施例で用いたペプチド混合物のマススペクトルである。実施例で用いた各種ペプチドのイオン化効率の比を表したグラフである。（Ａ）実施例２で測定した質量分析(LC-ESI-MS)の結果をＴＩＣ(Total ion chromatogram)で表した結果である。３つのピークはペプチド混合物の濃度を変えて行った実験結果を示し、左から７５ｐｍｏｌ、１５０ｐｍｏｌ、及び３００ｐｍｏｌのペプチド混合物を用いた結果である。（Ｂ）（Ａ）に示したＴＩＣより各ペプチドピーク面積を抽出して示したものである。抽出したペプチドは上から順に、ＳＨ３Ｌの３価イオンピーク、Ｔｙｒの２価イオンピーク、ｐＴｙｒの２価イオンピークに対するＸＩＣ(extracted ion chromatogram)、幅0.5 amuである。（Ａ）は、ヒスタグＳＨ２タンパク質のスクリーニング結果である。（Ｂ）は、ヒスタグＳＨ３タンパク質のスクリーニング結果である。いずれも、ＳＨ３及びＴｙｒペプチドについては２価と３価のイオン量の和を求め、ｐＴｙｒについては２価のイオン量のみを求めた。ヒスタグＳＨ２タンパク質のスクリーニング結果を、種々の方法により補正した結果を表示したものである。参考例で行ったヒスタグＳＨ２とｐＴｒｙペプチドの相互作用をＢＩＡＣＯＲＥ−３０００(Biacore社)で解析した結果である。

Claims

目的タンパク質と結合するリガンド化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）２種以上の候補化合物の質量分析を行い、各候補化合物のイオン化効率を測定する工程、
（ｂ）前記２種以上の候補化合物を含む混合物と目的タンパク質とを接触させる工程、
（ｃ）前記目的タンパク質と結合しない候補化合物を除去する工程、
（ｄ）前記目的タンパク質と候補化合物との複合体を回収する工程、
（ｅ）前記複合体の質量分析を行い、前記複合体に含まれる目的タンパク質、及び各候補化合物のイオン化量を測定する工程、そして
（ｆ）工程（ａ）及び（ｅ）の結果に基づいて前記複合体に含まれる各候補化合物量又はそれらの比率を計算する工程、
を含み、前記目的タンパク質と結合するリガンド化合物を同定することを特徴とするスクリーニング方法。
前記混合物中の候補化合物の濃度を変えて前記工程（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
前記混合物は、質量分析における内部標準物質を含み、そのイオン化量に基づいて、工程（ｅ）における前記各候補化合物のイオン化量を補正することを特徴とする請求項２に記載のスクリーニング方法。
前記目的タンパク質は、抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、核酸、及びレクチンからなる群より選択される何れかとの融合タンパク質として調製されることを特徴とする請求項１〜３何れか１項に記載のスクリーニング方法。
前記目的タンパク質は、ヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、又はストレプトアビジン結合ペプチドとの融合タンパク質として調製されることを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
前記目的タンパク質は、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として調製されることを特徴とする請求項４又は５に記載のスクリーニング方法。
工程（ｄ）で回収された複合体を、さらに逆相クロマトグラフィーで分離し、溶出された１又は２以上のフラクションについて質量分析することを特徴とする請求項１〜６何れか１項に記載のスクリーニング方法。
工程（ｅ）で測定された目的タンパク質のイオン化量に基づいて、各候補化合物のイオン化量を補正することを特徴とする請求項７に記載のスクリーニング方法。
前記質量分析がエレクトロスプレーイオン化法により行われることを特徴とする請求項１〜８何れか１項に記載のスクリーニング方法。