CN103936831A - 一种源于河豚鱼的呈味肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种源于河豚鱼的呈味肽及其制备方法和应用，该呈味肽具有SEQ ID No：1的氨基酸序列。所述呈味肽是从暗纹东方鲀的肌肉中分离纯化获得的具有豚鱼鲜美味道的氨基酸序列，可以应用于食品领域，作为基料或辅料来制作调味品。

Description

一种源于河豚鱼的呈味肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种源于河豚鱼的呈味肽及其制备方法和在食品领域的应用。

背景技术

食品中存在许多呈味物质（例如甜味物质、鲜味物质、咸味物质、酸味物质等），这些物质一般为游离氨基酸、肽、呈味核苷酸、无机盐等。在肉及肉制品中呈味物质以游离氨基酸和肽占有较重要的角色，这是由人类的味觉受体——味蕾与呈味物质的结构和性质所决定的。氨基酸和肽中的氨基和羧基两性基团具有缓冲能力，使得其具有复杂的呈味功能，能同时参与并影响食品的滋味的形成，能提高食品的总体风味，改进食品的质构，使食品的总体味感协调、细腻、醇厚浓郁。

这些年来，科研工作者们都尝试着从各式各样的美味食物中分离提取起关键作用的呈味肽（也称风味增强肽、美味肽等），其具有良好的加工特性、营养功能和生理活性，并且对食品的滋味具有很大的影响，可以用于食品佐料，例如可以用作调味品或香精香料的重要基料。

河豚鱼（也称河鲀）鱼肉质细嫩、鲜美，但是河豚鱼体内含有剧毒的神经毒素，食用极不安全，因此至今未在我国开放。如果能够提取河豚鱼肉中的关键呈味物质或者能够模拟其滋味特征，那么就可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

申请号为201210102244.1的专利公开了“一种呈味肽及其制备方法和应用”，上述专利公开的技术方案中描述了从海豚鱼中分离纯化出一种具有鲜甜味道的呈味肽，其氨基酸序列为Tyr-Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val，提供了单一结构的呈味肽，为其在食品领域中的应用提供技术指导。众所周知，每一种食物都有其特征味道，而食物口味的呈现为其中各味道化合物之间的综合平衡表现。由此可知，河豚鱼的鲜美味道很可能是由多种呈味肽以及其它呈味物质共同作用的结果。因此，改变河豚鱼的分离提取工艺，获取新的结构单一的呈味肽，对这些呈味肽在食品领域中的应用具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种源于河豚鱼的呈味肽及其制备方法以及该呈味肽在食品领域的应用。利用本发明，通过改变从河豚鱼中分离提取呈味肽的工艺方法，获得一种新的结构单一的呈味肽，为呈味物质在食品领域中的应用提供更多的技术指导。

本发明提供了一种源于河豚鱼的呈味肽，该呈味肽的氨基酸序列为Pro-Val-Ala-Arg-Met*-Cys-Arg，其中Met^*为氧化型甲硫氨酸。

优选地，所述的呈味肽来源于暗纹东方鲀的肌肉。

所述的呈味肽可通过人工合成方法获得。采用现有的多肽化学合成技术，合成氨基酸序列Pro-Val-Ala-Arg-Met*-Cys-Arg，其中Met^*为氧化型甲硫氨酸。

优选地，所述呈味肽从暗纹东方鲀的肌肉中分离获得，具体包括如下步骤：

（1）从暗纹东方鲀的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；

（2）将前述分子量小于3000Da的超滤组分使用分子量截留范围为200Da的纳滤膜进行纳滤分离，收集未过膜的浓缩液；

（3）将前述未过膜的浓缩液进一步通过凝胶色谱和反相高效液相进行分离纯化后，获得氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的呈味肽。

优选地，所述步骤（3）中采用Sephadex G-15凝胶色谱方法进行层析，对层析后选择的浓厚感和鲜味最强的组分进一步采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法进行层析，再选择其中鲜味和甜味最强的组分进行成分鉴定，确定氨基酸序列为Pro-Val-Ala-Arg-Met*-Cys-Arg，其中Met^*为氧化型甲硫氨酸。

本发明另一方面提供了上述源于河豚鱼的呈味肽在食品领域中的应用。

本发明还提供一种食品调味品，该食品调味品包含上述源于河豚鱼的呈味肽，即氨基酸序列Pro-Val-Ala-Arg-Met*-Cys-Arg，其中Met^*为氧化型甲硫氨酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）通过改变河豚鱼的提取工艺，获得了一种新的结构单一的呈味肽，可应用于食品领域，作为基料或辅料来制作调味品。为呈味肽在食品领域的应用提供了理论基础。

