CN107177651A - 双酶水解法制备高f值寡肽粗液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双酶水解法制备高F值寡肽粗液，操作步骤为：1）预处理；2）去腥；3）去脂；4）酶解。有益效果为：胃蛋白酶酶激活剂和风味蛋白酶酶激活剂分别能激活胃蛋白酶和风味蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，缩短寡肽粗液制备时间；胃蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶，它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸，芳香族氨基酸残基暴露率高，利于第二步外切酶特异性切除；风味蛋白酶天然安全，作为外切酶恰好可以将第一步酶解得到的苦肽降解为氨基酸。并且通过末端水解多肽，提高水解度。

Description

双酶水解法制备高F值寡肽粗液

技术领域

本发明涉及活性肽制备技术领域，具体是一种双酶水解法制备高F值寡肽粗液。

背景技术

带鱼（Largehead Hairtail），别称刀鱼、牙带鱼，属于脊索动物门、鲈形目，体型呈带状。主要分布于西太平洋和印度洋，在中国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。

2014年度，舟山市带鱼捕获量达到108104吨，占主要渔获品种的比例达到11.52%。舟山带鱼多以新鲜或加工成各种鱼制品出售，然而带鱼的开发利用依然处于粗加工阶段，高附加值的利用程度较低。

带鱼的平均蛋白含量达到18.4%以上，这使得它成为丰富的蛋白质原材料来源。蛋白质经过酶解等特殊处理，可以制备具备一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我国对带鱼蛋白的研究虽然取得了一些进展，但是还未能开发出高活性的蛋白，还未能更佳充分地开发利用带鱼资源。因此，对带鱼蛋白的深入研究，开发出具备高附加值的带鱼蛋白产品成为迫在眉睫的问题。

高F值寡肽是一类由2-9个氨基酸以独特的方式组合成的小肽混合物，其主要特征是氨基酸混合物中支链氨基酸与芳香族氨基酸比值远高于人体模式。支链氨基酸中的缬氨酸（Val）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）具有维护神经系统正常、增加食欲、治疗贫血、促进伤口痊愈等特殊的生理功能。在临床上，高F值寡肽常用来用来治疗肝性脑病，苯丙酮尿症，改善病人术后的营养状况等。近年来，国内高F 值寡肽开发方面成为功能食品的研究热点。如以大豆、玉米、花生等植物为原料，以金枪鱼、鱿鱼、牡蛎等水产品为原料制备的高F值寡肽。目前对于带鱼高F值寡肽的开发研究仅处在实验室水平的探索，市面上的制成品寥寥无几。

目前，较为流行和科学的制备高F值寡肽方法是采用双酶分布酶解法。其主要工艺是首先通过酶解使蛋白肽链的芳香族氨基酸残基位点暴露出来，然后用某些特定蛋白酶酶解切掉芳香族氨基酸，使之以游离态存在于溶液中，再用其他方法最大化去除芳香族氨基酸。制备高F寡肽的关键是尽可能的保留支链氨基酸（Val、Ile、Leu简称BCAA），去除芳香族氨基酸（Tyr、Phe，简称AAA），达到BCAA/AAA的摩尔浓度比大于20。

现有技术如授权公告号为CN104004087B的中国发明专利，公开了一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括： （1）水蛭干体初步清洗除杂，高速粉碎；（2）原料碱预浸泡；（3）碱性蛋白酶Alcalase AF 2.4L结合木瓜蛋白酶双酶水解；（4）采用活性炭粉静态吸附脱除芳香族氨基酸；（5）以凝胶过滤层析柱进一步分离纯化，收集分离产物，冷冻干燥 ，获得分子量低于2000Da，F值（Fischer ratio，即支链氨基酸与芳香族氨基酸摩尔含量的比值）高于20的水蛭寡肽粉。该方法制备过程简单，选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶两种商业用酶，易于工业生产，产率较高，具有一定的抗凝血效果，并为高F值类产品增加了新来源。该方法酶水解后蛋白转化率不是很理想，F值有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用双酶水解法制备芳香族氨基酸残基暴露率高，酶特异性切除芳香族氨基酸率高，F值高的粗肽液。

针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

双酶水解法制备高F值寡肽粗液，具体步骤为：

预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块；

去腥：在步骤1处理好的带鱼中按体积比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。浸泡，浸泡时间为4~8h。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过筛，按体积比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为20~25h。过滤，滤渣中按体积比1:2~4加入去离子水，去除油脂，过滤，在42~48℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述方法脱脂，脱脂率高达92%以上；

