CN108976275A - 从河豚鱼提取呈味肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP‑HPLC分离纯化，具体为：向河豚鱼肉中加重蒸水、莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡后匀浆；将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，沸水提取得水溶性物质提取液，然后切向超滤，滤过液冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解过滤后通过葡聚糖凝胶柱进行分离，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分；将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分用RP‑HPLC纯化，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽。有益效果为：本发明提取方法溶出速率快，溶解度高，亲水性佳，获得鲜味和甜味极佳的呈味肽，得到呈味肽能被快速、准确的分析。

Description

从河豚鱼提取呈味肽的方法

技术领域

本发明涉及生物活性成分提取技术领域，特别是涉及从河豚鱼提取呈味肽的方法。

背景技术

呈味物质能够被人的味觉感知到的特性，我们称之为滋味，它是食品感官质量中最重要的属性。滋味的五种类型甜味、咸味、酸味、苦味、鲜味，其感受器大部分分布于舌头表面。此外，呈味物质能与口腔后部、胃、直肠等部位的部分受体产生特异性结合，虽不能让人产生味感，但有加强味觉感受的作用。近年陆续有研究表明，一些短链小分子肽段也具有滋味特性或对滋味有增效作用，因而将这类小分子多肽作为呈味物质的说法也逐渐被接受。呈味肽是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000Da的寡肽类，包括特征滋味肽和风味前体肽。呈味肽广泛存在于肉、蛋、果蔬等多种天然食品原料中，不仅对食品天然滋味特性有影响，也会在加工过程中与食品中的其他物质相互作用产生更加丰富的滋味特性。

河豚鱼又称连巴鱼、气泡鱼、吹肚鱼等，泛指硬骨纲、鲀形目、鲀科的各属鱼类。河豚鱼味道鲜美，质地鲜嫩，营养丰富，俗有“鱼中之王”的美称，是一种很有经济价值的鱼类。100g河豚鱼肉中蛋白质含量高达18.7g，而脂肪含量仅为0.26g，此外，河豚鱼中含有丰富的维生素以及硒、锌等多种有益的微量元素，同时含有丰富的必需氨基酸和不饱和脂肪酸，尤其是可食部位中的谷氨酸含量为鱼类之最。河豚鱼营养丰富的同时，含有剧毒物质河豚毒素，是一种天然的剧毒生物碱类神经毒素，其毒性比氰化钾还大多倍。它在河豚鱼的血液、鲍、皮肤及生殖腺、肝脏、肾脏和脾脏中都存在着不同程度的分布。这种毒素的存在限制了河豚鱼加工业的发展。如果能够提取河豚鱼肉中的关键呈味物质或者能够模拟其滋味特征，那么就可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种溶出速率快，溶解度高，亲水性佳，获得鲜味和甜味极佳的呈味肽，得到呈味肽能被快速、准确的分析的从河豚鱼提取呈味肽的方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP-HPLC分离纯化，其具体包括如下步骤：

前处理：按固液比为1:3-5（g/mL）向河豚鱼肉中加重蒸水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡25-35min后匀浆，备用；

水溶性多肽制备：将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后沸水提取1-2h，过滤，滤液于温度为2-5℃、转速为10000-12000r/min的条件下离心18-25min，离心上清液用whatman1号滤纸过滤后，将滤液冻干，冻干粉末溶解于4-6倍的重蒸水中，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液，本发明采用沸水法提取呈味肽，提取率最高；

超滤分级：水溶性物质提取液在温度为20-30℃、压力为3-5MPa的条件下，经分子量截留为3-4kDa的超滤膜切向超滤，收集滤过液，冷冻干燥得冻干粉，备用；

凝胶层析分离步骤为：按固液比1:40-60（g/mL）将冻干粉用超纯水溶解，经0.22μm水相滤膜过滤后，通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离，分离条件：玻璃层析柱2.0cm×50cm，上样量2-5mL，流速0.5-2mL/min，检测波长220nm，感官评定每个分离组分并利用电子舌测定其滋味轮廓，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分，凝胶过滤层析利用分子量分级分离，不需要呈味肽的化学结合，降低因不可逆结合所致的呈味肽损失和失活，且由于目标物质需要进行感官评定等，选择葡聚糖凝胶层析可以保持其原有的生化、理化特性，为其滋味特性的验证提供便利；