（2）所获取的呈味肽能够与其它已知的从河豚鱼中提取的呈味物质综合运用，有助于模拟河豚鱼的原本滋味，使消费者在完全安全的情况下享受到河豚鱼鲜美的味道。

附图说明

图1为分子量在3000Da～200Da的提取组分0-F经Sephadex G-15凝胶色谱分离后的层析图谱；

图2为提取组分0-F和层析组分0-F1、0-F2、0-F3的滋味稀释分析结果；

图3为层析组分0-F1、0-F2、0-F3和谷氨酸钠（MSG）的电子舌二维主成分分析图；

图4为层析组分0-F1、0-F2、0-F3和谷氨酸钠（MSG）的电子舌滋味评价分析图；

图5为层析组分0-F1的RP-HPLC分离图谱；

图6为层析组分0-F1，分离组分0-F1-1、0-F1-2和谷氨酸钠（MSG）的电子舌二维主成分分析图；

图7为分离组分0-F1-1的基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）一级质谱图；

图8为分离组分0-F1-1的基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS/MS）二级质谱图。

具体实施方式

实施例1

提取、分离、纯化并鉴定具有SEQ ID No：1氨基酸序列的呈味肽

步骤（1）：获得河豚的寡肽（水溶性）提取液

原材料：河豚鱼为江苏中洋集团养殖的暗纹东方鲀。其经过江苏中洋集团的河豚鱼厨师剖杀分装后冰鲜运送回实验室。称取暗纹东方鲀肌肉200g，用绞肉机绞碎后加400ml超纯水匀浆(10000r，3×10s)，静止1小时后于4℃下离心20分钟，收集上清液；滤渣继续使用400ml超纯水重新提取后离心，合并2次上清液储存于-80℃下备用。

步骤（2）：河豚寡肽提取液的分离、纯化

将步骤（1）获得的上清液（河豚寡肽提取液）利用分子量截留范围为3000Da的超滤膜对其进行超滤分离，将分子量小于3000Da的超滤组分收集后继续使用分子量截留范围为200Da的纳滤膜进行纳滤分离，该纳滤膜可以快速去除小分子氨基酸和盐类，收集未能过膜的浓缩液，得到分子量范围为3000Da-200Da的提取液，将提取液冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中。

将前述提取液冷冻干燥后获得的提取组分（本文中用0-F表示）配制成浓度为100mg/ml的溶液，用Sephadex G-15凝胶色谱进行进一步的分离（洗脱液为去离子水，流速为0.75mL/min）。层析图谱结果参见图1，横坐标表示洗脱时间（Elution Time），单位小时（h），纵坐标表示检测波长为220nm的吸光度值。从图1可以看到3个吸收峰（0-F1、0-F2和0-F3），收集洗脱过程先后获得的3个洗脱组分（也称层析组分，依次用0-F1、0-F2和0-F3表示）。将收集的3个层析组分分别冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中。

从图1的结果可以看出，提取组分0-F经过Sephadex G-15凝胶色谱分离成三个主要组分0-F1、0-F2和0-F3，其中组分0-F1的物质含量最高。

步骤（3）：利用人工感官评定方法和电子舌系统测定提取组分0-F和层析组分0-F1、0-F2和0-F3的呈味特性

人工感官评定方法

滋味稀释分析（TDA）法如下：分别取提取组分0-F及层析组分0-F1、0-F2和0-F3的冻干样品各100mg，加水定容于100ml的容量瓶中。再依次取1mL加9mL水进行逐步稀释，各个组分逐步稀释的溶液按照浓度增加的顺序呈给经过训练的评价员(8名：3男，5女，经过培训的感官评定员)，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定。当某个稀释水平的溶液与两个空白(水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，记录此时的稀释倍数，即稀释值(TD)。TD最终结果值取各评价员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。感官评分数据利用SPSS17.0进行单因素方差分析，若有显著性差异，则进行邓肯多重范围检验。每份样品在不同时间内重复三次，均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。

提取组分0-F及层析组分0-F1、0-F2和0-F3的滋味稀释分析结果参见图2。图2柱状图中，横坐标表示提取组分0-F和层析组分0-F1、0-F2和0-F3，纵坐标表示：每个组分的稀释值（即滋味强度）。

