CN103648508A - 病毒灭活的血小板提取物及其用途和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒安全血小板提取物及其制剂和用途。所述提取物包含生物活性血小板衍生因子的混合物。有利的是，所述提取物包含比例平衡的因子并且为不可凝固的。

Description

病毒灭活的血小板提取物及其用途和制剂

技术领域

本发明涉及来源于多个供体的病毒灭活的血小板提取物及其制剂和用途。

背景技术

血小板是在止血和愈合中发挥着基本作用的小的、形状不规则的无核细胞。血小板包含一整套预先合成的蛋白，其中包括信号蛋白、细胞骨架蛋白、膜蛋白和调节蛋白。它们涉及在损伤部位处的组织再生和愈合过程的关键阶段，这主要是由于包含多个生物活性分子(包括生长因子(GF)、细胞因子和趋化因子)的血小板颗粒的含量。诸如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等血小板GF是在全部以下伤口愈合级联阶段中的关键作用者：炎症、增殖和重塑阶段。

研究已表明，血小板衍生的GF刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖(中性粒细胞和巨噬细胞)、胶原合成、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮形成和趋化作用。

血小板通常通过输注用于例如促进止血。最近，血小板越来越多地以富血小板血浆(PRP)的形式使用，其也称为PRP凝胶、血小板凝胶、PRP凝块等。通常，PRP是由在有限体积的血浆中浓缩的自体血小板构成的间接体内制剂(Lacci KM，Dardik A.Platelet-rich plasma：support for its use in woundhealing.Yale J Biol Med.2010年3月；83(1)：1-9)。

对于局部施用，PRP通常通过添加凝血酶和/或CaCl₂从而通过凝血酶(内源性或外源性的)与纤维蛋白原之间的相互作用形成纤维蛋白凝胶而活化。活化时，血小板发生活性脱颗粒作用并释放出各种调节剂，包括GF(Lacci KM，Dardik A，2010)。PRP的注射用途目前构成了小但快速成长的细分市场。将PRP用于软和硬组织填充的基本原理是其可能增强不愈性损伤中的组织再生、加速伤口成熟、血管化和上皮化、减少疤痕形成以及减少术后并发症和发病率(Lacci KM，Dardik A，2010)。

连同各种细胞类型使用活化的PRP的研究已表明从PRP释放的因子(如，生长因子)可诱导细胞增殖[(如Kanno等人，Platelet-rich plasmaenhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation.J OralMaxillofac Surg.2005年3月；63(3)：362-9；Bertrand-Duchesne等人，Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelialcell proliferation in vitro.J Periodontal Res.2010年2月；45(1)：87-93；Kakudo等人，Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts.Plast Reconstr Surg.2008年11月；122(5)：1352-60)，调节人内皮细胞的血管生成能力(Sulpice等人，Cross-talk between the VEGF-A and HGF signalling pathways in endothelial cells.Biol Cell.2009年9月；101(9)：525-39；Rughetti等人，Platelet gel-releasedsupernatant modulates the angiogenic capability of human endothelial cells.BloodTransfus.2008年1月；6(1)：12-7)，并且引发骨诱导性能(Intini G.The useof platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy.Biomaterials.2009年10月；30(28)：4956-66)]。此外，据发现，在与胎牛血清支持的水平相当或更高的水平下，活化的PRP支持体外细胞生长并维持许多目标细胞的活力，所述目标细胞包括骨髓瘤、杂交瘤、肝细胞、成纤维细胞和上皮细胞(Johansson等人，Platelet lysate：a replacement for fetal bovine serum in animalcell culture？Cytotechnology.2003年7月；42(2)：67-74)。

PRP及释放的生长因子目前用于多种组织再生外科手术，主要是骨科和牙科手术(Nurden等人，Platelets and wound healing.Front Biosci.2008年5月1日；13：3532-48)。在骨科手术中，PRP主要用于膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变(见Nurden等人2008年的综述)。牙科学和颌面外科学PRP应用主要包括钛种植体的巩固、上颌窦提升和骨重塑(见Nurden等人2008年的综述)。PRP还越来越多地用于肌腱和韧带修复、面部整形和重建手术、慢性皮肤伤口愈合、眼科学、面神经再生以及心脏和减肥手术(见Nurden等人2008年的综述)。

然而，自体PRP及释放因子的当前应用的主要缺点在于缺乏标准化。值得注意的是，可以商购获得参数(诸如制备时间、血小板收率和采集效率)不同的用于制备PRP的不同人工、半自动和全自动系统(Mazzucco等人，Not every PRP-gel is born equal.Evaluation of growth factor availability fortissues through four PRP-gel preparations：Fibrinet，RegenPRP-Kit，Plateltex andone manual procedure.Vox Sang.2009年8月；97(2)：110-8)。

另一个重要的变量是用于血小板活化的技术[自体、异源或重组凝血酶，氯化钙或巴曲酶(Rozman P，Bolta Z.Use of platelet growth factors intreating wounds and soft-tissue injuries.Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat.2007年12月；16(4)：156-65)]，其可影响颗粒释放效率和分泌的GF的量(Rozman P，Bolta Z，2007)。此外，由于血小板对机械应力和周围环境的变化非常敏感，因此，它们可在预期活化步骤前在加工过程中活化并释放GF(Mazzucco等人，2009)。这种不受控制的活化可进一步增加在使用不同PRP制备系统时最终产品组成的变化。另外，自体PRP制剂的一个主要固有弱点在于血小板GF含量在个体中不同，并因此可导致次佳的结果。最后，当处理自体PRP时，应考虑专用设备、一次性PRP加工试剂盒以及需要经培训的人员所造成的经济负担。

最近的出版物(Su等人，“A virally inactivated functional growth factorpreparation from human platelet concentrates”.Vox Sang.2009年8月；97(2)：119-128)公开了衍生自混合单采捐献血小板的可凝固功能生长因子提取物的制剂。然而，所公开的可凝固制剂具有只包括尤其对包膜病毒而非对无包膜病毒有效的一个病毒灭活步骤(即溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活)的缺点。该出版物指出了应用纳滤作为第二病毒灭活步骤的可能性。该制剂还包含血浆和白细胞蛋白杂质。通过疏水相互作用色谱(HIC)进行的S/D移除步骤大大减少了制剂中的PDGF。此外，制剂的可凝固潜力可限制其在局部施用方面的用途或阻碍其全身性用途。

Bumouf等人(“A novel virally inactivated human platelet lysatepreparation rich in TGF-beta，EGF and IGF，and depleted of PDGF and VEGF”.Biotechnol Appl Biochem.2010年8月6日；56(4)：151-60)公开了具有标准化TGF-β、EGF和IGF含量而不含PDGF和VEGF的经S/D处理的血小板裂解物。该出版物公开了通过疏水相互作用色谱制备这种避免移除SD的裂解物的方法。

需要得自多个供体的包含具有生长因子和/或营养因子活性的蛋白质混合物的病毒安全血小板提取物制剂。

发明内容

血小板包含一整套在组织再生和愈合过程的关键阶段中涉及到的因子。目前，将完整的自体活化血小板(来源于患者)用于促进伤口愈合。然而，使用完整的自体血小板存在多个缺点，特别是缺乏标准化；愈合所需的因子在患者自身的血小板中可能缺乏；需要特殊的设备；程序耗时并且需要患者自身进行的额外步骤；以及需要经过医学培训的人员。这些问题可例如通过使用由多个供体制得的血小板提取物而解决。然而，来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。有效地降低病毒传播风险可通过包括至少两个正交的病毒灭活步骤而实现。另外，血小板提取物的制造过程中的附加步骤可影响其中所含因子的回收率和活性。

本发明解决对得自多个供体的包含具有生长因子和/或营养因子活性的蛋白质混合物的病毒安全(至少双重病毒灭活)血小板蛋白质提取物的长期以来的需要。

本发明涉及活性的并且病毒安全的来源于多个供体的血小板提取物，及其制剂和用途。

病毒安全血小板提取物包含活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。

在一个方面，本发明涉及用于制备病毒安全血小板提取物的方法，该方法包括至少两个正交的病毒灭活处理，例如溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理和热灭活。该方法包括以下步骤：提供来自多个供体的富血小板成分，例如得自多个供体的混合单采经洗涤和/或白细胞减除的血小板成分；

制备血小板裂解物；

进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理；

通过疏水相互作用色谱(HIC)移除S/D，其中HIC包括以下步骤：将裂解物上样到HIC，并收集在非等度条件下洗脱的材料；以及

进行第二正交病毒灭活处理。

在本发明的一个实施例中，制备血小板裂解物在S/D病毒灭活处理过程中进行。

在本发明的又一个实施例中，在S/D病毒灭活处理过程中，例如通过过滤进行减少聚集体的子步骤。

在本发明的某些实施例中，HIC包括以下步骤：将裂解物上样到HIC；用等度溶液洗涤HIC；收集未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC；以及收集洗脱的材料。

另外，在本发明的又一个实施例中，等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。

另外，在本发明的又一个实施例中，在S/D移除前使裂解物与能够结合血小板衍生因子的分子(如肝素、硫酸葡聚糖以及它们的组合)接触。

另外，在本发明的又一个实施例中，将提取物冻干。

在另一方面，本发明涉及可根据本发明的方法获得的病毒安全血小板提取物。

本发明提供来源于多个供体的包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物的病毒安全血小板提取物。

在本发明的一个实施例中，提取物包含PDGF-AB、VEGF和TGFbl，其中PDGF-AB：TGF-b1的比率为至少0.2；和/或PDGF-AB：VEGF的比率为至少45。

在本发明的一个实施例中，提取物富含PDGF-AB和/或bFGF。

在本发明的一个实施例中，提取物为不可凝固的。

在本发明的一个实施例中，提取物具有低聚集体含量。

在本发明的一个实施例中，提取物为固体形式。

在本发明的一个实施例中，提取物提供有由选自以下的天然和/或合成材料制成的递送剂：聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。

在另一方面，本发明涉及该提取物在组织愈合、器官重建、组织再生和/或炎症治疗中的用途。

在另一方面，本发明涉及组织愈合、器官重建和/或组织再生的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的提取物。

在另一方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的提取物。

在本发明的一个实施例中，将提取物通过递送剂施用。

本发明提供通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体混合物中移除溶剂洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤：

提供生物液体混合物；以及

将混合物上样到HIC，收集未结合的材料和非等度条件下洗脱的材料。

本发明还提供通过HIC从生物液体制剂中移除溶剂洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤：

提供制剂；

将制剂上样到HIC；以及

收集非等度条件下洗脱的材料。

在本发明的一个实施例中，生物制剂为血小板衍生的制剂。

在本发明的一个实施例中，方法包括以下步骤：将制剂上样到HIC；用等度溶液洗涤HIC；收集未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC；以及收集洗脱的材料。

在本发明的一个实施例中，方法包括由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成的等度溶液；以及包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子的非等度溶液。

在另一方面，本发明提供可根据本发明的方法获得的病毒安全的制剂或混合物。

而在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括包含根据本发明的提取物、任选地包含递送剂的容器。

在一个实施例中，递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成：聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。

附图说明

图1显示了不同血小板提取物制剂的SDS-PAGE蛋白图谱表征。分子量标记[Bio-Rad161-0374(泳道1)]；人血清白蛋白[Plasbumin25(泳道2)]8μg；得自全血的洗涤血小板(泳道3)11μg；WAP(泳道4)8μg；S/D处理后的WAP(泳道5)14μg；S/D处理并通过SDR HyperD色谱树脂纯化而移除SD后的WAP(泳道6)10μg。

图2显示了用“混合WAP”、“LYO I”处理或未处理(0)的3T3细胞的增殖。实验一式三份地进行。将在饥饿培养基(标记为“0”)中生长的细胞用作对照；***-p＜0.001(t检验分析，与“0”比较)。

图3显示了(A)未处理的对照细胞(在饥饿培养基中生长的细胞)或(B)用LYO I处理的细胞的3T3-Swiss albino细胞形态的代表性光学显微图像(放大200倍)。

图4显示了添加LYO I(B)、2IU/ml凝血酶(C)、LYO I+2IU/ml凝血酶(D)、BAC组分(E)、或LYO I+BAC组分(F)时HUVEC形态的代表性光学显微图像(放大200倍)。(A)未处理的对照细胞。

图5显示了LYO II(▲)或混合的WAP II(■)对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。实验一式三份地进行。

图6显示了在用LYO II、凝血酶(T，孔中最终浓度为1IU/ml)和1IU/ml凝血酶+LYO II诱导后的HUVEC增殖。星号表示通过t检验分析(给出了p值)评价时与无LYO II的相关处理相比显著不同的结果。

图7显示了通过接种在基底膜提取物(BME)包被孔(阳性对照)上的HUVEC获得的血管样结构。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下采集。

图8显示了通过LYO II处理后的HUVEC获得的血管样结构(B)。(A)对照细胞。图片使用530nm荧光滤光片在放大200倍下采集。

图9A-9F显示了接种在纤维蛋白原(A-C)或纤维蛋白包被(D-F)的细胞中并用LYO II(B，E)或混合WAP II(C，F)处理的或未处理的(A，D)HUVEC的形态学外观。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下采集。

图10显示了LYO III或混合的WAP III对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将MasterMix(MM)用作阳性对照。针对通过特异性ELISA评估的PDGF-AB浓度进行归一化。

图11显示了用凝血酶(B；1IU/ml的最终浓度)、纤维蛋白原(C；11.3mg/ml的总蛋白)、LYO III(D)、纤维蛋白(凝血酶和纤维蛋白原)(E)以及纤维蛋白和LYO III(F)处理的HUVEC的形态学外观。A-未处理的对照细胞。图片使用530nm荧光滤光片在放大100倍下采集。

图12显示了在不同处理后的3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖水平。将MasterMix(MM；◆)用作参照。针对通过特异性ELISA评估的PDGF-AB浓度进行归一化。所有测试均一式三份地进行。

图13显示了通过LYO IV(B)、混合的WAP IV(C)和MasterMix(MM；D)诱导后的3T3-Swiss albino形态学外观。(A)未处理的细胞。图片使用相差显微镜在放大200倍下采集。

图14A-O显示了通过3T3-Swiss albino成纤维细胞进行的体外刮伤测定的代表性相差图像(放大100倍)。将细胞铺在不同的表面(未包被(A，D，G，J，M)、胶原蛋白(B，E，H，K，N)或纤维蛋白原(C，F，I，L，O)包被的孔)上，并用p200吸头刮伤。在用LYO IV(G，H，I)、混合的WAP IV(J，K，L)或PRP-R(M，N，O)处理后“0”(A，B，C)和24小时(D-O)时间点捕获伤口。

图15显示了在不同的处理组中开始处理后24小时表示为剩余百分比的伤口闭合定量评估。将细胞铺在不同的表面(未包被、胶原蛋白或纤维蛋白原包被的孔)上，并在通过p200吸头将单层刮伤后用LYO IV、混合的WAP IV或PRP-R处理。将剩余的伤口百分比计算为各位置中24h后的剩余距离与开始距离的比率。结果表示为6个重复样的平均值±S.D.。进行了t检验分析，统计显著性经确定为p＜0.05。*根据每个表面的与未处理的孔(0)比较)；#与未包被表面上的相关处理比较。

图16显示了接种在BME包被孔上并用LYO IV(B)或混合的WAP IV(C)处理的HUVEC的形态学外观。(A)接种在BME包被层上的未处理的HUVEC。图片使用530nm荧光滤光片在放大60倍下采集。

图17显示了LYO V或混合的WAP V对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将重组的人PDGF-AB用作对照。

图18显示了LYO VI或混合的WAP VI对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。将混合的PRP释出液(releasate)用作对照。

图19显示了LYO VI和混合的WAP VII；或LYO VII和混合的WAPVII对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖作用。

具体实施方式

本发明涉及来源于多个供体的活性和病毒安全(至少双重病毒灭活)的血小板提取物及其制剂和用途。病毒安全血小板提取物包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。

根据本发明发现，经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)相对于得自全血捐献的洗涤血小板包含极少量的白蛋白并可能包含少量的其他血浆杂质。还发现，经受S/D处理(裂解和病毒灭活)、S/D移除、冻干和复原(如LYO I提取物)的WAP具有生物活性并且能够诱导例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或3T3成纤维细胞的细胞系中的增殖和/或形态变化，例如血管样结构的形成(与血管生成相关)或纺锤样结构的形成(运动性增强的属性)。据观察，提取物的活性可通过添加凝血酶、生物活性组分(BAC；如EVICEL^TM纤维蛋白密封剂中的纤维蛋白原组分，(OmrixBiopharmaceuticals Ltd.))或凝血酶+BAC(纤维蛋白)而增强。

来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。通常采取多种措施以便最大程度降低病毒和/或未知病原体传播的风险，包括对捐献样品是否存在某些病毒的常规测试以及制造工艺过程中的病毒灭活/移除步骤。有效降低病毒传播风险可通过包括至少两个不改变产品有益性质的正交病毒灭活步骤而实现。诸如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和西尼罗河病毒的脂质包膜病毒通过破坏病毒脂膜的S/D处理而被快速有效地灭活。

接着，让提取物经受第二病毒灭活处理，例如热处理(巴氏灭菌)步骤或纳滤。根据本发明发现，提取物不能轻易地通过纳滤系统。

令人惊讶地，根据本发明发现，热处理(巴氏灭菌)病毒灭活步骤是可行的并得到生物活性提取物(例如LYO II)，如通过细胞增殖测定法和形态变化诱导(例如诱导血管生成或诱导纺锤样形状)测定法所测试。据发现，凝血酶、纤维蛋白原或纤维蛋白的添加显著增强了提取物活性(通过促进管状结构形成的纤维蛋白原或纤维蛋白的添加，以及通过增强增殖的凝血酶)。

在本发明的一个实施例中，对于热处理，让S/D处理的材料经受稳定化步骤。可将蔗糖和甘氨酸添加到溶液中，用作巴氏灭菌步骤过程中的稳定剂。然后可例如在恒定混合下通过60±0.5℃热处理9至10.5小时进行溶液的巴氏灭菌。接着可将溶液例如用醋酸盐-甘氨酸缓冲液稀释，并可例如通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液渗滤而从溶液中除去稳定剂。如果存在聚集材料，则可通过一个或多个连续过滤阶段(例如使用20、5和1.2μm过滤器，然后使用0.45μm过滤器)过滤而移除。可使用0.2μm过滤器在无菌条件下进行无菌过滤。可将溶液在经过高压灭菌的小瓶中冻干，然后在氮气氛围下并以部分真空(0.6巴)用经过高压灭菌的橡胶塞密封。

根据本发明发现，双重病毒灭活的提取物与原料浓度相比可浓缩(例如在LYO III中)例如4倍或32倍。浓缩可例如通过溶液渗滤和/或将冻干提取物以与冻干前的提取物体积相比较低的体积复原而实现。

如果存在聚集材料，则可通过如上所述的连续过滤而移除。据发现，浓缩的提取物(例如LYO III)包含极低量的血浆蛋白。据发现，浓缩的提取物(例如LYO VI和LYO VII)为不可凝固的。提取物表现出具有少量水平的或完全不存在凝血蛋白。浓缩的提取物不含生理活性的纤维蛋白原，因为生理活性的纤维蛋白原的水平无法通过本领域目前使用的灵敏方法加以检测。如通过非活化的部分凝血活酶时间测量试验(NAPTT)所评估，提取物缺乏促凝活性。NAPTT可基本上如European Pharmacopoeia7.0.；2.6.22：Activated coagulation factors monograph(01/2008：20622)；in EuropeanPharmacopoeia Strasburg(France)，Council of Europe，2009中所述而进行。不存在凝血因子还通过活化的部分凝血活酶时间(APTT)测试加以确定。该测试表明，根据本发明的血小板提取物缺乏凝血因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II和I中的一种或多种，从而使得提取物为不可凝固的。

根据本发明发现，提高提取物的浓度影响了3T3-Swiss albino小鼠成纤维细胞的增殖水平，当归一化到样品中存在的PDGF-AB量时浓缩提取物的影响比原料裂解物的影响更显著。要注意的是，浓缩提取物的影响比阳性对照(MasterMix，通过TGF-β1 200ng/ml、b-FGF0.5ng/ml、VEGF5ng/ml和PDGF-AB300ng/ml制备的重组人生长因子的定制混合物)更显著。另据发现，向人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层添加浓缩提取物促进了管型形成。通过添加结合纤维蛋白密封剂的浓缩提取物，显示出了HUVEC单层的管型形成中的协同效应。

对于最佳的S/D病毒灭活，可在S/D处理过程中增加聚集体移除子步骤(例如，如在LYO IV中所进行的)。聚集体移除可例如通过离心、过滤、制备性尺寸排阻色谱(SEC)、超滤(例如使用100KD聚醚砜(PES)膜、100KD聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、300KD PES膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜)和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。

