CN113575915B

CN113575915B - 牡蛎酱油的制备方法

Info

Publication number: CN113575915B
Application number: CN202111139467.0A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 钱冠兰; 孙建安
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113575915A

Abstract

本发明公开了一种牡蛎酱油的制备方法，包括以下步骤：（1）取新鲜牡蛎，加水，加入蛋白酶SCP003进行酶解处理；所述蛋白酶SCP003的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；（2）将成曲、氯化钠溶液和牡蛎酶解液混合，加入发酵罐中发酵；（3）控制发酵温度在40～45℃；当酱醪pH降至5.2时，加入复合酵母，继续发酵，共发酵30～35天；（4）将成熟酱醪进行压榨，得酱油，加温，静置，沉淀，即得。本发明的牡蛎酱油的制备方法，采用蛋白酶SCP003酶解牡蛎，采用变温快速发酵工艺，所制备的酱油的氨基态氮含量、氨基酸含量等指标明显提高，品质得到明显提升，而且生产周期明显缩短，这对于节约生产成本，较少资金占用等具有显著的意义。

Description

牡蛎酱油的制备方法

技术领域

本发明涉及一种牡蛎酱油的快速制备方法，属于酱油酿造技术领域。

背景技术

牡蛎，俗称海蛎子、蚝等，隶属软体动物门，双壳纲，珍珠贝目，是世界上第一大养殖贝类，是人类可利用的重要海洋生物资源之一，为全球性分布种类。牡蛎不仅肉鲜味美、营养丰富, 而且具有独特的保健功能和药用价值，是一种营养价值很高的海产珍品。牡蛎的含锌量居人类食物之首。古今中外均认为牡蛎有治虚弱、解丹毒、降血压、滋阴壮阳的功能。牡蛎作为一种优质的海产养殖贝类，不仅具有肉味鲜美的食用价值，而且其肉与壳均可入药，具有较高的药用价值。牡蛎肉中含有多种氨基酸、糖原、大量的活性微量元素及小分子化合物。

以牡蛎为原料制备酱油，是牡蛎相关产品研究的热点之一。CN 111227218 A（与本发明的申请人相同）公开了一种高盐稀态牡蛎酿造酱油，是用牡蛎加工产物添加到酱油酿造原料中，再按照高盐稀态酱油酿造方法制备的，制成的酱油香气浓郁，滋味鲜美，具有促进食欲的效果，且包含了牡蛎中多肽类、多糖类、牛磺酸等多种营养活性成分。但其发酵周期较长（需120天左右），有必要研发一种发酵周期短的酿造工艺。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种牡蛎酱油的快速制备方法。本发明利用特定的蛋白酶参与发酵，有效缩短了牡蛎酱油的发酵周期，降低了成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种牡蛎酱油的制备方法，包括以下步骤：

（1）取新鲜牡蛎，去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆；打浆后，按料液比1:1～10加水混合，加入蛋白酶SCP003进行酶解处理，添加量为牡蛎湿重的0.1%～3%，在25～50℃下，发酵5～24 h，得牡蛎酶解液；

所述蛋白酶SCP003的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

优选的，料液比为1:5，蛋白酶SCP003的添加量为1%，酶解温度为40℃，酶解时间为8 h；

（2）将成曲、42～45℃的20%～25%氯化钠溶液（质量体积比，单位g/ml）和牡蛎酶解液混合，加入发酵罐中发酵，其中，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.5～2.0倍（重量体积比，即：当成曲干料重量为100 g时，氯化钠溶液的用量为150～200 ml），牡蛎酶解液的用量为氯化钠溶液体积的20%～25%；

所述成曲，是通过以下方法制备得到的：称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲35～45 h，得成曲；

