JP4679368B2 - 発現微量タンパク質/ペプチドの検出・分離・同定法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポストゲノム時代において重要な役割を果たすことが期待される、発現タンパク質及び/又はペプチドを網羅的に解析するプロテオーム技術における新しい検出・分離・同定手法を提供するものとして有用である。
また、本発明は、上記微量検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び/又はペプチドを、高感度で検出・分離・同定するための発現タンパク質及び/又はペプチド同定システムを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、従来法では検出することができなかった、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び/又はペプチドを超高感度で検出・分離・同定することを可能とする新しい分析方法及び手段を提供することを目的とする。
(1)被験試料中の発現微量タンパク質及び/又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法において、1)被験試料中のタンパク質及び/又はペプチドを蛍光試薬で標識する、2)それを1次元又は2次元のHPLC/蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、3)上記蛍光分画を酵素水解に付する、4)それを第二段階のHPLC/蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する方法であって、
被検試料として、異なる試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも2つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きHPLCで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をHPLC−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び/又はペプチドの検出・分離・同定方法。
(3)水解物をHPLCによる定量に供し、試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドの各誘導体の比率を算出する前記(1)に記載の方法。
(4)試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドの第1の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第2の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、2つの励起・蛍光検出の可能なHPLCに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をHPLC−質量分析に供し、同定を行う前記(1)に記載の方法。
(5)試料A、Bが、2種類の細胞又は組織又は体液試料である前記(1)に記載の方法。
(6)蛍光誘導体化試薬として、DAABD−X、DAASeBD−X、及びDAAThBD−X(但し、XはCl又はF)のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも2つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び/又はペプチドを誘導体化する前記(1)に記載の方法。
(7)蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、DAABD−X、DAASeBD−X、又はDAAThBD−X(但し、XはCl又はF)と、それらの各同位体を組み合わせて使用する前記(6)に記載の方法。
(8)前記(1)から(7)のいずれかに記載の方法に使用する装置であって、少なくとも、1次元又は2次元のミクロカラム−HPLC/ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、第二段階のミクロカラムHPLC/ミクロ蛍光検出器、ミクロ自動注入装置、及び、HPLC−質量分析(MS)システムを構成要素として具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
本発明は、上記従来法の難点を克服するためになされたものであり、1)微量の発現タンパク質/ペプチドを蛍光試薬で標識し、2)それをHPLC/蛍光検出にて第一段の分離・蛍光検出を行い、3)その蛍光分画(コントロール試料と比べて、被験試料に特異的に増減する蛍光画分)のみを捕集後、酵素水解し、それを第二段のHPLC/蛍光検出にて分離し、蛍光ピークの確認を行った後、HPLC/MSに付し、蛍光標識タンパク質/ペプチドフラグメントの同定を行い、当該微量タンパク質/ペプチドの特定を行う方法に関するものである。尚、タンパク質/ペプチド試料が純度の高い場合には、第一段のHPLC/蛍光検出による分離を省くことができる。本発明の方法は、従来法と異なり、蛍光標識可能なタンパク質/ペプチドのみを特異的に抽出し、検出・同定することができるという特徴を有し、微量の発現タンパク質/ペプチドを特定するために尤も相応しい方法である。
(1)DAABD−Cl[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole]
(2)TAABD−Cl(7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole−4−sulfonylaminoethyl rimethylammonium chloride)