任选地，包括通过添加氯化钙或其他钙盐并澄清过滤而进行的聚集体移除附加步骤。例如，可添加40mM最终浓度的氯化钙(以促进聚集体沉淀)，然后例如使用20、5、1.2和0.45μm过滤器进行澄清过滤。在一个实施例中，在S/D处理后增加该步骤。

根据本发明发现，这些聚集体移除附加步骤是可行的并得到生物活性提取物。具有低聚集体含量的血小板提取物可有利地用于静脉内施用。另外，具有低聚集体含量的血小板提取物可与包含相对高浓度钙的组分一起使用。

据发现，在包含成纤维细胞的未包被的细胞培养孔中以及在胶原蛋白或纤维蛋白原包被的孔中，用经受了聚集体移除的提取物处理细胞以与原料裂解物以及与PRP-R[PRP-释出液，通过钙和凝血酶(得自EVICEL^TM)活化]相似的方式促进了成纤维细胞运动和伤口闭合(在刮伤测定中)。据报道，PRP-R在体内环境中有益于伤口愈合(Lacci KM，Dardik A，2010)。

此外，根据本发明发现，经受了聚集体移除的提取物诱导了与血管生成相关的HUVEC强形态变化。

根据本发明发现，某些血小板因子可在S/D移除步骤过程中通过增加在S/D移除所用HIC柱中的至少一个洗脱步骤并通过也收集洗脱的材料而加以回收。一个这样的因子为PDGF-AB。据发现，根据本发明通过用非等度溶液洗涤HIC，可以得到至少3倍的PDGF-AB回收或富集(如在LYOV、VI和VII中)。在用4ml重蒸馏水(DDW)复原后测量了最终冻干材料中的PDGF-AB浓度。据发现，PDGF-AB的浓度在LYO VI中为4,578pg/ml，在LYO V中为15,028pg/ml并且在LYO VII中为194,353pg/ml，它们对应于用作原料的每个血小板为约7×10^-7pg(在LYO VI中)、2.26×10^-6pg(在LYO V中)以及3.12×10^-5pg(在LYO VII中)的PDGF-AB。要注意的是，富含PDGF-AB的提取物对细胞增殖的影响比单独的重组PDGF-AB更显著，从而表明血小板的其他提取组分可协同地增强成纤维细胞增殖。使用本发明的方法富集/增加的另一个因子为bFGF(也称为FGF-2或b-FGF)。另据发现，根据本发明通过用非等度溶液洗涤HIC，可以得到至少1.8倍的bFGF回收或富集(如在LYO VI中)。据发现，bFGF的浓度为36-127pg/ml，对应于用作原料的每个血小板为约5.4×10^-9至1.95×10^-8pg的bFGF。

这些发现为制备根据本发明的提取物铺平了道路。本发明的提取物包括以下特征中的一个或多个：包含具有生长和/或营养因子(例如TGF-b1、b-FGF、VEGF和PDGF-AB)的蛋白质，其组成比本领域已知的其他血小板因子混合物更平衡；为双重病毒灭活的，例如经S/D处理和巴氏灭菌的；具有降低的聚集体含量；包含与相同因子的生理比例相似的因子比例；包含TGF-b1、VEGF与PDGF-AB之间的生理平衡比例；以及表现出减少的血浆杂质(例如降低的IgG和纤维蛋白原水平)。

术语“生理平衡比例”是指例如PDGF-AB：TGF-b1和/或PDGF-AB：VEGF之间的比例，该比例与血小板、浓缩血小板、混合血小板、白细胞减除血小板、混合的白细胞减除血小板、洗涤血小板、白细胞减除的洗涤单采血小板(WAP)制剂、血小板提取物、富血小板血浆释出液(PRP-R)、血清和/或血小板释出液的生理组成中这些因子的比例相似。“血清”通常是指包含通过活化的血小板释放的生长/营养因子而不含纤维蛋白原或其他凝结因子的血浆。就血清而言，生理比率可根据血清中存在的生长/营养因子值(根据商业ELISA试剂盒的包装说明书)来计算。在这样的例子中，据发现，PDGF-AB：TGF-b1和PDGF-AB：VEGF之间的生理比率分别为0.5和90.9。

在一个实施例中，WAP(原料)中PDGF-AB：TGF-b1之间的生理比率为至少0.2或在约0.2至约0.5的范围内，诸如约0.2、0.3、0.36、0.4、0.44和0.47。

在另一个实施例中，WAP(原料)中PDGF-AB：VEGF之间的生理比率为至少45或在约45至约103的范围内，诸如约45、64、73、76和103。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的提取物包含至少0.2的PDGF-AB：TGF-b1比率；和/或至少45的PDGF-AB：VEGF比率。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的提取物包含至少约0.56的PDGF-AB：TGF-b1比率；和/或至少约74的PDGF-AB：VEGF比率(如在LYO VII中)。

根据本发明的提取物具有以下优点中的一个或多个：为标准化的，并允许稳健的(一致的)生物性能；在细胞中表现出生物活性，例如诱导增殖和/或形态变化；在与单独的重组PDGF-AB的浓度相比较低的PDGF-AB浓度下表现出增加的活性，从而降低非增殖组织中转化变化的可能性；具有最佳的病毒安全性；具有改善的免疫安全性，例如因其相对于通过富含血小板的成分(未经受血浆蛋白移除步骤，例如洗涤步骤)制得的提取物包含低水平的血浆杂质；并且为不可凝固的。

术语“病毒安全血小板提取物”是指经受了至少两次正交病毒灭活处理的提取物。

“至少两次正交病毒灭活处理”涉及执行至少两次用于灭活病毒的不同和独立处理。可以使用以下非限制性处理例子中的两种或更多种的组合：巴氏灭菌、溶剂洗涤剂(S/D)、纳滤、低pH处理、紫外线辐照和硫氰酸钠处理。

术语“灭活病毒或病毒灭活”是指其中将病毒维持在溶液中但使之无活性(例如通过溶解其脂质衣壳)的情形；和/或其中将病毒例如通过尺寸排阻技术从溶液中物理移除的情形。

术语“血小板提取物”是指包含血小板衍生因子的混合物。通常，提取物不含细胞。

术语“裂解物”是指当细胞通过破坏其细胞膜而毁坏时产生的溶液。

术语“活性血小板提取物”是指包含诸如生长因子和/或营养因子的生物活性物质并表现出包括但不限于诱导细胞增殖、细胞运动性、细胞间相互作用和/或细胞形态变化的生物活性的血小板提取物。

术语“来源于多个供体的血小板提取物”是指由至少两个个体制得的血小板提取物。个体可以是人或其他哺乳动物。

术语“生长因子”通常是指促进细胞生长、增殖和/或分化的物质。生长因子的例子包括但不限于转化生长因子(TGF)(例如TGF-b1)、成纤维细胞生长因子(FGF)(例如bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)(例如PDGF-AB)等。

术语“营养因子”通常是指刺激细胞分化和/或存活的物质。营养因子的例子包括但不限于粘附分子、骨形态发生蛋白、细胞因子、eph受体酪氨酸激酶、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、GDNF、肝素结合生长因子、胰岛素样生长因子、神经营养因子、脑信号蛋白、转化生长因子(TGF)β、酪氨酸激酶受体配体等。

血小板因子可具有生长活性和营养活性。

术语“聚集体”是指包含诸如蛋白质聚集体的固体的一大块材料。蛋白质聚集可在生物治疗剂的制造过程中遇到(Protein aggregation andbioprocessing.Cromwell ME，Hilario E，Jacobson F.AAPS J.2006年9月15日；8(3)：E572-9，综述)。蛋白质的聚集体可以为可溶/不溶、共价/非共价、可逆/不可逆和/或天然/变性蛋白质的形式。如果需要，例如，对于静脉内施用，聚集体可通过本领域已知的不同技术从提取物中移除，例如通过离心、过滤、制备性尺寸排阻色谱(SEC)、超滤(例如使用100KD聚醚砜(PES)膜、100KD聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、300KD PES膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜)和/或通过本领域已知的任何其他方法。

有利的是，在本发明的一个实施例中，提取物表现出低聚集体含量并可用于静脉内施用。在本发明的一个实施例中，聚集体水平(浊度)可根据以下公式计算：

如上所述测得的低于≤0.03OD₃₂₀/毫克蛋白质的提取物水平可被视为具有低聚集体含量的提取物。在本发明的一个实施例中，聚集体含量在约0.01(检测限)至等于0.03OD₃₂₀/毫克蛋白质的范围内。

术语“血浆杂质”是指例如凝血酶、纤维蛋白原、纤粘蛋白、血管性血友病因子、因子II、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和IgG。

低水平的血浆杂质是指例如不可检测水平的生理活性凝血酶(通过凝结时间)；不可检测水平的生理活性纤维蛋白原(通过凝结时间)；低于约0.13或低于约0.034mg/ml的纤维蛋白原(通过ELISA)；低于约0.004或0.001mg/ml的纤粘蛋白；不可检测水平的生理活性血管性血友病因子；低于约0.0013或0.0014IU/ml的因子II；低于约0.008或0.009IU/ml的因子VII；不可检测水平的生理活性因子VIII；不可检测水平的生理活性因子IX；低于约0.003IU/ml的因子X；不可检测水平的生理活性因子XI和因子II；以及低于约0.076或0.011mg/ml的IgG。在本发明的一个实施例中，纤维蛋白原浓度(通过ELISA)在0.01至0.1mg/ml的范围内；纤粘蛋白浓度在0.002至0.02mg/ml的范围内；因子VII浓度在0.001至0.01IU/ml的范围内；因子X浓度在0.001至0.01IU/ml的范围内；并且IgG浓度在0.01至0.1mg/ml的范围内。表现出不可检测水平的凝结因子和/或蛋白质血浆杂质的提取物被视为不含这些因子/蛋白质。

“溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理”通常是指通过破坏其脂质包膜而使包膜或脂质衣壳病毒灭活的过程。处理可通过添加洗涤剂(诸如Triton X-45、Triton X-100或Tween80)和溶剂[诸如磷酸三正丁酯(TnBP)、二或三烷基磷酸酯]而进行。用于灭活脂质衣壳病毒的溶剂-洗涤剂组合可以为本领域已知的任何溶剂-洗涤剂组合，诸如TnBP和Triton X-100、Tween80和胆酸钠以及其他组合。

所用的一种或多种溶剂/一种或多种洗涤剂浓度可以是本领域中常用的那些，例如如US5094960A、US4789545A中所实施。在本发明的一个实施例中，使用＞0.1％TnBP与＞0.1％Triton X-100的组合。在本发明的另一个实施例中，使用1％Triton X-100与0.3％TnBP的组合。通常，溶剂-洗涤剂灭活病毒所处的条件包括：10-100mg/ml的溶剂洗涤剂，5-8范围内的pH水平，2-37℃范围内的温度，持续30分钟至24小时。然而，其他溶剂洗涤剂组合和合适的条件将对本领域的任何技术人员显而易见。

“巴氏灭菌”通常是指热破坏脂质包膜和无包膜病毒两者的过程。“巴氏灭菌”可与术语“热灭活”互换。热灭活可在59.5至60.5℃范围内的温度下进行9至10.5小时的一段时间，例如灭活可在60℃下进行10小时。可在巴氏灭菌步骤过程中将诸如蔗糖和甘氨酸的稳定剂添加到血小板裂解物中。

“纳滤”通常是指通过使用诸如Planova^TM20N、35N和75N，Viresolve/70^TM、Viresolve/180^TM的纳米级过滤器将脂质包膜和无包膜病毒从样品中排除的过程。过滤器可具有小于70nm，优选地介于15nm和50nm之间的孔尺寸。然而，具有足以从样品中减少或消除病毒的孔尺寸的任何膜均可用于纳滤。通过纳滤移除的病毒可以为包膜病毒[例如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒、西尼罗河病毒、细胞巨化病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒]和无包膜病毒(例如甲肝病毒、细小病毒B19(paravirus B19)、脊髓灰质炎病毒)。

低pH处理通常对包膜病毒有效。在本发明的一个实施例中，使血小板裂解物经受低pH(通常经受为4的pH)并持续介于6小时与21天之间的任何时间。“低pH处理”可与术语“酸性pH灭活”互换。

术语“活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物”是指包含至少4种不同的血小板衍生因子例如生长因子和/或营养因子的组合物。在本发明的一个实施例中，所述因子为TGF-b1、b-FGF、VEGF和PDGF-AB。

通常，本发明的提取物为不可凝固的并且表现出低水平的血浆杂质，例如低IgG和/或低纤维蛋白原水平。诸如低于3mg/ml的IgG和低于0.98mg/ml的纤维蛋白原，例如等于或低于约0.076mg/ml的IgG以及等于或低于约0.034mg/ml的纤维蛋白原。

术语“不可凝固的”是指不能单独地通过将提取物与活化剂(诸如凝血酶)混合而生成凝块的血小板提取物。“活化剂”是指能够由纤维蛋白原形成纤维蛋白的试剂，诸如凝血酶和/或可得自蛇毒的溶液。

本发明提供包含具有生长和/或营养因子(例如TGF-b1、b-FGF、VEGF和PDGF-AB)的蛋白质的病毒安全血小板提取物，其具有与其他血小板因子混合物相比更平衡的组成。

“更平衡的组成”是指得自多个供体并包含至少四种不同的具有生长因子活性和/或营养因子活性(诸如TGF-b1、b-FGF、VEGF和PDGF-AB)的蛋白质并且其中富含一种或多种血小板因子(例如PDGF-AB和/或bFGF)的组合物。富含PDGF-AB的提取物可例如包含与在不存在非等度溶液洗涤的情况下经受S/D和HIC法S/D移除的提取物相比至少3倍高的PDGF-AB量，例如约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8倍或更高。富含PDGF的提取物还涉及例如包含与S/D处理前或S/D处理后以及例如HIC法S/D移除前等同材料的PDGF-AB量相似的量/水平的PDGF-AB或包含与原料裂解物中的量相似的量的PDGF-AB的提取物。PDGF-AB富集可通过增加纯化和/或色谱步骤中的PDGF-AB回收率而获得。在一个实施例中，PDGF-AB的富集通过增加HIC步骤中S/D移除期间PDGF-AB的回收率而获得，方式是增添用非等度溶液进行的洗涤。因此，根据本发明的方法允许获得具有高PDGF-AB收率的血小板提取物。

富含bFGF的提取物可例如包含与在不存在非等度溶液洗涤的情况下经受S/D和HIC法S/D移除的相同提取物相比至少1.8倍高的bFGF量，例如约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8倍或更高。富含bFGF的提取物还涉及例如包含与S/D处理前或S/D处理后以及例如HIC法S/D移除前等同材料的bFGF量相似的量的bFGF或包含与原料裂解物中的量相似的量的bFGF的提取物。bFGF富集可通过增加纯化和/或色谱步骤中的bFGF回收率而获得。在一个实施例中，bFGF的富集通过增加HIC步骤中S/D移除期间的bFGF回收率而获得，方式是增添用非等度溶液进行的洗涤。因此，根据本发明的方法允许获得具有高bFGF收率的血小板提取物。

根据本发明的血小板提取物可用于任何治疗性目的。

本发明的提取物适于例如促进受试者中损伤组织的愈合。血小板提取物可按原样用于注射到目标区域中或用于静脉内施用；涂到绷带、泡沫、垫子和基质上/施用到其中，和/或可用于与纤维蛋白密封剂相结合用于局部施用。提取物可从不同的递送剂(诸如绷带、垫子、泡沫和基质)释放进所需的位置中/释放到所需的位置上。所述释放剂可由天然和/或合成材料制成。此类材料的例子包括但不限于聚合物、水凝胶、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)[PHEMA]、琼脂、氧化再生纤维素(ORC)、自组装肽[SAP]、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。

根据本发明发现，在大鼠皮下植入模型[通常用于评估植入组织中的组织反应、血管生成和总体愈合-国际标准化组织(ISO)10993-6，BiologicalEvaluation of Medical Devices-第6部分：Tests for Local Effects AfterImplantation(2007)]中与纤维蛋白密封剂相结合使用根据本发明的提取物导致了植入后7天与使用盐水或单独使用纤维蛋白密封剂相比有更多的血管生成和更佳的总体愈合。将提取物以两种不同的剂量使用，以下是实际施用的多种生长因子的量：TGF-b15.27或52.7ng；PDGF-AB0.1或1.05ng；bFGF0.0024或0.024ng；以及VEGF0.023或0.23ng(与200μl纤维蛋白密封剂一起施用)。已表明，提取物的有益效果为剂量依赖性的。

另据发现，根据本发明的提取物无有害作用，如通过显微镜测定的在植入部位仅存在少量的巨噬细胞和淋巴细胞所确定。

如本文所用，术语“受试者”包括哺乳类动物，包括人。在一个实施例中，受试者为患者。

术语“任何治疗性目的”是指在受试者中进行的用于美容用途、和/或用于任何疾病、障碍或病症的任何治疗或预防性处理。示例性的治疗性目的包括但不限于加速内部或外部伤口愈合，即，与未处理的伤口或与其他已知的伤口处理相比使伤口快速地愈合；治疗任何需要刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖、中性粒细胞和巨噬细胞、胶原蛋白合成、迁移、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮化和趋化性的损伤或病症；需要组织生成、再生或重组、上皮化、形成新血管或血管生成的损伤或病症；减少疤痕形成；降低术后并发症和发病率；愈合皮肤伤口，例如割伤或溃疡。

血小板提取物可用于多种外科领域，诸如但不限于骨外科(例如骨修复、关节软骨修复、膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变)；牙外科；牙科学和颌面外科(例如钛种植体的巩固、上颌窦提升和骨重塑)；肌肉、肌腱和韧带修复；面部整形和重建手术；慢性皮肤伤口愈合、皮肤烧伤愈合、眼科学；面神经再生、外周神经修复、中枢神经系统(CNS)修复(脊柱和/或脑外科)、视神经修复、神经压迫综合征修复、颅神经修复、坐骨神经修复；心脏和减肥手术。

可将提取物施用到患者身体部分的表面上。术语“表面”是指可通过裸眼视力看见的外表面以及为生物体内部解剖结构一部分的体内部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈、手、肘、臀、膝盖的皮肤以及其他皮肤部位。体内部分的例子包括但不限于暴露于外部环境的体腔或解剖学开口以及内部器官，诸如鼻孔；嘴唇；耳朵；生殖部位，包括子宫、阴道和卵巢；肺；肛门；脾；肝和心肌。表面可为出血或未出血的部位。作为另外一种选择，可将提取物通过注射例如真皮内、腹膜内、皮下、鞘内、胸骨内、颅内、肌内和/或静脉内注射施用。也可通过输注施用提取物。

术语“治疗有效量”是指预防或治疗(缓解一种症状或所有症状)疾病、障碍或病症所需的剂量。有效量可基于病程响应组合物的施用发生的任何变化进行测量。有效剂量可根据受试者的年龄和体重、疾病及其严重性(如早期或晚期)以及本领域技术人员可认识到的其他因素而变化。

提取物还可以包含药学上可接受的赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到提取物中的惰性物质。可添加赋形剂例如以便确保活性物质在贮存时保持其化学稳定性和/或生物活性，以有助于制造过程和/或出于美观原因(如，颜色)。所添加的赋形剂通常是安全且无毒的。

根据本发明的血小板提取物可结合外科密封剂使用。不同类型的外科密封剂可与血小板提取物结合使用，包括但不限于生物密封剂(诸如通过纤维蛋白原和凝血酶组分制成的纤维蛋白密封剂)；合成密封剂，诸如丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯和聚乙二醇(PEG)聚合物；以及例如由生物和合成材料的组合制成的半合成密封剂，诸如明胶-甲醛-间苯二酚(GFR)胶。在本发明的一个实施例中，将血小板提取物与纤维蛋白密封剂组分结合使用。在本发明的另一个实施例中，将血小板提取物与合成密封剂一起使用。

本发明提供试剂盒。该试剂盒可包括包含根据本发明的提取物的容器。提取物可以为固体形式、作为溶液或为冷冻形式。在以固体形式提供提取物的情况下，试剂盒还可包括具有用于复原固体提取物的药学上可接受的载体的容器。试剂盒还可包括用于将提取物注射进患者体内的一个或多个注射器和/或注射器针头。试剂盒可包括使用说明。说明可介绍将提取物施用给患者的方式。本发明还涉及包括包含纤维蛋白密封剂或合成密封剂的组分的容器、包含本发明提取物的容器和使用说明的试剂盒。任选地，本发明的提取物可在一种纤维蛋白密封剂组分的容器中。另外，本发明涉及包括包含冻干提取物的容器、包含复原溶液或载体的容器以及使用说明的试剂盒。

纤维蛋白密封剂组分可由血液组合物制成。血液组合物可以是全血或血液成分，即全血制品，例如血浆。

在本发明的一个实施例中，纤维蛋白原组分由作为来源于血浆的蛋白质溶液的生物活性组分(BAC)组成，该溶液还可以包含氨甲环酸和精氨酸或赖氨酸或精氨酸和赖氨酸混合物，或其药学上可接受的盐。BAC可衍生自冷沉淀物，尤其是浓缩的冷沉淀物。术语“冷沉淀物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)解冻，导致形成包含纤维蛋白原和因子XIII的沉淀的上清液时，可获得冷沉淀物。可例如通过离心收集沉淀物。BAC溶液还包含因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等，例如如US-B-6,121,232和WO9833533中所述。

