CN105116044B - 一种使用专属性肽段组鉴别梅花参的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别梅花参(Thelenota ananas)的方法，以及一组用于通过质谱法鉴定梅花参的对照多肽，所述多肽的序列为：SEQ ID NO.1：ADIAEDSLK；SEQ ID NO.2：AGPAGDDAPR；SEQ ID NO.3：MPIPLLEGK；SEQ ID NO.4：LDIPLLEGK。经鉴定:SEQ ID NO.1：ADIAEDSLK所述肽段为梅花参专有肽段，在其他物种中未见表达；SEQ ID NO.2：AGPAGDDAPR；SEQ ID NO.3：MPIPLLEGK；SEQ ID NO.4：LDIPLLEGK所述肽段虽在其他物种中存在，但在刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参、美国肉参中未见表达，上述肽段为梅花参专有肽段。

Description

一种使用专属性肽段组鉴别梅花参的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种使用专属性肽段组鉴别梅花参(Thelenota ananas)的方法。

背景技术

海参富含酸性黏多糖，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。故此，海参享有“营养宝库”之美誉，现代人把海参誉为“海味八珍之首”。市场上海参种类繁多，不同海参因其营养价值、口感等不同而价格相差巨大，梅花参(Thelenota ananas)同灰刺参一样经济价值很高，既是滋补品，又可治病抗癌，有一定的防衰老作用，含有较高的蛋白质，矿物质也较丰富，并且不含胆固醇，是理想的滋补品。中医认为：海参性温，味成，有补肾益精、养血润燥之功，可以治精血亏损、虚弱劳怯、阳痿、肠燥便艰等症。对于产后、病后体虚衰老，肺结核，神经衰弱等症，均可用之。

不同品种的海参相比较，有的粘多糖含量高，对心脑血管有好处；有的皂甙含量高，对抗癌有益。海参同人参一样，如果皂甙含量高，则药用价值高，但可能味道不好；而有的海参蛋白质含量高，如茄参和刺参，可以大量用在宾馆和家庭餐桌上，对蛋白质缺乏、营养不良的人群提供身体所需的营养物质。

由于目前缺乏特别有效的识别海参品种的方法，鉴别海参种类的方法还只是靠传统的外观观察，缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定海参的方法。

发明内容

本发明对梅花参(Thelenota ananas)的多肽进行了研究，建立了从多肽水平对梅花参进行鉴别的技术，填补了国内外海参鉴别的空白。

本发明首先涉及一组用于单独或组合检测梅花参的多肽，所述的多肽的序列为：

SEQ ID NO.1：ADIAEDSLK；

SEQ ID NO.2：AGPAGDDAPR；

SEQ ID NO.3：MPIPLLEGK；

SEQ ID NO.4：LDIPLLEGK。

本发明还涉及一种检测梅花参的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：

(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的梅花参成分。

所述的质谱前处理步骤如下：

(1)称取1g海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH₄HCO₃)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到1ml EP管中；

(2)取2μL 1mol/L DTT(0.154g二硫基苏糖醇DTT溶于1mL去离子水中)加入到100μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；

(3)取10μL现配的IAA(准确称取0.185g碘代乙酰胺IAA溶于1mL去离子水中，配置成1mol/L的IAA母液备用，配置过程需避光，现用现配)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；

(4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用200μL 50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层3次后，转移至新的EP管中；

(5)再加入200μL碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；

(6)取5ul Trypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；

(7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。

所述的质谱法检测为，采用AB SCIEX5600检测，

流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，

流速：0.25mL/min，

TOF扫描范围：350-1500Da，

正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。

所述的分析样本中的梅花参成分为，将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO.1～4的各条特异性多肽的质谱谱图，出现SEQ ID NO.1～4的各条特异性多肽的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为梅花参样本。

附图说明

图1，ADIAEDSLK在AB 5600上肽段断裂图

图2，ADIAEDSLK在梅花参中的质谱图

图3，AGPAGDDAPR在AB 5600上肽段断裂图

图4，AGPAGDDAPR在梅花参中的质谱图

图5，MPIPLLEGK在AB 5600上肽段断裂图

图6，MPIPLLEGK在梅花参中的质谱图

图7，LDIPLLEGK在AB 5600上肽段断裂图

图8，LDIPLLEGK在梅花参中的质谱图

具体实施方式

实施例1，特异性多肽的序列来源和比对信息

1.梅花参独有的多肽ADIAEDSLK来源

梅花参独有的多肽ADIAEDSLK来自于蛋白tropomyosin[Apostichopusjaponicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi|302340969，序列如下SEQ ID NO.5所示，分析发现ADIAEESLK第6位Glu突变成了Asp，得到的多肽ADIAEDSLK经过NCBI blast比对，未发现与其他任何物种一致：