(3)DAABD−F[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−fluoro−2,1,3−benzoxadiazole]
(4)TAABD−F(7−fluoro−2,1,3−benzoxadiazole−4−sulfonylaminoethyl trimethylammonium chloride)
(5)DAABSeD−Cl[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−chloro−2,1,3−benzoselenadiazole]
(6)TAABSeD−Cl(7−chloro−2,1,3−benzoselenadiazole−4−sulfonylaminoethyl trimethylammonium chloride)
(7)DAABSeD−F[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−fluoro−2,1,3−benzoselenadiazole]
(8)TAABSeD−F(7−fluoro−2,1,3−benzoselenadiazole−4−sulfonylaminoethyl trimethylammonium chloride)
(9)DAABThD−Cl[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−chloro−2,1,3−benzothiadiazole]
(10)TAABThD−Cl(7−chloro−2,1,3−benzothiadiazole−4−sulfonylaminoethyl trimethylammonium chloride)
(11)DAABThD−F[4−(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)−7−fluoro−2,1,3−benzothiadiazole]
(12)TAABThD−F(7−fluoro−2,1,3−benzothiadiazole−4−sulfonylaminoethyl trimethylammonium chloride)
ラ島に0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)に溶解した6M塩酸グアニジン溶液50μlを加えて可溶化した。これに6M塩酸グアニジン溶液に溶解した17.5mMTCEP、17.5mMSBD−F、10mMEDTA及び50mMCHAPSをそれぞれ50μlずつ加え、混合した。この溶液を40℃にて3時間反応させることにより蛍光誘導体化を行った。
(2)イオン交換HPLCによる1次分離
上記の反応溶液をイオン交換カラムに付し、NaClのグラジエント(0、0.04、0.08、0.12及び0.3M)により蛍光タンパク質/ペプチドを溶出させ、5つのフラクションに分離した。なお、蛍光タンパク質/ペプチドの検出はSBD骨格の蛍光により行った。HPLC条件を以下に示す。
カラム:TSKgel DEAE−5PW 7.5×75mm(東ソー(株))
ガードカラム:C8−300−S 54.0×10mm(YMC(株))
移動相:段階溶離〔0−5分:C100%、5−15分:A100%、15−25分:A87%B13%、25−35分A73%B27%、35−45分:A60%B40%、45−55分:B100%〕
A:5mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)/アセトニトリル(50:50)
B:5mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)/アセトニトリル(50:50)
(0.3MNaCl含有)
C:5mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)
カラム温度:室温(約25℃))
流速:0.5ml/min
検出:Ex380nm、Em505nm
注入量:200μl
上記の各画分を濃縮し、アセトニトリルを蒸発させた後、逆相カラムに付し、アセトニトリルの勾配溶離によりタンパク質/ペプチドをカラムから溶出させた。なお、タンパク質/ペプチドの検出はSBD骨格の蛍光によりモニターした。HPLC条件を以下に示す。
カラム:カプセルパックC8 SG300 2.0×100mm((株)資生堂)
移動相:勾配溶離(0→60分:B40%→100%)
A:0.05%トリフルオロ酢酸
B:0.05%トリフルオロ酢酸/アセトニトリル(40:60)
カラム温度:室温(約25℃)
流速:0.2ml/min
検出:Ex380nm、Em505nm
注入量:50μl
採取したHPLCの各ピーク画分をそれぞれのチューブに0.5M炭酸水素アンモニウム溶液5μlを加えてトリフルオロ酢酸を中和後、濃縮してアセトニトリルを蒸発させた。残渣(約80μl)に20μg/mlトリプシン(プロメガ)及び10mM塩化カルシウムをそれぞれ10μlずつ添加した。これを37℃で2時間インキュベートし、HPLC−MS/MS測定用の試料とした。
上記の試料を逆相カラムHPLCに付し、エレクトロスプレー法によるMS/MS測定を行った。HPLC条件を以下に示す。なお、タンパク質/ペプチドの同定はデータベースにNCBI、サーチエンジンにMASCOTを使用した。
カラム:Cadenza TC−C18 2.0 ×100mm(Imtact(株))
移動相:勾配溶離(0→30分:B20%→100%)
A:0.1%ギ酸
B:0.1%ギ酸/アセトニトリル(50:50)
カラム温度:室温(約25℃)
流速:0.2ml/min
測定モード:positive
測定範囲:500−3000m/z
注入量:50μl
