JP2014501757A - ウイルス不活化血小板抽出物、その使用及び調製 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルスに対して安全な血小板抽出物、その調製、及び使用に関する。抽出物は、生物活性血小板由来因子の混合物を含む。
有利には、抽出物は、バランスのとれた比率の因子を含み、かつ非凝固性である。

Description

本発明は、複数のドナーに由来するウイルス不活化血小板抽出物、及びその調製及び使用に関する。

血小板は、止血及び治癒において根本的な役割を果たす、小さくて不規則な形の無核細胞である。血小板は、あらかじめ合成されたタンパク質の完全なアレイを含み、その中にはシグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、膜タンパク質、及び調節タンパク質がある。血小板は、主に、成長因子（ＧＦ）、サイトカイン、及びケモカインなどの数多くの生物活性分子を含む血小板顆粒の含有により、治癒損傷における組織再生及び治癒の主要段階に関与する。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血小板成長因子は、次の創傷治癒カスケード：炎症、増殖、及び組織修復段階の全ての段階における中心的存在である。

研究により、血小板由来成長因子は、血管形成、有糸分裂誘発、細胞増殖、好中球及びマクロファージ、コラーゲン合成、創面収縮、細胞外マトリックス合成、上皮形成、並びに走化性を刺激することが示されている。

血小板は、例えば止血を改善するために、輸血で日常的に使用される。近年、血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）（ＰＲＰゲル、血小板ゲル、ＰＲＰクロットなどとも呼ばれる）の形態で用いられることが多くなっている。典型的には、ＰＲＰは、一定限度の量の血漿に濃縮された自己血小板からなるエクスビボ調製物である（Ｌａｃｃｉ ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ Ａ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ：ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１０ Ｍａｒ；８３（１）：１〜９）。

局所適用の場合、ＰＲＰは、通常、トロンビン及び／又はＣａＣｌ_２を加えることによって活性化され、トロンビン（内因性又は外因性）とフィブリノーゲンとの間の相互作用によってフィブリンゲルが形成される。活性化すると、血小板は活発に脱顆粒し、成長因子を含む様々なメディエーターを放出する（Ｌａｃｃｉ ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ Ａ，２０１０）。注射でのＰＲＰの使用は現在、小さいが急成長している市場分野となっている。軟組織及び硬組織の増強においてＰＲＰを使用する理論的根拠は、非治癒損傷における組織再生を増進する、創傷成熟、脈管化、及び上皮形成を早める、瘢痕形成を低減する、並びに術後の合併症及び死亡率を低減するその能力である（Ｌａｃｃｉ ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ Ａ，２０１０）。

活性化ＰＲＰを様々な細胞型と共に用いた研究は、ＰＲＰから放出された因子、例えば成長因子が、細胞増殖を誘発し得る（例えば、Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．２００５ Ｍａｒ；６３（３）：３６２〜９；Ｂｅｒｔｒａｎｄ−Ｄｕｃｈｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．２０１０ Ｆｅｂ；４５（１）：８７〜９３；Ｋａｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ ｏｎ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ．２００８ Ｎｏｖ；１２２（５）：１３５２〜６０）、ヒト内皮細胞の血管形成能を調節し得る（Ｓｕｌｐｉｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＶＥＧＦ−Ａ ａｎｄ ＨＧＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｓｅｐ；１０１（９）：５２５〜３９；Ｒｕｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｅｌ−ｒｅｌｅａｓｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．２００８ Ｊａｎ；６（１）：１２〜７）、及び骨芽誘発特性を誘発し得る（Ｉｎｔｉｎｉ Ｇ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ ｉｎ ｂｏｎｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００９ Ｏｃｔ；３０（２８）：４９５６〜６６）ことを示している。更に、活性化ＰＲＰは、インビトロ細胞成長を支援することが見出され、かつ、骨髄腫細胞、融合細胞、肝細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞などの多くの標的細胞の生存能力を、ウシ胎児血清による支援レベルと同等又はそれより優れたレベルで維持した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ：ａ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ？ Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００３ Ｊｕｌ；４２（２）：６７〜７４）。

ＰＲＰ及び放出される成長因子は、現在、主に整形外科及び口腔外科における様々な外科的組織再生治療で用いられている（Ｎｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８ Ｍａｙ １；１３：３５３２〜４８）。整形外科では、ＰＲＰは、主に、膝関節形成術、腰椎固定術のため、及び椎間板変性において用いられる（ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｎｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８）。歯科及び顎顔面外科手術におけるＰＲＰの用途としては、主に、チタンインプラントの圧密、上顎洞底挙上術、及び骨再形成が挙げられる（ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｎｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８）。（Ｎｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８によると）ＰＲＰは、腱及び靱帯修復、顔面美容整形手術及び再建手術、慢性的な皮膚創傷の治癒、眼科学、顔面神経再生のため、並びに心臓手術及び肥満手術において使用されることも多くなっている。

しかしながら、自己ＰＲＰ及び放出因子の現行の使用の重大な短所は、標準化ができていないことにある。注目すべきことには、ＰＲＰの調製に関する様々なマニュアル、半自動及び完全に自動化されたシステムは商業的に入手可能であるが、調製時間、血小板収率、及び収集効率などのパラメータが異なっている（Ｍａｚｚｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｏｔ ｅｖｅｒｙ ＰＲＰ−ｇｅｌ ｉｓ ｂｏｒｎ ｅｑｕａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｏｕｒ ＰＲＰ−ｇｅｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｆｉｂｒｉｎｅｔ，ＲｅｇｅｎＰＲＰ−Ｋｉｔ，Ｐｌａｔｅｌｔｅｘ ａｎｄ ｏｎｅ ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．２００９ Ａｕｇ；９７（２）：１１０〜８）。

別の重要な変数は、血小板活性化のために用いる技術であり［自己、異種、又は組み換えトロンビン、塩化カルシウム、又はバトロキソビン（Ｒｏｚｍａｎ Ｐ，Ｂｏｌｔａ Ｚ．Ｕｓｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｉｅｓ．Ａｃｔａ Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ Ａｌｐ Ｐａｎｏｎｉｃａ Ａｄｒｉａｔ．２００７ Ｄｅｃ；１６（４）：１５６〜６５）］、該技術は、顆粒放出の効率及び分泌される成長因子の量に影響を与え得る（Ｒｏｚｍａｎ Ｐ，Ｂｏｌｔａ Ｚ，２００７）。更に、血小板は、機械的応力、及びその中で活性化される可能性がある周囲環境の変化に非常に敏感であるので、成長因子は、意図する活性化段階の前に、処理中に放出される場合がある（Ｍａｚｚｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ，２００９）。この無制御活性化は、異なるＰＲＰ調製システムを使用する場合、最終生産物の組成の変動性を更に増加させ得る。その上、自己ＰＲＰ調製の最大の固有の欠点は、血小板成長因子の含有量が個体間で異なり、したがって準最適な結果を招く可能性があることである。最後に、自己ＰＲＰを扱う仕事をするに当たっては、専用の機械、使い捨てＰＲＰ処理キット、及び訓練された人材の必要性による経済的負担を考慮する必要がある。

近年の刊行物（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｖｉｒａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ」．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．２００９ Ａｕｇ；９７（２）：１１９〜１２８）は、プールしたアフェレーシス血小板成分献血に由来する、凝固可能な機能的成長因子抽出物の調製を開示している。しかしながら、開示の凝固可能な調製物は、ウイルス不活性化工程を１回だけ含む、即ち、特にエンベロープウイルスに対して有効であるが、非エンベロープウイルスに対しては有効でない溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）によるウイルス不活性化のみを含むという欠点を有する。この刊行物は、第２のウイルス不活性化工程としてナノ濾過を適用する可能性を示している。この調製物は、血漿及び白血球タンパク質不純物も含有する。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＳ／Ｄ除去工程は、調製物中のＰＤＧＦを大幅に低減する。更に、調製物の凝固性能力は、その使用を局所適用に限定する、又はその全身性使用を妨げ得る。

Ｂｕｒｎｏｕｆ ｅｔ ａｌ．（「Ａ ｎｏｖｅｌ ｖｉｒａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｒｉｃｈ ｉｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ，ＥＧＦ ａｎｄ ＩＧＦ，ａｎｄ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｏｆ ＰＤＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦ」．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０ Ａｕｇ ６；５６（４）：１５１〜６０）は、標準含有量のＴＧＦ−β、ＥＧＦ、及びＩＧＦを有し、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦが欠乏した、Ｓ／Ｄ処理された血小板溶解物を開示している。この刊行物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＳＤの除去を回避したこの溶解物の調製方法を開示している。

成長因子及び／又は栄養因子活性を有するタンパク質の混合物を含む、複数のドナーから得られるウイルスに対して安全な血小板抽出物の調製物の必要性が存在する。

血小板は、組織再生及び治癒過程の主要段階に関与する因子の完全なアレイを含む。現在、創傷治癒を促進するために、（患者由来の）全自己活性化血小板が用いられている。しかしながら、全自己血小板の使用には、複数の欠点、とりわけ標準化の欠如が存在すること、患者自身の血小板に治癒に必要な因子が不足している場合があること、特殊な装置が必要であること、手順は時間がかかり、かつ患者自身が行う追加の工程を必要とすること、医学的に訓練された人材を必要とすること、が挙げられる。これらの問題は、例えば、複数のドナーから調製された血小板抽出物を用いることによって解決され得る。しかしながら、ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。更に、血小板抽出物を製造するための追加の工程は、その中に含まれる因子の回収及び活性を含み得る。

本発明は、成長因子及び／又は栄養因子の活性を有するタンパク質の混合物を含む、複数のドナー由来の、ウイルスに対して安全な（少なくとも二重ウイルス不活性化）血小板タンパク質抽出物の長年にわたる必要性を解決する。

本発明は、複数のドナー由来の、活性でウイルスに対して安全な血小板抽出物、並びにその調製及び使用に関する。

ウイルスに対して安全な血小板抽出物は、活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物を含む。

一態様において、本発明は、ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法に関し、該方法は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理、例えば、溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理と熱不活化とを含む。該方法は、
複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程、例えば、複数のドナーからプールしたアフェレーシスから、洗浄及び／又は白血球低減血小板分画を提供する工程と、
血小板溶解物を調製する工程と、
溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってＳ／Ｄを除去する工程であって、該ＨＩＣは、溶解物をＨＩＣに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、
第２の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む。

本発明の一実施形態において、血小板溶解物を調製する工程は、Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に行われる。

本発明の更なる実施形態によると、Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に、例えば濾過によって、凝集物低減のサブ工程が行われる。

本発明の特定の実施形態において、ＨＩＣは、溶解物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む。

更に、本発明の更なる実施形態において、定組成溶液は、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、非定組成溶液は、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む。

更に、本発明の更なる実施形態において、溶解物は、Ｓ／Ｄ除去の前に、血小板由来因子と結合することができる分子例えば、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせと接触させられる。

更に、本発明の更なる実施形態において、該抽出物は凍結乾燥される。

別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物に関する。

本発明は、生物活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来の、ウイルスに対して安全な血小板抽出物を提供する。

本発明の一実施形態では、該抽出物は、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、及びＴＧＦｂ１を含み、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比は少なくとも０．２である、及び／又はＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比は少なくとも４５である。

本発明の一実施形態では、該抽出物は、ＰＤＧＦ−ＡＢ及び／又はｂＦＧＦが濃縮される。

本発明の一実施形態では、該抽出物は非凝固性である。

本発明の一実施形態では、該抽出物は、凝集物含有量が少ない。

本発明の一実施形態では、該抽出物は固形である。

本発明の一実施形態では、該抽出物は、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される送達剤と一緒に提供される。

別の態様において、本発明は、組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び／又は炎症の治療における該抽出物の使用に関する。

別の態様において、本発明は、本発明による抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、組織治癒、臓器再構築、及び／又は組織再生の方法に関する。

別の態様において、本発明は、本発明による抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、必要とする被験体炎症を治療する方法
に関する。本発明の一実施形態では、該抽出物は送達剤と一緒に投与される。

本発明は、
生体液体混合物を提供する工程と、
混合物をＨＩＣに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって生体液体混合物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法を提供する。

本発明はまた、ＨＩＣによって生体液体調製物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法であって、該調製物を提供する工程と、調製物をＨＩＣに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法を提供する。

本発明の一実施形態において、生体調製物は、血小板由来の調製物である。

本発明の一実施形態において、該方法は、調製物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む。

本発明の一実施形態において、該方法は、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、非定組成溶液が、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、定組成溶液を含む。

別の態様において、本発明は、本発明の方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な高い調製物又は混合物を提供する。

更に別の態様において、本発明は、本発明による抽出物を収容し、任意に送達剤を含む容器を含むキットを提供する。

一実施形態において、送達剤は、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される。

異なる血小板抽出物調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質特性評価を示す。分子量マーカー［Ｂｉｏ−Ｒａｄ １６１−０３７４（レーン１）］；ヒト血清アルブミン［Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ ２５．（レーン２）］８μｇ；全血からの洗浄血小板（レーン３）１１μｇ；ＷＡＰ（レーン４）８μｇ；Ｓ／Ｄ処理後のＷＡＰ（レーン５）１４μｇ；Ｓ／Ｄ処理及びＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂精製によるＳ／Ｄ除去後のＷＡＰ（レーン６）１０μｇ。 「プールしたＷＡＰ」、「ＬＹＯ Ｉ」で処理した３Ｔ３細胞、又は未処理の３Ｔ３細胞（０）の増殖を示す。実験を３回ずつ行った。飢餓培地中で成長した細胞（「０」としてマークされている）を対照として用いた。^＊＊＊−ｐ＜０．００１（ｔ検定分析、「０」と比較）。 （Ａ）未処理の対照細胞（飢餓培地中で成長した細胞）又は（Ｂ）ＬＹＯ Ｉで処理した細胞の３Ｔ３−スイスアルビノ細胞形態の代表的光顕微鏡画像（倍率２００倍）を示す。 ＬＹＯ Ｉ（Ｂ）、２ＩＵ／ｍＬのトロンビン（Ｃ）；ＬＹＯ Ｉ＋２ＩＵ／ｍＬのトロンビン（Ｄ）；ＢＡＣ成分（Ｅ）；又はＬＹＯ Ｉ＋ＢＡＣ成分（Ｆ）を添加した場合のＨＵＶＥＣ形態の代表的光顕微鏡画像（倍率２００倍）を示す。（Ａ）は未処理の対照細胞。 ＬＹＯ ＩＩ（▲）又はプールしたＷＡＰ ＩＩ（■）が３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に与える増殖促進効果を示す。実験を３回ずつ行った。 ＬＹＯ ＩＩ、トロンビン（Ｔ、ウェル中の最終濃度１ＩＵ／ｍＬ）、及び１ＩＵ／ｍＬのトロンビン＋ＬＹＯ ＩＩによる誘発の後のＨＵＶＥＣ増殖を示す。アスタリスクは、ｔ検定分析（ｐ値は示されている）によって評価した場合に、ＬＹＯ ＩＩを用いない関連処理と比較して有意に異なる結果を表す。 基底膜抽出物（ＢＭＥ）でコーティングされたウェルに播種したＨＵＶＥＣによってもたらされた血管様構造を示す（陽性対照）。写真は、５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して倍率１００倍で撮られた。 ＬＹＯ ＩＩによる処理の後にＨＵＶＥＣによってもたらされた血管様構造を示す（Ｂ）。（Ａ）対照細胞。写真は、５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して２００Ｘの倍率で撮られた。 フィブリノーゲン（Ａ〜Ｃ）又はフィブリン（Ｄ〜Ｆ）でコーティングされたセルに播種され、ＬＹＯ ＩＩ（Ｂ、Ｅ）若しくはプールしたＷＡＰ ＩＩ（Ｃ、Ｆ）で処理された、又は未処理（Ａ、Ｄ）のＨＵＶＥＣの形態的外観を示す。写真は、５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して倍率１００倍で撮られた。 ＬＹＯ ＩＩＩ又はプールしたＷＡＰ ＩＩＩが３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に与える増殖促進効果を示す。ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＭＭ）を陽性対照として用いた。正規化は特異的ＥＬＩＳＡによって評価されたＰＤＧＦ−ＡＢ濃度に対して行われた。 トロンビン（Ｂ；最終濃度１ＩＵ／ｍＬ）、フィブリノーゲン（Ｃ；１１．３ｍｇ／ｍＬの総タンパク質）、ＬＹＯ ＩＩＩ（Ｄ）、フィブリン（トロンビン及びフィブリノーゲン）（Ｅ）、並びにフィブリン及びＬＹＯ ＩＩＩ（Ｆ）で処理されたＨＵＶＥＣの形態的外観を示す。Ａ−無処理の対照細胞。写真は、５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して倍率１００倍で撮られた。 異なる処理の後の３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルを示す。ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＭＭ；登録商標）を参照として用いた。正規化は特異的ＥＬＩＳＡによって評価されたＰＤＧＦ−ＡＢ濃度に対して行われた。全ての試験を３回ずつ行った。 ＬＹＯ ＩＶ（Ｂ）、プールしたＷＡＰ ＩＶ（Ｃ）、及びＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＭＭ；Ｄ）によって誘発された後の３Ｔ３−スイスアルビノの形態的外観を示す。（Ａ）未処理の細胞。写真は、位相差顕微鏡を使用して倍率２００倍で撮られた。 ３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞を使用して実施したインビトロでの創傷スクラッチアッセイの代表的位相差画像（倍率１００倍）を示す。細胞を、未コーティングの表面（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、Ｍ）、コラーゲン（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ）、又はフィブリノーゲン（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ）でコーティングされたウェルの表面といった異なる表面に播き、ｐ２００ピペットチップで創傷をつけた。創傷は、時点「０」（Ａ，Ｂ，Ｃ）、及びＬＹＯ ＩＶ（Ｇ，Ｈ，Ｉ）、プールしたＷＡＰ ＩＶ（Ｊ，Ｋ，Ｌ）、又はＰＲＰ−Ｒ（Ｍ，Ｎ，Ｏ）による処理から２４時間後（Ｄ〜Ｏ）にキャプチャされた。 創傷修復の定量的評価を、異なる処理群において処理の開始から２４時間後に残っている割合として示す。細胞を異なる表面（未コーティング、コラーゲン又はフィブリノーゲンでコーティングしたウェル）に播き、単層をｐ２００ピペットチップで引っかいた後、ＬＹＯ ＩＶ、プールしたＷＡＰ ＩＶ、又はＰＲＰ−Ｒを用いて処理した。残った創傷の％を、各場所において２４時間後に残っている距離と開始距離との比として算出した。結果は、６つの複製物の平均±標準偏差として示されている。ｔ検定分析を実施し、統計的有意性はｐ＜０．０５として決定した。＊各表面毎に未処理のウェル（０）と比較；＃未コーティング表面上の関連処理と比較。 ＢＭＥコーティングされたウェルに播種され、ＬＹＯ ＩＶ（Ｂ）又はプールしたＷＡＰ ＩＶ（Ｃ）で処理されたＨＵＶＥＣの形態的外観を示す。（Ａ）ＢＭＥコーティング上に播種された未処理のＨＵＶＥＣ。写真は、５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して倍率６０倍で撮られた。 ＬＹＯ Ｖ又はプールしたＷＡＰ Ｖが３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に与える増殖促進効果を示す。組み換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢを対照として用いた。 ＬＹＯ ＶＩ又はプールしたＷＡＰ ＶＩが３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に与える増殖促進効果を示す。プールしたＰＲＰ放出物を対照として用いた。 ＬＹＯ ＶＩ及びプールしたＷＡＰ ＶＩＩ、又はＬＹＯ ＶＩＩ及びプールしたＷＡＰ ＶＩＩが、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に与える増殖促進効果を示す。

本発明は、複数のドナーに由来する、活性を有しかつウイルスに対して安全な（少なくとも二重ウイルス不活性化）血小板抽出物、並びにその調製及び使用に関する。ウイルスに対して安全な血小板抽出物は、生物活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物を含む。

全血輸血から得られる洗浄血小板と比べて、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）は、微量のアルブミンと、場合によっては、少量の他の血漿不純物とを含有することが、本発明により見出された。Ｓ／Ｄ処理（溶解及びウイルス不活性化）、Ｓ／Ｄ除去、凍結乾燥、及び再構成に供されたＷＡＰ（例えばＬＹＯ Ｉ抽出物）は、生体的に活性であり、細胞株、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又は３Ｔ３線維芽細胞において増殖及び／又は形態の変化、例えば、血管様構造形成（血管形成と関連する）又はスピンドル様構造の形成（運動性の増加の特性）を誘発することができることも見出された。該抽出物の活性は、トロンビン、生物活性成分（ＢＡＣ；Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．製のＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤において見られるようなフィブリノーゲン成分）、又はトロンビン＋ＢＡＣ（Ｆｉｂｒｉｎ）を添加することによって増加することが観察された。

ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。通常は、ウイルス及び／又は未知の病原体を伝播させる危険性を最小限に抑えるためにいくつかの手段がとられ、該手段には、特定のウイルスが存在するかどうかに関する提供されたサンプルの定期試験、及び製造プロセスの間のウイルス不活性化／除去工程などが含まれる。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、製品の有益な特性を変更しない少なくとも２つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びウエストナイルウイルスなどの脂質エンベロープウイルスは、ウイルスの脂質膜を破壊するＳ／Ｄ処理によって、迅速かつ効果的に不活性化される。

次に、抽出物は、第２のウイルス不活性化処理、例えば、熱処理（低温殺菌）工程又はナノ濾過に供された。抽出物はナノ濾過システムを容易に通過できないことが、本発明によって見出された。

驚くべきことに、熱処理（低温殺菌）によるウイルス不活性化工程は実行可能であり、細胞増殖アッセイ及び形態変化の誘発（例えば、血管形成の誘発又はスピンドル状の形状の誘発）アッセイにより試験した場合に、生物活性抽出物（例えばＬＹＯ ＩＩ）を生じさせることが本発明によって見出された。トロンビン、フィブリノーゲン、又はフィブリンの添加は、抽出物の活性を顕著にすることが見出された（フィブリノーゲン又はフィブリンの添加は管状構造形成を促進し、トロンビンは増殖を増加させる）。

本発明の一実施形態では、熱処理のため、Ｓ／Ｄ処理された材料は安定化工程に供された。低温殺菌工程中の安定化剤としての役割を果たすスクロース及びグリシンを、溶液に添加することができる。次いで、溶液は、６０±０．５℃にて９〜１０．５時間にわたって連続的に混合しながら熱処理することによって低温殺菌され得る。次に、溶液は、例えば、酢酸塩グリシン緩衝液で希釈され得、安定化剤は、例えば、酢酸塩グリシン緩衝液に対する透析濾過によって除去され得る。凝集物質が存在する場合には、例えば、２０、５及び１．２μｍのフィルタの後０．４５μｍのフィルタを使用する１回以上の逐次濾過による濾過によって、凝集物質を除去することができる。滅菌濾過は、０．２μｍのフィルタを使用して、無菌条件下で実施され得る。溶液は、高圧滅菌したバイアルの中で凍結乾燥され、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で高圧滅菌したゴム栓で密封され得る。

二重ウイルス不活性化抽出物は、出発物質の濃度と比較して４倍又は３２倍に濃縮され得る（例えば、ＬＹＯ ＩＩＩで見られるように）ことが、本発明によって見出された。濃縮は、例えば、溶液の透析濾過によって、及び／又は凍結乾燥された抽出物を、凍結乾燥前の抽出物の体積よりも小さい体積に再構成することによって、達成され得る。

凝集物質が存在する場合、上記の逐次濾過によって該凝集物質を除去することができる。濃縮された抽出物（例えば、ＬＹＯ ＩＩＩ）は、非常に少量の血漿タンパク質を含むことが見出された。濃縮抽出物（例えば、ＬＹＯ ＶＩ及びＬＹＯ ＶＩＩ）は凝固可能でないことが見出された。該抽出物は、限界レベルの凝固タンパク質を呈するか、又は凝固タンパク質が完全に欠如していた。生理的に活性なフィブリノーゲンレベルは、当該技術分野において現在用いられている高感度法によって検出不可能であるので、濃縮抽出物には生理的に活性なフィブリノーゲンが欠乏している。非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）測定試験によって評価すると、抽出物はプロ凝固活性を欠いていた。ＮＡＰＴＴは、本質的に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ７．０．；２．６．２２：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｏｎｏｇｒａｐｈ（０１／２００８：２０６２２）；ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ（Ｆｒａｎｃｅ），Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ，２００９に記載の通りに実施され得る。凝固因子の欠如もまた、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験によっても決定された。本発明による血小板抽出物には、凝固因子ＸＩＩ、ＸＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩ、Ｘ、Ｖ、ＩＩ、及びＩの１つ以上が欠如しており、このことにより該抽出物が非凝固性となることが、この試験によって示された。

