CN105063148A - 胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种胶原蛋白的制备方法，属于生物食品技术领域。本发明的目的是提供一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。本发明的胶原蛋白原液的制备步骤是：匀浆消化、吸附过滤、超滤浓缩换缓冲液、离子交换层析、超滤浓缩换保存液、过滤除菌制备胶原蛋白原液，在通过蛋白沉淀、离心、匀浆纤维后获得胶原蛋白。本发明工艺简单，操作容易，经过本发明工艺将牛皮进行处理后获得的浆液用于进行胶原蛋白的提取，能够明显增加胶原蛋白的提纯率和纯度。

Description

胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物食品技术领域。

背景技术

胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%以上。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分。由于胶原蛋白具有紧肤平皱、保湿滋润、修复组织、美白淡斑等功效，一直被人们食用、医用等，胶原蛋白一般在猪皮、牛皮等中提取，现有常规方法的制备胶原蛋白受工艺条件等影响，提纯率较低，而且提取出来的胶原蛋白中杂质较多，严重影响了胶原蛋白的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。

本发明的胶原蛋白原液的制备步骤是：

a、匀浆消化：

牛真皮组织解冻

取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克／升，混匀；

加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；

消化：称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.1mg/ml，即每100ml匀浆中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天；

b、吸附过滤：

用配置好的10MNaOH标准溶液调节消化液pH至9—9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；

调节pH值：消化液中加入等体积的超纯水,并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；

清洗硅藻土：根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取硅藻土，将硅藻土用10mMHCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；

吸附过滤：加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生泵用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生泵的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；

c、超滤浓缩换缓冲液：

用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，并用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3次；

d、离子交换层析：

装柱：将阳离子交换介质用0.5mol/LNaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值≤8.0；将洁净的层析柱与卫生泵相连接，将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液，将上述处理的阳离子交换介质用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动卫生泵，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积；

离子交换层析柱清洗再生：用0.5mol/LNaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≤8.0；再将层析柱用0.5mol/LHCl溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≥6.0；再将层析柱用50mmol/LNaAc、pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积；

上样：用卫生泵将粗提胶原蛋白溶液缓慢注入到层析柱中，用220mn紫外监测器监测，上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算；

冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白：用20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右；

洗脱吸附胶原蛋白：用含100mmol/LNaCl的20mmol/L、pH4.6NaAc缓冲液洗脱，收集洗脱峰的蛋白，即胶原溶液，洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积；

e、超滤浓缩换保存液：

对超滤系统进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原；浓缩离子交换层析洗脱的收集液溶液并用10mmol/L盐酸溶液反复换液3次；

f、过滤除菌：

用除菌过滤系统清洗、安装滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温；将除菌后溶液的容器密封，4℃冰柜保存，除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液。

本发明用胶原蛋白原液制备胶原蛋白的制备步骤是：

a、蛋白沉淀：

在除菌后胶原原液中加入1/10体积的0.2mol/L、pH11.2Na₂HPO₄缓冲溶液，用pH计测定混合液的pH值应在7.0—7.5之间，溶液由无色透明变为乳白色，室温下过夜；

b、离心：

用超低温高速离心机，10000rpm/min，离心胶原纤维30分钟；收集离心沉淀胶原纤维和上清液，用灭菌生理食盐水洗涤胶原纤维，10000rpm/min,离心30分钟，收集上清液并与前次上清液混合，收集胶原纤维，送检以检测蛋白浓度；