そのうち、約50のタンパク質/ペプチドが同定できた(表2、図6参照)。
全てのペプチドフラグメントのCIDスペクトルにより、確率的プロテイン同定法に基づくMASCOTによるデータベース照合を行い、予測通り、完全にBSAとしてタンパク質を同定した(スコア:39)。
Dexは、肝臓のグルコース産生の増加とインシュリン耐性の誘導により主なヒト糖尿病であるタイプ2の糖尿病を誘発する。実際に、Dex処理の24時間後に、血中グルコースレベルは209.8mg/dLに達し、処理前の値の118.3mg/dLより著しく高い(p<0.05)。本実施例では、2日間Dexで処理又は未処理のラット膵臓からランゲルハンス島(60島)を採取し、SBD−Fで誘導体化した。本発明の方法を生物試料に適用するための重要な態様は、タンパク質混合物からHPLCで発現タンパク質を分離することである。本実施例では、蛍光タンパク質は、まず、SBD−Fにより生成した多くのマイナス電荷と酸性アミノ酸部分に基づいてイオン交換クロマトグラフィー(IEC)で分離された。
4−chlorosulfonyl−7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole(CBD−Cl)(126.53 mg)をCH3CNに溶解し、N,N−dimethylethylenediamineを滴下し、triethylamineを加えた。室温で約10分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、シリカゲルカラム(CH2Cl2)で精製し、4−(dimethylaminoethy laminosulfonyl)−7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole(DAABD−Cl)(20.2mg,87.4%)を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
1H−NMR(CD3OD):7.94(1H,d,J=7.5),7.65(1H,d, J=7.5),3.06(2H,t,J=6.7),2.30(2H,t,J=6.7), 2.02(6H,s)。ESI−MS:m/z305(M+H)+
4−chlorosulfonyl−7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole(CBD−Cl)(126.53 mg)をCH3CNに溶解し、H2Oに溶かしたaminoethyl trimethylammonium chlorideを滴下し、triethylamineを加えた。室温で約20分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)に溶かし、ODSカラムを用いて分取し、画分には、SBD−Cl(化10)が不純物として入っていたため、陰イオン交換カラムを用いて分取し、減圧乾固して、7−chloro−2,1,3−benzoxadiazole−4−sulfoneaminoethyl trimethylammonium chloride(TAABD−Cl)(127.2mg,58.8 %)を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
1H−NMR(CD3OD):8.01(1H,d,J=7.3),7.69(1H,d, J=7.3),3.46−3.48(4H,m),3.12(9H,s)。ESI−MS :m/z319(M)+
DAABD−Cl、TAABDD−ClのSBD−Fとの比較
10μM還元型グルタチオン、システイン、ホモシステイン混合液100μLとDAABD−Cl又はTAABD−Cl 100μLを混合し、pH9、40℃、10〜120分間反応させた。尚、各試薬は5mM EDTAを含む0.10M ホウ酸緩衝液(pH 9)に溶解した。0.1%ぎ酸で反応停止後、生成物をHPLCを用いて測定した。
SBD−F(化11)の場合、40℃で誘導体化を行うと120分間の反応時間が必要であったが、DAABD−Clは10〜20分、TAABD−Clは20〜30分で反応が終了することがわかった。
したがって、反応時間はDAABD−Clの場合は20分、TAABD−Clの場合は30分が好適である。
上記(1)で作成したサンプルをLC−MSにより検出し、蛍光誘導体化試薬でラベル化していないもの及びSBD−Fで誘導体化したものと、相対強度を比較した。
10μMの以下に示した4種類のペプチド標品、17.5mM TAABD−Cl、10 mM EDTA、50mM CHAPS(界面活性剤)、2.5mM TCEP(還元剤)それぞれ50μLを混合し、pH9.0、40℃で、30,60,90,120分間反応させた。尚、各試薬は6.0M 塩酸グアニジン(タンパク変性剤)を含む0.10 M ホウ酸緩衝液(pH9.0)に溶解した。生成したTAABD化ペプチドをHPLCを用いて測定した。
1. vasopressin
2. oxytocin
3. somatostatin
4. amylin(rat)
図8に TAABD−Clとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
図8より、反応時間が60分までは生成量が増加した。反応停止後は氷冷下で保存し、−20℃にて保存すると、48時間はほとんど分解しなかった。
表4に示した10種類のペプチド・タンパク質標品10μM混合液、2.5mM TCEP、17.5mM DAABD−Cl、10mM EDTA、50mM CHAPSそれぞれ50μLを混合し、pH9.0、40℃で、30分間反応させた。尚、各試薬は6.0 M 塩酸グアニジンを含む0.10M ホウ酸緩衝液(pH9.0)に溶解した。生成したDAABD化ペプチド・タンパク質はHPLCを用いて測定し、蛍光検出の検出限界をSBD−Fと比較した。