优选的，所述氯化钠溶液的浓度为23%；

优选的，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.8倍；

优选的，牡蛎酶解液的用量为氯化钠溶液体积的23%；

（3）控制发酵温度在40～45℃（优选42℃）；当酱醪pH降至5.1～5.3（优选5.2）（通常6～7天达到该条件）时，降温至28～30℃，加入鲁氏和球拟复合酵母，复合酵母液用量为酱醪体积的0.5%（体积比，即100ml酱醪加入0.5 ml的复合酵母液，复合酵母液中酵母计数在3亿/ml）；添加酵母7天后,升温至40～45℃（优选42℃），继续发酵，共发酵30～35天，发酵结束后，得成熟酱醪；

进一步地，发酵的第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气30 min；之后每隔3天鼓气10min；

进一步地，加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，以混匀酱醪并补充氧气；

所述鲁氏和球拟复合酵母，为现有技术中已有的商品，本发明所用复合酵母为购自日本酿造工株式会社的TS 酵母；

（4）将成熟酱醪进行压榨，得酱油，加温至85～90℃，静置，沉淀（优选7天），取上清液，即为牡蛎酱油。

进一步地，对牡蛎酱油进行调配，调配后的料液经过85℃、30分钟热反应，得到自然发酵牡蛎酱油；调配后的料液的组分组成为：牡蛎酱油 87ml，食用盐1g，白砂糖3g，酵母抽提物1g。

本发明的牡蛎酱油的制备方法，采用蛋白酶SCP003酶解牡蛎，采用变温快速发酵工艺，与普通工艺制备的酱油相比，本发明所制备的酱油的氨基态氮含量、氨基酸含量等指标明显提高，品质得到明显提升。而且，本发明的生产周期明显缩短，由传统的120天减少至30～35天，这对于节约生产成本，较少资金占用等具有显著的意义。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：蛋白酶SCP003的电泳图，其中，泳道1为蛋白Marker，泳道2为纯化后的蛋白。

图2：不同料液比条件下的牡蛎水解度示意图。

图3：不同加酶量条件下的牡蛎水解度示意图。

图4：不同温度条件下的牡蛎水解度示意图。

图5：不同时间下的牡蛎水解度示意图。

图6：实施例3制备的牡蛎酱油样品氨基酸测定色谱图。

图7：实施例4制备的牡蛎酱油样品氨基酸测定色谱图。

图8：实施例5制备的牡蛎酱油样品氨基酸测定色谱图。

图9：实施例6制备的牡蛎酱油样品氨基酸测定色谱图。

图10：本发明的牡蛎酱油与竞品的评价对比示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 获得蛋白酶 SCP003

本发明从嗜麦芽寡养单孢菌（stenotrophomonas maltophilia）基因组序列中发掘到一段蛋白酶编码序列。嗜麦芽寡养单胞菌是一种分布广泛的细菌，为临床上常见的条件致病菌，广泛存在于水、土壤、动物体内。虽然该菌为条件致病菌，但其分布的广泛性和生长的快速性表明其自身存在着丰富的酶系对不同的底物进行分解以供其使用，该菌是一个待发掘的酶库，其中的蛋白酶可能具有与一般蛋白酶不同的特性。因此对实验室保藏的一株嗜麦芽寡养单胞菌进行了测序(为商品化产品,并非本实验室所独有)，并从其测序基因组中发掘出一段编码蛋白酶的序列，首次对其进行了异源表达和应用，将其命名为SCP003。序列经密码子优化后如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因片段存在于嗜麦芽寡养单胞菌中，可以以嗜麦芽寡养单胞菌基因组为模板通过PCR扩增得到，也可以根据序列通过人工基因合成序列得到。

