CN114072159A - 用于生产血液产品的材料和方法 - Google Patents

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安波·妮可·李
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格伦·迈克尔·菲茨帕特里克
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Abstract

本文提供了用于制备血液产品的材料和方法。在一个方面中，本文提供了一种包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物，其中水性介质的蛋白质浓度小于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。

Description

用于生产血液产品的材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月3日提交的美国临时申请序列号62/843,061和于2019年11月15日提交的美国临时申请序列号62/936,122的优先权，其各自通过引用以其整体并入本文。
政府利益的声明
本发明是在美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)的生物医学高级研究与发展局(BARDA)授予的合同号HHSO100201300021的政府支持下完成的。政府享有对本发明的一定权利。
技术领域
本公开总体上涉及血液产品(诸如具有降低的HLA抗体含量的血液产品)以及生产此类血液产品的方法。
背景技术
血液是多种组分的复杂混合物。一般来说，血液可以被描述为包含四个主要部分：红细胞、白细胞、血小板和血浆。前三种是细胞或细胞样组分，而第四种(血浆)是液体组分，其包括盐、蛋白质和许多身体功能所需的其他因子的广泛且可变的混合物。血液的组分可以通过各种方法相互分离。一般而言，差速离心是目前最常用的基于大小和(在一些应用中)密度来分离血液的不同组分的方法。
灭活的血小板(也通常被称为凝血细胞(thrombocyte))是血液中参与凝血过程的小的、通常形状不规则(例如盘状或卵状)的巨核细胞衍生的组分。它们有助于保护身体避免因外伤或损伤以及正常生理活动造成的过度失血。血小板被认为是正常止血的关键所在，为防止血液从受伤的血管中逸出提供了第一道防线。血小板通常通过粘附至破裂血管的内层，在此过程中被激活，变成无定形的形状，并与存在于血浆中或由血小板本身或血液的其他组分释放的凝血系统的组分相互作用而发挥作用。已发现纯化的血小板用于治疗血小板计数低(血小板减少症)和血小板功能异常(血栓栓塞症)的受试者。浓缩的血小板通常用于控制损伤后或获得性血小板功能缺陷或不足期间的出血，例如在手术期间发生的出血和由于血小板抑制剂的存在而引起的出血。
发明内容
该文件至少部分地基于游离蛋白(例如抗体(例如，人白细胞抗原(HLA)抗体或人中性粒细胞抗原(HNA)抗体))水平降低的血液产品(例如，包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)的生产。
本文提供了一种包括血小板和水性介质的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
实施方式可以具有以下特征中的一个或多个。水性介质的蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)I类抗体浓度的30％。水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)II类抗体浓度的30％。水性介质具有的人中性粒细胞抗原(HNA)抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的30％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的10％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的10％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的10％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆蛋白质浓度的5％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的5％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的5％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的5％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆蛋白质浓度的3％。水性介质的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的3％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的3％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的3％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆蛋白质浓度的1％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的1％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的1％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的1％。蛋白质浓度可以通过在280纳米(nm)处的吸光度来确定，其中路径长度为0.5cm。在一些实施例中，在280nm处的吸光度可以小于1.7AU。在一些实施例中，在280nm处的吸光度可以小于1.66AU。在一些实施例中，在280nm处的吸光度可以小于1.6AU。在一些实施例中，血小板计数可以是至少200×103个血小板/μL。在一些实施例中，血小板计数可以是至少2250×103个血小板/μL。在一些实施例中，组合物可以具有小于0.2×106个红细胞/μL的红细胞计数。在一些实施例中，组合物可以进一步包括红细胞。在一些实施例中，红细胞计数可以小于0.2×106个红细胞/μL。根据监管机构批准的测试，组合物对于HLA I类抗体可能呈阴性。根据监管机构批准的测试，组合物对于HLA II类抗体可能呈阴性。根据监管机构批准的测试，组合物对于HNA抗体可能呈阴性。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。水性介质可以进一步包括缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂。缓冲剂可以是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。碱可以是碳酸氢钠。负载剂可以是单糖、多糖或其组合。单糖可以选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。单糖可以是海藻糖。多糖可以是聚蔗糖。盐可以是氯化钠、氯化钾或其组合。有机溶剂可以选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。组合物可以通过包括包含血小板的起始材料的切向流过滤(TFF)、包含血小板的起始材料的离心或其组合的方法来制备。与未通过包括血液产品组合物的切向流过滤、血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少50％。与未通过包括血液产品组合物的切向流过滤、血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少75％。与未通过包括血液产品组合物的切向流过滤、血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少90％。与未通过包括血液产品组合物的切向流过滤、血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少95％。