CN101275156A - 胶原蛋白活性肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明通过来源于水产动物的未变性胶原蛋白，尤其是未变性I型胶原蛋白为原料，再经过在中温条件下酶解，透析，干燥等特殊的生化技术制备方法得到胶原蛋白肽。制得的胶原蛋白肽主要成分的分子质量范围为5－13KD，氮溶解指数＞98％，具有显著延长动物寿命以及抑制体内脂褐质生成等特殊的生理功效，可作为功能因子添加剂广泛应用于保健食品和宠物健康饲料添加剂中。
Description
技术领域
本发明属于活性肽开发技术领域，具体涉及以来源于水产动物的未变性胶原蛋白为原料，经过酶解等特殊的生化技术获得的具有延长动物寿命和抑制褐脂质形成等特殊生理功效的胶原蛋白活性肽及其制备方法。
背景技术
活性肽是指能够调节生物体的代谢或具有某些特殊生理活性的肽类，其生理作用有免疫调节、激素调节、营养调节、提高免疫力、清除自由基、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血、降血压等。胶原蛋白是广泛存在于动物细胞间的一种主要结构蛋白，用途涵盖食品、美容、外用和植入用生物医用材料等，已成为一种重要的活性分子。经水解后的胶原蛋白产物中含有多种具有各种生理功效的活性肽，在医疗、保健及美容方面具有良好的应用前景。
在胶原蛋白肽及其生理功能的研究中，最早引人注目的是降血压肽，其次为抗氧化肽。1979年Oshima等利用细菌胶原酶水解明胶，并从其水解物中分离出6种具有能抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的肽类，首次报道了胶原蛋白肽的降血压作用。以后，有关胶原蛋白肽的报道逐渐增多，如Orimura用16种酶对鲱鱼和猪皮的胶原蛋白进行酶解，从水解液中分离出能降血压和清除自由基的胶原蛋白肽，Saiga从鸡肉胶原蛋白酶解物中发现降血压和抗氧化的肽类，Kim等从阿拉斯加狭鳕鱼皮明胶、Mendis等从皮氏叫姑鱼皮明胶水解产物中获得了抗氧化肽。近几年，国内学者对胶原蛋白肽的研究也非常重视，并有多篇专利相继公开。其中，CN1233840C涉及一种胶原多肽的制造方法及产品、CN1404748A涉及蛋白肽保健食品及其制备方法、CN1994133A涉及胶原蛋白肽在食品中的应用方法、CN1552889A涉及制备胶原蛋白和胶原多肽的方法及其用途，但这些专利均以胶原蛋白为原料，不涉及水产品，也未见胶原蛋白肽的理化特征以及生物活性的报道；CN101061827A、CN1582771A、CN1814781A、CN100351272C虽然分别涉及从鱼皮、鱼骨、鱼鳞以及海星壳中制备胶原蛋白肽的生产工艺与方法，但这些专利中没有详细报道这些胶原蛋白肽的生物活性；CN101091789A涉及海洋胶原肽在制备免疫调节药物或食品中的用途，由鱼皮经水解获得的分子量在200-1000D的小分子肽，可增强小鼠迟发性变态反应能力和ConA刺激的T淋巴细胞增殖，增加抗体生成细胞数量，并对巨噬细胞碳粒廓清能力和对鸡红细胞的吞噬能力具有明显促进作用；CN101061827A涉及鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法和应用，其特征在于用热水提取胶原蛋白，然后加酶在40～50℃水解、90～100℃灭酶、用碱液调pH至中性、酶解液经过滤、超滤、钠滤、真空浓缩以及喷雾干燥，所获得的胶原蛋白肽具有抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化以及美容作用，但未见胶原蛋白肽具有延长动物寿命和抑制动物体内褐脂质形成的功效报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白活性肽的制备方法，该制备方法得到的胶原蛋白活性肽具有延长动物寿命和抑制褐脂质形成等特殊生理功效，可作为功能因子添加剂，应用于人类的保健食品以及宠物的健康饲料中。
为达到上述之目的，本发明的技术措施如下：
一方面，本发明公开了一种特殊的胶原蛋白活性肽，这种胶原蛋白活性肽系以来源于水产动物的未变性胶原蛋白为原料，经过酶解等特殊的生化技术而获得，其主要成分的分子质量范围为5-13KD，氮溶解指数＞98％，具有显著延长动物寿命以及抑制体内脂褐质生成等特殊的生理功效。
另一方面，上述胶原蛋白活性肽的具体制备方法如下：
(1)胶原蛋白的提取：
其提取方法是，将原料洗净破碎后，先后用5-15倍的净水和5％的NaCl溶液处理，分别去除水溶性和盐溶性杂蛋白，将除去杂蛋白的鱼皮用20倍1％的胃蛋白酶溶液(pH2)处理72h，离心(5000×g)，取上清夜，加入固体NaCl，使其浓度达到2.5M，离心(5000×g)，取沉淀，得到胶原蛋白粗品；
(2)获得蛋白水解产物
采用不同酶切位点的蛋白酶在中温条件下对未变性水产胶原蛋白进行可控水解，获得胶原蛋白水解产物；
(3)获得胶原蛋白肽
将以上胶原蛋白水解产物进行透析，并经干燥获得胶原蛋白肽。
上述未变性胶原蛋白指从各种水产动物(如海洋与淡水鱼皮、头足类动物皮、贝类外套膜等)原料中提取获得的各种胶原蛋白，其提取方法一般是，先将原料洗净，采用中性盐等去除原料中的非胶原杂蛋白类成分，然后采用低温酶解的方法将难溶性的胶原蛋白从原料中提取出来，从而获得未变性的水产胶原蛋白。
