CN109329860A - 一种鲜味肽和鲜味肽调味料以及它们的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲜味肽和鲜味肽调味料以及它们的制备方法，其中，鲜味肽包括氨基酸序列为Lys‑Gly‑Ser‑Leu‑Ala‑Glu‑Glu‑Glu的多肽，其制备方法为：将尼罗罗非鱼捣碎，加入蛋白水解酶进行酶解，再对酶解产物离心、浓缩，然后用Sephadex G‑15色谱柱对浓缩液进行分离，取其中的第三个组分，用RP‑HPLC对该组分进行分离，取其中的第二个组分，得鲜味肽。鲜味肽调味料的制备方法为：将上述制得的鲜味肽加入美拉德反应基料中，在105～125℃条件下经过美拉德反应制得。本发明中的鲜味肽和调味料不仅味道鲜美，而且具有较高的营养价值，是一种理想的味道调节制品。
Description
技术领域
本发明属于调味品制备技术领域，具体涉及一种鲜味肽和鲜味肽调味料以及它们的制备方法。
背景技术
尼罗罗非鱼是我国主要的食用鱼之一，肉质鲜美、细嫩，无论是红烧还是清烹，皆汁鲜味美，深受人们的喜爱。尼罗罗非鱼肌肉中粗蛋白含量在80％以上，氨基酸种类齐全，富含谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等呈鲜味的氨基酸，是营养全面、味道鲜美的优质蛋白源。提取尼罗罗非鱼肌肉中关键的呈鲜多肽并添加到食物中，有利于重现尼罗罗非鱼的鲜味，有效提升食物的鲜美风味，增加消费者的感官享受。
鲜味是由鲜味物质刺激人体味蕾上特定的鲜味受体产生一系列味觉信号并促使大脑感知到的一种令人愉悦而复杂的味道。而鲜味肽是一类由两个及以上的氨基酸组成的在一定浓度下能够呈现出鲜味味感的多肽或其盐类，广泛存在于畜禽肉类、鱼贝类、乳类、豆类乃至部分天然发酵类食物中。鲜味肽除本身具有特征鲜味外，其还能与还原糖、氨基酸、核苷酸等物质共同参与美拉德反应，产生特殊的复合风味，添加至食物中能有效改善其色泽和滋味，赋予食品整体味感协调、鲜香、醇厚、浓郁等特性，是制备新型复合调味品的重要基料。与目前常用的鲜味调味品谷氨酸钠、核苷酸等产品相比，呈鲜多肽天然的食物来源保证了其安全性，有食品的天然味感，作为鲜味剂能最大限度地保持原有食品的天然味道。以鲜味肽作为食品鲜味剂，不仅可提高食品的鲜味，还具有较高的营养价值。天然、营养的复合调味料是今后调味品行业发展的趋势，目前市场上的鲜味调味料主要以谷氨酸钠为主，而以鲜味肽、氨基酸、核苷酸为基料的富有营养价值的中高档复合调味品还很少见。
发明内容
本发明为克服目前鲜味调味料产品成分单一、鲜味味感不柔和、营养价值低等不足，提供了一种鲜味多肽以及包含该鲜味肽的调味料，同时还提供鲜味肽以及鲜味肽调味料的制备方法。
本发明中的鲜味肽包括氨基酸序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的多肽，其在水溶液中的呈鲜阈值为0.25mg/mL。本发明中的鲜味肽从尼罗罗非鱼中获得，具体获得方法包括以下步骤：
S1:取尼罗罗非鱼鱼肉，捣碎后加入蛋白水解酶，调节其pH值为6.0～7.0，并在50～60℃条件下酶解12～24h，再在90～95℃条件下灭酶10～20min，得酶解产物；
S2:以7000～8000rmp的转速对酶解产物进行离心处理，取上清液，并将上清液过200～3000Da的滤膜，得浓缩液；
S3:用凝胶色谱柱Sephadex G-15对浓缩液进行分离，收集其中的第三个组分U-3，再用RP-HPLC对U-3进行分离，收集其中的第二个组分U-3-2，并冷冻干燥，得鲜味肽冻干粉。
本发明中鲜味肽的制备方法可以进行如下改进：
进一步，本发明中所用到的蛋白水解酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶的至少一种。
进一步，在用蛋白水解酶对尼罗罗非鱼进行酶解时，加入的蛋白水解酶占匀浆液质量的1.2％～1.6％。