サンプル中に存在するＰＤＧＦ−ＡＢの量に正規化すると、抽出物の濃度の増加が、３Ｔ３−スイスアルビノマウス（Swiss albino mouse）線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、濃縮抽出物の影響は、出発物質の溶解物よりも顕著であることが本発明によって見出された。特に、濃縮抽出物の影響は、陽性対照（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、２００ｎｇ／ｍＬｍのＴＧＦ−β１、０．５ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦ、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＢ ３を用いて調製された組み換えヒト成長因子のカスタム混合物）よりも顕著であった。濃縮抽出物をヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単層に添加すると、管形成を促進することも見出された。ＨＵＶＥＣ単層の管形成における共力効果は、濃縮抽出物をフィブリン封止剤と組み合わせて添加することによって示された。

最適なＳ／Ｄウイルス不活性化が得られるように、Ｓ／Ｄ処理中に、凝集物を除去するサブ工程を加えることができる（例えば、ＬＹＯ ＩＶにおいて行われるようなサブ工程）。凝集物除去は、例えば、遠心分離；濾過；分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；例えば、１００ＫＤのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、１００ＫＤのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、３００ＫＤのＰＥＳ膜、ポリプロピレン膜、醉酸セルロース膜を使用する限外濾過によって、及び／又は当該技術分野において周知の任意の他の方法によって行われ得る。

任意に、塩化カルシウム（又は他のカルシウム塩）の添加と清澄濾過とによる凝集物除去の追加工程が含まれる。例えば、最終濃度４０ｍＭの塩化カルシウムを添加した後（凝集物の沈殿を促進するため）、例えば、２０、５、１．２、及び０．４５μｍのフィルタを使用して清澄濾過することができる。一実施形態において、この工程はＳ／Ｄ処理の後に追加される。

凝集物除去のためのこれら追加工程は実行可能であり、生物活性抽出物を生じさせることが、本発明によって見出された。凝集物含有量の低い血小板抽出物は、静脈内投与で有利に使用され得る。同様に、凝集物含有量の低い血小板抽出物は、比較的高濃度のカルシウムを含む構成成分と共に使用され得る。

凝集物除去に供された抽出物による細胞の処理は、出発物質の溶解物及びＰＲＰ−Ｒ［（ＰＲＰ放出物、カルシウム及びトロンビン（ＥＶＩＣＥＬ（商標）より入手）で活性化される］と同様の方法で、線維芽細胞運動性及び創傷閉鎖（スクラッチアッセイ）を促進することが、線維芽細胞を含有する未コーティングの細胞培養ウェル、及びコラーゲン又はフィブリノーゲンでコーティングされたウェルにおいて見出された。ＰＲＰ−Ｒは、インビボ設定における創傷治癒に有効であることが報告されている（Ｌａｃｃｉ ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ Ａ，２０１０）。

更に、凝集物除去に供された抽出物は、ＨＵＶＥＣにおいて、血管形成に関連する強い形態変化を誘発したことが、発明によって見出された。

特定の血小板因子は、Ｓ／Ｄ除去で使用するＨＩＣカラムに少なくとも１つの溶離工程を追加し、更に溶離物質を収集することによって、Ｓ／Ｄ除去工程中に回収され得ることが、本発明によって見出された。かかる因子の１つはＰＤＧＦ−ＡＢである。本発明に従ってＨＩＣを非定組成溶液で洗浄することにより、（ＬＹＯ Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩで見られるように）ＰＤＧＦ−ＡＢの回収又は濃縮が３倍となり得ることが見出された。ＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は、４ｍＬの再蒸留水（ＤＤＷ）を用いた再構成の後の最終凍結乾燥物質で測定された。ＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は、ＬＹＯ ＶＩにおいて４，５７８ｐｇ／ｍＬ、ＬＹＯ Ｖにおいて１５，０２８ｐｇ／ｍＬ、及びＬＹＯ ＶＩＩにおいて１９４，３５３ｐｇ／ｍＬであることが見出され、これらは、出発物質として用いた血小板当たりの、ＬＹＯ ＶＩにおいて約７×１０^−７ｐｇ、ＬＹＯ Ｖにおいて２．２６×１０^−６ｐｇ、及びＬＹＯ ＶＩＩにおいて３．１２×１０^−５ｐｇのＰＤＧＦ−ＡＢに相当する。特に、ＰＤＧＦ−ＡＢが濃縮された抽出物が細胞の増殖に与える影響は、組み換えＰＤＧＦ−ＡＢのみの場合よりも顕著であり、他の血小板の抽出成分が、線維芽細胞の増殖を相乗的に高める得るという事実を指摘した。本発明の方法を用いて濃縮／増加される別の因子は、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２又はβ−ＦＧＦとも称される）である。本発明に従ってＨＩＣを非定組成溶液で洗浄することにより、（ＬＹＯ ＶＩで見られるように）ｂＦＧＦの回収又は濃縮が少なくとも１．８倍となり得ることもまた見出された。ｂＦＧＦの濃度は３６〜１２７ｐｇ／ｍＬであることが見出され、これは出発物質として用いた血小板当たり約５．４×１０^−９〜１．９５×１０^−８ｐｇのｂＦＧＦに相当する。

これら知見は、本発明による抽出物の調製への道筋をつけた。本発明の抽出物は、次の特徴の１つ以上を含む：増殖及び／又は栄養因子（例えば、ＴＧＦ−ｂ１、ｂ−ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢ）を有するタンパク質を、当該技術分野において周知の血小板因子混合物と比べてよりバランスのとれた組成物と共に含む；二重ウイルス不活性される（例えば、Ｓ／Ｄ処理されかつ低温殺菌される）；凝集物含有量が少ない；同じ因子の生理学的比率と同様の比率で該因子を含む；ＴＧＦ−ｂ１、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢを生理学的にバランスのとれた比率で含む；並びに、血漿不純物の減少（例えば、ＩｇＧ及びフィブリノーゲンレベルの減少）を呈する。

用語「生理学的にバランスのとれた比率」は、血小板、濃縮血小板、プールした血小板、白血球低減血小板、プールした白血球低減血小板、洗浄血小板、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）調製物、血小板抽出物、多血小板血漿放出物（ＰＲＰ−Ｒ）、血清、及び／又は血小板放出物の生理学的組成物中の因子の比率と同様である、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比率及び／又はＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比率を指す。「血清」は、典型的には、活性化された血小板より放出される増殖／栄養因子を含有する、フィブリノーゲン又は他の凝固因子を有さない血漿を指す。血清の場合、生理学的比率は、血清中に存在する増殖／栄養因子値に従って（市販のＥＬＩＳＡキットの添付文書に従って）計算され得る。このような一例では、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１及びＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの生理学的比率は、それぞれ０．５及び９０．９であることが見出された。

一実施形態において、ＷＡＰ（出発物質）におけるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の生理学的比率は、少なくとも０．２、又は約０．２〜約０．５の範囲内、例えば、約０．２、０．３、０．３６、０．４、０．４４、及び０．４７である。

別の実施形態では、ＷＡＰ（出発物質）におけるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの生理学的比率は、少なくとも４５、又は約４５〜約１０３の範囲内、例えば、約４５、６４、７３、７６、及び１０３である。

本発明の一実施形態では、本発明による抽出物は、少なくとも０．２であるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比率、及び／又は少なくとも４５であるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比率を含む。

本発明の一実施形態では、本発明による抽出物は、少なくとも約０．５６であるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比率、及び／又少なくとも約７４であるＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦを含む（ＬＹＯ ＶＩＩで見られるように）。

本発明による抽出物は、次の利点の１つ以上を有する：標準化されており、ロバストな（安定した）生体的性能を可能にする：生物活性、例えば、細胞における増殖及び／又は形態変化の誘発を呈する；組み換えＰＤＧＦ−ＡＢのみの濃度と比較すると低い濃度のＰＤＧＦ−ＡＢで高い活性を呈するので、非増殖性細胞における形質転換変化（transformational change）の可能性が減少する；最適なウイルスに対する安全性を有する；例えば、血漿タンパク質除去工程（例えば、洗浄工程）に供されなかった血小板濃縮分画から調製された抽出物よりも低レベルの血漿不純物を含むので、改善された免疫学的な安全性を有する；及び非凝集性である。

用語「ウイルスに対して安全な血小板抽出物」は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理に供された抽出物を指す。

「少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理」は、ウイルスを不活性化するために、少なくとも２つの異なりかつ独立した処理を実施することを含む。以下の非限定的な処理の例のうちの２以上の組み合わせを用いることができる。すなわち、低温殺菌処理、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理、ナノ濾過処理、低ｐＨ処理、紫外線照射処理、及びチオシアン酸ナトリウム処理。

用語「ウイルスを不活性化する又はウイルス不活性化」は、ウイルスは溶液中に維持されるが、例えば、それらの脂質コーティングを溶解することによって生育不能にする状況、及び／又は、例えば、サイズ排除技術によって、ウイルスが溶液から物理的に除去される状況を指す。

用語「血小板抽出物」は、血小板由来因子を含む混合物を指す。典型的には、抽出物は細胞を含まない。

用語「溶解物」は、細胞膜を破壊することによって細胞が破壊されときに得られる溶液を指す。

用語「活性血小板抽出物」は、成長因子及び／又は栄養因子などの生体的活性物質を含み、かつ、細胞増殖細胞運動の誘発、細胞間相互作用、及び／又は細胞形態変化などであるが、これらに限定されない生物活性を示す血小板抽出物を指す。

用語「複数のドナー由来の血小板抽出物」は、少なくとも２つの個体から調製される血小板抽出物を指す。個体は、ヒト又は他の哺乳類であり得る。

用語「増殖因子」は、典型的には、細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する作用剤を指す。成長因子の例としては、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−ｂ１、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ｂＦＧＦ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。

用語「栄養因子」は、典型的には、細胞の分化及び／又は生存を刺激する作用剤を指す。栄養因子の例としては、接着分子、骨形成タンパク質、サイトカイン、ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＧＤＮＦ、ヘパリン結合成長因子、インスリン様成長因子、ニューロトロフィン、セマフォリン、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）β、チロシンキナーゼ受容体リガンド、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。

血小板因子は、増殖活性と栄養活性とを有し得る。

用語「凝集物」は、タンパク質凝集体などの固形物を含有する物質塊を指す。タンパク質凝集は、生体的薬物の製造中に起こり得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ＭＥ，Ｈｉｌａｒｉｏ Ｅ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｆ．ＡＡＰＳ Ｊ．２００６ Ｓｅｐ １５；８（３）：Ｅ５７２−９．Ｒｅｖｉｅｗ）。タンパク質の凝集物は、可溶性／不溶性、共有結合性／非共有結合性、可逆的／不可逆的、及び／又は天然／変性タンパク質の形態であり得る。例えば、静脈内投与に要求される場合、凝集物は、当該技術分野において周知である様々な技術、例えば、遠心分離、濾過、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、例えば１００ＫＤのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、１００ＫＤのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、３００ＫＤのＰＥＳ膜、ポリプロピレン膜、醉酸セルロース膜を使用する限外濾過によって、及び／又は当該技術分野において周知の任意の他の方法によって、抽出物から除去され得る。

有利には、本発明の一実施形態では、抽出物は、低い凝集物含有量を示し、静脈内投与で使用することができる。本発明の一実施形態では、次の式に従って凝集物レベル（濁度）を計算することができる。

前記のように測定して、タンパク質１ｍｇ当たり０．０３ＯＤ_３２０以下である抽出物のレベルは、凝集物含有量の少ない抽出物であると考えることができる。本発明の一実施形態では、凝集物含有量は、タンパク質１ｍｇ当たり約０．０１（検出限界）〜０．０３ＯＤ_３２０の範囲内である。

用語「血漿不純物」は、例えば、トロンビン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、及びＩｇＧを指す。

低レベルの血漿不純物とは、例えば、検出不可能なレベルの生理的に活性なトロンビン（凝固時間による）、検出不可能なレベルの生理的に活性なフィブリノーゲン（凝固時間による）、約０．１３未満又は約０．０３４ｍｇ／ｍＬ未満のフィブリノーゲン（ＥＬＩＳＡによる）、約０．００４又は０．００１ｍｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン、検出不可能なレベルの生理的に活性なフォンヴィレブランド因子、約０．００１３又は０．００１４ＩＵ／ｍＬ未満の第ＩＩ因子、約０．００８又は０．００９ＩＵ／ｍＬ未満の第ＶＩＩ因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第ＶＩＩＩ因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第ＩＸ因子、約０．００３ＩＵ／ｍＬ未満の第Ｘ因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第ＸＩ因子及び第ＩＩ因子、並びに約０．０７６又は０．０１１ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧを指す。本発明の一実施形態では、フィブリノーゲン濃度（ＥＬＩＳＡによる）は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの範囲内であり、フィブロネクチン濃度は０．００２〜０．０２ｍｇ／ｍＬの範囲内であり、第ＶＩＩ因子濃度は０．００１〜０．０１ＩＵ／ｍＬの範囲内であり、第Ｘ因子濃度は０．００１〜０．０１ＩＵ／ｍＬの範囲内であり、ＩｇＧ濃度は０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの範囲内である。検出不可能なレベルの凝固因子及び／又は血漿タンパク質不純物を呈する抽出物は、これら因子／タンパク質が欠乏していると考えられる。

「溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理」は、典型的には、脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープウイルス又は脂質被覆ウイルスを不活性化するプロセスを指す。処理は、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はＴｗｅｅｎ ８０など）及び溶媒［リン酸トリ−（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）、リン酸ジアルキル又はリン酸トリアルキルなど］の添加によって実施され得る。脂質被覆ウイルスを非活性化するために用いられる溶媒−洗剤の組み合わせは、例えば、ＴｎＢＰとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の組み合わせ、Ｔｗｅｅｎ ８０とコール酸ナトリウムの組み合わせ、及び他の組み合わせなど、当該技術分野において周知である任意の溶媒−洗剤の組み合わせであり得る。

使用する溶媒／洗剤の濃度は、例えば、米国特許第５０９４９６０Ａ号及び同第４７８９５４５Ａ号で実施されるような、当該技術分野において一般的に用いられる濃度であり得る。本発明の一実施形態では、＞０．１％のＴｎＢＰと＞０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の組み合わせが用いられる。本発明の別の実施形態では、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と０．３％のＴｎＢＰの組み合わせが用いられる。典型的には、溶媒−洗剤がウイルスを不活性化する条件は、５〜８のｐＨ値で１０〜１００ｍｇ／ｍＬの溶媒／洗剤、及び２〜３７℃の温度にて３０分〜２４時間からなる。しかしながら、溶媒／洗剤の他の組み合わせ、及び他の好適な条件が、当業者には明らかであろう。

「低温殺菌」は、典型的には、熱が脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を破壊するプロセスを指す。「低温殺菌」は、用語「熱不活化」と置き換えることができる。熱不活化は、５９．５〜６０．５℃の範囲の温度にて９〜１０．５時間にわたって行われ得る。例えば、不活性化は、６０℃にて１０時間にわたって行われ得る。スクロース及びグリシンなどの安定化剤が、低温殺菌工程中に血小板溶解物に添加され得る。

「ナノ濾過」は、典型的には、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）２０Ｎ、３５Ｎ、及び７５Ｎ；Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／７０（商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０（商標）などのナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスをサンプルから除外するプロセスを指す。フィルタは、７０ｎｍ未満、好ましくは１５〜５０ｎｍの孔径を有し得る。しかしながら、サンプルからウイルスを低減又は排除するのに十分な孔径を有する任意の膜を、ナノ濾過で採用することができる。ナノ濾過で除去されるウイルスは、エンベロープ［例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス］、及び非エンベロープ（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス）であり得る。

低ｐＨ処理は、典型的には、エンベロープウイルスに対して有効である。本発明の一実施形態では、血小板溶解物は、低ｐＨ、典型的にはｐＨ ４にさらされ、６時間から２１日の間続く。「低ｐＨ処理」は用語「酸性ｐＨ不活性化」と置き換えることができる。

用語「活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物」は、少なくとも４つの異なる血小板由来因子、例えば、成長及び／又は栄養因子を含む組成物を指す。本発明の一実施形態において、該因子は、ＴＧＦ−ｂ１、ｂ−ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢである。

典型的には、本発明の抽出物は、非凝集性であり、低レベルの血漿不純物、例えば、低ＩｇＧレベル及び／又は低フィブリノーゲンレベルを示す。例えば、約０．０７６ｍｇ／ｍＬ以下のＩｇＧ及び約０．０３４ｍｇ／ｍＬ以下のフィブリノーゲンといった、３ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ及び０．９８ｍｇ／ｍＬ未満のフィブリノーゲンである。

用語「非凝集性」は、抽出物をトロンビンなどの活性化剤と混合しただけでクロットを形成することができない血小板抽出物を指す。「活性化剤」は、フィブリノーゲンからフィブリンを形成することができる、トロンビンなどの作用剤、及び／又はヘビの毒から得られる溶液を指す。

本発明は、成長及び／又は栄養因子（例えば、ＴＧＦ−ｂ１、ｂ−ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢ）を有するタンパク質を、他の血小板因子混合物に比べてよりバランスのとれた組成物と共に含む、ウイルスに対して安全性な血小板抽出物を提供する。

「よりバランスのとれた組成物」は、複数のドナーから得られ、かつ成長因子活性及び／又は栄養因子活性を有する少なくとも４つの異なるタンパク質（例えば、ＴＧＦ−ｂ１、ｂ−ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢ）を含み、１つ以上の血小板因子、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ及び／又はｂＦＧＦが濃縮されている組成物を指す。ＰＤＧＦ−ＡＢが濃縮された抽出物は、Ｓ／Ｄ及び非定組成溶液による洗浄のないＨＩＣによるＳ／Ｄ除去に供された抽出部よりも、少なくとも３倍多い量、例えば、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８倍、又はそれ以上の量のＰＤＧＦ−ＡＢを含み得る。ＰＤＧＦが濃縮された抽出物はまた、例えば、Ｓ／Ｄ処理の前又はＳ／Ｄ処理の後、及び、例えば、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去の前の等価物質のＰＤＧＦ−ＡＢの量と同様であるＰＤＧＦ−ＡＢの量／レベルを含む抽出物、あるいは、出発物質（staring material）の溶解物中の量と同様のＰＤＧＦ−ＡＢの量を含む抽出物に関する。ＰＤＧＦ−ＡＢの濃縮は、精製及び／又はクロマトグラフィー工程におけるＰＤＧＦ−ＡＢの回収を増加させることによって得ることができる。一実施形態において、ＰＤＧＦ−ＡＢの濃縮は、非定組成溶液での洗浄を追加することにより、ＨＩＣ工程におけるＳ／Ｄ除去中にＰＤＧＦ−ＡＢの回収を増加させることによって得られる。したがって、本発明による方法により、高収率のＰＤＧＦ−ＡＢを有する血小板抽出物を得ることができる。

ｂＦＧＦが濃縮された抽出物は、例えば、Ｓ／Ｄ及び非定組成溶液による洗浄のないＨＩＣによるＳ／Ｄ除去に供された同じ抽出物よりも、少なくとも１．８倍多い量、例えば、約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８倍、又はそれ以上の量のｂＦＧＦを含み得る。ｂＦＧＦが濃縮された抽出物は又は、例えば、Ｓ／Ｄ処理の前又はＳ／Ｄ処理の後、及び、例えば、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去の前の等価物質のｂＦＧＦの量と同様であるｂＦＧＦの量を含む抽出物、あるいは、出発物質の溶解物中の量と同様のｂＦＧＦの量を含む抽出物に関する。ｂＦＧＦの濃縮は、精製及び／又はクロマトグラフィー工程におけるｂＦＧＦの回収を増加させることによって得ることができる。一実施形態において、ｂＦＧＦの濃縮は、非定組成溶液での洗浄を追加することにより、ＨＩＣ工程におけるＳ／Ｄ除去中にｂＦＧＦの回収を増加させることによって得られる。したがって、本発明による方法により、高収率のｂＦＧＦを有する血小板抽出物を得ることができる。

本発明による血小板抽出物は、任意の治療目的のために使用され得る。

本発明の抽出物は、例えば、被験体における傷害組織の治癒を促進するのに適している。血小板抽出物は、標的領域への注射用に又は静脈内投与用に使用され得、包帯、発泡体、パッド、及びマトリックス上に適用される／投与されることができ、並びに／又は局所適用のためにフィブリン封止剤と組み合わされて使用され得る。抽出物は、包帯、パッド、発泡体、及びマトリックスなどの様々な送達剤から、所望の場所の中／上に放出され得る。媒介物は、天然及び／又は合成材料で作製され得る。かかる物質の例としては、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［ＰＨＥＭＡ］、寒天、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）、自己組織化ペプチド［ＳＡＰ］、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による抽出物とフィブリン封止剤の組み合わせを、ラットの皮下移植モデル［移植組織における組織反応、血管形成、及び全体的治癒を評価するのに一般的に用いられる−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｔｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＯ）１０９９３−６，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ−Ｐａｒｔ ６：Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００７）］で使用すると、フィブリン封止剤のみ又は生理食塩水の使用と比べて、移植後７日後に、より多くの血管形成及びより良好な治癒がもたらされたことが、本発明によって見出された。抽出物は２つの異なる用量で用いられ、以下は実際に投与された、いくつかの成長因子の量である：ＴＧＦ−ｂ１ ５．２７又は５２．７ｎｇ；ＰＤＧＦ−ＡＢ ０．１又は１．０５ｎｇ；ｂＦＧＦ ０．００２４又は０．０２４ｎｇ；及びＶＥＧＦ ０．０２３又は０．２３ｎｇ（２００μＬのフィブリン封止剤と共に投与）。抽出物の有益な効果は用量依存的であることが示された。

本発明による抽出物は、顕微鏡で決定すると、移植部位に存在するマクロファージ及びリンパ球の数が少ないことから、有害効果を有さないこともまた見出された。

本明細書で使用する用語「被験体」は、ヒトを含む哺乳動物を含む。一実施形態では、被験体は患者である。

用語「任意の治療目的」は、化粧用途のため、及び／又は被験体における任意の疾病、疾患、又は病状のための、任意の治癒的又は予防的治療を指す。例示的な治療目的としては、内部又は外部創傷の早期治癒、即ち、非処置の創傷又は他の既知の創傷治療に比べて創傷を迅速に治癒させる；血管形成、有糸分裂誘発、細胞増殖、好中球及びマクロファージ、コラーゲン合成、遊走、創面収縮、細胞外マトリックス合成、上皮形成、及び走化性を刺激することが必要な任意の外傷又は病状の治療；組織生成、再生、又は再組織化、上皮形成、新血管形成、又は血管形成が必要な外傷又は病状の治療；瘢痕形成を少なくする；術後合併症及び死亡率を低減する；例えば切断部又は潰瘍などの皮膚創傷の治癒、が挙げられるが、これらに限定されない。

血小板抽出物は、整形外科（例えば、骨修復、関節軟骨修復、膝関節形成術、腰椎固定術、及び椎間板変性において）；口腔外科；歯科及び顎顔面外科（例えば、チタンインプラントの圧密、上顎洞底挙上術、及び骨再形成）；筋肉、腱及び靱帯修復のため；顔面成形手術及び再建外科；慢性的な皮膚創傷の治癒、皮膚火傷治癒、眼科学；顔面神経再生、末梢神経修復、中枢神経系（ＣＮＳ）修復（脊椎及び／又は脳外科手術）、視神経修復、神経圧迫症候群修復、脳神経修復、坐骨神経修復；心臓手術及び肥満手術などであるが、これらに限定されない、様々な手術分野で使用される。

抽出物は、患者の身体部位の表面上に投与される。用語「表面」は、裸眼視力で見ることができる外部表面、及び生物の内部構造の一部である内部身体部位の表面を指す。外部表面としては、顔の皮膚、喉、頭皮、胸、背中、耳、首、手、肘、臀部、膝、及び他の皮膚部位が挙げられるが、これらに限定されない。内部身体部位の例としては、外部環境に露出される体腔又は解剖学的開口部、及び鼻孔、唇、耳、子宮、膣、及び卵巣などの生殖器部、肺、肛門、脾臓、肝臓、並びに心筋などの内部器官が挙げられるが、これらに限定されない。表面は、出血性又は非出血性部位であってよい。あるいは、抽出物は、例えば、皮内、腹腔内、皮下、髄腔内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、及び／又は静脈内に注射によって投与され得る。抽出物はまた、点滴によって投与され得る。

用語「治療的有効量」は、疾病、疾患、又は病状を予防する又は治療する（ある症状又は全ての症状を緩和する）のに必要な用量を指す。有効量は、組成物の投与に応答した、疾病の経過中の任意の変化に基づいて判断され得る。有効用量は、被験体の年齢及び体重、疾患及びその重症度（例えば、早期か末期か）、並びに当業者によって認識され得る他の要因に応じて変えることができる。

抽出物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことも可能である。本明細書で使用する用語「賦形剤」は、抽出物に添加される不活性物質を指す。賦形剤は、例えば、貯蔵中に活性物質がそれらの化学安定性及び／又は生物活性を維持するのを確実にするために、製造プロセスを支援するために、及び／又は審美的理由で（例えば、色）添加され得る。添加される賦形剤は、一般に、安全かつ非毒性である。