得到上述胶原蛋白粗品后，用酸性溶液(如：0.5M醋酸)溶解，并采用酸性溶液(如：0.5M醋酸)为透析外液进行透析48-72h，至透析液无Cl-检出为止，获得优选的未变性I型胶原蛋白。
上述经透析后的胶原蛋白水解产物在干燥前可经过也可不经过亲水性葡聚糖凝胶(Sephadex-G50)层析进行纯化。
所述干燥方法可为真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等，优选为冷冻干燥；
所述不同酶切位点的蛋白酶均为食用级，可为来自于动物、植物以及微生物的酸性、中性以及碱性蛋白酶，优选为食用级胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
蛋白酶酶解胶原蛋白温度控制在30-60℃的中温条件，并使胶原蛋白进行可控水解，在此条件下胶原蛋白的水解度一般在5-15％范围内。
通过实验验证发现，本发明方法制备出的胶原蛋白活性肽具有显著延长动物寿命以及抑制动物体内脂褐质生成等功效。另外，该胶原蛋白活性肽还具有在体外抑制多酚氧化酶的活性。
制备得到的胶原蛋白活性肽可以作为功能因子添加剂广泛应用于保健食品中。这类保健食品适合于各种年龄层次的人群，尤其适合于中老年人服用，从而起到延缓衰老与延年益寿的作用；也可做宠物健康饲料添加剂，应用于各类宠物(如狗、猫、金鱼、鸽子、鹦鹉以及其他鸟类等)的健康型饲料中，最好用于价值昂贵的特种宠物饲料中，延长宠物的寿命。
本发明具有如下特点及收益：
(1)本发明所采用的原料为来源于水产品下脚料的未变性胶原蛋白，水产品下脚料包括海洋与淡水鱼皮、头足类动物皮、贝类外套膜等。原料来源广泛丰富，有效成分含量高，最终产品有很高的得率；成本低廉，附加值高，具有广阔的市场前景。
(2)本发明公开的胶原蛋白活性肽产品具有抑制体外多酚氧化酶活性、显著延长动物寿命以及抑制动物体内脂褐质生成功效。
(3)本发明公开的胶原蛋白活性肽制备方法，使用的试剂全部为食用级，工艺条件温和(30-60℃条件下酶解)，使产品的食用安全性高，可作为功能因子直接添加于各种保健食品特别是具有延缓衰老与延年益寿作用的老年性保健食品中，也可做宠物健康饲料添加剂，应用于各类宠物的健康型饲料中，延长宠物的寿命。
(4)本发明方法的操作简单，设备投资少，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体的实例来说明如何制备本产品，值得一提的是，本实例只用于对本发明做进一步的阐述和说明，不能认为是对本发明保护范围的限制。
实施例1
(1)将洗净的鱼皮捣碎、先后用5-15倍的净水和5％的NaCl溶液处理，分别去除水溶性和盐溶性杂蛋白。
(2)将除去杂蛋白的鱼皮用20倍1％的胃蛋白酶溶液(pH2)处理72h，离心(5000×g)，取上清夜，加入固体NaCl，使其浓度达到2.5M，离心(5000×g)，取沉淀，得胶原蛋白粗品。
(3)将胶原蛋白粗品用0.5M醋酸溶解，并采用0.5M醋酸为透析外液进行透析48-72h，至透析液无Cl-检出为止，获得未变性I型胶原蛋白。
(4)将胶原蛋白分散于20倍量的纯水中，将pH调至8，加热至50℃，保温40mins，然后按比例加入胰蛋白酶(酶与底物浓度为60U/g)进行酶解20mins或至水解度达到8％，得胶原蛋白水解液。
(5)将胶原蛋白水解液装入截留分子量为2kD的透析袋，以蒸馏水为外液进行透析过夜，再经冻干燥得胶原蛋白活性肽(CH-1)，经葡聚糖凝胶(Sephadex-G50)层析法进行分离纯化后，所获有效组分(CH-1-2)的分子量为7378D。
(6)将干燥后的CH-1添加于营养培养基中饲喂果蝇，能将果蝇的平均寿命由对照组的52.3天延长至69.7天，延长率达到33.3％，同维生素E的延寿功效(70.6天)相近；同时将果蝇体内的脂褐质含量由对照组的14.8％降至11.1％，同维生素E的效果(10.7％)类似。另外，CH-1还能明显抑制体外多酚氧化酶的活性，而且其活性呈剂量依赖关系，当CH-1的浓度为2mg/ml时，其活性达到相同剂量维生素C的33％；但当CH-1的浓度为5mg/ml时，其活性为同量维生素C的90％。
实施例2
将按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤获得的未变性I型胶原蛋白分散于10倍量的纯水中，将pH调至2，加热至60℃，按实施例1中的比例加入胃蛋白酶进行酶解，酶解时间大约为40mins或至水解度达到15％为止；将胶原蛋白水解液装入截留分子量为2kD的透析袋，以蒸馏水为外液进行透析过夜，再经冻干燥得胶原蛋白活性肽，经葡聚糖凝胶(Sephadex-G50)层析法进行分离纯化后，所获有效组分的分子量为5021D。
实施例3
将按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤获得的未变性I型胶原蛋白分散于10倍量的纯水中，将pH调至2，按实施例1中的比例加入胃蛋白酶进行酶解，温度控制在30℃，酶解时间大约为40mins或至水解度达到5％为止；将胶原蛋白水解液装入截留分子量为2kD的透析袋，以蒸馏水为外液进行透析过夜，再经冻干燥得胶原蛋白活性肽，经葡聚糖凝胶(Sephadex-G50)层析法进行分离纯化后，所获有效组分的分子量为5021D。