进一步，S1中酶解温度为55℃，酶解时间为20h，灭酶温度为95℃，灭酶时间为15min。
进一步，S2中先用3000Da的超滤膜对上清液进行过滤，再用200Da的纳滤膜对滤液进行除杂，得浓缩液。
制备出鲜味肽后，将其与其他鲜味物质混合，并通过美拉德反应制备出鲜味肽调味料，具体方法为：将前面制得的鲜味肽加入到美拉德反应基料中，配成浓度为0.5～2.0mg/mL的鲜味肽溶液，调节鲜味肽溶液pH值为5.0～6.0，并将其置于105～125℃条件下进行美拉德反应，反应2～3h得复合鲜味肽液，依次对复合鲜味肽液进行浓缩和冷冻干燥处理，得鲜味肽调味料；美拉德反应基料包括以下质量百分比的组分：木糖10％，半胱氨酸1.0～2.0％，牛磺酸2.0～2.5％，硫胺素1.0～2.0％，复合氨基酸0.5～1.0％，牛脂2.0～3.0％，余量为超纯水。
美拉德反应基料优先采用如下质量百分比的组分：美拉德反应基料包括以下质量百分比的组分：木糖10％，半胱氨酸2.0％，牛磺酸2.0％，硫胺素2.0％，复合氨基酸1.0％，牛脂2.0％，余量为超纯水。
本发明的有益效果是：本发明提供的尼罗罗非鱼来源的新型呈鲜多肽的鲜味强度较高，与核苷酸、还原糖、氨基酸和硫胺素等共同作用后产生的风味物质能制备具有类似熟制鱼肉风味的多肽新型复合调味料，将其添加到食物中可效提升其整体风味。
附图说明
图1为罗非鱼200Da～3000Da滤液Sephadex G-15凝胶分离色谱图；
图2为组分U-3的RP-HPLC分离色谱图；
图3为鲜味肽对酱油滋味的影响；
图4为鲜味肽美拉德反应产物对肉汤滋味的影响。
具体实施方式
本发明中为解决目前鲜味调味料产品成分单一、鲜味味感不柔和、营养价值低等问题，提供了一种鲜味多肽及其制备方法，以及包含该鲜味肽的调味料。
本发明中的鲜味肽包括氨基酸序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的多肽，其在水溶液中的呈鲜阈值为0.25mg/mL。本发明中的鲜味肽优先从尼罗罗非鱼中获得，下面结合实施例对本发明中的鲜味肽以及调味料的制备方法进行详细的说明。
实施例一
(1)蛋白酶解液的制备：选取来自德阳什邡市穗丰良种繁育场提供的尼罗罗非鱼，其经养殖基地专业人员剖杀、剔骨后冷链运送回制备基地。制备鲜味肽时，将鱼解冻，置于绞肉机中绞碎后称重，然后加入碎肉两倍重的超纯水，用高速组织捣碎机匀浆。调节罗非鱼肌肉匀浆液pH至7.0，并加入占匀浆液质量0.05％的木瓜蛋白酶和0.02％的中性蛋白酶，混合搅拌均匀后置于50℃的水浴锅中水解20h，再加入占匀浆液质量1.15％的风味蛋白酶，在50℃下继续水解4h。水解结束后，将水解产物加热至95℃，灭酶15min，得酶解产物。在4℃条件下，用8000rmp的速率对酶解产物离心20min，收集上清液，沉淀继续用超纯水匀浆离心提取，合并上清液，获得尼罗罗非鱼蛋白酶水解液，并于-80℃超低温冰箱储存备用。
(2)超滤制备浓缩液：利用分子量截留为3000Da的超滤膜对获得的尼罗罗非鱼蛋白酶水解液进行超滤富集，将分子量小于3000Da的超滤组分收集后继续使用分子量截留为200Da的纳滤膜进行纳滤分离，该纳滤膜可以快速去除小分子氨基酸和盐类，收集未能过膜的浓缩液，得到分子量范围为3000Da～200Da的浓缩液，将浓缩液冷冻干燥后储存于-80℃超低温冰箱中备用。
