CN102747125A - 带鱼抗氧化肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种带鱼抗氧化肽的制备方法，包括：加水将带鱼绞成鱼肉浆；将鱼肉浆入酶解罐，添加带鱼质量0.2～0.9%内切蛋白酶、水解；将水解液离心取上清液；将上清液微滤后入酶解罐，添加带鱼质量0.1～0.9%外切蛋白酶、水解；水解过程将酶解液从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.1～0.5L/min的流量循环；收集超滤膜透过液，减压浓缩至原体积1/10～1/5，-18~-20℃过夜，-60~-65℃、0.005~0.0054mbar冷冻干燥，得目标产品。本发明的带鱼抗氧化肽抗氧化活性较强，羟基自由基清除率达82.0％，超氧阴离子自由基清除率达85.2％，DPPH自由基清除率达61.5％。

Description

带鱼抗氧化肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种以带鱼为原料，通过复合酶水解带鱼蛋白质，酶解－膜分离耦合制备抗氧化肽的方法。

技术背景

带鱼又名刀鱼、牙带鱼，是鱼纲鲈形目带鱼科动物，是我国沿海产量较高的一种经济鱼类，味道鲜美，深受国内外消费者的青睐。带鱼具有较高的营养价值，对病后体虚、产后乳汁不足和外伤出血等症具有一定食疗作用。中医认为它具有和中开胃、暖胃补虚、润泽肌肤及美容等功效。带鱼体内蛋白质含量高，并且带鱼蛋白质是一种全价蛋白质，含有人体必需的八种氨基酸；还含有钙、磷、铁等微量元素，营养丰富。然而，随着捕捞强度的增大，海洋捕捞的小带鱼产量呈逐年上升趋势；小带鱼由于体型小，直接食用的价值较低；现在主要用来生产鱼粉等低值产品，更有作为废弃物直接丢弃，导致资源未得到充分利用，经济效益低下，甚至污染环境。

自从Harman提出自由基理论以来，人们逐渐认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关。抗氧化剂通过清除自由基，调整和改善人体生理功能，从而达到预防和治疗慢性疾病的目的。由于化学合成抗氧化剂的不安全性，高效、无毒的天然抗氧化剂成为开发研究的重点。进一步研究发现，抗氧化肽具有活性强、安全性高的优点，成为研究的热点。天然蛋白质特别是海洋蛋白质，基于生长环境的特异性，其多肽链中存在功能、结构新颖的活性片段；采用酶工程的技术手段水解蛋白质，释放有生物活性的抗氧化肽，已成为制备抗氧化肽的一种重要方法。抗氧化肽的活性与其结构密切相关，而结构取决于氨基酸序列和分子量大小。一般来说，分子量低于3000Da的肽类具有更高的抗氧化活性。低分子量抗氧化肽以其抗氧化能力强、较氨基酸更易为人体所吸收等优点，已广泛应用于医药及保健食品等行业。

酶解－膜分离耦合技术可在酶解的同时利用膜对酶解产物进行分离，目标肽被分离出来，酶、大分子多肽和蛋白则返回到反应体系中继续酶解。这种技术具有显著的优点：通过产物的在线分离，减少产物抑制效应和过度降解，提高产物活性；通过酶的循环使用，提高酶的利用率。

目前，国内已有人采用酶法水解制备抗氧化肽报道，但现有技术多使用一种酶水解。其美中不足是，由于仅采用一种酶水解蛋白质，并且在制备抗氧化肽的过程中，采用的超滤膜的截留分子量为5000Da～10000Da；导致得到的抗氧化肽的抗氧化能力较低，超氧阴离子自由基清除率仅为24.8～28.2％；DPPH自由基清除率也只有40.2～47.1％。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能充分利用原材料、获得具有较高抗氧化能力的带鱼抗氧化肽的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种带鱼抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重，加入1～3倍带鱼质量的水，绞碎成均匀的鱼肉浆；

（2）将步骤（1）制备的鱼肉浆放入酶解罐中，添加带鱼质量0.2%～0.9%的内切蛋白酶，调温至45～70℃，调pH至5.5～8.5，搅拌水解8～14h，得水解液；

（3）将步骤（2）所得水解液离心：4100~4500rpm、2~6℃、12～14分钟，取上清液；

（4）将步骤（3）的上清液经过0.45um（微米）的微孔滤膜进行微滤后放入酶解罐，然后添加带鱼质量0.1%～0.9%的外切蛋白酶，调温至40～55℃，调pH至5.0～8.0，搅拌水解7～10h；

