CN107674905A - 螺旋藻活性肽、组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种螺旋藻活性肽的制备方法及螺旋藻活性肽。该制备方法包括以下步骤：A、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，将上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，将固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，将得到的混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由重量比为1～3∶1～2的风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，酶解温度为45～65℃，酶解时间为1.5～4h，得到酶解液，将酶解液灭酶处理，制成螺旋藻活性肽粉。本发明的制备方法生产工艺简单，且制得的螺旋藻活性肽纯度高，短肽含量高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种螺旋藻活性肽的制备方法。
背景技术
螺旋藻属于蓝藻门颤藻科低等植物，蛋白质含量较为丰富，在世界各地都有广泛培植及用作膳食补充剂。螺旋藻具有多种功效：降低胆固醇、调节血糖、增强免疫系统、保护肠胃、治疗贫血症。
多肽与蛋白质和氨基酸相比具有多种优点。多肽在人体肠道内的吸收速度和吸收率比氨基酸高；人体内大部分重要激素及组织都是由多肽构成的；多肽对调节血压、胃分泌、营养神经，促进睡眠，调节免疫力有重要的意义；多肽在人体内具有控制机体生长发育生殖、降低胆固醇、促进矿物质吸收的功能。
CN200910076204.2公开了一种具有体内降血压活性的降血压肽及其制备和纯化方法，所述降血压肽的序列为缬氨酸-谷氨酸-脯氨酸，C端为脯氨酸，N端为缬氨酸。该方法以螺旋藻粉末为原料，采用超低温冻融与超声波破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再利用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行水解，通过检测体外血管紧张素转化酶抑制活性作为参考指标，确定最佳的酶解工艺参数。酶解后的螺旋藻活性肽混合液再通过超滤、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离等步骤，得到高纯度、高活性的螺旋藻降血压肽。
CN201410231192.7公开了一种利用螺旋藻泥制备高活性小肽的方法。该方法按照料水重量比是1∶6-10的比例于螺旋藻泥中加入水，使螺旋藻泥均匀分散于水中，得到螺旋藻泥混悬液；NaOH溶液调节螺旋藻泥混悬液的pH值是7.5-8.5，加入活性是10-150万u/g生物酶，使得酶底比达到600-700u/g，调整螺旋藻泥混悬液的酶解温度是45-70℃，酶解3-10小时，得到螺旋藻酶解液，煮沸灭酶活10min，迅速冷却，6000r/min离心10min，得到螺旋藻小肽酶解液，喷雾干燥后得到螺旋藻小分子活性肽。该方法采用的酶为碱性蛋白酶、植物蛋白水解复合酶或菠萝蛋白酶。该方法制备的螺旋藻活性小肽更容易被机体吸收，酶解产物与血浆蛋白相比有一定的优势。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种螺旋藻活性肽，该螺旋藻活性肽具有良好的免疫作用，且能够降低肝脏、肾脏的毒素。
本发明另一目的在于提供所述螺旋藻活性肽的制备方法，该方法工艺简单，适合工业化生产。
本发明的再一目的在于提供一种含有所述螺旋藻活性肽的组合物。
本发明的又一目的在于提供所述含有螺旋藻活性肽的组合物的制备方法。
本发明提供一种螺旋藻活性肽，其分子量在1000Da以下的组分占88％以上，游离氨基酸含量低于5％，且含有至少2％的三肽精氨酸-异亮氨酸-缬氨酸(Arg-Ile-Val，RIV)序列肽段。
本发明的螺旋藻活性肽，具有明显的增强免疫力作用，且能够降低肝脏、肾脏毒素。
本发明还提供上述螺旋藻活性肽的制备方法，包括如下步骤：
A、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2，酶解温度为45～65℃，酶解时间为1.5～4h，得到酶解液；