c、匀浆纤维

用离心前胶原原液和离心沉淀后上清液的胶原蛋白浓度，按胶原蛋白浓度35mg/ml计算出离心后胶原纤维的匀浆液半成品的体积；

公式：匀浆液半成品体积=（胶原原液浓度*胶原原液体积-离心上清液浓度*上清液体积）/35

用确定后匀浆液的体积，按盐酸利多卡因浓度3mg/ml计算出盐酸利多卡因需要量：公式：盐酸利多卡因溶液量=匀浆液半成品体积*3/20；

将胶原纤维沉淀分别转入胶原纤维匀浆乳化器中；

加入生理盐水和盐酸利多卡因溶液，最终定容到计算量体积；

利用胶原纤维匀浆乳化器的乳化头另一只胶原纤维匀浆乳化器的乳化头进行连接，推动胶原纤维通过胶原纤维匀浆乳化器的乳化头多次,使胶原纤维充分匀浆混匀。

本发明工艺简单，操作容易，经过本发明工艺将牛皮进行处理后获得的浆液用于进行胶原蛋白的提取，能够明显增加胶原蛋白的提纯率和纯度。

附图说明

图1是本发明工艺流程图。

具体实施方式、

本发明的胶原蛋白制备步骤是：

a、匀浆消化：

牛真皮组织解冻

取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克／升，混匀；

加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；

消化：称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.1mg/ml，即每100ml匀浆中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天；

b、吸附过滤：

用配置好的10MNaOH标准溶液调节消化液pH至9—9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；

调节pH值：消化液中加入等体积的超纯水,并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；

清洗硅藻土：根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取硅藻土，将硅藻土用10mMHCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；

吸附过滤：加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生泵用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生泵的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；

c、超滤浓缩换缓冲液：

用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，并用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3次；

d、离子交换层析：

装柱：将阳交换介质用0.5mol/LNaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值≤8.0；将洁净的层析柱与卫生泵相连接，将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液，将上述处理的阳交换介质用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动卫生泵，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积；

离子交换层析柱清洗再生：用0.5mol/LNaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≤8.0；再将层析柱用0.5mol/LHCl溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≥6.0；再将层析柱用50mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积；

上样：用卫生泵将粗提胶原蛋白缓慢注入到层析柱中，用220mn紫外监测器监测，上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算；

冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白：用20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右；

洗脱吸附胶原蛋白：用含100mmol/LNaCl的20mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液洗脱，收集洗脱峰蛋白，即胶原溶液，洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积；

e、超滤浓缩换保存液：

用超滤系统进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原；浓缩离子交换洗脱的收集液溶液并用10mmol/L盐酸溶液反复换液3次；

f、过滤除菌：

用除菌过滤系统清洗、安装滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温；将除菌后溶液的容器密封，4℃冰柜保存，除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液。

本发明用胶原蛋白原液制备胶原蛋白的制备步骤是：

a、蛋白沉淀：

在除菌后胶原原液中加入1/10体积的0.2mol/L，pH11.2Na₂HPO₄缓冲溶液，用pH计测定混合液的pH值应在7.0—7.5之间，溶液由无色透明变为乳白色，室温下过夜；

b、离心：

用超低温高速离心机，10000rpm/min，离心胶原纤维30分钟；搜集离心沉淀胶原纤维和上清液，用灭菌生理食盐水洗涤胶原纤维，10000rpm/min,离心30分钟，搜集上清液并与前次上清液混合，搜集胶原纤维，送检检测蛋白浓度；

