CN107279451A

CN107279451A - 带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法

Info

Publication number: CN107279451A
Application number: CN201710330815.XA
Authority: CN
Inventors: 王斌; 赵文浩; 赵玉勤; 丁冬各
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2017-10-24

Abstract

本发明提供一种带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，操作步骤为：1）预处理；2）去腥；3）脱脂；4）酶解。有益效果为：带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，本发明的去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；采用乙酸乙酯脱脂，脱脂率高；采用双酶酶解带鱼蛋白得到的多肽，对DPPH自由基和羟自由基清除能力强，抗氧化能力强；得到的多肽的分子量小，易被人体吸收，适合应用到食品、医药、化妆品领域；本发明方法操作简单，成本低廉，增加了带鱼的附加值，适合大规模生产。

Description

带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法

技术领域

本发明涉及活性肽制备技术领域，具体是一种带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法。

背景技术

带鱼（Largehead Hairtail），别称刀鱼、牙带鱼，属于脊索动物门、鲈形目，体型呈带状。主要分布于西太平洋和印度洋，在中国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。

2014年度，舟山市带鱼捕获量达到108104吨，占主要渔获品种的比例达到11.52%。舟山带鱼多以新鲜或加工成各种鱼制品出售，然而带鱼的开发利用依然处于粗加工阶段，高附加值的利用程度较低。

带鱼的平均蛋白含量达到18.4%以上，这使得它成为丰富的蛋白质原材料来源。蛋白质经过酶解等特殊处理，可以制备具备一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我国对带鱼蛋白的研究虽然取得了一些进展，但是还未能开发出高活性的蛋白，还未能更佳充分地开发利用带鱼资源。因此，对带鱼蛋白的深入研究，开发出具备高附加值的带鱼蛋白产品成为迫在眉睫的问题。

生物活性肽，是指蛋白质中的20种左右天然氨基酸以不同的排列和组合的方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的各种肽类的总称。活性肽和人体代谢和生理调节等具有密切的关系，展现出提高免疫力、抑菌、抗病毒、清除自由基、降血压以及血脂等功效，食用安全性极高。因此，活性肽成为目前食品、药品等领域研究的热点之一并取得了较好的发展态势。

目前，制备抗氧化肽的主要方法有天然提取法、化学合成法、生物发酵法、酶解法等方法。提取法是指从微生物、动植物中用特殊方法提取的某些天然存在的抗氧化肽。但是天然存在的抗氧化肽含量极小，提取的成本高、难度大无法满足大量生产的需要。化学合成法要使用大量的溶剂、试剂，不仅增加了成本，而且有毒的试剂会污染样品，带来毒副作用，无法实现清洁环保的需求。发酵法具有自己独特的优势，不仅能将微生物产酶和酶水解两步合一，省去酶的分离和提纯步骤，而且还能减少生产环节，降低成本，因此越来越获得青睐。同其他制备方法比较，在酶解过程温和，无需添加剧烈的化学试剂，没有有毒有害物质的生成，多肽回收率较高。这些优点，使得他们在蛋白质深加工和活性成分提取领域被深入研究和广泛应用。

现有技术如授权公告号为CN102533913B的中国发明专利，公开了一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：1）交联法共固定化双酶；2）鱼鳞预处理；3）共固定化酶定向水解鱼鳞蛋白；4）脱色脱腥；5）鱼鳞多肽超滤分离；6）真空浓缩；7）冷冻干燥。该方法所制备的抗氧化活性肽可作为天然抗氧化剂用于食品抗氧化保鲜中，且无毒副作用，安全性高；所用方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解产物易于纯化；为淡水鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径；产品可用于药品、食品和化妆品。共固定化酶制备繁琐，且共固定化酶与底物的接触面积变小，催化速率变慢。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能得到对DPPH 自由基和羟自由基清除能力强，油脂率很低，无腥味的带鱼抗氧化活性肽酶解液，操作简单、耗时短的制备方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，具体步骤：

预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块；

去腥：在步骤1处理好的带鱼中按料液比1:4~8加入去腥液，浸泡，浸泡时间为4~8h。去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过30~60目筛，按体积比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为20~25h。过滤，滤渣中按体积比1:2~4加入去离子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，过滤，42~48℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述方法脱脂，脱脂率高达92%以上；

酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH为6.8~7.5，加入1.2~1.6%木瓜蛋白酶，加热，酶解温度为46~53℃，酶解时间为4.6~5.3h。调节pH为8.2~8.9，加入2.8~3.3%碱性蛋白酶，加热，酶解温度为42~46℃，酶解时间为4.0~4.6h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，得到带鱼抗氧化活性肽酶解液。带鱼抗氧化活性肽序列为SCASRCKSRCRARRCKGYCSKFCGTASCTCICKCFRC。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和长度有关，这意味着不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。单一的蛋白酶对蛋白质的酶切位点少，得到的多肽量少，多种蛋白酶同时酶解蛋白质得到的多肽量大，但容易破坏多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用双酶酶解带鱼蛋白得到的多肽，对DPPH 自由基和羟自由基清除能力强，抗氧化能力强；得到的多肽的分子量小，易被人体吸收，适合应用到食品、医药、化妆品领域。