本発明による血小板抽出物は、外科用封止剤と組み合わされて使用され得る。生体封止剤（例えば、フィブリノーゲン及びトロンビン成分で調製されるフィブリン封止剤など）、アクリル酸、シアノアクリル酸、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーなどの合成封止剤、並びに、例えばゼラチン−ホルムアルデヒド−レゾルシノール（ＧＦＲ）接着剤などの生体材料及び合成材料の混合物から作られた半合成封止剤などであるが、これらに限定されない、異なる種類の外科用封止剤を、血小板抽出物と組み合わせて使用することができる。本発明の一実施形態では、血小板抽出物は、フィブリン封止剤成分と組み合わせて使用される。本発明の別の実施形態では、血小板抽出物は合成封止剤と共に使用される。

本発明はキットを提供する。キットは、本発明による抽出物を含む容器を含み得る。抽出物は、固形、溶液、又は凍結形態であり得る。抽出物が固形で提供される場合には、キットは、固形抽出物を再構成するための薬学的に許容可能な担体を有する容器を更に含み得る。キットは、抽出物を患者に注射するための１つ以上の注射器及び／又は注射針を更に含み得る。キットは、使用説明書を更に含み得る。説明書は、抽出物を患者に投与するための方法を説明していてもよい。本発明はまた、フィブリン封止剤又は合成封止剤の成分を収容する容器と、本発明の抽出物を収容する容器と、使用説明書とを含むキットに関する。任意に、本発明の抽出物は、フィブリン封止剤の一成分の容器の中に入れられてもよい。また、本発明は、凍結乾燥された抽出物を収容する容器と、再構成溶液又は担体を収容する容器と、使用説明書とを含むキットに関する。

フィブリン封止剤成分は、血液組成物から調製され得る。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿などの全血液の生成物であり得る。

本発明の一実施形態において、フィブリノーゲン成分は、トラネキサム酸及びアルギニン若しくはリジン、又は混合物、若しくはアルギニン及びリジン、又はそれらの薬学的に許容可能な塩を更に含み得る血漿由来のタンパク質の溶液である生物活性成分（ＢＡＣ）からなる。ＢＡＣは、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテートより誘導され得る。用語「クリオプレシピテート」は、全血より調製した凍結血漿から得られる血液成分を指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、通常は０〜４℃の温度で解凍すると、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含む沈殿による上清が形成されることで得ることができる。この沈殿物は例えば遠心分離によって回収することができる。ＢＡＣ溶液は、例えば、ＵＳ−Ｂ−６，１２１，２３２及びＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８３３５３３に記載されるように、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチン等を更に含む。

ＢＡＣ組成物は、塩酸アルギニンなどの安定化剤を含み得る。典型的には、ＢＡＣ中のフィブリノーゲンの量は、約４０〜約６０ｍｇ／ｍＬの範囲である。ＢＡＣ溶液中のトラネキサム酸の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬであり得る。塩酸アルギニンの量は、約１５〜約２５ｍｇ／ｍＬであり得る。

任意に、溶液は生理学的適合性を有するｐＨ値に緩衝される。緩衝液は、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及び溶媒としての注射用蒸留水から構成され得る。グリシンは組成物中に約６〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で存在してよく、クエン酸ナトリウムは約１〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲でよく、塩化ナトリウムは約５〜約９ｍｇ／ｍＬの範囲でよく、塩化カルシウムは約０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬの濃度であり得る。

別の実施形態では、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を、例えば、ＵＳ−Ｂ−７，１２５，５６９及びＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０２０９５０１９に記載の方法を用いて、１５μｇ／ｍＬ以下、例えば５μｇ／ｍＬ以下のプラスミノーゲンにまで低下させる。この場合、トラネキサム酸、アプロチニン（aprotinine）、又は任意の他の繊維素溶解阻害剤をＢＡＣに添加する必要はない。

フィブリン封止剤は、Ｃａ^２＋、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）などのクロットの形成を促す成分を含むことも可能であり、これらの成分は、別々の成分として提供されるか又はフィブリン封止剤成分と配合され得る。

血液組成物由来のフィブリン封止剤成分は、典型的には、感染性粒子から精製される。精製処置は、ナノ濾過、溶媒／洗浄剤処理によって、及び／又は当技術分野で既知の任意の他の方法によって、実施され得る。

用語「感染性粒子」は、微生物又はプリオンのような微細粒子を指し、これらは生物有機体の細胞に感染する又は伝搬し得る。感染性粒子はウイルス粒子であってもよい。

本発明に従って調製される血小板抽出物は、種々の細胞型、例えば、線維芽細胞及び幹細胞、例えば、内皮幹細胞、例えば、ＨＵＶＥＣと共に使用され得る。細胞型は、意図する治療的使用に従って決定され得る。例えば、椎間板の再生では、脊索由来の細胞を含む細胞組成物を使用することができる。血管形成の誘発では、内皮幹細胞を使用することができる。

本発明の血小板抽出物は、少なくとも２つの異なるウイルス不活性化処理を含む方法によって調製され得、該方法は次の工程を含む：複数のドナーから血小板が濃縮された分画を得る工程、血小板を溶解する工程、溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりＳ／Ｄを除去する工程、及び第２の直交するウイルス不活性化処理（例えば、低温殺菌）を実施する工程。ＨＩＣは、溶解物をＨＩＣに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。

ＨＩＣへの溶解物の充填は、カラム内に詰め込まれたＨＩＣ樹脂と溶解物とを接触させることによって行われ得る。

用語「溶解物とＨＩＣ樹脂との接触」は、広い意味で用いられ、例えば、溶解物内に存在するＳ／Ｄ物質と樹脂との間に結合相互作用が生じるように、溶解物を樹脂の十分近くまで接近させるあらゆるタイプの結合動作を指す。

本発明は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理を含む、ウイルスに対して安全な血小板抽出物の調製方法を提供し、該方法は、複数のドナーからの血小板が濃縮された分画を提供する工程と、血小板溶解物を調製する工程と、例えば凝集物が低減した溶解物中で溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、溶解物をＨＩＣに装填する工程を含むＨＩＣによりＳ／Ｄを除去する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離した分画を収集する工程と、第２の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む。

血小板を多く含む材料を得ることができる分画としては、血液分画、血漿分画、アフェレーシスから得た洗浄及び白血球低減血小板、及びアフェレーシスから得た血小板が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、複数のドナーからプールした洗浄及び／又は白血球低減血小板が、血小板抽出物の調製のための出発物質（staring material）として使用される。

有利には、洗浄血小板を出発物質（staring material）として使用することにより、上に述べたような血漿不純物が少ない非凝固性の血小板抽出物を得ることができる。

典型的には、用語「血小板出発物質」は、本発明の方法で使用するために複数のドナーから得た、血小板が濃縮された分画を指す。血小板が濃縮された分画は、例えば、全血単位から、血液分画から、及び／又は血漿分画から分離され得る。血小板が濃縮された分画は、アフェレーシス献血から得ることができる。出発物質は、洗浄及び／又は白血球低減され得る。本発明の一実施形態では、血小板が濃縮された分画は、洗浄及び白血球低減され、アフェレーシス献血から得られる。一実施形態において、アフェレーシス白血球低減収集単位中の血小板の最小数は、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」に明記されている通り、約３．０×１０^１１又はそれ以上である。

用語「洗浄血小板」は、洗浄工程に供された血小板を指す。洗浄手順の間、血小板の損失も起こり得る。洗浄は、０．９％塩化ナトリウムを、少量のデキストロースと共に、又は少量のデキストロースなしで用いて行われ得る。洗浄手順は、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」に詳述されている通りに行われ得る。本発明の一実施形態では、洗浄は次のように行われる。血小板物質単位を緩やかな条件下で遠心分離する。次に、上澄みを廃棄し、血小板ペレットを、緩やかな条件下において生理食塩水で（洗浄の合間に遠心分離しながら）少なくとも２回洗浄する。洗浄され、再懸濁された血小板は、本発明の方法で使用するまで凍結させることができる。

用語「白血球低減」は、全血中の白血球含有量よりも低い白血球含有量を指す（全血中の含有量は、血液単位当たり約１〜１０×１０^９白血球である）。任意の白血球の低減方法（例えば、濾過による）を用いて、白血球低減単位（leukocyte-reduced unit）を得ることができる。白血球の低減は、アフェレーシス中に実施され得る。本発明の一実施形態では、約８．３×１０^５未満の白血球を含有する血小板の単位を、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用する。別の実施形態では、約５×１０^６未満の白血球を含有する血小板の白血球低減単位を、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用する。

用語「アフェレーシス」は、典型的には、一部（例えば、血小板）が分離されて保持され、残りはドナーに返血される、単一ドナーからの採血を指す。単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、約３．０×１０^１１又はそれ以上の血小板を含有し得る。本発明の一実施形態では、単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、最大６．０×１０^１１までの血小板を含有する。

血小板の溶解及び血小板に捕獲された因子（例えば、様々な血小板成長因子及び／又は栄養因子）の放出は、血小板が濃縮された分画を凍結・解凍することによって、Ｓ／Ｄ処理によって、超音波処理によって［Ｓｌｅｚａｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖ１６６ ｐ４８９〜５０５］，ｂｙ Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ［Ｓａｌｇａｎｉｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ｖ３８５ ｐ３９４〜４１１］、及び／又は当該技術分野において周知の他の方法によって行われ得る。本発明の一実施形態では、血小板の溶解は、血小板が濃縮された分画を凍結・解凍した後、Ｓ／Ｄ処理を行うことによって実施される。典型的には、血小板の溶解は、無細胞血小板溶解物を生じさせる。

本発明の一実施形態では、抽出物調製物の第１のウイルス不活性化工程は、エンベロープウイルスを排除するための血小板の溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）処理を含む。Ｓ／Ｄ処理はまた、血小板の溶解、及びそれらの含有物の溶液中への放出を促進する。最適なエンベロープウイルス不活性化では、凝集物除去（例えば、濾過による）を含むサブ工程が、Ｓ／Ｄ処理工程中に行われる。

用語「Ｓ／Ｄ除去（溶媒−洗剤除去）」は、Ｓ／Ｄ処理で使用した溶媒−洗剤の大部分の除去を指す。溶媒−洗剤の除去は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＨＩＣ）、例えば、Ｃ−１８シリカ充填材料及びＳＤＲ（溶媒−洗剤除去）ＨｙｐｅｒＤの使用を含む。Ｓ／Ｄ除去は、油抽出工程を更に含み得る。本発明の一実施形態では、細孔容積が架橋疎水性アクリルポリマーで充填されたシリカビーズで作製されるクロマトグラフィー充填材であるＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤを使用して、溶媒−洗剤を除去する。ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤは、有利には、疎水性相互作用の混合モード吸着を伴い、分子排除効果に関連する［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｏｒｂｅｎｔ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ」．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｐｐｌ．１９９５ Ｆｅｂ ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。Ｃ−１８＋溶離条件と比べて、ＳＤＲ＋溶離条件を用いると良好な結果が得られることが、本発明によって見出された。一実施形態では、ＳＤＲ＋溶離条件を用いて、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収を増加させた。

ＨＩＣは、例えば、水性ポリマー樹脂マトリックスで充填されたカラムを指す。

疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ＨＩＣカラムに、結合緩衝液中のＳ／Ｄ処理された溶解物を充填することによって行うことができる。カラムは、例えば、カラムを結合緩衝液で洗浄することにより、Ｓ／Ｄ処理された溶解物を充填する前に平衡化される。用語「平衡化」は、カラムが、特定のｐＨ値又はイオン強度といった特定の緩衝液条件に達するようにすること及び／又はカラムが特定の緩衝液条件に達するように調整することを指す。一実施形態において、カラムの調整は、カラムにＳ／Ｄ処理された溶解物を充填する前に、所定のｐＨ値及びイオン強度を有する平衡化緩衝液でカラムを洗浄することによって行われる。本発明の一実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに５％（総体積に対するｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。本発明の別の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに１％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）を含む。本発明の別の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに０．２％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）を含む。本発明の更に別の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、０．２％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）、並びに１％の硫酸デキストラン（全重量に対するｗ／ｗ）を含む。平衡化緩衝液は、ＨＳＡを約０．２〜約５％（総体積に対するｖ／ｖ）の範囲濃度で含み得る。

用語「結合緩衝液」は、Ｓ／Ｄ処理された溶解物をクロマトグラフィーカラムに充填する間に用いられる緩衝液を指す。多くの場合、溶解物を装填する前及び／又は装填する間にカラムを調整するために用いられる平衡化緩衝液は、結合緩衝液と呼ばれる。本発明の一実施形態では、結合緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに５％（総体積に対するｖ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、結合緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに１％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）を含む。別の実施形態では、結合緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、並びに０．２％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）を含む。更に別の実施形態では、結合緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ６．８〜７．４）、０．２％のヒト血清アルブミン（総体積に対するｖ／ｖ）、並びに１％の硫酸デキストラン（総重量に対するｗ／ｗ）を含む。結合緩衝液は、約０．２〜約５％（総体積に対するｖ／ｖ）の範囲の濃度のＨＳＡを含み得る。

用語「非結合物質」は、典型的には、平衡で使用したのと同じ緩衝液、及び／又はＳ／Ｄ処理された抽出物をカラムに装填するのに使用した緩衝液（「結合緩衝液」）で充填カラムを洗浄した後に収集される分画を指す。有利には、ＨＩＣを用いるＳ／Ｄ除去工程において、カラムを洗浄して非結合物質を収集した後、生理学的にバランスのとれた比率を有するよりバランスのとれた組成物及び／又は抽出物を得るために、非定組成溶液を使用して特定の成長因子、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの回収を増加させる。その際、Ｓ／Ｄ処理された溶解物におけるＳ／Ｄ除去は、結合溶液中のＨＩＣにＳ／Ｄ処理された溶解物を充填し、定組成溶液で洗浄し、溶解物を含有する非結合物質を実質的にＳ／Ｄを有さずに収集し、次に、ＨＩＣ樹脂に結合したＰＤＧＦ−ＡＢ、及びおそらく他の因子、例えば、ｂＦＧＦを、溶離条件を用いて収集することによって行われる。最も一般的な溶離条件は、結合溶液によって形成された因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ）結合環境が消失するように、移動相の組成のずれ又は非定組成溶液を使用する。

本発明の一実施形態において、ＰＤＧＦ−ＡＢは、ＨＩＣ樹脂に結合したＰＤＧＦ−ＡＢを非定組成溶離条件（non isocratic elution conditions）を用いて溶離することによって、ＨＩＣを用いるＳ／Ｄ除去の間に３倍に濃縮される。

用語「溶離条件」は、非定組成条件を用いること、例えば、カラムを充填及び／又は平衡化するために使用した溶液又は条件と異なる、及び／又は先の工程で使用した溶液と異なる溶液又は条件を用いることを指す。溶離条件は、Ｓ／Ｄは実質的にカラムに結合したままであるのに対して、因子が溶離されるようなものである。本発明による方法は、非定組成溶液を用いる少なくとも１つの溶離工程を含む。

溶離条件は、典型的には塩濃度の上昇を伴う。Ｃ−１８樹脂を使用する場合、０．３Ｍから最大１ＭのＮａＣｌの範囲の濃度を用いるＨＩＣの後の、溶離緩衝液のＮａＣｌ濃度とＰＤＧＦ−ＡＢ回収との間には正の相関関係が存在する。改善された結果は濃度１Ｍにおいてにおいて得られた（ＰＤＧＦ−ＡＢ回収率約３０％）。ＳＤＲ樹脂を使用する場合、試験したＮａＣｌ濃度０．７及び１．５Ｍの全てで、同様のＰＤＧＦ−ＡＢの回収が得られた。

塩濃度の上昇と組み合わせて緩衝液に有機溶媒を加えることによって、ＰＤＧＦ−ＡＢの溶離条件の更なる改善が得られた。最適な溶離条件は、Ｓ／Ｄは実質的にカラムに結合したままである一方で、因子のほとんどが溶離されるようなものである。

ＰＤＧＦ−ＡＢの高い回収率は、Ｃ−１８及びＳＤＲ樹脂の両方において、１Ｍ未満のＮａＣｌ及び／又は２０％未満のエタノールを使用して、Ｓ／Ｄ除去に実質的に影響を与えずに得られることが、本発明によって見出された。

ｂ−ＦＧＦの溶離の増加は、エタノール及びＮａＣｌに加えて、ｂ−ＦＧＦを結合可能な分子、例えば、ヘパリンを緩衝液に加えることによって得られることが、本発明によって見出された。Ｓ／Ｄ除去工程の前に、増殖／栄養因子を結合可能な分子（例えば、硫酸デキストラン）で溶解物をインキュベートし、かかる分子の存在下でＳ／Ｄ除去工程を行うと、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂ−ＦＧＦの回収の最適な結果が得られた。

本発明の一実施形態では、使用する溶離溶液は、結合緩衝液と異なる、例えば、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なり；２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、及び１％のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なり；並びに／又は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、及び５％のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なる。本発明の別の実施形態では、溶離溶液は、酢酸ナトリウム、グリシン、及びヒト血清アルブミン以外の組成物を含む。本発明の別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、及び０．２％のヒト血清アルブミン以外の組成物を含む。別の実施形態では、溶離緩衝液は、有機溶媒、塩、及び／又は成長／栄養因子に結合する分子を含む。別の実施形態では、溶離緩衝液は、エタノールを、例えば１０〜１２．５％の濃度で、ＮａＣｌを、例えば０．５Ｍ〜１Ｍの濃度で、ヘパリンを、例えば５ＩＵ／ｍＬの濃度で、及び／又は硫酸デキストランを、例えば０．１〜１％の濃度で含む。別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、５ＩＵ／ｍＬのヘパリン、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のヒト血清アルブミンを含む。更に別の実施形態では、該溶液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のＨＳＡを含む。本発明の一実施形態において、該方法は、２つ以上の溶離工程を含む。そのような場合には、溶離溶液は、先の工程で使用した溶液と異なり、結合緩衝液と同一であり得る。

本発明の一実施形態において、非定組成溶液は、５％〜１５％のエタノール、０．２Ｍ〜１．２ＭのＮａＣｌ、及び０．１％〜１．０％のＨＳＡ（例えば、０．２％のＨＳＡ）を含有する酢酸塩グリシン緩衝液（例えば、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）である。他の可能な塩は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２であるが、これらに限定されない。他の可能な溶媒は、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコール（ethyelene glycol）であるが、これらに限定されない。

２つの溶離工程である、工程Ｉでは、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、５ＩＵ／ｍＬのヘパリン（増殖／栄養因子に結合する分子）、及び０．２％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）を用いて、及び工程ＩＩでは、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）を用いて行うことにより、かかる２つの溶離工程の不在下で得る調製物と比べて、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収又は濃縮が少なくとも３倍となり、ｂＦＧＦの回収又は濃縮が約１．８倍となる（ＬＹＯ ＶＩで見られるように）ことが、本発明によって見出された。

本発明の一実施形態では、非定組成条件による２工程溶離が行われる。本発明の別の実施形態では、該工程の少なくとも一方（例えば、第１の工程）で使用する非定組成溶液は、ヘパリンなどの成長因子に結合する分子を、２〜３０ＩＵ／ｍＬ、２〜２５ＩＵ／ｍＬ、２〜２０ＩＵ／ｍＬ、２〜１５ＩＵ／ｍＬ、２〜１０ＩＵ／ｍＬ、又は２〜５ＩＵ／ｍＬの濃度範囲で含む。本発明の一実施形態では、非定組成溶液は、ヘパリンを５ＩＵ／ｍＬの濃度で含む。

Ｓ／Ｄ処理の後でＳ／Ｄ除去工程の前に、最終濃度１％（ｗ／ｗ）の硫酸デキストラン［増殖／栄養因子に結合する分子］でインキュベートする工程を追加することにより、また、一方は、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）を用い、他方は、Ｓ／Ｄ除去工程の間の酢酸塩グリシン緩衝液中の１％の硫酸デキストラン及び０．２％のＨＳＡを用いる、２つの溶離工程を行うことにより、かかる溶離なしに得る調製物と比べて、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収又は濃縮が約６．６倍となり、ｂＦＧＦの回収又は濃縮が約２．８倍となり得る（ＬＹＯ ＶＩＩに見られるように）ことが、本発明に従って更に見出された。これら溶離工程によって、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去の前の因子の濃度と比較して、ｂＦＧＦの回収率は８５％に増加され得、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収率は８８％に増加され得る。

驚くべきことに、ＬＹＯ ＶＩにけるＰＤＧＦ−ＡＢの全体的な回収率が１．５％であるのに比べ、ＬＹＯ ＶＩＩにおける（出発物質、ＷＡＰからの）ＰＤＧＦ−ＡＢの全体的な回収率は、５１％であった。ＬＹＯ ＶＩにおける３７％と比べ、ＬＹＯ ＶＩＩにおけるＶＥＧＦの全体的な回収率は７３％であった。

本発明の一実施形態において、本発明の方法は、Ｓ／Ｄ除去工程に先立って、溶解物を、因子（例えば成長因子）に結合する分子と接触させる工程を更に含む。因子に結合する分子は、例えば、最終濃度範囲が０．０１〜１％、例えば１％（ｗ／ｗ）の濃度の硫酸デキストランであり得る。このような実施形態では、結合緩衝液は、酢酸ナトリウム、グリシン、及びヒト血清アルブミンに加えて、硫酸デキストランを含む。本発明の別の実施形態では、非定組成溶液は、最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）の硫酸デキストランを含む。

溶離溶液の順序は、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂ−ＦＧＦの回収レベルの一因となることが、本発明によって見出された。即ち、因子の回収は、異なる非定組成溶液を使用する場合、及び／又は溶離の順序が変更される又は逆になる場合に変化し得る。

分子は、接触すると増殖／栄養因子が結合することができる、ヘパリン、硫酸デキストラン、ヘパラン硫酸、及び他の硫酸化多糖類、グリコサミノグリカン、又は多価陰イオン、及び同類のものであり得る。

用語「分子と因子との間の接触」は、広い意味で用いられ、化合物と因子との間に結合相互作用が生じるように、分子を溶解物中に存在する目的の因子の十分近くまで接近させるあらゆるタイプの結合動作を指す。接触は、化合物を溶解物中に導入するなどであるが、これに限定されない、様々な方法で実施され得る。

有利には、Ｓ／Ｄ除去工程の前に、成長因子及び／又は栄養因子に結合する分子と溶解物とを接触させることで、いくつかの因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦ）の量の増加／濃縮がもたらされる。

別の態様において、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、生体液体物質から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去する方法に関する。該方法は、Ｓ／Ｄを含む液体をＨＩＣに充填する工程と、非結合分画及び非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。更に、別の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、生体液体物質から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去する方法に関する。該方法は、Ｓ／Ｄを含む液体をＨＩＣに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。

用語「生体液体物質」又は「生体液体混合物」は、生物源から得られる任意の種類の液体物質を指す。該液体物質としては、典型的には、限定するものではないが、全血漿又は血液分画、例えば、低温析出後の血漿、クリオプレシピテート、血漿又は血清；精液；痰；糞便；汗；唾液；鼻粘液；脳脊髄液；ＰＲＰ−Ｒなどの血小板由来の分画；及び尿；から得られる調製物、並びに細胞が調製物中に分泌する生体物質を含有する又はもとは細胞内部に存在し、細胞の溶解などの様々な操作に起因して液体調製物に放出された物質を含有する細胞培養液から得られる液体、が挙げられる。

一実施形態において、Ｓ／Ｄを除去する方法は、生体液体調製物をウイルス不活性化するプロセスの間に用いることができる。血液及び血漿調製物などの生体的に誘導された液体調製物は、複数の生体的に有用な化合物を精製することができる原料物質として用いられる。かかる化合物の例としては、免疫グロブリン、第ＶＩＩＩ因子、アルブミン、α−１−アンチトリプシン、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、ＰＰＳＢ、フィブリノーゲン、及びトロンビン（プロトロンビン）が挙げられる。更に、ホルモン、成長因子、酵素、及びリガンドなどの様々な生体生成物は、細胞培養液から得られる生体調製物から単離される。例えば、生体液体調製物のウイルス不活性化プロセスは、
（ａ）脂質被覆ウイルスを不活性化するのに十分な濃度及び条件下で、生体液体製物を溶媒−洗剤混合物で処理する工程と、
（ｂ）（ａ）で得た液体調製物をＨＩＣに通過させることによって、該液体調製物から溶媒−洗剤混合物を除去する工程と、
（ｃ）非結合分画及び非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。

別の実施形態では、工程（ｃ）では、非定組成条件下で溶離された分画のみが収集され得る。

定組成溶液の使用は、典型的には、液体クロマトグラフィーにおける一定組成の移動相の使用に関する。「非定組成溶液」は、典型的には、例えば、カラムを充填及び／若しくは洗浄するのに用いられる溶液及び／若しくは条件と異なる溶液及び／若しくは条件、並びに／又は、先の工程で用いられた溶液と異なる溶液を指す。

