CN110343146B - 一种蟹味菇呈味肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蟹味菇呈味肽及其制备方法和应用。所述的蟹味菇呈味肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的蟹味菇呈味肽，味感鲜美，添加在食物中，带来浓厚的味感效果。本发明研究发现，利用本实施例制备的蟹味菇呈味肽进行美拉德反应，所获得的美拉德肽具有良好的风味增强效果。

Description

一种蟹味菇呈味肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品学领域，涉及一种调味品，具体来说是一种蟹味菇呈味肽。

背景技术

浓厚感是除了五个基本味觉(酸、甜、苦、咸、鲜)之外的第六种味觉感受，它是由日本科学家最先发现和命名的。浓厚感肽是一种可以使食物整体浓厚感增加的物质，英文名为kokumi肽。和鲜味不同的是浓厚感并不是明显可以感知的滋味，它多半是指的一种感觉：加入了kokumi肽后食物变得更鲜美了，浓厚感更强了，食物更有滋味了等。具有kokumi味感的物质中以肽类物质居多。Kokumi肽通常在溶于水后与鲜味味感接近，与盐或谷氨酸钠同时存在时可以显著降低盐与谷氨酸钠的阈值，这一点也可以称之为一种味觉增强剂。Kokumi肽由于本身没有明显味道，所以它不会影响食物本身的滋味。

食物的味觉研究科学家在探索食物味道呈现原理中发现食物的味道是多样性的。而这些滋味是由不同的味蕾上的味觉敏感受体首先刺激并感知，然后通过特定的传导通路传到人体的大脑神经中枢的。人们对滋味的感觉通常分为3个阶段：前、中、后。加入kokumi肽的食物滋味会在前段更加圆和自然，中段更加绵厚，后段更加回味悠长。

研究发现，浓厚感肽能够刺激CaSR钙敏感受体。可以激发人体的钙敏感受体并可能修饰酸、甜、苦、咸、鲜等基本味感。最近的研究表明，浓厚感肽是有特定的钙敏感受体感知的。多种呈味多肽在一起具有协同作用，不同钙敏感受体会有复杂感知，会使甜的味道更甜，咸的味道更咸，并增加整体的滋味感受。

蟹味菇(hypsizygus marmoreus)隶属担子菌亚门、伞菌亚纲、伞菌目、离褶伞科、玉蕈属，是北温带一种优良的食用菌，其色灰白，盖半球形，盖中央有浅褐色隐印斑纹，肉质细嫩，具有浓厚的海鲜蟹味，产量高。蟹味菇含有丰富的多糖、维生素和氨基酸。新鲜的菇质感厚重，摸起来比较硬，重量轻，含水量高。现阶段对蟹味菇的研究主要集中在其栽培方面，关于呈味肽研究罕有报道。但实际测定表明，烘干的蟹味菇含有相比其他品种更多的蛋白质，为26.81％，所以从蟹味菇中提取呈味肽可行。

发明内容

本发明目的是提供一种蟹味菇呈味肽及其制备方法和应用，所述的这种蟹味菇呈味肽可以添加于食品或调味料中，丰富食品及调味料的口感，使其更加鲜美。

为了达到上述目的，本发明提供了一种蟹味菇呈味肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了上述的蟹味菇呈味肽的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：采用高压蒸煮法从蟹味菇中提取水溶性成分；

步骤2：采用超滤膜分离法截留分子量为500Da和3000Da之间的组分；

步骤3：对所得的膜分离组分进行层析和高效液相分离纯化，获得氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蟹味菇呈味肽。

优选地，所述的步骤1中的高压蒸煮条件为：将蟹味菇洗净，加水匀浆后，在35kPa-45kPa的压力下蒸煮1.5h-3.5h，过滤离心后，收集上清液。

优选地，所述的步骤3中的层析采用凝胶色谱。

优选地，所述的蟹味菇呈味肽采用UPLC-Q-TOF-MS鉴定。

本发明还提供了上述的蟹味菇呈味肽在食品中的应用。

本发明还提供了一种食品，其特征在于，含有上述蟹味菇呈味肽。

优选地，所述的食品为调味料。

本发明还提供了一种蟹味菇美拉德肽，由上述的蟹味菇呈味肽进行美拉德反应制得。

本发明所述的蟹味菇呈味肽来源于蟹味菇提取物。在本发明的具体实施方式中，对超滤组分进行层析后，通过人工感官评价选出浓厚感最强的组分，将该组分采用Sephadex G-15凝胶色谱方法进行层析。再将层析各组分加入鸡汤中，通过人工感官评价，选取最具有浓厚感的组分。优选地，采用RP-HPLC方法进行分离纯化。优选地，以UPLC-Q-TOF-MS进行结构鉴定。