E、将所述酶解液灭酶处理，然后制成螺旋藻活性肽粉。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤A中，调节pH至8～9进行微碱化处理，且浸泡16～20小时，利用微碱化和长时间浸泡，充分溶解蛋白质且尽量不对营养物质进行严重破坏。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤B中，采用弱酸将所述上清液调节pH至4～6；所述弱酸选自醋酸、乳酸、柠檬酸中的至少一种。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤E中，所述灭酶处理的温度为90～125℃，时间为0.5～3h。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤E中，将所述灭酶处理后的酶解液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将所述活性肽滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到螺旋藻活性肽粉；所述喷雾干燥在80～105℃下进行；所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂由活性炭和硅藻土按照重量比5～7∶1～3组成。
本发明还提供一种含螺旋藻活性肽的组合物，其由上述螺旋藻活性肽70～90重量份、桑叶5～15重量份和赤小豆5～15重量份制成。本发明还提供一种上述含螺旋藻活性肽的组合物的制备方法，所述制备方法包括：(1)采用上述方法制备螺旋藻活性肽粉；(2)分别将桑叶和赤小豆制备为桑叶粉和赤小豆粉；(3)将所述螺旋藻活性肽粉、桑叶粉和赤小豆粉按照比例混合均匀，得到所述组合物。本发明还提供所述含螺旋藻活性肽的组合物的另一种制备方法，所述制备方法包括：(1)采用上述方法制备螺旋藻活性肽粉；(2)将桑叶和赤小豆混合后用水作为溶剂提取，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物；(3)将所述螺旋藻活性肽粉和药材提取物混合均匀，得到所述组合物。
本发明还提供另一种含螺旋藻活性肽的组合物，其由螺旋藻粉70～90重量份、桑叶5～15重量份和赤小豆5～15重量份制成。本发明还提供一种所述含螺旋藻活性肽的组合物的制备方法，包括：
A’、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B’、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C’、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D’、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2；酶解温度为45-65℃，酶解时间为1.5-4h，得到酶解液；
D1'、将所述桑叶和赤小豆粉加入所述酶解液中，加热回流提取，过滤，得到混合液；
E’、将所述混合液制成含螺旋藻活性肽的组合物。
本发明的螺旋藻活性肽的制备方法，首次特定中药组合桑叶和赤小豆，可以进一步提升制备的螺旋藻活性肽的营养成分保健功能。桑叶和赤小豆对机体的主要作用如下：
桑叶：桑叶是上好的功能食品，能够降压，降血脂，抗衰老，增加耐力，降低胆固醇，抑制脂肪积累，抑制血栓生成，抑制肠内有害细菌繁殖，抑制有害的氧化物生成，最突出的功能是防治糖尿病。赤小豆：为豆科植物，赤小豆具备利水消肿，解毒排脓等功效。可用于治疗水肿胀满、脚气浮肿、黄疸尿赤、风湿热痹、痈肿疮毒、肠痈腹痛等。此两种成分均可将胆固醇及盐分对身体不必要的成分排泄出体外，因此被视为具有解毒的效果。赤小豆还可用于治疗心脏性和肾脏性水肿、肝硬化腹水、脚气病浮肿和外用于疮毒之症，都有一定效果。赤小豆水提取液对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、和伤寒杆菌等有抑菌作用。赤小豆煮汤饮服，可用于治疗肾脏、心脏、肝脏、营养不良、炎症等多种原因引起的水肿。赤小豆有较多的膳食纤维，具有良好的润肠通便、降血压、降血脂、调节血糖、解毒抗癌、预防结石、健美减肥的作用。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
＜螺旋藻活性肽及制备方法＞