将蛋白酶SCP003基因片段（SEQ ID NO.2所示）无缝连接到质粒pET-21a上，得到重组质粒pET-21a-SCP003，将该重组质粒转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，扩增后提取质粒转化至大肠杆菌BL21为宿主菌进行异源表达。将含有质粒pET-21a-SCP003的大肠杆菌接种至含氨苄的100 mL LB培养基中，37℃摇床培养过夜获得种子液。种子液转接至1000 mL的LB培养基中，37℃摇床培养12 h获得2级种子液。将2级种子液接种至50 L发酵罐中，37℃培养约4 h，当菌体生长至OD₆₀₀为0.6，添加终浓度为40 μM的IPTG，控制发酵温度为16℃诱导表达16 h。发酵液于8000 r/min 4℃离心10 min收集菌体，菌体使用pH 7.0的磷酸缓冲液进行重悬，使用高压均质机在600 bar压力下，高压均质破碎10 min，直到破碎液清澈不挂丝，破碎液于10000 r/min 4℃离心10 min后取上清。上清液使用镍柱进行纯化，挂柱后使用75mM咪唑洗脱，洗脱后使用截留分子量5 kDa的超滤膜进行浓缩脱盐，脱盐后将浓缩液真空冷冻干燥，得到蛋白酶SCP003酶粉，将酶粉用于酱油制备。该蛋白酶的蛋白电泳结果见图1，由图1可以看到，其分子量约为31 kDa，与预测分子量对应，确定该酶为所需的蛋白酶SCP003。

SEQ ID NO.1：

MNEPILLPRDIAHDARDWSDLQRAVALLEAPTLTARMANLVGTPLEFAVKALPKAVSGRIHGAVQAALSKSAQAALWSMDNSPGKGASTRWHKLAAATSGAVGGAFGFAALFIELPVSTTIMMRAVADVARSEGFDLSEFSTRQACLEVFALGGNSPRDDASETGYYLARGFTTDVMRHLSAELAGRVVTGRDLTLGVAPKEAGKLLAKMVEKVAARFGVVVTEKFAAQAVPIVGAAAGATLNTMFTDYYQDMARGHFIVRRLERKYGEDVVRACYDRVAHGAVRIEPRLE。

SEQ ID NO.2：5’-

1 ATGAACGAAC CAATTCTGCT GCCGCGTGAT ATCGCGCATG ACGCACGTGA TTGGTCTGATCTGCAGCGTG

71 CTGTTGCTCT GCTGGAAGCA CCGACCCTGA CTGCACGTAT GGCCAACCTG GTTGGTACCCCGCTGGAGTT

141 CGCCGTTAAA GCCCTGCCGA AAGCTGTCTC TGGTCGTATT CATGGCGCTG TTCAAGCGGCTCTGTCCAAA

211 TCTGCGCAGG CAGCTCTGTG GAGCATGGAC AACAGCCCGG GTAAAGGCGC ATCTACGCGTTGGCACAAAC

281 TGGCTGCTGC AACCTCCGGT GCTGTTGGTG GTGCTTTCGG TTTCGCGGCT CTGTTTATTGAACTGCCGGT

351 CTCTACGACT ATTATGATGC GCGCGGTTGC TGATGTTGCG CGTTCCGAAG GTTTCGATCTGTCTGAATTC

421 TCCACCCGTC AGGCTTGCCT GGAAGTGTTT GCACTGGGCG GTAACTCCCC ACGTGATGATGCCTCCGAAA

491 CGGGTTACTA CCTGGCCCGT GGCTTCACCA CCGATGTGAT GCGTCATCTG AGCGCGGAACTGGCGGGTCG

561 TGTTGTTACC GGTCGTGATC TGACCCTGGG TGTTGCGCCG AAAGAAGCCG GCAAACTGCTGGCGAAAATG

631 GTGGAGAAAG TTGCAGCACG CTTCGGCGTA GTGGTCACCG AAAAGTTTGC AGCACAGGCAGTACCAATTG

701 TTGGTGCTGC TGCTGGTGCG ACGCTGAATA CCATGTTCAC CGACTACTAC CAGGATATGGCTCGTGGTCA

771 TTTCATTGTA CGCCGCCTGG AACGCAAATA CGGCGAAGAT GTTGTTCGTG CATGTTACGACCGTGTTGCT

841 CACGGTGCAG TACGTATCGA ACCGCGTCTG GAG-3’。

实施例2 蛋白酶CSP003酶解牡蛎实验

（1）不同料液比实验

取新鲜牡蛎，去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆；打浆后，按料液比1:1、1:2、1:3、1:5、1:7加水混合，混合后加入1%的蛋白酶SCP003，酶解温度为35℃，酶解时间为8h，酶解结束后取样测定牡蛎水解度。

