CN109293766A - 从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯；水解步骤为：将鱼鳞胶原蛋白与枯草杆菌蛋白酶，加入到蒸馏水中完全溶解，加入过氧叔丁醇和甜菊糖，调节pH，恒温水浴下双频率超声辅助酶解得酶解液；微量的过氧叔丁醇和甜菊糖产生协同作用，能够增大胶原蛋白的水解程度，提高枯草杆菌蛋白酶的酶解速率；除金属步骤为：在酶解液中加入淀粉黄原酸酯和桑叶多糖，充分混合，反应，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液；淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有较高的重金属离子去除率。有益效果为：本发明提供的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，过程易控，水解彻底，产物中多肽占比大、易于被机体吸收、重金属含量低。

Description

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法

技术领域

本发明涉及胶原蛋白多肽提取技术领域，尤其是涉及一种从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白广泛存在于动物的皮、骨、腱、膜等结缔组织中，是构成结缔组织的主要成分。以往制作胶原蛋白主要利用资源丰富的陆生动物，如牛、猪的皮、骨等作为原料来加工制作。鱼类的胶原虽早已被人类认识，如龟板胶、黄鱼胶等，但却未能作为一种重要的工业应用材料加以利用，这主要是依靠海洋捕捞的产品，来源不稳定、缺乏规模性。近年来，由于陆生动物受环境、传染疾病等多种因素的影响，其蛋白质的安全性受到质疑，而水产养殖业和水产加工业有了很大的发展，鱼皮、鱼骨、鱼鳞等水产资源来源稳定，且无不安全之虑，因此，鱼胶原蛋白的应用、开发就成为了人们关注的热点。

目前，胶原蛋白生产提取的主要来源于三类物质：骨胶原、深海鱼鱼皮、鱼鳞。其中骨胶原主要来自猪、牛、羊等动物，原料易获取，原料源稳定，但是动物骨提取的骨胶原含有较多脂肪，骨胶原纯度稍低，美容性能稍差，并且由于宗教和动物疾病的原因，动物骨胶原的市场份额已经越来越小。用来生产胶原蛋白的深海鱼鱼皮主要为深海鳕鱼皮，鱼皮胶原蛋白含量高，性能优良，但是鳕鱼属于冷水性底层鱼类，生活在大海300米以下，人工无法进行养殖，获取难度较大，技术要求高。鱼鳞作为渔业加工的副产品，其中胶原蛋白的含量在80％以上，而胶原蛋白多肽在人体内具有主动吸收、快速吸收、直接吸收的特点，具有抑制血压上升、良好的生物相溶性和低抗原性特点，而且氨基酸组成与大分子胶原蛋白一致，另外胶原蛋白多肽由于分子量小，易于渗透入皮肤起到促进皮肤胶原代谢和再生的作用，因此可以在医药、保健品、化妆品等行业中进一步提升鱼鳞的应用价值。

提取胶原蛋白多肽的方法主要有热水浸提法、酸法、碱法、盐法及酶法等，其活性肽的获得方法则有从天然生物体中提取、通过化学方法和重组DNA技术合成、体外水解蛋白质等。随着酶制剂工业的迅猛发展，酶法水解比传统的酸法、碱法更为温和、安全、专一，不仅降解时间短，产品营养流失较少，而且无环境污染。目前，酶解海洋胶原蛋白主要有单酶法和多酶法，多酶法又分为混合酶解法和分步酶解法。酶解提取活性肽的条件通常应考虑所开发产品对分子量的要求，分子量较小的产品宜用多酶法。

现有技术如授权公告号为CN 101297673 B的中国发明专利，公开了一种鱼胶原低聚肽的加工方法，选用已脱灰、脱脂的干鱼鳞为原料，经过清洗、预处理、酶解、过滤、脱色、脱味、脱盐、无菌过滤、浓缩、喷雾干燥处理后，得到以干基计：蛋白含量≥95％、灰分＜0.5％、平均分子量为700Dalton的鱼胶原低聚肽粉；其加工出的产品品质高、质量好，无色、无苦味、无腥臭味、含盐量低、无任何毒副作用，酶解时间短，吸附过程使用的树脂填料可再生、可多次重复使用，避免了使用一次性活性炭带来的资源浪费和造成产品灰分高的问题，但是该方法酶解过程较为简单，由于胶原蛋白的三股超螺旋结构，容易水解不彻底，造成营养物质浪费，且产品的重金属含量较高，对其进一步应用到医药、保健品、化妆品等行业存在隐患。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，该方法过程易控，水解彻底，产物中多肽占比较大，易于被机体吸收，且重金属含量低，有利于其进一步应用到医药、保健品、化妆品等行业。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯，具体包括以下步骤：