本发明首先通过高压蒸煮从蟹味菇中获取水溶性成分，再对该水溶性成分进行膜分离，在进一步分离纯化。本发明的蟹味菇呈味肽作为呈味物质的一种，应用于食品领域，例如用于食品调味料的基料或辅料，这些是呈味物质的常规应用。

本发明和现有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的蟹味菇呈味肽，味感鲜美，添加在食物中，带来浓厚的味感效果。本发明研究发现，利用本实施例制备的蟹味菇呈味肽进行美拉德反应，所获得的美拉德肽具有良好的风味增强效果。

附图说明

图1为分子量为500Da-3000Da的膜分离组分经过Sephadex G-15凝胶色谱分离后的层析谱图。

图2为膜分离组分P2和层析组分F1-F6的滋味稀释分析结果。

图3为层析组分F1-F6在鸡汤中的味觉强度结果。

图4为层析组分F4的RP-HPLC分离谱图。

图5为F4a、F4b和F4c三个组分在鸡汤中的味觉强度结果。

图6为F4b组分的飞行时间质谱(TOF MS)一级质谱图；

图7为F4b组分的飞行时间质谱(TOF MS)二级质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种蟹味菇呈味肽的制备方法，具体步骤为：

步骤(1)：制备蟹味菇水溶性提取液

原材料：蟹味菇购自上海丰科生物科技有限公司。将蟹味菇清洗干净并去除杂质后，加水用匀浆机匀浆，然后按照1:1的比例加入去离子水，在40kPa的压力下蒸煮120分钟。用双层纱布过滤，滤液在10000r的转速下4℃离心10分钟，收集上清液。

步骤(2)：蟹味菇浓厚感肽提取液的分离、纯化

将上一步获取的上清液用分子量截留范围为3000Da和500Da的超滤膜进行超滤分离，收集分子量为小于500Da、500-3000Da和大于3000Da的超滤组分(记为P1、P2和P3)，冷冻干燥后储存于-20℃冰箱中。

将膜分离组分P2(冷冻干燥后的样品粉末)配制成浓度为25mg/ml的溶液，以超纯水为洗脱液，洗脱流速为0.9ml/min条件下，用Sephadex G-15凝胶色谱进行进一步层析分离。层析图谱结果见图1，横坐标表示洗脱时间(min)，纵坐标为检测波长为220nm下的丰度。从图1可以看到6个吸收峰，即层析得到6个分离组分，收集洗脱过程先后获得的6个层析组分(依次用F1、F2、F3、F4、F5和F6表示)。对其进行冷冻干燥，冻干的样品粉末与-20℃条件下贮存备用。

步骤(3)：利用人工感官评定分析来分析超滤组分P2和层析组分F1-F6的呈味特性。

感官评定的方法采用滋味稀释分析法(TDA)来确定凝胶分离得到的各个组分和膜分离组分P2的稀释因子，具体操作如下：分别取P2、F1-F6的冻干组分样品配成25mg/ml的溶液，并采用去离子水1:1的比例进行逐步稀释，配成一系列浓度梯度的溶液，采用三点检验法对每个稀释水平进行鉴评，直到某稀释倍数尝不到滋味为止。记录该稀释倍数，即为稀释因子(TD)。感官评价员为8人(4男4女，年龄25岁到30岁)，进行感官分析前，先以1％蔗糖溶液用作甜味标准品，以0.35％氯化钠溶液作为咸味标准品，以0.08％奎宁溶液作为苦味标准品，以0.35％谷氨酸钠溶液作为鲜味标准品，以0.08％柠檬酸溶液作为酸味标准品，对感官分析小组成员进行培训。于每日9:00am-12:00am进行啜饮，共进行五日，训练他们的味觉感官。将某个稀释水平溶液和两个去离子水之间的滋味差异刚好被识别出来时的稀释倍数即为滋味强度稀释因子，即为TD值。TD值取各个感官评价员的鉴评结果的平均值，每份样品在不同时间内重复三次，常温下测评。每位感官评价员还需对每个样品在水中的滋味特性进行描述性感官评价。

膜分离组分P2和层析组分F1-F6的滋味强度稀释因子结果见图2，图中横坐标表示组分名，纵坐标表示各组分的滋味强度稀释因子。

从图2可以看出，膜分离组分P2和层析组分F4的TD值最高，在相同范围内味感最强。

超滤组分P2和层析组分F1-F4的人工感官滋味特性评价结果参见下表。

表1感官评价结果

从表1结果可以看出，层析组分F4和膜分离组分P2的滋味描述最像，其鲜味都比较明显，且味感浓郁。

为了进一步确定各组分的味感，采用5分标度法，利用鸡汤与呈味肽作用，进行感官分析。感官评价评分0表示没有味道，5表示浓厚味感最为浓烈。对呈味肽滋味进行浓厚感感官评定时，样品温度维持在40±2℃。