BAC的组合物可包含稳定剂，诸如盐酸精氨酸。通常，BAC中纤维蛋白原的量在约40mg/ml至约60mg/ml的范围内。BAC溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约110mg/ml。盐酸精氨酸的量可为约15mg/ml至约25mg/ml。

任选地，将溶液缓冲到生理相容的pH值。缓冲液可由甘氨酸、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙和作为载体的注射用水组成。甘氨酸可按约6mg/ml至约10mg/ml的量存在于组合物中，柠檬酸钠可在约1mg/ml至约5mg/ml的范围内，氯化钠可在约5mg/ml至约9mg/ml的范围内，并且氯化钙可在约0.1-0.2mg/ml的浓度范围内。

在另一个实施例中，将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低至等于或低于15μg/ml，例如5μg/ml或更低的纤溶酶原，例如使用如US-B-7,125,569和WO02095019中所述的方法。在这种情况下，不需要向BAC中添加氨甲环酸、抑肽酶或任何其他纤溶抑制剂。

还可能的是，纤维蛋白密封剂包含促进凝块形成的组分，诸如Ca²⁺、因子VIII、纤粘蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(vWF)，它们可作为单独的组分提供或与纤维蛋白密封剂组分一起配制。

来源于血液组合物的纤维蛋白密封剂组分通常由感染性粒子纯化而得。纯化程序可通过纳滤、溶剂洗涤剂处理和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。

术语“感染性粒子”是指可在生物有机体细胞中感染或繁殖的微观粒子，例如微生物或朊病毒。感染性粒子可以是病毒粒子。

根据本发明制备的血小板提取物可与多种细胞类型结合使用，例如成纤维细胞和干细胞(例如内皮干细胞，如HUVEC)。细胞类型可根据预期的治疗性用途加以确定。例如，对于椎间盘再生，可以使用包含来源于脊索的细胞的细胞组合物。对于诱导血管生成，可以使用内皮干细胞。

本发明的血小板提取物可通过包括至少两次不同的病毒灭活处理并包括以下步骤的方法制备：获得来自多个供体的富含血小板的成分；裂解血小板；进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理；通过疏水相互作用色谱(HIC)移除S/D；以及进行第二正交病毒灭活处理，例如巴氏灭菌。HIC包括以下步骤：将裂解物上样到HIC，并收集在非等度条件下洗脱的级分。

将裂解物上样到HIC可通过使裂解物与充填在柱内的HIC树脂接触而进行。

术语“裂解物与HIC树脂之间的接触”以其最广泛的含义使用并指例如将裂解物与树脂靠得足够近使得将在树脂与裂解物内存在的S/D材料之间发生结合相互作用的任何类型的结合操作。

本发明提供用于制备病毒安全血小板提取物的包括至少两次正交病毒灭活处理的方法，该方法包括以下步骤：提供来自多个供体的富含血小板的成分；制备血小板裂解物；例如在减除了聚集体的裂解物中进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理；通过包括以下步骤的HIC移除S/D：将裂解物上样到HIC，并收集未结合的材料和在非等度条件下洗脱的级分；以及进行第二正交病毒灭活处理。

可从其获得富含血小板的材料的成分包括但不限于血液成分、血浆成分、单采的经洗涤和白细胞减除的血小板以及单采血小板。在一个实施例中，将通过多个供体混合的经洗涤和/或白细胞减除的血小板用作制备血小板提取物的原料。

有利的是，使用经洗涤血小板作为原料使得能够获得如上所定义具有减少的血浆杂质的不可凝固的血小板提取物。

通常，术语“血小板原料”涉及用于本发明方法的得自多个供体的富含血小板的成分。富含血小板的成分可例如从多个单位的全血、从血液成分和/或从血浆成分分离。富含血小板的成分可得自单采捐献样品。原料可以为经洗涤的和/或白细胞减除的。在本发明的一个实施例中，富含血小板的成分经洗涤和减除白细胞并得自单采捐献样品。在一个实施例中，单采的白细胞减除采集单位中的最低血小板数为约或高于3.0×10¹¹，如“Circular ofInformation for the Use of Human Blood and Blood Components”中所说明。

术语“经洗涤血小板”是指经受了洗涤步骤的血小板。在洗涤程序过程中，还可能丧失血小板。洗涤可使用含有或不含少量右旋糖的0.9％氯化钠进行。洗涤程序可如“Circular of Information for the Use of Human Bloodand Blood Components”中所详述的进行。在本发明的一个实施例中，洗涤如下进行：在温和条件下离心血小板材料单位。然后，弃去上清液，将血小板沉淀用盐水在温和条件下洗涤至少两遍(在洗涤之间进行离心)。可将经洗涤和重悬的血小板冷冻，直到用于本发明的方法。

术语“白细胞减除的”是指比全血中的白细胞含量低的白细胞含量(全血中的含量为每单位血液约1至10×10⁹个白细胞)。可将任何白细胞减除方法(例如通过过滤)用于获得白细胞减除的单位。白细胞减除可在单采过程中进行。在本发明的一个实施例中，将包含少于约8.3×10⁵个白细胞的血小板单位用作制备血小板提取物的原料。在另一个实施例中，将包含少于约5×10⁶个白细胞的白细胞减除的血小板单位用作制备血小板提取物的原料。

术语“单采”通常是指从单个供体抽取血液，其中将一部分(例如血小板)分离和保留而将其余部分输回供体体内。得自单个供体的一个单位的单采血小板可包含约或高于3.0×10¹¹个血小板。在本发明的一个实施例中，得自单个供体的一个单位的单采血小板包含高达6.0×10¹¹个血小板。

血小板的裂解以及血小板中截留的因子(例如各种血小板生长因子和/或营养因子)的释放可通过冷冻和解冻富含血小板的成分、通过S/D处理、通过超声处理[Slezak等人，(1987)J.Exp.Med.第166卷，第489-505页]、通过弗氏压碎器[Salganicoff等人，(1975)Biochem.Biophys.Acta，第385卷，第394-411页]和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。在本发明的一个实施例中，血小板的裂解通过冷冻和解冻富含血小板的成分然后进行S/D处理而进行。通常，血小板的裂解产生无细胞的血小板裂解物。

在本发明的一个实施例中，提取物制备的第一病毒灭活步骤包括血小板的溶剂-洗涤剂(S/D)处理以消除包膜病毒。S/D处理还促进血小板的裂解并将它们的内容物释放到溶液中。对于最佳的包膜病毒灭活，在S/D处理步骤过程中进行包括聚集体移除(例如，通过过滤)的子步骤。

术语“S/D移除(溶剂-洗涤剂移除)”是指移除S/D处理中所用的大部分溶剂-洗涤剂。移除溶剂-洗涤剂包括使用疏水相互作用色谱柱(HIC)，例如C-18二氧化硅填料和SDR(溶剂-洗涤剂移除)HyperD。S/D移除还可包括油提取步骤。在本发明的一个实施例中，将SDR HyperD用于移除溶剂-洗涤剂，SDR HyperD是一种由二氧化硅小球制成的色谱填料，而珠粒中的孔体积由三维交联疏水性丙烯酸类聚合物填充。SDR HyperD有利地涉及疏水相互作用的混合模式吸附，并与分子排阻效应相关[Guerrier L等人，“Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivatedbiological fluids”.J Chromatogr B Biomed Appl.1995年2月3日；664(1)：119-125]。根据本发明发现，使用SDR+洗脱条件与C-18+洗脱条件相比获得了更佳的结果。在一个实施例中，使用SDR+洗脱条件得到了提高的PDGF-AB回收率。

HIC是指例如用疏水性聚合物树脂基质填充的柱。

疏水相互作用色谱可通过将结合缓冲液中的经S/D处理的裂解物上样到HIC柱而进行。可将柱在上样经S/D处理的裂解物之前例如通过用结合缓冲液洗涤柱而进行平衡。术语“平衡”是指允许和/或调节柱达到特定的缓冲条件，诸如特定的pH水平和离子强度。在一个实施例中，对柱的调节通过在将经S/D处理的裂解物上样到柱上之前将柱用具有预定pH水平和离子强度的平衡缓冲液洗涤而进行。在本发明的一个实施例中，平衡缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及5％(占总体积的体积比)的人血清白蛋白(HSA)。在本发明的另一个实施例中，平衡缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及1％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)。在本发明的另一个实施例中，平衡缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及0.2％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)。而在本发明的另一个实施例中，平衡缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)、0.2％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)和1％的硫酸葡聚糖(占总重量的重量比)。平衡缓冲液可包含约0.2至约5％浓度范围内的HSA(占总体积的体积比)。

术语“结合缓冲液”是指在将经S/D处理的裂解物上样到色谱柱上的过程中所用的缓冲液。通常，用于在对裂解物进行上样之前和/或期间调节柱的平衡缓冲液称为结合缓冲液。在本发明的一个实施例中，结合缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及5％(占总体积的体积比)的人血清白蛋白。在另一个实施例中，结合缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及1％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)。在另一个实施例中，结合缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)以及0.2％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)。而在另一个实施例中，结合缓冲液包含20mM的醋酸钠和10mM的甘氨酸(pH6.8-7.4)、0.2％的人血清白蛋白(占总体积的体积比)和1％的硫酸葡聚糖(占总重量的重量比)。结合缓冲液可包含约0.2至约5％浓度范围内的HSA(占总体积的体积比)。

术语“未结合的材料”通常是指在通过使用用于平衡的相同缓冲液和/或用于将经S/D处理的提取物上样到柱上的缓冲液(“结合缓冲液”)洗涤已上样的柱之后收集到的级分。有利的是，在使用HIC的S/D移除步骤中，在洗涤柱并收集未结合的材料后，采用非等度溶液以提高某些生长因子(例如PDGF-AB和bFGF)的回收率；以获得更为平衡的组成和/或具有生理平衡比例的提取物。就这一点而言，经S/D处理的裂解物中的S/D移除通过以下步骤进行：将经S/D处理的裂解物在结合溶液中上样到HIC上，用等度溶液洗涤，收集包含基本上无S/D的裂解物的未结合材料，接着通过使用洗脱条件收集结合到HIC树脂的PDGF-AB以及可能的其他因子(例如bFGF)。最常见的洗脱条件采用流动相或非等度溶液的组成差异，因而丧失了通过结合溶液形成的因子(例如PDGF-AB)结合环境。

在本发明的一个实施例中，通过使用非等度洗脱条件洗脱结合到HIC树脂的PDGF-AB，在采用HIC进行S/D移除期间，PDGF-AB富集3倍。

术语“洗脱条件”是指使用非等度条件，例如与用于上样和/或平衡柱的溶液或条件不同的溶液或条件，和/或与用于前一步骤的溶液不同的溶液。洗脱条件使得S/D基本上保持与柱结合而因子则被洗脱。根据本发明的方法包括至少一个采用非等度溶液的洗脱步骤。

洗脱条件通常涉及盐浓度的增加。据发现，当使用C-18树脂时，在使用0.3M直至1M NaCl范围内的浓度进行HIC后，洗脱缓冲液中的NaCl浓度与PDGF-AB回收率之间存在正相关性。在1M的浓度下获得了改善的结果(约30％的PDGF-AB回收率)。当使用SDR树脂时，在0.7和1.5M的所有NaCl测试浓度下获得了相似的PDGF-AB回收率。

通过与盐浓度的增加相结合向缓冲液中添加有机溶剂，获得了PDGF-AB洗脱条件的进一步改善。最佳的洗脱条件使得S/D基本上保持与柱结合而大部分因子则被洗脱。

根据本发明发现，在C-18和SDR两种树脂中，通过低于1M的NaCl和/或低于20％的乙醇获得了高PDGF-AB回收率而不显著影响SD移除。

根据本发明发现，除了乙醇和NaCl外，通过在缓冲液中添加能够结合b-FGF的分子(例如肝素)，获得了增加的b-FGF洗脱。当在S/D移除步骤前将裂解物与能够结合生长/营养因子的分子(例如硫酸葡聚糖)一起温育并在存在此分子的存在下进行S/D移除步骤时，获得了用于PDGF-AB和b-FGF回收的最佳结果。

在本发明的一个实施例中，所用的洗脱溶液不同于结合缓冲液，例如不同于包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和0.2％人血清白蛋白的溶液；不同于包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和1％人血清白蛋白的溶液和/或不同于包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和5％人血清白蛋白的溶液。在本发明的另一个实施例中，洗脱溶液包含除醋酸钠、甘氨酸和人血清白蛋白之外的组分。在本发明的另一个实施例中，洗脱溶液包含除20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和0.2％人血清白蛋白之外的组分。在另一个实施例中，洗脱缓冲液包含有机溶剂、盐和/或结合一种或多种生长/营养因子的分子。在另一个实施例中，洗脱缓冲液包含例如10-12.5％浓度的乙醇、例如0.5M-1M浓度的NaCl、例如5IU/ml浓度的肝素和/或例如0.1-1％浓度的硫酸葡聚糖。在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、10％乙醇、1MNaCl和0.2％人血清白蛋白。在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、12.5％乙醇、0.5M NaCl和0.2％人血清白蛋白。在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、12.5％乙醇、0.5M NaCl、5IU/ml肝素和0.2％人血清白蛋白。在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、1％硫酸葡聚糖和0.2％人血清白蛋白。在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、12.5％乙醇、0.5M NaCl、0.1％硫酸葡聚糖和0.2％人血清白蛋白。而在另一个实施例中，洗脱溶液包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA。在本发明的一个实施例中，方法包括不止一个洗脱步骤。在此情况下，洗脱溶液不同于用于前一步骤的溶液并可与结合缓冲液相同。

在本发明的一个实施例中，非等度溶液为包含5％至15％乙醇、0.2M至1.2M NaCl以及0.1％至1.0％HSA(例如0.2％HSA)的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(例如20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH 6.8-7.4)。其他可能的盐为但不限于KCl、MgCl₂、CaCl₂。其他可能的溶剂为但不限于异丙醇、甘油、乙二醇。

根据本发明发现，通过执行以下两个洗脱步骤：I-采用包含12.5％乙醇、0.5M NaCl、5IU/ml肝素[结合一种或多种生长/营养因子的分子]和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)以及II-采用包含10％乙醇、1M NaCl和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)，当与不存在此类洗脱步骤的情况下获得的制剂相比时，可以获得至少3倍的PDGF-AB回收或富集并且可以获得约1.8倍的bFGF回收或富集(如在LYO VI中)。

在本发明的一个实施例中，进行采用非等度条件的两步洗脱。在本发明的另一个实施例中，用于步骤中的至少一个步骤(例如第一步骤)中的非等度溶液包含2至30IU/ml、2-25IU/ml、2-20IU/ml、2-15IU/ml、2-10IU/ml或2-5IU/ml浓度范围内的结合生长因子的分子(诸如肝素)。在本发明的一个实施例中，非等度溶液包含5IU/ml浓度的肝素。

根据本发明还发现，通过在S/D处理后和S/D移除步骤前增添与1％(w/w)最终浓度的硫酸葡聚糖[结合一个或多个生长/营养因子的分子]一起温育的步骤，并通过执行两个洗脱步骤，一个采用包含12.5％乙醇、0.5MNaCl、0.1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)，而另一个在S/D移除步骤期间采用醋酸盐-甘氨酸缓冲液中的1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA，与无此类洗脱得到的制剂相比时，可得到约6.6倍的PDGF-AB回收或富集以及约2.8倍的bFGF回收或富集(如在LYO VII中)。通过这些洗脱步骤，与通过HIC进行S/D移除之前的因子浓度相比，bFGF的回收率可增加到85％而PDGF-AB的回收率可增加到88％。

令人惊讶地，与LYO VI中1.5％的PDGF-AB总体回收率相比，LYOVII中PDGF-AB(得自原料，WAP)的总体回收率为51％。LYO VII中VEGF的总体回收率为73％，相比之下LYO VI中为37％。

在本发明的一个实施例中，本发明的方法还包括在S/D移除步骤之前将裂解物与结合因子(例如生长因子)的分子接触的步骤。结合因子的分子可以例如为最终浓度范围为0.01至1％(例如1％(w/w)的浓度)的硫酸葡聚糖。在这样的实施例中，结合缓冲液除了醋酸钠、甘氨酸和人血清白蛋白外还包含硫酸葡聚糖。在本发明的另一个实施例中，非等度溶液包含最终浓度为0.1％(w/w)的硫酸葡聚糖。

根据本发明发现，洗脱溶液的顺序在PDGF-AB和b-FGF的回收水平中发挥着作用。也就是说，当使用不同的非等度溶液时和/或当改变或颠倒洗脱顺序时，因子的回收率可以变化。

所述分子可以为在接触时生长/营养因子可结合的肝素、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素和其他硫酸化多糖、糖胺聚糖或聚阴离子等。

术语“分子与因子之间的接触”以其最广泛的含义使用并指使分子与裂解物中存在的所关注因子足够靠近使得将在化合物与因子之间发生结合相互作用的任何类型的结合操作。接触可以不同的方式进行，包括但不限于将化合物引入裂解物中。

有利的是，在S/D移除步骤前，将裂解物与结合生长因子和/或营养因子的分子接触导致多种因子(例如PDGF-AB、bFGF)的量升高/富集。

在另一方面，本发明涉及通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体物质中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法。该方法包括以下步骤：将包含S/D的液体上样到HIC，收集未结合的级分以及在非等度条件下洗脱的级分。而在另一方面，本发明涉及通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体物质中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法。该方法包括以下步骤：将包含S/D的液体上样到HIC，以及收集在非等度条件下洗脱的级分。

术语“生物液体物质”或“生物液体混合物”是指得自生物来源的任何类型的液体物质。这通常包括但不限于得自体液的制剂，诸如全血浆或血液成分，例如冷冻耗尽血浆、冷沉淀物、血浆或血清；精液；痰液；粪便；汗液；唾液；鼻粘液；脑脊髓流体；血小板衍生成分，诸如PRP-R；和尿液，以及得自细胞培养物的液体，其包含通过细胞分泌进制剂中的生物物质，或包含最初存在于细胞内并因各种操纵(诸如细胞裂解)而释放到液体制剂中的物质。

在一个实施例中，用于移除S/D的方法可在生物液体制剂病毒灭活的过程中使用。将生物来源的液体制剂(诸如血液和血浆制剂)用作可由其

纯化出多种生物有用化合物的原料。此类化合物的例子包括免疫球蛋白、因子VIII、白蛋白、α1抗胰蛋白酶、因子IX、因子XI、PPSB、纤维蛋白原和凝血酶(凝血酶原)。此外，从得自细胞培养物的生物制剂分离出各种生物产品，诸如激素、生长因子、酶和配体。例如，生物液体制剂的病毒灭活工艺包括以下步骤：

(a)将生物液体制剂用溶剂-洗涤剂组合在足以使脂质衣壳病毒灭活的浓度和条件下进行处理；

(b)通过使(a)中得到的液体制剂在HIC上通过而从液体制剂中移除溶剂-洗涤剂组合；以及

(c)收集未结合的级分和在非等度条件下洗脱的级分。

在另一个实施例中，在步骤(c)中，可以只收集在非等度条件下洗脱的级分。

使用等度溶液通常涉及在液相色谱中使用恒定组成的流动相。“非等度溶液”通常是指例如与用于上样和/或洗涤柱的溶液和/或条件不同的溶液和/或条件，和/或与用于前一步骤的溶液不同的溶液。

为了移除无包膜病毒，可以执行至少第二病毒灭活步骤，例如热处理(巴氏灭菌)。

在某些实施例中，通过在本发明的方法中包括钙补充步骤然后进行澄清过滤而获得聚集体含量的进一步降低。

术语“钙补充”是指向提取物/生物液体物质中添加钙，例如钙盐。钙盐的例子包括但不限于碳酸钙、氢氧化钙、柠檬酸钙、氯磷酸钙、磷酸钙(包括磷酸二钙和磷酸三钙)、氯化钙或它们的组合。钙可按1至100mM的最终浓度补充。在一个实施例中，将CaCl₂以40mM的最终浓度加入提取物中。可在钙补充后在50RPM的混合下将提取物例如在25℃下温育30分钟。

术语“澄清过滤”是指通过过滤从提取物/生物液体物质中移除粒子，诸如聚集体。可以进行多个过滤步骤。例如，可将提取物依次经20、3和0.45μm过滤器过滤。可例如通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。