本发明提供一种螺旋藻活性肽，其分子量在1000Da以下的组分占88％以上，游离氨基酸含量低于5％，且含有至少2％的三肽精氨酸-异亮氨酸-缬氨酸(Arg-Ile-Val，RIV)序列肽段。本发明的螺旋藻活性肽，具有明显的增强免疫力作用，且能够降低肝脏、肾脏毒素。
本发明的螺旋藻活性肽的制备方法，包括如下步骤：
A、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2，酶解温度为45～65℃，酶解时间为1.5～4h，得到酶解液；
E、将所述酶解液灭酶处理，然后制成螺旋藻活性肽粉。
根据本发明的制备方法，步骤A中，所述螺旋藻粉的粒径为3～95μm。所述螺旋藻粉可以通过将干螺旋藻进行超微粉碎，然后过筛得到，例如过200～600目筛。采用本发明的粒径的螺旋藻粉，能够在后期的酶解步骤中有效提高酶解率，充分利用螺旋藻中的蛋白成分。所述浸泡优选为在搅拌下进行浸泡，从而使螺旋藻粉中的成分充分溶出。步骤A中，加水量为螺旋藻粉重量的3～8倍，优选为3～5倍。优选地，在浸泡工序完成后，进行机械搅拌，从而使液体均匀，便于离心。
步骤A中，所述固液分离方法可以为过滤、离心等，并优选为离心分离。步骤A中，浸泡过程可以加热或在常温下进行，并优选在常温下进行。通常，碱液浸泡过程中需进行加热处理；而发明人发现，在常温下浸泡即可将螺旋藻粉中的成分充分溶出，从而避免进行加热产生的额外能耗，且操作更方便。
根据本发明的制备方法，步骤B中，采用弱酸将所述上清液调节pH至4～6。所述弱酸可以选自醋酸、乳酸、柠檬酸中的至少一种。现有的螺旋藻活性肽提取方法中，考虑到调节效率，这一步骤通常采用强酸调节pH值至酸性，所述强酸例如为盐酸、硫酸等，而较少考虑酸的性质对于产品的影响；发明人发现，强酸对于蛋白质成分破坏较大，对最终得到的螺旋藻活性肽产品活性产生不利影响。而采用弱酸调节pH，使蛋白质沉淀出来，减少了对蛋白质营养物质的破坏，且最终得到的螺旋藻活性肽产品活性更好。步骤B中，优选地，所述沉淀时间为8～12h，从而保证上清液中的蛋白质成分在上述pH下充分沉淀出来。优选地，沉淀工序完成后进行机械搅拌在搅拌下进行，从而使液体均匀，便于离心。
根据本发明的制备方法，步骤C中，采用加热方法使蛋白质变性。在所述的加热条件下即能够实现螺旋藻中的蛋白质成分完全变性，且有利于后续步骤中进行充分酶解，同时且避免了化学试剂对产品的污染。在加热变形后进行均质，进一步提高了酶解效率。
根据本发明的制备方法，步骤D中，将所述混悬液调节至pH5～9，优选为pH7～9，更优选为pH7～8。本发明中，将pH调节至上述弱碱性，更有利于本发明的酶制剂进行酶解。本发明中，酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶按照重量比为1～3∶1～2组成。根据本发明优选的实施方式，风味蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1.5～2.5∶1～1.5。根据本发明一个优选的实施方式，风味蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为2∶1.2。本发明的酶解过程一次性加入上述酶制剂，并在上述pH条件下进行酶解，能够得到更佳酶解效果。本发明的酶制剂对于螺旋藻中的蛋白质成分的酶解效率高，明显高于每种酶单用，且高于现有的螺旋藻活性肽用酶。当风味蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为2∶1.2时，酶解效率最高。根据本发明的制备方法，所述酶制剂的加入量可以为所述混悬液中固形物重量的0.2～2wt％，优选为0.3～1.5wt％，更优选为0.4～1.2wt％。本发明中，酶解温度为45～65℃，酶解时间为1.5～4h；优选地，酶解温度为45～60℃，酶解时间为2～3h。在上述酶制剂的加入量、酶解时间和温度下，螺旋藻蛋白可实现有效酶解。
根据本发明的制备方法，步骤E中，所述灭酶处理的温度为90～125℃，时间为0.5～3h。步骤E中，灭酶处理后的酶解液可以采用常规方法制成螺旋藻活性肽粉。
根据本发明一优选的实施方式，将所述灭酶处理后的酶解液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将所述活性肽滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到螺旋藻活性肽粉，该螺旋藻活性肽粉为精制螺旋藻活性肽粉。