结果如图2所示，可以看出随着料液比的减小，蛋白酶SCP003酶解牡蛎的水解度逐渐增大，可能随着牡蛎底物的稀释，体系粘度减小，更有利于牡蛎的酶解。虽然1:7料液比下牡蛎的水解度大于1:5料液比下的水解度，但结果相差不大，考虑到体系的液体体积和酶解效率，选择1:5料液比为牡蛎酶解体系的最终料液比。

（2）不同加酶量实验

取新鲜牡蛎，去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆；打浆后，按料液比1:5加水混合，混合后分别加入0.1%、0.3%、0.5%、1.0%和1.5%的蛋白酶SCP003，酶解温度为35℃，酶解时间为8 h，酶解结束后取样测定牡蛎水解度。

结果如图3所示，可以看出随着加酶量的增加，牡蛎的水解度也逐渐增大，在加酶量为1.5%的时候，牡蛎的水解度达到最大值29.1%，但较加酶量1.0%提升不大，考虑到使用酶的成本问题，选择1.0%为体系的最终加酶量。

（3）不同酶解温度实验

取新鲜牡蛎，去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆；打浆后，按料液比1:5加水混合，混合后加入1%的蛋白酶SCP003，酶解温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，酶解时间为8 h，酶解结束后取样测定牡蛎水解度。

结果如图4所示，可以看出不同温度条件下牡蛎的水解度不同，在低于40℃时，随着温度的升高，牡蛎的水解度逐渐增大。在40℃时达到最大的水解度，高于40℃时酶活性降低，水解度也随之降低。根据结果分析，选取40℃为牡蛎酶解的最适温度。

（4）牡蛎酶解时间曲线

取新鲜牡蛎，去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆；打浆后，按料液比1:5加水混合，混合后加入1%的蛋白酶SCP003，酶解温度40℃，分别在酶解时间为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h时取样测定牡蛎水解度。

结果如图5所示，可以看出，随着酶解时间的延长，牡蛎的水解度也在逐渐增加，在8 h时达到比较高的水平，时间再延长后牡蛎水解度的上升幅度不大，综合考虑酶解效率，选择8 h为牡蛎的酶解处理时间。

实施例3 使用普通高盐稀态工艺发酵牡蛎酱油

新鲜牡蛎去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆。打浆后，按料液比1:5加水混合，加入中性蛋白酶（庞博生物，100万U/g）进行酶解处理，添加量为牡蛎湿重的1%，在40℃下发酵8 h，得牡蛎酶解液。

称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲40 h，得成曲。配制23%的氯化钠溶液，将氯化钠溶液的温度降至4℃，与成曲混合，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量（即豆粕和小麦的重量之和）的1.8倍，同时添加上述制备的牡蛎酶解液，添加量为氯化钠溶液体积的23%，加入发酵罐中进行共同发酵。

酱醪入罐后压缩空气混匀，发酵温度控制在15℃±2℃。第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气约30 min。之后每隔3天鼓气10min。当罐中酱醪pH降至5.2，向发酵罐中加入复合酵母液（本发明所用复合酵母为购自日本酿造工株式会社的TS 酵母，下同），复合酵母液用量为0.5%，加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，混匀酱醪并补充氧气。发酵温度控制在28～30℃，发酵过程中若出现固液分层，立即开压缩空气短搅拌，鼓气10 min。共发酵120天（普通工艺120天发酵周期，前15天是低温发酵,然后逐渐升温,后恒温发酵.添加酵母时温度已经升至28～30℃，然后持续这个温度发酵）。