如果需要，可将通过本发明方法获得的血小板提取物与冷冻保护剂一起配制然后进行冻干。

术语“冷冻保护剂”是指添加到溶液中以便在冷冻过程中保持活性组分(例如生长因子和/或营养因子)的化学稳定性和/或生物活性的物质。冷冻保护剂的非限制性例子包括但不限于碳水化合物，诸如单糖：包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)、半乳糖和核糖二糖(ribosedisaccharidesDisaccharides)：蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖，以及二糖寡糖，另一组为多元糖醇：麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨醇、木糖醇和异麦芽糖醇。除了碳水化合物外，也可以将诸如聚乙二醇(PEG)的其他聚合物用作冷冻保护剂，诸如聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。其他氨基酸和聚胺。

术语“冻干”通常是指冷冻物质然后降低水浓度(例如通过升华到不支持生物或化学反应的水平)的过程。所得的冻干生物材料可贮存相对长的一段时间。在贮存后，可将冻干材料作为粉末使用或可通过添加各种体积的水溶液而复原。在复原过程中添加的体积可与冻干前溶液的体积相似、更低(导致与原料的体积相比提取物浓缩)或更高(导致与原料的体积相比提取物稀释)。

如果需要，可将血小板提取物保持冷冻或固体(例如冻干)状态以长期贮存或作为粉末使用。

例如，可将通过本发明的方法获得的血小板提取物保持在例如-18℃或更低温度下的冷冻状态或固体(例如冻干)状态以长期贮存。还可将血小板提取物例如在2℃至8℃的温度下冷藏。

冻干提取物可作为固体使用或可在使用前在药学上可接受的载体中复原。术语“药学上可接受的载体”是指适于人类施用或适于动物施用的任何稀释剂和/或媒介物。载体可选自本领域已知的任何载体，诸如但不限于盐水、氯化钠溶液、乳酸林格氏溶液(LR)、5％右旋糖的生理盐水溶液以及注射用水。

如果与纤维蛋白密封剂一起施用，则提取物可在密封剂组分之一(凝血酶或纤维蛋白原)中复原或可在另一种稀释剂或媒介物中单独复原。

有利的是，冻干循环和制剂可允许提取物例如在纤维蛋白密封剂中非常快速地复原，例如以便促进需要紧急使用的止血和愈合，因此在该情况下复原有利地在数秒内完成。在本发明的一个实施例中，将白蛋白用在制剂中以允许快速复原。

本发明基于以下举例说明根据本发明的血小板提取物的制备并示出了其活性(在体外和体内条件下)的实验和发现。以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容在此均以引用方式并入。

以下实例为例证性的，而非限制性的。

实例

材料和方法。

经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制剂。

根据“Circular of Information for the Use of Human Blood and BloodComponents”(2009年12月)并遵照适用的联邦法令以及FDA和美国卫生部法规采集并加工血小板材料单位(白细胞减除单采血小板单位)。

每个单位具有大约200ml的体积。基于FDA法规、要求和指南，从经筛查并发现适合捐献可输注血液组分的单个供体抽取每个单位。所包括的单位仅仅是通过采用经FDA批准的试剂盒和方法发现为红血细胞抗体非反应性的并且为以下病毒阴性的单位：乙肝病毒表面抗原；乙肝病毒核心抗原抗体；丙肝病毒抗体；人类嗜T淋巴细胞病毒1型和2型抗体；人类免疫缺陷病毒1型和2型抗体；HIV-1(通过核酸检测(NAT)技术)；HCV RNA(通过NAT)；西尼罗河病毒RNA(通过NAT)；和梅毒血清学检测。一个单采白细胞减除采集单位中的最低血小板数在“信息通报”中有所规定：≥3.0×10¹¹个(单个全血单位中的血小板数≥5.5×10¹⁰)。

将所有单位维持在推荐的输注条件下(参见FDA批准的血液采集、加工和贮存系统的使用说明)直至洗涤步骤。

洗涤程序。

将每个单位按如下方式在无菌条件下洗涤：

1.将每个单位在室温下以4658×g离心6分钟(不使用破碎转子)。在这些温和条件下，避免了细胞的破碎。

2.弃去上清液，将血小板沉淀复溶在200ml无菌对接盐水(dockedsaline)中(一种将液体在封闭系统中的容器之间转移以保持无菌状态的方式)。

3.在步骤1中规定的相同条件下进行第二次离心。

4.弃去盐水，将沉淀的血小板重悬在200ml无菌对接盐水中。

5.将经洗涤和重悬的血小板在-20至-30℃下冷冻。冷冻步骤在从前一步骤起的4小时之内进行。

在血液采集中心(Rock River Valley Blood Center，Rockford，IL/FDA许可证号249)进行白细胞减除单采血小板单位的上文详述的采集和洗涤程序。将最终的WAP袋在制备之日起两个月内提供给实验。单位以干冰冷冻状态接收。

实例1：通过混合的WAP制备并用溶剂洗涤剂(S/D)处理的冻干血小板 提取物。

通过将袋子置于37℃的水浴中30分钟，将9袋WAP(每袋包含大约200ml)解冻。在下一步中，将WAP袋子用70％乙醇擦拭，切开，然后将它们的内容物在室温下(约22℃)倒入不锈钢烧杯中。将烧杯置于搅拌装置上，将混合的WAP材料(约1800ml)在室温下(约22℃)缓慢混合5分钟。在搅拌过程中，将200ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液[200mM醋酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA；目录号32318)；和100mM甘氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA；目录号15527)，pH6.8-7.4]和人血清白蛋白(HSA；最终浓度为占总体积的5％v/v)(Plasbumin25，TalecrisBiotherapuetics，NC，USA；目录号Plasbumin25)添加到混合的WAP中。取出500ml样品(从2000ml中取出)，用溶剂洗涤剂(S/D)处理以灭活脂质包膜病毒(参见下文的程序)。将余下的(1500ml)在-80℃冷冻以便用于后面的分析(“混合的WAP”)。将500ml样品转移到冷的(4℃)不锈钢烧杯中并置于4℃水浴中。使样品经受如下的S/D处理：将1％Triton X-100(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA；目录号20180501)和0.3％磷酸三正丁酯(TnBP；Merck目录号100002)(v/v)混合在一起，然后通过使用连接到RW20顶置式电子搅拌器(IKA-Werke GmbH&Co.，Staufen，Germany)的3叶不锈钢螺旋桨在60RPM的搅拌下缓慢添加到样品中。将样品在4℃下连续搅拌4小时。S/D处理后，将样品依次通过20、10和5μm聚丙烯囊式过滤器(DOL型，MDI Advanced Microdevices Pvt.Ltd.，Ambala，India；目录号分别为DOLX5111DDXX101、DOLX5108DDXX101、DOLX5107DDXX101)以便在S/D移除步骤之前除去粗颗粒碎片。

通过使用填充了80ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp，Porr Washington，NY，USA；目录号20033-015)的XK26/40液相色谱柱(Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare；目录号18-8768-01)结合

自动液相色谱系统(GE Healthcare)进行了S/D的移除。柱长为15cm。整个运行中的流速为10ml/min。将柱通过320ml重蒸馏水(ddH₂0)准备并用240ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠、10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)和HSA(占总体积的5％v/v)平衡。上样(500ml)后，将柱用144ml包含5％HSA v/v的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)洗涤，然后用144ml ddH₂0洗涤。包含未结合样品和洗涤缓冲液的收集到的总流过体积为720ml。将溶于醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)的D-甘露糖醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA；目录号M9546)添加到收集的流过材料中(最终浓度为2％v/v)并用作接下来的冷冻干燥工艺过程中的蛋白质冷冻保护剂。WAP的冷冻和解冻以及使WAP经受S/D处理和S/D移除得到了血小板提取物/裂解物的制剂。

将收集的流过材料等分到经高压灭菌的玻璃小瓶(Fiolax Clear40×22×1mm，Schott，Müllheim，Germany)中(每个瓶中2ml)并根据下表1中详述的循环进行冻干(冻干机Epsilon2-8D，Martin ChristGefriertrocknungsanlagen GmbH，Osterode am Harz，Germany)。

表1：冻干循环。

将冻干材料在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中用经过高压灭菌的橡胶塞(有机硅20mm，West Pharmaceutical Services，Lionville，PA，USA；目录号7001-2742)密封。由混合的WAP制得并用S/D和SDR HyperD色谱树脂处理的冻干血小板提取物在本文中称为“LYO I”。

LYO I中的纯化步骤包括S/D处理的单次病毒灭活步骤。

实例2：不同血小板提取物制剂的蛋白图谱表征。

以下实验的目的在于表征经洗涤的白细胞减除单采血小板的蛋白图谱[未经任何处理的WAP材料(得自上述美国血液采集中心)与得自全血(得自MDA血库)的经洗涤血小板进行比较]；以及研究S/D处理或S/D处理+SDR HyperD色谱树脂纯化是否会影响WAP的蛋白图谱。S/D处理和SDRHyperD色谱树脂纯化如上文所详述进行。在所有情况下，提取物均通过冷冻和解冻血小板并在指明时通过S/D处理而获得。蛋白质图谱分析通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行。每种测试的制剂的蛋白质量如下指定。使用Pierce BCA蛋白质测定(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA；目录号23235)根据制造商的说明测定了总蛋白量。SDS-PAGE程序按以下方式进行：将制剂加到具有Tris甘氨酸运行缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA；目录号161-0772)的4-12％Tris甘氨酸凝胶1.5mm×10孔(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；目录号EC6038BOX)上。所用的运行条件为使用PowerPack300电源(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)保持25mA恒定电流1.5小时。在运行步骤后，将凝胶在2-8℃下用基于InstantBlue Coomassie的染色溶液根据制造商的说明(Expedeon Inc.，San Diego，CA，USA；目录号ISB01L)染色过夜。图1显示了不同制剂的蛋白图谱。

结果表明经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP；泳道4)相对于得自全血捐献的经洗涤血小板(泳道3)包含极少量的白蛋白。在S/D处理之后WAP的带型(泳道5)以及在S/D处理+SDR HyperD色谱树脂纯化之后WAP的带型(泳道6)与原料的带型(即WAP；泳道4)相似。

这些结果表明蛋白质的组成在上述加工步骤过程中未受明显影响。

实例3：LYO I对细胞增殖和细胞形态的影响。

进行了以下实验以研究LYO I(由混合的WAP制得、经S/D处理、经受了SDR HyperD色谱树脂并冻干的冻干血小板提取物-如实例1中详述进行制备)对成纤维细胞增殖的生物学影响。将LYO I对细胞增殖的影响与WAP的影响进行了比较。

细胞增殖测定。

为此，将3T3-Swiss albino成纤维细胞(ATCC，目录号CCL92)以25×10³个细胞/ml(2500个细胞/孔)的浓度铺在经组织培养处理的Costar96孔板(Corning Life Science，MA USA)的100μl充分生长培养基[DMEM(Biological Industries，Israel；目录号01-055-1A)，包含4.5g/l葡萄糖并补充了4mM谷氨酰胺(Biological Industries，Israel；目录号03-020-1B)、10％胎牛血清(FCS；HyClone，USA；目录号SH30070.03)、青霉素(100U/ml)/链霉素(0.1mg/ml)/两性霉素(0.25μg/ml)溶液(P/S/A；Biological Industries，Israel；目录号03-033-1B)]中。将接种的细胞在37℃下在5％C0₂的潮湿气氛中温育。细胞接种24小时后，将充分生长培养基弃去，然后用100μl饥饿培养基将孔洗涤两次，再将100μl新鲜饥饿培养基添加到每个孔中[饥饿培养基：含4.5g/l葡萄糖并补充了4mM谷氨酰胺、1％MEM-EAGLE非必需氨基酸(Biological Industries，Israel；目录号01-340-1B)、1％人血清白蛋白(Plasbumin25，Talecris Biotherapeutics，Germany)和P/S/A(采用上文列出的浓度)的DMEM]。

在更换培养基后24小时通过添加“混合的WAP”(参见上文的制剂)或复原的“LYO I”诱导了增殖。LYO I在0.4ml饥饿培养基中复原(与冻干前的材料相比5倍浓缩)。通过使用Pierce BCA蛋白质测定(参见实例2)测定了总蛋白量。通过ELISA(Quantikine，R&D Systems，MNUSA：人TGF-β1目录号DB100B、人bFGF基本目录号HSFB00D、人PDGF-AB目录号DHD00B、人EGF目录号DEG00)检测了WAP I和LYOI中多种生长因子的浓度，在用WAP I和LYO I处理过的孔中，增殖测定期间孔中存在的量分别如下：TGF-β1-205和350ng/ml；bFGF-260和265pg/ml；PDGF-AB-75和7ng/ml；以及EGF-3和3ng/ml。

在添加WAP或LYO I后48小时通过使用WST-1细胞增殖试剂根据制造商的说明Roche Diagnostics，Mannheim，Germany；目录号11-644-807)评价了增殖，该试剂基于线粒体活性对细胞增殖和细胞活力进行定量。将板在37℃下在5％CO₂的潮湿氛围中温育2小时，然后震摇1分钟。使用ELISA酶标仪针对作为空白的背景对照(无细胞的饥饿培养基)测量了450nm处的样品吸光度。从各值减去在650nm处获得的参考值。

用“混合的WAP”或“LYO”处理过的3T3细胞的增殖率在图2中示出。实验一式三份地进行。将饥饿培养基中生长的细胞(标记为“0”)用作对照[***-p＜0.001(t检验分析，与“0”比较)]。

结果表明，与对照(标记为0)相比，通过添加WAP和LYO I显著提高了细胞增殖率。

细胞形态学。

通过两种不同的细胞系类型监测了LYO I对细胞形态学的影响：来源于新生儿的内皮干细胞的人脐静脉内皮细胞(HUVEC；Lonza Switzerland；目录号C2519A)；和3T3-Swiss albino成纤维细胞。在某些条件下，例如在伤口愈合过程中，成纤维细胞获得纺锤样形状。这些形状是成纤维细胞运动性增强的属性(Park等人，Comparative study on motility of the culturedfetal and neonatal dermal fibroblasts in extracellular matrix.Yonsei Med J.2001年12月；42(6)：587-94；Nagano等人，PDGF regulates the actin cytoskeletonthrough hnRNP-K-mediated activation of the ubiquitin E3-ligase MIR.EMBO J.2006年5月3日；25(9)：1871-82)。通常用于评估不同物质对血管生成的诱导的HUVEC形成血管样结构(Arnaoutova I，Kleinman HK.In vitroangiogenesis：endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.Nat Protoc.2010；5(4)：628-35)。这些形态变化与血管生成相关。

为了监测LYO I对细胞形态的影响，将HUVEC或3T3-Swiss albino细胞以25×10³个细胞/ml(2500个细胞/孔)的浓度接种在96孔板的100ul充分生长培养基中[对于HUVEC：补充了低血清生长添加剂(LSGS；GibcoInvitrogen，CA USA；目录号S00310)和P/S/A溶液(采用上述的浓度)的培养基200(Gibco Invitrogen，CA USA；目录号M200500)；对于3T3-Swiss albino细胞；如前述实验中所列]。细胞接种24小时后，将充分生长培养基弃去，然后用100μl饥饿培养基将每个孔洗涤两次，再添加100μl新鲜饥饿培养基[对于HUVEC：补充了2％FCS和P/S/A(与上述浓度相同)的培养基200；对于3T3：如前述实验中所列]。更换为饥饿培养基24小时后，将复原的LYO I(孔中的总蛋白为20mg/ml；复原在每个细胞的0.4ml适当饥饿培养基中进行)添加到孔中。孔中TGF-β、bFGF、PDGF-AB和EGF的浓度与在增殖测定法中的所述浓度相同。

在一些HUVEC样品中，进行了附加的处理：在一些样品中，添加2IU/ml的凝血酶(孔中的最终浓度)(如在EVICEL^TM纤维蛋白密封剂的凝血酶组分中的溶液，(Omrix Biopharmaceuticals Ltd.))；在一些样品中，添加按1∶16稀释的纤维蛋白原组分(1∶16为孔中的最终稀释度；所用的纤维蛋白原组分为EVICEL^TM纤维蛋白密封剂的BAC组分)；在其他样品中，添加LYO I+2IU/ml凝血酶(孔中的最终浓度)以及LYO I+稀释的纤维蛋白原组分(1∶16)。所有稀释均在饥饿培养基中进行。将饥饿培养基中生长的未处理细胞用作对照。

在不同的处理后48小时(3T3；图3)或72小时(HUVEC，图4)对细胞形态进行了显微评价。每个实验一式三份地进行。

结果表明，未处理的3T3-Swiss albino细胞(图3A)具有钻石、风筝样形状(参见条纹状箭头)。添加LYO I(图3B)导致了纺锤样结构的形成(连续箭头)

未处理的和经凝血酶处理的HUVEC细胞(分别为图4A和4C)具有钻石样形状(条纹状箭头)，而添加LYO I(图4B)则诱导了血管样结构的形成(连续箭头)。此外，用LYO I和凝血酶处理HUVEC细胞(图4D)或用LYO I和BAC处理HUVEC细胞(图4F)导致了与其他处理组相比形成了增多的血管样结构。单独使用BAC进行处理(图4E)产生了些微的影响(形成了少许血管样结构)。

实例4：由混合的WAP制得、经S/D处理、经巴氏灭菌和无菌过滤的 冻干血小板提取物。

来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。通常采取多种措施以便最大程度降低病毒和/或未知病原体传播的风险，包括对捐献样品是否存在某些病毒的常规测试以及制造工艺过程中的病毒灭活/移除步骤。有效降低病毒传播风险可通过包括至少两个不改变产品有益性质的正交病毒灭活步骤而实现。诸如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和西尼罗河病毒的脂质包膜病毒通过破坏病毒脂膜的S/D处理而被快速有效地灭活。

巴氏灭菌是热破坏脂质包膜和无包膜病毒两者的过程。纳滤是通过使用特殊的纳米级过滤器从样品中排除脂质包膜和无包膜病毒的过程。

在以下实例中，评估了使用巴氏灭菌作为第二病毒灭活步骤的能力。

按实例1中所详述制备混合的WAP材料并进行S/D处理，不同的是：1)使用三袋WAP(600ml的总体积)。2)取430ml样品并进行S/D处理，将其余170ml在-80℃下冷冻，用于进行后面的分析(“混合的WAP II”)。3)将HSA以1％v/v(而非如LYO I中的5％HSA)的最终浓度加入样品中。4)将500ml[430ml样品+70ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(200mM醋酸钠和100mM甘氨酸)]样品转移到不锈钢烧杯中并置于设为25℃(而不是实例1中的4℃)的水浴中。5)在添加Triton X-100和TnBP后，将样品在25℃下连续搅拌2小时(在此实验中添加Triton X-100和TnBP的时间较短为2小时，而实例1中为4小时，这是因为S/D处理在较高的温度即25℃下进行，而实例1中为4℃)。6)S/D移除采用以下条件进行：填充了80ml SDRHyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂的XK26/40液相色谱柱，结合BT300-2J蠕动泵(MRC，Israel)和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)，10ml/min的恒定流速。用320ml ddH₂0准备柱，然后使用240ml包含1％HSA v/v(非5％)的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠、10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)进行平衡。7)上样后(450ml)，将柱用144ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠、10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)+1％HSA v/v，然后用144ml ddH₂O洗涤。8)未将D-甘露糖醇添加到流过材料中。接着，使经S/D处理的流过材料(即，未结合的级分和洗涤缓冲液)(610ml)经受如下的稳定化和巴氏灭菌步骤：在搅拌下(约22℃)将每克流过样品对应一克蔗糖缓慢添加到流过材料中，直到蔗糖完全溶解。然后，将溶液升温至37±1℃，并在搅拌和使用0.5N NaOH将pH调节到6.8-7.4的同时将每克流过材料对应0.11g甘氨酸缓慢添加到溶液中。pH调节进行到甘氨酸完全溶解为止。之后在37℃搅拌下逐渐添加每克流过材料对应0.8g蔗糖，直至完全溶解。将蔗糖和甘氨酸添加到溶液中，用作巴氏灭菌步骤过程中的稳定剂。然后在恒定混合(50RPM)下通过60℃的热处理对溶液进行10小时巴氏灭菌。为了将所得的粘稠溶液(因添加稳定剂而形成)转移到干净的容器中，将其用醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)稀释直至1830ml的总体积。使用具有2个Omega Minisette10kDa滤盒(Pall Corp，Port Washington，NY，USA)的Filtron超滤系统，通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠，10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)渗滤而将稳定剂从溶液中移除。渗滤步骤如下进行：首先将样品浓缩到900ml的体积，然后通过逐渐添加缓冲液并将溶液体积保持在900±100ml而针对总体积为5,400ml的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠，10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)进行渗析。然后将渗析后的溶液浓缩至400ml。

为了移除聚集的材料，将溶液依次通过5和1.2μm的Sartopure PP2过滤器(目录号5591342P5、5591303P5)然后是0.45μm的Sartopore2过滤器(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France；目录号5441306G5)进行过滤。使用0.2μm的Sartopore2过滤器(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France；目录号5441307H5)在无菌条件下(在生物无菌操作柜内)进行了无菌过滤。然后如实例1中所指示将溶液等分(4ml)到经高压灭菌的玻璃小瓶中，冻干并在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中用经过高压灭菌的橡胶塞密封。如上制得的冻干血小板提取物在本文中称为“LYO II”。