上記(2)で誘導体化した物質のうち、vasopressin、oxytocin、somatostatin、calcitonin、amylinはLC−MSにより同定できた。それらの分子量を以下に示す。
m/z 541.8(M+3H)3+[DAABD−vasopressin]
516.0(M+3H)3+[DAABD−oxytocin]
726.6(M+3H)3+[DAABD−somatostatin]
989.9(M+4H)4+[DAABD−calcitonin]
892.8(M+5H)5+[DAABD−amylin]
また、タンパク質の場合は酵素によってペプチドに分解する必要があるため、酵素トリプシンで消化し、LC−MS/MS検出及びMASCOTによるデータベース検索を行って同定を試みた結果、システインを含まないペプチドのアミノ酸配列も併せて決定し、タンパク質を同定することができた。
2−fluoroacetanilideを硝酸で処理して、1−acetylamino−2−nitro−6−fluorobenzeneとし、これを脱アセチル化して、2−fluoro−6−nitroanillineとし、次いで、パラジウム担持炭素触媒を用いて水素化して、3−fluoro−o−phenylenediamineを得た。
Selenium dioxideエタノール加熱溶液を、3−fluoro−o−phenylenediamine(60mg,0.48mmol)のエタノール加熱溶液に加え、混合物を30分加熱した。これを、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のジクロロメタンで溶出し、4−fluoro−2,1,3−benzoselenadiazoleを白色粉末(88mg)として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
mp.129℃、NMR(methanol−d4):δH7.55(1H,d,J=9.2)、7.41(1H,m)、7.06(1H,m)、ESI−MS:m/z202.8[(M+H)]。
m.P.>300℃、NMR(methanol−d4):δH7.97(1H,d d,J=7.6,J=5.4)、7.11(1H,dd,J=7.6,J=10.1)、ESI−MS:m/z280.8[(M−H)]。
N−thionylaniline(0.49g,3.5mmol)を3−fluoro−o−phenylenediamine(200mg,1.6mmol)トルエン(2ml)溶液に加えた。反応混合物を100−120℃で4時間加熱し、溶媒を濾別した後、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を10%HCl溶液及び水で各々洗浄した。有機相を乾燥し、減圧乾固させた。これをシリカゲルによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のクロロホルムで溶出し、4−fluoro−2,1,3−benzothiadiazoleを淡黄色油として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
NMR(methanol−d4):δH7.69(1H,d,J=8.9)、7.50(1H,m)、7.20(1H,m)、ESI−MS:m/z154.9[(M+H)]。
decomp.265℃、NMR(methanol−d4):δH8.06(1H,dd,J=7.9,J=4.9)、7.11(1H,dd,J=7.9,J=9.8)、ESI−MS:m/z232.8[(M−H)]。
上記方法により合成したSBSeD−F及びSBThD−Fを下記の化12に示す。
1mMEDTAを含む0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)による上記SBSeD−F、SBThD−F又はSBD−Fの各蛍光試薬溶液(4mM)の500μl部分を、0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)によるシステイン(0.4mM)溶液の同量と混合した。この混合物を60℃で8時間放置した。反応の後、反応混合物をHPLC分離し、各システイン誘導体に相当するフラクションを集め、それらの蛍光スペクトルを測定した。
4mMの各試薬、SBSeD−F、SBThD−F又はSBD−F及び1mM EDTAを含む0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0又はpH10)の500μl部分を、0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0又はpH10)によるシステイン溶液(0.4mM)の同量と混合した。反応混合物をHPLC分離し、60℃での反応をモニターした。
SBD−Fのような水溶性試薬は、そのsulfonic acid残渣により水溶体中での誘導体の可溶性を増加させ、結果として、誘導体の吸収又は沈殿が減少する。したがって、インシュリンのような比較的疎水性ペプチドのSBD−Fによる誘導体は、逆相カラムで溶出され、高感度に検出されたが、本実施例では、更に、benzoselenadiazole又はbenzothiadiazole骨格をもつ蛍光試薬としてSBSeD−F及びSBThD−Fを合成し、それらのシステインに対する反応性及びその誘導体の蛍光特性を調べた。
このように、水溶性の蛍光試薬SBSeD−F及びSBThD−Fは、SBD−Fと比べて蛍光特性及び疎水性の点で異なっており、プロテオーム解析のための新規蛍光誘導体化試薬として有用である。
(1)方法
