CN116375780B

CN116375780B - 一种用于识别gtp结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116375780B
Application number: CN202310647180.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡容; 李梦轩; 王智明; 徐静; 李雯雯; 谭静; 郭常川
Original assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University; Shandong University
Current assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University; Shandong University
Priority date: 2023-06-02
Filing date: 2023-06-02
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2043-06-02
Also published as: CN116375780A

Abstract

本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用。本发明基于GTP的结构连接较小的光亲和侧链修饰，开发了一种新型的用于检测GTP结合蛋白的小分子活性探针，该探针可以在细胞裂解液中有效标记GTP结合蛋白用于高通量的蛋白质组学分析，并对探针的结合位点进行鉴别和分析，还可用于GTP竞争型抑制剂的作用位点分析，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

GTP蛋白即鸟苷三磷酸结合蛋白，在许多生命基础活动中都起着重要作用，包括细胞信号转导、细胞内搬运以及细胞的增殖、分化和凋亡等。G蛋白是一类在细胞信号转导过程中起着分子开关作用的GTP结合蛋白，其突变或活性的失调通常伴随着疾病的发生，例如在多种恶性肿瘤中均检测到的因突变而一直处于激活状态的小G蛋白KRAS。G蛋白的作用涉及多种信号通路，如受上游的表皮生长因子受体、G蛋白偶联受体调控，和参与下游的cAMP信号通路、MAPK通路等，对基因表达、转录和细胞的增殖等都有重要作用。鉴于G蛋白的枢纽作用，针对G蛋白的活性分析和机制研究具有非常重要的意义。

目前用于检测G蛋白活性的方法主要有以下两种：一是使用能选择性结合活性状态G蛋白的效应蛋白，来进行免疫沉降和蛋白免疫印迹分析；二是通过定量分析在GTP水解过程中产生的自由磷酸分子来估测G蛋白的酶活。前一种方法主要适用于判断特定G蛋白的活性，针对不同的G蛋白需要采用不同的蛋白和抗体进行免疫沉降分析，成本较高且无法同时分析多种不同的G蛋白。后一种方法虽能够高通量地判断在不同条件或者药物处理下G蛋白的酶活性，却无法从蛋白混合液中分辨出检测到的活性相对应的G蛋白。

基于活性的蛋白质组学方法通过利用具有反应活性的小分子探针，从复杂的生物样品中选择性地共价标记探针的靶蛋白，进而富集靶蛋白并使用质谱来分析鉴定。发明人发现，目前已报道了不同的GTP探针，通过荧光或者质谱的方式来检测探针与G蛋白的相互作用。已报道的探针或标记效率不高、不适用于高通量筛选和结合位点分析；或反应活性过高导致非特异性标记较多，且探针稳定性较差。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用。本发明基于GTP的结构连接较小的光亲和侧链修饰，开发了一种新型的用于检测GTP结合蛋白的小分子活性探针，该探针可以在细胞裂解液中有效标记GTP结合蛋白用于高通量的蛋白质组学分析，并对探针的结合位点进行鉴别和分析，还可用于GTP竞争型抑制剂的作用位点分析。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针，所述光亲和探针具有如下结构式：

。

在本发明中，上述光亲和探针命名为GTP-N探针。

本发明设计上述GTP光亲和探针（GTP-N探针），含有结合基团GTP、光亲和基团双吖丙啶和生物正交基团炔基。其中，光亲和基团可以在紫外照射条件下形成卡宾，插入到氨基酸的N-H键、O-H键、C-H键之间，形成共价连接。炔基可以和叠氮化合物进行点击化学反应，连接荧光基团（如罗丹明）或生物素基团（如生物素-DADPS-叠氮，CAS：1260247-50-4），用于荧光成像或亲和富集等。此外，通过能够酸性裂解的磷酰胺键连接GTP与修饰基团，在标记蛋白后能将探针中分子量较大的GTP部分解离，减小探针修饰带来的分子量变化，便于通过质谱进行修饰位点分析。本发明通过试验验证，上述GTP光亲和探针具有共价捕获GTP结合蛋白用于后续分析的能力。

本发明的第二个方面，提供上述光亲和探针的制备方法，所述制备方法包括如下合成路线：

。

具体的，所述制备方法包括：将1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺（EDC）加入鸟苷三磷酸二钠盐的二甲基甲酰胺水溶液中，避光搅拌处理7分钟；然后取3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶加入体系中继续搅拌反应4-5小时，使用氯仿萃取反应2-3次，水相转移至离心管中，加入氯化钠溶解，加入无水乙醇，低温过夜沉淀；离心弃去上清，得到固体使用C18柱进行分离纯化。分离纯化具体条件为：流动相A为50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流动相B为含30%乙腈的50 mM三乙胺乙酸盐溶液，并调整流动相pH为8，流速为2 mL/min，检测波长为252nm，柱温为25℃；梯度洗脱条件：0-5分钟，5% B；5-10分钟，5-30% B；10-37分钟，30-34.5%B；37-42分钟，34.5-100%B；42-47分钟，100%B；47-52分钟，100-5%B；52-57分钟，5%B；分别收集各保留时间下的各组分，冻干后通过质谱测试确定GTP-N探针在保留时间28-30分钟，11%乙腈处出峰。收集合并该部分纯品后冻干即得。

其中，1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺、鸟苷三磷酸的二钠盐、3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶的摩尔比为0.3-0.8:0.05-0.2:0.05-0.2；优选为0.5:0.1:0.11。

本发明的第三个方面，提供一种检测试剂盒，所述试剂盒至少包含上述光亲和探针。优选的，所述检测试剂盒还可以包含其他任意试剂（如反应增强剂、酶试剂、缓冲液、清洗液）等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂为氯化镁，较低浓度（0.05-2.5 mM）氯化镁条件下能够有效增强探针的标记。

本发明的第四个方面，提供上述光亲和探针或检测试剂盒在GTP结合蛋白相关研究中的应用。

具体的，所述GTP结合蛋白相关研究至少包括：

（a）细胞裂解液中GTP结合蛋白的蛋白质谱分析；

（b）纯化后的GTP结合蛋白的标记分析；

（c）G蛋白抑制剂的分析。

其中，所述应用（a）的具体方法包括：

将上述光亲和探针加入细胞裂解液（具体为HEK 293T细胞裂解液）并进行紫外照射（UV_365nm）后，与生物素-DADPS-叠氮（CAS：1260247-50-4）进行点击化学反应，然后在酸性条件下裂解，从而减小对肽段修饰的分子量，以便进行更准确的基于质谱的修饰位点分析；具体的，使用高分辨液质联用（LC-MS/MS）对探针标记到的蛋白（具体为On-Beads酶解法制备肽段样品）进行了检测分析，使用MaxQuant软件对得到的质谱数据进行肽段归属，使用DAVID网站进行GO分析。

其中，LC-MS/MS具体参数条件包括：

使用nLC Easy 1200液相串联Q-Exactive Orbitrap质谱进行检测。使用纳升液相C18毛细管色谱柱，分析柱填料粒径3 μm，柱子内径75 μm，柱长18 cm，预柱填料粒径5 μm，柱子内径150 μm，柱长4 cm，流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为含80%乙腈的0.1%甲酸溶液，流速为300 nL/min。梯度洗脱条件：0-5分钟，5-10% B；5-140分钟，10-35% B；140-145分钟，35-55% B；145-146分钟，55-88% B；146-156分钟，88-99%B；156-181min，99%B。

Q-Exactive采用正离子检测模式，质谱喷雾电压为2.1 kV，离子传输管温度为275℃，进行一级全扫描和TopN为20的二级扫描，扫描m/z范围为350-1800。一级扫描分辨率为70000，动态增益控制1×10⁶个离子，最大注入时间为50 ms，二级扫描分辨率17500，动态增益控制5×10⁴个离子，最大注入时间为50 ms，隔离宽度为2m/z，标准化碰撞能量为28、29、30。

所述应用（b）中，所述GTP结合蛋白为KRAS蛋白，其至少包括：对KRAS蛋白荧光凝胶成像分析；KRAS蛋白的完整分子量检测；以及对KRAS蛋白的胶内酶解修饰位点的检测。