LYO II的制备包括S/D处理、巴氏灭菌步骤和最终的0.2μm无菌过滤。

实例5：LYO II对细胞增殖和细胞形态的影响。

以下实验的目的在于确定LYO II(由混合的WAP制得、经S/D处理、经受了SDR HyperD色谱树脂处理、经巴氏灭菌、无菌过滤和冻干的冻干血小板提取物)对细胞增殖的影响。在两种不同的细胞系中如实例3中所述进行了细胞接种浓度和充分生长培养基更换，所述两种不同的细胞系为：HUVEC和3T3-Swiss albino(将相容的充分生长培养基和饥饿培养基用于每种细胞类型；参见上述培养基组分；每孔100μl培养基中有2500个细胞)。

在3T3-Swiss albino细胞中，在更换培养基24小时之后通过添加混合的WAP II或复原的LYO II(将通过4ml溶液冻干而成的LYO II复原在0.5ml无菌纯化水中-与混合的WAP II相比浓缩8倍)而诱导增殖。在复原LYOII后，将LYO II和混合的WAP II均在相容的饥饿培养基中进行5倍连续稀释(将混合的WAP II的起始浓度指定为1，因此使用1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032的相对浓度；将LYO II的起始浓度指定为8(此浓度未在本实验中进行测试)并因此使用1.6、0.32、0.064、0.0128、0.00256的相对浓度)。从每种稀释液取10μl添加到孔中(初始接种浓度为2500个细胞；和100μl培养基)。通过ELISA(Quantikine，R&D Systems，MNUSA：人PDGF-AB目录号DHD00B、人VEGF目录号DVE00)检测了WAP II和LYO II中多种生长因子的浓度，在用WAP II和LYO II处理过的孔中，增殖测定期间孔中存在的实际浓度(最高浓度)分别如下：bFGF-120和280pg/ml；VEGF-0.75和2.7ng/ml；以及PDGF-AB-80和36ng/ml。

在48小时之后，通过使用WST-1细胞增殖试剂评价了3T3-Swissalbino细胞的增殖水平。将板在37℃下在5％CO₂的潮湿氛围中温育4小时。在温育期结束时，将板震摇1分钟，然后如实例3中所详述测量了样品的吸光度。将未处理细胞获得的OD值从获得的OD结果中减去，并将计算值绘制为S形剂量响应曲线。使用GraphPad Prism软件计算了R²拟合和半数有效浓度(EC50)。LYO II或混合的WAP II对3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖影响在图5中示出。实验一式三份地进行。

结果表明，LYO II对3T3-Swiss albino的增殖影响与原料(混合的WAP II)的该影响相似。这些结果证实，包括两步病毒灭活的LYO II生产工艺不影响其较之WAP原料的效能，例如对于混合的WAP II和LYO II，EC50值分别为0.018和0.013。

对于HUVEC，在更换培养基24小时之后通过不同的处理诱导了增殖：添加含有或不含有复原LYO II的凝血酶(T；孔中最终浓度为1IU/ml；来自EVICEL^TM纤维蛋白密封剂的凝血酶组分，OmrixBiopharmaceuticals Ltd.)；以及添加复原的LYO II。将未处理的细胞用作参照(标记为0)。将10μl的每种处理溶液添加到每个孔中。

由4ml溶液冻干而得的LYO II的复原在0.5ml无菌纯化水中进行-浓缩了8倍。

bFGF、VEGF和PDGF-AB的浓度与在对3T3细胞进行的增殖测定中的所述浓度相同。

在通过WST-1细胞增殖试剂开始处理的72小时之后进行了增殖水平的测量。在温育期(4小时)结束时，将板震摇1分钟，然后如上所示测量了样品的吸光度。测量一式两份地进行。将第三个重复样用Calcein-AM染色，以便探究LYO II的生成血管的效能(参见下文的结果“HUVEC中的血管样结构形成”)。

在用LYO II、凝血酶和凝血酶+LYO II进行诱导后的HUVEC增值率在图6中示出。

结果表明，向HUVEC添加LYO II导致与对照细胞(无LYO II的“0”)或与仅用凝血酶处理的细胞相比，增殖显著更高。添加LYO II+凝血酶(T)导致与仅添加LYO II相比，增殖活性更加明显。HUVEC中的血管样结构形成。

作为阳性对照进行了以下实验，以便观察当HUVEC生长在HUVEC饥饿培养基中的基底膜提取物(BME)包被层上时，通过其获得的血管样结构。BME在影响细胞粘附、迁移、增殖和分化以及细胞生长的组织结构中发挥着重要作用(Mehta VB，Besner GE.HB-EGF promotes angiogenesis inendothelial cells via PI3-kinase and MAPK signaling pathways.Growth Factors.2007年8月；25(4)：253-63；Arnaoutova I，Kleinman HK.2010)。将生长在HUVEC饥饿培养基中的胶原蛋白包被孔上的细胞用作阴性对照。

为了获得阳性对照图像，将HUVEC细胞以1×10⁵个细胞/ml(10000个细胞/孔)的浓度铺在96孔板的100μl HUVEC充分生长培养基(如上所列)中。将接种的细胞在37℃下在5％CO₂的潮湿气氛中温育。24小时后，将充分生长培养基弃去，向每个孔中添加100μl新鲜饥饿培养基(参见上文实例3的培养基组分)。在细胞接种前，将孔根据制造商方案包被50μl/孔的减少了生长因子的基底膜提取物(BME；Cultrex，Trevigen Inc.，MD，USA；目录号3433-005-001)或包被50μl/孔的浓度为3mg/ml的牛胶原蛋白I型(Invitrogen，CA，USA，目录号A10644-01，根据制造商方案制备以用于凝胶化程序)。

在24小时的温育期后，在37℃下通过添加5μM对细胞染色30分钟，然后使用Axiovert200显微镜(放大100倍)和530nm的荧光滤光片(CarlZeiss MicroImaging，NY，USA)采集代表性图片。Calcein-AM是一种在生物学中用于测试细胞活力和短期标记细胞的荧光染料-在转移到细胞中后，细胞内酯酶(存在于活细胞中)将乙酰甲氧基基团移除，而分子则被截留在细胞内并产生强绿色荧光。由于死亡的细胞缺乏活性酯酶，因此只有活的细胞被标记上。图7给出了结果。

结果表明，在BME包被的表面上检测到了反映血管生成潜力的明显的管状结构。在胶原蛋白包被层上未观察到管型形成(数据未示出)。

为了探索LYO II诱导血管生成的能力，将得自前一实验(实例5中的细胞增殖实验)的第三重复样如上用5μM Calcein-AM进行染色，并使用Axiovert200显微镜(放大200倍)和530nm荧光滤光片采集了代表性图片。在用LYO II处理后通过HUVEC获得的血管样结构在图8中示出。

可以看出，添加复原的LYO II(8B)导致了开始形成与阳性对照处理(接种在BME包被层上的HUVEC；图7)相似的管状结构。

为了探索LYO II诱导可能与诱导的细胞运动性相关的细胞形态变化的能力，在与实例5细胞增殖测定相似的条件下对3T3-Swiss albino细胞进行了实验(使用了相容的充分生长和饥饿培养基)。据观察，与未处理的细胞(数据未示出)相比，LYO II和混合的WAP II诱导了形态变化(形成钻石样至纺锤样形状)。

在另一项实验中，评价了在存在纤维蛋白密封剂或纤维蛋白原的情况下LYO II诱导血管样结构的能力。纤维蛋白密封剂包含细胞外基质的组分，例如纤粘蛋白和纤维蛋白原(Bar等人，“The binding of fibrin sealant tocollagen is influenced by the method of purification and the cross-linkedfibrinogen-fibronectin(heteronectin)content of the′fibrinogen′component”.Blood Coagul Fibrinolysis.2005；16：111-117)。添加了纤维蛋白密封剂以便形成与体内环境相似的环境条件。为此，将HUVEC以1×10⁵个细胞/ml(10000个细胞/孔)的浓度接种在组织预包被(采用纤维蛋白原或纤维蛋白-参见下文的程序)培养处理的Costar96孔板的100μl完全培养基中。24小时后，将培养基弃去，添加100μl饥饿培养基(该培养基包含上列组分)。纤维蛋白原或纤维蛋白预包被层如下形成：

a.将50μl纤维蛋白原组分(来自EVICEL^TM纤维蛋白密封剂；OmrixBiopharmaceuticals Ltd.；用HUVEC饥饿培养基稀释到4mg/ml)添加到每个孔中。将板在37℃下温育1小时，吸起溶液，将孔用PBS洗涤两次。

b.50μl/孔的纤维蛋白由25μl纤维蛋白原组分(用HUVEC饥饿培养基稀释到8mg/ml的EVICEL^TM纤维蛋白密封剂)和25μl凝血酶组分(用HUVEC饥饿培养基稀释到2IU/ml的EVICEL^TM纤维蛋白密封剂)形成。

将包被溶液施加到孔中后，将板在37℃下温育1小时。然后，吸起溶液，将孔用PBS洗涤两次。接着，将细胞在上文列出的条件下接种(每个孔100μl充分生长培养基对应10000个细胞)。在细胞接种24小时之后，将培养基替换为100μl饥饿培养基。在更换培养基24小时之后，将10μl混合的WAP II或复原的LYO II(在2ml无菌水中，即相对于WAP原料的体积浓缩2倍)添加到孔中。在用WAP II和LYO II处理过的孔中，WAP II和LYO II中多种生长因子的浓度分别如下：bFGF-480和1120pg/ml；VEGF-3和10.8ng/ml；以及PDGF-AB-320和144ng/ml。

将细胞如上用Calcein-AM进行染色，并采集了放大100倍的代表性图片。图9给出了结果。

显然的是，纤维蛋白原或纤维蛋白包被的表面不足以诱导将会导致管型形成的明显的形态变化。然而，与纤维蛋白原或纤维蛋白包被层一起添加LYO II或混合的WAP II促进了管状结构的形成。

实例6：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、经S/D处 理、经巴氏灭菌、无菌过滤和浓缩的冻干血小板提取物。

如实例4中所述制备经S/D和热处理的混合WAP材料，不同的是：1)使用了10袋WAP(总体积为2000ml)；2)取1720ml的样品以进行S/D处理，并将其余的280ml在-80℃下冷冻以用于后面的分析(“混合的WAPIII”)；3)添加HSA，达到样品中的HSA为1％(v/v)的最终浓度；4)S/D移除采用以下条件进行：填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂的XK50液相色谱柱，结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪，40ml/min的恒定流速；5)收集到的流过材料的体积为2700ml；6)为了转移在稳定化和巴氏灭菌后的粘稠溶液，将该溶液用醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和100mM甘氨酸)稀释直至8600ml的总体积；7)通过以下方式采用Centramate PE切向流滤膜盒支架+4个Omega Centramate10kDa超滤盒(PallCorp，Port Washington，NY，USA)进行了渗滤：首先将样品浓缩到3500ml的体积(从8600ml的体积)，然后通过逐渐添加缓冲液并将体积保持在3500ml±200ml而针对10,320ml总体积的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)渗析。然后将渗析后的样品浓缩到450ml-大约为起始体积的25％；参见上文的第2点，其中取1720ml样品以进行S/D处理；8)将浓缩-渗析后的溶液依次通过20、5和1.2μm Sartopure PP2过滤器然后是0.45μm Sartopore2过滤器过滤，以移除聚集的材料(不只通过5和1.2μm，然后是0.45μm)。通过0.2μm进行了无菌过滤。然后如上所述将过滤后的样品等分(4ml)并冻干。如上制得的冻干血小板提取物在本文称为“LYO III”。

如在LYO II中，LYO III的病毒纯化步骤包括S/D处理、附加巴氏灭菌步骤和最终的无菌过滤。在渗析步骤过程中，渗析溶液的体积与起始体积相比浓缩为1/4。

实例7：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、经S/D处 理、经巴氏灭菌和浓缩的冻干血小板提取物(“LYO III”)中的血浆蛋白的浓 度。

测量了在混合的WAP III中和LYO III中各种血浆蛋白(包括凝血中涉及到的蛋白)的浓度。

以冻干前的体积(4ml)，在ddH₂O中进行了LYO III的复原。

如下所述评估了不同蛋白的浓度：

通过对欧洲药典测定法(0903/1997)程序进行改进测量了凝血酶凝结活性。通过使用STart4凝血分析仪(Diagnostica Stago，Asnières sur Seine，France)将凝血酶标准品(Omrix，Israel)与0.1％的纤维蛋白原溶液(EnzymeResearch Laboratories，IN，USA)混合，绘制了凝结时间对数值与凝血酶浓度对数值的关系的校准曲线。通过得到的凝结时间计算了不同样品中的凝血酶活性(由凝血机自动计算，由校准曲线内插然后乘以稀释因子)。

根据改进的基于克劳斯法的欧洲药典测定法0903/1997评估了活性纤维蛋白原的量。使用STart4凝血分析仪(Diagnostica Stago，Asnières sur Seine，France)测量了凝结时间。在该方法中，在存在过量凝血酶的情况下使用纤维蛋白原(Enzyme Research Laboratories，IN，USA)绘制了校准曲线，然后由校准曲线计算了样品的纤维蛋白原浓度。

使用商业ELISA试剂盒(MD Biosciences，Zurich，Switzerland；目录号HFIBKT)根据制造商的说明测量了总纤维蛋白原。

使用商业ELISA试剂盒(Technoclone目录号TC12030)进行了纤粘蛋白的定量。

通过ELISA测定法进行了血管性血友病因子(vWF)的定量。将以下抗体用于测定多克隆兔抗人vWF抗体(DAKO；目录号A0082)和多克隆兔抗人vWF HR偶联抗体。使用Unicalibrator(Diagnostica Stago；目录号00625)绘制了标准曲线。

使用STart4凝血分析仪通过以下购自Diagnostica Stago，Asnières surSeine(France)的试剂测定了因子II、VII、VIII、IX、X和XI的量：STA-Deficient II(目录号00745)、STA-Deficient VII(目录号00743)、STA-Deficient VIII(目录号0725)、STA-Deficient IX(目录号00724)、STA-Deficient X(目录号00738)和STA-Deficient XI(目录号00723)。所有试剂均根据制造商的说明使用。

使用Western印迹(一种半定量分析)通过碱性磷酸酶偶联的AffiniPure山羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，PA，USA；目录号109-055-088)测量了IgG浓度。通过用人IgG BRP欧洲药典参考标准品绘制的校准曲线计算了样品中的IgG浓度。

表2：血小板原料(混合的WAP III)和LYO III中各种血浆蛋白的浓 度。

蛋白质	混合的WAP III	LYO III
			凝血酶(凝结时间)IU/ml	＜0.25*	＜0.25*
纤维蛋白原(凝结时间)mg/ml	＜0.08*	＜0.08*
			纤维蛋白原(mg/ml)	0.13	0.034
纤粘蛋白(mg/ml)	0.001	0.004
			血管性血友病因子(IU/ml)	＜0.0625*	＜0.0625*
因子II(IU/ml)	＜0.003*	＜0.003*
			因子VII(IU/ml)	0.008	0.009
因子VIII(IU/ml)	＜0.2*	＜0.2*
			因子IX(IU/ml)	＜0.0038*	＜0.0038*
因子X(IU/ml)	0.003	0.003
			因子XI(IU/ml)	0.0045	＜0.0028*
IgG(mg/ml)	0.011	0.076

*值是指检测限，因此将样品视为不含这些蛋白质。

表2中所示的结果表明混合的WAP III和LYO III包含极低量的血浆蛋白。LYO III中存在边际水平的凝血蛋白或完全不存在凝血蛋白使血小板提取物不凝结。相比之下，根据Burnouf(WO2009/087560)制备的血小板提取物包含高浓度的凝血因子。LYO III和混合的WAP III包含低于0.08mg/ml的活性纤维蛋白原。

实例8：LYO III对成纤维细胞中的细胞增殖以及对HUVEC中的形态 变化的影响。

使用3T3-Swiss albino细胞如实例5中所详述进行了LYO III对细胞增殖的影响的研究。

将由4ml溶液冻干并与起始WAP体积相比浓缩到1/4的LYO III在0.5ml无菌纯化水中复原-8倍浓缩(与混合的WAP III的起始体积相比浓缩到1/32)。在复原后，将混合的WAP III或复原的LYO III在合适的饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后将每种稀释样取10μl添加到包含100μl饥饿培养基的孔中。将混合的WAP III的起始浓度指定为1，并相应地计算出系列稀释度。将LYO III的起始浓度指定为32，并相应地计算出系列稀释度。通过ELISA(Quantikine，R&D Systems，MN USA：人TGF-β1目录号DB100B、人FGF基本目录号HSFB00D、人VEGF目录号DVE00、人PDGF-AB目录号DHD00B)检测了WAP III和LYO III中多种生长因子的浓度，在用WAP III和LYO III处理过的孔中，增殖测定期间孔中存在的实际浓度(最高浓度)分别如下：TGF-β1-170和4250ng/ml；bFGF-85和540pg/ml；VEGF-1和13ng/ml；以及PDGF-AB-73和33ng/ml。

作为标准对照，通过以下组分制备了重组人生长因子的定制混合物(在本文称为MasterMix；MM)：TGF-β1 200ng/ml、b-FGF0.5ng/ml、VEGF5ng/ml和PDGF-AB300ng/ml(这些生长因子购自R&D Systems；目录号分别为240-B-010/CF、233-FB-025/CF、293-VE-010/CF和222-AB-010)。将MM混合物也在饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后加入孔中(10μl)。在处理开始后72小时通过使用WST-1细胞增殖试剂评价了增殖(将无任何添加剂的细胞用作背景并从OD值中减去)。在温育期(4小时)结束时，将板震摇1分钟，然后如上所示测量了样品的吸光度。测试一式三份地进行。为了基于共同的因子比较不同的材料，将获得的结果归一化(见下文)为PDGF-AB的浓度，PDGF-AB是存在于所有测试材料中的触发3T3细胞增殖的生长因子。归一化为PDGF-AB通过以下方式进行：测量复原LYO III中的PDGF-AB浓度[商业ELISA试剂盒(Quantikine，R&DSystems，MN，USA；目录号DHD00B)]，并以相对稀释度计算PDGF-AB浓度。将通过WST-1细胞增殖试剂获得的OD结果针对计算出的PDGF-AB浓度值作图。将MasterMix(MM)用作阳性对照。针对通过特异性ELISA评估的PDGF-AB浓度进行归一化。

LYO III或混合的WAP III对3T3-Swiss albino细胞的增殖影响的结果在图10中示出。

结果表明，当归一化为样品中存在的PDGF-AB的量时，浓度渐增的LYO III或混合的WAP III影响了3T3-Swiss albino成纤维细胞的增殖水平，而LYO III的影响更明显。要注意的是，两种处理的影响甚至比阳性对照(MM)更明显。

进行了管形成测定，以评估LYO III的生成血管的效应，并探索LYOIII与纤维蛋白密封剂或其组分的可能的协同效应。为了消除添加剂对细胞贴附到板表面的任何可能的影响，首先接种细胞，然后仅用不同的添加剂进行处理。

为此，将HUVEC以50×10³个细胞/ml(5000个细胞/孔)的浓度铺到经组织培养处理的Costar96孔板的100μl充分生长培养基(与上面相同的组分)中。细胞接种24小时后，将充分生长培养基弃去，然后用100μl饥饿培养基将孔洗涤两次，再将100μl饥饿培养基添加到每个孔(与上面相同的组分)中。

更换培养基24小时后，通过添加10μl LYO III(在0.5ml无菌水中复原-相对于混合的WAP III体积浓缩到1/32)或LYO III与纤维蛋白[由1IU/ml凝血酶(孔中的最终浓度)和11.3mg/ml(总蛋白)纤维蛋白原形成，凝血酶和纤维蛋白原均为稀释在饥饿培养基中的EVICEL^TM纤维蛋白密封剂(Omrix Biopharmaceuticals Ltd.)的组分]的组合启动测定。孔中TGF-β、bFGF、VEGF和PDGF-AB的浓度与上面增殖中的浓度相同。

将通过上列相同浓度的凝血酶和/或纤维蛋白原进行了处理的细胞用作参照。在不同的处理48小时后，在37℃下将细胞用5μM Calcein-AM染色30分钟，然后使用放大100倍的Axiovert200显微镜和530nm荧光滤光片(Zeiss)采集了代表性图片。图11给出了结果。

如图11中所示，在对照细胞中未观察到管型形成(A)。另外，明显的是，单独的凝血酶或纤维蛋白原只有微弱的诱导HUVEC形态变化的能力，如可通过极低数量的延长细胞和血管样形状(分别为B和C)而评估。使用纤维蛋白(凝血酶和纤维蛋白原；E)处理导致了细胞朝管型形成发生重排，然而未检测到明显的血管结构。向HUVEC单层添加LYO III(D)促进了管型形成，所述管型形成通过添加纤维蛋白而进一步增强(F)。