本发明中，所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂由活性炭、珍珠岩和硅藻土组成，且活性炭和硅藻土的重量比5～7∶1～3。根据本发明的一个优选的实施方式，所述组合过滤助剂中活性炭和硅藻土的重量比5.7∶2。根据本发明的另一个优选的实施方式，所述组合过滤助剂中活性炭和硅藻土的重量比6.3∶2.3。发明人发现，现有方法制备的螺旋藻活性肽带有异味，并具有苦味，口感差；多种过滤助剂单用均难以同时将二者脱除。本发明的过滤助剂能够有效除去螺旋藻本身带有的异味和苦味以及脱色，简化了工艺流程。本发明中，所述陶瓷膜的孔径可以为20～500nm，更优选为20～300mm。采用这样的陶瓷膜孔径，能够实现酶解液的进一步精制。
通常，肽的喷雾干燥操作在120～140℃进行，一般认为这样的干燥温度对于肽的活性影响不大。然而，发明人发现，现有的喷雾干燥的温度明显影响肽的活性。而本发明中，优选地，所述喷雾干燥操作在80～105℃进行，从而有效保持螺旋藻活性肽的活性。
＜含螺旋藻活性肽的组合物及其制备方法＞
本发明的含螺旋藻活性肽的组合物可以由螺旋藻活性肽70～90重量份、桑叶5～15重量份和赤小豆5～15重量份制成。
本发明中，螺旋藻活性肽可以采用本发明的上述制备方法制备得到的。螺旋藻活性肽溶解性和消化利用率高，无依赖性，可有效提高人体内白细胞水平，从而提高人体免疫功能，延缓人体机能衰老。
本发明的含螺旋藻活性肽的组合物的制备方法，可以采用多种制备方法得到。
根据本发明的一个实施方式，所述组合物的制备方法为：(1)制备螺旋藻活性肽粉；(2)分别将桑叶和赤小豆制备为桑叶粉和赤小豆粉；(3)将所述螺旋藻活性肽粉、桑叶粉和赤小豆粉混合均匀，得到本发明的组合物。所述螺旋藻活性肽粉优选采用上述的制备方法制备得到。所述桑叶粉优选为将桑叶进行超微粉碎制得。所述赤小豆粉优选为将赤小豆进行超微粉碎制得。其中，步骤(1')采用上述“螺旋藻活性肽的制备方法”制得，这里不再赘述。
根据本发明的另一个实施方式，所述组合物的制备方法为：(1’)制备螺旋藻活性肽粉；(2’)将桑叶和赤小豆用水作为溶剂提取，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物；(3’)将所述螺旋藻活性肽粉和药材提取物混合，得到本发明的组合物。其中，步骤(1’)采用上述“螺旋藻活性肽的制备方法”制得，这里不再赘述。
本发明的含螺旋藻活性肽的组合物还可以由螺旋藻粉70～90重量份、桑叶5～15重量份和赤小豆5～15重量份制成(注意前后统一)。
优选地，所述含螺旋藻肽的组合物的制备方法为：
A’、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B’、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C’、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D’、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶、木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2；酶解温度为45-65℃，酶解时间为1.5-4h，得到酶解液；
D1’、将所述桑叶和赤小豆加入所述酶解液中，加热回流提取，过滤，得到混合液；
E’、将所述混合液制成含螺旋藻活性肽的组合物。
其中，步骤A’～D’的具体操作和参数分别与上述“螺旋藻活性肽的制备方法”中A～D相同，这里不再赘述。
步骤D1’中，优选地，所述桑叶和赤小豆以粉末形式加入所述酶解液中，从而提高提取率。加热回流提取时间为1～3小时，优选为1～2小时。所述过滤可采用常规过滤方法，从而滤去药渣，得到混合液。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤E’中，将所述混合液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到精制的含螺旋藻活性肽的组合物。优选地，所述喷雾干燥操作在80～105℃进行，从而有效保持螺旋藻活性肽的活性。
本发明中，所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂如上文所述，这里不再赘述。本发明的过滤助剂除了除去螺旋藻本身带有的异味和苦味，还可以有效的脱除螺旋藻的绿色，起到脱色的作用。本发明中，所述陶瓷膜的孔径可以为20～500nm，更优选为20～300mm。采用这样的陶瓷膜孔径，能够实现混合液的进一步精制。优选地，所述喷雾干燥操作在80～105℃进行，从而有效保持螺旋藻活性肽的活性。
