CN109722462B - 一种海蜇降血脂肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种海蜇降血脂肽及其制备方法，本发明是以新鲜海蜇或腌制海蜇为原料，经过脱盐、粉碎后，分别用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶分步进行酶解得到海蜇蛋白水解肽液，然后通过离心、截留和浓缩得到海蜇降血脂肽浓缩液，再经喷雾干燥或真空冷冻干燥得到海蜇降血脂肽粉。本发明制备的海蜇降血脂肽经C57BL/6高血脂模型雄性小鼠灌胃实验证明具有较好的辅助降血脂功效。该海蜇降血脂肽的生产工艺，可操作性强，产品质量可控，蛋白质酶解程度完全，所得的海蜇降血压肽粉呈白色或淡黄色，活性高，易溶于水，可用于食品和医疗保健等领域。
Description
技术领域
本发明属于功能多肽制备技术领域，具体涉及一种海蜇降血脂肽及其制备方法。
背景技术
海蜇，又称水母，隶属于腔肠动物门，钵水母纲、根口水母目，根口水母科，海蜇属的无缘膜动物。我国海蜇资源丰富，广泛分布于我国东南沿海的浙江、江苏、福建等地，是我国传统渔业生产的主要大型水母。海蜇营养价值极高，脂肪含量极低，蛋白质和无机盐等含量丰富，脯氨酸、精氨酸等含量高，是一种有很高营养价值的食品。海蜇不仅具有很高的营养价值，而且还是一味治病良药。近代我国医药卫生部门报道：认为对治疗高血压、高血脂、气管炎、哮喘、胃溃疡等均有一定的疗效。因此，海蜇作为一种医食同源的大型生物，具有重要的经济和食用价值。
制备海洋活性多肽的方法主要有：直接提取、体外降解和利用工程菌进行发酵、酶水解法或化学合成活性肽。体外水解蛋白质制备活性肽主要有三条工艺路线：酸水解、碱水解和酶法水解。前面两种方法简单，但存在营养和毒理方面的有害效应，因此在食品加工中的应用受到了极大的限制。蛋白质的酶法水解不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理上的问题；同时酶作用具有特异性、高效性和专一性，可以在温和的条件下进行，能耗也低，所以酶法水解在食品加工中应用非常广泛。
利用酶法水解海蜇蛋白质制备海蜇活性多肽的技术已有报道。例如：2011年9月21日公开CN102191306A中国发明专利申请公布说明书中公开了“海蜇降压肽的酶法制备方法”、2011年12月21日公开CN102286590A中国发明专利申请公布说明书中公开“一种降压肽的制备方法”，上述公开文件中对海蜇的原料进行脱盐、洗净、破碎、加水稀释后或采用碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶进而获得酶解液而获得海蜇多肽液，而后进行干燥得到海蜇多肽粉，从而进一步加工制备其他功能制品。上述公开文件中，对海蜇进行酶解均是采用的是单酶。而在蛋白质水解中，酶的选择是核心技术，所用的酶不同得到的产品不同，不同的酶解工艺所得的肽的产品活性是不一样的。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种海蜇降血脂肽及其制备方法，所提供的方法产品质量可控、蛋白质酶解完全、所得到的海蜇肽活性高。
本发明所提供的一种海蜇降血脂肽，其制备方法如下：
1)原料的处理：将海蜇原料清洗后，进行粉碎处理得到海蜇浆液；
所述的海蜇原料为新鲜的海蜇或腌制海蜇；腌制海蜇用清水浸泡、复水、脱盐至盐分不高于5％；
2)第一步酶解：加入水调整步骤1)的海蜇浆液中的蛋白质的质量浓度为2％—5％；调整pH值为6.5—7.5，料液比为1.0-3.0g/ml，控制温度为50-55℃，加入木瓜蛋白酶，保温酶解6-8h，得到海蜇木瓜蛋白酶水解液；
其中木瓜蛋白酶的用量为每克蛋白质加入100-400u的木瓜蛋白酶；
3)第二步酶解将步骤2)得到的海蜇木瓜蛋白酶水解液调整pH值为6.5-7.5，料液比为1.0-3.0g/ml，温度为45-50℃，加入风味蛋白酶，酶解4-6h，得到海蜇双酶酶解液；
其中风味蛋白酶用量为每克蛋白质加入100-400u的风味蛋白酶，
