CN107475337A - 一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法 - Google Patents

一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,以酸法提取胶原蛋白为基础,在其基础上加以改进,采用冰醋酸为载体,配合胃蛋白酶为催化剂,避免了使用柠檬酸产生异味、乙酸提取效率低的问题,且采用透析的方式进行分离提纯,得到的胶原蛋白液纯度大大提高,品质更佳。

Description

一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体是一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子,动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%,某些生物体甚至高达80%以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性,因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白由动物皮提取,皮中除胶原蛋白外还含有透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖,它们含有大量极性基团,是保湿因子,且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用,故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用,因而广泛应用于美容用品中。
由于胶原是细胞外间质成分,在体内以不溶性大分子结构存在,并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起,因此胶原的制备包括材料的选择、预处理、酸碱酶盐水法提取、不同类型胶原的分离和纯化。提取方法包括酸法、碱法、酶法等,但酸法由于各种不足,酸法很少单独使用,一般和酶法配合,提取工序复杂,而碱法易引起蛋白质变性,且不易控制,胶原蛋白品质不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,包括以下步骤:
S1,前处理:
S11,称取动物皮组织50重量份,用氯仿/乙醇混合溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪,去毛并细切;
S12,将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次;
S13,将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状,用缓冲液充分洗涤2小时,以去除脂质及血清等成分,低温离心,弃上清,取沉淀;
S2,提取
S21,在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸,搅拌并维持在4℃,提取48h;
S22,高速冷冻离心机离心吸取上清液,在上清液中加入NaCl至4.4mol/L搅拌过夜;
S23,低温离心,将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中,再逐级用2.4mol/L,1.7mol/L及1.0mol/L的NaCl反复盐析、酸溶,得到的上清液即为胶原粗提液;
S3,提纯:
S31,在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液调节pH值到7,冷冻离心除掉沉淀物,在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末,缓慢搅拌,4℃静置过夜保存;
S32,离心取沉淀,用稀醋酸再次溶解,将溶解液装入透析袋中,用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液,透析1天,再用蒸馏水透析3天,每天换透析液两次,最后得到胶原蛋白水溶液;
S33,将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白,并粉碎制成粉剂。
作为本发明进一步的方案:步骤S11中,氯仿/乙醇混合溶液中氯仿和乙醇的体积比为2:1。
作为本发明进一步的方案:步骤S13中,所述缓冲液可为含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl溶液,pH值为7.5。
作为本发明进一步的方案:步骤S13中,低温离心条件参数为:转速8000r/min,离心时间30min,离心温度4℃。
作为本发明进一步的方案:步骤S22中,高速冷冻离心机的转速设定参数为4000r/min。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明以酸法提取胶原蛋白为基础,在其基础上加以改进,采用冰醋酸为载体,配合胃蛋白酶为催化剂,避免了使用柠檬酸产生异味、乙酸提取效率低的问题,且采用透析的方式进行分离提纯,得到的胶原蛋白液纯度大大提高,品质更佳。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中,一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,包括以下步骤:
S1,前处理:
S11,称取动物皮组织(优选猪皮或牛皮)50重量份,用氯仿/乙醇混合溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪,去毛并细切;
S12,将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次;
S13,将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状,用缓冲液充分洗涤2小时,以去除脂质及血清等成分,低温离心,弃上清,取沉淀;
S2,提取
S21,在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸,搅拌并维持在4℃,提取48h;
S22,高速冷冻离心机离心吸取上清液,在上清液中加入NaCl至4.4mol/L搅拌过夜;
S23,低温离心,将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中,再逐级用2.4mol/L,1.7mol/L及1.0mol/L的NaCl反复盐析、酸溶,得到的上清液即为胶原粗提液;
S3,提纯:
S31,在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6mol/LNaOH溶液调节pH值到7,冷冻离心除掉沉淀物,在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末,缓慢搅拌,4℃静置过夜保存;
S32,离心取沉淀,用稀醋酸再次溶解,将溶解液装入透析袋中,用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液,透析1天,再用蒸馏水透析3天,每天换透析液两次,最后得到胶原蛋白水溶液;
S33,将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白,并粉碎制成粉剂。
步骤S11中,氯仿/乙醇混合溶液中氯仿和乙醇的体积比为2:1。
步骤S13中,所述缓冲液可为含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl溶液,pH值为7.5。
步骤S13中,低温离心条件参数为:转速8000r/min,离心时间30min,离心温度4℃。
步骤S22中,高速冷冻离心机的转速设定参数为4000r/min。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1,前处理:
S11,称取动物皮组织50重量份,用氯仿/乙醇混合溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪,去毛并细切;
S12,将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次;
S13,将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状,用缓冲液充分洗涤2小时,以去除脂质及血清等成分,低温离心,弃上清,取沉淀;
S2,提取:
S21,在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸,搅拌并维持在4℃,提取48h;
S22,高速冷冻离心机离心吸取上清液,在上清液中加入NaCl至4.4mol/L搅拌过夜;
S23,低温离心,将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中,再逐级用2.4mol/L,1.7mol/L及1.0mol/L的NaCl反复盐析、酸溶,得到的上清液即为胶原粗提液;
S3,提纯:
S31,在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6mol/LNaOH溶液调节pH值到7,冷冻离心除掉沉淀物,在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末,缓慢搅拌,4℃静置过夜保存;
S32,离心取沉淀,用稀醋酸再次溶解,将溶解液装入透析袋中,用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液,透析1天,再用蒸馏水透析3天,每天换透析液两次,最后得到胶原蛋白水溶液;
S33,将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白,并粉碎制成粉剂。
2.根据权利要求1所述的一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,其特征在于:步骤S11中,氯仿/乙醇混合溶液中氯仿和乙醇的体积比为2:1。
3.根据权利要求1所述的一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,其特征在于:步骤S13中,所述缓冲液可为含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl溶液,pH值为7.5。
4.根据权利要求1所述的一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,其特征在于:步骤S13中,低温离心条件参数为:转速8000r/min,离心时间30min,离心温度4℃。
5.根据权利要求1所述的一种从动物皮脂中提取胶原蛋白的方法,其特征在于:步骤S22中,高速冷冻离心机的转速设定参数为4000r/min。
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