線虫(Bristol N2株)を、大腸菌(E.coli)のOP50株を栄養源として20℃で、NGM寒天上に培養し、M9バッファーにより浮遊させてバクテリアから分離した。上記線虫をM9バッファーで2回洗った後、−80℃で保管して用いた。この線虫を等量の10mM CHAPSに懸濁し、超音波で溶解した。可溶性のフラクションを4℃で10,000rpm、5分の遠心分離により集めた。上澄を可溶性フラクションとして−20℃で保管した。このフラクションのタンパク質濃度をBSAを標準に用いるBradford methodで決定した。上澄の約20μL(100μgタンパク質)を同容量の2.5mM TCEP,17.5mM DAABD−Cl、10mM Na2 EDTA及び50mM CHAPSを6.0Mグアニジンを含む100mMホウ酸塩緩衝液(pH9.0)中で混合した。反応混合物を40℃で30分インキュベートした後、反応を200μLの0.1%ギ酸で停止し、次いで、反応混合物(10μgタンパク質)の30μLをHPLCシステムに注入した。
図11は、DAABD−Clで誘導体化した、線虫の可溶性フラクションから得られたタンパク質(約10μg)のクロマトグラムを示す。本実施例では、タンパク質の分離、トリプシンによる加水分解及び任意に選択されたピークフラクションのLC−MS/MS同定により、10種類のタンパク質が同定された。
図中、1はリボゾームタンパク質S3a(MW=28942)、2はカルレティキュリン(calreticulin)前駆体(MW=45588)、3はリボゾームタンパク質L1(MW=38635)、4は伸長因子(elongation factor)1−アルファ(MW=50636)、5はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MW=35098)、6は40Sリボゾームタンパク質(MW=22044)、7はビテロゲニン(vitellogenin)(MW=193098)、8はアルギニンキナーゼ(MW=41969)、9はHSP−1熱ショック(heat shock)70kdタンパク質A(MW=69680)及び10はリボゾームタンパク質L7Ae(MW=13992)を示す。本実施例では、任意に選択された10種類のタンパク質が同定されたが、本発明では、同様にして、他のタンパク質の同定をすることが可能である。
4−クロロ−7−クロロスルフォニル−2,1,3−ベンゾキサジアゾール(0.25g、0.99mmol)をアセトニトリル(8ml)に溶解し、室温で撹拌した。次いで、これにN,N−ジエチルエチレンジアミン(0.21ml、1.49mmol)及びトリエチルアミン(0.21ml、1.49ml)を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(10%メタノール/クロロホルム)で精製し、生成物を得た。得られた固体をメチレンクロライド及びジイソプロピルエステルから再結晶し、明るい黄色の小板状の生成物(0.22g、0.66mmol、67%)を得た。1H−NMR(CDCl3,500MHz)δ7.97(d,J=7.4Hz,1H),7.53(d,J=7.4Hz,1H),3.05(t,J=5.7Hz,2H),2.48(t,J=5.7Hz,2H),2.33(q,J=7.5Hz,4H),0.87(t,J=7.5Hz,6H);13C−NMR(CDCl3,125MHz)δ148.77,145.00,133.40,129.15,127.88,127.47,51.14,46.09,40.45,11.36;IR(KBr,cm−1)3446,3209,3101,2976,2817,1525,1347,1164.
ジメチルアンモニウムクロライド−d6(2.46g)及びブロモアセトニトリル(3.37g)をジエチルエーテル(20ml)に溶解した。10℃でこれに50%NaOH(4.5g)を添加した後、混合物を同じ温度で2時間撹拌した。エーテル層を分離し、水層をエーテル(10ml×3)で抽出した。合体したエーテル層をMgSO4で乾燥し、次いで、減圧で濃縮してN,N−ジメチルアミノアセトニトリル−d6溶液(10g)を得て、次いで、それを10℃でテトラハイドロフラン(40ml)中のLiAlH4(1.28g)及びスルフォン酸(1.69g)の混合物に加えた。反応混合物を室温で13時間よく撹拌、混合した。これにエーテル(30ml)を加えた後、混合物をNaOH(水6mlに4g溶解)で処理した。エーテル層を分離し、水層をエーテル(10ml×2)で抽出した。合体したエーテル層をMgSO4で乾燥し、次いで、(5gになるまで)減圧濃縮した。残渣を希釈し、フラクション(70−80℃)を合わせて、1.79g(収率52.5%)のN,N−ジメチルエチレンジアミン−d6(77.4% THF溶液)を得た。1H−NMR(CDCl3):δ1.82−1.88(1.54H,m for THF,4H),2.33(2H,t,J=6Hz),2.77(2H,t,J=6.4Hz),3.72−3.76(1.48H,m for THF,4H)
4−クロロ−7−クロロスルフォニル−2,1,3−ベンゾキサジアゾール(3.28g)をCH3CN(60ml)に溶解した。この溶液に、N,N−ジメチルエチレンジアミン−d6(1.0g)及びトリエチルアミン(1.92ml)を各々加えて、氷で冷却して、同じ温度に1時間保持し、室温で1.5時間撹拌、混合した。次いで、反応混合を減圧濃縮し、残渣をAcOEtに溶解した。エチルアセテート溶液を飽和NaHCO3、蒸留水、飽和NaCl溶液で各々洗浄し、MgSO4で乾燥した。ろ過した溶液を減圧濃縮し、残渣をCH2Cl2:MeOH(50:1)を溶出液としてシリカゲルカラムで精製した。溶出した溶液を減圧乾燥し、残渣をEtOH−AcOEtで再結晶して1.36g(収率41.3%)のDAABD−Cl−d6:mp、110℃を得た。1H−NMR(CDCl3):δ7.99(1H,d,J=7.3Hz),7.54(1H,d,J=7.3Hz),3.13(2H,m),2.33(2H,m),ESI−MS:m/z311(M+H)+,IR(KBr)cm−1;1342and1166.