实例9：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、在低聚集 体条件下经S/D处理、经巴氏灭菌和浓缩的冻干血小板提取物。

在此实验中，由冷冻的材料在解冻前如下所述制备了冻干血小板提取物：对10袋WAP单独称重，用70％乙醇擦拭，切开然后将冷冻的材料置于大烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中。对空袋称重，使用空袋与满袋之间的重量差来计算WAP净重(每袋的WAP净重为约200g)。使用连接到RW20顶置式电子搅拌器(IKA-Werke GmbH & Co.，Staufen，Germany)的不锈钢螺旋桨以20RPM将混合的材料在25℃下缓慢混合直到完全解冻。混合的WAP的同渗容摩为275mOs[通过使用Advanced^TM微渗压计3300型(Advanced Instruments Inc，Norwood，MA，USA)测得]。向混合的WAP中添加10％醋酸盐-甘氨酸缓冲液(200mM醋酸钠、100mM甘氨酸，pH6.8-7.4)和1％HSA(占溶液最终体积的体积比)。为了在整个过程中尽可能恒定地保持同渗容摩水平，使用NaCl(Sigma-A1drich，St.Louis，MO，USA)将缓冲液的同渗容摩调节到WAP原料的同渗容摩。在下一步中，通过在以50RPM混合的同时向混合样品中缓慢添加1％Triton X-100和0.3％TnBP(v/v)而进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳，将S/D处理分成两个部分。首先，将样品连续搅拌30分钟，然后通过20、5和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(SartoriusStedimBiotech S.A.，Aubagne，France)过滤。接着，将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中，并以50RPM再混合2小时以继续病毒灭活工艺。

S/D移除采用以下设备进行：填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱，结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)。将1800ml经S/D处理的血小板提取物上样到柱上，然后用540ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(200mM醋酸钠、100mM甘氨酸，pH6.8-7.4)+1％HSA v/v进行洗涤。从柱(流过)收集了2700ml总体积。据发现，在制造工艺过程中形成了可能干扰生产后续阶段的水不溶性聚集体。另据发现，在存在钙的情况下聚集作用增强。因此，决定使用钙在早期促进聚集体发生沉淀，然后通过澄清过滤除去这些聚集体。因此，在S/D移除程序后将CaCl₂缓慢添加(至40mM的最终浓度)到提取物中，然后将提取物在50RPM混合下在25℃下温育30分钟。然后使用20、5和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(SartoriusStedim Biotech S.A.，Aubagne，France)对产物进行过滤。在下一步中，使提取物经受如实例4中所述的稳定化和巴氏灭菌。为了将所得的粘稠溶液转移到干净的容器中，将其用醋酸盐-甘氨酸缓冲液(以粘稠溶液中存在20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的最终浓度；pH6.8-7.4)和1％HSA v/v稀释直至11,320ml的总重量。通过使用Centramate PE切向流滤膜盒支架+4个OmegaCentramate10kDa超滤盒(Pall)针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)渗滤进行了稳定剂的移除。渗滤如下进行：首先将提取物浓缩至3600ml的体积，然后通过逐渐添加缓冲液并将溶液体积保持在3600±200ml而针对总体积为10,800ml的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)进行渗析。然后将渗析溶液浓缩至473ml的体积，其为起始体积的大约25％。

对于稳定化，将甘露糖醇以2％w/w的最终浓度添加到溶液中。为了移除聚集的材料，将样品依次通过20、5和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2过滤器过滤。使用0.2μm Sartopore2过滤器在无菌条件下进行了无菌过滤。然后将产物在无菌条件下等分成4ml的部分，并如上所详述进行冻干。将冻干材料在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中密封。如上制得的冻干血小板提取物在本文中称为“LYO IV”。

LYO IV的病毒纯化步骤包括S/D处理，其包括在SD处理内的过滤子步骤。该步骤的过滤通过20、5、1.2和0.45μm过滤器进行。此外，进行了巴氏灭菌步骤和最终的无菌过滤。在渗析步骤过程中，渗析溶液的体积与起始体积相比浓缩为1/4。

实例10：LYO IV对成纤维细胞中的细胞增殖和形态变化以及对 HUVEC中的形态变化的影响。

如实例5中所详述进行了LYO IV对细胞增殖的影响的研究。将3T3-Swiss albino细胞以25×10³个细胞/ml(2500个细胞/孔)的浓度铺到经组织培养处理的Costar96孔板的充分生长培养基(如上文详述的组分)中。在细胞接种24小时之后，将充分生长培养基更换为新鲜的饥饿培养基(如上)。在更换培养基24小时之后，通过添加混合的WAP IV或复原的LYOIV诱导了增殖。复原如下所述进行：将由4ml溶液冻干的LYO IV(与起始的混合WAP相比浓缩到1/4)在0.5ml无菌纯化水中复原-8倍浓缩(与混合WAP IV的起始体积相比浓缩到1/32)。在复原后，将复原的LYO IV或混合的WAP IV在合适的饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后将每种稀释样取10μl添加到包含100μl饥饿培养基的孔中。将混合的WAP IV的起始浓度指定为1，并相应地计算出系列稀释度(相对浓度)。将LYO IV的起始浓度指定为32，并相应地计算出系列稀释度。通过ELISA(与上面相同的试剂盒)检测了WAP IV和LYO IV中多种生长因子的浓度，在用WAP IV和LYO IV处理过的孔中，增殖测定期间孔中存在的实际浓度(最高浓度)分别为：TGF-β-230和2000ng/ml；bFGF-100和170pg/ml；VEGF-1.25和8.1ng/ml；PDGF-AB-57和27ng/ml；以及血小板反应蛋白-1-60和330ng/ml。

将如实例8中制备的MasterMix(MM)用作阳性对照。将该混合物在饥饿培养基中进行5倍连续稀释，并取10μl添加到孔中。将MM的最大浓度指定为30(因为MM中PDGF-AB的浓度为30ng/ml)，并相应地计算出系列稀释度。

在开始处理48小时之后，如上所详述对细胞增殖进行了评估。在用WST-1温育4小时后，如上文所述测量了样品的吸光度。将所得的结果归一化为PDGF-AB(如上所阐述)。所有测试均一式三份地进行。图12给出了结果。

结果表明，LYO IV和混合的WAP IV对3T3-Swiss albino成纤维细胞增殖水平具有相似的影响。所产生的影响甚至比阳性对照(MM)更明显。

为了评价LYO IV对3T3-Swiss albin0细胞形态变化的影响，在处理后采集了相差显微图像(将细胞如实例10的增殖测定中所述进行接种，随后用10μl添加到100μl饥饿培养基中的复原LYO IV(在0.5ml无菌水中)、混合WAP IV和最大浓度的MM(如实例8中)处理，并且在处理2天后采集了图像)。孔中TGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB和血小板反应蛋白-l的浓度与在增殖测定中的所述浓度相同。图13显示了代表性图像。

未处理的成纤维细胞具有钻石样形状(图13A)。向3T3-Swiss albino成纤维细胞添加LYO IV(B)促进了细胞从钻石样细胞到纺锤样形状的形态变化，这是运动型成纤维细胞的特征。这些观察到的形态变化比用混合的WAP IV处理后观察到的变化(C)和用阳性对照(MM；D)处理后观察到的变化要强。

如上指出，3T3成纤维细胞的纺锤样形状是运动潜能的属性。在以下实验中，在用LYO IV处理后，通过使用刮伤迁移测定法(Liang等人，In vitroscratch assay：a convenient and inexpensive method for analysis of cell migrationin vitro.Nat Protoc.2007；2(2)：329-33)评价了细胞的实际运动性。为此，将3T3-Swiss albino细胞以1×10⁵个细胞/ml(50,000个细胞/孔)的浓度铺在经组织培养处理的Costar24孔板(Coming Life Science，MA USA))的0.5ml充分生长培养基(如上)中。接种前，将孔包被以下物质之一：

1.胶原蛋白包被层-12.5μg/cm²，由胶原蛋白溶液形成(牛胶原蛋白I型，5mg/ml，(Invitrogen，CA，USA)，目录号A10644-01，根据制造商关于薄包被层程序的方案进行制备，使用了在10mM乙酸中50μg/ml的稀释度)。将包被层根据制造商方案施加。

2.纤维蛋白原包被层-250μg/cm²，由通过DMEM培养基稀释到lmg/ml纤维蛋白原的EVICEL^TM纤维蛋白密封剂(OmrixBiopharmaceuticals Ltd.)的纤维蛋白原组分形成。在室温下温育1小时后，吸起溶液，将孔用新鲜的DMEM洗涤。

将未包被的孔用作对照。细胞接种6小时后，将充分生长培养基弃去，然后用0.5ml饥饿培养基将孔洗涤两次，再将0.5ml新鲜饥饿培养基添加到每个孔(如上)中。过夜饥饿后，通过p200塑料吸管末端在孔的中间对细胞单层造成创伤，然后将脱离的细胞与饥饿培养基一起洗掉，再加入0.5ml新鲜饥饿培养基。添加混合的WAP IV、复原的LYO IV(在2ml无菌水中)或PRP-R(PRP释出液)[制备方式如下：将60ml单个供体的PRP(由MDA，血库，(Israel)制备并从其获得)通过3ml1000IU/ml的凝血酶(来自EVICEL^TM)和2ml2M的CaCl₂活化，然后以3000g在4℃下离心10分钟，得到用于实验的27ml上清液]后，评价了细胞迁移(即运动性)。将所有处理溶液按1∶10稀释到孔中(50μl)。各处理均一式两份地进行。

在孔中(分别针对WAP IV和LYO IV)，WAP IV和LYO IV中多种生长因子的浓度如下：TGF-β-920和8000ng/ml；bFGF-400和680pg/ml；VEGF-5和32.4ng/ml；PDGF-AB-228和108ng/ml；以及血小板反应蛋白-1-240和1320ng/ml。

在时间点0处和24小时后，使用相差显微镜(放大100倍)在每个孔中的三个不同的位置处采集了创伤宽度(每种处理6张图片)。在每张图片中，对创伤宽度测量5次(每个孔15次)，并将伤口闭合(较窄的伤口宽度)计算为同一位置中开始处理后24小时时所剩余伤口的百分比。

在不同处理中的不同时间点处的创伤宽度的代表性相差图片在图14中示出。图15显示了在不同的处理组中开始处理后24小时时表示为剩余百分比的伤口闭合定量评估。结果以6个重复样的平均值±S.D.示出。

结果表明，在所有表面(包被或未包被的孔)上，LYO IV以与混合的WAP IV和PRP-R(已报道能在体内环境中实现有效的伤口愈合，Lacci KM，Dardik A，2010)相似的方式促进了成纤维细胞运动和单层中的刮伤闭合(伤口比对照参考处理要窄)。

胶原蛋白包被的孔显示出较之纤维蛋白原包被的孔略高的运动促进作用。

进行了管形成测定，以评估LYO IV诱导HUVEC形态变化的能力。这些形态变化与血管生成相关。为此，将HUVEC以1×10⁵个细胞/ml(10000个细胞/孔)的浓度铺在经组织培养处理的Costar96孔板的100μl饥饿培养基(如上，不含2％FCS)中。为了模拟细胞外基质环境，在细胞接种前将孔用BME(根据制造商方案为50μl/孔)包被。

在接种过程中，将10μl混合的WAP IV或LYO IV(在2ml无菌水中复原，相对于混合的WAP IV体积浓缩到1/8)添加到指定的孔中。孔中TGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB和血小板反应蛋白-1的浓度与上文的迁移测定中的所述浓度相同。将接种在BME包被层上的未处理HUVEC用作参照。24小时后，在37℃下将细胞用5μM Calcein-AM染色30分钟，然后使用放大60倍的Axiovert200显微镜和530nm荧光滤光片(Zeiss)采集了代表性图片。结果示于图16中。

如图16中所观察到的，较之WAP IV或未处理的细胞的管型形成效能(分别为C和A)，LYO IV导致最强的管型形成效能(B)(用LYO IV处理导致形成了血管样结构)。

实例11：评价纳滤作为第二病毒灭活步骤的用途。

如实例1中所详述由10个供体(2000m1)制备混合的WAP材料。然后，将200ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液和1％HSA v/v添加到混合的WAP中。取出50ml样品，如下所详述用S/D进行处理，然后贮存在-80℃下直至进行测定。在分析时，将样品在室温解冻，然后通过0.45μm针式过滤器(Millex-HV，Millipore；目录号SLHV033RS)过滤(以移除任何颗粒物)。只过滤了约25ml(总共50ml)过滤器即发生堵塞，因此采用新的过滤器过滤剩余的样品。通过冷冻和解冻并通过进行S/D处理而获得了提取物。

解冻后，使用填充了8ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(PallCorp.)的HR10×10液相色谱柱(Amersham Pharmacia Biotech)结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)执行了S/D移除步骤。工艺过程中所用的流动参数为：lml/min，最大压力限为1.0巴。

将柱通过32ml纯化水接着通过24ml含1％HSA v/v的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行准备。将40ml提取物样品上样到柱中。上样好提取物样品后，将柱首先用14ml含1％HSA v/v的醋酸盐-甘氨酸缓冲液洗涤。第二洗涤步骤采用22ml含10％乙醇/1M NaCI/0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行。在我们的实验中发现后一洗涤步骤增加了某些生长因子例如PDGF-AB和DGF-BB的回收率(参见实例12)。然后将柱用16ml纯化水洗涤。收集的流过液体的总体积为80ml。为了有利于在早期使聚集体沉淀，如实例9中所述通过CaCl₂进行了沉淀处理。CaCl₂处理后采用5μm囊式过滤器(mdiAdvanced Microdevices)然后采用0.45μm针式过滤器(Millex-HV，Millipore；目录号SLHV033RS)对提取物样品进行了澄清过滤。

为了移除较小的聚集体，在纳滤步骤前通过使材料经过0.2和0.1μm过滤器进行了预过滤步骤。为了过滤整个80ml提取物样品，使用了两个0.2μm真空过滤器(Nalgene Supor Mach V50mm)和四个0.1μm针式过滤器(Millex VV，Millipore；目录号SLVV033RS)。然后使过滤后的材料经受纳滤步骤。将纳滤系统按如下顺序组装：压力氮气罐-压力调节器-带2.5巴压力表(PGl)的过滤外壳SEALKLEEN(Pall Corp.)-阀门-0.2μm过滤器(Minisart，Sartorius；目录号16534)-0.1μm过滤器(Millipore；目录号VVLP02500)-1.0巴压力表(PG2)-PLANOVA75N过滤器(Asahi Kasei；目录号75NZ-001)-1.0巴压力表(PG3)-PLANOVA35N过滤器(AsahiKasei；目录号35NZ-001)-1.0巴压力表(PG4)-PLANOVA20N过滤器(Asahi Kasei：目录号20NZ-001)。

纳滤程序如下进行：

在上样提取物样品前，通过以下方式测试了系统的性能：将过滤外壳充注40ml纯化水(PuW)并通过增加进入系统的氮气流而提高压力。在正常条件下，预计溶液在通过每个PLANOVA过滤器后仅以较小的压降流过系统。如下表3所示，40ml PuW在无大的压降的情况下通过了系统。

确认系统的性能后，将过滤外壳充注含1％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠、10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)(与提取物样品中存在的缓冲液相同的缓冲液)。下表的结果表明，压力水平和流速使得缓冲液能够通过整个系统。然而，当将提取物样品上样后，其未能通过整个系统。如下表所示，PLANOVA75N(PG2)前的压力读数为0.9巴，而PLANOVA75N后和PLANOVA35N过滤器(PG3)前的压力仅为0.2巴，表明样品不能轻易通过PLANOVA75N过滤器。

表3：当使DDW、缓冲液和血小板提取物经受纳滤时获得的压力水平 和流速。

这些结果表明，使用上文详述的条件将纳滤用作第二病毒灭活步骤是不可行的。

实例12：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、经S/D 处理、使用洗脱条件通过SDR HvDerD色谱移除了S/D、经巴氏灭菌和浓缩 的冻干血小板提取物。

在此实验中，如下所述制备了冻干血小板提取物：对10袋WAP单独称重，用70％乙醇擦拭，切开然后将冷冻的材料置于大烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中。对空袋称重，将空袋与满袋之间的重量差用于计算WAP净重。混合的WAP的总净重为1947克。将混合的材料在25℃下缓慢混合，直至完全解冻(与实例9中所用相同的搅拌条件)。混合的WAP的同渗容摩为265mOs。将213ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(达到20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的最终浓度，pH6.8-7.4)和1％v/v(占溶液最终体积的百分比)人血清白蛋白(HSA，Talecris USA)添加到混合的WAP中。为了在整个过程中尽可能恒定地保持同渗容摩水平，使用NaCl(Sigma-A1drich，St.Louis，MO，USA)将缓冲液的同渗容摩调节到WAP原料的同渗容摩。如之前所述通过在以50RPM混合的同时向混合样品中缓慢添加1％Triton X-100和0.3％TnBP(v/v)而进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳，在S/D处理过程中对样品进行了过滤。简而言之，在添加S/D后，将样品连续搅拌30分钟，然后通过20、3和1.2μmSartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France)过滤。接着，将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中，并以50RPM再混合两小时以继续病毒灭活工艺。

S/D移除采用以下设备进行：填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱，结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)。将1800ml经S/D处理的血小板提取物(含1620ml血小板材料)上样到柱上，然后用600ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液+1％HSA洗涤。接着用900ml含10％乙醇、1M NaCl和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行洗脱。最后用600ml纯化水洗涤柱。收集了未结合的和洗脱的材料。从柱收集了3600ml总体积。为了促进聚集体的沉淀，如之前所述在S/D移除程序后将CaCl₂(40mM的最终浓度)缓慢添加到提取物中，然后将提取物在以50RPM混合的同时在25℃下温育30分钟。使用20和3μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(Sartorius StedimBiotech S.A.，Aubagne，France)对产物进行过滤。在下一步中，使提取物经受如实例4中所述的稳定化和巴氏灭菌。通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)渗滤而进行了稳定剂的移除。然后将渗析溶液浓缩至530ml的体积(其为起始体积的大约29％)。

对于稳定化，将甘露糖醇以2％w/w的最终浓度添加到溶液中。为了移除聚集的材料，将样品通过3μm Sartopure PP2过滤器和0.45μm Sartopore2过滤器过滤。使用0.2μm Sartopore2过滤器在无菌条件下进行了无菌过滤。然后将获得的产物(452ml的体积)在无菌条件下等分成4ml的部分，并如上所详述进行冻干。将冻干材料在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中密封。如上制得的冻干血小板提取物在本文称为“LYO V”。

LYO V的病毒纯化步骤包括S/D处理，其包括在SD处理内的过滤子步骤。该步骤的过滤通过20、3、1.2和0.45μm过滤器进行。SDR步骤包括使用非等度溶液洗涤柱。非等度溶液为含10％乙醇、1M NaCl和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液。此外，进行了巴氏灭菌步骤和最终的无菌过滤。在渗析步骤过程中，渗析溶液的体积与起始体积相比浓缩为约1/3.5。

在LYO II-LYO V的生产工艺中，在将样品上样到SDR色谱树脂前以及从SDR树脂收集样品后(在溶剂和洗涤剂移除后)测量了材料中的PDGF-AB含量。在不同生产工艺(LYO II-LYO V)中PDGF-AB的回收百分比在表4中示出。使用特定的商业ELISA试剂盒(分别为Quantikine人PDGF-AB免疫测定法，制造商：R&D systems，目录号DHD00B；以及Quantikine HS人bFGF免疫测定法，目录号HSFB00D，制造商：R&Dsystems)测量了PDGF-AB和bFGF含量。

表4：LYO II-V中PDGF-AB和bFGF从SDR柱的回收率。

如表4中所示，如上所述在LYO V加工期间在S/D移除步骤中增添非等度溶液洗脱步骤导致了更高的PDGF-AB回收率。通过洗脱步骤PDGF-AB的回收率为45％，相比之下在不存在此步骤的情况下回收率为11-16％-回收率增加了约2倍。在用4ml重蒸馏水(DDW)复原后还测量了最终冻干材料中的PDGF-AB和bFGF浓度。PDGF-AB的浓度为15,028pg/ml，其对应于用作原料的每个血小板2.26×10^-6pg的PDGF-AB。bFGF的浓度为36pg/ml，其对应于用作原料的每个血小板5.4×10^-9pg的bFGF。