预处理：取鱼鳞，清水洗净，低温烘干，粉碎，用1-2％柠檬酸溶液浸泡24-36小时，间歇搅拌，12-18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；然后用0.03-0.05％氢氧化钠溶液浸泡24-36小时，间歇搅拌，12-18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；预处理可以除去鱼鳞中的钙质、非胶原物质，以便于进一步的提取胶原蛋白；

提取：将预处理后的鱼鳞置于0.05-0.08mol/L柠檬酸溶液体系中，加入底物重量0.3-0.5％的木瓜蛋白酶限制性酶解，控制温度在5-10℃，双频率超声辅助酶解，持续低速搅拌下酶解24-48小时，沸水浴灭酶，将酶解液于10000-13000r/min高速离心，取上清液，沉淀重复酶解操作2-3次，收集上清液，冷冻干燥得鱼鳞胶原蛋白干品；弱酸体系下限制酶解，在既保证胶原蛋白不变性的同时又具有较高的胶原蛋白提取率，提取率可以达到45％以上；

水解：称取25-40份冻干的鱼鳞胶原蛋白与0.7-0.9份枯草杆菌蛋白酶，加入到100-150份蒸馏水中完全溶解，加入0.02-0.06份过氧叔丁醇、0.02-0.03份甜菊糖，调节pH为7.5-8.0，置于45-55℃恒温水浴锅内，双频率超声辅助酶解，水解1.5-2小时后用沸水浴灭酶15-20分钟，冷却得酶解液；胶原蛋白独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收较困难，不易被人体充分利用，鱼鳞胶原蛋白分子经水解后主要形成相对分子量较小的多肽、小肽、氨基酸，水解后其吸收利用率可以提高很多，且可以促进食品中的其它蛋白质的吸收；

微量的过氧叔丁醇和甜菊糖产生协同作用，一方面能够增加枯草杆菌蛋白酶与鱼鳞胶原蛋白结合的活性位点，提高酶与底物的亲和力，增大水解程度，同时加快枯草杆菌蛋白酶的酶解速率，从而缩减水解反应时间，降低时间成本与人工成本，并且在随后的水解液煮沸时蒸腾除去，不会残留在胶原蛋白肽产品中；另一方面，能够促进枯草杆菌蛋白酶将鱼鳞胶原蛋白的肽链从内部断开，使蛋白内部的氨基酸暴露出来，并进一步将多肽末端的疏水性氨基酸切断、释放出来，在增加小分子氨基酸游离程度的同时，还能有效减少肽的苦味，改善口感；

除金属：在酶解液中加入淀粉黄原酸酯和桑叶多糖，充分混合，反应20-24h后，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液，过滤压力控制在0.2-0.6MP；

提纯：将鱼鳞胶原蛋白多肽清液依次通过大孔吸附树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂进行吸附，去除清液中的颜色、异味和盐类，吸附后用洗脱液进行洗脱；然后收集提纯液减压浓缩，冷冻干燥即得鱼鳞胶原蛋白多肽；提纯后，胶原蛋白多肽产品中的氨基酸、小肽占比提高，其分子量介于200D-2000D之间，易于被机体吸收利用，胶原蛋白多肽具有多种医疗保健功效，如抑制血管紧张素转化酶活性，其具有的抗氧化活性能消除自由基，还可以减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等，是一种易吸收、无毒副作用的营养保健物质。

优选的，所用的双频率超声辅助酶解的超声频率分别为30-45kHz与50-60kHz，超声声强为0.4-0.5W/cm²；双频率超声可以通过降低酶解反应Ea和KM值，增加酶与底物的接触频率与接触面积，增大酶解反应速率。