RP-HPLC分离纯化步骤为：将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分配成8-12mg/mL的溶液，用RP-HPLC纯化，HPLC条件：进样体积50μL，流速1mL/min，检测波长215nm，洗脱A液：0.05%TFA溶液，洗脱B液：纯乙腈溶液，等度洗脱90%A和10%B，将收集的组分用电子舌测定其滋味轮廓，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽，RP-HPLC分辨率、回收率高，重复性好且操作简便，得到的呈味肽兼具鲜味和甜味，是形成河豚鱼鲜美浓郁味感的重要组成成分之一，不含有剧毒物质河豚毒素，可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

作为优选，前处理步骤中莽草酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01-0.02%，对羟基肉桂酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01-0.06‰。莽草酸和对羟基肉桂酸的存在一方面能够改变细胞的渗透压，协助湿法超微粉碎快速破坏细胞膜物质，提高呈味肽的溶出速率，大大提高了提取的效率，另一方面能够作用于肽的疏水端，提高肽在水中的溶解度，使所得水溶性物质提取液中含有较多种类肽，避免呈味肽损失，提高其得率，且能改变疏水性肽多的不良滋味，提高呈味肽的鲜味和甜味。

作为优选，水溶性多肽制备步骤中椰油酰胺丙基甜菜碱的添加量为河豚鱼肉重的0.003-0.005‰。该椰油酰胺丙基甜菜碱加入能够协助沸水改变呈味肽的分子构象，增加呈味肽中氨基酸的亲水性性能，使带正电基团、带负电基团和亲水性基团能快速地接到电子舌上相对应的感受器位置，可实现对呈味肽滋味特性快速、准确的分析，最终提高呈味肽的得率，且分子构象的改变使得呈味肽能更好地与鲜味受体结合，能增加呈味肽的鲜味和甜味。

本发明采用沸水法提取呈味肽，并通过离心、过滤、微滤对杂质进行排除，并通过超滤排除大分子多肽的影响，其中超滤采用切向过滤的方式，保证过滤过程中不会因为压力过大导致膜的破裂引起目标物质的损失，获得鲜味和甜味极佳的呈味肽，可应用于食品领域，作为基料或辅料来制作调味品，为呈味肽在食品领域的应用提供了理论基础。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明采用沸水法提取呈味肽，并通过离心、过滤、微滤对杂质进行排除，并通过超滤排除大分子多肽的影响，获得鲜味和甜味极佳的呈味肽，可应用于食品领域；2）本发明提取方法的前处理步骤能够提高呈味肽的溶出速率和溶解度，避免呈味肽损失，提高其得率，且能改变疏水性肽多的不良滋味，提高呈味肽的鲜味和甜味；3）本发明提取方法能够改变呈味肽的分子构象，增加呈味肽中氨基酸的亲水性性能，使得呈味肽能更好地与鲜味受体结合，能增加呈味肽的鲜味和甜味，且能可实现对呈味肽滋味特性快速、准确的分析，最终提高呈味肽的得率。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP-HPLC分离纯化，其具体包括如下步骤：

1）前处理：按固液比为1:5（g/mL）向河豚鱼肉中加重蒸水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡25min后匀浆，备用；

2）水溶性多肽制备：将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后沸水提取2h，过滤，滤液于温度为2℃、转速为12000r/min的条件下离心18min，离心上清液用whatman 1号滤纸过滤后，将滤液冻干，冻干粉末溶解于6倍的重蒸水中，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液，该步骤采用沸水法提取呈味肽，提取率最高；

3）超滤分级：水溶性物质提取液在温度为20℃、压力为5MPa的条件下，经分子量截留为3kDa的超滤膜切向超滤，收集滤过液，冷冻干燥得冻干粉，备用；

4）凝胶层析分离步骤为：按固液比1:60（g/mL）将冻干粉用超纯水溶解，经0.22μm水相滤膜过滤后，通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离，分离条件：玻璃层析柱2.0cm×50cm，上样量2mL，流速2mL/min，检测波长220nm，感官评定每个分离组分并利用电子舌测定其滋味轮廓，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分，凝胶过滤层析利用分子量分级分离，不需要呈味肽的化学结合，降低因不可逆结合所致的呈味肽损失和失活，且由于目标物质需要进行感官评定等，选择葡聚糖凝胶层析可以保持其原有的生化、理化特性，为其滋味特性的验证提供便利；