实施例4
将按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤获得的未变性I型胶原蛋白分散于10倍量的纯水中，将pH调至2，按实施例1中的比例加入胃蛋白酶进行酶解，酶解时间大约为40mins或至水解度达到12％为止；将胶原蛋白水解液装入截留分子量为2kD的透析袋，以蒸馏水为外液进行透析过夜，再经冻干燥得胶原蛋白活性肽(CH-2)；经葡聚糖凝胶((Sephadex-G50)层析法进行分离纯化后，所获有效组分(CH-2-1)的分子量为12057D；将干燥后的CH-2添加于营养培养基中饲喂果蝇，能将果蝇的平均寿命由对照组的52.3天延长至65.1天，比维生素E(70.6天)的延寿效果差5.5天；同时将果蝇体内的脂褐质含量由对照组的14.8％降至11.8％，略低于维生素E(10.7％)的效果。另外，CH-2还能明显抑制体外多酚氧化酶的活性，而且其活性呈剂量依赖关系。当CH-2的浓度为2mg/ml时，其活性达到相同剂量的维生素C的40.4％，但当其浓度增加至5mg/ml时，其活性达到相同剂量的维生素C的99.6％。
实施例5
将按实施例1中(1)、(2)、(3)步骤获得的未变性I型胶原蛋白分散于10倍量的纯水中，将pH调至7，按按实施例1中的比例加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解时间约40mins或至水解度为7％；将胶原蛋白水解液装入截留分子量为2kD的透析袋，以蒸馏水为外液进行透析过夜，再经冻干燥得胶原蛋白活性肽(CH-3)；将干燥后的CH-3添加于营养培养基中饲喂果蝇，能将果蝇的平均寿命由对照组的52.3天延长至67.2天，略低于维生素E(70.6天)的延寿功效；同时将果蝇体内的脂褐质含量由对照组的14.8％降至11.7％。另外，CH-3还能明显抑制体外多酚氧化酶的活性，而且其活性呈剂量依赖关系。当CH-3的浓度为2mg/ml时，其活性达到相同剂量的维生素C的15.4％，但当其浓度增加至5mg/ml时，其活性达到相同剂量的维生素C的98.6％。
Claims (14)
1.一种胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白的提取：
其提取方法是，将原料洗净破碎后，先后用5-15倍的净水和5％的NaCl溶液处理，分别去除水溶性和盐溶性杂蛋白，将除去杂蛋白的鱼皮用20倍1％的胃蛋白酶溶液(pH2)处理72h，离心(5000×g)，取上清夜，加入固体NaCl，使其浓度达到2.5M，离心(5000×g)，取沉淀，得到胶原蛋白粗品；
(2)获得蛋白水解产物
采用不同酶切位点的蛋白酶在中温条件下对未变性水产胶原蛋白进行可控水解，获得胶原蛋白水解产物；
(3)获得胶原蛋白肽
将以上胶原蛋白水解产物进行透析，并经干燥获得胶原蛋白肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胶原蛋白为未变性I型胶原蛋白，在得到胶原蛋白粗品后，用0.5M醋酸溶解，并采用0.5M醋酸为透析外液进行透析48-72h，至透析液无Cl-检出为止，获得未变性I型胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为酸性蛋白酶。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为中性蛋白酶。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的酸性蛋白酶为胃蛋白酶。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶为胰蛋白酶。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的中性蛋白酶为木瓜蛋白酶。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的中温条件为30-60℃
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的可控水解为胶原蛋白水解度在5-15％。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胶原蛋白肽的分子量为5-13KD。
12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胶原蛋白肽的氮溶解指数大于98％。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法制备的胶原蛋白肽用于延长动物寿命和抑制动物体内脂褐质生成。
14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法制备的胶原蛋白多肽用于人类的功能性食品及宠物饲料中。
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