c、匀浆纤维

用离心前胶原原液和离心沉淀后上清液的胶原蛋白浓度，按胶原蛋白浓度35mg/ml计算出离心后胶原纤维的匀浆液半成品的体积；

公式：匀浆液半成品体积=（胶原原液浓度*胶原原液体积-离心上清液浓度*上清液体积）/35

用确定后匀浆液的体积，按盐酸利多卡因浓度3mg/ml计算出盐酸利多卡因需要量：公式：盐酸利多卡因溶液量=匀浆液半成品体积*3/20；

将胶原纤维沉淀分别转入针筒；

加入生理食盐水和盐酸利多卡因溶液，最终定容到计算量体积；

利用胶原纤维匀浆乳化器的乳化头另一只胶原纤维匀浆乳化器的乳化头进行连接，推动胶原纤维通过胶原纤维匀浆乳化器的乳化头多次,使胶原纤维充分匀浆混匀。

以下对本发明做进一步详细的描述：

4.操作过程及工艺条件

4.1.备料

准备好所需原辅料。

配液

4.2.1.10M氢氧化钠溶液

4.2.2.0.5M氢氧化钠溶液

4.2.3.0.1M氢氧化钠溶液

4.2.4.10mmol/ml盐酸溶液

4.2.5.0.5M盐酸溶液制备

4.2.6.1mol/LpH4.6醋酸钠母液

4.2.7.3mol/L氯化钠母液

4.2.8.0.2mol/L，pH11.2Na ₂ HPHO ₄ 溶液

4.2.90.9%注射用生理盐水

按配液岗位标准操作规程配制上述溶液，其中4.2.6、4.2.7、4.2.8、4.2.9所述溶液的配制需要用0.45微米一次性过滤器过滤溶液，再经过高温蒸汽灭菌后使用。

匀浆消化

4.3.1牛真皮组织解冻

按投料量要求取冻存的牛真皮组织，每袋500克放入5000毫升烧杯中，加入2000毫升超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状。

4.3.2匀浆工序即将牛真皮组织颗粒用组织捣碎机绞成均匀的无明显牛皮颗粒的悬浮液。

把成糊状的组织颗粒用小铁勺转移到组织捣碎机的玻璃杯中3勺，约50毫升，加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮，将组织匀浆转入塑料桶。

所有组织颗粒绞碎均匀后将塑料桶加入超纯水至组织的含量为25克／升，混匀。

4.3.3加冰醋酸至组织悬浮液塑料桶调制溶液浓度0.5毫克/毫升。

4.3.4消化

称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织匀浆液至0.1mg/ml，即每100ml匀浆中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天。

完毕后立即对器具进行清洗，清洗内容按设备清洁规程执行，并做好清场清洁记录。

吸附过滤

4.4.1灭活胃蛋白酶

按酸度计的标准操作规程，用配置好的10MNaOH标准溶液调节消化液pH至9—9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶。

调节pH值

消化液中加入等体积的超纯水,并用浓盐酸调节pH到4.0。搅拌2小时。

清洗硅藻土

根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L(干重)称取硅藻土，将硅藻土用10mMHCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次。

吸附过滤

加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时。

将玻璃滤纸置于布氏漏斗中，把布氏漏斗和循环水真空泵用硅胶管连接紧密，按真空抽滤的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土。如果胶原溶液浑浊，可重复过滤一次，收集过滤液。

超滤浓缩换缓冲液

4.5.1处理超滤系统

溶液超滤前对超滤系统按照超滤系统标准操作规程进行膜包孔径的选择并安装、冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原，如果为新膜，在第一次使用之前，应测量它的水通量NWP。

用超滤系统浓缩过滤后消化胶原溶液，用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3次，记录最终浓缩液体积。

离子交换层析

4.6.1装柱

首次层析提纯需要对层析柱和层析介质进行处理后，把层析介质有效的装填到层析柱中，保证良好的提纯交换效果。已经装填好层析介质的层析柱在未来的生产中不必重新装填，除非层析柱中的介质不均匀或有结块和气泡影响层析提纯效果的。

将阳离子交换介质用0.5mol/LNaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值≤8.0。

将洁净的层析柱与卫生泵相连接。将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液，将上述处理的CM52-Cellulose用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动卫生泵，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积。

4.6.2离子交换层析柱清洗再生

在每次进行对粗提胶原蛋白进行精制提取前，都应对离子交换层析柱清洗再生，保证去除交换介质吸附的杂蛋白和热源，并恢复再生交换介质吸附胶原蛋白的能力。

按卫生泵的标准操作规程将装好的层析柱用0.5mol/LNaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≤8.0；

再将层析柱用0.5mol/LHCl溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≥6.0；

再将层析柱用50mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积。

上样

用卫生泵将粗提胶原蛋白缓慢注入到层析柱中，加样速度根据柱的直径而定，层析柱（150×180mm）上样速度为30ml/min左右。用220mn紫外监测器监测，打开纪录仪，开到最慢走纸速度，调整基线使划线指针在记录纸“10”的位置。上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算，层析柱（150×180mm）上样量大约为3g胶原蛋白。

冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白

上样结束后用20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右，纪录仪指针恢复到基线位置。

洗脱吸附胶原蛋白

用含100mmol/LNaCl的20mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液洗脱。收集洗脱峰蛋白，即胶原溶液。洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积，

4.7超滤浓缩换保存液

4.7.1按照超滤系统标准操作规程进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原。

浓缩离子交换洗脱的收集液溶液并用10mmol/L盐酸溶液反复换液3次，记录最终浓缩液体积。

4.8过滤除菌

4.8.1按除菌过滤系统标准操作规程清洗、安装一定孔径的滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温备用。

按除菌过滤系统标准操作规程在一定速度下，使待处理液完全通过过滤器进入到指定容器内。

将除菌后溶液的容器密封，4℃冰柜保存。

除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液，按原液检验标准检测合格后方可进入下一步生产。

蛋白沉淀

4.9.1在除菌后胶原原液中加入1/10体积的0.2mol/L，pH11.2Na₂HPO₄缓冲溶液，用pH计测定混合液的pH值应在7.0—7.5之间，溶液由无色透明变为乳白色。

室温下过夜。

离心

4.10.1按照超低温高速离心机标准操作规程，10000rpm/min，离心胶原纤维30分钟。

分别收集离心沉淀胶原纤维和上清液。

用灭菌生理食盐水洗涤胶原纤维，10000rpm/min,离心30分钟。

收集上清液并与前次上清液混合，收集胶原纤维，送检检测蛋白浓度。

匀浆纤维

4.11.1用离心前胶原原液和离心沉淀后上清液的胶原蛋白浓度，按产品质量标准规定的胶原蛋白浓度35mg/ml计算出离心后胶原纤维可以生产的匀浆液半成品的体积。

公式：匀浆液半成品体积=（胶原原液浓度*胶原原液体积-离心上清液浓度*上清液体积）/35

4.11.2用确定后匀浆液的体积，按产品质量标准规定的盐酸利多卡因浓度3mg/ml计算出盐酸利多卡因需要量。

公式：盐酸利多卡因溶液量=匀浆液半成品体积*3/20

4.11.3将胶原纤维沉淀分别转入100ml针筒。

4.11.4加入生理食盐水和盐酸利多卡因溶液，最终定容到计算量体积。

4.11.5利用胶原纤维匀浆乳化器的乳化头另一只胶原纤维匀浆乳化器的乳化头进行连接，推动胶原纤维通过胶原纤维匀浆乳化器的乳化头多次（30次以上）,使胶原纤维充分匀浆混匀。

半成品检测。

按半成品质量标准相关项目检测合格后进入下一步生产。

分装

按生产要求的装量将浆后胶原纤维半成品注入到预充注射器内，并装配好胶塞及推杆。

包装

将预充注射器安装到PVC塑料托中，装入密封袋内，封口，同使用说明书装入外包装盒。

打印批号

在小包装铝箔袋、外包装盒的批号处准确清晰地打印上批号、生产日期和有效期。

成品检测

取样，按质量标准检测相关项目。

入库

包装结束后，将产品入成品待验区，请验，合格后办理入库手续并入库。

本发明医用胶原充填剂是将高纯度牛真皮组织的胶原蛋白分散在含有0.3%利多卡因的磷酸盐生理盐水缓冲液中的无菌材料，是无菌胶原蛋白装入预充注射器中的注射剂型，属国家医疗器械Ⅲ类，用来植入真皮组织内,以矫正非重力负荷区的由于软组织缺损所造成的轮廓缺陷，添补皮肤凹陷部位。

本发明匀浆消化过程中加入了胃蛋白酶，将自然三螺旋结构形态的胶原纤维消化成分子量30万左右的胶原蛋白分子，同时切除胶原蛋白分子的氨基和羧基末端（末端肽）的球状区域，并保持了胶原蛋白天然的空间螺旋区段结构和生物活性，从而去除了胶原蛋白的潜在免疫源性。