优选的，在除金属过程中，酶解溶液中加入的淀粉黄原酸酯为2-10％，桑叶多糖为1-2％；

淀粉黄原酸酯和桑叶多糖的特殊存在，能够打破酶解溶液中重金属络合物的配位结构，破坏络离子与重金属离子的络合平衡状态，使其分子中的极性基与酶解溶液中的重金属离子发生键合离子转移，即淀粉黄原酸酯和桑叶多糖将分子中的极性基位置让给酶解溶液中的重金属离子形成稳定的重金属盐沉淀，这些重金属盐沉淀的溶度积远小于重金属离子形成的其它沉淀的溶度积，从而重金属离子以沉淀的形式从酶解溶液中分离出来，最终可降低重金属对鱼胶原低聚肽产品的污染毒害；同时，淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有较高的稳定性，制备简单，成本低廉，具有较高的重金属离子去除率。

优选的，提纯中使用的洗脱液为室温下去离子水，流速为2-3BV/h。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)采用枯草杆菌蛋白酶破坏胶原蛋白独特的三股超螺旋结构，得到相对分子量较小的多肽，水解后其吸收利用率可以提高很多，且可以促进食品中其它蛋白质的吸收；

(2)过氧叔丁醇和甜菊糖具有协同作用，一方面能够增大胶原蛋白的水解程度，提高枯草杆菌蛋白酶的酶解速率，缩减水解反应时间，降低时间成本与人工成本，另一方面，能够提高疏水性氨基酸的游离程度，改善口感；

(3)通过在酶解液中加入淀粉黄原酸酯和桑叶多糖，降低胶原蛋白多肽中的重金属含量，从而降低对人体的毒害作用，有利于其进一步应用到医药、保健品、化妆品等行业。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯，具体步骤如下：

预处理：取鱼鳞，清水洗净，低温烘干，粉碎，用1％柠檬酸溶液浸泡24小时，间歇搅拌，12小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；然后用0.03％氢氧化钠溶液浸泡24小时，间歇搅拌，12小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；预处理可以除去鱼鳞中的钙质、非胶原物质，以便于进一步的提取胶原蛋白；

提取：将预处理后的鱼鳞置于0.05mol/L柠檬酸溶液体系中，加入底物重量0.3％的木瓜蛋白酶限制性酶解，控制温度在5℃，于超声频率为30kHz，超声声强为0.4W/cm²下双频率超声辅助酶解，持续低速搅拌下酶解24小时，沸水浴灭酶，将酶解液于10000r/min高速离心，取上清液，沉淀重复酶解操作2次，收集上清液，冷冻干燥得鱼鳞胶原蛋白干品；弱酸体系下限制酶解，在既保证胶原蛋白不变性的同时又具有较高的胶原蛋白提取率，提取率可以达到45％以上；

水解：称取25份冻干的鱼鳞胶原蛋白与0.7份枯草杆菌蛋白酶，加入到100份蒸馏水中完全溶解，加入0.02份过氧叔丁醇、0.02份甜菊糖，调节pH为7.5，置于45℃恒温水浴锅内，于超声频率为50kHz，超声声强为0.4W/cm²下双频率超声辅助酶解，水解1.5小时后用沸水浴灭酶15分钟，冷却得酶解液；胶原蛋白独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收较困难，不易被人体充分利用，鱼鳞胶原蛋白分子经水解后主要形成相对分子量较小的多肽、小肽、氨基酸，水解后其吸收利用率可以提高很多，且可以促进食品中的其它蛋白质的吸收；

微量的过氧叔丁醇和甜菊糖产生协同作用，一方面能够增加枯草杆菌蛋白酶与鱼鳞胶原蛋白结合的活性位点，提高酶与底物的亲和力，增大水解程度，同时加快枯草杆菌蛋白酶的酶解速率，从而缩减水解反应时间，降低时间成本与人工成本，并且在随后的水解液煮沸时蒸腾除去，不会残留在胶原蛋白肽产品中；另一方面，能够促进枯草杆菌蛋白酶将鱼鳞胶原蛋白的肽链从内部断开，使蛋白内部的氨基酸暴露出来，并进一步将多肽末端的疏水性氨基酸切断、释放出来，在增加小分子氨基酸游离程度的同时，还能有效减少肽的苦味，改善口感；

除金属：在酶解液中加入2％的淀粉黄原酸酯和1％的桑叶多糖，充分混合，反应20h后，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液，过滤压力控制在0.2MP；