起始材料可以是(a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阳性，(b)基于监管机构批准的测试，对HLA II类抗体呈阳性，(c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阳性，或(d)(a)、(b)和(c)中的一种或多种。起始材料可以具有约60至约80mg/ml的蛋白质浓度。起始材料可以包括供体血液产品。供体血液产品可以是汇集的供体血液产品。起始材料可以包括供体单采材料。TFF可以包括浓缩。TFF可以包括渗滤。渗滤可以包括具有至少两个渗滤体积(diavolume)的渗滤。TFF可以包括缓冲液交换。可以使用孔径为约0.2μm至约1μm的膜进行TFF。可以使用孔径为约0.2μm至约0.45μm的膜进行TFF。可以在约20℃至约37℃的温度下进行TFF。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处吸光度的50％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的30％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的10％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的5％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的3％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的1％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.70AU。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.66AU。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.60AU。可以进行TFF，直到血小板浓度为至少约2000×103个血小板/μL。可以进行TFF，直到血小板浓度为至少约2250×103个血小板/μL。TFF可以包括将缓冲液交换为包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的缓冲液。缓冲剂可以是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。碱可以是碳酸氢钠。负载剂可以是单糖、多糖或其组合。单糖可以选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。单糖可以是海藻糖。多糖可以是聚蔗糖。盐可以是氯化钠、氯化钾或其组合。有机溶剂可以选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。离心可以包括以1400×g至约1550×g离心。离心可以包括以1450×g至约1500×g离心。该过程可能缺乏对包含血小板的组合物的离心。组合物可以包括小于5.0％(通过散射强度)的微粒。组合物可以包括小于4.5％(通过散射强度)的微粒。组合物可以包括小于4.0％(通过散射强度)的微粒。组合物可以包括小于3.5％(通过散射强度)的微粒。血小板或血小板衍生物可以具有至少55％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少60％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少65％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少85％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少90％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约10％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约15％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约20％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以具有至少70％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少75％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少8％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少10％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少15％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少20％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少82％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少85％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少90％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有与细胞膜相关的纤维蛋白原。水性介质可以具有小于2.0mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有小于1.5mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有约0.4至约1.3mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有约0.5至约1.0mmol/L的乳酸盐浓度。血小板衍生物可以包括血栓小体。
本文还提供了一种用于制备包含血小板和水性介质的组合物的方法，所述方法包括对包含血小板的起始材料进行切向流过滤(TFF)、对包含血小板的起始材料进行离心或其组合，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
实施方式可以具有以下特征中的一个或多个。起始材料可以是(a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阳性，(b)基于监管机构批准的测试，对HLAII类抗体呈阳性，(c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阳性，或(d)(a)、(b)和(c)中的一种或多种。起始材料可以具有约60至约80mg/ml的蛋白质浓度。起始材料可以包括供体血液产品。供体血液产品可以是汇集的供体血液产品。起始材料可以包括供体单采材料。TFF可以包括浓缩。TFF可以包括渗滤。渗滤可以包括具有至少两个渗滤体积的渗滤。TFF可以包括缓冲液交换。可以使用孔径为约0.2μm至约1μm的膜进行TFF。可以使用孔径为约0.2μm至约0.45μm的膜进行TFF。可以在约20℃至约37℃的温度下进行TFF。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的50％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的30％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的10％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的5％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的3％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于起始材料在280nm处的吸光度的1％。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.70AU。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.66AU。可以使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于1.60AU。