4)酶灭活将步骤3)得到的海蜇双酶酶解液加热至95-100℃，保持10-20分钟，进行酶灭活，得到灭酶海蜇双酶酶解液；
5)分离浓缩将步骤4)得到的灭酶海蜇双酶酶解液离心进行分离，取上清液，采用超滤截留分子量3KDa以下的多肽，并进行浓缩，得到海蜇降血脂肽浓缩液；
所述的离心条件如下：离心条件为：8000g离心15-20分钟；
6)干燥将步骤5)得到的海蜇降血脂肽浓缩液进行喷雾干燥或冷冻干燥，得到海蜇降血脂肽粉。
所述的喷雾干燥，其进风温度控制在180-185℃，出风温度控制在70-75℃，喷雾压力为0.4MPa。
冷冻干燥，其真空度控制在25-35Pa,冷阱温度控制在-75℃至-84℃。
本发明所提供的海蜇降血脂肽在制备降血脂制品中的应用。
本发明是以新鲜海蜇或腌制海蜇为原料，经过脱盐、粉碎后，分别用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶分步进行酶解得到海蜇蛋白水解肽液，然后通过离心、截留和浓缩得到海蜇降血脂肽浓缩液，再经喷雾干燥或真空冷冻干燥得到海蜇降血脂肽粉。本发明制备的海蜇降血脂肽经C57BL/6高血脂模型雄性小鼠灌胃实验证明具有较好的辅助降血脂功效。该海蜇降血脂肽的生产工艺，可操作性强，产品质量可控，蛋白质酶解程度完全，所得的海蜇降血压肽粉呈白色或淡黄色，活性高，易溶于水，可用于食品和医疗保健等领域。
附图说明
图1：六种蛋白酶在最适条件下对海蜇蛋白的酶解效果图。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明做进一步详细说明。
实施例1海蜇降血脂肽酶法制备工艺的优化
(1)蛋白酶的选择：以水解度为指标，在酶添加量为200u/g、料液比1:1g/ml和酶解时间6h条件下，比较六种不同蛋白酶在其最合适酶解条件下(见表1)下对海蜇蛋白的酶解效果(见图1)，最终确定木瓜蛋白酶和风味蛋白酶为最适用酶。
表1：不同蛋白酶的最适酶解温度和pH值
(2)单酶酶解工艺优化：以水解度为指标，分析温度、pH值、料液比、酶添加量和酶解时间对降血脂肽的制备效果的影响。
取一定量的洗净及脱盐的海蜇进行粉碎，得到海蜇匀浆液，加入一定体积相应pH值缓冲液至一定的料液比，添加一定比例的蛋白酶，置于一定条件下酶解一定的时间；待反应结束后，将酶解液置于沸水浴中加热10min使蛋白酶失活，10000g离心15min，取上清多肽液进行水解度测定。并在单因素实验基础上，用Design-Expert8.0软件进行响应面优化分析。
表2：木瓜蛋白酶酶解工艺响应面实验设计因素水平编码表
表3：木瓜蛋白酶酶解工艺响应面实验方案及结果
表4：风味蛋白酶解工艺响应面实验设计因素水平编码表
表5：风味蛋白酶酶解工艺响应面实验方案及结果
结果显示，木瓜蛋白酶的最优酶解工艺为：温度为55℃、pH值为7.0、料液比为1.0g/ml、酶添加量为200u/g和酶解时间为6h；风味蛋白酶的最优酶解工艺为50℃、pH值为7.0、料液比为1.56g/ml、酶添加量为200u/g和酶解时间7h。
表6：不同蛋白酶组合方式对海蜇蛋白酶解效果的影响
备注：A-木瓜蛋白酶B-风味蛋白酶
由结果确定的最佳组合方式为：先添加木瓜蛋白酶，在温度为55℃、pH值为7.0、料液比为1.2g/ml、酶添加量为200u/g和酶解时间为6h；再添加风味蛋白酶，在温度50℃、pH值为7.0、料液比为1.56g/ml、酶添加量为200u/g条件下继续酶解7h，所获得的水解液的水解度为72.64％。在此酶解条件下获得的海蜇肽的降血脂效果最好。
实施例2
(1)原料的处理称取50kg腌制的海蜇为原料，清水浸泡、复水、脱盐至盐分为3.5％，清洗干净后，采用多功能粉碎机进行粉碎，所得海蜇浆颗粒大小控制在160μm；
(2)第一步酶解测定步骤(1)所得海蜇浆的水分和蛋白质含量，根据测定结果，加水调整蛋白质的质量浓度为3％；调整pH值为7.02，控制温度为55℃，加入木瓜白酶，木瓜蛋白酶的用量为每克蛋白质加入300u的木瓜蛋白酶，保温酶解6h，得到海蜇木瓜蛋白酶水解液；