在上述水解过程中将酶解液从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.1～0.5L/min的流量循环；调节超滤膜的压力为0.07～0.09Mpa，超滤膜的截留分子量为3000Da，进行酶解－膜分离耦合反应；小于膜截留分子量的分子透过膜，未透过部分则返回酶解罐继续酶解，反应过程中每隔10~15分钟向酶解罐中补加水，以保持反应体系体积恒定，收集超滤膜透过液；

（5）反应结束后，将收集的超滤膜透过液，减压浓缩至原体积的1/10～1/5，-18~-20℃预冻过夜，-60~-65℃、0.005~0.0054mbar（毫巴）冷冻干燥22~24h，即得到带鱼抗氧化肽。

步骤（2）所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶或Alcalase碱性蛋白酶；酶解过程中保持温度和pH的恒定。

步骤（4）所述外切蛋白酶为Flavourzyme风味蛋白酶、氨肽酶或羧肽酶；酶解过程中保持温度和pH的恒定。

本发明上述带鱼质量指的是步骤（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重后的带鱼质量。

本发明具有以下显著优点和有益效果：

（1）本发明先使用内切蛋白酶将蛋白质水解为分子量较大、肽链较长的多肽，并通过离心（离心过程采用在4℃条件下操作，仍能保持酶的活性，在后面的循环步骤中使得内、外切酶始终处于活性状态，从而更有效的进行蛋白质水解）、微滤等手段将可溶性多肽与不溶性组分分离；再使用外切蛋白酶进一步水解。由于内切蛋白酶和外切蛋白酶的作用位点不同，使得蛋白质水解更有效，更加有利于低分子量的抗氧化肽的释放，避免现有技术的单一一种酶带来的缺陷；

（2）本发明超滤膜分离器采用的膜截留分子量为3000Da，进一步保证了低分子量的抗氧化肽的制备、制得的抗氧化肽具有较高抗氧化活性。

（3）与传统先酶解、再分离制备抗氧化肽的工艺相比，本发明采用酶解－膜分离耦合反应制备带鱼抗氧化肽，使得反应和分离同时进行，能及时将抗氧化肽从体系中分离出来，避免活性抗氧化肽受到酶的进一步分解而失去功能；同时也把大分子留在反应体系中继续酶解，提高了酶的使用效率和抗氧化肽产物的得率。

（4）本发明的带鱼抗氧化肽的制备方法，具有工艺简便，如带鱼原料仅仅通过简单的处理即可使用、生产成本低、生产周期短的优点。带鱼抗氧化肽可广泛用于医药、保健食品及化妆品等领域，为低值小带鱼的深加工生产高附加值产品提供了一条有效途径。

具体实施方式

下面给出3个优选实施例，但本发明不仅局限于以下实施例。

实施例1：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取1.0kg带鱼，加入3.0kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至60℃，调pH至7.5，以带鱼质量计，添加带鱼质量0.9%的Alcalase碱性蛋白酶，搅拌水解12h；将水解液离心：4500rpm，4℃、12分钟，取上清液。将上清液经过0.45um（微米）的微孔滤膜进行微滤后放入酶解罐，以带鱼质量计，添加0.9％的Flavourzyme风味蛋白酶，调温至50℃，调pH至6.5，搅拌水解10h；在上述水解过程中将酶解液（也可称水解液）从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.1L/min的流量循环，调节超滤膜的压力为0.09Mpa，超滤膜的截留分子量为3000Da

小于超滤膜截留分子量的分子透过膜即得到透过液，未透过部分则返回酶解罐继续酶解，反应过程中每隔10分钟向酶解罐中补加水，以保持反应体系体积恒定，收集超滤膜透过液；反应结束后，将收集的超滤膜透过液减压浓缩至原体积的1/10，-20℃预冻过夜，-65℃、0.0054mbar冷冻干燥24h，得到带鱼抗氧化肽。采用重量法测定带鱼抗氧化肽的收率为18.5%（收率定义为100g湿重带鱼获得的抗氧化肽的质量g）。采用SphadexG-75凝胶过滤层析，测定带鱼抗氧化肽的相对分子质量，带鱼抗氧化肽的平均分子量为898Da。采用邻二氮菲法测定带鱼抗氧化肽的羟基自由基清除率；邻苯三酚自氧化法测定带鱼抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除率；DPPH法测定带鱼抗氧化肽的DPPH自由基清除率。结果表明：羟基自由基清除率为82.0％，超氧阴离子自由基清除率为85.2％，DPPH自由基清除率为61.5％。