实例13：LYO V对成纤维细胞的细胞增殖的影响。

使用3T3-Swiss albino细胞如实例5中所详述进行了LYO V对细胞增殖的影响的研究。

将由4ml溶液冻干并与起始WAP体积相比浓缩到1/4的LYO V在0.5ml无菌纯化水中复原-8倍浓缩(与混合的WAP V的起始浓度相比浓缩到1/32)。在复原后，将混合的WAP V或复原的LYO V在合适的饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后将每种稀释样取10μl添加到包含100μl饥饿培养基的孔中。将混合的WAP V的起始浓度指定为1，并相应地计算出系列稀释度。将LYO V的起始浓度指定为32，并相应地计算出系列稀释度。作为标准对照，使用了重组人PDGF-AB(R&D Systems；目录号222-AB-010)。将PDGF-AB也在饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后加入孔中(10μl)。通过ELISA(与上面相同的试剂盒)检测了WAP V和LYO V中多种生长因子的浓度，在用WAP V和LYO V处理过的孔中，增殖测定期间孔中存在的实际浓度(最高浓度)分别为：TGF-β-159.4和169.8ng/ml；bFGF-0.1ng/ml和0.029ng/ml；VEGF-0.89和1.05ng/ml；以及PDGF-AB-56.86和12ng/ml。

在处理开始后72小时通过使用WST-1细胞增殖试剂评价了增殖(将无任何添加剂的细胞用作背景并从OD值中减去)。在温育期(4小时)结束时，将板震摇1分钟，然后如上所示测量了样品的吸光度。测试一式三份地进行。将通过WST-1细胞增殖试剂获得的OD结果针对计算出的PDGF-AB浓度值作图。结果示于图17中。

结果表明，渐增浓度的LYO V或混合的WAP V影响了3T3-Swissalbin0成纤维细胞的增殖水平，而LYO V的影响稍微没那么明显。这种明显的降低是由于将结果归一化为存在于LYO混合物中的仅一种生长因子(PDGF-AB)，并且其回收率与之前的实例相比显著升高。要注意的是，两种处理(LYO V和WAP V)的影响比单独的重组PDGF-AB更明显，从而表明血小板的其他提取组分可协同地增强成纤维细胞增殖。

实例14：在以上实例制备的LYO I-LYO IV中进行的制造步骤的比 较。

表5总结了在每种LYO制备中进行的主要制造步骤。

表5：在每种LYO制备中进行的主要制造步骤。

*洗脱通过非等度溶液进行：含10％乙醇、1M NaCl和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸，pH6.8-7.4)。

实例15：根据本发明制备的血小板提取物中的聚集体含量水平。

聚集在蛋白质药物中是不可取的，因为它不仅会影响生物活性还会增加不良副作用(如免疫原性)的机会。聚集还可能降低蛋白质的稳定性。在以下实例中，测定了根据本发明制备的血小板提取物中的聚集体含量。

为此，通过以下方式测定了聚集水平(浊度)：测量320nm处的光密度(OD₃₂₀)(其通常表示存在聚集体，如Ultraviolet absorption Spectroscopy，Mach H.等人，Protein stability and folding，Shirley B.A.编辑，第91-114页，1995，Humana Press，New Jersey中所述)并减去以高浓度存在于血小板提取物中并被视为背景读数的人血清白蛋白(HSA)的OD₃₂₀读数。将浊度(未稀释溶液在320nm处的吸光度)除以蛋白质浓度[通过Pierce BCA蛋白质测定法(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA；目录号23235)测定]而获得归一化浊度(聚集)，再进行扣减。

根据以下公式计算聚集体水平：

将每毫克蛋白质≤0.03的计算得到的OD₃₂₀水平视为低聚集体含量。

将根据以上实例制备的不同冻干血小板提取物(LYO II-V)在DDW中复原(达到与冻干步骤前相同的体积)。在下一步中，将lml样品转移到聚丙烯酸比色皿(Sarstedt，目录号67.740)并使用Ultrospec2100pro分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech)测量了320nm处的OD。平行地，测量了320nm处HSA的OD水平(采用与所测试的提取物相同的参数)，并根据上述公式计算了聚集体水平(使用了不同的HSA浓度，并如公式中所示将读数除以溶液的总蛋白)。

据发现，所有测试的血小板提取物的计算的OD₃₂₀水平皆≤0.03每毫克蛋白质。因此，根据本发明制备的血小板提取物具有低聚集体含量。

实例16：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、经S/D 处理、使用两个非等度溶液步骤进行SDR洗脱、经巴氏灭菌和浓缩的冻干 血小板提取物。

在此实验中，如下所述制备了冻干血小板提取物：对10袋WAP单独称重，用70％乙醇擦拭，切开然后将冷冻的材料置于大烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中。对空袋称重，将空袋与满袋之间的重量差用于计算WAP净重。混合的WAP的总净重为1906克。将混合的材料在25℃下缓慢混合，直至完全解冻(与实例9中所用相同的搅拌条件)。混合的WAP的同渗容摩为267mOs。将209ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(达到20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的最终浓度，pH6.8-7.4)和0.2％v/v(占溶液最终体积的百分比)人血清白蛋白(HSA，Talecris USA)添加到混合的WAP中。为了在整个过程中尽可能恒定地保持同渗容摩水平，使用NaCl(Sigma-A1drich，St.Louis，MO，USA)将缓冲液的同渗容摩调节到WAP原料的同渗容摩。如之前所述通过在以50RPM混合的同时向混合样品中缓慢添加1％Triton X-100和0.3％TnBP(v/v)而进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳，在S/D处理过程中对样品进行了过滤。首先，将样品连续搅拌30分钟，然后通过20和3μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μmSartopore2(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France)过滤。接着，将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中，并以50RPM再混合2小时以继续病毒灭活工艺。

S/D移除采用以下设备进行：填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱，结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)。将1800ml经S/D处理的血小板提取物(含1620ml血小板材料)上样到柱上，然后用600ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液+0.2％HSA洗涤。已知的是肝素会结合某些生长因子。探索了肝素在洗脱步骤中对生长因子回收率的影响。因此，在本实验中，通过600ml含12.5％乙醇、0.5M NaCl、5IU/ml肝素(肝素钠-Fresenium5000IU/ml，Bodene(PTY)Ltd，South Africa)和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行了洗脱。该洗脱步骤后为通过600ml含10％乙醇、1M NaCl和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行的第二洗脱步骤。最后用300ml纯化水洗涤柱。收集并混合未结合和洗脱的材料。从柱收集了3700ml总体积。使用3和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(Sartorius Stedim BiotechS.A.，Aubagne，France)对收集的材料进行过滤。在下一步中，使提取物经受如实例4中所述的稳定化和巴氏灭菌。通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)渗滤而进行了稳定剂的移除。然后将渗析溶液浓缩至450ml的体积(其为起始体积的大约25％)。

对于稳定化，将甘露糖醇以2％w/w的最终浓度添加到溶液中。为了移除聚集的材料，将样品通过3μm Sartopure PP2过滤器和0.45μm Sartopore2过滤器过滤。使用0.2μm Sartopore2过滤器在无菌条件下进行了无菌过滤。然后将所得的样品在无菌条件下等分成4ml的部分，并如上所详述进行冻干。将冻干材料在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中密封。如上制得的冻干血小板提取物在本文称为“LYO VI”。

LYO VI的病毒纯化步骤包括S/D处理，其包括在SD处理内的过滤子步骤。此步骤的过滤通过20、3和0.45μm过滤器进行。SDR步骤包括使用非等度溶液的多个洗脱步骤，其中一个包含5IU/ml的肝素。此外，进行了巴氏灭菌步骤和最终的无菌过滤。在渗析步骤中，渗析溶液的体积与起始体积相比浓缩为1/4。

在LYO II-LYO IV和LYO VI的生产工艺中，在将样品上样到SDR色谱树脂前以及从SDR树脂收集样品后(在溶剂和洗涤剂移除后)测量了材料中的PDGF-AB和bFGF含量。在不同工艺中在SDR柱后的PDGF-AB和bFGF回收百分比在表6中示出。使用上述的特定商业ELISA试剂盒测量了PDGF-AB和bFGF含量。

表6：LYO II-VI中PDGF-AB和bFGF从SDR柱的回收率。

如表6中所示，添加包含肝素的洗脱步骤不仅显著改善了PDGF-AB的回收率，还改善了bFGF的回收率。在非等度溶液(LYO V)中，bFGF的回收率为56％，相比之下，在不存在肝素时回收率为37％-回收率增加了约0.5倍。当比较LYO VI中与LYO II-IV中的bFGF回收率时，观察到了约2倍的增加。

在用4ml重蒸馏水(DDW)复原后还测量了最终LYO VI材料中的PDGF-AB和bFGF浓度。PDGF-AB和bFGF的浓度分别为4,578和127pg/ml，对应于用作原料的每个血小板7×10^-7pg的PDGF-AB和1.95×10^-8pg的bFGF。

实例17：LYO VI对成纤维细胞的细胞增殖的影响。

使用3T3-Swiss albino细胞如实例5中所详述进行了LYO VI对细胞增殖的影响的研究。

将由4ml溶液冻干并与起始WAP体积相比浓缩到1/4的LYO VI在0.5ml无菌纯化水中复原-与冻干前的血小板提取物相比浓缩了8倍(合计与混合的WAP VI的起始体积相比浓缩到1/32)。在复原后，将混合的WAP VI或复原的LYO VI在合适的饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后将每种稀释样取10μl上样到包含100μl饥饿培养基的孔中。将混合的WAPVI的起始浓度指定为2.5(因为其代表冻干前的2.5μl血小板提取物-使用了与冻干前的血小板提取物相比稀释了4倍的10μl WAP)，并相应地计算出系列稀释度。

将所测试的LYO VI的起始浓度指定为80(因为其代表冻干前的80μl血小板提取物-将冻干粉复原后的10μl8倍浓缩的材料)，并相应地计算出系列稀释度。通过ELISA(如上的相同试剂盒)测量了WAP VI和LYOVI中多种生长因子的浓度。在用WAP VI和LYO VI处理过的孔中，增殖测定期间添加到孔中的实际浓度(最高浓度)分别如下：TGF-β-180和2000ng/ml；bFGF-120和1000pg/ml；VEGF-1.1和11.7ng/ml；PDGF-AB-84.4和36.6ng/ml；以及EGF-3.6和24.4ng/ml。

作为阳性对照，使用了PRP-R。PRP-R由10个供体的混合PRP制得。简而言之，在室温下将400ml/袋的10袋全血(MDA，血库，Israel))均以850Xg离心10分钟。然后在室温下将得自各袋的80ml上清液以850Xg单独地再离心10分钟。采集了30ml(得自各袋)的PRP上清液，在2-8℃下贮存过夜。第二天将PRP用1.5ml1000IU/ml的凝血酶和lml2M的CaCl₂在室温下活化1小时，然后在4℃下以3000g离心10分钟。最后将所有10个供体的上清液混合并通过滚转运动一起混合约10分钟。将该混合的PRP-R储液(170ml的总体积)用作本实验的PRP-R原料。PRP-R中TGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB和EGF的浓度如下：-15ng/ml；-2pg/ml；-90pg/ml；-9ng/ml；和-80pg/ml。将制得的PRP-R在合适的饥饿培养基中进行5倍连续稀释，然后将起始PRP-R以及各稀释样取10μl添加到孔中。将PRP-R的起始浓度指定为10(因为其与冻干前的血小板提取物相当)。

在处理开始后48小时通过使用WST-1细胞增殖试剂进行温育评价了增殖(将无任何添加剂的细胞用作背景并从OD值中减去)。在温育期(4小时)结束时，将板震摇1分钟，然后如上所示测量了样品的吸光度。测试一式三份地进行。将通过WST-1细胞增殖试剂获得的OD结果针对实际添加到细胞中的血小板提取物浓度(如上所阐述)作图。结果示于图18中。结果表明，渐增浓度的LYO VI、混合的WAP VI和PRP-R增加了3T3-Swissalbino成纤维细胞的增殖水平，而LYO VI的影响较不明显。

实例18：由混合的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制得、经S/D 处理、用硫酸葡聚糖温育、用硫酸葡聚糖洗脱了SDR、经巴氏灭菌和浓缩 的冻干血小板提取物。

在此实验中，如下所述制备了冻干血小板提取物：对10袋WAP单独称重，用70％乙醇擦拭，切开然后将冷冻的材料置于大烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中。对空袋称重，将空袋与满袋之间的重量差用于计算WAP净重。混合的WAP的总净重为1916克。将混合的材料在25℃下缓慢混合，直至完全解冻(与实例9中所用相同的搅拌条件)。混合的WAP的同渗容摩为272mOs。将21lml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(达到20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的最终浓度，pH6.8-7.4)和0.2％v/v(占溶液最终体积的百分比)人血清白蛋白(HSA，Talecris USA)添加到混合的WAP中。为了在整个过程中尽可能恒定地保持同渗容摩水平，使用NaCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)将缓冲液的同渗容摩调节到WAP原料的同渗容摩。

如之前所述通过在以50RPM混合的同时向混合样品中缓慢添加1％Triton X-100和0.3％TnBP(v/v)而进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳，将S/D处理分成两个部分。首先，将样品连续搅拌30分钟，然后通过20和3μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μmSartopore2(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France)过滤。接着，将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中，并以50RPM再混合2小时以继续病毒灭活工艺。

已知的是硫酸葡聚糖会结合某些生长因子。因此，研究了硫酸葡聚糖的添加对血小板因子回收率的影响。将硫酸葡聚糖(Sigma-Aldrich，Canada；目录号D4911)添加到样品中达到1％(w/w)的最终浓度，然后在50RPM搅拌下在25℃下温育20分钟。将样品用5μm Sartopore PP2过滤器过滤以移除颗粒物。

接下来，采用以下设备进行了S/D移除：填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱，结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO，NE，USA)。将柱用900ml包含1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液平衡。将1800ml经S/D和硫酸葡聚糖处理过的血小板提取物(含1620ml的血小板材料)上样到柱上，然后是用600ml含12.5％乙醇、0.5M NaCl、0.1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行的洗脱步骤。其后用600ml含1％硫酸葡聚糖和0.2％HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(与用于之前步骤中的溶液相比被视为非等度的)进行洗涤。接着，将柱用300ml纯化水洗涤。从柱收集了3000ml总体积。使用3和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(Sartorius Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France)对收集的材料进行过滤。在下一步中，使提取物经受如实例4中所述的稳定化和巴氏灭菌。通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(如上)渗滤而进行了稳定剂的移除。然后将渗析溶液浓缩至480ml的体积(其为起始体积的大约27％)。

对于稳定化，将甘露糖醇以2％w/w的最终浓度添加到溶液中。为了移除聚集的材料，将样品通过3μm Sartopure PP2过滤器和0.45μm Sartopore2过滤器过滤。使用0.2μm Sartopore2过滤器在无菌条件下进行了无菌过滤。然后将获得的产品在无菌条件下等分成4ml的部分，并如上所详述进行冻干。将冻干材料在氮气氛围下和部分真空(0.6巴)中密封。

如上制得的冻干血小板提取物在本文称为“LYO VII”。LYO VII的病毒纯化步骤包括S/D处理，其包括在SD处理内的过滤子步骤。此步骤的过滤通过20、3和0.45μm过滤器进行。在SDR移除前将血小板提取物用硫酸葡聚糖进行处理。SDR步骤包括在硫酸葡聚糖的存在下使用非等度溶液进行的多个洗脱步骤。此外，进行了巴氏灭菌步骤和最终的无菌过滤。在渗析步骤中，渗析溶液的体积与起始体积相比浓缩为约1/4。

在LYO II-LYO IV和LYO VII的生产工艺中，在将样品上样到SDR色谱树脂前以及从SDR树脂收集样品后(在溶剂和洗涤剂移除后)测量了材料中的PDGF-AB和bFGF含量。不同生产工艺中PDGF-AB和bFGF的回收百分比在表7中示出。使用上述的商业ELISA试剂盒测量了PDGF-AB和bFGF含量。

表7：LYO II-IV和LYO VII中PDGF-AB和bFGF从SDR柱的回收 率。

如表7中所示，增加使用硫酸葡聚糖进行温育和在存在硫酸葡聚糖的情况下的洗脱显著改善了PDGF-AB和bFGF两者的回收率。bFGF的回收率为85％，而PDGF-AB的回收率为88％。

令人惊讶的是，LYO VII中从原料的PDGF-AB回收率从LYO VI中的1.5％增加到了LYO VII中的51％。此外，LYO VII中从原料的VEGF回收率从LYO VI中的37％增加到了LYO VII中的73％。

在用4ml重蒸馏水(DDW)复原后还测量了最终LYO VII材料中的PDGF-AB和bFGF浓度。PDGF-AB和bFGF的浓度分别为194，353和64pg/ml，对应于用作原料的每个血小板3.12×10^-5pg的PDGF-AB和1.03×10^-8pg的bFGF。

这些发现表明，向工艺步骤中添加硫酸葡聚糖对也在SDR柱下游的因子回收率具有有利的影响。

实例19：LYO VII对成纤维细胞的细胞增殖的影响。

使用3T3-Swiss albino细胞如实例5中所详述进行了LYO VII对细胞增殖的影响的研究。

将由4ml溶液冻干并与起始WAP体积相比浓缩到约1/4的LYO VII在0.5ml无菌纯化水中复原-8倍浓缩(与混合的WAP VII的起始体积相比总体浓缩为约1/32)。在复原后，将混合的WAP VII或复原的LYO VII在饥饿培养基中进行5倍连续稀释，随后将每种稀释样取10μl添加到包含100μl饥饿培养基的孔中。如上所阐述，将混合的WAP VII的起始浓度指定为2.5并相应地计算出系列稀释度，并且将LYO VII的起始浓度指定为80并相应地计算出系列稀释度。通过ELISA(与上面相同的试剂盒)检测了WAPVII和LYO VII中多种生长因子的浓度，在WAP VII和LYO VII中，增殖测定期间添加到孔中的实际浓度(最高浓度)分别为：TGF-β-260和2800ng/ml；bFGF-190和510pg/ml；VEGF-1.1和2lng/ml；PDGF-AB-114和1550ng/ml；PDGF-BB-21和150ng/ml；以及EGF-3.1和33.1ng/ml。

另外，在相同的测定中测试了如实例16中制备的WAP VI和LYO VI以用于活性比较(10μl如实例16中所述的连续稀释样；如实例17中所述进行了血小板提取物单位的标准化)。

在处理开始后48小时通过使用WST-1细胞增殖试剂评价了增殖(将无任何添加剂的细胞用作背景并从OD值中减去)。在使用试剂的温育期(4小时)结束时，将板震摇1分钟，然后如上所示测量了样品的吸光度。测试一式三份地进行。将通过WST-1细胞增殖试剂获得的OD结果针对实际添加到细胞中的冻干前的血小板提取物单位(如上所阐述)作图。使用GraphPad Prism软件进行了S形剂量响应分析，并在图线上显示了EC50值。结果在图19中示出。结果清楚地表明，LYO VII(EC501.26)与LYO VI(EC504.10)相比在诱导成纤维细胞增殖方面更强效，而它们的原料WAPVII和WAP VI(EC50分别为0.36和0.32)对成纤维细胞增殖水平的影响程度相同。LYO VII的增殖影响较之LYO VI更明显并且更接近起始WAP。

实例20：在以上实例制备的LYO II-VII中进行的制造步骤的比较。

表8总结了在所有LYO制备中进行的制造步骤。

表8：在所有LYO制备中进行的制造步骤。

*   洗脱在存在乙醇和NaCl的情况下进行。

**  洗脱在存在肝素的情况下进行。

*** 洗脱在存在硫酸葡聚糖的情况下进行。

实例21：根据本发明制备的血小板提取物中多种生长因子之间的比 率。

以下实例显示了根据本发明制备的血小板提取物中多种生长因子之间的比率；并研究了所得的比率是否接近生理比率。生理比率根据血清中的生长因子值进行计算。这些值得自用于上述生长因子测量的特定ELISA试剂盒的包装说明书。

血清是不含纤维蛋白原或其他凝结因子的血浆。血清包含通过活化的血小板释放的因子。

使用上述的特定商业ELISA试剂盒测量了LYO VII(在将其复原在4ml DDW中后)中TGF-b1、PDGF-AB和VEGF的水平，并计算了PDGF-AB∶TGFbl之间以及PDGF-AB∶VEGF之间的比率。生长因子水平和比率分别在下表9和10中示出。

表9：LYO VII和血清中TGF-b1、PDGF-AB和VEGF的水平*。

生长因子	血清**	LYO VII
			TGF-b1	40	343
PDGF-AB	20	194
			VEGF	0.22	2.6

*  值的单位为ng/ml。

** 得自用于上述测量的特定ELISA试剂盒包装说明书的血清中可检测值的平均值。

表10：LYO VII和血清中计算得到的生长因子比率。

表10中给出的结果表明LYO VII包含0.56的PDGF-AB∶TGF-b1比率(与血清中的生理比率0.5相近)和74的PDGF-AB∶VEGF比率。据发现，两个比率均在上述实例的原料(WAP)的计算比率范围内。

实例22：根据本发明制备的血小板提取物的凝血活性。

以下实验的目的在于确定LYO VI-VII是否具有促凝活性。通过非活化的部分凝血活酶时间测量试验(NAPTT)评估了血小板提取物中是否存在活化的凝血因子。该测试基于European Pharmacopoeia7.0.；2.6.22：Activatedcoagulation factors monograph(01/2008：20622)；European PharmacopoeiaStrasburg(France)，Council of Europe，2009中所述测定法而进行。