5）RP-HPLC分离纯化步骤为：将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分配成8mg/mL的溶液，用RP-HPLC纯化，HPLC条件：进样体积50μL，流速1mL/min，检测波长215nm，洗脱A液：0.05%TFA溶液，洗脱B液：纯乙腈溶液，等度洗脱90%A和10%B，将收集的组分用电子舌测定其滋味轮廓，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽，RP-HPLC分辨率、回收率高，重复性好且操作简便，得到的呈味肽兼具鲜味和甜味，是形成河豚鱼鲜美浓郁味感的重要组成成分之一，不含有剧毒物质河豚毒素，可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

前处理步骤中莽草酸的添加量为河豚鱼肉重的0.02%，对羟基肉桂酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01‰。莽草酸和对羟基肉桂酸的存在一方面能够改变细胞的渗透压，协助湿法超微粉碎快速破坏细胞膜物质，提高呈味肽的溶出速率，大大提高了提取的效率，另一方面能够作用于肽的疏水端，提高肽在水中的溶解度，使所得水溶性物质提取液中含有较多种类肽，避免呈味肽损失，提高其得率，且能改变疏水性肽多的不良滋味，提高呈味肽的鲜味和甜味。

水溶性多肽制备步骤中椰油酰胺丙基甜菜碱的添加量为河豚鱼肉重的0.005‰。该椰油酰胺丙基甜菜碱加入能够协助沸水改变呈味肽的分子构象，增加呈味肽中氨基酸的亲水性性能，使带正电基团、带负电基团和亲水性基团能快速地接到电子舌上相对应的感受器位置，可实现对呈味肽滋味特性快速、准确的分析，最终提高呈味肽的得率，且分子构象的改变使得呈味肽能更好地与鲜味受体结合，能增加呈味肽的鲜味和甜味。

该提取方法采用沸水法提取呈味肽，并通过离心、过滤、微滤对杂质进行排除，并通过超滤排除大分子多肽的影响，其中超滤采用切向过滤的方式，保证过滤过程中不会因为压力过大导致膜的破裂引起目标物质的损失，获得鲜味和甜味极佳的呈味肽，可应用于食品领域，作为基料或辅料来制作调味品，为呈味肽在食品领域的应用提供了理论基础。

实施例2：

从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP-HPLC分离纯化，其具体包括如下步骤：

1）前处理：按固液比为1:4（g/mL）向河豚鱼肉中加重蒸水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡30min后匀浆，备用；

2）水溶性多肽制备：将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后沸水提取1.5h，过滤，滤液于温度为4℃、转速为11000r/min的条件下离心20min，离心上清液用whatman 1号滤纸过滤后，将滤液冻干，冻干粉末溶解于5倍的重蒸水中，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液；

3）超滤分级：水溶性物质提取液在温度为25℃、压力为4MPa的条件下，经分子量截留为3.5kDa的超滤膜切向超滤，收集滤过液，冷冻干燥得冻干粉，备用；

4）凝胶层析分离步骤为：按固液比1:50（g/mL）将冻干粉用超纯水溶解，经0.22μm水相滤膜过滤后，通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离，分离条件：玻璃层析柱2.0cm×50cm，上样量4mL，流速1mL/min，检测波长220nm，感官评定每个分离组分并利用电子舌测定其滋味轮廓，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分；

5）RP-HPLC分离纯化步骤为：将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分配成10mg/mL的溶液，用RP-HPLC纯化，HPLC条件：进样体积50μL，流速1mL/min，检测波长215nm，洗脱A液：0.05%TFA溶液，洗脱B液：纯乙腈溶液，等度洗脱90%A和10%B，将收集的组分用电子舌测定其滋味轮廓，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽。