淀粉黄原酸酯和桑叶多糖的特殊存在，能够打破酶解溶液中重金属络合物的配位结构，破坏络离子与重金属离子的络合平衡状态，使其分子中的极性基与酶解溶液中的重金属离子发生键合离子转移，即淀粉黄原酸酯和桑叶多糖将分子中的极性基位置让给酶解溶液中的重金属离子形成稳定的重金属盐沉淀，这些重金属盐沉淀的溶度积远小于重金属离子形成的其它沉淀的溶度积，从而重金属离子以沉淀的形式从酶解溶液中分离出来，最终可降低重金属对鱼胶原低聚肽产品的污染毒害；同时，淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有较高的稳定性，制备简单，成本低廉，具有较高的重金属离子去除率；

提纯：将鱼鳞胶原蛋白多肽清液依次通过大孔吸附树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂进行吸附，去除清液中的颜色、异味和盐类，吸附后用室温下去离子水，流速为2BV/h进行洗脱；然后收集提纯液减压浓缩，冷冻干燥即得鱼鳞胶原蛋白多肽；提纯后，胶原蛋白多肽产品中的氨基酸、小肽占比提高，其分子量介于200D-2000D之间，易于被机体吸收利用。

实施例2：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯，具体步骤如下：

预处理：取鱼鳞，清水洗净，低温烘干，粉碎，用1％柠檬酸溶液浸泡32小时，间歇搅拌，16小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；然后用0.04％氢氧化钠溶液浸泡32小时，间歇搅拌，16小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；预处理可以除去鱼鳞中的钙质、非胶原物质，以便于进一步的提取胶原蛋白；

提取：将预处理后的鱼鳞置于0.06mol/L柠檬酸溶液体系中，加入底物重量0.4％的木瓜蛋白酶限制性酶解，控制温度在6℃，于超声频率为35kHz，超声声强为0.4W/cm²下双频率超声辅助酶解，持续低速搅拌下酶解36小时，沸水浴灭酶，将酶解液于12000r/min高速离心，取上清液，沉淀重复酶解操作3次，收集上清液，冷冻干燥得鱼鳞胶原蛋白干品；弱酸体系下限制酶解，在既保证胶原蛋白不变性的同时又具有较高的胶原蛋白提取率，提取率可以达到45％以上；

水解：称取30份冻干的鱼鳞胶原蛋白与0.8份枯草杆菌蛋白酶，加入到130份蒸馏水中完全溶解，加入0.03份过氧叔丁醇、0.02份甜菊糖，调节pH为7.8，置于50℃恒温水浴锅内，于超声频率为55kHz，超声声强为0.4W/cm²下双频率超声辅助酶解，水解1.7小时后用沸水浴灭酶18分钟，冷却得酶解液；胶原蛋白独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收较困难，不易被人体充分利用，鱼鳞胶原蛋白分子经水解后主要形成相对分子量较小的多肽、小肽、氨基酸，水解后其吸收利用率可以提高很多，且可以促进食品中的其它蛋白质的吸收；

微量的过氧叔丁醇和甜菊糖产生协同作用，一方面能够增加枯草杆菌蛋白酶与鱼鳞胶原蛋白结合的活性位点，提高酶与底物的亲和力，增大水解程度，同时加快枯草杆菌蛋白酶的酶解速率，从而缩减水解反应时间，降低时间成本与人工成本，并且在随后的水解液煮沸时蒸腾除去，不会残留在胶原蛋白肽产品中；另一方面，能够促进枯草杆菌蛋白酶将鱼鳞胶原蛋白的肽链从内部断开，使蛋白内部的氨基酸暴露出来，并进一步将多肽末端的疏水性氨基酸切断、释放出来，在增加小分子氨基酸游离程度的同时，还能有效减少肽的苦味，改善口感；

除金属：在酶解液中加入6％的淀粉黄原酸酯和1％的桑叶多糖，充分混合，反应22h后，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液，过滤压力控制在0.4MP；