发酵结束后，对成熟酱醪进行压榨，得酱油，加温至85～90℃，静置，沉淀7天，取上清液，即为牡蛎酱油。

实施例4 使用变温高盐稀态工艺发酵牡蛎酱油

新鲜牡蛎去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆。打浆后，按料液比1:5加水混合，加入中性蛋白酶进行酶解处理，添加量为牡蛎湿重的1%，在40℃下，发酵8 h，得牡蛎酶解液。

称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲40 h，得成曲。配制23%的氯化钠溶液，将氯化钠溶液的温度提至45℃，与成曲混合，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.8倍，同时添加上述制备的牡蛎酶解液，添加量为氯化钠溶液体积的23%，加入发酵罐中进行共同发酵。

酱醪入罐后压缩空气混匀，发酵温度控制在42℃±2℃。第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气约30 min。之后每隔3天鼓气10min。当罐中酱醪pH降至5.2（通常6～7天达到该条件）时，降温至28～30℃，向发酵罐中加入复合酵母液，复合酵母液用量为0.5%，加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，混匀酱醪并补充氧气。添加酵母7天后,升温至42℃±2℃继续发酵，发酵过程中若出现固液分层，立即开压缩空气短搅拌，鼓气10 min。共发酵35天。

实施例5 使用变温高盐稀态工艺及专用蛋白酶发酵牡蛎酱油

新鲜牡蛎去壳洗净、去除黑变和内脏后，加少许水打浆。打浆后，按料液比1:5加水混合，加入实施例1制备的蛋白酶SCP003进行酶解处理，添加量为牡蛎湿重的1%，在40℃下，发酵8 h，得牡蛎酶解液。

称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲40 h，得成曲。配制23%的氯化钠溶液，将氯化钠溶液的提至45℃，与成曲混合，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.8倍，同时添加上述制备的牡蛎酶解液，添加量为氯化钠溶液体积的23%，加入发酵罐中进行共同发酵。

酱醪入罐后压缩空气混匀，发酵温度控制在42℃±2℃。第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气约30 min。之后每隔3天鼓气10min。当罐中酱醪pH降至5.2（通常6～7天达到该条件）时，降温至28～30℃，向发酵罐中加入复合酵母液，复合酵母液用量为0.5%（体积比，即100ml酱醪加入0.5 ml的复合酵母液，复合酵母液中酵母计数在3亿/ml），加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，混匀酱醪并补充氧气。添加酵母7天后,升温至42℃±2℃继续发酵，发酵过程中若出现固液分层，立即开压缩空气短搅拌，鼓气10 min。共发酵35天。

实施例6 使用普通高盐稀态工艺及专用蛋白酶发酵牡蛎酱油

称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲40 h，得成曲。配制23%的氯化钠溶液，将氯化钠溶液的温度降至4℃，与成曲混合，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.8倍，同时添加上述制备的牡蛎酶解液，添加量为氯化钠溶液体积的23%，加入发酵罐中进行共同发酵。

酱醪入罐后压缩空气混匀，发酵温度控制在15℃±2℃。第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气约30 min。之后每隔3天鼓气10min。当罐中酱醪pH降至5.2，向发酵罐中加入复合酵母，复合酵母用量为0.5%，加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，混匀酱醪并补充氧气。发酵温度控制在28～30℃，发酵过程中若出现固液分层，立即开压缩空气短搅拌，鼓气10 min。共发酵120天（普通工艺120天发酵周期，前15天是低温发酵,然后逐渐升温,后恒温发酵.添加酵母时温度已经升至28～30℃，然后持续这个温度发酵）。