所述应用（c）中，所述G蛋白抑制剂为EHT 1864；

具体的，所述应用（c）为对G蛋白抑制剂的潜在靶蛋白的分析与鉴定。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案基于GTP的结构连接较小的光亲和侧链修饰，开发了一种新型的用于检测GTP结合蛋白的小分子活性探针。该探针主要有以下三个优势：首先，使用最小化连接基团，降低修饰对GTP与蛋白结合的影响，更好地模拟GTP与蛋白的结合；其次，探针含有的用于生物正交反应的炔基，可以和叠氮化合物进行点击化学反应，连接荧光基团罗丹明进行荧光凝胶成像或者连接生物素基团进行亲和富集和质谱检测；最后，通过能够酸性裂解的磷酰胺键连接GTP与修饰基团，在标记蛋白后能将探针中分子量较大的GTP部分解离，减小探针修饰带来的分子量变化，便于通过质谱进行修饰位点分析。

总之，上述探针可以在细胞裂解液中有效标记GTP结合蛋白用于高通量的蛋白质组学分析，并对探针的结合位点进行鉴别和分析，还可用于GTP竞争型抑制剂的作用位点分析，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明探针的结构；(a)为GTP-O探针；(b)为GTP-N探针；(c)为GTP对照探针。

图2为本发明探针的设计；(a)表示GTP-O探针与GTP-N探针均含有结合基团GTP、光亲和基团双吖丙啶和生物正交基团炔基；(b)表示炔基和叠氮化合物进行点击化学反应，连接罗丹明荧光基团或生物素基团；(c)表示基于光交联反应，光亲和基团可以在紫外照射条件下形成卡宾，插入到氨基酸的N-H键、O-H键、C-H键之间。

图3为本发明GTP-N探针酸性裂解基团设计。

图4为本发明探针在负离子模式下的一级质谱图。

图5为本发明探针在负离子模式下的二级质谱图。

图6为本发明通过液相色谱分析GTP-O探针三种pH条件下的稳定性。

图7为本发明通过液相色谱分析GTP-N探针三种pH条件下的稳定性。

图8为本发明对照探针使用1%三氟乙酸处理不同时间在负离子模式下的一级质谱。

图9为本发明不同标记条件对GTP-N探针标记效果的影响；(a)不同浓度探针的标记效果；(b)探针不同孵育时间的标记效果；(c)探针紫外照射不同时间的标记效果；(d)探针点击化学反应不同时间的标记效果。除图中标注条件外，使用探针浓度为50 μM，孵育时间为10分钟，紫外照射时间为30分钟，点击化学反应时间为2小时。

图10为本发明不同标记条件对探针标记效果的影响；(a)使用不同浓度镁离子时GTP-O探针的标记效果；(b)使用不同乙二胺四乙酸溶液处理条件时GTP-N探针的标记效果。除图中标注条件外，使用探针浓度为50 μM，孵育时间为10分钟，紫外照射时间为30分钟，点击化学反应时间为2小时。EDTA-NAP5指在使用NAP-5前加入乙二胺四乙酸溶液处理，NAP5-EDTA指在使用NAP-5后加入乙二胺四乙酸溶液处理。

图11为本发明不同探针标记的比较；(a)在加或不加1 mM GTP的情况下使用0.1mM GTP-O探针、GTP-N探针进行标记；(b)GTP-N探针、GTP对照探针的标记效果。除图中标注条件外，使用氯化镁浓度为1 mM，孵育时间为10分钟，紫外照射时间为30分钟，点击化学反应时间为2小时。

图12为本发明不同竞争剂对GTP-O探针标记效果的影响；(a)GTP、ATP对探针标记的竞争效果；(b)GTP、GDP、GMP对探针标记的竞争效果，星号代表特异性竞争条带。除图中标注条件外，使用探针浓度为50 μM，氯化镁浓度为1 mM，孵育时间为10分钟，紫外照射时间为30分钟，点击化学反应时间为2小时。

图13为本发明GTP-O探针标记的蛋白质谱分析；(a)韦恩图显示GTP-O探针在三次生物学重复中鉴定到的总蛋白；(b)韦恩图显示GTP-O探针在三次生物学重复中鉴定到的GTP结合蛋白；(c)GTP-O探针标记细胞裂解液三次生物学重复共同鉴定到的蛋白的GO分子功能分析。

图14为本发明GTP-N探针标记的蛋白质谱分析；(a)韦恩图显示GTP-N探针在三次生物学重复中鉴定到的总蛋白；(b)韦恩图显示GTP-N探针在三次生物学重复中鉴定到的GTP结合蛋白；(c)GTP-N探针标记细胞裂解液三次生物学重复共同鉴定到的蛋白的GO分子功能分析。

图15为本发明GTP-N探针和GTP对照探针鉴定到的蛋白数量及质谱检测强度比较；(a)韦恩图显示对照探针和GTP-N探针鉴定到的总蛋白比较；(b)韦恩图显示对照探针和GTP-N探针鉴定到的GTP结合蛋白比较；(c)对照探针和GTP-N探针共同标记到的总蛋白质谱检测强度比较。使用各蛋白的质谱检测信号强度比值（对照探针检测组/GTP-N探针检测组）。

图16为本发明非标记定量分析GTP对GTP-O探针及GTP-N探针的蛋白标记的竞争效果；(a)火山图显示GTP-O探针及GTP竞争探针标记的三次生物学重复的非标记定量分析结果；(b)火山图显示GTP-N探针及GTP竞争探针标记的三次生物学重复的非标记定量分析结果，标注了p值小于0.05的GTP结合蛋白的基因名；(c)在GTP竞争GTP-O探针标记中下调（比值<1）的蛋白的GO分子功能分析；(d)在GTP竞争GTP-N探针标记中下调（比值<1）的蛋白的GO分子功能分析。

图17为本发明GTP-O探针与GTP-N探针对蛋白标记结果比较；(a)韦恩图显示GTP-O探针和GTP-N探针在三次生物学重复中鉴定到的总蛋白；(b)韦恩图显示GTP-O探针和GTP-N探针在三次生物学重复中鉴定到的GTP结合蛋白；(c)火山图显示GTP-O探针及GTP-N探针三次生物学重复中共同鉴定到的蛋白的质谱检测强度定量结果。使用各蛋白的质谱检测信号强度比值（GTP-O探针检测组/GTP-N探针检测组），并取以2为底的对数值，X = 0左侧为该蛋白在使用GTP-N探针时检测强度更高，右侧为该蛋白在使用GTP-O探针时检测强度更高，黑色点代表已报道的GTP结合蛋白。

图18为本发明GTP结合蛋白EEF1A1的含探针修饰肽段二级质谱图。

图19为本发明GTP-N探针对GST-KRAS标记的荧光凝胶成像；(a)不同浓度GTP-N探针对GST-KRAS标记效果。使用氯化镁浓度为1 mM，探针孵育10分钟，紫外照射30分钟；(b)GTP-N探针对GST-KRAS和BSA的标记比较，使用探针浓度为26 μM，氯化镁浓度为1 mM，探针孵育10分钟，紫外照射30分钟；(c)GTP-N探针标记GST-KRAS及GTP竞争的荧光凝胶成像。使用蛋白量为5 μg，1 μM，探针浓度：蛋白浓度=1：5，使用氯化镁浓度为1 mM，探针孵育10分钟，紫外照射30分钟。

图20为本发明GST-KRAS的QTOF检测结果。

图21为本发明探针标记GST-KRAS的QTOF检测结果。

图22为本发明GST-KRAS含探针修饰肽段SYGIPFIETSAK的二级质谱图。

图23为本发明GST-KRAS含探针修饰肽段VEDAFYTLVR的二级质谱图。

图24为本发明使用EHT 1864竞争探针标记后蛋白的质谱检测强度变化热图；(a)使用EHT 1864竞争探针标记后总蛋白的检测强度变化；(b)使用EHT 1864竞争探针标记后GTP结合蛋白检测的强度变化；(c)使用EHT 1864竞争探针标记后检测强度总体呈下降趋势的蛋白的检测变化。使用质谱检测强度的比值（抑制剂竞争组/不加抑制剂探针组），并取以2为底的对数值作图；探针浓度为20 μM，EHT 1864的浓度为探针的1倍、2倍、5倍、10倍。