实施例2：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取2.0kg带鱼，加入5.0kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至50℃，调pH至7.0，以带鱼质量计，添加0.8%的Neutrase中性蛋白酶，搅拌水解10h；将水解液离心，4500rpm，4℃、14分钟，取上清液。将上清液经过0.45um的微孔滤膜进行微滤后放入酶解罐，以带鱼质量计，添加0.5%的羧肽酶，调温至40℃，调pH至5.5，搅拌水解9h；在上述水解过程中将酶解液从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.25L/min的流量循环，调节超滤膜的压力为0.09Mpa，超滤膜的截留分子量为3000Da；反应结束后，将收集的超滤膜透过液，减压浓缩至原体积的1/8，-20℃预冻过夜，-65℃，0.0054mbar，冷冻干燥24h，得到带鱼抗氧化肽。采用重量法测定带鱼抗氧化肽的收率为17.8%（收率定义为100g湿重带鱼获得的抗氧化肽的质量g）。采用SphadexG-75凝胶过滤层析，测定带鱼抗氧化肽的相对分子质量，带鱼抗氧化肽的平均分子量为1202Da。采用邻二氮菲法测定带鱼抗氧化肽的羟基自由基清除率；邻苯三酚自氧化法测定带鱼抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除率；DPPH法测定带鱼抗氧化肽的DPPH自由基清除率。结果表明：羟基自由基清除率为78.0％，超氧阴离子自由基清除率为82.6％，DPPH自由基清除率为57.8％。

实施例3：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取2.5kg带鱼，加入5.0kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至50℃，调pH至6.5，以带鱼质量计，添加0.5%的木瓜蛋白酶，搅拌水解14h；将水解液离心，4500rpm，4℃、13分钟，取上清液。将上清液经过0.45um的微孔滤膜进行微滤后放入酶解罐，以带鱼质量计，添加0.8%的氨肽酶，调温至45℃，调pH至7.5，搅拌水解8h；在上述酶解过程中将酶解液从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.4L/min的流量循环，调节超滤膜的压力为0.08Mpa，超滤膜的截留分子量为3000Da；反应结束后，将收集的超滤膜透过液，减压浓缩至原体积的1/5，-20℃预冻过夜，-65℃，0.0054mbar，冷冻干燥24h，得到带鱼抗氧化肽。采用重量法测定带鱼抗氧化肽的收率为16.7%（收率定义为100g湿重带鱼获得的抗氧化肽的质量g）。采用SphadexG-75凝胶过滤层析，测定带鱼抗氧化肽的相对分子质量，带鱼抗氧化肽的平均分子量为1528Da。采用邻二氮菲法测定带鱼抗氧化肽的羟基自由基清除率；邻苯三酚自氧化法测定带鱼抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除率；DPPH法测定带鱼抗氧化肽的DPPH自由基清除率。结果表明：羟基自由基清除率为74.6％，超氧阴离子自由基清除率为78.2％，DPPH自由基清除率为56.5％。

Claims (3)

1.一种带鱼抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重，加入1～3倍带鱼质量的水，绞碎成均匀的鱼肉浆；

（2）将步骤（1）制备的鱼肉浆放入酶解罐中，添加带鱼质量0.2%～0.9%的内切蛋白酶，调温至45～70℃，调pH至5.5～8.5，搅拌水解8～14h，得水解液；

（3）将步骤（2）所得水解液离心：4100~4500rpm、2~6℃、12～14分钟，取上清液；

（4）将步骤（3）的上清液经过0.45微米的微孔滤膜进行微滤后放入酶解罐，然后添加带鱼质量0.1%～0.9%的外切蛋白酶，调温至40～55℃，调pH至5.0～8.0，搅拌水解7～10h；

在上述水解过程中将酶解液从酶解罐中泵入超滤膜分离器，使酶解液以0.1～0.5L/min的流量循环；调节超滤膜的压力为0.07～0.09Mpa，超滤膜的截留分子量为3000Da，进行酶解－膜分离耦合反应；小于膜截留分子量的分子透过膜，未透过部分则返回酶解罐继续酶解，反应过程中每隔10~15分钟向酶解罐中补加水，以保持反应体系体积恒定，收集超滤膜透过液；

（5）反应结束后，将收集的超滤膜透过液，减压浓缩至原体积的1/10～1/5，-18~-20℃预冻过夜，-60~-65℃、0.005~0.0054mbar冷冻干燥22~24h，即得到带鱼抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶或Alcalase碱性蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的外切蛋白酶为Flavourzyme风味蛋白酶、氨肽酶或羧肽酶。