实施例3、4、5、6发酵酱油的记录表及检测的数值如表1所示。

表1 实施例3、4、5、6制备的牡蛎酱油样品氨基酸含量

从表1可见，实施例3、4、5、6制备的牡蛎酱油，氨基酸总量分别为11.36 mg/g，11.56 mg/g,12.09 mg/g,11.66 mg/g，本发明的方法（实施例5）比普通方法的氨基酸总量高出0.73mg/g，密度按照1.17g/ml，转换后就是高出0.08g/100ml。酱油标准GB/T18186，特级酱油0.80g/100ml，可见酱油提高0.08g/100ml,相当于全氮提高了10%。

对比可见，本发明（实施例5）制备的牡蛎酱油，氨基酸含量高，明显优于实施例3、4、6。另外从主要呈味氨基酸丙氨酸含量（实施例3、4、5、6中丙氨酸占比分别为5.85%、5.92%、6.46%、6.39%）也可看出，实施例5中蛋白酶SCP003的添加具有明显优势，说明使用来自嗜麦芽寡养单胞菌的蛋白酶SCP003可使牡蛎蛋白酶解效率更高，得到氨基酸含量明显提升的酶解原料。

对实施例5制备的牡蛎酱油进行调配，调配后的料液经过85℃、30分钟热反应，得到自然发酵牡蛎酱油；调配后的料液的组分组成为：牡蛎酱油 87ml，食用盐1g，白砂糖3g，酵母抽提物1g。执行标准GB/T18186，特级，如表2所示。

表2

AN	TN	NaCl	pH
				≥0.8g/100ml	≥1.5g/100ml	14-15g/100ml	4.8-5.0

与竞品（某企业生产的一款市售酱油）相比较，如表3、图10所示。可见，本发明的酱油，评价更高。

表3

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 牡蛎酱油的制备方法

<141> 2021-09-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> Stenotrophomonas maltophilia

<400> 1

Met Asn Glu Pro Ile Leu Leu Pro Arg Asp Ile Ala His Asp Ala Arg

1 5 10 15

Asp Trp Ser Asp Leu Gln Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu Ala Pro Thr

20 25 30

Leu Thr Ala Arg Met Ala Asn Leu Val Gly Thr Pro Leu Glu Phe Ala

35 40 45

Val Lys Ala Leu Pro Lys Ala Val Ser Gly Arg Ile His Gly Ala Val

50 55 60

Gln Ala Ala Leu Ser Lys Ser Ala Gln Ala Ala Leu Trp Ser Met Asp

65 70 75 80

Asn Ser Pro Gly Lys Gly Ala Ser Thr Arg Trp His Lys Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Ala Phe Gly Phe Ala Ala Leu Phe

100 105 110

Ile Glu Leu Pro Val Ser Thr Thr Ile Met Met Arg Ala Val Ala Asp

115 120 125

Val Ala Arg Ser Glu Gly Phe Asp Leu Ser Glu Phe Ser Thr Arg Gln

130 135 140

Ala Cys Leu Glu Val Phe Ala Leu Gly Gly Asn Ser Pro Arg Asp Asp

145 150 155 160

Ala Ser Glu Thr Gly Tyr Tyr Leu Ala Arg Gly Phe Thr Thr Asp Val

165 170 175

Met Arg His Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Arg Val Val Thr Gly Arg

180 185 190

Asp Leu Thr Leu Gly Val Ala Pro Lys Glu Ala Gly Lys Leu Leu Ala

195 200 205

Lys Met Val Glu Lys Val Ala Ala Arg Phe Gly Val Val Val Thr Glu

210 215 220

Lys Phe Ala Ala Gln Ala Val Pro Ile Val Gly Ala Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Thr Leu Asn Thr Met Phe Thr Asp Tyr Tyr Gln Asp Met Ala Arg Gly

245 250 255

His Phe Ile Val Arg Arg Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Glu Asp Val Val