7−フルオロ−2,1,3−ベンゾセレナジアゾール−4−スルフォニルクロライド(75mg)を3mlのアセトニトリルに溶解した。これに、N,N−ジメチルエチレンジアミン−(22mg)及びトリエチルアミン(35μl)を加えた後、混合物を氷の上で30分間撹拌した。反応混合を減圧で関そうし、残渣をCH2Cl2に溶解し,CH2Cl2−CH3OH(93:7)を用いてシリカゲルクロマトグラフィーに供し、7−フルオロ−N−[2−(ジメチルアミノ)エチル]−2,1,3−ベンゾセレナジアゾール−4−スルフォンアミド(49mg、56%)を赤い粉末として生成した。mp:117−120℃。1H−NMRδH8.09(1H,d,J=7.5Hz),7.24(1H,d,J=7.5Hz),2.93(2H,t,J=6.7Hz),2.27(2H,t,J=6.7Hz),1.98(6H,s)in CD3OD;ESI−MSm/z353[(M+H)+]
1mM(システイン、ホモシステイン、アラニン、セリン、又はグルタチオン)溶液の20μLを、同容量の2.5mMTCEP、17.5mMDAANSeD−F、10mMNa2EDTA及び50mMCHAPSと混合した。各試薬は、6.0Mグアニジンを含む100mMホウ酸バッファーに溶解した。反応混合物を40℃で10−120分間加熱し、反応を0.1%トリフルオロ酢酸の200μLで停止した。混合溶液を300μLのメタノールで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約420nm、最大蛍光波長は約540nmであった。
0.1%トリフルオロ酢酸で反応を停止した上記反応混合物の10μLをHPLCシステムに供した。HPLCシステムは、ポンプ(L−7100、日立社製)、分離カラムTSKgel120−TQA(内径250×4.6mm)(東ソー社製)及び蛍光検出器(FL−2025、ジャスコ社製)で構成した。蛍光検出は540nmで、励起波長は420nmで行った。移動相は、150mMリン酸バッファー/CH3CN(94/6)であり、流速は0.75ml/分とした。
同定のために、反応混合物をHP1090シリーズIIシステム(Hewlett−Packard(GmbH)のカラムに直接注入して、エレクトロスプレー法によるMS及びMS/MSスペクトルを得た。クロマトグラフィーは、Cadenza TC−18カラム(シリカの12nm孔、内径100×2.0mm)(Imtact(株))で行った。移動相は、0.1%ギ酸の溶出液(A)及び水/CH3CN/ギ酸(50/50/0.1)の溶出液(B)で構成した。0から100%Bで流速0.2ml/分で15分間グラジエント溶出を行った。このとき得られたクロマトグラムは、システイン、ホモシステイン、グルタチオンの3つのピークを与えた。
100μMのペプチド及びタンパク質(インシュリン、トリプシン阻害剤、α−酸グリコプロテイン、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン)溶液又は10μM BSA溶液の20μLを同容量の2.5mM TCEP、17.5mM DAABD−Cl(比較として)、10mM Na2EDTA及び50mM CHAPSと混合した。各反応混合物を6.0Mグアニジンを含む100mMホウ酸バッファー(pH9.0)に溶解した。各反応混合物を40℃で60分間(DAABSeD−F)又は20分間(DAABD−Cl)加熱し、反応を0.1%トリフルオロ酢酸の200μLで停止した。混合物をメタノール300μLで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約425nm、最大蛍光波長は約535nmであった。
メタノールを除いた上記反応混合物の55μLをHPLCカラムに供した。HPLCシステムは、ポンプ(L−7100、日立社製)、タンパク質用のRPカラム(30nm孔サイズ、内径250×4.6mm)(Imtact社製)及び蛍光検出器(FL−2025、ジャスコ社製)で構成した。蛍光検出は、550nm(励起波長450nm)(DAABSeD−F)又は490nm(励起波長370nm)(DAABD−Cl)で行った。溶出液(A)は、水/CH3CN/トリフルオロ酢酸(90/10/0.1)からなり、溶出液(B)は、水/CH3CN/トリフルオロ酢酸(30/70/0.1)で構成した。0から100%Bで流速0.5mL/分で200分間のグラジエント溶出を行った。
α−ラクトアルブミンを含み、10mMEDTA、50mMCHAPS、2.5mMTCEP、6.0Mグアニジンを含む混合溶液を2つの部分に分け、試料Aには1μMのα−ラクトアルブミン及び試料Bには2μMのα−ラクトアルブミンを含むように調整した。試料AはDAABD−Clと40℃で20分間反応させ、試料BはDAABSeD−Fと40℃で30分間反応させ、両者の反応溶液を再度混合した。混合物を2つの蛍光検出器に直列に連結したHPLCに供した。一つは、370nmで励起して蛍光波長490nmでDAABD誘導体をモニターし、もう一つは、450nmで励起して蛍光波長550nmでDAABSeD誘導体をモニターした。HPLCシステムは上記(4)と同じである。
前述のように、ベンゾキサジアゾール試薬の、7−クロロ−N−[2−(ジメチルアミノ)エチル]−2,1,3−ベンゾキサジアゾール−4−スルフォンアミド(DAABD−Cl)は、感度のよい、選択的なチオール特異的試薬であり、プロテオミクス研究に有用である。DAABD−Clは、ペプチド及びタンパク質のチオールと反応して誘導体化し、390nmの励起で502nmで蛍光を発する。本実施例では、図12の合成経路により、7−フルオロ−N−[2−(ジメチルアミノ)エチル]−2,1,3−ベンゾセレナジアゾール−4−スルフォンアミド(DAABSeD−F)をDDABD−Clのカウンターパートとして合成した。