可以进行TFF，直到血小板浓度为至少约2000×103个血小板/μL。可以进行TFF，直到血小板浓度为至少约2250×103个血小板/μL。TFF可以包括将缓冲液交换为包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的缓冲液。缓冲剂可以是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。碱可以是碳酸氢钠。负载剂可以是单糖、多糖或其组合。单糖可以选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。单糖可以是海藻糖。多糖可以是聚蔗糖。盐可以是氯化钠、氯化钾或其组合。有机溶剂可以选自由乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合组成的群组。离心可以包括以1400×g至约1550×g离心。离心可以包括以1450×g至约1500×g离心。该过程可能缺乏对包含血小板的组合物的离心。与未通过包括对血液产品组合物的切向流过滤、对血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少50％。与未通过包括对血液产品组合物的切向流过滤、对血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少75％。与未通过包括对血液产品组合物的切向流过滤、对血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少90％。与未通过包括对血液产品组合物的切向流过滤、对血液产品组合物的离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以降低至少95％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)I类抗体浓度的30％。水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)II类抗体浓度的30％。水性介质具有的人中性粒细胞抗原(HNA)抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的30％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的10％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的10％。水性介质具有的人HNA抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的10％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的5％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的5％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的5％。水性介质具有的人HNA抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的5％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的3％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的3％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的3％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的3％。蛋白质浓度可以小于供体单采血浆的蛋白质浓度的1％。水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的1％。水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度可以小于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的1％。水性介质具有的人HNA抗体浓度可以小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的1％。根据监管机构批准的测试，所述组合物对HLA类抗体可能呈阴性。根据监管机构批准的测试，所述组合物对HLA II类抗体可能呈阴性。根据监管机构批准的测试，组合物中对HNA抗体可能呈阴性。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLAII类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于5％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于3％。如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比可以小于1％。根据权利要求125-199中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于5.0％(通过散射强度)的微粒。组合物可以包括小于4.5％(通过散射强度)的微粒。所述组合物可以包括小于4.0％(通过散射强度)的微粒。组合物可以包括小于3.5％(通过散射强度)的微粒。血小板或血小板衍生物可以具有至少55％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少60％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少65％的CD41阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少85％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少90％的CD42阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约10％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约15％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以保留供体单采血小板的至少约20％的乳酸脱氢酶活性。血小板或血小板衍生物可以具有至少70％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少75％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的膜联蛋白V阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少8％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少10％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少15％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少20％的CD47阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少80％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少82％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少85％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有至少90％的CD62阳性百分比。血小板或血小板衍生物可以具有与细胞膜相关的纤维蛋白原。水性介质可以具有小于2.0mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有小于1.5mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有约0.4至约1.3mmol/L的乳酸盐浓度。水性介质可以具有约0.5至约1.0mmol/L的乳酸盐浓度。血小板衍生物可以包括血栓小体。所述方法可以进一步包括病原体减少步骤。病原体减少步骤可以在TFF之前。所述方法可以进一步包括冻干包含血小板或血小板衍生物的组合物。所述方法可以进一步包括热处理包含血小板或血小板衍生物的组合物。