从图2中可以看出：提取组分0-F和层析组分0-F1的TD值最高，在相同含量范围内，最具有味感。

提取组分0-F和层析组分0-F1、0-F2和0-F3的人工感官滋味特性评价结果参见表1

表1

从表1的结果可以看出：提取组分0-F和层析组分0-F1的滋味描述最为相似，都具有浓厚感和鲜味。

利用电子舌系统测定层析组分0-F1、0-F2和0-F3的滋味轮廓。本实验采用的电子舌是法国Alpha.MOS公司的Astree电子舌系统，该电子舌系统包含7个非专一性化学传感器阵列（SRS、GPS、STS、UMS、SPS、SWS、BRS）、一个参比电极、电信号处理器以及模式识别系统。每个传感器阵列具有不同的硅胶有机膜，可以对不同的滋味分子产生非特异性吸附，传感器与参比电极之间电势差的变化经电信号处理器转化成可描述的电信号数据，进而数据处理软件将电信号数据转化成可以解释的数据模型。传感器阵列SRS、STS、UMS、SWS、BRS分别对酸味、咸味、鲜味、甜味和苦味敏感，但SWS、BRS传感器要分别涉入相应甜味和苦味物质作为参考标准。传感器阵列GPS和SPS为交敏性传感器，对五个基本味都有敏感性，但敏感程度不同。7个传感器可从总体呈味和具体某种呈味评价待测样品。

电子舌则是对样品和标准品同时进行测定，将得到的原始数据用主成分分析方法（PCA）进行分析。一般为PCA的二维图，PC1表示样品的最主要成分（例如表明了83.521%的样品差异），PC2表示样品的次主要成分（例如表明了12.925%的样品差异）。本实施例中采用0.01摩尔的谷氨酸钠（MSG）溶液作为鉴定鲜味的标准品，通过对比实施例待测样品与标准品之间的距离（软件自动生成）来判断待测样品的滋味（鲜味和甜味）的强度。PC1表示样品的最主要成分，是引起样品差异最主要的因素，因而在判断各组分滋味时主要以PC1方向上的距离远近为辨别标准。

分别将层析组分0-F1、0-F2和0-F3的冻干样品用超纯水配成0.5mg/mL的溶液各80mL。每次取80mL在室温下检测，每个样品检测4次。鲜味对照标准品为0.01mol的谷氨酸钠（MSG）。

图3为层析组分0-F1、0-F2、0-F3和谷氨酸钠（MSG）的电子舌二维主成分分析图。横坐标表示检测到的最主要成分PC1，纵坐标表示检测到的次主要成分PC2。PC1(83.521%)所代表的变量要大于PC2(12.925%)，三个组分的差异首先主要体现在PC1方向上的各组分距离的差异程度，其次是PC2方向上的差异程度。由图3可以看出，层析组分和标准品各自的3次结果聚在一起，但又不完全重合，说明了电子舌的灵敏度高。从PC1可以看出：3个层析组分0-F1、0-F2和0-F3中，0-F1组分最接近谷氨酸钠，这表明相对于其它2个层析组分，0-F1组分的鲜味和甜味最强。

图4为层析组分0-F1、0-F2、0-F3和谷氨酸钠（MSG）的电子舌滋味评价分析图。图中可以看到谷氨酸钠的鲜味最高，在层析组分中，0-F1的鲜味值最高，接近于谷氨酸钠的鲜味值，而0-F2和0-F3的鲜味值则较低，与感官评价结果吻合。同时0-F1的酸味值最高，略高于谷氨酸钠的酸味，而0-F2有最强烈的咸味，略高于谷氨酸钠的咸味值，咸味和酸味容易与鲜味物质产生协同作用，更加提升其鲜味的强度。

综合图1-图4以及表1的结果，可以认为：0-F1组分的滋味强度最高，具有特征性浓厚感和鲜味，因此选择0-F1层析组分进行下一步的RP-HPLC分离纯化。

步骤（4）：针对层析组分0-F1采用RP-HPLC进行分离纯化

采用RP-HPLC方法对层析组分0-F1进行分离纯化。所用色谱柱为Kromasil C18柱(250*10mm，5μm，EKA chemical，Sweden)。RP-HPLC的分离条件为：等度洗脱，90%乙腈和10%超纯水，流速1ml/min,上样量为20μL，检测波长为214nm。