将层析各组分F1-F6配制成0.2g/L溶液，各组取10ml分别加入50ml的鸡汤参考液中，配制成样品溶液，并以纯鸡汤参考液加10ml去离子水作为空白对照。鸡汤参考液的配制使用清炖鸡汤浓汤宝，购自联合利华公司，采用每128g浓汤宝加入1000ml去离子水稀释获取，然后封存备用。评分结果如图3所示。

综合图1-图3以及表1的结果，可以认为：F4组分的呈味肽鲜味最强，味感最为浓郁，因此选择F4组分进行下一步的RP-HPLC分离纯化。

步骤(4)：进一步分离纯化F4组分

采用RP-HPLC方法对F4组分进行进一步分离纯化。所用色谱柱为Spursil C18(5μm，250*4.6mm；Dikma Technologies Inc.)。RP-HPLC的分离条件为：等度洗脱，30％甲醇和70％超纯水，流速：0.8mL/min，柱温：25℃，上样量为10μL，检测波长220nm。

层析组分F4的RP-HPLC分离谱图见图4。图中横坐标表示洗脱时间(min)，纵坐标表示检测波长220nm下的丰度。

由图4中可以看到三个吸收峰，收集洗脱过程的吸收峰，得到3个分离组分(依次记为F4a、F4b、F4c)。各组分冷冻干燥后于-80℃保存。

步骤(5)：利用人工感官评定分析来分析RP-HPLC分离组分的呈味特性。

感官评价由8名感官评价员(4男4女，年龄25岁到30岁)完成。按照步骤(3)中的培训方法对评价员进行训练。按5分标度法配制感观样品。将RP-HPLC组分F4a、F4b、F4c配制成0.2g/L溶液，各组取10ml分别加入50ml的鸡汤参考液中，配制成样品溶液。以10ml去离子水加50ml鸡汤做空白对照。由感官评价员进行品评。感官评价评分0表示没有味道，5表示浓厚味感最为浓烈，品评样品温度为40±2℃。感官评价结果如图5。

由图5可以看出，组分F4b的浓厚味感最强，因此选择F4b进行多肽序列鉴定。

步骤(6)组分F4b的多肽序列结构鉴定

制样：将F4组分样品溶于色谱纯水中，在漩涡混合仪上混合使其充分溶解，然后离心后取上层清液备用。

UPLC-Q-TOF-MS测定条件如下：

液相条件：采用BEH C18色谱柱(5cm×2.1mm，1.7μm)：进样量10μL；流速：0.3ml/min；采用两种洗脱液作为流动相进行梯度洗脱，洗脱液A为0.1％乙腈水溶液，洗脱液B为0.1％甲酸水溶液；柱温45℃；梯度洗脱条件如下：0-2min：100％B；2-3min：90％B；3-10min：0％B。

质谱条件如下：电离模式：ESI+，毛细管电压3.2KVolts，锥孔电压20KVolts，离子源温度100℃，脱溶剂气化温度400℃，锥孔流速50L/h，离子能量1Volt，碰撞能量6Volts和20Volts，扫描时间1s，检测电压1700Volts，质量范围20-1000m/z。

UPLC-Q-TOF-MS对组分F4b进行分离鉴定后，通过Masslynx中的Biolynx鉴定F4b分离组分的相对分子量。图6的横坐标为分子量(m/z)，纵坐标表示丰度。从图6结果显示F4b的主要离子碎片([M+H]⁺)为505.8，最后分析相对分子质量为503.99Da。通过二级质谱鉴定F4b分离组分的氨基酸序列，经过分析得出最后的肽序列为Gly-Val-Gly-Ala-Pro，结果见图7。图7的横坐标为离子碎片的分子量(m/z)，纵坐标为丰度。

综上，可以得到RP-HPLC分离组分F4b的一种呈味肽，其多肽序列结构为Gly-Val-Gly-Ala-Pro，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(7)，蟹味菇美拉德肽的制备。

将上述得到的蟹味菇呈味肽用水溶解，配制成20％的肽溶液，按肽糖比例3:1的比例加入木糖，混合均匀后用1％的柠檬酸和5％的柠檬酸钠溶液调节pH为8.0，在120℃条件下反应3h，采用冰水冷却终止反应。感官评价结果发现，蟹味菇呈味肽进行美拉德反应后，其鲜味及浓厚感更为浓郁。本实施例中的蟹味菇呈味肽有明显的风味增强效果，可以用于食品领域，可以作为基料和辅料加入调味品，丰富食品味感。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种蟹味菇呈味肽及其制备方法和应用

<130> BCN1191681

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Gly Val Gly Ala Pro

1 5

Claims (2)

1.一种蟹味菇呈味肽在调味料中的应用，其特征在于，所述蟹味菇呈味肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种调味料，其特征在于，含有一种蟹味菇呈味肽，所述蟹味菇呈味肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

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