CN110484586A - 一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，包括如下步骤：以罗非鱼骨为原料，清洗、干燥、粉碎、脱脂、超声波辅助酸解、酶解、离心、上清液经过膜分离、离子交换树脂吸附、解吸、干燥获得风味肽粗品。本发明具有节能环保、生产效率高、产品品质高等优点，有效推动罗非鱼加工副产物的资源化利用，有利于提升加工企业经济效益，具有积极的经济价值。

Description

一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法

技术领域

本发明属于农产品综合加工与天然产物提取技术领域，具体涉及一种从罗非鱼骨中制备风味肽的方法，该方法通过超声波辅助酶解、膜分离、树脂吸附等工序制备苦味肽与鲜味肽。

背景技术

罗非鱼是世界重要的养殖水产之一，我国是全球最大的罗非鱼养殖国与加工出口国，2017年产量为177万吨，其中约25％出口国外。目前，我国出口罗非鱼产品以冻鱼片为主。在加工冻鱼片过程中，会产生大量低价的副产品，如鱼骨、鱼皮、鱼鳞等。由于缺乏相关加工技术，上述加工副产物往往通过简单加工，作为动物饲料或肥料销售，产品附加值较低，影响加工企业与养殖户的增收，不利于整个行业的可持续发展。

研究发现，罗非鱼骨中含有丰富的蛋白，其蛋白含量在20％左右，具有一定的开发利用价值。然而，罗非鱼骨蛋白以胶原蛋白为主(约占总蛋白的80％)，由于胶原蛋白分子量大、且结构紧密，氨基酸组成不均衡，所以罗非鱼骨蛋白营养价值较低，不适宜直接作为食物食用。

将低价蛋白通过酶解制备功能肽是低价蛋白深加工的常用方法。研究发现：通过适当酶解原料蛋白，可以制备风味肽(苦、鲜、甜、咸)等功能肽。较传统调味料，风味肽除赋予食品风味，还可以增加消费者蛋白摄入量，同时某些风味肽还具有其他有益的生理功能(如降血压、降血糖、抗氧化)，因此，风味肽的开发与应用是调味料发展方向，具有广阔光明的市场前景。

目前，国内尚未有以罗非鱼骨为原料制备风味肽的报道，为提高罗非鱼资源的利用率，增加产品附加值，推动罗非鱼产业的健康发展，有必要建立以罗非鱼骨为原料制备风味肽的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，实现罗非鱼加工副产物的增值加工，该方法具有生产效率高、节能环保、条件温和、产品品质好等优点。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，包括如下步骤：

1)罗非鱼骨预处理：

将罗非鱼骨除杂清洗后，干燥、粉碎、脱脂，获得罗非鱼骨粉，备用；

其中，罗非鱼骨指除去尾鳍未发生霉变的鱼骨。清洗包括1％(w/v)NaOH清洗、自来水清洗组成。鱼骨粉碎至60-200目。脱脂采用溶剂萃取，溶剂可以是正已烷、石油醚、乙醚或它们组合。

2)风味肽制备：

将步骤1)罗非鱼骨粉按1:10-1:25(w/v)加入酸溶液中，搅拌均匀，加入到超声波提取仪中，加热到80-100℃，超声波处理0.5-2.0h，随后降低温度到30-60℃，加入胃蛋白酶水解，水解0.5-2.0h，调整pH到6.5-8.0，加入复合蛋白酶，水解0.5-2.0h，水解完毕，采用配置200-600目滤布的平板离心机以3000-5000rpm离心，收集上清液；

其中，酸可以是HCl、H₂SO₄或二者的混合物。胃蛋白酶水解的pH为1.0-2.0，胃蛋白酶的添加量为原料质量的0.1％-1.0％。酸解与酶解是均保持搅拌，在酸解过程中，搅拌速度为600-1000rpm，而在酶解过程中，搅拌速度为300-700rpm。调节pH所用的试剂为NaOH和HCl。

3)风味肽分离：

将步骤2)获得的上清液采用二级超滤处理，二级超滤透过液采用反渗透膜进行浓缩，将反渗透膜浓缩液采用阳离子交换树脂吸附，将吸附后的料液进行过滤，调节滤液的pH，随后采用阴离子交换树脂吸附，分别采用洗脱液洗脱阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，将收集的洗脱液分别中和后，采用纳滤脱盐浓缩后，干燥，分别获得苦味肽和鲜味肽。