图25为本发明重要蛋白检测强度比值变化。注：探针浓度为20 μM，EHT 1864的浓度为探针的1倍、2倍、5倍、10倍；使用质谱检测强度的比值（抑制剂竞争组/不加抑制剂探针组）并取以2为底的对数，图中标注了具体数值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 新型GTP光亲和探针的设计与合成

1. 材料及方法

1.1 实验试剂

甲醇和乙腈（欧普森），二甲基甲酰胺（阿达玛斯），二甲基亚砜和四丁基氢氧化铵（西格玛-奥德里奇），三乙胺（通用试剂），盐酸、冰醋酸和氢氧化钠（国药），吡啶（吉至生化），阳离子交换树脂Dowex 50WX4 100-200 (H)（阿法埃莎），鸟苷三磷酸二钠盐（笛柏），3-(3-炔-1-丁基)-3-(2-碘乙基)-3H-双吖丙啶、3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶、5-己炔-1-胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、碳酸钠（毕得医药），氯化钠（泰坦），氯仿（铁塔），三氟乙酸（安耐吉），磷酸盐缓冲液（索莱宝）。

1.2 实验仪器

恒温磁力搅拌器（艾卡）、离心机（艾本德）、高效液相色谱仪（安捷伦1260）、质谱（赛默飞LCQ Fleet）、冷冻干燥机（北京四环冻干）、紫外可见分光光度计（岛津UV2600）、半制备柱（月旭Ultimate AQ-C18，5 μm，10×250 mm）、分析柱（月旭Ultimate XB- C18，5 μm，4.6×250 mm）、恒温金属浴（Mini H100）、核磁共振波谱仪（布鲁克）、pH计（赛多利斯）。

1.3 实验步骤

1.3.1 探针的合成与纯化

GTP-O探针：

使用阳离子交换树脂将鸟苷三磷酸二钠盐交换为GTP，并加入氢氧化四丁基铵至溶液呈中性，冻干后得到鸟苷三磷酸四丁基胺盐。在避光圆底烧瓶中，取GTP四丁基胺盐（0.1 mmol，76 mg，1个当量），加入二甲基亚砜0.64 mL，搅拌，向其中加入3-(3-炔-1-丁基)-3-(2-碘乙基)-3H-双吖丙啶（0.2 mmol，0.03 mL，2个当量），加入三乙胺（0.487 mmol，0.068 mL，4.87个当量）。室温下避光搅拌52小时。冻干反应液后溶于少量水，使用C18柱（月旭Ultimate AQ-C18，5 μm，10×250 mm）进行分离。流动相A为50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流动相B为含30%乙腈的50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流速为2 mL/min，检测波长为252 nm，柱温为25℃。梯度洗脱条件：0-5分钟，5% B；5-10分钟，5-30% B；10-46分钟，30-48% B；46-51分钟，48-100%B；51-61分钟，100%B；61-66分钟，100-5%B；66-71分钟，5%B。分别收集各保留时间下的各组分，冻干后通过质谱测试确定GTP-O探针在保留时间43-45分钟，14%乙腈处出峰。收集合并该部分纯品后冻干，得到白色固体。探针浓度由其水溶液在252 nm处的紫外吸收测定（消光系数ε = 13700 M^-1cm^-1），产率16.7%。探针分装冻存于-80℃。通过高分辨质谱，核磁共振和液相色谱分析来确定其结构和纯度。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.11 (s,1H), 5.91 (d,J= 6.1 Hz, 1H), 4.51 (dd,J= 5.2, 3.3 Hz, 1H), 4.35 – 4.29 (m,1H), 4.21 (dd,J= 5.5, 3.4 Hz, 2H), 3.77 (qd,J= 6.6, 2.2 Hz, 2H), 2.29 (t,J=2.7 Hz, 1H), 1.94 (td,J= 7.3, 2.6 Hz, 2H), 1.88 (s, 2H), 1.65 (td,J= 6.3, 2.7Hz, 2H), 1.59 (t,J= 7.2 Hz, 2H).³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ -11.43(dd,J= 17.8,9.2 Hz, 2P), -22.70 (t,J= 16.2 Hz, 1P).

GTP-N探针：

在避光条件下，圆底烧瓶中，取鸟苷三磷酸的二钠盐（0.1 mmol，56.7 mg，1个当量）溶于1 mL纯水中，另取一玻璃小瓶，将1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺（0.5 mmol，95.8 mg，5个当量）溶于1 mL纯水中。将1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺溶液加入至反应瓶中，25℃避光搅拌7分钟。取3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶（0.11 mmol，14.11 μL，1.1个当量）溶于2 mL二甲基甲酰胺中，加入至反应瓶中，25℃继续搅拌4.5小时。使用2 mL氯仿萃取反应三次，水相转移至离心管中，加入氯化钠0.2455 g溶解，加入30 mL无水乙醇，-20℃过夜沉淀。4℃离心10分钟，转速为4200 rpm，弃去上清，得到的白色固体加1.667mL水溶解后冻干得到白色粉末，溶于少量水中，使用C18柱（月旭Ultimate AQ-C18，5 μm，10×250 mm）进行分离纯化。流动相A为50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流动相B为含30%乙腈的50mM三乙胺乙酸盐溶液，并调整流动相pH为8，流速为2 mL/min，检测波长为252 nm，柱温为25℃。梯度洗脱条件：0-5分钟，5% B；5-10分钟，5-30% B；10-37分钟，30-34.5% B；37-42分钟，34.5-100%B；42-47分钟，100%B；47-52分钟，100-5%B；52-57分钟，5%B。分别收集各保留时间下的各组分，冻干后通过质谱测试确定GTP-N探针在保留时间28-30分钟，11% 乙腈处出峰。收集合并该部分非纯品后可通过半制备柱再次分离纯化，冻干，直至得到纯的探针为白色固体。探针浓度由其水溶液在252 nm处的紫外吸收测定（消光系数ε = 13700 M^-1cm^-1），产率32.3%。探针分装冻存于-80℃。通过高分辨质谱，核磁共振和液相色谱分析来确定其结构和纯度。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.11 (s, 1H), 5.90 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 4.52(dd,J= 5.2, 3.3 Hz, 1H), 4.32 (dt,J= 5.4, 2.6 Hz, 1H), 4.21 (dd,J= 5.6, 3.5Hz, 2H), 2.75 – 2.62 (m, 2H), 2.30 (t,J= 2.6 Hz, 1H), 1.93 (td,J= 7.3, 2.7Hz, 2H), 1.90 (s, 3H), 1.60 – 1.53 (m, 2H), 1.50 (t,J= 7.3 Hz, 2H).³¹P NMR(162 MHz, D₂O): δ -1.72 (d,J= 20.5 Hz, 1P), -11.49 (d,J= 19.4 Hz, 1P), -22.81(t,J= 19.8 Hz, 1P).