DAABSeD−Fによる低分子量チオール(システイン、ホモシステイン、グルタチオン、アラニン、セリン及びトリプシン)の誘導体化反応を40℃(pH9.0)で行った。ペプチド及びタンパク質(インシュリン、α1−酸グリコタンパク質、トリプシン阻害剤、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン、BSA等)の場合、反応を促進するために、CHAPS及びグアニジンの存在下で行った。予測したように、DAABSeD−Fは、アラリン(アミノ及びカルボキシル基を含む)セリン(アミノ、カルボキシル及び水酸基を含む)及びチロシン(アミノ、カルボキシル、フェノール性水酸基を含む)のようなチオールを含まない化合物との反応では蛍光を示さなかった。これに対して、チオール化合物の場合には、蛍光を発し、その強度は30分で最大に達したが、これは、DAABSeD−Fはペプチド及びタンパク質と同様に低分子量のチオールと特異的に反応し、蛍光を生じ、反応速度は、DAABD−Clと同様であることを示している。
DAABSeD誘導体は、最大励起及び蛍光波長が、それぞれ423−429nm及び524−542nmの範囲にあることを示した(表5)。
DAABSeD−Fで誘導体化したチオール混合物をエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計を備えたHPLCに供した。各チオールについて単一ピークが得られた。マススペクトルから、各低分子量チオールのDAABSeD誘導体が、システイン(MW=121)、ホモシステイン(MW=135)及びグルタチオン誘導体(MW=307)について、ベースイオンピークがm/z=454(M+H)+、468(M+H)+及び640(M+H)+として検出された。本実験では、用いたエレクトロスプレー法による分子イオン検出の限界(MWが3000以下)のため、タンパク質のDAASeD誘導体の同定は困難であった。
DAABSeD−Fで誘導体化したタンパク質から得られるクロマトグラムは、各誘導体の単一ピークを示し、重なるピークは観察されなかった。試薬自体は蛍光を発しないので、DAABSeD−Fピークは現れなかった。上述の誘導体のピーク高さは、注入量に比例した。バソプレシン、α−ラクトアルブミン及びBSAの検出限界は、それぞれ、7.5、7.2、及び7.2fmolであった。これらの検出限界はDAABD誘導体のものと同様であった。DAABD誘導体に比較して、DAABSeD誘導体は早く溶出したので、DAABSeD誘導体は、DAABD誘導体よりも、HPLC固定相に対する低い親和性を有していた。同様の傾向は、SBD誘導体と比べて、SBSeD誘導体についても観察された。
DAABD及びDAABSeD誘導体を併用した、二つの誘導体の同時蛍光検出は、同一起源の異なる歴史を有する二つのタンパク質試料の比較を簡便にする。例えば、一方が病態患者試料で一方が健常者からの試料、あるいは、二つの細胞又は組織試料で、一方がある薬剤で処理され、他方が未処理のものが例示される。本実験では、試料A中のα−ラクトアルブミンのDAABD誘導体の反応溶液と、試料B中のα−ラクトアルブミンのDAASeBD誘導体の反応溶液を合体し、二つの蛍光検出器に連結したHPLCに供した。それぞれの検出波長は、DAABD誘導体では370nmの励起で490nmで行い、DAASeBD誘導体では、450nmの励起で550nmで行なった。二つの誘導体は、クロマトグラムで各単一ピークを与えた。α−ラクトアルブミンのDAABD誘導体及びα−ラクトアルブミンのDAASeBD誘導体の保持時間は、53.3分、及び50.0分であった。
Claims (8)
- 被験試料中の発現微量タンパク質及び/又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法において、1)被験試料中のタンパク質及び/又はペプチドを蛍光試薬で標識する、2)それを1次元又は2次元のHPLC/蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、3)上記蛍光分画を酵素水解に付する、4)それを第二段階のHPLC/蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する方法であって、
被検試料として、異なる試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも2つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きHPLCで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をHPLC−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び/又はペプチドの検出・分離・同定方法。 - 各蛍光ピークをそのまま又は合体してHPLCによる定量に供し、試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項1に記載の方法。
- 水解物をHPLCによる定量に供し、試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項1に記載の方法。
- 試料A中及び試料B中のタンパク質及び/又はペプチドの第1の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第2の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、2つの励起・蛍光検出の可能なHPLCに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をHPLC−質量分析に供し、同定を行う請求項1に記載の方法。