其中，膜分离可以采用平板膜或卷式膜。干燥可以采用喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥。

本发明一具体实施例中，步骤2)所述超声波处理在酸解与酶解阶段条件不同，酸解阶段的条件是：超声波频率为20kHZ、40kHZ、59kHZ或其组合，超声波方式为连续；在酶解阶段采用的超声波频率为20kHZ，超声波方式为连续或间歇。

本发明一具体实施例中，步骤2)所述酶解分为两个阶段，第一个阶段采用胃蛋白酶水解，第二个阶段为复合蛋白酶水解，其中复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰糜蛋白酶中的两种或三种组成，添加量为原料质量的0.1％-3％。

本发明一具体实施例中，步骤3)所述二级超滤系统中，第一级超滤膜的截留分子量为5000-20000道尔顿，第二级超滤膜的截留分子量为1000-3000道尔顿；采用的反渗透膜对氯化钠的截留率大于99％，浓缩至原体积的5％-15％。

本发明一具体实施例中，步骤3)离子树脂吸附可以为动态吸附或静态吸附；其中阳离子交换树脂为弱酸性阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂；阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的洗脱液分别为0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/LHCl溶液。

采用上述方法，在pH7.0-8.0条件下，苦味肽呈现正电荷，可以与弱酸阳离子发生离子交换被吸附，而鲜味肽为负电荷不被树脂吸附，随后调节滤液的pH4.0-5.0，此时鲜味肽依然保持负电荷，而其他多肽呈现正电荷，故鲜味肽可以与阴离子交换树脂发生吸附。

本发明一具体实施例中，步骤3)滤液的pH调节到4.0-5.0；纳滤膜的截留分子量为100-150道尔顿，浓缩至原体积的5％-10％。

本发明制备的苦味肽和鲜味肽采用TCA-NSI法(三氯乙酸氮溶解指数法)测定，该测定方法是利用三氯乙酸沉淀蛋白，随后利用凯氏定氮仪测定其中的多肽。

测定过程如下：准确称取2g样品，加入50mL 15％三氯乙酸溶液，搅拌30min，转移至离心管，采用4000rpm离心15min，准确测量上清液总体积Vt，从中吸取5mL上清液加入到消化管中，采用凯氏定氮法测定上清液中多肽质量，从而计算上清液中总多肽质量，进而计算出样品的多肽含量。

上述制备方法集成目前先进的超声波辅助提取、膜分离、蛋白酶解、树脂吸附等技术，在提高生产效率的同时，也降低生产成本，减少环境污染与能源消耗，并提高产品品质与安全性。该方法开辟罗非鱼骨的高值化加工的途径，延长罗非鱼产品的加工链，推动罗非鱼加工业升级，带动整个罗非鱼产业可持续发展。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)由于采用酸解与酶解相结合，增加原料中蛋白的溶出率与水解度，从而提高多肽的产率。

2)膜分离与树脂层析的结合，实现在控制成本的前提下，风味肽的高效分离纯化。

3)制备的风味肽，不但可以应用于食品调味，也可以作为原料应用于医药、化妆品、保健品等行业。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。

实施例1：

一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，包括如下步骤：

1)罗非鱼骨预处理：

收集罗非鱼骨1kg，剔除发霉骨头，用1％(w/v)NaOH溶液清洗除去血污、碎肉等杂物，自来水清洗至中性，沥水后，采用50℃热风干燥6h后，破碎至100目，采用正已烷在70℃进行索氏抽提6h，最后将脱脂罗非鱼骨粉密封备用。

2)风味肽制备：

将脱脂罗非鱼骨粉按1:10(w/v)加入0.1mol/L硫酸溶液中，搅拌均匀，加入到超声波提取仪中，加热到95℃，采用20kHZ超声波处理，超声波功率为2000W，连续超声方式工作1.0h，搅拌速度为700rpm。酸解结束后，降低温度到40℃，调节pH到1.5，并将超声波功率调整为1000W，工作方式改为间歇(工作与停歇时间比为2:1)，加入原料质量的0.2％(w/v)胃蛋白酶水解，500rpm搅拌水解1.5h，随后维持搅拌速度与温度不变，调整pH到7.5，加入胰糜蛋白酶与木瓜蛋白酶的复合蛋白酶(两者质量比例为1:1)，复合蛋白酶加入量为原料质量的0.5％，水解2.0h。水解完毕，采用配置300目滤布的平板离心机以5000rpm离心，收集上清液。