GTP对照探针：

在避光圆底烧瓶中，取鸟苷三磷酸的二钠盐（0.2 mmol，0.1134 g，1个当量）溶于2mL纯水中，另取一玻璃小瓶，将1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺（1 mmol，0.1917 g，5个当量）溶于2 mL纯水中。将1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺溶液加入至反应瓶中，避光搅拌7分钟。取5-己炔-1-胺（0.22 mmol，21.4 mg，1.1个当量）溶于4 mL二甲基甲酰胺中，加入至反应瓶中，继续搅拌4.5小时。使用4 mL氯仿萃取反应三次，水相转移至离心管中，加入氯化钠0.491 g溶解，加入60 mL无水乙醇，-20℃过夜沉淀。4℃离心10分钟，转速为4200 rpm，弃去上清，得到的白色固体加3.334 mL水溶解后冻干得到白色粉末，溶于少量水中，使用C18柱（月旭Ultimate AQ-C18，5 μm，10×250 mm）进行分离纯化。流动相A为50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流动相B为含30%乙腈的50 mM三乙胺乙酸盐溶液，并调整流动相pH为8，流速为2mL/min，检测波长为252 nm，柱温为25℃。梯度洗脱条件：0-5分钟，5% B；5-20分钟，5-15%B；20-45分钟，15-20% B；45-51分钟，20-22% B；51-56分钟，22-100%B；56-66分钟，100%B；66-71分钟，100-5%B；71-76分钟，5%B。分别收集各保留时间下的各组分，冻干后通过质谱测试确定GTP对照探针在保留时间44-46分钟，6.7% 乙腈处出峰。收集合并该部分纯品后冻干，得到白色固体。探针浓度由其水溶液在252 nm处的紫外吸收测定（消光系数ε = 13700M^-1cm^-1），产率9%。探针分装冻存于-80℃。通过质谱，核磁共振和液相色谱分析来确定其结构和纯度。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.01 (s, 1H), 5.79 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 4.42(dd,J= 5.1, 3.3 Hz, 1H), 4.25 – 4.18 (m, 1H), 4.10 (t,J= 4.5 Hz, 2H), 2.71(q,J= 7.3 Hz, 2H), 2.18 – 2.11 (m, 1H), 1.99 (td,J= 6.9, 2.6 Hz, 2H), 1.79(d,J= 0.8 Hz, 3H), 1.35 – 1.26 (m, 4H).³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ -1.07 (d,J=20.9 Hz, 1P), -11.57 (d,J= 19.2 Hz, 1P), -22.98 (t,J= 20.1 Hz, 1P).

1.3.2 探针稳定性实验

对GTP-O探针、GTP-N探针的稳定性研究主要选择了三种pH条件：含1%三氟乙酸的70%乙腈溶液（pH = 3）、磷酸盐缓冲液（pH = 7.4）和碳酸盐缓冲液（pH = 12）。使用探针终浓度为0.4 mM，在各溶液中37℃孵育不同时间，并于各时间点取出10 μL溶液，将pH调至中性后置于-20℃待液相检测。使用分析柱（月旭 Ultimate XB- C18，5 μm，4.6×250 mm）进行分析检测，并进样未经处理的探针作为对照。流动相A为50 mM三乙胺乙酸盐溶液，流动相B为含30%乙腈的50 mM三乙胺乙酸盐溶液，并调整流动相pH为8，流速为1 mL/min，检测波长为252 nm，柱温为30℃。梯度洗脱条件：0-5分钟，5% B；5-10分钟，5-30% B；10-30分钟，30-40% B；30-35分钟，40-100%B；35-40分钟，100%B；45-50min，5%B。使用GTP对照探针，分别在1%三氟乙酸溶液中孵育5分钟、30分钟后取出少量进行质谱检测。

2. 结果与讨论

通过将GTP与较小的修饰基团连接，合成了三种GTP探针（图1），GTP-O探针与GTP-N探针含有结合基团GTP、光亲和基团双吖丙啶和生物正交基团炔基；GTP对照探针含有结合基团GTP和生物正交基团炔基，不含光亲和基团。其中，光亲和基团可以在紫外照射条件下形成卡宾，插入到氨基酸的N-H键、O-H键、C-H键之间，形成共价连接；炔基可以和叠氮化合物进行点击化学反应，连接荧光基团或生物素基团，用于后续的荧光成像或亲和富集（图2）。而不含有光亲和基团的对照探针主要用于与光亲和探针进行对比，分析光亲和基团对蛋白标记的影响。

另外，根据可酸性裂解磷酰胺基团设计的GTP-N探针，在探针标记蛋白后能在酸性条件下断开分子量较大的GTP，结合使用含有可酸性裂解的硅氧基的生物素-DADPS-叠氮进行点击化学反应进行连接和富集，减小探针对肽段修饰分子量，以便进行更准确的基于质谱的修饰位点分析（图3）。

使用质谱对所合成的三种探针进行了表征，并对其二级离子进行了归属，验证了探针的结构（图4和图5）。在探针稳定性实验中，GTP-O探针在三种pH条件下24小时内均没有降解，说明该探针具有较好的稳定性（图6）。GTP-N探针在碱性、中性条件下24小时内较稳定，当使用三氟乙酸酸性条件0.5小时探针已经分解，24小时又进一步变化（图7）。使用对照探针在1%三氟乙酸溶液中孵育不同的时间，质谱测定其酸性条件下的解离产物。当对照探针在1%三氟乙酸溶液中孵育5分钟时，探针大部分未分解；当在1%三氟乙酸溶液中孵育30分钟时，探针几乎全部分解，通过质谱测定可以看到探针分解为GTP（图8）。说明GTP-N探针也具有较好的稳定性，同时在酸性条件下，能够解离释放出GTP，从而减小探针修饰带来的分子量变化，便于后续基于质谱的结合位点分析。

实施例2 光亲和探针标记用于细胞裂解液中GTP结合蛋白的荧光凝胶成像分析

1. 材料及方法

1.1 实验试剂

甲醇、冰醋酸、三乙醇胺（天津富宇），鸟苷三磷酸二钠盐、鸟苷二磷酸二钠盐、鸟苷单磷酸二钠盐（笛柏），氯化钠（泰坦），氯仿（铁塔），碳酸氢钠、罗丹明B-PEG₃-叠氮、三-(2-羧乙基)磷盐酸盐、硫酸铜、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺、溴酚蓝、β-巯基乙醇、苯甲基磺酰氟（毕得医药），4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠（皆为尔），Triton X-100（碧云天），氯化镁、异丙基硫代半乳糖苷（麦克林），四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺（鼎国），考马斯亮蓝R-250、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸酶抑制剂A、磷酸酶抑制剂B、蛋白酶抑制剂（艾默），布拉德福德试剂盒、BCA试剂盒（碧云天）。

1.2 实验仪器

移液枪、离心机（艾本德），恒温金属浴（Mini H100），NAP-5（安玛西亚），酶标仪、PCR扩增仪、电泳仪（伯乐），365 nm紫外灯（ZF-1），涡旋仪（艾卡），水平摇床（大龙），荧光成像仪（美国GE Amersham Imager 600），灭菌锅、超净台、摇床（山东博科），超声细胞破碎仪（新芝生物），亲和层析柱（碧云天），超滤管（默克密理博），pH计（赛多利斯），NanoDrop one（赛默飞世尔）。

1.3 实验步骤

探针标记HEK 293T细胞裂解液的荧光凝胶成像

取适量HEK 293T细胞，置于冰上融化后，使用细胞5-10倍体积的1%裂解液（1%Triton X-100，50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，150 mM氯化钠，pH = 7.4，使用前加入磷酸酶抑制剂A、磷酸酶抑制剂B、蛋白酶抑制剂）冰上裂解细胞30分钟，每10分钟涡旋5 s。4℃离心30分钟，转速为12000 rpm。取上清。向其中加入（或不加入）不同浓度的乙二胺四乙酸溶液（pH = 8）处理不同时间。将细胞裂解液使用NAP-5处理，除去内源性核苷酸小分子，得到的蛋白溶液使用Bradford法测蛋白浓度，各样品使用100 μg蛋白，使用0.1%裂解液（0.1%Triton X-100，50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，150 mM氯化钠，pH = 7.4，使用前加入磷酸酶抑制剂A、磷酸酶抑制剂B、蛋白酶抑制剂）稀释后，加入各条件下的不同处理试剂至指定浓度，如金属离子、探针、竞争剂等，并使体系终体积为100 μL，蛋白终浓度为1 μg/μL。冰上孵育后，使用365 nm紫外灯冰上照射，使光亲和基团双吖丙啶形成卡宾的结构并插入至氨基酸上形成共价连接。点击化学反应连接罗丹明B-PEG₃-叠氮，依次向体系中加入终浓度1 mM三-(2-羧乙基)磷盐酸盐，0.1 mM三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺的二甲基亚砜溶液，1 mM硫酸铜，0.1 mM 罗丹明B-PEG₃-叠氮的二甲基亚砜溶液，室温涡旋振荡后加入十倍体积冰甲醇过夜沉淀蛋白或使用4倍体积甲醇、1倍体积氯仿、三倍体积水沉淀蛋白。4℃离心30分钟，转速为12000 rpm。弃去上清，蛋白沉淀使用冰甲醇再次洗涤后离心留蛋白沉淀，洗两次。蛋白沉淀使用30 μL 4%十二烷基硫酸钠缓冲液（4%十二烷基硫酸钠，150 mM氯化钠，50 mM三乙醇胺，pH = 7.4）溶解后，使用BCA法测蛋白浓度，加入4×上样缓冲液（0.25M三羟甲基氨基甲烷，pH = 6.8，4%十二烷基硫酸钠，40%甘油，0.02%溴酚蓝，使用前每800 μL加入200 μL β-巯基乙醇），95℃加热5分钟，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（4%浓缩胶，10%分离胶），90 V恒压电泳110分钟左右。电泳结束后切下分离胶置于双蒸水中，使用AmershamImager 600进行荧光凝胶成像，选择激发光光源为520 nm。荧光凝胶成像后，使用考马斯亮蓝染色液（0.1% 考马斯亮蓝，10%冰醋酸，50%甲醇）对凝胶进行蛋白染色30分钟，并使用脱色液（10%冰醋酸，30%甲醇）脱去背景色。