非エンベロープウイルスを除去するために、少なくとも第２のウイルス不活性化工程、例えば、熱処理（低温殺菌）が行われ得る。

特定の実施形態では、凝集物含有量の更なる低減は、本発明の方法に、カルシウム補充とその後の清澄濾過の工程を含めることによって得られる。

用語「カルシウム補充」は、カルシウム（例えば、カルシウム塩）を抽出物／生体液体物質に添加することを指す。カルシウム塩の例としては、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、クロロリン酸カルシウム（calcium chlorophosphate）、リン酸二カルシウム及びリン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウム、塩化カルシウム、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。カルシウムは、１〜１００ｍＭの最終濃度範囲で補充され得る。一実施形態において、ＣａＣｌ_２は、最終濃度４０ｍＭになるように抽出物に添加される。抽出物は、カルシウム補充後に５０ＲＰＭで混合しながら、例えば、２５℃にて３０分にわたってインキュベートされ得る。

用語「清澄濾過」は、濾過によって抽出物／生体液体物質から凝集物などの粒子を除去することを指す。多段階濾過工程を実施するとができる。例えば、抽出物は、２０、３及び０．４５μｍのフィルタを通して連続的に濾過され得る。滅菌濾過は、例えば、０．２μｍのフィルタによって行われ得る。

所望により、本発明の方法によって得た血小板抽出物は、抗凍結剤と共に配合されて凍結乾燥されてもよい。

用語「抗凍結剤」は、凍結中に活性成分（例えば、成長因子及び／又は栄養因子）の化学安定性及び／又は生物活性を維持するために溶液に添加される物質を指す。抗凍結剤の非限定的な例としては、例えば、単糖類としてグルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、ガラクトース、及びリボシドサッカライド（ribosedisaccharides）；二糖類としてスクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロース；並びに二糖類、オリゴ糖（Disaccharides oligosaccharides）などの炭水化物を挙げることができるが、これらに限定されない。他の群はポリオール（糖アルコール：マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びイソマルト）である。炭水化物とは別に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの他のポリマーを抗凍結剤として使用することが可能である。他のものとしては、アミノ酸及びポリアミンが挙げられる。

用語「凍結乾燥」は、典型的には、物質を凍結した後、例えば昇華によって、生体反応又は化学反応を支持しないレベルまで水分濃度を低減するプロセスを指す。得られた凍結乾燥された生物的物質は、比較的長期間にわたって貯蔵することが可能である。貯蔵後、凍結乾燥物質は、粉末として使用することができる、又は様々な量の水溶液の添加によって再構成することができる。再構成の間に添加される量は、凍結乾燥前の溶液の体積と同様、それより少ない（出発物質の体積と比較すると抽出物の濃縮物が得られる）、又はそれより多い（出発物質の体積と比較すると抽出物の希釈物が得られる）場合がある。

所望により、血小板抽出物は、長期貯蔵の目的で又は粉末として使用するために、凍結された状態で又は固体として保存され得る。

例えば、本発明の方法によって得た血小板抽出物は、長期貯蔵を目的として、例えば−１８℃又はそれより低い温度で冷凍保存されることができる、又は（例えば、凍結乾燥された）固体として保存され得る。血小板抽出物はまた、例えば２℃〜８℃の温度で冷蔵され得る。

凍結乾燥された抽出物は、固体として使用されてもよく、又は使用に先立って薬学的に許容可能な担体の中で再構成されてもよい。用語「薬学的に許容可能な担体」は、ヒトへの投与又は動物への投与に適した任意の希釈剤及び／又は媒体を指す。担体は、生理食塩水、塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンガー（ＬＲ）、通常生理食塩水中５％デキストロース、及び注射用蒸留水などであるが、これらに限定されない、当該技術分野において周知の担体のいずれかから選択することができる。

フィブリン封止剤と共に投与する場合、抽出物は、封止成分（トロンビン又はフィブリノーゲン）中で再構成することができる、又は別の希釈剤又は媒体の中で別々に再構成されることができる。

有利には、凍結乾燥サイクル及びその製剤は、例えば緊急な使用を必要とする止血及び治癒を容易にするため、例えばフィブリン封止剤内での抽出物の非常に迅速な再構成を可能とすることができ、この場合には、再構成は数秒以内に有利に行われる。本発明の一実施形態では、迅速な再構成を可能にするため、アルブミンが製剤化して用いられる。

本発明は、本発明による血小板抽出物の調製を例示し、（インビトロ設定及びインビボ設定における）その活性を示す以下の実験及び知見に基づく。以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参考として本明細書に組み込まれる。

以下の例は例示であり、限定するものではない。

材料及び方法。
洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）調製物。
血小板物質単位（白血球低減アフェレーシス血小板単位）を収集し、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」（２００９年１２月）に従って処理し、ＦＤＡ及びＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの適用法令及び規則に適合させた。

各単位は、およそ２００ｍＬの量を有した。各単位は、検査され、ＦＤＡの規制、要件、及びガイドラインに基づいて輸血可能な血液成分の提供にふさわしいと判断された単一ドナーから採取された。ＦＤＡによって承認されたキット及び方法（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体；Ｃ型肝炎ウイルス抗体；ヒトＴ細胞白血球ウイルス１型及び２型抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型抗体；核酸増幅検査（nucleic acid technology testing）（ＮＡＴ）によるＨＩＶ−１；ＮＡＴによるＨＣＶ ＲＮＡ；ＮＡＴによるウエストナイルウイルスＲＮＡ；及び梅毒血清検査）を用いることによって、赤血球抗体に対し非反応性であり、かつこれらウイルスが陰性であることが判明した単位のみが含まれた。白血球低減アフェレーシス収集単位中の血小板の最小数は、情報の回状に定められた通りであった：≧３．０×１０^１１（単一全血単位中の血小板の数は、≧５．５×１０^１０である）。

全単位は、洗浄工程まで、輸血の推奨条件下で維持された（ＦＤＡによって承認されたｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｙｓｔｅｍの使用法を参照のこと）。

洗浄手順。
各単位は、無菌条件下で次の通りに洗浄された。
１．各単位は、室温にて４６５８×ｇで６分にわたって遠心分離された（破砕回転翼（break rotor）は使用しなかった）。こうした緩やかな条件下で、細胞の破損は回避された。
２．上澄みを廃棄し、無菌連結された（無菌状態を維持するために、閉鎖システムにおいて容器間で液体を移送する方法）２００ｍＬの生理食塩水中で血小板ペレットを再構成した。
３．工程１で指定されたのと同じ条件で第２の遠心分離を行った。
４．生理食塩水を廃棄し、ペレット化された血小板を無菌連結された生理食塩水２００ｍＬの中に再懸濁した。
５．洗浄され、再懸濁された血小板を−２０〜−３０℃で凍結した。凍結工程は、先の工程から４時間以内に行われた。

白血球低減血小板アフェレーシス単位の慎重に実施された上記収集及び洗浄手順は、血液収集センターで行われた（Ｒｏｃｋ Ｒｉｖｅｒ Ｖａｌｌｅｙ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ／ＦＤＡ Ｌｉｃｅｎｓｅ ＃２４９）。最終ＷＡＰバッグは、調製日から２か月以内に実験用に供給された。これら単位は、ドライアイスの上で凍結された状態で受領した。

実施例１：プールしたＷＡＰから調製されかつ溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）で処理された凍結乾燥された血小板抽出物。
９個のＷＡＰバッグ（各バックは約２００ｍＬを含有する）は、該バックを３７℃の水浴に３０分にわたって入れることによって解凍された。次の工程で、ＷＡＰバッグを７０％エタノールで拭き、切り開き、それらの内容物を室温（約２２℃）にてステンレス鋼製ビーカーの中に注ぎ込んだ。ビーカーを攪拌装置の上に置き、プールしたＷＡＰ物質（〜１８００ｍＬ）を、室温（約２２℃）にて５分間ゆっくり混合した。攪拌中、２００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液［２００ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号３２３１８）、及び１００ｍＭのグリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号１５５２７）（ｐＨ ６．８〜７．４）］、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；総体積に対する最終濃度５％ ｖ／ｖ）（Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ ２５、Ｔａｌｅｃｒｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃｓ，ＮＣ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ ２５）を、プールしたＷＡＰに添加した。（２０００ｍＬのうち）５００ｍＬのサンプルを取り出し、溶媒及び洗剤（Ｓ／Ｄ）で処理し、脂質エンベロープウイルスを不活性化した（以下の手順を参照のこと）。残り（１５００ｍＬ）は、後で分析するために−８０℃で凍結した（「プールしたＷＡＰ」）。サンプル５００ｍＬを冷やした（４℃）ステンレス鋼製ビーカーに移し、４℃の水浴に入れた。サンプルを次の通りにＳ／Ｄ処理に供した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号２０１８０５０１）及び０．３％のリン酸トリ−（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ；Ｍｅｒｃｋカタログ番号１００００２）（ｖ／ｖ）を一緒に混合した後、ＲＷ２０オーバーヘッドスターラー（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続された３枚羽根ステンレス鋼プロペラを使用して６０ＲＰＭで攪拌しながらサンプルにゆっくり加えた。サンプルをその後も引き続き４℃にて４時間にわたって攪拌した。Ｓ／Ｄ処理の後、Ｓ／Ｄ除去工程に先立って粗粒子状残骸を除去するために、２０、１０、及び５μｍポリプロピレン製のカプセルフィルタ（ＤＯＬ Ｔｙｐｅ、ＭＤＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ；カタログ番号はそれぞれＤＯＬＸ５１１１ＤＤＸＸ１０１、ＤＯＬＸ５１０８ＤＤＸＸ１０１、ＤＯＬＸ５１０７ＤＤＸＸ１０１）にサンプルを連続して通し、濾過した。

Ｓ／Ｄの除去は、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ；カタログ番号２００３３−０１５）８０ｍＬが詰め込まれたＸＫ２６／４０液体クロマトグラフィーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；カタログ番号１８−８７６８−０１）を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ自動液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に使用して行われた。カラム長さは１５ｃｍであった。流量は、試行全体にわたって１０ｍＬ／分であった。再蒸留水（ｄｄＨ_２０）３２０ｍＬを用いてカラムを調製し、２４０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）及びＨＳＡ（総体積に対し５％ ｖ／ｖ）でカラムを平衡化した。サンプル（５００ｍＬ）を充填した後、カラムを、５％ ＨＳＡ（ｖ／ｖ）を含有する（上記の）酢酸塩グリシン緩衝液１４４ｍＬ、次いでｄｄＨ_２Ｏ １４４ｍＬで洗浄した。未結合サンプル及び洗浄緩衝液を含む収集した全フロースルー体積は７２０ｍＬであった。（上記の）酢酸塩グリシン緩衝液中のＤ−マンニトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｍ９５４６）を、フロースルーで収集した物質に加え（最終濃度２％ ｖ／ｖになるように）、このＤ−マンニトールは、次の凍結乾燥プロセスの間のタンパク質の抗凍結剤としての役割を果たした。ＷＡＰの凍結及び解凍、並びにＷＡＰをＳ／Ｄ処理及びＳ／Ｄ除去に供することで、血小板抽出物／溶解物の調製物を得た。

フロースルーで収集した物質を、高圧滅菌したガラス製バイアル（Ｆｉｏｌａｘ Ｃｌｅａｒ ４０×２２×１ｍｍ、Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍｕｌｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に分注し（各バイアルに２ｍＬ）、下の表１に詳しく述べられているサイクルに従って凍結乾燥した（Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ Ｅｐｓｉｌｏｎ ２−８Ｄ、Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ Ｇｅｆｒｉｅｒｔｒｏｃｋｎｕｎｇｓａｎｌａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｏｓｔｅｒｏｄｅ ａｍ Ｈａｒｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。

凍結乾燥物質は、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で、高圧滅菌したゴム栓（シリコーン２０ｍｍ、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ；カタログ番号７００１−２７４２）で密封された。プールしたＷＡＰから調製され、Ｓ／Ｄ及びＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂で処理された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ Ｉ」と呼ばれる。

ＬＹＯ Ｉの精製工程は、単一ウイルス不活性化工程であるＳ／Ｄ処理を含んだ。

実施例２：様々な血小板抽出物調製物のタンパク質プロフィールの特徴付け。
以下の実験は、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板のタンパク質プロフィールを特徴付け［全血（ＭＤＡ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋより入手）からの洗浄血小板と比較した場合の、未処理のＷＡＰ物質（上述のｔｈｅ ＵＳ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手）］、Ｓ／Ｄ処理又はＳ／Ｄ処理＋ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂精製がＷＡＰのタンパク質プロフィールに影響を与えたかどうかを調べることを目的とした。Ｓ／Ｄ処理及びＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂精製は上で詳述した通りに行われた。全ての場合において、抽出物は、血小板を凍結・解凍し、必要であれば、Ｓ／Ｄ処理することによって得た。タンパク質プロフィール分析はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって行われた。各試験調製物のタンパク質の量は、以下に特定されている。全タンパク質量は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ；カタログ番号２３２３５）を使用し、製造者の使用説明書に従って決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順は、次のようなやり方で行われた。調製物を、トリス−グリシンランニング緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号１６１−０７７２）を有する、４〜１２％のトリス−グリシンゲル１．５ｍＭ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＥＣ６０３８ＢＯＸ）に充填した。用いた実行条件は、２５ｍＡ定電流にて１．５時間であり、ＰｏｗｅｒＰａｃｋ ３００電源（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。実行工程の後、ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅベースの染色液を製造者の使用説明書（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＩＳＢ０１Ｌ）に従って使用して、２〜８℃にて一晩染色した。図１は、様々な調製物のタンパク質プロフィールを示す。

結果は、全血輸血から得た洗浄血小板（レーン３）に対し、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ；レーン４）は微量のアルブミンを含有することを示している。Ｓ／Ｄ処理後（レーン５）及びＳ／Ｄ処理＋ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂精製後（レーン６）のＷＡＰのバンド形成パターンは、出発物質（即ち、ＷＡＰ；レーン４）のそれと同様であった。

これらの結果は、タンパク質の組成は、上記処理工程中に有意に影響を受けないことを示している。

実施例３：ＬＹＯ Ｉが細胞増殖及び細胞の形態に与える影響。
以下の実験は、ＬＹＯ Ｉ（プールしたＷＡＰから調製され、Ｓ／Ｄで処理され、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂にさらされ、かつ凍結乾燥された、凍結乾燥血小板抽出物−実施例１に詳述されている通りに調製）が、線維芽細胞の細胞増殖に与える生体影響を調べるために行われた。ＬＹＯ Ｉが細胞増殖に与える影響を、ＷＡＰの影響と比較した。

細胞増殖アッセイ。
この目的のため、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ９２）を、２５×１０^３細胞／ｍＬ（２５００細胞／ウェル）の濃度で、組織培養用の処理をしたＣｏｓｔａｒ社の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＡ ＵＳＡ）の中の１００μＬの完全増殖培地［４．５ｇｒ／Ｌのグルコースを含有し、４ｍＭのグルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０３−０２０−１Ｂ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ；カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）／アンフォテリシン（amphotericine）（０．２５μｇ／ｍＬ）溶液（Ｐ／Ｓ／Ａ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０３−０３３−１Ｂ）を添加したＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０１−０５５−１Ａ）］中に播いた。播種した細胞を、５％ ＣＯ_２の湿気のある環境中で、３７℃にてインキュベートした。細胞播種から２４時間後に、完全増殖培地を廃棄し、ウェルを１００μＬの飢餓培地で２回洗浄し、１００μＬの新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた［飢餓培地：４．５ｇｒ／Ｌのグルコースを含有し、４ｍＭのグルタミン、１％のＭＥＭ−ＥＡＧＬＥ非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０１−３４０−１Ｂ）、１％のヒト血清アルブミン（Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ ２５、Ｔａｌｅｃｒｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＰ／Ｓ／Ａ（上記の濃度）を添加したＤＭＥＭ］。

増殖は、「プールしたＷＡＰ」（上記の調製参照）又は再構成された「ＬＹＯ Ｉ」を添加することによる培地の交換の２４時間後に誘発された。ＬＹＯ Ｉは、０．４ｍＬの飢餓培地の中で再構成された（凍結乾燥前の物質に比べて５倍の濃度）。全タンパク質量は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイによって決定された（実施例２参照）。ＷＡＰ Ｉ及びＬＹＯ Ｉの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ ＵＳＡのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ：ヒトＴＧＦ−β１カタログ番号ＤＢ１００Ｂ、ヒト線維芽細胞増殖因子カタログ番号ＨＳＦＢ００Ｄ、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢカタログ番号ＤＨＤ００Ｂ、ヒトＥＧＦカタログ番号ＤＥＧ００）によって検出し、増殖アッセイ中のウェルに存在する量は次の通りである：ＷＡＰ Ｉ及びＬＹＯ Ｉで処理したウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β１−２０５及び３５０ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ−２６０及び２６５ｐｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＡＢ−７５及び７ｎｇ／ｍＬ；並びにＥＧＦ−３及び３ｎｇ／ｍＬ。

増殖は、ＷＡＰ又はＬＹＯ Ｉ添加の４８時間後に、ミトコンドリア活性に基づいて細胞増殖及び細胞生存率定量化するＷＳＴ−１細胞増殖試薬を製造者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号１１−６４４−８０７）に従って使用して評価した。プレートを、５％ ＣＯ_２の湿気のある環境中で、３７℃にて２時間インキュベートした後、１分間振盪した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、サンプルの吸光度を、ブランクとしてのバックグラウンド対照（細胞を有さない飢餓培地）に対して４５０ｎｍで測定した。６５０ｎｍで得た基準値を各値から減算した。

「プールしたＷＡＰ」又は「ＬＹＯ」で処理した３Ｔ３細胞の増殖が、図２に示されている。実験を３回ずつ行った。飢餓培地で成長した細胞（「０」としてマークされている）を対照として用いた［^＊＊＊−ｐ＜０．００１（ｔ検定分析）、「０」と比較］。

結果は、対照（０としてマークされている）に比べ、ＷＡＰ及びＬＹＯ Ｉを添加することによって、細胞増殖速度が有意に促進されたことを示す。

細胞形態。
ＬＹＯ Ｉが細胞の形態に与える影響を、次の２つの異なる細胞株の型を用いてモニターした：新生児由来の内皮幹細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｌｏｎｚａ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ番号Ｃ２５１９Ａ）；及び３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞。一定の条件の下で、例えば創傷治癒過程の間、線維芽細胞はスピンドル状の形状を獲得する。これら形状は、線維芽細胞の運動性の増加の特性である（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ．Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ．２００１ Ｄｅｃ；４２（６）：５８７〜９４；Ｎａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．ＰＤＧＦ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｎ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｎＲＮＰ−Ｋ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｅ３−ｌｉｇａｓｅ ＭＩＲ．ＥＭＢＯ Ｊ．２００６ Ｍａｙ ３；２５（９）：１８７１〜８２）。ＨＵＶＥＣは多くの場合、血管様構造体からの様々な物質による血管新生の誘導を評価するために用いられる（Ａｒｎａｏｕｔｏｖａ Ｉ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ ＨＫ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｅｌｌｅｄ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１０；５（４）：６２８〜３５）。これら形態変化は血管形成に関連する。

ＬＹＯ Ｉが細胞の形態に与える影響をモニターするために、ＨＵＶＥＣ又は３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を、２５×１０^３細胞／ｍＬ（２５００細胞／ウェル）の濃度で、９６ウェルプレートの中の１００μＬの完全増殖培地［ＨＵＶＥＣ：Ｌｏｗ Ｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＬＳＧＳ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ ＵＳＡ；カタログ番号Ｓ００３１０）及びＰ／Ｓ／Ａ溶液（上記濃度）を添加したｍｅｄｉｕｍ ２００（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ ＵＳＡ；カタログ番号Ｍ２００５００）；３Ｔ３−スイスアルビノ細胞用：先行実験に記載されている通り］中に播いた。細胞播種から２４時間後に、完全増殖培地を廃棄し、各ウェルを１００μＬの飢餓培地で２回洗浄し、１００μＬの新鮮な飢餓培地を加えた［ＨＵＶＥＣ：２％のＦＣＳ及びＰ／Ｓ／Ａ（上記濃度と同じ）を添加したｍｅｄｉｕｍ ２００；３Ｔ３用：先行実験に記載されている通り］。飢餓培地に変更してから２４時間後に、再構成したＬＹＯ Ｉ（ウェル当たりの総タンパク質は２０ｍｇ／ｍＬ；再構成は各細胞に適した飢餓培地０．４ｍＬの中で行われた）をウェルに加えた。ウェルにおけるＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＥＧＦの濃度は、増殖アッセイにおけるものと同じである。

いくつかのＨＵＶＥＣサンプルに追加処理を行った。いくつかのサンプルには、２ＩＵ／ｍＬのトロンビン（ウェル中の最終濃度）［ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）のトロンビン成分と同じ溶液］を添加し、いくつかのサンプルには、１：１６に希釈したフィブリノーゲン成分（ウェル中の最終希釈；使用したフィブリノーゲン成分は、ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤のＢＡＣ成分）を添加し、他のサンプルには、ＬＹＯ Ｉ＋２ＩＵ／ｍＬのトロンビン（ウェル中の最終濃度）を添加し、他のサンプルには、ＬＹＯ Ｉ＋希釈したフィブリノーゲン成分（１：１６）を添加した。希釈は全て飢餓培地中で行われた。飢餓培地で増殖した未処理の細胞を対照として使用した。

様々な処理の後４８時間（３Ｔ３；図３）又は７２時間（ＨＵＶＥＣ、図４）の時点で、細胞の形態を顕微鏡で評価した。各実験を３回ずつ行った。

結果は、未処理の３Ｔ３−スイスアルビノ細胞（図３Ａ）は、菱形の凧状の形状を有した（ストライプの矢印参照）ことを示している。ＬＹＯ Ｉの添加は（図３Ｂ）、スピンドル様構造（連続矢印）の形成をもたらした。

ＨＵＶＥＣの未処理の細胞及びトロンビンで処理した細胞（それぞれ、図４Ａ及び図４Ｃ）は、菱形の形状（ストライプの矢印）を有し、ＬＹＯ Ｉの添加は（図４Ｂ）、血管様構造の形成を誘発した（連続矢印）。更に、ＨＵＶＥＣ細胞を、ＬＹＯ Ｉ及びトロンビン（図４Ｄ）又はＬＹＯ Ｉ及びＢＡＣ（図４Ｆ）で処理すると、他の処理群に比べて血管様構造の形成の増加がもたらされた。ＢＡＣのみでの処理（図４Ｅ）は、軽微な影響をもたらした（少数の血管様構造が形成された）。

実施例４：プールしたＷＡＰから調製され、Ｓ／Ｄで処理され、低温殺菌され、かつ無菌濾過された凍結乾燥血小板抽出物。
ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。通常は、ウイルス及び／又は未知の病原体を伝播させる危険性を最小限に抑えるためにいくつかの手段がとられ、該手段には、特定のウイルスが存在するかどうかに関する提供されたサンプルの定期試験、及び製造プロセスの間のウイルス不活性化／除去工程などが含まれる。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、製品の有益な特性を変更しない少なくとも２つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びウエストナイルウイルスなどの脂質エンベロープウイルスは、ウイルスの脂質膜を破壊するＳ／Ｄ処理によって、迅速かつ効果的に不活性化される。

低温殺菌は、熱が脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を破壊するプロセスである。ナノ濾過は、特別なナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスをサンプルから排除するプロセスである。