(3)第二步酶解将步骤(2)得到的海蜇木瓜蛋白酶水解液的pH值调整至6.84，保持温度为50℃，加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的用量为每克蛋白质加入400u的风味蛋白酶，酶解4h，得到海蜇双酶酶解液；
(4)酶灭活将步骤(3)得到的海蜇双酶酶解液加热至95℃，保持20分钟，进行酶灭活，得到灭酶的海蜇双酶酶解液；
(5)分离浓缩将步骤(4)得到的灭酶海蜇双酶酶解液离心进行分离，离心条件为：8000g，15分钟，取上清液，采用3KDa超滤膜进行截留，得到分子量小于3KDa的海蜇肽并进行浓缩，得到海蜇降血脂肽浓缩液，该海蜇降血脂浓缩液的可溶性固形物含量为16.72％。
(6)干燥将步骤(5)得到的海蜇降血脂肽浓缩液进行真空冷冻干燥，冷冻干燥的条件为：真空度控制在30Pa，冷阱温度控制在-80℃。得到海蜇降血脂肽粉2kg。
实施例3
(1)原料的处理称取50kg新鲜的海蜇为原料，清水浸泡、复水、脱盐至盐分为4.5％，清洗干净后，采用多功能粉碎机进行粉碎，所得海蜇浆颗粒大小控制在120μm；
(2)第一步酶解测定步骤(1)所得海蜇浆的水分和蛋白质含量，根据测定结果，加水调整蛋白质的质量浓度为4％，调整pH值为7.21，控制温度为52℃，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的用量为每克蛋白质加入100u的木瓜蛋白酶，控制料液比为1.5g/ml，保温酶解8h，得到海蜇木瓜蛋白酶水解液；
(3)第二步酶解将步骤(2)得到的海蜇木瓜蛋白酶水解液的pH值调整至7.04，保持温度为48℃，加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的用量为每克蛋白质加入100u的风味蛋白酶，控制料液比为2.0g/ml，酶解6h，得到海蜇双酶酶解液；
(4)酶灭活将步骤(3)得到的海蜇双酶酶解液加热至98℃，保持10分钟，进行酶灭活，得到灭酶的海蜇双酶酶解液；
(5)分离浓缩将步骤(4)得到的灭酶海蜇双酶酶解液离心进行分离，离心条件为：8000g，20分钟，取上清液，用3KDa超滤膜进行截留，得到分子量小于3KDa的海蜇肽并进行浓缩，得到海蜇降血脂肽浓缩液，该海蜇降血脂浓缩液的可溶性固形物含量为18.12％。
喷雾干燥时其进风温度控制在185℃，出风温度控制在75℃，喷雾压力为0.4MPa，得到海蜇降血脂肽粉2.18kg。
实施例4
(1)原料的处理称取100kg腌制的海蜇为原料，清水浸泡脱盐至盐分≤4％，清洗干净后，采用多功能粉碎机进行粉碎，所得海蜇浆颗粒大小控制在180μm；
(2)第一步酶解测定步骤(1)所得海蜇浆的水分和蛋白质含量，根据测定结果，加水调整蛋白质的质量浓度为2％；调整pH值为6.5，控制温度为52℃，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的用量为每克蛋白质加入200u的木瓜蛋白酶，控制料液比为3.0g/ml，保温酶解8h，得到海蜇木瓜蛋白酶水解液；
(3)第二步酶解将步骤(2)得到的海蜇木瓜蛋白酶水解液的pH值调整至7.24，保持温度为50℃，加入风味蛋白酶，风味蛋白酶的用量为每克蛋白质加入300u的风味蛋白酶，控制料液比为3.0g/ml，酶解4h，得到海蜇双酶酶解液；
(4)酶灭活将步骤(3)得到的海蜇双酶酶解液加热至97℃，保持15分钟，进行酶灭活，得到灭酶的海蜇双酶酶解液；
(5)分离浓缩将步骤(4)得到的灭酶海蜇双酶酶解液离心进行分离，离心条件为：8000g，15分钟，取上清液，用3KDa超滤膜进行截留，得到分子量小于3KDa的海蜇肽并进行浓缩，得到海蜇降血脂肽浓缩液，该海蜇降血脂浓缩液的可溶性固形物含量为17.12％。
(6)干燥将步骤(5)得到的海蜇降血脂肽浓缩液进行真空冷冻干燥，冷冻干燥的条件为：真空度控制在35Pa，冷阱温度控制在-75℃。得到海蜇降血脂肽粉3.5kg。
下面以实施例3制备的海蜇降血脂肽粉进行动物实验说明本发明的降血脂效果