- 試料A、Bが、2種類の細胞又は組織又は体液試料である請求項1に記載の方法。
- 蛍光誘導体化試薬として、DAABD−X、DAASeBD−X、及びDAAThBD−X(但し、XはCl又はF)のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも2つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び/又はペプチドを誘導体化する請求項1に記載の方法。
- 蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、DAABD−X、DAASeBD−X、又はDAAThBD−X(但し、XはCl又はF)と、それらの各同位体を組み合わせて使用する請求項6に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載の方法に使用する装置であって、少なくとも、1次元又は2次元のミクロカラム−HPLC/ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、第二段階のミクロカラムHPLC/ミクロ蛍光検出器、ミクロ自動注入装置、及び、HPLC−質量分析(MS)システムを構成要素として具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
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Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US6112158A (en) * | 1996-08-01 | 2000-08-29 | Siemens Power Transmission & Distribution, Llc | Service type recognition in electrical utility meter |
DE50108670D1 (de) * | 2000-02-11 | 2006-04-06 | Proteosys Ag | Verwendung von neuregulin-beta als indikator und/oder target |
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US6630300B2 (en) * | 2000-11-21 | 2003-10-07 | Tosoh Corporation | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus |
US6653625B2 (en) * | 2001-03-19 | 2003-11-25 | Gyros Ab | Microfluidic system (MS) |
US7179655B2 (en) * | 2001-03-02 | 2007-02-20 | Activx Biosciences, Inc. | Protein profiling platform |
US6812030B2 (en) | 2001-04-25 | 2004-11-02 | Biotrove, Inc. | System and method for high throughput sample preparation and analysis using column chromatography |
ATE447178T1 (de) * | 2001-07-02 | 2009-11-15 | Arctic Diagnostics Oy | Zwei photonen absorbierende bordipyrromethen- difluorid-farbstoffe und ihre anwendungen |
WO2003020832A1 (en) * | 2001-09-06 | 2003-03-13 | Council Of Scientific And Industrial Research | Fluorescent natural dye from a marine organism |
WO2003029425A2 (en) | 2001-10-01 | 2003-04-10 | Diversa Corporation | Whole cell engineering using real-time metabolic flux analysis |
JP2005506840A (ja) * | 2001-10-01 | 2005-03-10 | ディヴァーサ コーポレイション | リアルタイム代謝フラックス分析を用いた全細胞操作 |
AU2002359110A1 (en) | 2001-12-11 | 2003-07-09 | Astrazeneca Ab | Machine and method for processing biomolecules |
US6658739B1 (en) * | 2002-07-11 | 2003-12-09 | De Lun Huang | Pipe cutter |
US7632686B2 (en) * | 2002-10-03 | 2009-12-15 | Anderson Forschung Group | High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry |
US8101422B2 (en) * | 2005-09-16 | 2012-01-24 | Dionex Corporation | Multidimensional chromatography apparatus and method |
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