以下の実施例では、第２のウイルス不活性化工程として低温殺菌を用いる能力を評価した。

ＷＡＰ物質のプールを調製し、次の１）〜８）であることを除いては、実施例１に詳述されている通りにＳ／Ｄ処理した。１）３個のＷＡＰバッグを使用した（総体積６００ｍＬ）。２）４３０ｍＬのサンプルを取り出してＳ／Ｄで処理し、残りの１７０ｍＬは、後で分析するために−８０℃で凍結した（「プールしたＷＡＰ ＩＩ」）。３）ＨＳＡを最終濃度１％ ｖ／ｖになるように（ＬＹＯ Ｉに見られるように５％のＨＳＡではない）サンプルに添加した。４）５００ｍＬ［４３０ｍＬのサンプル＋７０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び１００ｍＭのグリシン）］のサンプルをステンレス鋼製ビーカーに移し、２５℃（実施例１に見られるように４℃ではない）に設定された水浴に入れた。５）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｎＢＰを添加した後、サンプルを２５℃にて２時間にわたって連続的に撹拌した（Ｓ／Ｄ処理が、実施例１の４℃に対し２５℃と高い温度で行われたので、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｎＢＰは、実施例１の４時間に対し、この実験では２時間と短時間で添加された）。６）Ｓ／Ｄ除去は、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂８０ｍＬが詰め込まれたＸＫ２６／４０液体クロマトグラフィーカラムを、ＢＴ３００−２Ｊ蠕動ポンプ（ＭＲＣ，Ｉｓｒａｅｌ）、及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用し、１０ｍＬ／分の定流量で実施された。カラムを３２０ｍＬのｄｄＨ_２０を用いて調製した後、１％のＨＳＡ ｖ／ｖ（５％ではない）を含有する２４０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）で平衡させた。７）サンプル（４５０ｍＬ）の充填後、カラムを１４４ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）＋１％のＨＳＡ ｖ／ｖで洗浄し、続いて１４４ｍＬのｄｄＨ_２Ｏで洗浄した。８）Ｄ−マンニトールはフロースルー物質に添加されなかった。次に、Ｓ／Ｄ処理されたフロースルー物質（即ち非結合分画及び洗浄緩衝液）（６１０ｍＬ）を、以下の通りに安定化工程及び低温殺菌に供した。フロースルーサンプル１グラム当たり１グラムのスクロースを、スクロースが完全に溶解するまで混合しながら（約２２℃）、フロースルー物質にゆっくりと加えた。次に、溶液を３７±１℃まで温め、フロースルー物質１ｇ当たり０．１１ｇのグリシンを、混合及び０．５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８〜７．４に調製しながら、溶液にゆっくりと加えた。ｐＨ調製は、グリシンが完全に溶解するまで行われた。その後、フロースルー物質１ｇ当たり０．８ｇのスクロースを、完全に溶解するまで３７℃で混合しながら徐々に加えた。スクロース及びグリシンは、低温殺菌工程中の安定化剤としての役割を果たすように溶液に添加された。次に、連続的に混合しながら（５０ＲＰＭ）６０℃にて１０時間にわたって熱処理することによって、溶液を低温殺菌した。（安定化剤の添加によって形成された）得られた粘性溶液を清潔な容器に移すため、最大総体積１８３０ｍＬまで酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）で希釈した。２ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ １０ｋＤａカセット（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を備えるＦｉｌｔｒｏｎ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）に対して透析濾過を行うことによって、溶液から安定化剤を除去した。透析濾過工程は次の通りに行われた。初めに、サンプルを９００ｍＬの体積まで濃縮し、溶液体積を９００±１００ｍＬに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積５，４００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）に対して透析を行った。次に、透析した溶液を４００ｍＬになるまで濃縮した。

凝集物質を除去するため、溶液を、５及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ（カタログ番号５５９１３４２Ｐ５、５５９１３０３Ｐ５）に通し、次に０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ；カタログ番号５４４１３０６Ｇ５）に通して、連続的に濾過した。滅菌濾過は、無菌条件下で（生体無菌キャビネットの中で）、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ；カタログ番号５４４１３０７Ｈ５）を使用して行われた。次に、実施例１に示されているように、溶液を高圧滅菌したガラス製バイアルの中に分注し（４ｍＬ）、凍結乾燥し、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で高圧滅菌したゴム栓で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ ＩＩ」と呼ばれる。

ＬＹＯ ＩＩの調製は、Ｓ／Ｄ処理、低温殺菌工程、及び０．２μｍを通す最終滅菌濾過を含んだ。

実施例５：ＬＹＯ ＩＩが細胞増殖及び細胞形態に与える影響。
以下の実験は、ＬＹＯ ＩＩ（プールしたＷＡＰから調製され、Ｓ／Ｄで処理され、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィー樹脂にさらされ、低温殺菌、無菌濾過、及び凍結乾燥された血小板抽出物）が細胞増殖に与える影響を決定することを目的とした。細胞播種濃度及び完全増殖培地交換は、２つの異なる細胞株であるＨＵＶＥＣ及び３Ｔ３−スイスアルビノにおいて、実施例３と同様に行われた（各細胞型に適合する完全増殖培地及び飢餓培地を用いた；上記培地成分参照；１００μＬの培地中、１ウェル当たり２５００個の細胞）。

３Ｔ３−スイスアルビノ細胞では、プールしたＷＡＰ ＩＩ又は再構成ＬＹＯ ＩＩ（４ｍＬの溶液から凍結乾燥され、０．５ｍＬの滅菌精製水中で再構成されたＬＹＯ ＩＩ−プールしたＷＡＰ ＩＩと比べて８倍に濃縮）を加えることによる培地の交換から２４時間後に増殖が誘発された。ＬＹＯ ＩＩの再構成の後、ＬＹＯ ＩＩ及びプールしたＷＡＰ ＩＩの両方を、適合する飢餓培地で５倍に連続希釈した（プールしたＷＡＰ ＩＩの開始濃度を１とし、それに基づいて、１、０．２、０．０４、０．００８、０．００１６、０．０００３２の相対濃度を用いた；ＬＹＯ ＩＩの開始濃度を８（この濃度は本実験では試験されなかった）とし、それに基づいて、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１２８、０．００２５６の相対濃度を用いた）。各希釈から１０μＬをウェルに加えた（初期接種濃度は２５００個の細胞；及び１００μＬの培地）。ＷＡＰ ＩＩ及びＬＹＯ ＩＩの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｂｙ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ ＵＳＡ：ヒトＰＤＧＦ−ＡＢカタログ番号ＤＨＤ００Ｂ、ヒトＶＥＧＦカタログ番号ＤＶＥ００）によって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ ＩＩ及びＬＹＯ ＩＩで処理したウェル中、それぞれ、ｂＦＧＦ−１２０及び２８０ｐｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−０．７５及び２．７ｎｇ／ｍＬ；並びにＰＤＧＦ−ＡＢ−８０及び３６ｎｇ／ｍＬ。

３Ｔ３−スイスアルビノ細胞の増殖レベルを、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を使用して４８時間後に評価した。プレートを、５％ ＣＯ_２の湿気のある環境中で、３７℃にて４時間インキュベートした後。インキュベーション期間の終わりに、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を、実施例３に詳述されている通りに測定した。未処理細胞で得たＯＤ値を得られたＯＤ結果から減算し、計算値をＳ字用量反応曲線としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、Ｒ^２フィット及び半有効濃度（ＥＣ５０）値を算出した。ＬＹＯ ＩＩ又はプールしたＷＡＰ ＩＩが３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に及ぼす増殖促進効果が図５に示されている。実験を３回ずつ行った。

結果は、ＬＹＯ ＩＩが３Ｔ３−スイスアルビノに及ぼす増殖促進効果は、出発物質（プールしたＷＡＰ ＩＩ）のそれと同様であること示す。これらの結果は、２段階のウイルス不活性化を含むＬＹＯ ＩＩの生産過程は、ＷＡＰ出発物質と比較してその効力に影響を与えないことを示している（例えば、ＥＣ５０値は、プールしたＷＡＰ ＩＩで０．０１８及びＬＹＯ ＩＩで０．０１３であった）。

ＨＵＶＥＣでは、様々な処理［再構成ＬＹＯ ＩＩと共に、又は再構成ＬＹＯ ＩＩなしでの、トロンビン（Ｔ；ウェル中の最終濃度１ＩＵ／ｍＬ；Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．のＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤からのトロンビン成分）の添加、及び再構成ＬＹＯ ＩＩの添加］による培地交換から２４時間後に増殖が誘発された。未処理の細胞を基準として用いた（０としてマークされている）。各処理溶液１０μＬを各ウェルに加えた。

４ｍＬの溶液から凍結乾燥されたＬＹＯ ＩＩの再構成は、０．５ｍＬの滅菌精製水中で行われた（即ち８倍濃縮）。

ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は、３Ｔ３細胞において行われた増殖アッセイと同じであった。

増殖レベルの測定は、処理開始から７２時間後に、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬によって行われた。インキュベーション期間（４時間）の終わりに、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。測定は２回ずつ行った。ＬＹＯ ＩＩの血管形成能を調査するため、第３の複製物をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した（結果は下の「ＨＵＶＥＣにおける血管様構造の形成」を参照のこと）。

ＬＹＯ ＩＩ、トロンビン、及びトロンビン＋ＬＹＯ ＩＩによる誘発後のＨＵＶＥＣの増殖速度が図６に示されている。

これらの結果は、ＨＵＶＥＣに対するＬＹＯ ＩＩの添加は、対照細胞（「０」、ＬＹＯ ＩＩを有さない）又はトロンビンのみで処理された細胞と比べて、有意に高い増殖をもたらしたことを示している。ＬＹＯ ＩＩ＋トロンビン（Ｔ）の添加は、ＬＹＯ ＩＩのみの添加と比べて、より顕著な増殖活性をもたらした。ＨＵＶＥＣにおける血管様構造の形成。

以下の実験は、基底膜抽出物（ＢＭＥ）コーティング上のＨＵＶＥＣ飢餓培地中で成長させたときにＨＵＶＥＣによってもたらされる血管様構造を観察するための陽性対照として実施された。ＢＭＥは、細胞粘着、遊走、増殖、及び分化、並びに細胞の成長に影響を与える組織構築において極めて重要な役割を果たす（Ｍｅｈｔａ ＶＢ，Ｂｅｓｎｅｒ ＧＥ．ＨＢ−ＥＧＦ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．２００７ Ａｕｇ；２５（４）：２５３〜６３；Ａｒｎａｏｕｔｏｖａ Ｉ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ ＨＫ．２０１０）。コラーゲンでコーティングされたウェル上のＨＵＶＥＣ飢餓培地中で成長した細胞を、陰性対照として用いた。

陽性対照の画像を得るため、（上で記載されている通り）ＨＵＶＥＣ細胞を、１×１０^５細胞／ｍＬ（１００００細胞／ウェル）の濃度で、９６ウェルプレートの１００μＬのＨＵＶＥＣ完全増殖培地中に播いた。播種された細胞を、５％ ＣＯ_２の湿気のある環境中で、３７℃にてインキュベートした。２４時間後、完全増殖培地を廃棄し、１００μＬの新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた（上記実施例３の培地成分参照）。細胞播種に先立ち、ウェルは、５０μＬ／ウェルの成長因子を低減した基底膜抽出物（ＢＭＥ；Ｃｕｌｔｒｅｘ，Ｔｒｅｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ；カタログ番号３４３３−００５−００１）で、製造者の手順に従ってコーティングされた、又は濃度３ｍｇ／ｍＬの５０μＬ／ウェルのウシのコラーゲンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ１０６４４−０１、ゲル化手順に関する製造者の手順に従って調製）でコーティングされた。

２４時間のインキュベーション期間の後、５μＭを３７℃にて３０分にわたって添加することによって細胞を染色し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡（倍率１００倍）及び５３０ｎｍの蛍光フィルタ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、代表写真を撮った。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭは、細胞生存率を試験するため、及び細胞を短期間標識化するために用いられる蛍光染料であり、細胞内に輸送された後、細胞内のエステラーゼ（生存細胞に存在する）は、メトキシ酢酸基（acetomethoxy group）を除去し、分子が中に閉じ込められ、強い緑色蛍光を提供する。死細胞には活性エステラーゼがないので、生細胞のみが標識化される。結果を図７に示す。

結果は、血管形成の可能性を反映するはっきりした管状構造が、ＢＥＭでコーティングされた表面上で検出された。コラーゲンコーティングでは管形成は観察されなかった（データは示されていない）。

血管形成を誘発するＬＹＯ ＩＩの能力を調査するため、先の実験（実施例５の細胞増殖実験）からの第３の複製物を、上記のように５μＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡（倍率２００倍）及び５３０ｎｍの蛍光フィルタを使用して、代表写真を撮った。ＬＹＯ ＩＩによる処理の後にＨＵＶＥＣによってもたらされた血管様構造を図８に示す。

再構成ＬＹＯ ＩＩの添加（８Ｂ）は、陽性対照の処理（ＢＭＥコーティング上に播種されたＨＵＶＥＣ、図７）と同様に、管状構造の形成の開始をもたらしたことが分かる。

誘発された細胞運動性と相関している可能性がある細胞形態変化を誘発するＬＹＯ ＩＩの能力を調査するため、実施例５の細胞増殖アッセイと同様の条件で、３Ｔ３−スイスアルビノ細胞で実験を行った（適合する完全増殖培地及び飢餓培地を使用した）。未処理の細胞と比較して、ＬＹＯ ＩＩ及びプールしたＷＡＰ ＩＩは、（菱形の形状からスピンドル様形状への）形態変化を誘発したことが観察された（データは示されていない）。

別の実験では、フィブリン封止剤又はフィブリノーゲンの存在下で血管様構造を誘発するＬＹＯ ＩＩの能力を評価した。フィブリン封止剤は、細胞外基質成分、例えば、フィブロネクチン及びフィブリノーゲンを含む（Ｂａｒ ｅｔ ａｌ．「Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎ ｓｅａｌａｎｔ ｔｏ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｈｅｔｅｒｏｎｅｃｔｉｎ）ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ『ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ』ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」．Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．２００５；１６：１１１〜１１７）。インビボ設定と似た環境条件を作り出すため、フィブリン封止剤の添加を行った。この目的のため、ＨＵＶＥＣを、１×１０^５細胞／ｍＬ（１００００細胞／ウェル）の濃度で、組織が（フィブリノーゲン又はフィブリンで−以下の手順参照）プレコートされた培養処理済みのＣｏｓｔａｒ社の９６ウェルプレートの、１００μＬの完全培地中に播種した。２４時間後、培地を廃棄し、１００μＬの飢餓培地を加えた（培地は上記成分を含む）。フィブリノーゲン又はフィブリンのプレコートは以下の通りに形成された。
ａ．５０μＬのフィブリノーゲン成分（ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤の成分；Ｏｍｒｉｘ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、ＨＵＶＥＣ飢餓培地で４ｍｇ／ｍＬに希釈）を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、溶液を吸引し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。
ｂ．５０μＬ／ウェルのフィブリンを２５μＬのフィブリノーゲン成分（ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤の成分、ＨＵＶＥＣ飢餓培地で８ｍｇ／ｍＬに希釈）及び２５μＬのトロンビン成分（ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤の成分、ＨＵＶＥＣ飢餓培地で２ＩＵ／ｍＬに希釈）から形成した。

コーティング溶液をウェルに塗布した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次に、溶液を吸引し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。次に、上記の条件下で細胞を播種した（１００μＬの完全増殖培地中１００００細胞／ウェル）。細胞播種から２４時間後に、培地を１００μＬの飢餓培地と交換した。培地を変えてから２４時間後に、１０μＬのプールしたＷＡＰ ＩＩ又は（２ｍＬの滅菌水中で、即ちＷＡＰ出発物質の体積に対して２倍の濃度に）再構成されたＬＹＯ ＩＩを、ウェルに加えた。ＷＡＰ ＩＩ及びＬＹＯ ＩＩの両方におけるいくつかの成長因子の濃度は、次の通りであった：ＷＡＰ ＩＩ及びＬＹＯ ＩＩで処理したウェル中、それぞれ、ｂＦＧＦ−４８０及び１１２０ｐｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−３及び１０．８ｎｇ／ｍＬ；及びＰＤＧＦ−ＡＢ−３２０及び１４４ｎｇ／ｍＬ。

細胞を上記のようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色し、代表写真を倍率１００倍で撮った。結果を図９に示す。

フィブリノーゲン又はフィブリンでコーティングされた表面は、管形成をもたらすことになる顕著な形態変化を誘発するには不十分であったことが明らかである。しかしながら、ＬＹＯ ＩＩ又はプールしたＷＡＰ ＩＩのいずれかを、フィブリノーゲン又はフィブリンコーティングと一緒に加えると、管状構造形成を促進した。

実施例６：プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製され、Ｓ／Ｄ処理、低温殺菌、無菌濾過、及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。
Ｓ／Ｄ処理及び熱処理されたＷＡＰ物質のプールを、次の１）〜８）であることを除いては、実施例４の通りに調製した。１）１０個のＷＡＰバッグを使用した（総体積２０００ｍＬ）。２）１７２０ｍＬのサンプルを取り出してＳ／Ｄで処理し、残りの２８０ｍＬは、後で分析するために−８０℃で凍結した（「プールしたＷＡＰ ＩＩＩ」）。３）最終濃度が１％のＨＳＡ ｖ／ｖになるようにＨＳＡをサンプルに添加した。４）Ｓ／Ｄ除去は、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂２９５ｍＬが詰め込まれたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計と共に使用し、４０ｍＬ／分の定流量で実施された。５）フロースルーで収集した物質の体積は２７００ｍＬであった。６）安定化及び低温殺菌の後に粘性溶液を移動させるため、溶液を総体積８６００ｍＬまで酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び１０ｍＭのグリシン）で希釈した。７）Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ＰＥ接線流濾過薄膜カートリッジホルダー＋４ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ １０ｋＤａ限外濾過カセット（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用し、最初にサンプルを３５００ｍＬの体積まで濃縮し（体積８６００ｍＬから）、続いて、溶液体積を３５００ｍＬ±２００ｍＬに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積１０，３２０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同様）に対して透析を行うことによって、透析濾過を行った。次に、透析したサンプルを４５０ｍＬまで濃縮した（開始時体積の約２５％：１７２０ｍＬのサンプルを取り出してＳ／Ｄで処理した上記工程２を参照のこと）。８）凝集物質を除去するために、濃縮された透析溶液を、２０、５、及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタに通し、次に０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタに通して連続的に濾過した（５及び１．２μｍに通すだけでなく、続いて０．４５μｍにも通した）。滅菌濾過は０．２μｍを通して行われた。次に、前述のように、濾過したサンプルを分注し（４ｍＬ）、凍結乾燥した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ ＩＩＩ」と呼ばれる。

ＬＹＯ ＩＩと同様に、ＬＹＯ ＩＩＩのウイルス精製工程は、Ｓ／Ｄ処理、追加の低温殺菌工程、及び最終滅菌濾過を含んだ。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して４倍に濃縮された。

実施例７：プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製され、Ｓ／Ｄ処理、低温殺菌、及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物（「ＬＹＯ ＩＩＩ」）中の血漿タンパク質の濃度。
血液凝固に関与するタンパク質を含む様々な血漿タンパク質の濃度を、プールしたＷＡＰ ＩＩＩ及びＬＹＯ ＩＩＩにおいて測定した。

ＬＹＯ ＩＩＩの再構成は、凍結乾燥前の体積（４ｍＬ）のｄｄＨ_２Ｏ中で行われた。

様々なタンパク質の濃度を次のように評価した。

以下の修正済みのヨーロッパ薬局方検定（０９０３／１９９７）手順により、トロンビンの凝固活性を測定した。トロンビン標準品（Ｏｍｒｉｘ，Ｉｓｒａｅｌ）と０．１％フィブリノーゲン溶液（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）とを、ＳＴａｒｔ４凝固器具（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して混合することによって、対数凝固時間と対数トロンビン濃度とを比較する検量線をプロットした。得られた凝固時間（凝固機により自動的に計算、検量線から内挿し、その後希釈係数を乗じた）により、様々なサンプル中のトロンビンの活性を算出した。

活性のあるフィブリノーゲンの定量化を、クラウス法に基づく、修正済みのヨーロッパ薬局方検定（０９０３／１９９７）に従って評価した。凝固時間を、ＳＴａｒｔ４凝固器具（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定した。この方法では、トロンビンの過剰存在下でフィブリノーゲン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を用いて検量線を作成した後、この検量線からサンプルのフィブリノーゲン濃度を算出する。

市販のＥＬＩＳＡキット（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ番号ＨＦＩＢＫＴ）を製造者の使用説明書に従って使用して、総フィブリノーゲンを測定した。

フィブロネクチンの定量化は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＴＣ１２０３０）を使用して行われた。

フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の定量化は、ＥＬＩＳＡアッセイにより行われた。ポリクローナルウサギ抗ヒトｖＷＦ抗体（ＤＡＫＯ；カタログ番号Ａ００８２）、及びポリクローナルウサギ抗ヒトｖＷＦ ＨＲＰコンジュゲート抗体を、アッセイで使用した。Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ；カタログ番号００６２５）を使用して標準曲線を作成した。

第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩ因子の量は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅから購入した次の試薬を使用し、ＳＴａｒｔ４凝固器具を用いて決定した：ＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＩＩ（カタログ番号００７４５）、ＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＶＩＩ（カタログ番号００７４３）、ＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＶＩＩＩ（カタログ番号０７２５）、ＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＩＸ（カタログ番号００７２４）、ＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｘ（カタログ番号００７３８）、及びＳＴＡ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＸＩ（カタログ番号００７２３）。全ての試薬は、製造者の使用説明書に従って使用した。

ＩｇＧ濃度は、ウエスタンブロット法による半定量的分析によって、アルカリ性ホスファターゼ結合アフィニィピュア（AffiniPure）ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＰＡ，ＵＳＡ；カタログ番号１０９−０５５−０８８）を使用して測定した。サンプル中のＩｇＧ濃度は、ヒトＩｇＧ ＢＲＰ Ｐｈ．Ｅｕｒ．標準品を用いて作成した検量線から算出した。

^＊ 値は検出限界を指すので、サンプルはこれらタンパク質が欠乏していると考えられる。

表２に示される結果は、プールしたＷＡＰ ＩＩＩ及びＬＹＯ ＩＩＩの両方が、非常に少量の血漿タンパク質を含んでいることを示す。ＬＹＯ ＩＩＩにおける凝固タンパク質の限界レベル又は完全欠損は、血小板抽出物を非凝固性にする。これと比べると、Ｂｕｒｎｏｕｆ（ＷＯ ２００９／０８７５６０）に従って調製された血小板抽出物は、高濃度の凝固因子を含有する。ＬＹＯ ＩＩＩ及びプールしたＷＡＰ ＩＩＩは、０．０８ｍｇ／ｍＬ未満の活性のあるフィブリノーゲンを含む。

実施例８：線維芽細胞の細胞増殖及びＨＵＶＥＣの形態変化にＬＹＯ ＩＩＩが与える影響。
ＬＹＯ ＩＩＩが細胞増殖に与える影響を、３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を使用し、実施例５に詳述されている通りに行った。

４ｍＬの溶液から凍結乾燥され、ＷＡＰの開始体積と比較して４倍に濃縮されたＬＹＯ ＩＩＩを、０．５ｍＬの滅菌精製水の中で再構成した（即ち８倍濃縮）（プールしたＷＡＰ ＩＩＩの出発体積と比較すると３２倍の濃縮）。再構成の後、プールしたＷＡＰ ＩＩＩ又は再構成ＬＹＯ ＩＩＩを、適切な飢餓培地中で５倍に連続希釈し、各希釈物の１０μＬを、１００μＬの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたＷＡＰ ＩＩＩの開始濃度を１とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＬＹＯ ＩＩＩの開始濃度を３２とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＷＡＰ ＩＩＩ及びＬＹＯ ＩＩＩの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ ＵＳＡのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ：ヒトＴＧＦ−β１カタログ番号ＤＢ１００Ｂ、ヒト線維芽細胞増殖因子カタログ番号ＨＳＦＢ００Ｄ、ヒトＶＥＧＦカタログ番号ＤＶＥ００、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢカタログ番号ＤＨＤ００Ｂ）によって検出し、増殖アッセイ中にウェル中に存在した有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ ＩＩＩ及びＬＹＯ ＩＩＩで処理したウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β１−１７０及び４２５０ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ−８５及び５４０ｐｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−１及び１３ｎｇ／ｍＬ；並びにＰＤＧＦ−ＡＢ−７３及び３３ｎｇ／ｍＬ。

標準対照として、組み換えヒト成長因子のカスタム混合物（本明細書ではＭａｓｔｅｒＭｉｘ；ＭＭと呼ぶ）を、次の成分を用いて調製した：ＴＧＦ−β１ ２００ｎｇ／ｍＬ、ｂ−ＦＧＦ ０．５ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ ５ｎｇ／ｍＬ、及びＰＤＧＦ−ＡＢ ３００ｎｇ／ｍＬ（成長因子はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した；それぞれ、カタログ番号２４０−Ｂ−０１０／ＣＦ、２３３−ＦＢ−０２５／ＣＦ、２９３−ＶＥ−０１０／ＣＦ、及び２２２−ＡＢ−０１０）。ＭＭ混合物も飢餓培地中で５倍に連続希釈し、ウェルに加えた（１０μＬ）。処理の開始から７２時間後に、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した（添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、ＯＤ値から減算した）。インキュベーション期間（４時間）の終わりに、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を３回ずつ行った。共通因子に基づいて様々な物質を比較するために、得られた結果は、ＰＤＧＦ−ＡＢ（全試験物質中に存在する、３Ｔ３細胞増殖を引き起こす成長因子）の濃度に正規化された（以下参照）。ＰＤＧＦ−ＡＢへの正規化は、再構成ＬＹＯ ＩＩＩ中のＰＤＧＦ−ＡＢ濃度を測定し［市販のＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ；カタログ番号ＤＨＤ００Ｂ）］、相対希釈におけるＰＤＧＦ−ＡＢの濃度を算出することによって行われた。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬によって得たＯＤ結果を、算出したＰＤＧＦ−ＡＢ濃度値に対してプロットした。ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＭＭ）を陽性対照として用いた。正規化は特異的ＥＬＩＳＡによって評価されたＰＤＧＦ−ＡＢ濃度に対して行われた。