建立高血脂动物模型实验采用70只SPF级别雄性C57BL/6成年小鼠，体重约为22-25g，随机选取20只小鼠作为空白组，给予普通饲料喂养，其余的小鼠均给予D12492高脂饲料喂养，即造模组，所有动物均自由饮水，每周分别从空白组和造模组随机抽取3只小鼠，尾静脉取血，检测TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)判断造模是否成功。6周后造模组动物TC水平约升高为空白组的2倍，视为造模成功。
海蜇降血脂肽动物实验筛选40只造模成功的高血脂小鼠，随机分为4组，分别为高血脂模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只小鼠。另外随机选取10只原空白组小鼠作为空白组，共5组。空白组和高脂模型组给予等体积0.9％的生理盐水灌胃，低剂量组给予样品水溶液300mg/kg剂量灌胃；中剂量组给予600mg/kg剂量灌胃；高剂量组给予1200mg/kg剂量灌胃；在灌胃的同时，空白组给予普通饲料喂养，其它组均给予D12492高脂饲料喂养，所有小鼠均自由饮水，每天灌胃一次，连续灌胃8周，断食12h，眼球取血制备血清。测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，实验结果如表7。
表7小鼠血清指标检测结果(n＝10，mean±SD)
注：与高脂模型组相比*P＜0.05,**P＜0.01；
与高脂模型组相比，海蜇降血脂肽对小鼠灌胃8周后，不管是低剂量组，还是中剂量组和高剂量，血清中总胆固醇和低密度脂蛋白均有所下降，其中中剂量组和高剂量组均有明显降低，有极显著性的差异(**P＜0.01)；同时能够增加血清中高密度脂蛋白水平，其中中剂量组和高剂量组有极显著性的差异(**P＜0.01)，而且海蜇降血脂肽对小鼠体重无明显的影响。本发明制备的海蜇降血脂肽能够有效的降低高血脂症小鼠体内总胆固醇和低密度脂蛋白水平，显著升高高密度脂蛋白水平。
Claims (7)
1.一种海蜇降血脂肽，其特征在于，所述的海蜇降血脂肽的制备方法如下：
1）原料的处理：将海蜇原料清洗后，进行粉碎处理得到海蜇浆液；
2）第一步酶解： 加入水调整步骤1）的海蜇浆液中的蛋白质的质量浓度为4%；调整pH值为7.21，料液比为1.5g/ml，控制温度为52℃，加入木瓜蛋白酶，保温酶解8h，得到海蜇木瓜蛋白酶水解液；
木瓜蛋白酶的用量为每克蛋白质加入100u的木瓜蛋白酶；
3）第二步酶解：将步骤2）得到的海蜇木瓜蛋白酶水解液调整pH值为7. 04，料液比为2.0g/ml，温度为48℃，加入风味蛋白酶，酶解6h，得到海蜇双酶酶解液；
风味蛋白酶用量为每克蛋白质加入100u的风味蛋白酶；
4）酶灭活：将步骤3）得到的海蜇双酶酶解液加热至98℃，保持10分钟，进行酶灭活，得到灭酶海蜇双酶酶解液；
5）分离浓缩：将步骤4）得到的灭酶海蜇双酶酶解液离心进行分离，离心条件为：8000g，20分钟；取上清液，用3KDa超滤膜进行截留，得到分子量小于3KDa的海蜇肽，并进行浓缩，得到海蜇降血脂肽浓缩液；
6）干燥：将步骤5）得到的海蜇降血脂肽浓缩液进行喷雾干燥或冷冻干燥，得到海蜇降血脂肽粉。
2.如权利要求1所述的海蜇降血脂肽，其特征在于，所述的1）中述的海蜇原料为新鲜的海蜇或腌制海蜇。
3.如权利要求2所述的海蜇降血脂肽，其特征在于，所述的腌制海蜇用清水浸泡、复水、脱盐至盐分不高于5%。
4.如权利要求1所述的海蜇降血脂肽，其特征在于，所述的6）中的喷雾干燥，其进风温度控制在180-185℃，出风温度控制在70-75℃，喷雾压力为0.4MPa。
5.如权利要求1所述的海蜇降血脂肽，其特征在于，所述的6）中的冷冻干燥，其真空度控制在25-35Pa, 冷阱温度控制在-75℃至-84℃。
6.权利要求1所述的海蜇降血脂肽在制备降血脂制品中的应用。
7.一种降血脂制品，其特征在于，所述的降血脂制品中包含有权利要求1所述的海蜇降血脂肽。
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