3)风味肽分离：

将上清液采用二级超滤处理(一级超滤系统采用截留分子量5000道尔顿的卷式膜，二级超滤膜采用截留分子量1000道尔顿的卷式膜)，操作压力为1.0MPa，收集二级超滤的透过液，采用反渗透膜进行浓缩至料液原体积的10％，随后将浓缩液添加到弱酸阳离子交换树脂层析柱，用3倍柱体积的蒸馏水冲洗，收集流出液，将流出液pH调节到4.5，随后上样到弱碱阴离子交换树脂，用3倍柱体积的蒸馏水冲洗。最后分别用0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液对弱酸阳离子交换树脂与弱碱阴离子交换树脂进行洗脱，分别收集洗脱液，中和后，采用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜进行脱盐浓缩，采用-60℃冷冻干燥，分别收集到17.64g苦味肽粗品和7.56g鲜味肽粗品。

实施例2：

1)罗非鱼骨预处理：

收集罗非鱼骨3kg，剔除发霉骨，用1％(w/v)NaOH溶液清洗除去血污、碎肉等杂物，自来水清洗至中性，沥水后，采用60℃热风干燥4h后，破碎至200目，加入12L沸程60-90℃石油醚进行萃取，同样条件重复萃取5次后，将脱脂罗非鱼骨粉密封备用。

2)风味肽制备：

将脱脂罗非鱼骨粉按1:15(w/v)加入0.15mol/LHCl溶液中，搅拌均匀，加入到超声波提取仪中，加热到85℃，采用40kHZ超声波处理，超声波功率为2500W，连续超声方式工作1.5h，搅拌速度为800rpm。酸解结束后，降低温度到35℃，调节pH到1.3，同时，调整超声波功率到1000W，工作方式改为间歇，工作时间与停歇时间比为1:2，加入原料质量的0.5％(w/v)胃蛋白酶水解，400rpm搅拌水解1.5h，随后维持搅拌速度，将温度升高至45℃，调整pH到8.0，加入复合蛋白酶(由中性蛋白酶、胰糜蛋白酶组成，两者质量比例为1:2)，复合蛋白酶加入量为原料质量的0.8％，水解1.5h。水解完毕，采用配置400目滤布的平板离心机以5000rpm离心，收集上清液。

3)风味肽分离：

将上清液采用二级超滤处理(一级超滤系统采用截留分子量10000道尔顿的卷式膜，二级超滤膜采用截留分子量3000道尔顿的卷式膜)，操作压力为1.5MPa，收集二级超滤的透过液，采用反渗透膜进行浓缩至料液原体积的5％，随后将浓缩液添加到弱酸阳离子交换树脂层析柱，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，收集流出液，将流出液pH调节到4.2，随后上样到弱碱阴离子交换树脂，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗。最后分别用0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液对弱酸阳离子交换树脂与弱碱阴离子交换树脂进行洗脱，分别收集洗脱液，中和后，采用截留分子量为100道尔顿的纳滤膜进行脱盐浓缩，采用50℃真空干燥，分别收集到65.575g苦味肽粗品和25.21g鲜味肽粗品。

实施例3：

1)罗非鱼骨预处理：

收集罗非鱼骨3kg，剔除发霉骨，用1％(w/v)NaOH溶液清洗除去血污、碎肉等杂物，自来水清洗至中性，沥水后，采用40℃热风干燥7h后，破碎至160目，加入10L正已烷萃取，同样条件重复萃取7次后，将脱脂罗非鱼骨粉密封备用。

2)风味肽制备：

将脱脂罗非鱼骨粉按1:20(w/v)加入0.15mol/L H2SO4溶液中，搅拌均匀，加入到超声波提取仪中，加热到100℃，采用59kHZ超声波处理，超声波功率为3000W，连续超声方式工作1.0h，搅拌速度为900rpm。酸解结束后，降低温度到37℃，调节pH到1.6，同时，调整超声波功率到1000W，工作方式改为间歇，工作时间与停歇时间比为1:1，加入原料质量的0.6％(w/v)胃蛋白酶水解，500rpm搅拌水解1.2h，随后维持搅拌速度，将温度升高至50℃，调整pH到7.0，加入复合蛋白酶(由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，两者质量比例为1:2)，复合蛋白酶加入量为原料质量的0.75％，水解2h。水解完毕，采用配置300目滤布的平板离心机以5000rpm离心，收集上清液。