３Ｔ３−スイスアルビノ細胞に対するＬＹＯ ＩＩＩ又はプールしたＷＡＰ ＩＩＩの増殖促進効果の結果を図１０に示す。

結果は、サンプル中に存在するＰＤＧＦ−ＡＢの量に正規化されると、ＬＹＯ ＩＩＩ又はプールしたＷＡＰ ＩＩＩの濃度の増加が、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、ＬＹＯ ＩＩＩの影響がより顕著であることを示している。特に、両方の処理の影響は、陽性対照（ＭＭ）よりも更に顕著であった。

ＬＹＯ ＩＩＩの血管新生効果を評価し、かつＬＹＯ ＩＩＩ及びフィブリン封止剤又はその成分の推定される共力効果を調査するために、管形成アッセイを行った。プレート表面への細胞の結合に対する添加剤のあらゆる考えられる影響を排除するために、最初に細胞を播種し、その後初めて様々な添加剤で処理した。

この目的のため、ＨＵＶＥＣを、５０×１０^３細胞／ｍＬ（５０００細胞／ウェル）の濃度で、組織培養用の処理をしたＣｏｓｔａｒ社の９６ウェルプレートの中の１００μＬの完全増殖培地（上記と同じ成分）中に播いた。細胞播種から２４時間後に、完全培地を廃棄し、ウェルを１００μＬの飢餓培地で２回洗浄し、１００μＬの飢餓培地を各ウェルに加えた（上記と同じ成分）。

培地を交換してから２４時間後に、１０μＬのＬＹＯ ＩＩＩ（０．５ｍＬの滅菌水中で再構成−プールしたＷＡＰ ＩＩＩの体積と比較すると３２倍に濃縮）又はＬＹＯ ＩＩＩとフィブリン［１ＩＵ／ｍＬのトロンビン（ウェル中の最終濃度）及び１１．３ｍｇ／ｍＬ（総タンパク質）のフィブリノーゲンで形成：トロンビン及びフィブリノーゲンは共に、飢餓培地で希釈されたＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）の成分である］との組み合わせを添加することによって、アッセイを開始した。ウェル中のＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は、上記の細胞増殖アッセイと同じであった。

上記と同じ濃度のトロンビン及び／又はフィブリノーゲンで処理した細胞を、基準として用いた。様々な処理から４８時間後に、５ｕＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを３７℃にて３０分にわたって使用して細胞を染色し、倍率１００倍のＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡及び５３０ｎｍの蛍光フィルタ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、代表写真を撮った。結果を図１１に示す。

図１１に示すように、対照細胞（Ａ）に管形成は観察されなかった。また、トロンビン又はフィブリノーゲンのみは、非常に少ない数の細長い細胞及び血管状の形状から評価され得るように、ＨＵＶＥＣの形態変化を誘発する最低限の能力しか有さなかったことが明らかである（それぞれＢ及びＣ）。フィブリン（トロンビン及びフィブリノーゲン；Ｅ）による処理は、管形成に向けた細胞の再配列をもたらしたが、明らかな血管構造物は検出されなかった。ＨＵＶＥＣ単層へのＬＹＯ ＩＩＩ（Ｄ）の添加は管形成を促進し、これはフィブリン（Ｆ）の添加によって更に増大された。

実施例９：プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製され、低凝集条件下でＳ／Ｄで処理され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。
この実験では、凍結乾燥された血小板抽出物は、次のように解凍される前の凍結物質から調製された。１０個のＷＡＰバッグを個別に坪量し、７０％エタノールで拭き、切り開き、２５℃に調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味ＷＡＰ重量を算出した（各バッグの正味ＷＡＰ重量は約２００ｇであった）。プールした物質を、ＲＷ２０オーバーヘッドスターラー（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたステンレス鋼製のプロペラを２０ＲＰＭで使用して、完全に解凍するまで２５℃にてゆっくり混合した。プールしたＷＡＰのオスモル濃度は、２７５ｍＯｓであった［Ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｍｉｃｒｏ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して測定］。１０％の酢酸塩グリシン緩衝液（２００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）及び１％のＨＳＡ（溶液の最終体積に対するｖ／ｖ）をプールしたＷＡＰに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、緩衝液のオスモル濃度をＷＡＰ出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。次の工程において、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｖ／ｖ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理を２つのパートに分割した。最初に、サンプルを３０分にわたって連続的に攪拌した後、２０、５及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。

２９５ｍＬのＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）が詰め込まれたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理された血小板抽出物をカラムに充填した後、５４０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）＋１％のＨＳＡ ｖ／ｖで洗浄した。２７００ｍＬの総体積をカラムから収集した（フロースルー）。製造の後の段階を妨げる可能性がある非水溶性の凝集物は、製造プロセスの間に形成されることが見出された。凝集は、カルシウムの存在下で増すこともまた見出された。したがって、早い段階での凝集物の沈殿を促進し、その後清澄濾過によってこれら凝集物を除去するために、カルシウムを使用することを決定した。したがって、Ｓ／Ｄ除去過程の後に、ＣａＣｌ_２をゆっくりと抽出物に添加し（最終濃度が４０ｍＭになるように）、該抽出物を５０ＲＰＭで混合しながら、２５℃にて３０分にわたってインキュベートした。次に、２０、５及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、生成物を濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例４と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。得られた粘性溶液を清潔な容器に移すため、酢酸塩グリシン緩衝液（粘性溶液中の最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び１０ｍＭのグリシンとなる、ｐＨ ６．８〜７．４）及び１％のＨＳＡ ｖ／ｖで、総重量が最大１１，３２０ｍＬになるまで希釈した。Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ＰＥ接線流濾過薄膜カートリッジホルダー＋４ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ １０ｋＤａ限外濾過カセット（Ｐａｌｌ）を使用して、酢酸塩グリシン緩衝液に対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った（上記の通り）。透析濾過は次の通りに行われた。初めに、抽出物を３６００ｍＬの体積まで濃縮し、次に、溶液体積を３６００±２００ｍＬに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積１０，８００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液に対して透析を行った（上記の通り）。次いで、透析した溶液を４７３ｍＬの体積まで濃縮した（これは出発体積の約２５％である）。

安定化のため、マンニトールを最終濃度２％ ｗ／ｗになるまで溶液に添加した。凝集物質を除去するため、サンプルを２０、５及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ、及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタに通して連続的に濾過した。滅菌濾過は、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、生成物を無菌条件下で４ｍＬずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ ＩＶ」と呼ばれる。

ＬＹＯ ＩＶのウイルス精製工程は、Ｓ／Ｄ処理内に濾過サブ工程を含むＳ／Ｄ処理を含んだ。この工程の濾過は、２０、５、１．２、及び０．４５μｍのフィルタを通して行われた。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間に、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して４倍に濃縮された。

実施例１０：ＬＹＯ ＩＶが、線維芽細胞における細胞増殖及び形態変化、並びにＨＵＶＥＣにおける形態変化に与える影響。
細胞増殖に対するＬＹＯ ＩＶの影響を、実施例５に詳述されている通りに行った。３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を、２５×１０^３細胞／ｍＬ（２５００細胞／ウェル）の濃度で、組織培養用の処理をしたＣｏｓｔａｒ社の９６ウェルプレートの中の完全増殖培地（上で詳述した成分）中に播いた。細胞播種後２４時間で、完全増殖培地を新鮮な飢餓培地と交換した（上述の通り）。プールしたＷＡＰ ＩＶ又は再構成ＬＹＯ ＩＶの添加によって培地が交換されてから２４時間後に、増殖が誘発された。再構成は次の通りに行われた。（出発プールしたＷＡＰと比較して４倍に濃縮された）４ｍＬの溶液から凍結乾燥されたＬＹＯ ＩＶを、０．５ｍＬの滅菌精製水中で再構成した（即ち８倍濃縮）（出発体積のプールしたＷＡＰ ＩＶと比較すると３２倍濃縮）。再構成に続いて、再構成ＬＹＯ ＩＶ又はプールしたＷＡＰ ＩＶを、適切な飢餓培地中で５倍に連続希釈し、各希釈物の１０μＬを、１００μＬの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたＷＡＰ ＩＶの開始濃度を１とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した（相対濃度）。ＬＹＯ ＩＶの開始濃度を３２とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＷＡＰ ＩＶ及びＬＹＯ ＩＶの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（上記と同じキット）によって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ ＩＶ及びＬＹＯ ＩＶで処理したウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β−２３０及び２０００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ−１００及び１７０ｐｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ−１．２５及び８．１ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ−ＡＢ−５７及び２７ｎｇ／ｍｌ、並びにトロンボスポンジン−１−６０及び３３０ｎｇ／ｍＬ。

実施例８で調製したＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＭＭ）を陽性対照として使用した。この混合物を飢餓培地中で５倍に連続希釈し、１０μＬをウェルに加えた。ＭＭの最大濃度を３０とし（ＭＭ中のＰＤＧＦ−ＡＢの濃度が３０ｎｇ／ｍＬであったので）、それに基づいて連続的な希釈を算出した。

細胞の増殖を、上で詳述されている通りに、処理の開始から４８時間後に評価した。ＷＳＴ−１で４時間インキュベートした後、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。得られた結果をＰＤＧＦ−ＡＢに正規化した（上で説明した通り）。全ての試験は３回ずつ行われた。結果を図１２に示す。

結果は、ＬＹＯ ＩＶ及びプールしたＷＡＰ ＩＶが、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに同様の影響を有したことを示す。得られた結果は、陽性対照（ＭＭ）よりも更に顕著であった。

ＬＹＯ ＩＶが３Ｔ３−スイスアルビノ細胞の形態変化に与える影響を評価するため、処理の後に位相差顕微鏡画像を撮った（細胞は、実施例１０の増殖アッセイと同様に播種され、１００μＬの飢餓培地に添加した１０μＬの再構成ＬＹＯ ＩＶ（０．５ｍＬの滅菌水中）、プールしたＷＡＰ ＩＶ、及び最大濃度のＭＭ（実施例８と同様）で処理され、処理後２日目に画像を撮った）。ウェル中のＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びトロンボスポンジン−ｌ濃度は、増殖アッセイと同様であった。代表画像を図１３に示す。

未処理の線維芽細胞は菱形の形状を有する（図１３Ａ）。３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞に対するＬＹＯ ＩＶ（Ｂ）の添加は、菱形の形状の細胞からスピンドル状の形状（運動性を有する線維芽細胞の特徴）への細胞の形態変化を促進した。これら観察された形態変化は、プールしたＷＡＰ ＩＶ（Ｃ）及び陽性対照（ＭＭ；Ｄ）で処理した後に観察された変化よりも激しかった。

上で示したように、３Ｔ３線維芽細胞のスピンドル状の形状は、運動性の潜在性の特性である。次の実験で、創傷遊走アッセイを用いることによって、ＬＹＯ ＩＶで処理した後の細胞の実際の運動性を評価した（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．インビトロスクラッチアッセイ：インビトロでの細胞遊走を分析するための便利で安価な方法。Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（２）：３２９〜３３）。３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を、１×１０^５細胞／ｍＬ（５０，０００細胞／ウェル）の濃度で、組織培養用の処理をしたＣｏｓｔａｒ社の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＡ ＵＳＡ）の中の０．５ｍＬの完全増殖培地（上述の通り）中に播いた。播種に先立ち、次の１及び２の一方でウェルをコーティングした。
１．コラーゲンコーティング−コラーゲン溶液（コラーゲンＩ、ウシ、５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ１０６４４−０１、薄コーティング手順のために製造者の手順に従って調製、１０ｍＭの酢酸中５０μｇ／ｍＬの希釈物を使用）から１２．５μｇ／ｃｍ^２。コーティングは製造者の手順に従って塗布された。
２．ＤＭＥＭ培地で１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンに希釈された、ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）のフィブリノーゲン成分から２５０μｇ／ｃｍ^２。室温で１時間インキュベートした後、溶液を吸引し、ウェルを新鮮なＤＭＥＭで洗浄した。

未コーティングのウェルを対照として使用した。細胞播種から６時間後、完全増殖培地を廃棄し、０．５ｍＬの飢餓培地でウェルを２回洗浄し、０．５ｍＬ新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた（上述の通り）。一晩飢餓状態に保った後、ｐ２００プラスチックピペットチップを使用してウェルの中央の細胞単層に創傷をつけ、剥離した細胞を飢餓培地と一緒に洗い流し、０．５ｍＬの新鮮な飢餓培地を加えた。プールしたＷＡＰ ＩＶ、再構成ＬＹＯ ＩＶ（２ｍＬの滅菌水中）、又はＰＲＰ−Ｒ（ＰＲＰ−放出物）［次の通りに調製：単一ドナーのＰＲＰ（ＭＤＡ，Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ，Ｉｓｒａｅｌによって調製され、かつそこから入手）６０ｍＬを、１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン（ＥＶＩＣＥＬ（商標））３ｍＬ及び２ＭのＣａＣｌ_２ ２ｍＬで活性化した後、３０００ｇで１０分にわたり４℃にて遠心分離し、実験で使用する上澄み２７ｍＬを得た］のいずれかを添加した後に、細胞の遊走（即ち運動性）を評価した。全処理溶液を１：１０に希釈し、ウェル（５０μＬ）に入れた。各処理を２回ずつ行った。

ＷＡＰ ＩＶ及びＬＹＯ ＩＶの両方におけるいくつかの成長因子の濃度は、次の通りである：ウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β−９２０及び８０００ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ−４００及び６８０ｐｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−５及び３２．４ｎｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＡＢ−２２８及び１０８ｎｇ／ｍＬ；並びにトロンボスポンジン−１−２４０及び１３２０ｎｇ／ｍＬ（それぞれ、ＷＡＰ ＩＶ及びＬＹＯ ＩＶに関する）。

０時点及び２４時間後に、創傷の幅を、各ウェルの異なる３か所において、位相差顕微鏡（倍率１００倍）を使用してキャプチャした（各処理毎に６枚の写真）。各写真で、創傷の幅を５回（１ウェル当たり１５回）測定し、創傷修復（wound closure）（狭くなった創傷の幅）を、同じ位置における処理の開始から２４時間後に残っている創傷の割合として算出した。

異なる処理における異なる時点での創傷の幅の代表的な位相差写真を図１４に示す。異なる処理群における処理の開始から２４時間後に残っている割合としての、創傷の修復の定量的評価を図１５に示す。結果は、６つの複製物の平均±標準偏差として示されている。

結果は、全ての表面上（コーティングされた又は未コーティングのウェル）で、ＬＹＯ ＩＶは、プールしたＷＡＰ ＩＶ及びＰＲＰ−Ｒ（インビボ設定における創傷治癒に有効であると報告されている、Ｌａｃｃｉ ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ Ａ，２０１０）と同様のやり方で、線維芽細胞運動性及び単層におけるスクラッチの修復を促進した（創傷は、対照標準処理よりも狭い）。

コラーゲンでコーティングされたウェルは、フィブリノーゲンでコーティングされたウェルと比較して、わずかに高い運動性促進効果を示した。

ＨＵＶＥＣの形態変形を誘発するＬＹＯ ＩＶの能力を評価するため、管形成アッセイを行った。これら形態変化は血管形成に関連する。この目的のため、ＨＵＶＥＣを、１×１０^５細胞／ｍＬ（１００００細胞／ウェル）の濃度で、組織培養用の処理をしたＣｏｓｔａｒ社の９６ウェルプレートの中の１００μＬの飢餓培地（２％のＦＣＳ以外は上記の通り）中に播いた。細胞外基質環境をシミュレートするため、細胞播種の前に、ウェルをＢＭＥでコーティングした（製造者の手順に従って５０μＬ／ウェル）。

播種の間、１０μＬのプールしたＷＡＰ ＩＶ又はＬＹＯ ＩＶ（２ｍＬの滅菌水中で再構成、プールしたＷＡＰ ＩＶの体積に対し８倍に濃縮）のいずれかを、指定されたウェルに加えた。ウェル中のＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びトロンボスポンジン−１の濃度は、上記遊走アッセイと同じであった。ＢＭＥコーティング上に播種した未処理のＨＵＶＥＣを基準として用いた。２４時間後、細胞を、３７℃で３０分にわたり５ｕＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色し、倍率６０倍のＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡及び５３０ｎｍの蛍光フィルタ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して代表写真を撮った。結果を図１６に示す。

図１６に見られるように、ＷＡＰ ＩＶ（Ｃ）又は未処理の細胞（Ａ）と比較して、ＬＹＯ ＩＶ（Ｂ）は最も高い管形成（tubologenic）能力を有した（ＬＹＯ ＩＶによる処理は血管様構造形成をもたらした）。

実施例１１：第２のウイルス不活性化工程としてのナノ濾過の使用を評価する。
ＷＡＰ物質のプールを、１０個体のドナーから、実施例１に詳述されている通りに調製した（２０００ｍＬ）。次に、２００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液及び１％のＨＳＡ ｖ／ｖを、プールしたＷＡＰに加えた。５０ｍＬのサンプルを取り出し、以下に詳述されている通りにＳ／Ｄで処理し、アッセイまで−８０℃で貯蔵した。分析に当たって、サンプルを室温で解凍した後、０．４５μｍのシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ ｂｙ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）を通して濾過した（あらゆる粒子状物質を除去するため）。（５０ｍＬのうち）約２５ｍＬのみが、フィルタが詰まる前に濾過されたので、残りのサンプルに関しては新しいフィルタを使用した。抽出物は、凍結・解凍によって、及びＳ／Ｄ処理を行うことによって得られた。

解凍後、Ｓ／Ｄ除去工程を、８ｍＬのＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）が詰め込まれたＨＲ １０×１０液体クロマトグラフィーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して行った。プロセスの間に用いたフローパラメータは、１ｍＬ／分、最大圧力制限１００ｋＰａ（１．０Ｂａｒ）であった。

カラムは、３２ｍＬの精製水の後、１％のＨＳＡ ｖ／ｖを含む２４ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を用いて調製した。カラムに４０ｍＬの抽出物サンプルを充填した。抽出物サンプルを充填した後、最初に、１％のＨＳＡ ｖ／ｖを含む１４ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液でカラムを洗浄した。第２の洗浄工程は、１０％のエタノール／１ＭのＮａＣｌ／０．２％のＨＳＡを含む２２ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して行われた。後者の洗浄工程は、いくつかの成長因子、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢの回収を増加させることが、我々の実験で判明した（実施例１２参照）。次に、カラムを１６ｍＬの精製水で洗浄した。収集されたフロースルーの総体積は８０ｍＬであった。初期段階における凝集物の沈殿を促進するため、実施例９に記載のように、ＣａＣｌ_２を用いた沈殿が行われた。ＣａＣｌ_２処理後の抽出物サンプルの清澄濾過は、５μｍのカプセルフィルタ（ｍｄｉ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した後、０．４５μｍのシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ ｂｙ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）を使用して行われた。

小さな凝集物を取り除くため、物質を０．２及び０．１μｍのフィルタに通過させることによって、ナノ濾過工程の前に前濾過工程を行った。全抽出物サンプル８０ｍＬを濾過するため、２つの０．２μｍ真空フィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｓｕｐｏｒ Ｍａｃｈ Ｖ ５０ｍＭ）及び４つの０．１μｍのシリンジフィルタ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｌｌｅｘ ＶＶ；カタログ番号ＳＬＶＶ０３３ＲＳ）を使用した。次に、濾過した物質をナノ濾過工程に供した。ナノ濾過システムは、次の通りに一列に組み立てられた：加圧窒素ガスタンク−圧力調整器−２５０ｋＰａ（２．５Ｂａｒ）圧力計（ＰＧ１）を有するフィルタハウジングＳＥＡＬＫＬＥＥＮ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）−バルブ−０．２μｍのフィルタ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＭｉｎｉｓａｒｔ；カタログ番号１６５３４）−０．１μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＶＶＬＰ０２５００）−１００ｋＰａ（１．０Ｂａｒ）圧力計（ＰＧ２）−ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎフィルタ（Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ；カタログ番号７５ＮＺ−００１）−１００ｋＰａ（１．０Ｂａｒ）圧力計（ＰＧ３）−ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎフィルタ（Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ；カタログ番号３５ＮＺ−００１）−１００ｋＰａ（１．０Ｂａｒ）圧力計（ＰＧ４）−ＰＬＡＮＯＶＡ ２０Ｎフィルタ（Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ；カタログ番号３５２０ＮＺ−００１）。

ナノ濾過手順は次の通りに行われた。

抽出物サンプルを充填する前に、フィルタハウジングを４０ｍＬの精製水（ＰｕＷ）で充填し、システムへの窒素ガス流を増加させて圧力を上昇させることによって、システムの性能を試験した。通常の状態で、溶液は、各ＰＬＡＮＯＶＡフィルタを通過した後にわずかな圧力低下があるだけで、システムを貫流するはずである。下の表３に示されるように、４０ｍＬのＰｕＷは、圧力が激減することなくシステムを通過した。

システムの性能を確認した後、フィルタハウジングを、１％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）（抽出物サンプル中の存在するのと同じ緩衝液）で充填した。下の表の結果は、圧力レベル及び流量が、緩衝液が全システムを貫流するのを可能にしたことを示す。しかしながら、抽出物サンプルを充填すると、システムを貫流することができなかった。下の表に示されるように、ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ（ＰＧ２）の前の圧力読み値は９０ｋＰａ（０．９Ｂａｒ）であるのに対し、ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎの後でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎフィルタ（ＰＧ３）の前はたったの２０ｋＰａ（０．２Ｂａｒ）であり、このことは、サンプルがＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎフィルタを簡単に貫流することができなかったことを示した。

結果は、上で詳述されている条件を用いてナノ濾過を第２のウイルス不活性化工程として利用するのは実行可能でないことを示している。

実施例１２：プールした洗浄アフェレーシス白血球除去血小板（ＷＡＰ）から調製され、Ｓ／Ｄで処理され、溶離条件を用いるＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィーによってＳ／Ｄ除去され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。
この実験では、凍結乾燥された血小板抽出物を次の通りに調製した。１０個のＷＡＰバッグを個別に坪量し、７０％エタノールで拭き、切り開き、２５℃に調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味ＷＡＰ重量を算出した。プールしたＷＡＰの総正味重量は１９４７ｇであった。プールした物質を、完全に解凍するまで２５℃にてゆっくり混合した（実施例９と同じ攪拌条件）。プールしたＷＡＰのオスモル濃度は２６５ｍＯｓであった。２１３ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４、となるように）及び１％ ｖ／ｖ（溶液の最終体積に対する）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ ＵＳＡ）を、プールしたＷＡＰに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、緩衝液のオスモル濃度をＷＡＰ出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｖ／ｖ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールしたサンプルにゆっくり加えることによって、前述のようにＳ／Ｄ処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理の間にサンプルを濾過した。簡潔には、Ｓ／Ｄを加えた後、サンプルを３０分にわたって連続攪拌し、続いて、２０、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に通して濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。

２９５ｍＬのＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）が詰め込まれたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理された血小板抽出物（血小板物質を１６２０ｍＬを含有）をカラムに充填した後、６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液＋１％のＨＳＡで洗浄した。次に、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のＨＳＡを含有する９００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液で溶離した。最後にカラムを６００ｍＬの精製水で洗浄した。未結合及び溶離物質を収集した。総体積３６００ｍＬをカラムから収集した。凝集物の沈殿を促進するため、前述のように、Ｓ／Ｄ除去過程の後にＣａＣｌ_２をゆっくりと抽出物に添加し（最終濃度が４０ｍＭになるように）、該抽出物を５０ＲＰＭで混合しながら、２５℃にて３０分にわたってインキュベートした。２０及び３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、生成物を濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例４と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液（上記の通り）に対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を５３０ｍＬ（出発体積の約２９％）になるまで濃縮した。

安定化のため、マンニトールを最終濃度２％ ｗ／ｗになるまで溶液に添加した。凝集物質を除去するため、サンプルを３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、得られた生成物（体積４５２ｍＬ）を無菌条件下で４ｍＬずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ Ｖ」と呼ばれる。

ＬＹＯ Ｖのウイルス精製工程は、Ｓ／Ｄ処理内に濾過サブ工程を含むＳ／Ｄ処理を含んだ。この工程の濾過は、２０、３、１．２、及び０．４５μｍのフィルタを通して行われた。ＳＤＲ工程は、非定組成溶液を使用してカラムを洗浄することを含んだ。非定組成溶液は、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液であった。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して約３．５倍に濃縮された。

ＬＹＯ ＩＩ〜ＬＹＯ Ｖの物質生産過程において、サンプルをＳＤＲクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びＳＤＲ樹脂からサンプルを収集した後（溶媒及び洗剤除去の後）の物質のＰＤＧＦ−ＡＢ含有量を測定した。異なる物質生産過程（ＬＹＯ ＩＩ〜ＬＹＯ Ｖ）におけるＰＤＧＦ−ＡＢの回収率を表４に示す。市販の特異的ＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＰＤＧＦ−ＡＢイムノアッセイ；製造者：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＤＨＤ００Ｂ、並びにＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＨＳヒトｂＦＧＦカタログ番号ＤＨＤ００Ｂ、及びＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＨＳヒトｂＦＧＦカタログ番号ＨＳＦＢ００Ｄイムノアッセイ；製造者：それぞれＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を測定した。