SEQ ID NO.5：

MDTIKKKLSQLKADKEKALDEKDVAEASMKEAMERVEQVNDENKELQTRIKQLETELDDTSEKLNTTVIKCEAAEKAQQTAEEEMANLQRKLQLTEEELSRSEERVADLQSKYTDIEQSSEENERQRKVLESRSAADDERMSELETQVMSSKTSLEDSDRKYDEASRKLTVTEEELARSEERSAAFESSLSQMKEELHQLHNNVKSLEAQEEKFTENEEMYEKKVRDLEDKLKVAEDRADIAEESLKSLKTSLDQLEDELMIEKEKVREMTEEMERTIQELNFEV

采用AB SCIEX5600质谱仪(AB 5600)检测目标肽段的断裂图和质谱图

图1是ADIAEDSLK在AB 5600上肽段断裂图

图2是ADIAEDSLK在梅花参中的质谱图，

其母离子为481.245，

子离子分别为：890.447,775.420，662.336和591.298。

2.梅花参独有的多肽AGPAGDDAPR来源

多肽AGPAGDDAPR来自于蛋白actin isoform 2[Holothuria glaberrima]，其在NCBI上的Accesion number是gi|215882299，序列如下SEQ ID NO.6所示，分析发现AGFAGDDAPR第3位Phe突变成了Pro，得到的多肽AGPAGDDAPR，经过NCBI blast比对，虽然发现有细菌、鼠类等物种和其一致，但对比刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参，该多肽是梅花参独有的：

SEQ ID NO.6：

MCEEEVAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNAPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANSVLSGGTSMYPGIADRMQKEITALAPPTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDESGPSIVHRKCF

图3是AGPAGDDAPR在AB 5600上肽段断裂图

图4是AGPAGDDAPR在梅花参中的质谱图，

其母离子为309.482，

子离子分别为：701.321,630.284，573.263和428.201。

3.梅花参独有的多肽MPIPLLEGK、LDIPLLEGK的来源

多肽MPIPLLEGK和LDIPLLEGK均来自于蛋白major yolk protein 2[Apostichopusjaponicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi|240846033，序列如下SEQ ID NO.7所示，分析发现MLIPLLEGK第2位Leu突变成了Pro，得到了多肽MPIPLLEGK；MLIPLLEGK第1位Met突变成了Leu，第2位Leu突变成了Asp，得到了多肽LDIPLLEGK。这两个多肽经过NCBI blast比对，虽然发现有细菌等物种和其一致，但对比刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参，该两条多肽是梅花参独有的：