一般来讲，该测试包括向人血浆中添加磷脂(兔脑磷脂，Pel-Freez，目录号41053-2)和钙以使得能够引发凝血级联。人标准血浆(Unicalibrator，Diagnostica Stago，目录号0625或凝血参考品，TC technoclone，参考号5220120)中所含的无活性凝血因子在添加包含活性凝血因子的样品后发生活化，从而导致血浆凝血酶原转化成活性凝血酶。因此，血浆纤维蛋白原立即转化成不溶性纤维蛋白(凝块形成)，并可通过凝血计(STart4凝血分析仪，Diagnostica Stago，Asnières sur Seine(France))测量凝结时间。上述参考对照样品中因子活化的过程通常耗时4-7分钟。在平行实验中，将血小板提取物的样品加入人标准血浆中，并如上测量凝结时间。将所得的结果除以参考对照样品的结果。将计算得到的比率用作所测试的血小板提取物样品促凝活性的量度。低于1的比率表示所测试的样品包含活化的凝血因子并因此具有促凝活性。

在测量前将所测试的血小板提取物用4ml纯化水(PuW)复原。

表11：LYO VI-VII的促凝活性。

*三次测量的平均值。

表11中给出的结果表明，根据本发明制备的血小板提取物通过NAPTT测定法评估不具有促凝活性。

实例23：确定根据本发明制备的血小板提取物是否存在凝血因子。

以下实验的目的在于确定LYO VI-VII是否包含凝血因子。通过活化的部分凝血活酶时间(APTT)[也称为高岭土-脑磷脂凝固时间(KCCT)或高岭土部分凝血活酶时间(PTTK)]测定了血小板提取物中是否存在凝血因子(活化的和非活化的因子)。

APTT是一种内在凝血途径的一般性凝血筛查试验，可评估血浆衍生样品发生凝血的潜力。APTT检测以下凝血因子是否存在：因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II(凝血酶原)和I。

该测定法涉及在存在标准量的脑磷脂(即磷脂)和因子XII活化剂(高岭土)的情况下血浆的复钙作用。将该测定法设计为限度试验，其中所测试的样品应在999秒后表现出无凝结。

通过使用KIT试剂C.K.(Diagnostica Stago，参考号00597，含试剂1和试剂2)根据制造商的说明进行了测定。在进行APTT试验前，将所测试的LYO用4ml纯化水(PuW)复原。

表12：确定凝血因子是否存在。

*RSD-相对标准偏差。

结果表明，根据APTT试验，根据本发明的血小板提取物缺乏凝血因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II和I中的一种或多种，从而使得提取物为不可凝固的。

实例24：根据本发明制备的血小板提取物在体内模型中对血管生成水 平和总体愈合的影响。

使用大鼠皮下植入模型研究了根据本发明制备的血小板提取物对血管生成和总体愈合的影响。这一模型通常用于评估植入组织中的组织反应、血管生成和总体愈合[国际标准化组织(ISO)10993-6，Biological Evaluation ofMedical Devices-第6部分：Tests for Local Effects After Implantation(2007)]。

在植入3天和7天后评价了两个参数。

本实验中使用了10只雌性大鼠。每只动物具有沿着背部两侧在皮下组织中通过手术形成的两个皮下囊袋(总共4个囊袋)。将每个囊袋填充以下供试品之一：纤维蛋白密封剂+1X血小板提取物、纤维蛋白密封剂+0.1X血小板提取物(1X中所用血小板提取物量的10％)、仅纤维蛋白密封剂和盐水。

供试品的制备和施用：

纤维蛋白密封剂+1X血小板提取物-通过将如实例16中由4ml血小板提取物溶液制备的冻干血小板提取物(与LYO VI的制备相似)用2ml纤维蛋白原溶液(EVICEL^TM纤维蛋白密封剂的BAC组分的溶液，OmrixBiopharmaceuticals Ltd.)复原而制备了1X血小板提取物。将血小板提取物-纤维蛋白原混合物取100μl与100μl凝血酶溶液(EVICEL^TM纤维蛋白密封剂的凝血酶组分的溶液，Omrix Biopharmaceuticals Ltd.，但在40mM氯化钙溶液中稀释到20IU/ml的浓度；最终凝血酶浓度为10IU/ml)混合。将200μl血小板提取物-纤维蛋白原-凝血酶混合物施用到上述形成的囊袋的一个中。

纤维蛋白密封剂+0.1X血小板提取物-通过冻干400μl如实例16中制备的血小板提取物溶液并将冻干物用2ml纤维蛋白原溶液复原而制备了0.1X血小板提取物。将血小板提取物-纤维蛋白原混合物取100μl与100μl经稀释的凝血酶溶液混合(所用的纤维蛋白原和稀释的凝血酶溶液如上所指定)。将200μl血小板提取物-纤维蛋白原-凝血酶混合物施用到第二个囊袋中。

在0.1X和1X中实际施用的多种生长因子的量分别为：TGF-b1：5.27和52.7ng；PDGF-AB：0.1和1.05ng；bFGF：0.0024和0.024ng；以及VEGF：0.023和0.23ng(与200ml纤维蛋白密封剂一起施用)。

纤维蛋白密封剂-将100μl纤维蛋白原溶液与100μl经稀释的凝血酶溶液(如上)混合。将最终混合物施用到第三个囊袋中。

盐水-将200μl盐水施用到第四个囊袋中并用作对照组。

靠近置于每个囊袋内的位置标记[经蒸汽灭菌的高密度聚乙烯(HDPE)，大小为1mm×1mm×5mm](以便标记施用的精确位置以供随后评估)进行了四个供试品的施用。

将五只动物在各时间点(植入后第3天和7天)进行人道处死，并采集所有四个植入部位(在每个时间点从每只动物采集)并浸入10％的中性缓冲福尔马林中。由每个植入部位制作多个切片，并对切片进行处理以便用于显微评估。将组织学切片用苏木精和伊红染色。

使用以下规定的主观评级量表，通过显微镜评估了不同测试组植入区域中的血管生成和总体愈合：

血管生成评级量表：

0＝无；1＝差：有限性、局灶性或节段性，制剂渗透有限，1-3个新生血管芽以及有限的成纤维细胞支持结构；2＝一般：局灶性、多灶性或弥漫性制品渗透，明显的成组毛细管，具有充分的成纤维细胞支持；3＝好：制品被组织完全渗透，毛细管具有成纤维细胞支持结构；以及4＝优异：优于所评价的研究间隔的预期。

总体伤口愈合评级量表：

0＝无；1＝差：差于对照植入部位，差于外科手术和植入后时间的预期；2＝一般：几乎与对照植入部位相同或与对照植入部位相同，与外科手术和植入后时间的预期大致相同；3＝好：略优于外科手术和植入后时间的预期；以及4＝优异：优于植入后时间的预期。

不同供试品的血管生成和愈合的平均评分值在下表13中示出。

表13：在不同的时间间隔对不同供试品植入后的血管生成和总体愈合 的平均评分。

*总体愈合无法在植入3天后适当地评分，因为研究间隔非常短(时间不足以实现在微观上明显的“愈合”)。

在两个间隔中，未观察到用各种供试品处理后的有害作用(经显微测定在植入部位仅存在少量的巨噬细胞和淋巴细胞)。

在植入3天后，在两个所测试的参数中，未观察到不同供试品之间的显著差异或趋势。因此，3天的间隔作为其余研究间隔的基线。

植入7天后，与其他供试品相比，纤维蛋白密封剂+1X血小板提取物导致了更多的血管生成和更佳的总体愈合(参见表13的平均评分)。纤维蛋白密封剂+1X血小板提取物的7天血管生成评级高于植入3天后观测到的评级。

与仅有纤维蛋白密封剂和盐水的供试品相比，纤维蛋白密封剂+0.1X血小板提取物表现出更多的血管生成和更佳的总体愈合的趋势。

实例25：在S/D移除步骤中的洗脱步骤期间不同非等度条件的影响。

在以下实例中，研究了在HIC S/D移除步骤期间不同的洗脱条件对PDGF-AB和bFGF的回收率的影响。

使用两种不同类型的疏水性树脂进行了实验：HyperD SDR(PALL)和C-18(Waters)。两者均基于二氧化硅。C-18具有18碳疏水性聚合物部分，而HyperD则具有交联到二氧化硅小球的疏水性聚合物并涉及与分子排阻效应相关的混合模式吸附[Guerrier L等人，“Specific sorbent to removesolvent-detergent mixtures from Virus-inactivated biological fluids”.JChromatogr B Biomed Appl.1995年2月3日；664(1)：119-125]。

用2ml树脂填充1em直径的Bio-Rad柱(小规模试验)。所用的最大流速为：0.3ml/min。

在以下所有实验中，如下制备了经S/D处理的血小板裂解物：将10ml含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和1％HSA v/v(占溶液最终体积的百分比)的经洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)在37℃下解冻(在添加醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液后将混合的WAP材料冷冻)。在下一步中，将1％Triton X-100和0.3％TnBP加入溶液中，然后将溶液在室温(22+2℃)下温育和混合(在滚轴混匀仪上)2小时以进行血小板裂解和抗病毒处理。然后将裂解物经10μm和5μm针式过滤器过滤以移除任何颗粒物。

除非另外指明，否则在上样经S/D处理的裂解物之前将树脂填充柱用10ml纯化水洗涤，然后用10ml醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液(如上的相同浓度；在所测试的pH水平下)平衡。在下一步中，将9ml经S/D处理的裂解物上柱，然后用10ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液+HSA(如上的相同浓度；在所测试的pH水平下)洗涤。在该洗涤步骤之后，是如下所详述的采用10ml经补充的醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液(非等度溶液)的不同洗脱步骤。收集并混合经洗涤和洗脱的材料。

在所有实验中，在向色谱树脂上样前以及从树脂收集样品后(在溶剂和洗涤剂移除后)测量了裂解物中的PDGF-AB和bFGF含量，并计算了不同洗脱步骤中因子的回收百分比。使用上述的特定商业ELISA试剂盒测量了两种因子的含量。

第一组实验研究了在S/D移除期间醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液的NaCl含量和pH水平对PDGF-AB回收率的影响。将醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液补充了不同的NaCl浓度(0.3-1.5M)，并将经补充的缓冲液用作非等度溶液进行了SDR洗脱步骤。

表14：NaCl浓度和pH对PDGF-AB从SDR或C-18树脂的回收率的影 响。

结果表明，当使用C-18树脂时，在使用0.3M直至1M NaCl范围内的浓度进行HIC后，洗脱缓冲液中NaCl浓度与PDGF-AB回收率之间存在正相关性。在1M的浓度下获得了最佳的结果(约30％的PDGF-AB回收率)。所测试的pH未影响回收率。

当使用SDR树脂时，在所有NaCl测试浓度(0.7和1.5M)下获得了相似的回收率。另外，据观察，当使用SDR作为树脂时，与使用C-18作为树脂时相比获得了较高的PDGF-AB回收率(在3和7中比较PDGF-AB回收率)。

另一组实验研究了在S/D移除期间向醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液中添加NaCl和乙醇对PDGF-AB从SDR或C-18柱的回收率的影响。为此，将醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液补充了不同的NaCl和乙醇浓度，并将经补充的缓冲液用作非等度溶液进行了SDR洗脱步骤。

表15：NaCl和乙醇洗脱对PDGF-AB从SDR或C-18柱的回收率的效 率。

	树脂	pH	NaCl(M)	EtOH(％)	PDGF-AB回收率(％)
						1	C-18	7	0.5	10	28.2
2	C-18	7	0.5	20	32.1
						3	C-18	7	1.0	20	48.8
4	SDR	7	0.5	20	46.8
						5	SDR	7	1.0	10	41.7
6	SDR	7	1.0	20	73.1

结果表明，除了NaCl外再向溶液中添加乙醇导致了与仅使用NaCl相比更高的回收率(将表15中的1和2与表14的2进行比较；并将表15的3与表14的4进行比较)。另据观察，通过1M NaCl和20％乙醇在两种树脂类型中均得到了最高的PDGF-AB回收率，而SDR树脂具有更高的回收率。

在前一组实验中，经证实，通过补充了1M NaCl和20％乙醇的醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液在两种树脂类型中均获得了最大的PDGF-AB回收率。在以下一组实验中，评价了相同条件(补充了1M NaCl和20％乙醇的醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液)下S/D材料(TritonX-100和TnBP)的移除效率。值得注意的是，血液衍生产品中Triton X-100和TnBP每一者的容许极限为5μg/ml。在S/D移除步骤后测量了收集的级分中的Triton X-100和TnBP浓度。Triton X-100通过反相HPLC和紫外检测器测定，而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。还评价了在与未经受非等度条件洗脱的LYO IV相似的方式制备的经S/D处理的裂解物中S/D材料的水平(大规模制备，但是程序在S/D移除步骤后结束)。结果示于下表16中。

表16：SDR或C-18色谱后收集的材料中的S/D材料浓度。

*NA-不详。

结果表明，通过1M NaCl和20％乙醇(在之前的实验中经确定为有效的PDGF-AB回收率)执行洗脱步骤导致了血小板溶液中存在相对高含量的S/D材料(如5.7或0.6μg/ml的Triton X-100浓度)。然而，当使用较低浓度的NaCl和/或乙醇时，在S/D材料移除步骤后在血小板溶液中检测到了较低浓度的TritonX-100和TnBP。

另外，结果表明，在相同的实验条件下，与使用SDR树脂相比当使用C-18树脂时检测到了较少的S/D材料(将2与4比较并且将3与5比较)。

在下一步中，通过在SDR步骤期间使用NaCl和乙醇的组合执行洗脱步骤而研究了b-FGF的回收率。研究了不同的离子强度和不同的乙醇浓度。在此实验中，使用了SDR树脂。

表17：添加到醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液中的NaCl和乙醇对bFGF从 SDR柱的回收率的影响。

结果表明，经证实可有效改善PDGF-AB回收率的所测试的非等度条件对b-FGF的回收率具有较小的影响(将1与2-5进行比较)。

为了尝试在洗脱步骤期间增加b-FGF的回收率并进一步增加PDGF-AB的回收率，研究了向非等度溶液添加肝素的影响。测试了肝素，因为已知其会结合某些生长因子。在此实验中，使用了SDR树脂。在不同洗脱条件下b-FGF回收率的结果在下表18中示出。

表18：在洗脱步骤期间与NaCl/乙醇结合的肝素对b-FGF从SDR柱的 回收率的影响。

	pH	肝素(IU/ml)	NaCl(M)	EtOH(％)	b-FGF回收率(％)
						1	7	10	0	0	16.4
2	7	100	0	0	17.5
						3	7	2	0.5	12.5	44.3
4	7	5	0.5	12.5	44.8
						5	7.5	5	0.5	15	44.2
6	7	30	0.5	15	55
						7	7.3	5	1.0	10	22.1

结果表明10和100IU/ml浓度的单独的肝素具有较低的积极作用(将表18的1和2与表17的1比较)。然而，2-30IU/ml浓度范围的肝素与0.5M浓度的NaCl以及12.5-15％浓度范围的乙醇的组合导致了与仅使用肝素相比b-FGF回收率出现协同增加(将3-6与1-2比较)。将NaCl浓度从0.5M增至1M连同将乙醇浓度降至10％导致了回收率降低到约22％。

结果还表明在所测试的条件下，在洗脱步骤期间添加肝素不影响PDGF-AB的回收率(数据未示出)。

为了尝试进一步提高PDGF-AB和b-FGF从SDR柱的回收率，在以下实验中，在S/D移除步骤前将裂解物用硫酸葡聚糖温育和/或将其添加到洗脱步骤中。与肝素相似，硫酸葡聚糖是一种能够结合多种生长因子并使b-FGF和VEGF稳定的硫酸化多糖[Kajio，Kawahara & Kato(1992)FEBS，第306卷，第243-6页；Huang等人，(2007)Biomacromolecules，第8卷，第1607-14页]。以表19中所详述的川页序进行了洗涤和洗脱。

单独地或结合NaCl和EtOH测试了硫酸葡聚糖(0.1％或1％)。在室温下用硫酸葡聚糖(条件I-L)将裂解物温育了15分钟。

表19：在不同条件下的PDGF-AB和b-FGF回收率。

*  条件包括在洗脱1前采用醋酸盐-甘氨酸-HSA的洗涤步骤。

** 条件包括在洗脱1和2前采用醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液的附加洗脱步骤。

“条件”缩写为Con.；“平衡”缩写为Eq.；“醋酸盐-甘氨酸-HSA”缩写为AGH；“硫酸葡聚糖”缩写为D.S.。

如表19中所见，洗脱溶液的顺序在PDGF-AB和b-FGF的回收水平中发挥着作用。例如，将条件A的回收率与B或E和F进行比较，其中洗脱顺序颠倒，且生长因子的回收率受到了影响。

另外，缓冲液的组成也影响所测试生长因子的回收率，其中条件K最有利于PDGF-AB和b-FGF的回收(分别为62％和51％)。

Claims (34)

1. 一种用于制备病毒安全血小板提取物的方法，所述方法包括至少两次正交病毒灭活处理并包括以下步骤：

提供来自多个供体的富含血小板的成分；

制备血小板裂解物；

进行溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理；

通过疏水相互作用色谱(HIC)移除所述S/D，其中所述HIC包括以下步骤：将所述裂解物上样到HIC，并收集在非等度条件下洗脱的材料；以及

进行第二正交病毒灭活处理。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中制备所述血小板裂解物在所述S/D病毒灭活处理过程中进行。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述S/D病毒灭活处理过程中进行减除聚集体的子步骤。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述聚集体减除通过过滤进行。

5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述HIC包括以下步骤：将所述裂解物上样到HIC；用等度溶液洗涤HIC；收集所述未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC；以及收集所述洗脱的材料。

6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中所述非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。

7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，还包括在S/D移除之前使所述裂解物与能够结合血小板衍生因子的分子接触。

8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中所述分子选自肝素、硫酸葡聚糖以及它们的组合。

9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二正交病毒灭活处理包括热灭活。

10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述富含血小板的成分为得自多个供体的混合单采经洗涤和/或白细胞减除的血小板成分。

11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括冻干所述提取物。

12. 一种能够根据权利要求1至11中任一项所述的方法获得的病毒安全血小板提取物。

13. 一种来源于多个供体的病毒安全血小板提取物，包含生物活性血小板细胞生长因子和/或营养因子的混合物。

14. 根据权利要求13所述的提取物，包含PDGF-AB、VEGF和TGFb1，其中PDGF-AB: TGF-b1的比率为至少0.2；和/或PDGF-AB: VEGF的比率为至少45。

15. 根据权利要求12至14中任一项所述的提取物，富含PDGF-AB。

16. 根据权利要求12至15中任一项所述的提取物，富含bFGF。

17. 根据权利要求12至16中任一项所述的提取物，为不可凝固的。

18. 根据权利要求12至17中任一项所述的提取物，具有低聚集体含量。

19. 根据权利要求12至18中任一项所述的提取物，其中所述提取物为固体形式。

20. 根据权利要求12至19中任一项所述的提取物，其提供有递送剂。

21. 根据权利要求20所述的提取物，其中所述递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成：聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。

22. 根据权利要求12至21中任一项所述的提取物，其用于组织愈合、器官重建、组织再生和/或治疗炎症。

23. 一种组织愈合、器官重建和/或组织再生的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求12至21中任一项所述的提取物。

24. 一种治疗有需要的受试者的炎症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求12至21中任一项所述的提取物。

25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述提取物通过递送剂施用。

26. 一种通过疏水相互作用色谱(HIC)从生物液体混合物中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤：

提供所述生物液体混合物；以及

将所述混合物上样到HIC，收集所述未结合的材料和非等度条件下洗脱的材料。

27. 一种通过HIC从生物液体制剂中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法，包括以下步骤：

提供所述制剂；

将所述制剂上样到HIC；以及

收集非等度条件下洗脱的材料。

28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述生物制剂为血小板衍生的制剂。

29. 根据权利要求27或28所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：将所述制剂上样到HIC；用等度溶液洗涤HIC；收集所述未结合的材料；用非等度溶液洗涤HIC；以及收集所述洗脱的材料。

30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述等度溶液由醋酸盐-甘氨酸缓冲液和人血清白蛋白组成；并且其中所述非等度溶液包含有机溶剂和/或能够结合血小板衍生因子的分子。

31. 一种能够根据权利要求26至30中任一项所述的方法获得的病毒安全制剂或混合物。

32. 一种试剂盒，包括包含根据权利要求12至19中任一项所述的提取物的容器。

33. 根据权利要求32所述的试剂盒，还包含递送剂。

34. 根据权利要求32或33所述的试剂盒，其中所述递送剂由选自以下的天然和/或合成材料制成：聚合物、水凝胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、琼脂、氧化再生纤维素、自组装肽、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。

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