表４に示されるように、ＬＹＯ Ｖの処理中に、上記のようにＳ／Ｄ除去工程において非定組成溶液による溶離工程を加えることにより、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収率がより高くなる。溶離工程がある場合のＰＤＧＦ−ＡＢの回収率は４５％であり、これと比べてこの工程の不在下での回収率は１１〜１６％であり、回収率は約３倍増大した。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの濃度もまた、４ｍＬの再蒸留水（ＤＤＷ）による再構成の後、最終凍結乾燥物質で測定された。ＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は１５，０２８ｐｇ／ｍＬであり、これは出発物質として用いた血小板当たり２．２６×１０^−６ｐｇ ＰＤＧＦ−ＡＢに相当する。ｂＦＧＦの濃度は３６ｐｇ／ｍＬであり、これは出発物質として用いた血小板当たり５．４×１０^−９ｐｇ ｂＦＧＦに相当する。

実施例１３：線維芽細胞の細胞増殖にＬＹＯ Ｖが与える影響。
ＬＹＯ Ｖが細胞増殖に与える影響を、３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を使用し、実施例５に詳述されている通りに行った。

４ｍＬの溶液から凍結乾燥され、ＷＡＰの開始体積と比較して４倍に濃縮されたＬＹＯ Ｖを、０．５ｍＬの滅菌精製水中で再構成した（即ち８倍濃縮）（プールしたＷＡＰ Ｖの開始濃度と比較すると３２倍濃縮）。再構成に続いて、プールしたＷＡＰ Ｖ又は再構成ＬＹＯ Ｖを適切な飢餓培地中で５倍に連続希釈し、各希釈物の１０μＬを、１００μＬの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたＷＡＰ Ｖの開始濃度を１とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＬＹＯ Ｖの開始濃度を３２とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。標準対照として、組み換えヒトＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２２２−ＡＢ−０１０）を使用した。ＰＤＧＦ−ＡＢもまた飢餓培地中で５倍に連続希釈し、ウェル（１０μＬ）に加えた。ＷＡＰ Ｖ及びＬＹＯ Ｖの両方におけるいくつかの成長因子の濃度をＥＬＩＳＡ（上記と同じキット）によって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ Ｖ及びＬＹＯ Ｖで処理したウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β−１５９．４及び１６９．８ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ ０．１ｎｇ／ｍＬ及び０．０２９ｎｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−０．８９及び１．０５ｎｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＡＢ−５６．８６及び１２ｎｇ／ｍＬ。

処理の開始から７２時間後に、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した（添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、ＯＤ値から減算した）。インキュベーション期間（４時間）の最後に、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を３回ずつ行った。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬によって得たＯＤ結果を、算出したＰＤＧＦ−ＡＢ濃度値に対してプロットした。結果を図１７に示す。

結果は、ＬＹＯ Ｖ又はプールしたＷＡＰ Ｖの濃度の増加が、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、ＬＹＯ Ｖの影響が若干少ないことを示している。この明らかな減少は、ＬＹＯ混合物中に存在し、その回収が先の実施例と比較して有意に増加した１つの成長因子のみ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）に結果を正規化したことに起因した。特に、両方の処理（ＬＹＯ Ｖ及びＷＡＰ Ｖ）の影響は、組み換えＰＤＧＦ−ＡＢ単独による影響よりも顕著であり、このことは、他の血小板の抽出成分が線維芽細胞の増殖を相乗的に高めることを示した。

実施例１４：上記実施例で調製したＬＹＯ Ｉ〜ＬＹＯ ＩＶにおいて実施された製造工程の比較。
表５は、各ＬＹＯの調製において実施された主要な製造工程を要約している。

^＊ 溶離は、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のＨＳＡを含有する酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）を用いて行われた。

実施例１５：本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝集物含有量のレベル。
タンパク質製剤にける凝集は、生物活性を損ない得るからだけでなく、望ましくない副作用（例えば、免疫原性）の可能性を増加させるので、望ましくない。凝集はタンパク質安定性も低下させ得る。以下の実施例では、本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝集物含有量を決定した。

この目的のため、凝集レベル（濁度）を、３２０ｎｍ（ＯＤ_３２０）で光学密度を測定し（これは、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍａｃｈ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｅｄ．Ｓｈｉｒｌｅｙ Ｂ．Ａ．ｐｐ ９１〜１１４，１９９５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに記載されているように、凝集物の存在を典型的に示す）、かつ、血小板抽出物中に高濃度で存在し、バックグラウンド読み値であると考えられたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＯＤ_３２０読み値を減算することによって決定した。減算の前に、濁度（３２０ｎｍにおける原液の吸光度）をタンパク質濃度［Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ；カタログ番号２３２３５）によって決定］で割ることによって、正規化濁度（凝集）を得た。

凝集物レベルを次式に従って算出した。

タンパク質１ｍｇ当たり≦０．０３より低い、得られた算出ＯＤ_３２０レベルは、低凝集物含有量であると考えられた。

上記実施例に従って調製した異なる凍結乾燥血小板抽出物（ＬＹＯ ＩＩ−Ｖ）を、（凍結乾燥工程前と同じ体積となるように）ＤＤＷ中で再構成した。次の工程で、１ｍＬのサンプルをアクリル製キュベット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号６７．７４０）の中に移し、ＯＤを、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒｏ分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して３２０ｎｍで測定した。これと平行して、ＨＳＡのＯＤレベルを３２０ｎｍで測定し（試験抽出物と同じパラメータで）、凝集物レベルを上記式に従って算出した（異なるＨＳＡ濃度を用い、該式に示されるように読み値を溶液の総タンパク質で除した）。

試験した全ての血小板抽出物の算出されたＯＤ_３２０レベルは、タンパク質１ｍｇ当たり≦０．０３であることが判明した。したがって、本発明に従って調製した血小板抽出物は、低い凝集物レベルを有した。

実施例１６：プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製され、Ｓ／Ｄで処理され、非定組成溶液による２段階を用いてＳＤＲ溶離され、かつ低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。
この実験では、凍結乾燥血小板抽出物を次の通りに調製した。１０個のＷＡＰバッグを個別に坪量し、７０％エタノールで拭き、切り開き、２５℃に調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味ＷＡＰ重量を算出した。プールしたＷＡＰの総正味重量は１９０６ｇであった。プールした物質を、完全に解凍するまで２５℃にてゆっくり混合した（実施例９と同じ攪拌条件）。プールしたＷＡＰのオスモル濃度は２６７ｍＯｓであった。２０９ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）及び０．２％ ｖ／ｖ（溶液の最終体積に対する）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ ＵＳＡ）を、プールしたＷＡＰに添加した。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、緩衝液のオスモル濃度をＷＡＰ出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｖ／ｖ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を上述の通りに行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理の間にサンプルを濾過した。最初に、サンプルを３０分にわたって連続的に攪拌した後、２０及び３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。

２９５ｍＬのＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）が詰め込まれたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理された血小板抽出物（血小板物質を１６２０ｍＬを含有）をカラムに充填した後、６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液＋０．２％のＨＳＡで洗浄した。ヘパリンは特定の成長因子に結合することで知られている。溶離工程において成長因子を回収する際のヘパリンの効果を調査した。したがって、この実験では、溶離は、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、５ＩＵ／ｍＬのヘパリン（ヘパリンナトリウム−Ｆｒｅｓｅｎｉｕｍ ５０００ＩＵ／ｍＬ、Ｂｏｄｅｎｅ（ＰＴＹ）Ｌｔｄ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）、及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して行われた。この溶離工程の後に、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を用いる第２の溶離工程を行った。最後にカラムを３００ｍＬの精製水で洗浄した。未結合及び溶離物質を収集し、記録した。総体積３７００ｍＬをカラムから収集した。収集した材料を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例４と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液（上記の通り）に対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を４５０ｍＬの体積まで濃縮した（これは出発体積の約２５％である）。

安定化のため、マンニトールを最終濃度２％ ｗ／ｗになるまで溶液に添加した凝集物質を除去するため、サンプルを３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。得たサンプルを無菌条件下で４ｍＬずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ ＶＩ」と呼ばれる。

ＬＹＯ ＶＩのウイルス精製工程は、Ｓ／Ｄ処理内に濾過サブ工程を含むＳ／Ｄ処理を含んだ。この工程の濾過は、２０、３、及び０．４５μｍのフィルタを通して行われた。ＳＤＲ工程は、非定組成溶液を使用するいくつかの溶離工程を含み、該溶液のうちの１つは５ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含んだ。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間に、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して４倍に濃縮された。

ＬＹＯ ＩＩ〜ＬＹＯ ＩＶ及びＬＹＯ ＶＩの物質生産過程において、サンプルをＳＤＲクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びＳＤＲ樹脂からサンプルを収集した後（溶媒及び洗剤除去の後）の物質のＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を測定した。異なる過程におけるＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの回収率を表６に示す。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を、上記の市販の特異的ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

表６に示されるように、ヘパリンを含む溶離工程を加えることによって、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収率だけでなく、ｂＦＧＦの回収率も有意に向上した。ｂＦＧＦの回収率は５６％であり、それに対して非定組成溶液中にヘパリンが存在しない場合（ＬＹＯ Ｖ）では３７％であった。ＬＹＯ ＶＩにおけるｂＦＧＦの回収率と、ＬＹＯ ＩＩ〜ＩＶにおけるｂＦＧＦの回収率とを比較すると、約２倍の増加が観察された。

ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの濃度も、４ｍＬの再蒸留水（ＤＤＷ）による再構成の後、最終ＬＹＯ ＶＩで測定された。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの濃度は、それぞれ、４，５７８及び１２７ｐｇ／ｍＬであり、これは出発物質として用いた血小板当たり７×１０^−７ｐｇのＰＤＧＦ−ＡＢ及び１．９５×１０^−８ｐｇのｂＦＧＦに相当する。

実施例１７：ＬＹＯ ＶＩが線維芽細胞の細胞増殖に与える影響。
ＬＹＯ ＶＩが細胞増殖に与える影響を、３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を使用し、実施例５に詳述されている通りに行った。

４ｍＬの溶液から凍結乾燥され、ＷＡＰの開始体積と比較して４倍に濃縮されたＬＹＯ ＶＩを、０．５ｍＬの滅菌精製水中で再構成した（即ち凍結乾燥前の血小板抽出物と比べて８倍濃縮）（合計で、プールしたＷＡＰ ＶＩの出発体積と比較すると３２倍濃縮）。再構成に続いて、プールしたＷＡＰ ＶＩ又は再構成ＬＹＯ ＶＩを、適切な飢餓培地中で５倍に連続希釈し、各希釈物の１０μＬを、１００μＬの飢餓培地を含有するウェルの中に充填した。プールしたＷＡＰ ＶＩの開始濃度を２．５とし（これは凍結乾燥前の血小板抽出物２．５μＬを表す。凍結乾燥前の血小板抽出物と比較して４倍に希釈されたＷＡＰを１０μＬ使用した。）、それに基づいて連続的な希釈を算出した。

試験したＬＹＯ ＶＩの開始濃度を８０とし（これは凍結乾燥前の血小板抽出物８０μＬを表す−凍結乾燥粉末の再構成後の８倍濃縮物質１０μＬ）、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＷＡＰ ＶＩ及びＬＹＯ ＶＩの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（上記と同じキット）で測定した。増殖アッセイ中にウェルに添加された有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ ＶＩ及びＬＹＯ ＶＩで処理されたウェル中、それぞれ、ＴＧＦ−β−１８０及び２０００ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ−１２０及び１０００ｐｇ／ｍＬ；ＶＥＧＦ−１．１及び１１．７ｎｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＡＢ−８４．４及び３６．６ｎｇ／ｍＬ；並びにＥＧＦ−３．６及び２４．４ｎｇ／ｍＬ。

陽性対照としてＰＲＰ−Ｒを使用した。ＰＲＰ−Ｒは、１０個体のドナーによるプールしたＰＲＰから調製された。簡潔には、１０個のバッグの全血（４００ｍＬ／バッグ）（ＭＤＡ，Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ，Ｉｓｒａｅｌより入手）を、それぞれ室温にて８５０×ｇで１０分間遠心分離した。次に、各バッグの得られた上澄み８０ｍＬを、室温にて８５０×ｇで更に１０分間別々に遠心分離した。３０ｍＬ（各バッグから得た）のＰＲＰ上澄みを収集し、２〜８℃で一晩貯蔵した。翌日、ＰＲＰを、１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン１．５ｍＬ及び２ＭのＣａＣｌ_２ １ｍＬで室温にて１時間にわたり活性化させた後、３０００ｇにて１０分にわたり４℃で遠心分離した。最終的に１０個体のドナー全ての上澄みをプールし、回転運動によって約１０分にわたって一緒に混合した。このプールしたＰＲＰ−Ｒストック（総体積１７０ｍＬ）を、この実験の出発ＰＲＰ−Ｒ物質として使用した。ＰＲＰ−Ｒ中のＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＥＧＦの濃度は次の通りであった；１５ｎｇ／ｍＬ；２ｐｇ／ｍＬ；９０ｐｇ／ｍＬ；９ｎｇ／ｍＬ；及び８０ｐｇ／ｍＬ。調製したＰＲＰ−Ｒを適切な飢餓培地中で５倍に連続希釈し、出発ＰＲＰ−Ｒ １０μＬ及び各希釈物１０μＬを各ウェルに加えた。ＰＲＰ−Ｒの開始濃度を１０とした（これは凍結乾燥前の血小板抽出物に相当する）。

処理の開始から４８時間後に、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した（添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、ＯＤ値から減算した）。インキュベーション期間（４時間）の最後に、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を３回ずつ行った。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬によって得たＯＤ結果を、実際に細胞に添加した血小板抽出物濃度値に対してプロットした（上で説明した通り）。結果を図１８に示す。結果は、ＬＹＯ ＶＩ、プールしたＷＡＰ ＶＩ、及びＰＲＰ−Ｒの濃度の増加が、３Ｔ３−スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルを増大させ、ＬＹＯ ＶＩの影響が少なかったことを示している。

実施例１８：プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製され、Ｓ／Ｄ処理され、硫酸デキストランを使用してインキュベートされ、硫酸デキストラン使用してＳＤＲ溶離され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。
この実験では、凍結乾燥血小板抽出物を次の通りに調製した。１０個のＷＡＰバッグ個別に坪量し、７０％エタノールで拭き、切り開き、及び２５℃に調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味ＷＡＰ重量を算出した。プールしたＷＡＰの総正味重量は１９１６ｇであった。プールした物質を、完全に解凍するまで２５℃にてゆっくり混合した（実施例９と同じ攪拌条件）。プールしたＷＡＰのオスモル濃度は２７２ｍＯｓであった。２１１ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ ６．８〜７．４）及び０．２％ ｖ／ｖ（溶液の最終体積に対する）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ ＵＳＡ）をプールしたＷＡＰに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、緩衝液のオスモル濃度をＷＡＰ出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。

１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｖ／ｖ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を上述の通りに行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理を２つのパートに分割した。最初に、サンプルを３０分にわたって連続的に攪拌した後、２０及び３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。

硫酸デキストランは特定の成長因子に結合することで知られている。したがって、硫酸デキストランの添加が血小板因子の回収率に与える影響を調査した。硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｎａｄａ；カタログ番号Ｄ４９１１）を最終濃度１％（ｗ／ｗ）になるようにサンプルに添加し、５０ＲＰＭにて２０分間攪拌しながら２５℃でインキュベートした。粒子状物質を除去するため、５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ＰＰ２フィルタを使用してサンプルを濾過した。

次に、２９５ｍＬのＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）が詰め込まれたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６ ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。１％の硫酸デキストラン及び０．２％のＨＳＡを含有する９００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液でカラムを平衡化させた。Ｓ／Ｄ及び硫酸デキストランで処理した血小板抽出物１８００ｍＬ（血小板物質を１６２０ｍＬを含有）をカラムに充填した後、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のＨＳＡを有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して溶離工程を行った。その後、１％の硫酸デキストランと０．２％のＨＳＡとを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して洗浄した（先の工程で用いられた溶液と比較すると非定組成であると考えられる）。次に、カラムを３００ｍＬの精製水で洗浄した。総体積３０００ｍＬをカラムから収集した。収集した材料を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例４と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液（上記の通り）に対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を４８０ｍＬの体積まで濃縮した（これは出発体積のおよそ２７％である）。

安定化のため、マンニトールを最終濃度２％ ｗ／ｗになるまで溶液に添加した凝集物質を除去するため、サンプルを３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタ及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、得た生成物を無菌条件下で４ｍＬずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で密封した。

上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書では「ＬＹＯ ＶＩＩ」と呼ばれる。ＬＹＯ ＶＩＩのウイルス精製工程は、Ｓ／Ｄ処理内に濾過サブ工程を含むＳ／Ｄ処理を含んだ。この工程の濾過は、２０、３、及び０．４５μｍのフィルタを通して行われた。ＳＤＲ除去の前に、血小板抽出物を硫酸デキストランを使用して処理した。ＳＤＲ工程は、硫酸デキストランの存在下で非定組成溶液を使用するいくつかの溶離工程を含んだ。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して４倍に濃縮された。

ＬＹＯ ＩＩ〜ＬＹＯ ＩＶ及びＬＹＯ ＶＩＩの物質生産過程において、サンプルをＳＤＲクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びＳＤＲ樹脂からサンプルを収集した後（溶媒及び洗剤除去の後）の物質のＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を測定した。異なる物質生産過程におけるＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの回収率を表７に示す。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を、上記の市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

表７に示されるように、硫酸デキストランを使用するインキュベーション及び硫酸デキストランの存在下での溶離を加えることによって、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ双方の回収率が有意に向上した。ｂＦＧＦの回収率は８５％であり、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収率は８８％であった。

驚くべきことに、ＬＹＯ ＶＩＩにおける出発物質からのＰＤＧＦ−ＡＢの回収率は、ＬＹＯ ＶＩにおける１．５％からＬＹＯ ＶＩＩにおける５１％まで増加した。更に、ＬＹＯ ＶＩＩにおける出発物質からのＶＥＧＦの回収率は、ＬＹＯ ＶＩにおける３７％からＬＹＯ ＶＩＩにおける７３％まで増加した。

ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの濃度は、４ｍＬの再蒸留水（ＤＤＷ）による再構成の後、最終ＬＹＯ ＶＩＩ物質で測定された。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの濃度は、それぞれ、１９４，３５３及び６４ｐｇ／ｍＬであり、これは出発物質として用いた血小板当たり３．１２×１０^−５ｐｇのＰＤＧＦ−ＡＢ及び１．０３×１０^−８ｐｇのｂＦＧＦに相当する。

これらの知見は、プロセス工程に硫酸デキストランを加えることは、ＳＤＲカラムの下流の因子回収にも好ましい影響をもたらすことを示している。

実施例１９：ＬＹＯ ＶＩＩが線維芽細胞の細胞増殖に与える影響。
ＬＹＯ ＶＩＩが細胞増殖に与える影響を、３Ｔ３−スイスアルビノ細胞を使用し、実施例５に詳述されている通りに行った。

４ｍＬの溶液から凍結乾燥され、ＷＡＰの開始体積と比較して約４倍に濃縮されたＬＹＯ ＶＩＩを、０．５ｍＬの滅菌精製水中で再構成した（即ち８倍濃縮）（プールしたＷＡＰ ＶＩＩの出発体積と比較して約３２倍の総濃度）。再構成に続いて、プールしたＷＡＰ ＶＩＩ又は再構成ＬＹＯ ＶＩＩを、飢餓培地中で５倍に連続希釈し、各希釈物の１０μＬを、１００μＬの飢餓培地を含有するウェルに加えた。上で説明した通り、プールしたＷＡＰ ＶＩＩの開始濃度を２．５とし、それに基づいて連続的な希釈を算出し、ＬＹＯ ＶＩＩの開始濃度を８０とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。ＷＡＰ ＶＩＩ及びＬＹＯ ＶＩＩの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ＥＬＩＳＡ（上記と同じキット）によって測定し、増殖アッセイ中にウェルに添加された有効濃度（最高濃度）は次の通りである：ＷＡＰ ＶＩＩ及びＬＹＯ ＶＩＩ中、それぞれ、ＴＧＦ−β−２６０及び２８００ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ−１９０及び５１０ｐｇ／ｍl；ＶＥＧＦ−１．１及び２１ｎｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＡＢ−１１４及び１５５０ｎｇ／ｍＬ；ＰＤＧＦ−ＢＢ−２１及び１５０ｎｇ／ｍＬ；並びにＥＧＦ−３．１及び３３．１ｎｇ／ｍＬ。

更に、実施例１６と同様に調製されたＷＡＰ ＶＩ及びＬＹＯ ＶＩを、活性比較のためのアッセイと同じアッセイで試験した（実施例１６に記載の１０μＬの連続希釈物；血小板抽出物単位への標準化は実施例１７に記載の通りに行われた）。

処理の開始から４８時間に、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した（添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、ＯＤ値から減算した）。試薬を使用するインキュベーション期間（４時間）の最後に、プレートを１分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を３回ずつ行った。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬によって得たＯＤ結果を、凍結乾燥が 実際に細胞に添加される前に、血小板抽出物単位に対してプロットした（上で説明した通り）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＳ字用量反応分析を実施し、ＥＣ５０値をグラフで示す。結果を図１９に示す。結果は、ＬＹＯ ＶＩ（ＥＣ５０ ４．１０）と比較すると、ＬＹＯ ＶＩＩ（ＥＣ５０ １．２６）は線維芽細胞の増殖を誘発する上でより有力である一方で、それらの出発物質であるＷＡＰ ＶＩＩ及びＷＡＰ ＶＩ（ＥＣ５０は、それぞれ、０．３６及び０．３２）は、線維芽細胞の増殖レベルに同程度の影響を与えたことを明確に示している。ＬＹＯ ＶＩＩの増殖促進効果はより顕著であり、ＬＹＯ ＶＩよりも出発ＷＡＰに近かった。

実施例２０：上記実施例で調製したＬＹＯ ＩＩ〜ＶＩＩにおいて実施された製造工程の比較。
表８は、全てのＬＹＯの調製において実施された製造工程を要約している。

^＊ 溶離はエタノール及びＮａＣｌの存在下で行われた。
^＊＊ 溶離はヘパリンの存在下で行われた。
^＊＊＊ 溶離は硫酸デキストランの存在下で行われた。

実施例２１：本発明に従って調製した血小板抽出物におけるいくつかの成長因子の間の比率。
以下の実施例は、本発明に従って調製した血小板抽出物におけるいくつかの成長因子の間の比率を示し、求めた比率が生理学的比率に近いかどうかを調べる。生理学的比率は、血清中の成長因子値に従って算出された。これらの値は、上の成長因子測定で使用した特異的ＥＬＩＳＡキットの添付文書から得た。

血清は、フィブリノーゲン又は他の凝固因子を有さない血漿である。血清は、活性化された血小板によって放出された因子を含有する。

ＴＧＦ−ｂ１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＶＥＧＦのレベルを、上記市販の特異的ＥＬＩＳＡキットを使用してＬＹＯ ＶＩＩ（４ｍＬのＤＤＷ中での再構成の後）中で測定し、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦｂ１、及びＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比率を算出した。成長因子のレベル及び比率を、それぞれ下の表９及び１０に示す。

^＊ 値はｎｇ／ｍＬで示されている。
^＊＊ 上記測定で使用した特異的ＥＬＩＳＡキットの添付文書から得た、血清における検出可能な値の平均。

表１０に示されている結果は、ＬＹＯ ＶＩＩが０．５６のＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１比（血清における生理学的比率である０．５と同様）及び７４のＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦ比を含むことを示している。値は共に、上記実施例の出発物質（ＷＡＰ）における算出比率内であることが判明した。

実施例２２：本発明に従って調製した血小板抽出物の凝固活性。
以下の実験は、ＬＹＯ ＶＩ〜ＶＩＩがプロ凝固活性を有するかどうかを判定することを目的とした。血小板抽出物中の活性化された凝固因子の存在を、非活性化部分トロンボプラスチン時間測定試験（ＮＡＰＴＴ）によって評価した。この試験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ７．０．；２．６．２２：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｏｎｏｇｒａｐｈ（０１／２００８：２０６２２）；ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ（Ｆｒａｎｃｅ），Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ，２００９に記載のアッセイに基づく。