淀粉黄原酸酯和桑叶多糖的特殊存在，能够打破酶解溶液中重金属络合物的配位结构，破坏络离子与重金属离子的络合平衡状态，使其分子中的极性基与酶解溶液中的重金属离子发生键合离子转移，即淀粉黄原酸酯和桑叶多糖将分子中的极性基位置让给酶解溶液中的重金属离子形成稳定的重金属盐沉淀，这些重金属盐沉淀的溶度积远小于重金属离子形成的其它沉淀的溶度积，从而重金属离子以沉淀的形式从酶解溶液中分离出来，最终可降低重金属对鱼胶原低聚肽产品的污染毒害；同时，淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有较高的稳定性，制备简单，成本低廉，具有较高的重金属离子去除率；

提纯：将鱼鳞胶原蛋白多肽清液依次通过大孔吸附树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂进行吸附，去除清液中的颜色、异味和盐类，吸附后用室温下去离子水，流速为2BV/h进行洗脱；然后收集提纯液减压浓缩，冷冻干燥即得鱼鳞胶原蛋白多肽；提纯后，胶原蛋白多肽产品中的氨基酸、小肽占比提高，其分子量介于200D-2000D之间，易于被机体吸收利用。

实施例3：

从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯，具体步骤如下：

预处理：取鱼鳞，清水洗净，低温烘干，粉碎，用2％柠檬酸溶液浸泡36小时，间歇搅拌，18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；然后用0.05％氢氧化钠溶液浸泡36小时，间歇搅拌，18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；预处理可以除去鱼鳞中的钙质、非胶原物质，以便于进一步的提取胶原蛋白；

提取：将预处理后的鱼鳞置于0.08mol/L柠檬酸溶液体系中，加入底物重量0.5％的木瓜蛋白酶限制性酶解，控制温度在10℃，于超声频率为45kHz，超声声强为0.5W/cm²下双频率超声辅助酶解，持续低速搅拌下酶解48小时，沸水浴灭酶，将酶解液于13000r/min高速离心，取上清液，沉淀重复酶解操作3次，收集上清液，冷冻干燥得鱼鳞胶原蛋白干品；弱酸体系下限制酶解，在既保证胶原蛋白不变性的同时又具有较高的胶原蛋白提取率，提取率可以达到45％以上；

水解：称取40份冻干的鱼鳞胶原蛋白与0.9份枯草杆菌蛋白酶，加入到150份蒸馏水中完全溶解，加入0.06份过氧叔丁醇、0.03份甜菊糖，调节pH为8.0，置于55℃恒温水浴锅内，于超声频率为60kHz，超声声强为0.5W/cm²下双频率超声辅助酶解，水解2小时后用沸水浴灭酶20分钟，冷却得酶解液；胶原蛋白独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收较困难，不易被人体充分利用，鱼鳞胶原蛋白分子经水解后主要形成相对分子量较小的多肽、小肽、氨基酸，水解后其吸收利用率可以提高很多，且可以促进食品中的其它蛋白质的吸收；

微量的过氧叔丁醇和甜菊糖产生协同作用，一方面能够增加枯草杆菌蛋白酶与鱼鳞胶原蛋白结合的活性位点，提高酶与底物的亲和力，增大水解程度，同时加快枯草杆菌蛋白酶的酶解速率，从而缩减水解反应时间，降低时间成本与人工成本，并且在随后的水解液煮沸时蒸腾除去，不会残留在胶原蛋白肽产品中；另一方面，能够促进枯草杆菌蛋白酶将鱼鳞胶原蛋白的肽链从内部断开，使蛋白内部的氨基酸暴露出来，并进一步将多肽末端的疏水性氨基酸切断、释放出来，在增加小分子氨基酸游离程度的同时，还能有效减少肽的苦味，改善口感；

除金属：在酶解液中加入10％的淀粉黄原酸酯和2％的桑叶多糖，充分混合，反应24h后，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液，过滤压力控制在0.6MP；

淀粉黄原酸酯和桑叶多糖的特殊存在，能够打破酶解溶液中重金属络合物的配位结构，破坏络离子与重金属离子的络合平衡状态，使其分子中的极性基与酶解溶液中的重金属离子发生键合离子转移，即淀粉黄原酸酯和桑叶多糖将分子中的极性基位置让给酶解溶液中的重金属离子形成稳定的重金属盐沉淀，这些重金属盐沉淀的溶度积远小于重金属离子形成的其它沉淀的溶度积，从而重金属离子以沉淀的形式从酶解溶液中分离出来，最终可降低重金属对鱼胶原低聚肽产品的污染毒害；同时，淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有较高的稳定性，制备简单，成本低廉，具有较高的重金属离子去除率；