(3)分离纯化及质谱鉴定：优先采用Sephadex G-15凝胶色谱(2.0cm×50cm)对浓缩液进行进一步纯化，将步骤(2)中获得的3000Da～200Da的肽冻干粉用超纯水配成10mg/mL的溶液，经0.45μm的水相滤膜过滤后，开始进行分离，分离条件为：上样量2mL，流速1mL/min，检测波长220nm，结果获得4个组分，如图1所示。分别收集各凝胶层析组分峰，冷冻干燥后储存于-80℃下备用。分别对其进行感官评价，感官评价方法为：样品用蒸馏水配置为浓度为10mg/mL的初始肽溶液，按1:1的比例逐步稀释，各个稀释液按照浓度增加的顺序呈给12名(6男，6女)经过感官训练的评价员，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定：当某个稀释水平的溶液与两个空白(蒸馏水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，记录此时的稀释倍数，即稀释值(TD)。TD最终结果值取各评价员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。感官评分数据利用SPSS 21.0进行单因素方差分析，若有显著性差异，则进行邓肯多重范围检验。每份样品在不同时间内重复三次，均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。将各组分的感官评价结果列于表1中，从表中可以看出，鲜味最强的肽段为组分U-3。
表1罗非鱼凝胶分离组分感官评价表
将组分U-3溶于超纯水中配成浓度为20mg/mL的溶液，经RP-HPLC进行进一步分离纯化，分离条件为：进样体积20μL，柱温30℃，流速0.6mL/min，检测波长220nm。RP-HPLC分离结果表明组分U-3中主要包含两条肽段，如图2所示，分别为U-3-1和U-3-2，其中U-3-2为U-3的主要成分。采用MALDI-TOF-MS质谱对该液相分离组分进行分析鉴定，鉴定U-3-2的氨基酸序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu。
(4)化学合成验证：于上海淘普生物科技有限公司经固相多肽合成法合成步骤(3)中所述序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的多肽，结合感官评价验证其呈味，结果如表1所示。结果表明组分U-3中的主要呈鲜物质是序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的多肽，根据其TD值进行进一步低倍稀释，结合感官评价最终确定其阈值为0.25mg/mL。
实施例二
称取实施例一中的尼罗罗非鱼碎肉100g，加入200mL超纯水，于高速组织捣碎机中匀浆，然后向匀浆液中加入占匀浆液质量0.5％的木瓜蛋白酶、1.0％的风味蛋白酶、0.05％胰蛋白酶和0.01％中性蛋白酶，混合搅拌均匀，并调节匀浆液的pH至6.0，然后置于60℃的水浴锅中，水解12h。水解结束后，将水解产物加热至90℃，灭酶20min，得酶解产物。在4℃条件下，用7000rmp的速率对酶解产物离心25min，沉淀继续用超纯水匀浆离心提取，合并上清液，获得尼罗罗非鱼蛋白酶水解液，并于-80℃超低温冰箱储存备用。
经如实施例一所述的超滤、Sephadex G-15凝胶色谱和RP-HPLC纯化、MALDI-TOF-MS质谱鉴定后得到氨基酸序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的鲜味肽冻干粉。
实施例三
以实施例二中的鲜味肽冻干粉为原料，将该冻干粉按0.3mg/mL浓度添加到酱油中，此酱油标记为鲜味肽酱油。随机挑选12名感官评定员对其进行感官评价，以酱油为对照组，以0.08％的柠檬酸溶液，1％的蔗糖溶液，0.08％的奎宁溶液，0.35％的食盐溶液，0.35％的谷氨酸钠溶液分别作为酸、甜、苦、咸、鲜五种基本味觉的呈味标准溶液，以标准溶液为5分，采用10分制对鲜味肽酱油溶液进行感官评价打分，以评定其呈味强度。所有样品皆由3位随机数编码后再交由感官评价员进行滋味评定，同个样品重复评价3次，取3次测定平均值为最终评价分数。感官评分结果发现该鲜味肽能有效提升酱油的鲜味，如图3所示。
实施例四