260 265 270

Arg Ala Cys Tyr Asp Arg Val Ala His Gly Ala Val Arg Ile Glu Pro

275 280 285

Arg Leu Glu

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgaacgaac caattctgct gccgcgtgat atcgcgcatg acgcacgtga ttggtctgat 60

ctgcagcgtg ctgttgctct gctggaagca ccgaccctga ctgcacgtat ggccaacctg 120

gttggtaccc cgctggagtt cgccgttaaa gccctgccga aagctgtctc tggtcgtatt 180

catggcgctg ttcaagcggc tctgtccaaa tctgcgcagg cagctctgtg gagcatggac 240

aacagcccgg gtaaaggcgc atctacgcgt tggcacaaac tggctgctgc aacctccggt 300

gctgttggtg gtgctttcgg tttcgcggct ctgtttattg aactgccggt ctctacgact 360

attatgatgc gcgcggttgc tgatgttgcg cgttccgaag gtttcgatct gtctgaattc 420

tccacccgtc aggcttgcct ggaagtgttt gcactgggcg gtaactcccc acgtgatgat 480

gcctccgaaa cgggttacta cctggcccgt ggcttcacca ccgatgtgat gcgtcatctg 540

agcgcggaac tggcgggtcg tgttgttacc ggtcgtgatc tgaccctggg tgttgcgccg 600

aaagaagccg gcaaactgct ggcgaaaatg gtggagaaag ttgcagcacg cttcggcgta 660

gtggtcaccg aaaagtttgc agcacaggca gtaccaattg ttggtgctgc tgctggtgcg 720

acgctgaata ccatgttcac cgactactac caggatatgg ctcgtggtca tttcattgta 780

cgccgcctgg aacgcaaata cggcgaagat gttgttcgtg catgttacga ccgtgttgct 840

cacggtgcag tacgtatcga accgcgtctg gag 873

Claims

1.一种牡蛎酱油的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）取新鲜牡蛎，加水打浆；打浆后，按料液比1:5加水混合，加入蛋白酶SCP003进行酶解处理，添加量为牡蛎湿重的1%，在40℃下，发酵8 h，得牡蛎酶解液；

所述蛋白酶SCP003的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）将成曲、42～45℃的20%～25%氯化钠溶液和牡蛎酶解液混合，加入发酵罐中发酵，其中，氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.5～2.0倍，牡蛎酶解液的用量为氯化钠溶液体积的20%～25%；

所述成曲是通过以下方法制备得到的：称取豆粕75 g，小麦25 g，加入60 mL水，灭菌冷却至室温，接入米曲霉，25℃下制曲35～45 h，得成曲；

（3）控制发酵温度在40～45℃；当酱醪pH降至5.1～5.3时，降温至28～30℃，加入鲁氏和球拟复合酵母；添加酵母7天后,升温至40～45℃，继续发酵，共发酵30～35天，发酵结束后，得成熟酱醪；

发酵的第2天开始用压缩空气搅拌一次，鼓气30 min；之后每隔3天鼓气10min；

复合酵母液的用量为酱醪体积的0.5%；

加入酵母后立即进行搅拌，鼓气30 min，以混匀酱醪并补充氧气；

（4）将成熟酱醪进行压榨，得酱油，加温至85～90℃，静置，沉淀，取上清液，即为牡蛎酱油。

2.根据权利要求1所述的牡蛎酱油的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，氯化钠溶液的浓度为23%；

氯化钠溶液的用量为成曲干料重量的1.8倍；

牡蛎酶解液的用量为氯化钠溶液体积的23%。

3.根据权利要求1所述的牡蛎酱油的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，发酵温度控制在42℃；

当酱醪pH降至5.2时，加入复合酵母。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的牡蛎酱油的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：对牡蛎酱油进行调配，调配后的料液经过85℃、30分钟热反应，得到自然发酵牡蛎酱油。

5.根据权利要求4所述的牡蛎酱油的制备方法，其特征在于：调配后的料液的组分组成为：牡蛎酱油 87ml，食用盐1g，白砂糖3g，酵母抽提物1g。