酶解：在带鱼粉末中按体积比1:4.6~5.3加入蒸馏水，调节pH，加入胃蛋白酶和酶激活剂，胃蛋白酶酶激活剂成份及其重量份为：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份维生素B1。上述酶激活剂能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，缩短寡肽粗液制备时间。胃蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为1.5~2.3，酶解温度为35-37℃，酶解时间为1.8~2.6h。胃蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶，它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸，芳香族氨基酸残基暴露率高，利于第二步外切酶特异性切除。酶解结束后沸水浴灭酶5~10min，调节pH，加入风味蛋白酶和酶激活剂，风味酶酶激活剂成份及其重量份为：0.03~0.05份醋酸镁和0.001~0.003份碳酸二甲酯。上述酶激活剂能激活风味蛋白酶活性。风味蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为6.4~7.2，酶解温度为48~52℃，酶解时间为1.2~1.9h。风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的水解，后期风味优化。由于第一步内切酶解后，生成了一些短链肽，而其中的一些含有疏水氨基酸，具有苦感。而利用风味酶作为外切酶恰好可以将苦肽降解为氨基酸。并且通过末端水解多肽，提高水解度。风味酶作为内切酶将芳香族氨基酸从多肽链上切除，提高了寡肽的F值。因此，利用风味酶不仅可以去除苦味，改善口感，制取风味良好的动植物水解产品，提高产品质量，而且还能降低生产成本，这符合工业化生产的必要条件。风味蛋白酶酶解结束后沸水浴灭酶5~10min，过滤得到高F值寡肽粗液。高F值寡肽粗液中含有氨基酸序列为HSHACTSY的高F值寡肽。

与现有技术相比，本发明的优点在于：带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，本发明的去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；采用乙酸乙酯脱脂，脱脂率高；胃蛋白酶酶激活剂和风味蛋白酶酶激活剂分别能激活胃蛋白酶和风味蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，缩短寡肽粗液制备时间；胃蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶，它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸，芳香族氨基酸残基暴露率高，利于第二步外切酶特异性切除；风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的水解，后期风味优化。由于第一步内切酶解后，生成了一些短链肽，而其中的一些含有疏水氨基酸，具有苦感。而利用风味酶作为外切酶恰好可以将苦肽降解为氨基酸。并且通过末端水解多肽，提高水解度。风味酶作为内切酶将芳香族氨基酸从多肽链上切除，提高了寡肽的F值。因此，利用风味酶不仅可以去除苦味，改善口感，制取风味良好的动植物水解产品，提高产品质量，而且还能降低生产成本，这符合工业化生产的必要条件。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

双酶水解法制备高F值寡肽粗液，具体步骤为：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块；

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中按体积比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。浸泡，浸泡时间为4~8h。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过筛，按体积比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为20~25h。过滤，滤渣中按体积比1:2~4加入去离子水，去除油脂，过滤，在42~48℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述方法脱脂，脱脂率高达92%以上；

4）酶解：在带鱼粉末中按体积比1:4.6~5.3加入蒸馏水，调节pH，加入胃蛋白酶和酶激活剂，胃蛋白酶酶激活剂成份及其重量份为：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份维生素B1。上述酶激活剂能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，缩短寡肽粗液制备时间。胃蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为1.5~2.3，酶解温度为35-37℃，酶解时间为1.8~2.6h。胃蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶，它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸，芳香族氨基酸残基暴露率高，利于第二步外切酶特异性切除。酶解结束后沸水浴灭酶5~10min，调节pH，加入风味蛋白酶和酶激活剂，风味酶酶激活剂成份及其重量份为：0.03~0.05份醋酸镁和0.001~0.003份碳酸二甲酯。上述酶激活剂能激活风味蛋白酶活性。风味蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为6.4~7.2，酶解温度为48~52℃，酶解时间为1.2~1.9h。风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的水解，后期风味优化。由于第一步内切酶解后，生成了一些短链肽，而其中的一些含有疏水氨基酸，具有苦感。而利用风味酶作为外切酶恰好可以将苦肽降解为氨基酸。并且通过末端水解多肽，提高水解度。风味酶作为内切酶将芳香族氨基酸从多肽链上切除，提高了寡肽的F值。因此，利用风味酶不仅可以去除苦味，改善口感，制取风味良好的动植物水解产品，提高产品质量，而且还能降低生产成本，这符合工业化生产的必要条件。风味蛋白酶酶解结束后沸水浴灭酶5~10min，过滤得到高F值寡肽粗液。