2. 结果与讨论

2.1 探针标记条件的优化

为了达到较好的探针标记效果，比较了不同的探针标记条件，包括探针浓度、孵育时间、不同金属离子浓度、乙二胺四乙酸处理条件、紫外365 nm照射时间、点击化学反应时间。

荧光凝胶成像结果显示，使用不同浓度的探针进行标记时蛋白条带标记效果逐渐增强，进一步证明了探针标记的浓度依赖性，在探针浓度为50 μM时，能够有效且较强地对细胞裂解液进行标记（图9a）。探针标记效率随孵育时间的延长而稍有增加（图9b）。探针标记强度随着紫外365 nm照射时间延长而增强，在不进行紫外照射条件下探针标记条带较少且标记强度大大减弱，证明了光亲和探针标记的紫外依赖性，照射30分钟条件下探针能够对蛋白进行较强的标记（图9c）。不同点击化学反应时间对探针标记结果影响不大（图9d）。

GTP和蛋白的结合常常需要镁离子的参与，因此比较了不同浓度镁离子对探针标记的影响，发现在较低浓度（0.05-2.5 mM氯化镁）条件下能够有效增强探针的标记（图10a）；乙二胺四乙酸作为金属络合物可以和离子结合影响内源性GTP及探针和蛋白的结合效果，在实验中发现，在使用NAP-5处理细胞裂解液除去内源性核苷酸小分子之前或之后加入乙二胺四乙酸会降低探针的标记效果（图10b）。

最终选择探针孵育10分钟，不使用乙二胺四乙酸预处理细胞裂解液，氯化镁浓度为1 mM，紫外365 nm照射30分钟，点击化学反应2小时的条件进行探针标记细胞裂解液的实验。当进行荧光凝胶实验时，选择使用探针浓度为50 μM，在此浓度下已经能够呈现出清晰的荧光条带，当进行后续质谱检测实验时，可选择使用探针浓度为100 μM，在此浓度下探针标记效果较强，从而提升对肽段的质谱检测强度。

2.2 不同探针标记的比较

根据荧光凝胶成像分析，GTP-N探针对蛋白的标记强于GTP-O探针（图11a），对于不含有光亲和基团的对照探针，不能与蛋白进行光交联共价连接，仅能标记到较少条带，证明了探针的光亲和标记对蛋白标记的必要性（图11b）。

2.3 探针的竞争实验

为了验证探针标记的特异性，使用ATP、GTP、GDP、GMP进行了探针标记的竞争实验（图12）。在加入各竞争剂后冰上孵育10分钟，然后加入探针进行标记。荧光凝胶成像结果显示，使用GTP竞争时出现了明显的特异性竞争条带，而ATP、GMP对探针标记出现随浓度升高而增强的非特异性竞争，说明探针特异性较好，而对于GDP，出现了较GTP弱的竞争，是由于一些GTP结合蛋白也可以与GDP结合。

实施例3 光亲和探针标记用于细胞裂解液中GTP结合蛋白的蛋白质谱分析

在最佳探针标记条件下，通过GTP光亲和探针对HEK 293T细胞裂解液进行标记，使用高分辨液质联用对探针标记到的蛋白进行了检测分析，根据GTP对探针标记蛋白的竞争作用，验证了探针对GTP结合蛋白标记的特异性。

1. 材料及方法

1.1 实验试剂

硫酸铜、碳酸氢铵、碘乙酰胺（毕得医药），Triton X-100（碧云天），氯化镁（麦克林），甲醇、三乙醇胺、冰醋酸（天津富宇），氯仿（铁塔），甲酸、乙腈（赛默飞世尔），十二烷基硫酸钠、三-(2-羧乙基)磷盐酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、尿素（皆为尔），四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺（鼎国），考马斯亮蓝R-250、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（索莱宝），生物素-PEG₃-叠氮、生物素-DADPS-叠氮（乐研）、胰酶、链霉亲和素微珠（赛默飞世尔），磷酸酶抑制剂A、磷酸酶抑制剂B、蛋白酶抑制剂（艾默），布拉德福德试剂盒、BCA试剂盒（碧云天），1×磷酸盐缓冲液、10×磷酸盐缓冲液（索莱宝）。

1.2 实验仪器

离心浓缩仪（艾本德），超滤管（默克密理博），MAbPac RP柱（赛默飞世尔，4 μm，3×50 mm），NAP-5（GE），紫外365 nm灯管，0.22 μm滤膜（艾杰尔），恒温金属浴（Mini H100），UPLC 3000、C18 tip、nLC Easy 1200液相、Q-Exactive Orbitrap质谱、旋转摇床（赛默飞世尔），Maxis Ⅱ QTOF质谱（布鲁克），超声波清洗仪（山东博科），酶标仪、电泳仪（Bio-Rad），涡旋仪（IKA），水平摇床（大龙），pH计（赛多利斯）。

1.3 实验步骤

1.3.1 通过On-Beads酶解法制备探针标记HEK 293T细胞裂解液质谱样品

使用优化后的标记条件对HEK 293T细胞裂解液进行标记，基于On-Beads酶解法制备肽段样品，进行蛋白质组学研究。使用0.1 mM探针标记1 mg细胞裂解液及紫外照射后，进行点击化学反应连接生物素-叠氮，依次向体系中加入终浓度1 mM三-(2-羧乙基)磷盐酸盐，0.1 mM三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺的二甲基亚砜溶液，1 mM硫酸铜，0.5mM生物素-PEG₃-叠氮（GTP-O探针标记样品使用）或0.5 mM生物素-DADPS-叠氮（GTP-N探针标记样品使用）的二甲基亚砜溶液，室温涡旋振荡2小时后，冰甲醇过夜沉淀蛋白。

蛋白沉淀使用100 μL 4%十二烷基硫酸钠缓冲液（4%十二烷基硫酸钠，150 mM氯化钠，50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH = 7.4）彻底溶解后，加入900 μL稀释缓冲液（150 mM氯化钠，50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH = 7.4）稀释十二烷基硫酸钠。另取链霉亲和素微珠每样品50 μL，使用前用20倍体积稀释缓冲液（150 mM氯化钠，50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH = 7.4）洗三次离心弃去上清液，再加入至样品中。室温下旋转摇床上结合2小时。使用离心过滤柱洗去非特异结合蛋白，分别使用1%十二烷基硫酸钠的1×磷酸盐溶液（pH = 7.4）、10×磷酸盐（pH = 7.4）、1×磷酸盐（pH = 7.4）洗涤，各溶液洗涤时每次使用1 mL，连续洗五次。最后使用含8 M尿素的50 mM碳酸氢铵溶液转移出微珠，共500 μL重悬微珠。加入终浓度20 mM三-(2-羧乙基)磷盐酸盐进行二硫键的还原，37℃反应1小时。加入终浓度50 mM 碘乙酰胺进行烷基化，室温避光反应30分钟。离心2min，转速为3000 rpm，轻轻吸取上清溶液弃去，并加入25 mM碳酸氢铵溶液重悬微珠后再次离心弃去上清溶液，交换溶液三次后，重悬微珠于100 μL 25 mM碳酸氢铵溶液中，加入1 μL胰酶（1 μg/μL），37℃酶解18小时。