提纯：将鱼鳞胶原蛋白多肽清液依次通过大孔吸附树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂进行吸附，去除清液中的颜色、异味和盐类，吸附后用室温下去离子水，流速为3BV/h进行洗脱；然后收集提纯液减压浓缩，冷冻干燥即得鱼鳞胶原蛋白多肽；提纯后，胶原蛋白多肽产品中的氨基酸、小肽占比提高，其分子量介于200D-2000D之间，易于被机体吸收利用。

对比例1：

水解过程中不加入过氧叔丁醇和甜菊糖，其余部分和实施例2完全一致。

对比例2：

除金属过程酶解液中未添加淀粉黄原酸酯和桑叶多糖，其余部分和实施例2完全一致。

实施例4：

将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2分别设为对照组1、对照组2。

采用GB/T22729-2008中所规定的标准及检测方法对试验组及对照组1和2中鱼鳞胶原蛋白多肽的分子量、重金属盐含量进行检测及评价，结果见表1。

表1测定结果

由表1可知，试验组制备得到的鱼鳞胶原蛋白多肽，其分子量介于200D-2000D之间的比例高于对照组1，表明过氧叔丁醇和甜菊糖的加入提高了鱼鳞胶原蛋白的水解程度；而试验组制备得到的鱼鳞胶原蛋白多肽，重金属含量明显低于对照组2，说明淀粉黄原酸酯和桑叶多糖具有增益效果，能够提高酶解液中重金属离子的去除率。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，包括：预处理、提取、水解、除金属、提纯，其特征在于：所述除金属步骤为：在酶解液中加入淀粉黄原酸酯和桑叶多糖，充分混合，反应，经硅藻土过滤，得鱼鳞胶原蛋白多肽清液。

2.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述酶解液中加入2-10%的淀粉黄原酸酯和1-2%的桑叶多糖；反应时间为20-24h，过滤压力为0.2-0.6MP。

3.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述预处理步骤为：取鱼鳞，清水洗净，低温烘干，粉碎，用1-2％柠檬酸溶液浸泡24-36小时，间歇搅拌，12-18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤；然后用0.03-0.05％氢氧化钠溶液浸泡24-36小时，间歇搅拌，12-18小时换一次溶液，浸泡完成后用去离子水冲洗至中性，过滤。

4.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述提取步骤为：将预处理后的鱼鳞置于0.05-0.08mol/L柠檬酸溶液体系中，加入底物重量0.3-0.5％的木瓜蛋白酶限制性酶解，控制温度在5-10℃，双频率超声辅助酶解，持续低速搅拌下酶解24-48小时，沸水浴灭酶，将酶解液高速离心，取上清液，沉淀重复酶解操作2-3次，收集上清液，冷冻干燥得鱼鳞胶原蛋白干品。

5.根据权利要求4所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述双频率超声辅助酶解超声频率为30-45kHz，超声声强为0.4-0.5W/cm²。

6.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述水解步骤为：将25-40份冻干的鱼鳞胶原蛋白与0.7-0.9份枯草杆菌蛋白酶，加入到100-150份蒸馏水中完全溶解，加入过氧叔丁醇、甜菊糖，调节pH为7.5-8.0，置于45-55℃恒温水浴锅内，双频率超声辅助酶解，水解1.5-2小时后用沸水浴灭酶15-20分钟，冷却得酶解液。

7.根据权利要求6所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述过氧叔丁醇的加入量为0.02-0.06份，甜菊糖的加入量为0.02-0.03份。

8.根据权利要求6所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述双频率超声辅助酶解超声频率为50-60kHz，超声声强为0.4-0.5W/cm²。

9.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述提纯步骤为：将鱼鳞胶原蛋白多肽清液依次通过大孔吸附树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂进行吸附，吸附后用洗脱液进行洗脱；然后收集提纯液减压浓缩，冷冻干燥即得鱼鳞胶原蛋白多肽。

10.根据权利要求9所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述洗脱液为室温下去离子水，流速为2-3BV/h。