一般に、試験は、凝固カスケードの開始を可能にするために、ヒト血漿へのリン脂質（Ｒａｂｂｉｔ Ｂｒａｉｎ Ｃｅｐｈａｌｉｎ、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、カタログ番号４１０５３−２）及びカルシウムの添加を含む。ヒト標準血漿（Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号０６２５又はＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＴＣ ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、参照番号５２２０１２０）に含まれる不活性凝固因子は、活性凝固因子を含むサンプルの添加の後活性化され、血漿プロトロンビンを活性トロンビンに転換させる。その結果、血漿フィブリノーゲンは不溶性フィブリンに直ちに転換し（クロット形成）、凝固時間は凝固計（ＳＴａｒｔ４ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって測定することができる。上記参照対照サンプルにおける因子活性化プロセスは、通常４〜７分を要する。並列実験で、血小板抽出物のサンプルをヒト標準血漿中に添加し、凝固時間を上記のように測定する。得られた結果を参照対照サンプルの結果で割る。算出された比率は、試験した血小板抽出物サンプルのプロ凝固活性の尺度となる。１未満の比率は、試験したサンプルが活性化された凝固因子を含有しており、したがってプロ凝固活性を有することを意味する。

試験した血小板抽出物は、測定前に４ｍＬの精製水（ＰｕＷ）を使用して再構成された。

^＊ ３回の測定の平均値。

表１１に示される結果は、本発明に従って調製した血小板抽出物は、ＮＡＰＴＴアッセイによって評価すると、プロ凝固活性を有さないことを示している。

実施例２３：本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝固因子の存在の判定。
以下の実験は、ＬＹＯ ＶＩ〜ＶＩＩ因子が凝固因子を含むかどうかを判定することを目的とした。血小板抽出物中の凝固因子（活性又は不活性因子）の存在を、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）［カオリンセファリン凝固時間（ＫＣＣＴ）又はカオリン加部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴＫ）としても知られる］によって判定した。

ＡＰＴＴは、血漿由来のサンプルが凝固を経る可能性を評価することができる、内在性凝固経路の一般的凝固スクリーニング試験である。ＡＰＴＴは、次の凝固因子の存在を検出する：因子ＸＩＩ、ＸＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩ、Ｘ、Ｖ、ＩＩ（プロトロンビン）、及びＩ。

アッセイは、標準化された量のケファリン（即ちリン脂質）及び第ＸＩＩ因子活性化剤（カオリン）の存在下での血漿のカルシウム再沈着を含む。アッセイは、試験されるサンプルが９９９秒後に凝固を示すべきでない限度試験として設計された。

アッセイは、キット試薬Ｃ．Ｋ．ＰＲＥＳＴ（登録商標），Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、参照番号００５９７（試薬１と試薬２とを含む）を使用して、製造者の説明書に従って行われた。試験したＬＹＯは、ＡＰＴＴ試験を行う前に４ｍＬの精製水（ＰｕＷ）を使用して再構成された。

^＊ＲＳＤ−相対標準偏差

結果は、ＡＰＴＴ試験によると、本発明による血小板抽出物は、凝固因子ＸＩＩ、ＸＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩ、Ｘ、Ｖ、ＩＩ、及びＩの１つ以上を欠いており、抽出物を非凝固性にしていること示している。

実施例２４：本発明に従って調製した血小板抽出物がインビボモデルにおける血管形成レベル及び全体的治癒に与える影響。
本発明に従って調製した血小板抽出物が血管形成及び全体的治癒に与える影響を、ラットの皮下移植モデルを用いて調べた。このモデルは、移植組織における組織反応、血管形成、及び全体的治癒を評価するためによく使用される［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｔｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＯ）１０９９３−６，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ−Ｐａｒｔ ６：Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００７）］。

移植の後３日目及び７日目に２つのパラメータを評価した。

１０匹の雌ラットをこの実験で使用した。各動物は、背中の両側に沿って皮下組織の中に外科的に作られた２つの皮下ポケットを有した（合計で４つのポケット）。各ポケットに次の試験物品のうちの１つを充填した：フィブリン封止剤＋１Ｘ血小板抽出物、フィブリン封止剤＋０．１Ｘ血小板抽出物（１Ｘで使用した血小板抽出物の量の１０％）、フィブリン封止剤のみ、及び生理食塩水。

試験物品の調製及び投与。
フィブリン封止剤＋１Ｘ血小板抽出物−実施例１６と同様に（ＬＹＯ ＶＩの調製と同様に）４ｍＬの血小板抽出物溶液から調製された凍結乾燥血小板抽出物を、２ｍＬのフィブリノーゲン溶液（ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）のＢＡＣ成分と同様の溶液）を使用して再構成することによって、１Ｘ血小板抽出物を調製した。血小板抽出物−フィブリノーゲン混合物からの１００μＬを、１００μＬのトロンビン溶液（ＥＶＩＣＥＬ（商標）フィブリン封止剤（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）のトロンビン成分と同様の溶液であるが、４０ｍＭの塩化カルシウム溶液中で濃度２０ＩＵ／ｍＬに希釈、最終トロンビン濃度は１０ＩＵ／ｍＬであった）と混合した。２００μＬの血小板抽出物−フィブリノーゲン−トロンビン混合物を、上で作ったポケットのうちの１つの中に投与した。

フィブリン封止剤＋０．１Ｘ血小板抽出物−０．１Ｘ血小板抽出物を、実施例１６と同様に調製した４００μＬの血小板抽出物溶液を凍結乾燥し、２ｍＬのフィブリノーゲン溶液を使用してこの凍結乾燥物を再構成することによって調製した。ｍＬの血小板抽出物−フィブリノーゲン混合物からの１００μＬを、１００μＬの希釈トロンビン溶液と混合した（使用したフィブリノーゲン及び希釈トロンビン溶液は、上記で特定された通りである）。２００μＬの血小板抽出物−フィブリノーゲン−トロンビン混合物を第２のポケットの中に投与した。

０．１Ｘ及び１Ｘ中に実際に投与したいくつかの成長因子の量は、それぞれ次の通りであった：ＴＧＦ−ｂ１ ５．２７及び５２．７ｎｇ；ＰＤＧＦ−ＡＢ ０．１及び１．０５ｎｇ；ｂＦＧＦ ０．００２４及び０．０２４ｎｇ；並びにＶＥＧＦ ０．０２３及び０．２３ｎｇ（フィブリン封止剤２００μＬと共に投与）。

フィブリン封止剤−１００μＬのフィブリノーゲン溶液と１００μＬの希釈トロンビン溶液とを混合した（上述の通り）。最終混合部を第３のポケットの中に投与した。

生理食塩水−２００μＬの生理食塩水を第４のポケットの中に投与し、対照群として使用した。

４種の試験物質の投与は、各ポケット内に設置した位置標識［サイズ１ｍｍ×１ｍｍ×５ｍｍの蒸気殺菌した高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）］に隣接して行われた（後の評価のために投与した正確な位置を標識するため）。

５匹の動物を各時点（移植から３日後及び７日後）で人道的に屠殺し、（各時点において各動物から）４つの移植部位全てを収集し、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。各移植部位から複数の部位を切断し、これらの部位を微視的評価用に処理した。組織部位をヘマトキシリン・エオシンにより染色した。

異なる試験群の移植領域における血管形成及び全体的治癒を、以下に規定する主観的評価尺度を用いて顕微鏡的に評価した。

血管形成の評価尺度：
０＝なし；１＝不十分：限定的、局所的、又は断片的、物品の限定的浸透、１〜３の新生血管芽及び限定的な線維芽細胞支持組織；２＝可：限局的、多発的、又は拡散、物品への浸透を伴う、毛細管群が適切に線維芽細胞を支持；３＝良：物品は組織に完全に浸透、線維芽細胞支持構造を有する毛細管；及び４＝優：評価した研究間隔で期待されたよりも良好。

全体的創傷治癒の評価尺度：
０＝なし；１＝不十分：対照移植部位よりも低い、外科的処置及び移植後時間での予想よりも低い；２＝可：対照移植部位に匹敵又は同じ、外科的処置及び移植後時間での予想とほぼ同じ；３＝良：外科的処置及び移植後時間での予想よりもやや良好；及び４＝優：外科的処置及び移植後時間での予想以上。

異なる試験物品の血管形成及び治癒に関する平均採点値を下の表１３に示す。

^＊ 移植後３日後に関しては、研究間隔が非常に短かったので（「治癒」を顕微鏡によって明らかにするには時間が十分でない）、全体的治癒を適切に採点することができなかった。

両方の間隔において、様々な試験物品による処理後に有害効果は観察されなかった（移植部位における少数のマクロファージ及びリンパ球の存在によって顕微鏡で判定した場合）。

移植後３日の２つの試験されたパラメータにおいて、異なる試験物品の間に有意な差異又は傾向は観察されなかった。したがって、３日間隔は、残りの研究間隔の基準としての役割を果たした。

移植後７日では、フィブリン封止剤＋１Ｘ血小板抽出物は、他の試験物品と比較して、より多くの血管形成及びより良好な全体的治癒を伴った（表１３の平均点を参照のこと）。フィブリン封止剤＋１Ｘ血小板抽出物の７日目の血管形成の評点は、移植後３日に観察された評点よりも高かった。

フィブリン封止剤＋０．１Ｘ血小板抽出物は、フィブリン封止剤のみ及び生理食塩水の試験物品と比較すると、より多くの血管形成及びより良好な全体的治癒に向けた傾向を示した。

実施例２５：Ｓ／Ｄ除去工程における溶離工程中の異なる非定組成条件の影響。
以下の実施例では、ＨＩＣ Ｓ／Ｄ除去工程中の異なる溶離条件がＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの回収率に与える影響を調べた。

実験は、２つの異なる種類の疎水性樹脂であるＨｙｐｅｒＤ ＳＤＲ（ＰＡＬＬ）及びＣ−１８（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して行われた。双方とも石英系である。Ｃ−１８は、１８個の炭素原子を有する疎水性ポリマー部分を有し、これに対してＨｙｐｅｒＤは、シリカビーズと架橋する疎水性ポリマーを有し、かつ分子排除効果に関連する混合モード吸着を伴う［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｏｒｂｅｎｔ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ」．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｐｐｌ．１９９５ Ｆｅｂ ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。

２ｍＬの樹脂を直径１ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄカラムに詰め込んだ（小規模実験）。用いた最大流量は０．３ｍＬ／分であった。

以下の実験全てにおいて、Ｓ／Ｄで処理された血小板溶解物を次の通りに調製した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、及び１％のＨＳＡ ｖ／ｖ（溶液の最終体積に対する）を含有する洗浄白血球低減アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）１０ｍＬを３７℃で解凍した（プールしたＷＡＰ物質は、酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液の添加後に凍結された）。次の工程で、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰを溶液に加え、溶液をインキュベートし、血小板溶解及び抗ウイルス処理のために室温（２２±２℃）にて２時間にわたり（チューブ回転装置の上で）混合した。次に、あらゆる粒子状物質を除去するため、溶解物を１０μｍ及び５μｍのシリンジフィルタを通して濾過した。

別段の指示がない限り、樹脂充填カラムは、Ｓ／Ｄ処理された溶解物を充填する前に１０ｍＬの精製水で洗浄され、１０ｍＬの酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液で平衡化された（上記と同じ濃度；試験したｐＨ値）。次の工程で、９ｍＬのＳ／Ｄ処理された溶解物をカラムに充填した後、１０ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液＋ＨＳＡ（上記と同じ濃度、試験したｐＨ値）で洗浄した。この洗浄工程の後、以下に詳述されるように補充された酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液（非定組成溶液）１０ｍＬを使用する異なる溶離工程が行われた。洗浄及び溶離物質を収集し、プールした。

全実験において、サンプルをクロマトグラフィー樹脂に充填する前の溶解物、及び樹脂からサンプルを収集した後（溶媒及び洗剤除去の後）の溶解物中のＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦ含有量を測定し、異なる溶離工程における因子の回収率を算出した。両方の因子の含有量を、上記市販の特異的ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

実験の第１セットは、Ｓ／Ｄ除去中の酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液のＮａＣｌ含有量及びｐＨ値が、ＰＤＧＦ−ＡＢの回収率に与える影響を調べた。酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液を異なるＮａＣｌ濃度（０．３〜１．５Ｍ）で補充し、補充した緩衝液を非定組成溶液として用いてＳＤＲ溶離工程を行った。

結果は、Ｃ−１８樹脂を使用する場合には、０．３Ｍから最大で１Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度を用いるＨＩＣの後、溶離緩衝液のＮａＣｌ濃度とＰＤＧＦ−ＡＢの回収率との間に正の相関関係が存在することを示している。１Ｍの濃度で最適な結果が得られた（ＰＤＧＦ−ＡＢ回収率は約３０％）。試験したｐＨは回収率に影響を与えなかった。

ＳＤＲ樹脂を使用する場合には、ＮａＣｌの試験濃度（０．７及び１．５Ｍ）全てにおいて同様の回収率が得られた。また、Ｃ−１８を樹脂として使用する場合と比較して、ＳＤＲを樹脂として使用する場合に、より高いＰＤＧＦ−ＡＢ回収率が得られることが観察された（３と７のＰＤＧＦ−ＡＢ回収率を比較されたい）。

実験の別のセットは、Ｓ／Ｄ除去中の酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液へのＮａＣｌ及びエタノールの両方の添加が、ＳＤＲ又はＣ−１８カラムからのＰＤＧＦ−ＡＢの回収率に与える影響を調べた。この目的のため、酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液を異なるＮａＣｌ及びエタノール濃度で補充し、補充した緩衝液を非定組成溶液として使用して、ＳＤＲ溶離工程を行った。

結果は、ＮａＣｌに加えてエタノールを溶液に添加すると、ＮａＣｌのみを使用する場合と比較すると、より高い回収率となったことを示している（表１５の１及び２を表１４の２と比較、並びに表１５の３を表１４の４と比較されたい）。最大ＰＤＧＦ−ＡＢ回収率は、両方の樹脂タイプにおいて１ＭのＮａＣｌ及び２０％のエタノールにより得られ、ＳＤＲ樹脂はより高い回収率を有したことも観察された。

実験の前回のセットでは、両方の樹脂タイプにおいて、１ＭのＮａＣｌ及び２０％のエタノールで補充された酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液により、最大ＰＤＧＦ−ＡＢ回収率が得られたことが示された。実験の次のセットでは、同じ条件下（１ＭのＮａＣｌ及び２０％のエタノールが補充された酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液）でのＳ／Ｄ物質（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｎＢＰ）除去の有効性を評価した。注目すべきことには、血液由来の製品中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｎＢＰのそれぞれの許容限度は、５μｇ／ｍＬである。収集された分画中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の後に測定した。Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。Ｓ／Ｄ物質のレベルは、非定組成条件による溶離に供されていないＬＹＯ ＩＶと同様の方法で調製されたＳ／Ｄ処理された溶解物においても評価された（大規模調製であるが、Ｓ／Ｄ除去工程の後にこの手順は中止された）。結果を以下の表１６に示す。

^＊ 該当なし−データなし

結果は、１ＭのＮａＣｌ及び２０％のエタノール（先の実験でＰＤＧＦ−ＡＢの回収に有効であるとして決定された）を用いて溶離工程を行うことにより、比較的多量のＳ／Ｄ物質（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度は５．７又は０．６μｇ／ｍＬ）が血小板溶液中に存在することになることを示している。しかしながら、低濃度のＮａＣｌ及び／又はエタノールを用いると、共に低濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｎＢＰが、Ｓ／Ｄ物質除去工程の後の血小板溶液中で検出された。

更に、結果は、同じ実験条件下では、ＳＤＲ樹脂を使用する場合と比較して、Ｃ−１８樹脂を使用する場合に、検出されるＳ／Ｄ物質がより少ないことも示している（２と４及び３と５を比較されたい）。

次の工程では、ＳＤＲ工程中にＮａＣｌとエタノールとの組み合わせを用いて溶離工程を行うことによって、ｂ−ＦＧＦの回収率を調べた。異なるイオン強度及び異なるエタノール濃度を調べた。この実験では、ＳＤＲ樹脂を使用した。

結果は、ＰＤＧＦ−ＡＢ回収率を効果的に改善することが示された試験した非定組成条件は、ｂ−ＦＧＦの回収率にわずかな影響しか有さなかったことを示した（１と２〜５を比較されたい）。

溶離工程中のｂ−ＦＧＦの回収率を高め、かつＰＤＧＦ−ＡＢの回収率を更に高めるため、非定組成溶液へのヘパリン添加の効果を調べた。ヘパリンはいくつかの成長因子に結合することが知られているという理由から、ヘパリンを試験した。この実験では、ＳＤＲ樹脂を使用した。異なる溶離条件下でのｂ−ＦＧＦの回収率の結果を下の表１８に示す。

結果は、濃度１０及び１００ＩＵ／ｍＬのヘパリン単独では、明白な効果が低かったことを示した（表１８の１及び２と表１７の１とを比較されたい）。しかしながら、濃度範囲２〜３０ＩＵ／ｍＬのヘパリンと、濃度０．５ＭのＮａＣｌ及び濃度範囲１２．５〜１５％のエタノールとの組み合わせは、ヘパリン単独使用と比較すると、相乗的に増加したｂ−ＦＧＦの回収率をもたらした（３〜６と１〜２を比較されたい）。ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍから１Ｍに増加し、エタノール濃度が１０％に減少すると、回収率は約２２％に低下した。

結果は、試験した条件下では、溶離工程中のヘパリンの添加はＰＤＧＦ−ＡＢの回収率に影響を与えなかったことも示した（データは示されていない）。

ＳＤＲカラムからのＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂ−ＦＧＦの回収率を更に高めるため、次の実験では、溶解物は、Ｓ／Ｄ除去工程の前に硫酸デキストランを使用してインキュベートされた、及び／又は溶離工程において添加された。ヘパリンと同様に、硫酸デキストランは、様々な成長因子に結合してｂ−ＦＧＦ、及びＶＥＧＦを安定化させることができる硫酸化多糖類である［Ｋａｊｉｏ，Ｋａｗａｈａｒａ ＆ Ｋａｔｏ（１９９２）ＦＥＢＳ ｖ３０６ ｐ２４３〜６；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｖ８ ｐ１６０７〜１４］。洗浄及び溶離は、表１９に詳述されている順番で行われた。

硫酸デキストラン（０．１％又は１％）を、単独で又はＮａＣｌ及びＥｔＯＨｔｐと組み合わせて試験した。硫酸デキストランによる溶解物のインキュベーション（条件Ｉ−Ｌ）を室温にて１５分間行った。

^＊条件は、溶離１の前のＡｃ−Ｇｌｙ−ＨＳＡを使用した洗浄工程を含んだ。
^＊＊ 条件は、溶離１及び２の前の酢酸塩グリシン−ＨＳＡ緩衝液を使用した追加の溶離工程を含んだ。

「条件」はＣｏｎ．と略されており、「平衡」はＥｑ．と略されており、「酢酸塩グリシン−ＨＳＡ」はＡＧＨと略されており、「硫酸デキストラン」はＤ．Ｓ．と略されている。

表１９から分かるように、溶離溶液の順序は、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂ−ＦＧＦの回収レベルに影響を及ぼす。例えば、条件ＡとＢ又は条件ＥとＦとを比較すると、溶離の順序は逆であり、成長因子の回収率に影響を与えた。

緩衝液組成も試験した成長因子の回収率に影響を与え、条件ＫがＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂ−ＦＧＦの回収率に好都合である（それぞれ６２％及び５１％）。

〔実施の態様〕
（１） ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理を含み、かつ、
複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程と、
血小板溶解物を調製する工程と、
溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって前記Ｓ／Ｄを除去する工程であって、該ＨＩＣは、前記溶解物をＨＩＣに充填する工程及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、
第２の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、
を含む方法。
（２） 前記血小板溶解物を調製することが、前記Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に行われる、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に、凝集物低減のサブ工程が行われる、実施態様１又は２に記載の方法。
（４） 前記凝集物低減が濾過によって行われる、実施態様３に記載の方法。
（５） 前記ＨＩＣが、前記溶解物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。

（６） 前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンから成り、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、実施態様５に記載の方法。
（７） Ｓ／Ｄ除去の前に、前記溶解物を、血小板由来因子と結合することができる分子と接触させることを更に含む、実施態様１〜６のいずれかに記載の方法。
（８） 前記分子が、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様６又は７に記載の方法。
（９） 前記第２の直交するウイルス不活性化処理が熱不活化を含む、実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０） 前記血小板が濃縮された分画が、複数のドナーからプールしたアフェレーシス（aphaeresis）からの洗浄及び／又は白血球低減血小板分画である、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。

（１１） 前記抽出物を凍結乾燥することを更に含む、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２） 実施態様１〜１１のいずれかの方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物。
（１３） 生物活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来のウイルスに対して安全な血小板抽出物。
（１４） ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、及びＴＧＦｂ１を含み、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比が少なくとも０．２である、及び／又はＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比が少なくとも４５である、実施態様１３に記載の抽出物。
（１５） ＰＤＧＦ−ＡＢが濃縮された、実施態様１２〜１４のいずれかに記載の抽出物。

（１６） ｂＦＧＦが濃縮された、実施態様１２〜１５のいずれかに記載の抽出物。
（１７） 非凝固性である、実施態様１２〜１６のいずれかに記載の抽出物。
（１８） 凝集物含有量が少ない、実施態様１２〜１７のいずれかに記載の抽出物。
（１９） 前記抽出物が固形の形態である、実施態様１２〜１８のいずれかに記載の抽出物。
（２０） 送達剤と共に提供される、実施態様１２〜１９のいずれかに記載の抽出物。

（２１） 前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される、実施態様２０に記載の抽出物。
（２２） 組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び／又は炎症の治療用である、実施態様１２〜２１のいずれかに記載の抽出物。
（２３） 実施態様１２〜２１のいずれかに記載の抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、組織治癒、臓器再構築、及び／又は組織再生の方法。
（２４） 実施態様１２〜２１のいずれかに記載の抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、必要とする被験体の炎症を治療する方法。
（２５） 前記抽出物が送達剤と一緒に投与される、実施態様２３又は２４に記載の方法。

（２６） 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって生体液体混合物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法であって、
前記生体液体混合物を提供する工程と、
前記混合物をＨＩＣに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。
（２７） ＨＩＣによって生体液体調製物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法であって、
前記調製物を提供する工程と、
前記調製物をＨＩＣに充填する工程と、
非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。
（２８） 前記生体調製物が血小板由来の調製物である、実施態様２７に記載の方法。
（２９） 前記方法が、前記調製物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、実施態様２７又は２８に記載の方法。
（３０） 前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、実施態様２９に記載の方法。

（３１） 実施態様２６〜３０のいずれかに記載の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な調製物又は混合物。
（３２） 実施態様１２〜１９のいずれかに記載の抽出物を収容する容器を含むキット。
（３３） 送達剤を更に含む、実施態様３２に記載のキット。
（３４） 前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される、実施態様３２又は３３に記載のキット。

Claims (31)

1. ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理を含み、かつ、
   複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程と、
   血小板溶解物を調製する工程と、
   溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、
   疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって前記Ｓ／Ｄを除去する工程であって、該ＨＩＣは、前記溶解物をＨＩＣに充填する工程及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、
   第２の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、
   を含む方法。
2. 前記血小板溶解物を調製することが、前記Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｓ／Ｄウイルス不活性化処理中に、凝集物低減のサブ工程が行われる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記凝集物低減が濾過によって行われる、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＨＩＣが、前記溶解物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンから成り、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、請求項５に記載の方法。
7. Ｓ／Ｄ除去の前に、前記溶解物を、血小板由来因子と結合することができる分子と接触させることを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記分子が、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記第２の直交するウイルス不活性化処理が熱不活化を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記血小板が濃縮された分画が、複数のドナーからプールしたアフェレーシスからの洗浄及び／又は白血球低減血小板分画である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抽出物を凍結乾燥することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項の方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物。
13. 生物活性血小板細胞成長因子及び／又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来のウイルスに対して安全な血小板抽出物。
14. ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、及びＴＧＦｂ１を含み、ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＴＧＦ−ｂ１の比が少なくとも０．２である、及び／又はＰＤＧＦ−ＡＢ：ＶＥＧＦの比が少なくとも４５である、請求項１３に記載の抽出物。
15. ＰＤＧＦ−ＡＢが濃縮された、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抽出物。
16. ｂＦＧＦが濃縮された、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の抽出物。
17. 非凝固性である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の抽出物。
18. 凝集物含有量が少ない、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
19. 前記抽出物が固形の形態である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の抽出物。
20. 送達剤と共に提供される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抽出物。
21. 前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される、請求項２０に記載の抽出物。
22. 組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び／又は炎症の治療用である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の抽出物。
23. 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって生体液体混合物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法であって、
    前記生体液体混合物を提供する工程と、
    前記混合物をＨＩＣに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。
24. ＨＩＣによって生体液体調製物から溶媒−洗剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法であって、
    前記調製物を提供する工程と、
    前記調製物をＨＩＣに充填する工程と、
    非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。
25. 前記生体調製物が血小板由来の調製物である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記方法が、前記調製物をＨＩＣに充填する工程と、ＨＩＣを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、ＨＩＣを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. 前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び／又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な調製物又は混合物。
29. 請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抽出物を収容する容器を含むキット。
30. 送達剤を更に含む、請求項２９に記載のキット。
31. 前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び／又は合成材料で作製される、請求項２９又は３０に記載のキット。

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