SEQ ID NO.7：

MKYLLLFCLAVGAFASINIEREGECPTDITNVDSTLYGVCNDECDVDSSCSDQLHKCCATNCGRRCVNPMRVTPVTEEEENKTREEITEMLTTILSERRDLIKKLDMYPPPLARFIMMKNRTDVVRMCVTTPCELRKCQRIAQTMTYKVTPRKEWFCQLATTTEQCLFWAERGWTDTVMARENKIFVAVDKFNVTSLAYEKNKNAPTEIEKKVQNITLALTLTTSNIETFHHLMGRKVCSAGVNITSAFITPMCNLIYKDVMLATGDVVESSADFFGKMCVPGILNKTFDKNETYPEKLTTACHNLETEYTGIKGSLKCIKSGHGEVVFVDSKVVKELDERFAGVFKLVCEDQSLPLSQWEQTKCHLGYTPRPVLFLNPERNVTYKNELKEIILEAGKMKTPTVDLFNSSDYVCIKEAPKDLIFMDENTNLEFLEDPFSLPAVQEYMKVFNTCQALTPKPRAKICTTTPVQYQKCITMKKVFQTDIELRNISWGCVLARTEMDCMRNVLNGTADLYSGDVKEIFTAGNDFQLQPMMIQDENLRFQKSLFHNATVKSYTIAVMKKSKFWKKFGEDTKVVNIRNLTVCSPDIKSVPNFHLPIGHLLSNGVIPRIGSVFESVSRFYKSVCLPGAAPVDWTWDSDLILGHEVNWGIPGLSFYNFTGFDWFIWNAPHTWTFYNMNRKTPGTLKEFMKNRMLIPLLEGKLTVPEGFNPDTFDYSILDDVLSVEGLGDILNDIPDEIRDSLVDIRTKRVDRKEKFRELYEEKTGDAFVSLRDRRLGKLTLRGFLQQSFQNMEDEWGIFDDVNAPVLSSKSVGKGMTGGKVSNLRDILRGAATTADDNTVIGNLLKDYDSEYTVPVISRIFSKLLNERFETLDGLAKTLEILHRVPTMSSIRGTDYEWLKHPAVQSYLKIYAPRLISFHSDLYTSEELAKTQFSRYLNPIWLSPTFKDFLDVTKTHMTKLTEMCRGYGDRQGVGNSHEPFYGNEGALRCIEDTEEGDIAFIDTKNFATLSTTDYVMVTPLGIVQPINPESIMNGTFGTVPFPALMTAFNKTGSWRWNVTKALLIAQKKYPTNTSTDYTMYGVDSVFMPETKKMYPVPLNMQTHPTYLGSRLTRAFEALIKPSTHDWWKERRHICSGESYTNVIEQRNGTCKAIVKDVTCGGMPRPKVISVGTTENKKPVVVRMCSRPTSFVREMAEFRCDNGYGYLKPVMVPTTCSCVPCDEIEYKPTWTTDIMWNTTEKNHIITENIETMMKLWGNEEFWTNHTLNSNFEIGVVNVTAMKNETEKLGPLTVLKSVGSCEANWYGNGWNTEWFVNTSRPVCLGTIPGLRRTLTAQRIQTKLMP

图5是MPIPLLEGK在AB 5600上肽段断裂图

图6是MPIPLLEGK在梅花参中的质谱图，

其母离子为499.291，

子离子分别为：866.535，769.482，656.398和559.345。

图7是LDIPLLEGK在AB 5600上肽段断裂图

图8是LDIPLLEGK在梅花参中的质谱图，

其母离子为499.300，

子离子分别为：884.509，769.482，656.398和559.345。

实施例2，海参样本处理及检测步骤

对待测海参样本进行分析的步骤包括

(一)样本前处理步骤：

(1)称取1g海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH₄HCO₃)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到1ml EP管中；

(2)取2μL 1mol/L DTT(0.154g二硫基苏糖醇DTT溶于1mL去离子水中)加入到100μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；

(3)取10μL现配的IAA(准确称取0.185g碘代乙酰胺IAA溶于1mL去离子水中，配置成1mol/L的IAA母液备用，配置过程需避光，现用现配)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；

(4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用200μL 50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层3次后，转移至新的EP管中；

(5)再加入200μL碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；

(6)取5ul Trypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；

(7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。

(二)上机检测，

采用AB SCIEX5600检测，

流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，

流速：0.25mL/min，

TOF扫描范围：350-1500Da，

正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。

检测结果对比实施例1中的各条特异性多肽的质谱谱图，出现实施例1所述质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为梅花参样本。

经进一步鉴定，所述肽段为梅花参专有肽段，在其他刺参、美国肉参等不同海参品种种未见表达。

Claims (4)

1.一组用于单独或任意组合检测梅花参(Thelenota ananas)的多肽，所述的多肽的序列为：

SEQ ID NO.1：ADIAEDSLK；

SEQ ID NO.2：AGPAGDDAPR；

SEQ ID NO.3：MPIPLLEGK；

SEQ ID NO.4：LDIPLLEGK。

2.一种检测梅花参的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；

(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的梅花参成分；

所述的分析样本中的梅花参成分为，将待测样品的质谱结果对比如权利要求1所述的SEQ ID NO.1～4的各条特异性多肽的质谱谱图，出现如权利要求1所述的SEQ ID NO.1～4的任一条或多条特异性多肽的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为梅花参样本。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理步骤如下：

(1)称取海参样品均质成粉末状态，加入蛋白提取液，所述蛋白提取液成分为8M尿素和50mM NH₄HCO₃，震荡提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；

(2)取DTT加入到上述蛋白溶液中，37℃反应1小时；

(3)取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；

(4)采用10K滤膜超滤30分钟，使用碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层3次后，转移至新的EP管中；

(5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；

(6)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37℃酶解16-18小时；

(7)采用10K滤膜超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为，采用AB SCIEX5600检测，

流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，

流速：0.25mL/min，

TOF扫描范围：350-1500Da，

正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。