对于加入的胃蛋白酶，经过灭活、助滤过滤，超滤浓缩、吸附提纯等工艺进行去除，同时根据《中国药典》制定了胃蛋白酶残留量的ELISA夹心法检测标准。

此步骤是确保胶原蛋白产品没有过敏反应等副作用的关键点。工艺中让胃蛋白酶在较低温度下，长时间（7-10天）对胶原蛋白进行消化，达到了彻底去除胶原分子的氨基和羧基末端端肽。

本发明离子交换层析工艺中运用胶原蛋白为带正电荷蛋白质的这一特性，通过阳离子交换介质吸附胶原蛋白后再洗脱分离的方法，最后得到精确提纯的胶原蛋白。工艺中严格控制胶原蛋白洗脱峰的回收位点，并对洗脱回收液进行纯度检测。

此步骤为提取高纯度胶原蛋白的关键工艺。在胶原蛋白经过超滤去除小分子杂蛋白粗提的基础上，进一步精确提取，使胶原蛋白的纯度达到99%以上，去除了产品中杂质蛋白的潜在副作用。

本发明通过膜过滤除菌的方式，反复两次对胶原蛋白溶液进行除菌。除菌过滤设备及过滤膜要经过严格的无菌和完整性验证，保障除菌效果。

胶原蛋白溶液的过滤除菌是保证医用胶原充填剂成品无菌及无热源的关键步骤，确保被使用者注射后无炎症和发热反应。

过滤除菌环境为万级洁净条件下的局部百级，从而保证了过滤除菌效果。

本发明红外光谱检测结论

从胶原样品与标准的SigmaⅠ型胶原的红外光谱谱图中可以看见，标准的SigmaⅠ型胶原的红外谱图中的主要峰在本发明医用胶原充填剂中的胶原蛋白红外谱图中都有体现，两者的红外谱图几乎重合，

图中3410cm-1附近是N-H伸缩振动，1650cm-1附近是酰胺Ⅰ带的C=O伸缩振动，1540cm-1附近是酰胺Ⅱ带N-H弯曲振动，1450～1230cm-1附近的吸收峰表明了胶原蛋白3股螺旋结构的完整性，

胶原的N-H伸缩振动位于3410cm-1说明了肽链间氢键的存在，1237cm-1与1452cm-1的峰强度比值为0.98，非常接近胶原特征值1.0。由此可见，本发明医用胶原充填剂中的胶原蛋白的三股螺旋结构是保持完整的。

本发明生产工艺中运用了多步病毒去除灭活工艺，包括pH＜2的10%冰醋酸溶液浸泡牛皮10天、胃蛋白酶消化牛皮7-10天以上、不同分子量的超滤筛选以及离子交换层析的精密提取等，这些工艺对可能潜在的病毒完全可以达到灭活去除的目的，

经中国药品生物制品检定所实验证明，产品生产工艺中的10%冰醋酸处理和胃蛋白酶消化步骤为有效的灭活病毒方法，

生产工艺中通过胃蛋白酶将免疫原性本来就很低的胶原蛋白的氨基和羧基末端（末端肽）球状区域进行切除，进一步去除其潜在免疫原性

产品经上海生物材料研究测试中心检测，无明显的免疫毒性。

本发明医用胶原充填剂含有0.3%盐酸利多卡因，目的为注射过程中减轻患者的疼痛感，盐酸利多卡因是临床使用时间最长且应用最为广泛的局部麻醉药物，其药理毒理、药代动力学、用法用量、不良反应及注意事项等已经过充分的研究，盐酸利多卡因在胶原充填剂真皮注射植入中的作用为浸润麻醉，国家标准规定盐酸利多卡因皮下注射浓度为0.25%-0.5%，用量为50-300mg，本发明医用胶原充填剂中的盐酸利多卡因浓度为0.3%，产品一次植入量不超过10毫升，即一次性应用盐酸利多卡因的最大用量小于30mg，本发明医用胶原充填剂中盐酸利多卡因的用法完全符合国家规定的标准用法用量，对被植入者是安全的。