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明的保护范围不受此限制。
实施例1
螺旋藻活性肽的制备方法，包括以下步骤：
A、将螺旋藻进行超微粉碎，过400目筛，得到螺旋藻粉；将螺旋藻粉加入螺旋藻粉重量4倍量的水，混合，用氢氧化钠溶液调节至pH 8，浸泡18h；机械搅拌，离心，取上清液；
B、将所述上清液用醋酸溶液调节至pH5，沉淀蛋白质，机械搅拌，离心，取固体部分；
C、将所述固体部分加入水，于95℃下加热30min，然后进行均质，得到混悬液；
D、将所述混悬液调节pH至7.5，加入酶制剂进行酶解，得到酶解液；该酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶按照2∶1.2组成；酶制剂的用量为混悬液中固形物重量的0.5wt％；酶解温度为50℃，酶解时间为2.5h；
E、将该酶解液进行灭酶处理，灭酶温度为95℃，时间为1h；将灭酶后的酶解液浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到螺旋藻活性肽粉。
实施例2
螺旋藻活性肽的制备方法，包括以下步骤：
A、将螺旋藻进行超微粉碎，过400目筛，得到螺旋藻粉；将螺旋藻粉加入螺旋藻粉重量4倍量的水，混合，用氢氧化钠溶液调节至pH 8，浸泡18h；机械搅拌，离心，取上清液；
B、将所述上清液用醋酸溶液调节至pH5，沉淀蛋白质，机械搅拌，离心，取固体部分；
C、将所述固体部分加入水，于95℃下加热30min，然后进行均质，得到混悬液；
D、将所述混悬液调节pH至7.5，加入酶制剂进行酶解，得到酶解液；该酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶按照2∶1.2组成；酶制剂的用量为混悬液中固形物重量的0.5wt％；酶解温度为50℃，酶解时间为2.5h；
E、将该酶解液进行灭酶处理，灭酶温度为95℃，时间为1h；将灭酶后的酶解液离心，离心液经板框压滤机过滤，板框压滤机内含有过滤助剂，过滤助剂由活性炭和硅藻土按照重量比6.3∶2.3组成；再经孔径为400nm的陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将该活性肽透过液浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到螺旋藻活性肽粉。
实施例3
分别将桑叶和赤小豆制成桑叶粉和赤小豆粉。将实施例1的螺旋藻活性肽粉85重量份、桑叶粉6重量份和赤小豆粉9份混合均匀，得到含螺旋藻活性肽的组合物。
实施例4
将桑叶8重量份和赤小豆8重量份混合，加入水作为溶剂加热回流提取3次，每次加水量依次为桑叶和赤小豆总重量的8倍量、6倍量、6倍量，每次提取时间依次为1.5小时、1.5小时、1小时，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物。将实施例2的螺旋藻活性肽粉84重量份和上述药材提取物混合均匀，得到含螺旋藻活性肽的组合物。
实施例5
A’、将螺旋藻进行超微粉碎，过400目筛，得到螺旋藻粉94重量份；将螺旋藻粉加入螺旋藻粉重量4倍量的水，混合，用氢氧化钠溶液调节至pH 8，浸泡18h；机械搅拌，离心，取上清液；
B’、将所述上清液用醋酸溶液调节至pH5，沉淀蛋白质，机械搅拌，离心，取固体部分；
C’、将所述固体部分加入水，于95℃下加热30min，然后进行均质，得到混悬液；
D’、将所述混悬液调节pH至7.5，加入酶制剂进行酶解，得到酶解液；该酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶按照2∶1.2组成；酶制剂的用量为混悬液中固形物重量的0.5wt％；酶解温度为50℃，酶解时间为2.5h；
D1’、将桑叶3重量份和赤小豆3重量份加入所述酶解液中，加热回流提取，提取时间为2h，过滤，得到混合液；
E’、将该酶解液进行灭酶处理，灭酶温度为95℃，时间为1h；将灭酶后的酶解液离心，离心液经板框压滤机过滤，板框压滤机内含有过滤助剂，过滤助剂由活性炭和硅藻土按照重量比6.3∶2.3组成；再经孔径为400nm的陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将该活性肽透过液浓缩，在中低温喷雾干燥塔内于85℃喷雾干燥，得到螺旋藻活性肽粉。