各样品中加入200 μL 25 mM碳酸氢铵溶液重悬微珠，离心2分钟，转速为12000rpm，轻轻吸取上清溶液，并重悬6次合并得到①号样品（不含有探针修饰的游离肽段部分）。对于GTP-O探针标记的样品，微珠使用含1%三氟乙酸的70%乙腈溶液200 μL重悬并涡旋5分钟，离心2分钟，转速为12000 rpm，轻轻吸取上清溶液，并重悬5次合并得到②号样品。对于GTP-N探针，使用含有可酸性断裂的硅氧键的生物素-DADPS-叠氮（CAS：1260247-50-4）进行点击化学反应，从而减小对肽段修饰的分子量，以便进行更准确的基于质谱的修饰位点分析。对于此类样品，在制备②号样品（含有探针修饰的肽段部分）时，使用100 μL 10%甲酸重悬微珠，并在旋转摇床上使微珠能够悬浮于溶液中，室温下旋转30分钟后离心2分钟，转速为12000 rpm，轻轻吸取上清溶液，再次加入100 μL 10%甲酸重悬微珠，室温下旋转30分钟后离心取出上清溶液合并，并再次加入100 μL 10%甲酸重悬微珠离心合并，该含有探针修饰的肽段溶液补加三氟乙酸至终浓度为1%，在37℃孵育30分钟使脱去GTP。肽段溶液离心浓缩后使用C18 tip除盐，冻存于-80℃直至LC-MS/MS检测。样品均溶解于20 μL纯水中，①号样品进样量4 μL，②号样品进样量8 μL。

1.3.2 LC-MS/MS检测方法和数据分析

使用nLC Easy 1200液相串联Q-Exactive Orbitrap质谱进行检测。使用自制备纳升液相C18毛细管色谱柱，分析柱填料为Reprosil-Pur120 C18-AQ （德国迈克），粒径3 μm，柱子内径75 μm，柱长18 cm，预柱填料为Reprosil-Pur120 C18-AQ （德国迈克），粒径5 μm，柱子内径150 μm，柱长4 cm，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含80%乙腈的0.1%甲酸，流速为300 nL/min。梯度洗脱条件：0-5分钟，5-10% B；5-140分钟，10-35% B；140-145分钟，35-55%B；145-146分钟，55-88% B；146-156分钟，88-99%B；156-181min，99%B。

通过MaxQuant (v2.1.4.0)软件对获取的MS原始文件进行分析，并根据Uniprot人类蛋白组数据库（2022年11月，总蛋白20401个）搜库。酶特异性设置为胰蛋白酶。半胱氨酸氨基甲基化被设定为固定修饰，蛋氨酸氧化和氮端乙酰化被设定为可变修饰。为了鉴定探针修饰位点，对双吖丙啶有标记偏好的氨基酸YECDHKS添加了脱去GTP的N探针修饰（+252.1950 Da）作为可变修饰。

2. 结果与讨论

使用0.1 mM的GTP探针对HEK 293T细胞裂解液进行标记，并使用On-Beads酶解法制备肽段样品进行LC-MS/MS检测。使用MaxQuant软件对得到的质谱数据进行肽段归属，使用DAVID网站进行GO分析。使用10倍探针浓度的GTP作为竞争剂，与不含竞争剂的样品作为对照，进行探针标记的非标记定量分析。

2.1 GTP-O探针标记HEK 293T细胞裂解液的蛋白质谱分析

对于GTP-O探针，在三次生物学重复中均能鉴定到超过2000个蛋白，其中有1808个蛋白被重复鉴定到，有95个GTP结合蛋白在三次生物学重复中均被检测到（图13a和图13b）。使用DAVID网站对三次生物学重复中共同鉴定到的总蛋白进行GO分析，显示其分子功能涉及GTP结合、GTP酶活性、小G蛋白结合等（图13c），参与翻译起始及调控、囊泡运输、细胞内蛋白质转运等生物过程，证明了GTP-O探针能够特异性的富集到GTP结合相关蛋白。

2.2 GTP-N探针标记HEK 293T细胞裂解液的蛋白质谱分析

对于GTP-N探针，在三次生物学重复中均能鉴定到2800个以上的总蛋白，其中有2461个蛋白被重复鉴定到，有115个GTP结合蛋白在三次生物学重复中均被检测到（图14a和图14b）。使用DAVID网站进行GO分析，显示其分子功能涉及GTP结合、GTP酶活性、小G蛋白结合等，参与翻译起始调控、内质网到高尔基体囊泡介导的转运、细胞内蛋白质转运等生物过程，证明了探针能够特异性的富集到GTP结合相关蛋白，且标记效果好于GTP-O探针（图14c）。

2.3 GTP-N探针和GTP对照探针对HEK 293T细胞裂解液标记的比较

使用0.1 mM对照探针对HEK 293T细胞裂解液进行标记，并与相同条件下平行进行的GTP-N探针的标记结果进行比较。GTP-N探针含有光亲和基团，能够与蛋白连接后在紫外光照射条件下进行光交联，与蛋白形成共价连接，而对照探针不含光亲和基团，能用于分析光亲和基团对蛋白标记的影响。

结果显示，不含光亲和基团的对照探针鉴定到的蛋白较GTP-N探针少，且对照探针所鉴定到的GTP结合蛋白GTP-N探针几乎都能鉴定到（图15a和图15b）。虽然对照探针也能鉴定到2000个以上的总蛋白和100个GTP结合蛋白，但其检测到的蛋白的质谱信号强度大大低于GTP-N探针（图15c），说明了光亲和基团产生的共价交联作用能使探针更有效地钓取靶蛋白。

2.4 GTP竞争对GTP-O探针或GTP-N探针标记的影响

使用10倍探针浓度的GTP来竞争GTP-O探针或GTP-N探针对HEK 293T细胞裂解液的标记，与不加GTP竞争的探针标记组对比，能更有效地鉴定出GTP特异性的结合蛋白。对探针标记到的蛋白进行非标记定量分析，对三次生物学重复中共同鉴定到的蛋白的非标记定量分析的信号强度进行比较（图16a和图16b）。根据火山图分析，大部分GTP结合蛋白的标记效率在加入GTP竞争之后都有所降低。通过GTP对两种探针标记的竞争结果可以看出，GTP-N探针对GTP结合蛋白的标记选择性比GTP-O探针好，对GTP竞争探针标记中显著下调的蛋白进行GO分子功能分析也显示，GTP-N探针对GTP结合及GTP酶活性相关蛋白的富集特异性更强（图16c和图16d）。

在GTP-N探针和GTP-O探针标记的三次生物学重复中共同鉴定到的总蛋白和GTP结合蛋白中，大部分蛋白均能被两种探针检测到，GTP-N探针比GTP-O探针重复鉴定到的蛋白更多（图17a和图17b）。对于这两种探针在三次生物学重复中共同鉴定到的1673个蛋白，绝大多数蛋白的质谱信号强度在使用GTP-N探针标记时强于GTP-O探针（图17c），说明GTP-N探针对蛋白的标记效果优于GTP-O探针。

2.5 探针标记蛋白的修饰位点的鉴定

对于使用On-Beads酶解法制备的GTP-N探针标记的质谱样品，使用含有可酸性断裂的硅氧键的生物素-DADPS-叠氮（CAS：1260247-50-4）进行点击化学反应。在使用胰酶酶解得到肽段后，使用25 mM碳酸氢铵重悬微珠收集该溶液，得到不含探针修饰游离肽段（即①号样品），此时含探针修饰的肽段因含有生物素基团仍与微珠紧密结合，使用10%甲酸孵育微珠，断开生物素基团上的硅氧基，使含有探针修饰的肽段游离出来，并补加终浓度1%的三氟乙酸在37℃孵育30分钟脱去GTP。收集该部分肽段样品（即②号样品）进行探针修饰位点的鉴定。根据该方法鉴定到了GTP结合蛋白EEF1A1的含修饰的肽段二级质谱图，并对其碎片离子b离子和y离子进行了归属（图18）。