3)风味肽分离：

将上清液采用二级超滤处理(一级超滤系统采用截留分子量20000道尔顿的卷式膜，二级超滤膜采用截留分子量3000道尔顿的卷式膜)，操作压力为1.2MPa，收集二级超滤的透过液，采用反渗透膜进行浓缩至料液原体积的5％，随后将浓缩液添加到弱酸阳离子交换树脂层析柱，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，收集流出液，将流出液pH调节到4.0，随后上样到弱碱阴离子交换树脂，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗。最后分别用0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液对弱酸阳离子交换树脂与弱碱阴离子交换树脂进行洗脱，分别收集洗脱液，中和后，采用截留分子量为100道尔顿的纳滤膜进行脱盐浓缩，采用55℃真空干燥，分别收集到53.468g苦味肽粗品和19.889g鲜味肽粗品。

此处需要说明的是，本发明采用索氏抽提法测定脱脂是否完全，采用该方法本发明得到的鱼骨粉脂肪含量不高于0.5％。

综上可知：本发明方法可有效利用罗非鱼骨中的低价蛋白，生产具有成本可控、处理量大、操作简便等优点，产品品质好。本发明方法为推动罗非鱼的综合加工，延长了罗非鱼加工链条，给消费者提供新型产品，可以为加工企业与养殖户带来丰厚收益。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)罗非鱼骨预处理：

将罗非鱼骨除杂清洗后，干燥、粉碎、脱脂，获得罗非鱼骨粉，备用；

2)风味肽制备：

将步骤1)罗非鱼骨粉按1:10-1:25加入酸溶液中，搅拌均匀，加入到超声波提取仪中，加热到80-100℃，超声波处理0.5-2.0h，随后降低温度到30-60℃，加入胃蛋白酶水解，水解0.5-2.0h，调整pH到6.5-8.0，加入复合蛋白酶，水解0.5-2.0h，水解完毕，采用配置200-600目滤布的平板离心机以3000-5000rpm离心，收集上清液；

3)风味肽分离：

将步骤2)获得的上清液采用二级超滤处理，二级超滤透过液采用反渗透膜进行浓缩，将反渗透膜浓缩液采用阳离子交换树脂吸附，将吸附后的料液进行过滤，调节滤液的pH，随后采用阴离子交换树脂吸附，分别采用洗脱液洗脱阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，将收集的洗脱液分别中和后，采用纳滤脱盐浓缩后，干燥，分别获得苦味肽和鲜味肽。

2.如权利要求1所述的从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，

步骤2)所述超声波处理在酸解与酶解阶段条件不同，

酸解阶段的条件是：超声波频率为20kHZ、40kHZ、59kHZ或其组合，超声波方式为连续；

在酶解阶段采用的超声波频率为20kHZ，超声波方式为连续或间歇。

3.如权利要求1所述的从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，

步骤2)所述酶解分为两个阶段，第一个阶段采用胃蛋白酶水解，第二个阶段为复合蛋白酶水解，其中复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰糜蛋白酶中的两种或三种组成，添加量为原料质量的0.1％-3％。

4.如权利要求1所述的从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，

步骤3)所述二级超滤系统中，第一级超滤膜的截留分子量为5000-20000道尔顿，第二级超滤膜的截留分子量为1000-3000道尔顿；采用的反渗透膜对氯化钠的截留率大于99％，浓缩至原体积的5％-15％。

5.如权利要求1所述的从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，

步骤3)离子树脂吸附可以为动态吸附或静态吸附；其中阳离子交换树脂为弱酸性阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂；阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的洗脱液分别为0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/LHCl溶液。

6.如权利要求1所述的从罗非鱼骨蛋白制备风味肽的方法，其特征在于，步骤3)滤液的pH调节到4.0-5.0；纳滤膜的截留分子量为100-150道尔顿，浓缩至原体积的5％-10％。