对比例1
除了将实施例2中步骤B的醋酸溶液替换为盐酸溶液，其他步骤与对比文件1相同。
对比例2
除了将实施例2中步骤E的过滤助剂替换为同等重量的活性炭，其他步骤与实施例2相同。
对比例3
除了将实施例2中步骤E的喷雾干燥温度设置为135℃，其他步骤与实施例2相同。
对比例4
根据专利文献CN201410231192.7的实施例1-3的方法分别获得螺旋藻小分子活性肽A、B和C。
测定实施例1-2和对比例1～4中螺旋藻活性肽中肽含量以及所述实施例和对比例的味道结果见表2。
肽的含量测定方法为：参考GB/T 22492大豆肽粉中肽含量的测定方法进行。
苦味评价方法为：取1g螺旋藻活性肽加入10ml温水中搅拌均匀，将稀释倍数计为苦味值，1-略有苦味；2-苦味较弱；3-有苦味；4-苦味一般；5-苦味偏重；6-苦味较重；7-苦味很重。计算20人的平均苦味值，结果见表2。
腥味评价方法为：评价方法为：0-无腥味；1-略有腥味；2-腥味较弱；3-有腥味；4-腥味一般；5-腥味偏重；6-腥味较重；7-腥味很重计算20人的平均腥味值。
表1
螺旋藻活性肽的理化组成和分子量分布分析
螺旋藻活性肽的成分分析结果见表2，从中可以看出本发明制备的螺旋藻活性肽总蛋白质含量高达97.3％，具有很高的产品质量。
表1：螺旋藻活性肽的基础理化成分分析
| 含量％ | |
| 总蛋白质(干基) | 97.3±0.39 |
| 脂肪 | 0.09±0.01 |
| 灰分 | 4.75±0.21 |
将螺旋藻活性肽样品于GEL-HPLC中进样以后，得到其凝胶色谱图，用液相数据处理软件将螺旋藻活性肽的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。本发明用峰面积归一化法计算了螺旋藻活性肽的相对分子质量分布范围，如表3所示。由分子量分布结果可以看出，分子量小于1000Da的组分总共占89.21％，如果按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的低聚肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在140Da-500Da的占57.42％，占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。
表3：螺旋藻活性肽分子量分布结果
螺旋藻活性肽中结构鉴定与标志性肽段定量
根据国内外最新营养研究表明，蛋白质摄入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被机体消化吸收。肽类物质除具有易消化、易吸收的营养功能外，更重要的生物学意义主要体现在其具有氨基酸不可比拟的生理活性功能。螺旋藻活性肽作为一种混合性肽，含有许多具有各种生理功能的肽段。同时，其相对分子质量小于1000的组分占到88％以上，说明本产品基本上是由短肽组成。特殊的蛋白原料来源和独特的生产工艺，使本产品含有一定量的特征成分肽。
我们对螺旋藻活性肽中的肽段进行分离及结构鉴定。通过采用高效液相色谱分离与质谱分析，对本产品中的肽段进行分离及结构鉴定，共鉴定出42个肽段的一级结构。
我们已研究出定量测定螺旋藻活性肽中三肽精氨酸-异亮氨酸-缬氨酸(Arg-Ile-Val，RIV)的高效液相色谱分析法。将螺旋藻活性肽样品经前处理后，以反相C18填料为固定相，依据样品组分分子极性大小的差别进行分离，在紫外吸收波长220nm条件下检测，采用外标法进行定量，并对色谱图及其数据进行处理，计算得到RIV的含量。鉴于不同批次的螺旋藻活性肽样品中均含有2％以上的RIV，故将RIV作为螺旋藻活性肽中的特征性成分。
实验例1
下面对实施例2、实施例5的肽或者含肽组合物以及对比4螺旋藻小分子活性肽A的进行小鼠灌胃测试，具体测试方法如下：
将50只小鼠按体重随机分成5组：空白对照组、实施例1、实施例4和对比实施例7，每组10只，用北京维通利华实验动物技术有限公司提供的标准饲料分笼饲养，自由饮食饮水。适应性喂养5天后进行灌胃试验。
每日分别给实验组小鼠灌胃，小鼠定时测定体重，根据体重计算灌胃的量，灌胃量为：1.7g/日/kg，连续灌胃30天。测试细胞免疫功能指标、体液免疫功能指标和NK细胞活性。
表4：空白对照组、实施例、对比实施例小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性。
相同列中数据(平均值±标准差)后不同字母表示显著性差异(p＜0.05，n＝3).