层析组分0-F1的RP-HPLC分离图谱参见图5。图5中横坐标表示保留时间（min），纵坐标表示检测波长为215nm的吸光度值。

从图5中可以看到2个吸收峰（0-F1-1和0-F1-2），收集洗脱过程先后获得的2个分离组分（依次用0-F1-1和0-F1-2表示）。将获得的两个分离组分分别冷冻干燥后储存于-80℃下。

步骤（5）：利用电子舌来测定层析组分0-F1和RP-HPLC分离组分0-F1-1和0-F1-2的呈味特性。

电子舌测定方法参见步骤（3），对照样品为0.01mol的谷氨酸钠溶液（MSG）。

图6为层析组分0-F1，RP-HPLC分离组分0-F1-1、0-F1-2和谷氨酸钠（MSG）的电子舌主成分分析图。其中PC1表明了83.946%样品差异，PC2解释了13.828%样品差异。由图6可以看出,从组分和谷氨酸钠的相对距离可以看出0-F1离谷氨酸钠最为接近，而经过纯化的0-F1-1比0-F1-2更接近于谷氨酸钠，也离0-F1更为接近，所以确定0-F1-1比0-F1-2具有更好的滋味强度，因此选定0-F1-1组分进行结构测定。

步骤（6）：0-F1-1组分的鉴定

制样：取0-F1-1的冻干物8μg，溶解于0.8μL50%乙腈,0.1%含有4mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸的三氟乙酸(TFA)溶液中。

先点0.5μL样品于MALDI不锈钢靶板上，自然干燥后，再点上0.5μL0.5g/Lα-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)溶液（其溶剂为0.1%三氟乙酸-50%乙腈），在室温下自然干燥。另点0.5μL0.5g/L HCCA溶液作空白对照。

利用基质辅助激光解析飞行时间一级质谱（MALDI-TOF/TOF MS）鉴定0-F1-1分离组分的相对分子量。参见图7，为分离组分0-F1-1的基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）一级质谱图，其中横坐标为分子量（m/z），纵坐标为丰度。图7的结果显示0-F1-1的主要离子碎片([M+H]+)为810.9046。经过验证，最后分析出0-F1-1的相对分子量为810.9Da。

利用基质辅助激光解析飞行时间二级质谱（MALDI-TOF/TOFMS/MS））鉴定0-F1-1分离组分的氨基酸序列。参见图8，为分离组分0-F1-1的基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS/MS）二级质谱图，其中横坐标为离子碎片的分子量，纵坐标为丰度。经过分析验证，得到0-F1-1组分的结构序列为Pro-Val-Ala-Arg-Met^*-Cys-Arg，该结构序列中的Met^*表示氧化型甲硫氨酸。

综合图7、图8的结果，可以得到0-F1-1分离组分为较为纯化的呈味肽，其氨基酸序列为Pro-Val-Ala-Arg-Met^*-Cys-Arg，其中Met^*为氧化型甲硫氨酸。

本实施例中从暗纹东方鲀肌肉中提取的呈味肽（其氨基酸序列如SEQID No：1所示）具有特征性浓厚感和鲜味，该呈味肽可应用于食品领域，例如作为基料或辅料来制作调味品。

Claims (8)

1.一种源于河豚鱼的呈味肽，其特征在于：该呈味肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.如权利要求1所述的源于河豚鱼的呈味肽，其特征在于：所述的呈味肽来源于暗纹东方鲀的肌肉。

3.如权利要求1所述的源于河豚鱼的呈味肽，其特征在于：所述的呈味肽通过人工合成方法获得。

4.一种源于河豚鱼的呈味肽的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）从暗纹东方鲀的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；

（2）将前述分子量小于3000Da的超滤组分使用纳滤膜进行纳滤分离，收集未过膜的浓缩液；

（3）将前述未过膜的浓缩液进一步分离纯化后，获得氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的呈味肽。

5.如权利要求4所述的源于河豚鱼的呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中使用分子量截留范围为200Da的纳滤膜进行纳滤分离，收集的未过膜浓缩液的分子量范围为3000Da-200Da。

6.如权利要求4所述的源于河豚鱼的呈味肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中所述未过膜的浓缩液进一步通过凝胶色谱和反相高效液相色谱进行分离纯化。

7.如权利要求1或2所述的源于河豚鱼的呈味肽在食品领域的应用。

8.一种食品调味品，其特征在于：该食品调味品中包含权利要求1所述的源于河豚鱼的呈味肽。