实施例2：

双酶水解法制备高F值寡肽粗液，最优选步骤为：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成4cm长小块；

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中按体积比1:6加入去腥液，去腥液成份及其最优选重量份为：8份柠檬酸、17份紫苏提取物、0.1份氯化钠、0.5份碳酸氢钠、0.001份乌索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份维生素E。浸泡，浸泡时间为7h。带鱼身上的腥味物质特征成分是三甲胺，上述去腥液既能与三甲胺反应形成季铵盐，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明显；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过40目筛，按体积比1:5加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为24h。过滤，滤渣中按体积比1:3加入去离子水，去除油脂，过滤，在45℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解液的色泽、气味的变化；其次，脂肪与蛋白乳化造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件；

4）酶解：在带鱼粉末中按体积比1:5加入蒸馏水，调节pH，加入胃蛋白酶和酶激活剂，胃蛋白酶酶激活剂成份及其重量份为：0.003份乙酸丙酯和0.04份维生素B1。上述酶激活剂能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，缩短寡肽粗液制备时间。胃蛋白酶的加酶量为3%，pH为2.0，酶解温度为36℃，酶解时间为2.2h。胃蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶，它倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸，芳香族氨基酸残基暴露率高，利于第二步外切酶特异性切除。酶解结束后沸水浴灭酶8min，调节pH，加入风味蛋白酶和酶激活剂，风味酶酶激活剂成份及其最优选重量份为：0.05份醋酸镁和0.001份碳酸二甲酯。上述酶激活剂能激活风味蛋白酶活性。风味蛋白酶的加酶量为3%，pH为7.0，酶解温度为50℃，酶解时间为1.7h。风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的水解，后期风味优化。由于第一步内切酶解后，生成了一些短链肽，而其中的一些含有疏水氨基酸，具有苦感。而利用风味酶作为外切酶恰好可以将苦肽降解为氨基酸。并且通过末端水解多肽，提高水解度。风味酶作为内切酶将芳香族氨基酸从多肽链上切除，提高了寡肽的F值。因此，利用风味酶不仅可以去除苦味，改善口感，制取风味良好的动植物水解产品，提高产品质量，而且还能降低生产成本，这符合工业化生产的必要条件。风味蛋白酶酶解结束后沸水浴灭酶8min，过滤得到高F值寡肽粗液。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 双酶水解法制备高F值寡肽粗液

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

His Ser His Ala Cys Thr Ser Tyr

1 5

Claims (10)

1.双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于以下步骤：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块；

2）去腥：在步骤1处理好的带鱼中加入去腥液，浸泡；

3）脱脂：将去腥后的带鱼捣碎，过筛，加入乙酸乙酯，搅拌，过滤，滤渣中加入去离子水，去除油脂，过滤，烘干，得到去脂带鱼粉末；

4）酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH，加入胃蛋白酶和酶激活剂，加热，酶解结束后灭酶，调节pH，加入风味蛋白酶和酶激活剂，加热，酶解结束后灭酶，过滤，得到高F值寡肽粗液。

2.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤2中带鱼：去腥液体积比为1:4~8，浸泡时间为4~8h。

3.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤3中带鱼粉末：乙酸乙酯体积比为1:4.5~5.2，脱脂时间为20~25h。

4.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤3中在42~48℃环境下烘干。

5.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤3中滤渣：去离子水体积比为1:2~4。

6.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤4胃蛋白酶酶激活剂成份及其重量份为：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份维生素B1。

7.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤4中带鱼粉末：蒸馏水体积比为1:4.6~5.3，胃蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为1.5~2.3，酶解温度为35-37℃，酶解时间为1.8~2.6h。

8.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤4中风味酶酶激活剂成份及其重量份为：0.03~0.05份醋酸镁和0.001~0.003份碳酸二甲酯。

9.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的步骤4中风味蛋白酶的加酶量为2.8~3.3%，pH为6.4~7.2，酶解温度为48~52℃，酶解时间为1.2~1.9h。

10.根据权利要求1所述的双酶水解法制备高F值寡肽粗液，其特征在于：所述的高F值寡肽粗液中含有氨基酸序列为HSHACTSY的高F值寡肽。