结果表明，各组小鼠体重的增长差异不大，动物在试验过程中活动正常，无异常表现，表明各组合物对小鼠的生长发育和健康无不良影响。具体小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性结果如表4。由表4测试数据可以知道，提供实施例1的活性肽、实施例4的组合物、对比例7的螺旋藻小分子活性肽具有提高免疫作用的药理数据，且效果上实施例5＞实施例2＞对比例4。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (10)
1.一种螺旋藻活性肽的制备方法，其包括如下步骤：
A、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2，酶解温度为45～65℃，酶解时间为1.5～4h，得到酶解液；
E、将所述酶解液灭酶处理，然后制成螺旋藻活性肽粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，采用弱酸将所述上清液调节pH至4～6；所述弱酸选自醋酸、乳酸、柠檬酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤E中，所述灭酶处理的温度为90～125℃，时间为0.5～3h。
4.根据权利要求1所述的螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于，步骤E中，将所述灭酶处理后的酶解液进行离心，离心液首先经板框压滤机过滤，再经陶瓷膜过滤，得到活性肽透过液；将所述活性肽滤液浓缩，喷雾干燥，从而得到螺旋藻活性肽粉；所述喷雾干燥在80～105℃下进行；所述板框压滤机内含有组合过滤助剂，所述组合过滤助剂由活性炭和硅藻土按照重量比5～7∶1～3组成。
5.一种螺旋藻活性肽，其特征在于，所述螺旋藻活性肽采用根据权利要求1～4任一项所述的方法制备得到。
6.一种含螺旋藻活性肽的组合物，其特征在于，所述组合物由螺旋藻活性肽70～90重量份、桑叶5～15重量份和赤小豆5～15重量份制成。
7.根据权利要求6所述的含螺旋藻活性肽的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)根据权利要求1～5任一项所述的方法制备螺旋藻活性肽粉；(2)分别将桑叶和赤小豆制备为桑叶粉和赤小豆粉；(3)将所述螺旋藻活性肽粉、桑叶粉和赤小豆粉混合均匀，得到所述组合物；或者
所述制备方法包括：(1)根据权利要求1～5任一项所述的方法制备螺旋藻活性肽粉；(2)将桑叶和赤小豆混合后用水作为溶剂提取，提取液浓缩，干燥，粉碎，得到药材提取物；(3)将所述螺旋藻活性肽粉和药材提取物混合均匀，得到所述组合物。
8.一种含螺旋藻活性肽的组合物，其特征在于，所述组合物由螺旋藻粉90～98重量份、桑叶5～10重量份和赤小豆5～10重量份制成。
9.根据权利要求8所述的含螺旋藻活性肽的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
A’、将螺旋藻粉加入水，调节pH至8～9，浸泡16～20小时，固液分离，取上清液；
B’、将所述上清液调节pH至4～6进行沉淀，固液分离，取固体部分；
C’、将所述固体部分加入水，于85～100℃下加热20～40min，然后进行均质，得到混悬液；
D’、将所述混悬液调节pH至5～9，加入酶制剂进行酶解；所述酶制剂由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，且所述风味蛋白酶与中性蛋白酶的重量比为1～3∶1～2；酶解温度为45-65℃，酶解时间为1.5-4h，得到酶解液；
D1’、将所述桑叶和赤小豆加入所述酶解液中，加热回流提取，过滤，得到混合液；
E’、将所述混合液制成含螺旋藻活性肽的组合物。
10.据权利要求1～4任一项所述的方法制备得到螺旋藻活性肽，其分子量在1000Da以下的组分占88％以上，游离氨基酸含量低于5％，且含有至少2％的三肽精氨酸-异亮氨酸-缬氨酸(Arg-Ile-Val，RIV)序列肽段。
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