实施例4 光亲和探针标记用于重组G蛋白的分析

为了验证该GTP光亲和探针对GTP结合蛋白的标记，以小G蛋白KRAS为例，在大肠杆菌中表达并纯化了其重组蛋白GST-KRAS，在探针标记后对其分子量以及酶解后的肽段进行了质谱分析，验证了探针对其标记并检测到了探针的标记位点。

1. 材料与方法

1.1 实验试剂

氨苄青霉素钠、琼脂糖（索莱宝），甘油（阿达玛斯），GST重组蛋白纯化树脂（碧云天），胰蛋白冻、酵母提取物（奥克斯阿德），2×phanta flash master mix（诺唯赞），BamHI、10×Green缓冲液、T4连接酶（赛默飞世尔），SalI、rCutSmart缓冲液（NEB），溶菌酶（索莱宝），DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒（天根）。其余试剂同实施例3中1.1。

1.2 实验仪器

同实施例3中的1.2。

1.3 实验步骤

1.3.1 KRAS蛋白的表达和纯化

使用pGEX-4T-1作为空载体插入KRAS基因片段，构建了能够表达在N端含有GST标签的KRAS蛋白的质粒。将测序结果正确的质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单克隆接种培养，表达GST-KRAS。蛋白纯化时所用缓冲液均在使用前加入苯甲基磺酰氟至终浓度1 mM。每1 L菌液得到的裂解液使用2 mL GST标签蛋白纯化树脂进行结合，树脂在使用前使用裂解液洗两次交换缓冲液。树脂和细菌裂解液混合物在4℃，旋转摇床上结合6小时。将树脂混合物装入亲和层析柱中，流穿液流出，使用洗液（50 mM三羟甲基氨基甲烷，150 mM氯化钠，10%甘油，pH = 8）洗去杂蛋白，洗脱液（50 mM三羟甲基氨基甲烷，150 mM氯化钠，10mM谷胱甘肽，10%甘油，pH = 8）洗脱GST标签蛋白，收集合并后使用超滤管（10 kDa）超滤浓缩并交换缓冲液（50 mM三羟甲基氨基甲烷，150 mM氯化钠，10%甘油，pH = 7.4）。使用Bradford试剂盒进行蛋白浓度测定，蛋白溶液分装冻存于-80℃。

1.3.2 探针标记GST-KRAS的荧光凝胶成像

使用GTP-N探针标记GST-KRAS，加入各条件下的不同处理试剂至指定浓度，如金属离子、探针、竞争剂等，冰上孵育后，使用365 nm紫外灯冰上照射，点击化学反应连接罗丹明B-PEG₃-叠氮，室温涡旋振荡后加入十倍体积冰甲醇过夜沉淀蛋白。蛋白沉淀离心洗涤后使用4%十二烷基硫酸钠缓冲液（4%十二烷基硫酸钠，150 mM氯化钠，50 mM三乙醇胺，pH =7.4）溶解，加入4×上样缓冲液（0.25 M三羟甲基氨基甲烷，pH = 6.8，4%十二烷基硫酸钠，40%甘油，0.02%溴酚蓝，使用前每800 μL加入200 μL β-巯基乙醇），95℃加热5分钟，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（4%浓缩胶，10%分离胶），90 V恒压电泳110分钟左右。电泳结束后切下分离胶置于双蒸水中，使用Amersham Imager 600进行荧光凝胶成像，选择激发光光源为520nm。荧光凝胶成像后，使用考马斯亮蓝染色液（0.1%考马斯亮蓝，10%冰醋酸，50%甲醇）对凝胶进行蛋白染色30分钟，并使用脱色液（10%冰醋酸，30%甲醇）脱去背景色。

1.3.3 探针标记KRAS重组蛋白的完整分子量检测

取GST-KRAS蛋白，使用NAP-5除去内源性核苷酸小分子，Bradford试剂盒测定蛋白浓度后，取200 μg GST-KRAS蛋白，加入氯化镁终浓度1 mM，按照蛋白：探针 = 1：10量加入GTP-N探针，冰上孵育10分钟，紫外365 nm冰上照射30分钟，使用4倍体积甲醇、1倍体积氯仿、三倍体积水沉淀蛋白，并再次使用甲醇、氯仿、水洗涤沉淀蛋白，4℃离心30分钟，转速为12000 rpm，弃去上清，为提高蛋白沉淀后复溶时的溶解度，将蛋白沉淀先置于-20℃放置20分钟，在冰上加入少量80%甲酸溶解蛋白后，再加入水稀释至100 μL，使用0.22 μm滤膜过滤后，使用UPLC 3000与Maxis Ⅱ QTOF联用进样测试。

UPLC流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含0.1%甲酸的90%乙腈，流速为0.5 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为80℃。使用MAbPac RP柱（赛默飞世尔，4 μm，3×50 mm）分离。梯度洗脱条件：0-5分钟，30% B；5-15分钟，30-98% B；15-16分钟，98-100% B；16-21分钟，100%B；21-22分钟，100-30%B。在保留时间7.6-7.7分钟处出蛋白峰。

Maxis Ⅱ 采用ESI源，正离子检测模式，m/z扫描范围为300-3000，质谱喷雾电压为4 kV，雾化压力为0.4 Bar，离子传输管温度为200℃，干燥气体N₂气流速为4 L /min。对得到的质谱图进行去卷积化处理，使用savitzky golay方法设置starting point为0.14kDa进行平滑去噪，并进行基线校正后进行蛋白去卷积化，质量范围设置为10 kDa-80 kDa，信噪比阈值设置为10。

1.3.4 通过胶内酶解法制备探针标记KRAS的肽段样品

取GST-KRAS蛋白或经探针标记后的GST-KRAS蛋白，加入15 μL 4%十二烷基硫酸钠缓冲液（4%十二烷基硫酸钠，150 mM氯化钠，50 mM三乙醇胺，pH = 7.4）溶解后，加入4×上样缓冲液，95℃加热5分钟，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，90 V恒压电泳110分钟左右。电泳结束后切下分离胶，使用考马斯亮蓝染色液（0.1% 考马斯亮蓝，10%冰醋酸，50%甲醇）对凝胶进行蛋白染色30分钟，并使用脱色液（10%冰醋酸，30%甲醇）反复脱色。待凝胶背景完全脱色后，将目标条带凝胶切下，并将胶块切成1 mm³的小块，放入离心管中。向其中依次加入含25mM碳酸氢铵的50%乙腈溶液和25 mM碳酸氢铵的水溶液，于37℃摇床上反复脱色，弃去废液，至凝胶变成透明。加入乙腈使胶块完全脱水为白色，吸出废液弃去，使用真空离心浓缩仪干燥20分钟至凝胶完全干燥。将胶块重旋于含25 mM碳酸氢铵的20 mM三-(2-羧乙基)磷盐酸盐溶液，并在37℃下孵育1小时。冷却至室温后加入含25 mM碳酸氢铵的500 mM碘乙酰胺溶液至碘乙酰胺终浓度为50 mM，并室温避光孵育30分钟。加入含25 mM碳酸氢铵的50% 乙腈溶液，涡旋洗涤脱色2次后再加入乙腈使胶块完全脱水，吸出废液弃去，使用真空离心浓缩仪干燥20分钟至凝胶完全干燥。加入含胰酶的25 mM碳酸氢铵溶液使胶块吸收后，37℃酶解16小时。离心，取出肽段溶液，并将凝胶进一步用含5％醋酸和50％乙腈的溶液冰上超声15分钟取出溶液，并再向凝胶块中加入100 μL乙腈孵育使肽段全部溶解至溶液中，合并上述溶液，离心浓缩并使用C18小柱除盐。样品根据蛋白量溶解于适量水中，取1 μg左右蛋白量进行LC-MS/MS检测。