以实施例二中酶解纯化所得的鲜味肽为原料，将其加入到美拉德反应基料中，配成浓度为1mg/mL的鲜味肽溶液，调节鲜味肽溶液的pH值至6.0，搅拌均匀后送至美拉德反应釜中，升温至110℃，进行美拉德反应，反应2.5h得复合鲜味肽液，感官评价结果如图4所示。将该美拉德复合鲜味肽液在真空浓缩机中50～60℃条件下进行浓缩；将美拉德复合鲜味肽液浓缩液置于真空冷冻干燥设备中，在温度为-40℃，真空度在0.8MPa条件下进行冷冻干燥10h，将粉状产品密封保存，即得一种美拉德复合调味料。将该美拉德复合调味料添加于肉汤中，使其在肉汤中的浓度为0.02％，该肉汤记为鲜味肽肉汤。随机挑选12名感官评定员对鲜味肽肉汤进行感官评价，以原始肉汤为对照，按照实施例三所述的感官评价方法进行比评。结果表明鲜味肽肉汤的鲜味较纯肉汤而言显著增强，如图4所示。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种鲜味肽，其特征在于，包括氨基酸序列为Lys-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu的多肽。
2.根据权利要求1所述的鲜味肽，其特征在于：所述鲜味肽的呈鲜阈值为0.25mg/mL。
3.制备如权利要求1～2任一项所述鲜味肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:取尼罗罗非鱼鱼肉，捣碎匀浆后加入蛋白水解酶，调节匀浆液的pH值为6.0～7.0，在50～60℃条件下酶解12～24h，再在90～95℃条件下灭酶10～20min，得酶解产物；
S2:以7000～8000rmp的转速对酶解产物进行离心处理，取上清液，并将上清液过200～3000Da的滤膜，得浓缩液；
S3:用凝胶色谱柱Sephadex G-15对浓缩液进行分离，收集其中的第三个组分U-3，再用RP-HPLC对U-3进行分离，收集其中的第二个组分U-3-2，并冷冻干燥，得鲜味肽冻干粉。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白水解酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶的至少一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白水解酶占匀浆液质量的1.2％～1.6％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：S1中酶解温度为55℃，酶解时间为20h，灭酶温度为95℃，灭酶时间为15min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：S2中先用3000Da的超滤膜对上清液进行过滤，再用200Da的纳滤膜对滤液进行除杂，得浓缩液。
8.一种鲜味肽调味料，其特征在于：包括权利要求1或2所述的鲜味肽。
9.权利要求8所述鲜味肽调味料的制备方法，其特征在于：将鲜味肽加入到美拉德反应基料中，配成浓度为0.5～2.0mg/mL的鲜味肽溶液，调节鲜味肽溶液的pH值为5.0～6.0，并将其置于105～125℃条件下进行美拉德反应，反应2～3h得复合鲜味肽液，依次对复合鲜味肽液进行浓缩和冷冻干燥处理，得鲜味肽调味料；所述美拉德反应基料包括以下质量百分比的组分：木糖10％，半胱氨酸1.0～2.0％，牛磺酸2.0～2.5％，硫胺素1.0～2.0％，复合氨基酸0.5～1.0％，牛脂2.0～3.0％，余量为超纯水。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述美拉德反应基料包括以下质量百分比的组分：木糖10％，半胱氨酸2.0％，牛磺酸2.0％，硫胺素2.0％，复合氨基酸1.0％，牛脂2.0％，余量为超纯水。
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