与现有技术相比，本发明的优点在于：带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，本发明的去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；采用乙酸乙酯脱脂，脱脂率高；采用双酶酶解带鱼蛋白得到的多肽，对DPPH 自由基和羟自由基清除能力强，抗氧化能力强；得到的多肽的分子量小，易被人体吸收，适合应用到食品、医药、化妆品领域；本发明方法操作简单，成本低廉，增加了带鱼的附加值，适合大规模生产。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，具体步骤：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块；

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中按料液比1:4~8加入去腥液，浸泡，浸泡时间为4~8h。去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过30~60目筛，按体积比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为20~25h。过滤，滤渣中按体积比1:2~4加入去离子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，过滤，42~48℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述方法脱脂，脱脂率高达92%以上；

4）酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH为6.8~7.5，加入1.2~1.6%木瓜蛋白酶，加热，酶解温度为46~53℃，酶解时间为4.6~5.3h。调节pH为8.2~8.9，加入2.8~3.3%碱性蛋白酶，加热，酶解温度为42~46℃，酶解时间为4.0~4.6h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，得到带鱼抗氧化活性肽酶解液。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和长度有关，这意味着不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。单一的蛋白酶对蛋白质的酶切位点少，得到的多肽量少，多种蛋白酶同时酶解蛋白质得到的多肽量大，但容易破坏多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用双酶酶解带鱼蛋白得到的多肽，对DPPH 自由基和羟自由基清除能力强，抗氧化能力强；得到的多肽的分子量小，易被人体吸收，适合应用到食品、医药、化妆品领域。

实施例2：

带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，最优选步骤：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成4cm长小块；

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中按料液比1:6加入去腥液，浸泡，浸泡时间为7h。去腥液成份及其最优选重量份为：8份柠檬酸、17份紫苏提取物、0.1份氯化钠、0.5份碳酸氢钠、0.001份乌索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份维生素E。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过40目筛，按体积比1:5加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为22h。过滤，滤渣中按体积比1:3加入去离子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，过滤，将滤渣放入电热鼓风干燥箱45℃烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述方法脱脂，脱脂率高达92%以上；

4）酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入1.5%木瓜蛋白酶，加热，酶解温度为50℃，酶解时间为5.0h。调节pH为8.5，加入3%碱性蛋白酶，加热，酶解温度为45℃，酶解时间为4.5h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，得到带鱼抗氧化活性肽酶解液。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和长度有关，这意味着不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。单一的蛋白酶对蛋白质的酶切位点少，得到的多肽量少，多种蛋白酶同时酶解蛋白质得到的多肽量大，但容易破坏多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用双酶酶解带鱼蛋白得到的多肽，对DPPH 自由基和羟自由基清除能力强，抗氧化能力强；得到的多肽的分子量小，易被人体吸收，适合应用到食品、医药、化妆品领域。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ser Cys Ala Ser Arg Cys Lys Ser Arg Cys Arg Ala Arg Arg Cys Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Cys Ser Lys Phe Cys Gly Thr Ala Ser Cys Thr Cys Ile Cys

20 25 30

Lys Cys Phe Arg Cys

35

Claims

1.带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于以下步骤：

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中加入去腥液，浸泡；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过筛，加入乙酸乙酯，搅拌，过滤，滤渣中加入去离子水，去除油脂，过滤，烘干，得到去脂带鱼粉末；

4）酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH，加入木瓜蛋白酶，加热，调节pH，加入碱性蛋白酶，加热，酶解结束后灭酶，过滤，得到带鱼抗氧化活性肽酶解液。

2.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中带鱼：去腥液体积比为1:4~8，浸泡时间为4~8h。

3.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中带鱼粉末：乙酸乙酯体积比为1:4.5~5.2，脱脂时间为20~25h。

4.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中在42~48℃环境下烘干。

5.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。

6.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中滤渣：去离子水体积比为1:2~4。

7.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中木瓜蛋白酶的加酶量为1.2~1.6%，pH为6.8~7.5，酶解温度为46~53℃，酶解时间为4.6~5.3h。

8.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中碱性蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为8.2~8.9，酶解温度为42~46℃，酶解时间为4.0~4.6h。

9.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中使用冰醋酸或氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液调节pH。

10.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化活性肽酶解液的制备方法，其特征在于：所述的带鱼抗氧化活性肽序列为SCASRCKSRCRARRCKGYCSKFCGTASCTCICKCFRC。