本发明医用胶原充填剂对人体验证性试验

试验入选188例受试者，在双侧鼻唇沟部位注射，观察150天，注射后第150天鼻唇沟左侧和右侧研究者疗效评价总有效率（包括显效率）分别是83.6%和87.3%。

试验结论

1.医用胶原充填剂用于充填鼻唇沟皱纹安全有效

2.填充作用明显，可持续5个月以上

3.临床操作方便

4.该产品为局部注射使用，较之手术等其它治疗方式，对患者创伤较小，降低了对其日常工作生活的影响。

Claims (2)

1.一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于：胶原蛋白原液的制备步骤是：

a、匀浆消化：

牛真皮组织解冻

取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克／升，混匀；

加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；

消化：称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.1mg/ml，即每100ml匀浆中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天；

b、吸附过滤：

用配置好的10MNaOH标准溶液调节消化液pH至9—9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；

调节pH值：消化液中加入等体积的超纯水,并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；

清洗硅藻土：根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取硅藻土，将硅藻土用10mMHCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；

吸附过滤：加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生泵用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生泵的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；

c、超滤浓缩换缓冲液：

用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3次；

d、离子交换层析：

装柱：将阳离子交换介质用0.5mol/LNaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值≤8.0；将洁净的层析柱与蠕动泵相连接，将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液，将上述处理的阳离子交换介质用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动蠕动泵，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积；

离子交换层析柱清洗再生：用0.5mol/LNaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≤8.0；再将层析柱用0.5mol/LHCl溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≥6.0；再将层析柱用50mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积；

上样：用卫生泵将粗提胶原蛋白缓慢注入到层析柱中，用220mn紫外监测器监测，上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算；

冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白：用20mmol/LNaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右；

洗脱吸附胶原蛋白：用含100mmol/LNaCl的20mmol/L，pH4.6NaAc缓冲液洗脱，收集洗脱峰蛋白，即胶原溶液，洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积；

e、超滤浓缩换保存液：

用超滤系统进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原；浓缩离子交换洗脱的收集液溶液并用10mmol/L盐酸溶液反复换液3次；

f、过滤除菌：

用除菌过滤系统清洗、安装滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温；将除菌后溶液的容器密封，4℃冰柜保存，除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：

a、蛋白沉淀：

在除菌后胶原原液中加入1/10体积的0.2mol/L、pH11.2Na₂HPO₄缓冲溶液，用pH计测定混合液的pH值应在7.0—7.5之间，溶液由无色透明变为乳白色，室温下过夜；

b、离心：

用超低温高速离心机，10000rpm/min，离心胶原纤维30分钟；收集离心沉淀胶原纤维和上清液，用灭菌生理食盐水洗涤胶原纤维，10000rpm/min,离心30分钟，收集上清液并与前次上清液混合，收集胶原纤维，送检检测蛋白浓度；

c、匀浆纤维

用离心前胶原原液和离心沉淀后上清液的胶原蛋白浓度，按胶原蛋白浓度35mg/ml计算出离心后胶原纤维的匀浆液半成品的体积；

公式：匀浆液半成品体积=（胶原原液浓度*胶原原液体积-离心上清液浓度*上清液体积）/35

用确定后匀浆液的体积，按盐酸利多卡因浓度3mg/ml计算出盐酸利多卡因需要量：公式：盐酸利多卡因溶液量=匀浆液半成品体积*3/20；

将胶原纤维沉淀分别转入胶原纤维匀浆乳化器中；

加入生理食盐水和盐酸利多卡因溶液，最终定容到计算量体积；

利用胶原纤维匀浆乳化器的乳化头另一只胶原纤维匀浆乳化器的乳化头进行连接，推动胶原纤维通过胶原纤维匀浆乳化器的乳化头多次,使胶原纤维充分匀浆混匀。