前处理步骤中莽草酸的添加量为河豚鱼肉重的0.015%，对羟基肉桂酸的添加量为河豚鱼肉重的0.04‰。

水溶性多肽制备步骤中椰油酰胺丙基甜菜碱的添加量为河豚鱼肉重的0.004‰。

实施例3：

从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP-HPLC分离纯化，其具体包括如下步骤：

1）前处理：按固液比为1:3（g/mL）向河豚鱼肉中加重蒸水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡35min后匀浆，备用；

2）水溶性多肽制备：将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后沸水提取1h，过滤，滤液于温度为5℃、转速为10000r/min的条件下离心25min，离心上清液用whatman 1号滤纸过滤后，将滤液冻干，冻干粉末溶解于4倍的重蒸水中，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液，本发明采用沸水法提取呈味肽，提取率最高；

3）超滤分级：水溶性物质提取液在温度为30℃、压力为3MPa的条件下，经分子量截留为4kDa的超滤膜切向超滤，收集滤过液，冷冻干燥得冻干粉，备用；

4）凝胶层析分离步骤为：按固液比1:40（g/mL）将冻干粉用超纯水溶解，经0.22μm水相滤膜过滤后，通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离，分离条件：玻璃层析柱2.0cm×50cm，上样量5mL，流速0.5mL/min，检测波长220nm，感官评定每个分离组分并利用电子舌测定其滋味轮廓，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分；

5）RP-HPLC分离纯化步骤为：将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分配成12mg/mL的溶液，用RP-HPLC纯化，HPLC条件：进样体积50μL，流速1mL/min，检测波长215nm，洗脱A液：0.05%TFA溶液，洗脱B液：纯乙腈溶液，等度洗脱90%A和10%B，将收集的组分用电子舌测定其滋味轮廓，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽。

前处理步骤中莽草酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01%，对羟基肉桂酸的添加量为河豚鱼肉重的0.06‰。

水溶性多肽制备步骤中椰油酰胺丙基甜菜碱的添加量为河豚鱼肉重的0.003‰。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.从河豚鱼提取呈味肽的方法，包括前处理、水溶性多肽制备、超滤分级、凝胶层析分离、RP-HPLC分离纯化，其特征在于：所述前处理步骤为：向河豚鱼肉中加重蒸水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡后匀浆，备用。

2.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述莽草酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01-0.02%，对羟基肉桂酸的添加量为河豚鱼肉重的0.01-0.06‰。

3.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述河豚鱼肉和重蒸水的固液比为1:3-5（g/mL），浸泡25-35min。

4.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述水溶性多肽制备步骤为：将匀浆中加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后沸水提取1-2h，过滤，离心上清液过滤，将滤液冻干，冻干粉末溶解于4-6倍的重蒸水中，微孔滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液。

5.根据权利要求4所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述椰油酰胺丙基甜菜碱的添加量为河豚鱼肉重的0.003-0.005‰。

6.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述超滤分级步骤为：水溶性物质提取液在温度为20-30℃、压力为3-5MPa的条件下，经分子量截留为3-4kDa的超滤膜切向超滤，收集滤过液，冷冻干燥得冻干粉，备用。

7.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述凝胶层析分离步骤为：按固液比1:40-60（g/mL）将冻干粉用超纯水溶解，过滤后通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离，感官评定每个分离组分并利用电子舌测定其滋味轮廓，筛选出滋味特性强同时肽含量高的组分。

8.根据权利要求7所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述分离条件：玻璃层析柱2.0cm×50cm，上样量2-5mL，流速0.5-2mL/min，检测波长220nm。

9.根据权利要求1所述的从河豚鱼提取呈味肽的方法，其特征在于：所述RP-HPLC分离纯化步骤为：将凝胶层析分离筛选得到的呈味多肽组分配成8-12mg/mL的溶液，用RP-HPLC纯化，HPLC条件：进样体积50μL，流速1mL/min，检测波长215nm，洗脱A液：0.05%TFA溶液，洗脱B液：纯乙腈溶液，等度洗脱90%A和10%B，将收集的组分用电子舌测定其滋味轮廓，收集滋味特性强且肽含量高的组分，冷冻干燥，即得呈味肽。