2. 结果与讨论

2.1 探针标记KRAS重组蛋白的荧光凝胶成像分析

使用GTP-N探针对简单纯化后的重组GST-KRAS蛋白（MW = 47.95 kDa）进行了标记，使用荧光凝胶成像验证探针对KRAS的标记（图19）。

梯度浓度的GTP-N探针对GST-KRAS标记呈现随探针浓度升高而增强的标记效果（图19a），并且延长曝光时间至10分钟时，GTP-N探针使用浓度可低至0.2 μM，仍能显出清晰的荧光标记条带（图19c），说明GTP-N探针对GST-KRAS的标记是非常有效的。当使用非GTP结合蛋白BSA（66 kDa）进行探针标记时，标记效果非常弱（图19b），使用GTP对探针标记进行竞争时，荧光凝胶结果显示GTP能够有效地减弱探针的标记强度（图19c），进一步证明了探针对GST-KRAS标记的特异性。

2.2 探针标记KRAS重组蛋白的完整蛋白分子量检测

首先使用UHPLC-QTOF液质联用分析验证了所合成的重组G蛋白GST-KRAS的正确性，其质谱检测结果去卷积化后m/z为47946.0342（图20），误差为-79 ppm。使用GTP-N探针对GST-KRAS进行光亲和标记，然后进行相同的质谱分析，检测到了GST-KRAS加上一个脱去GTP之后的探针修饰（+109.0891 Da）所对应的蛋白峰，其质谱检测结果去卷积化后m/z为48054.3484（图21），误差为-95 ppm。由于在溶解样品时使用80%甲酸进行孵育，探针可能在此酸性条件下断裂脱去GTP。该结果验证了探针对KRAS蛋白的标记。

2.3 探针标记KRAS重组蛋白的胶内酶解修饰位点的检测

将QTOF测试剩余的GTP-N探针标记GST-KRAS样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切下蛋白相应分子量条带后进行胶内酶解，对肽段除盐后进行液质联用分析，检测到了GST-KRAS对应肽段，序列覆盖率达91.5%。由于数据分析时选择肽段长度为5-25，在KRAS序列162-176、183-189中富含较多的胰酶酶切位点赖氨酸和精氨酸，酶切后肽段长度小于5个氨基酸，为了减少肽段归属中的错误，不对其进行归属分析。

在GTP-N探针标记GST-KRAS的胶内酶解样品中，鉴定到了GST-KRAS含探针修饰（+109.0891 Da）的肽段二级质谱图（图22、图23），并对碎片离子b离子和y离子进行了归属。该GTP-N探针对GST-KRAS的修饰位点E143和E153，位于KRAS的核苷酸结合相关G5的保守基序SAK附近，说明该探针能用于G蛋白结合位点的分析。

实施例5 光亲和探针标记用于G蛋白抑制剂的分析

使用GTP-N探针对GTP竞争型抑制剂EHT 1864在HEK 293T 细胞裂解液中的靶蛋白进行了鉴定，比较梯度浓度EHT 1864对探针标记产生的影响，分析抑制剂的作用。

1.1 实验试剂

EHT 1864（毕得医药，CAS：754240-09-0），其余试剂同实施例3中的1.1。

1.2 实验仪器

同实施例3中的1.2。

1.3 实验步骤

G蛋白抑制剂竞争探针标记HEK 293T细胞裂解液的质谱样品制备

使用On-Beads酶解法对GTP-N探针进行HEK 293T细胞裂解液蛋白标记及使用GTP竞争型抑制剂EHT 1864进行预孵育抑制探针与GTP结合蛋白的结合。使用探针的终浓度为20 μM，EHT 1864分别使用20 μM、40 μM、100 μM、200 μM浓度，先使用抑制剂对细胞裂解液在冰上预孵育10分钟后，加入GTP-N探针进行标记及后续实验和LC-MS/MS检测。

2. 结果与讨论

EHT 1864是一种直接靶向于Rac家族GTP结合位点的GTP竞争型抑制剂，能够降低细胞活力，破坏各种癌细胞的细胞骨架形成和细胞粘附作用。通过使用GTP-N探针对EHT1864在HEK 293T细胞裂解液中的靶蛋白进行鉴定，比较梯度浓度EHT 1864对探针标记产生的影响，分析抑制剂的作用。

在总蛋白和GTP结合蛋白中看到一些蛋白检测强度随抑制剂浓度升高而降低，可能是抑制剂潜在的靶点（图24）。使用以下四个条件对鉴定到的蛋白进行筛选：①使用10倍浓度时竞争组/探针组<0.5，即log₂(竞争组/探针组)<-1；②5倍浓度时竞争组/探针组<2/3，即log₂(竞争组/探针组)<-0.58；③2倍浓度时竞争组/探针组<1.2，即log₂(竞争组/探针组)<0.26；④1倍浓度时竞争组/探针组<1.2，即log₂(竞争组/探针组)<0.26。这些蛋白参与细胞DNA及中心体复制及调控、翻译、蛋白质转运、成骨细胞分化等生物过程，分子功能与DNA复制、翻译、细胞周期调控、细胞粘附等相关。EHT 1864的降低细胞活力作用，破坏癌细胞细胞骨架形成和细胞粘附作用等，可能与其对这些蛋白的活性影响相关，EHT 1864可能与这些蛋白具有直接或间接结合作用，或影响了其上游通路从而影响了蛋白的活性。

在使用梯度浓度的EHT 1864孵育后进行探针标记时发现其靶蛋白RAC1的质谱信号呈下降的趋势，但整体降低不明显，可能由于该抑制剂对标记位点的竞争不够强，或者质谱定量结果的准确性有待提升。此外，还鉴定到了一些已被报道过可能受EHT 1864影响的蛋白，这些蛋白可能是EHT 1864的潜在靶蛋白，包括ACTR2、ACTR3、PLCG1等，这些蛋白在使用EHT 1864后检测强度总体下降（图25）。其中，ACTR2、ACTR3曾被报道是RAC1的下游靶基因，可能是EHT 1864在骨髓瘤治疗中发挥作用的潜在靶点。PLCG1是磷脂酶Cγ1，曾有文献报道在使用EHT 1864治疗后发现两种突变型PLCG2（磷脂酶Cγ2）活性显著降低，与EHT1864对RAC2的抑制相关。另外，检测到了与血小板作用调节相关的蛋白YWHAH（14-3-3蛋白，自噬相关蛋白）、ESD（酯酶D）、COX5A（细胞色素氧化酶5A，调节血红素铁离子氧化还原）、PAFAH1B1（血小板活化因子乙酰水解酶1B调节亚基1）在使用EHT 1864后检测强度下降，可能与文献中报道的在100 μM高浓度EHT 1864的给药条件下，小鼠血小板中观察到触发血小板凋亡的脱靶效应相关。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于识别GTP结合蛋白的光亲和探针，其特征在于，所述光亲和探针具有如下结构式：

。

2.权利要求1所述光亲和探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下合成路线：

。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少包含权利要求1所述光亲和探针。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含氯化镁，所述氯化镁为0.05-2.5 mM。

5.权利要求1所述光亲和探针或权利要求3-4任一项所述检测试剂盒在GTP结合蛋白相关研究中的应用；

所述GTP结合蛋白相关研究选自：（a）细胞裂解液中GTP结合蛋白的蛋白质谱分析；（b）纯化后的GTP结合蛋白的标记分析；（c）G蛋白抑制剂的分析；

所述应用不包含疾病的诊断和治疗方法。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，

所述应用（a）的具体方法选自：将所述光亲和探针加入HEK 293T细胞裂解液并进行紫外照射后，与生物素-DADPS-叠氮进行点击化学反应；具体的，使用LC-MS/MS对探针标记到的蛋白进行了检测分析，使用MaxQuant软件对得到的质谱数据进行肽段归属，使用DAVID网站进行GO分析；

所述应用（b）中，所述GTP结合蛋白为KRAS蛋白，其选自：对KRAS蛋白荧光凝胶成像分析；KRAS蛋白的完整分子量检测；以及对KRAS蛋白的胶内酶解修饰位点的检测；

所述应用（c）中，所述G蛋白抑制剂为EHT 1864；所述应用（c）为对G蛋白抑制剂的潜在靶蛋白的分析与鉴定。