本文还提供了一种通过本文所述的任何方法制备的包括血小板和水性介质的组合物。
本文还提供了一种用于制备冻干的血小板的方法，包括(a)使用本文所述的任何方法来制备包含血小板和水性介质的组合物，和(b)冻干包含血小板和水性介质的组合物。
本文还提供了一种通过本文所述的任何方法制备的包含冻干的血小板的组合物。
本文还提供了一种用于制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物的方法，所述方法包括稀释包含血小板的起始材料以形成稀释的起始材料，将血小板浓缩至约2250×103个细胞/μL(±250×103)以形成浓缩的血小板组合物，以及用至少2倍渗滤体积(DV)的制剂(preparation agent)洗涤浓缩的血小板组合物以形成TFF处理的组合物。
实施方式可以包括以下特征中的一个或多个。稀释可以包括用大约等重量(±10％)的制剂进行稀释。所述方法可以进一步包括病原体减少步骤。病原体减少步骤可以在稀释起始材料之前进行。残余血浆百分比可以小于约15％的相对血浆(如由血浆蛋白含量确定的)。在洗涤后，如果经TFF处理的组合物中细胞的浓度不是约2000×103个细胞/μL(±300×103)，则所述方法可以进一步包括稀释制剂或者可以被浓缩至落入该范围内。所述方法可以进一步包括冻干经TFF处理的组合物以形成冻干的组合物。所述方法可以进一步包括在约80℃下处理冻干的组合物持续约24小时。
本文还提供了一种通过本文所述的任何方法制备的包含血小板或血小板衍生物的组合物。
本文所述的材料和方法可以提供若干优点。首先，它们可以允许采集其他以其他方式延迟的供体，并且减少对单采材料的竞争。
附图说明
图1A示出了使用侧向散射相对于前向散射来识别PBS中的I类和II类HLAFLOWPRATM珠的初始门控位置。
图1B示出了使用藻红蛋白荧光相对于前向散射来识别PBS中的I类和II类HLAFLOWPRATM珠的初始门控位置。
图2A示出了在PBS、供应商贫血小板血浆(PPP)(一式三份)和在I类HLA上门控的供体贫血小板血浆(一式三份)中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图2B示出了在PBS、供应商贫血小板血浆(PPP)(一式三份)和在II类HLA上门控的供体贫血小板血浆(一式三份)中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图2C示出了在PBS、供应商贫血小板血浆(PPP)(单一数据集)和在I类HLA上门控的供体贫血小板血浆(单一数据集)中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图2D示出了在PBS、供应商贫血小板血浆(PPP)(单一数据集)和在II类HLA上门控的供体贫血小板血浆(单一数据集)中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图3A示出了在I类HLA上门控的George King PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图3B示出了在II类HLA上门控的George King PPP中FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图4A示出了在I类HLA上门控的供体1PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图4B示出了在II类HLA上门控的供体1PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图5A示出了在I类HLA上门控的供体2PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图5B示出了在II类HLA上门控的供体2PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图6A示出了在I类HLA上门控的供体3PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图6B示出了在II类HLA上门控的供体3PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图7A示出了在I类HLA上门控的供体4PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图7B示出了在II类HLA上门控的供体4PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图8A示出了在I类HLA上门控的供体5PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图8B示出了在II类HLA上门控的供体5PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图9A示出了在I类HLA上门控的供体6PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图9B示出了在II类HLA上门控的供体6PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图10A示出了在I类HLA上门控的供体7PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图10B示出了在II类HLA上门控的供体7PPP中的FLOWPRATM珠的示例性FITC-H直方图。
图11A示出了在I类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图11B示出了在II类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图12A示出了在切向流过滤(TFF)至50％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在I类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图12B示出了在切向流过滤(TFF)至50％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在II类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图13A示出了在切向流过滤(TFF)至约8％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在I类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图13B示出了在切向流过滤(TFF)至约8％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在II类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图14A示出了在切向流过滤(TFF)至约6％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在I类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图14B示出了在切向流过滤(TFF)至约6％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在II类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图15A示出了在切向流过滤(TFF)至约1％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在I类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图15B示出了在切向流过滤(TFF)至约1％(通过280nm处的吸光度)保留的血浆蛋白后，在II类HLA上门控的FLOWPRATM珠汇集的供体PPP的示例性FITC-H直方图。
图16示出了未染色(深数据点)或用抗CD-41抗体染色(浅数据点)的血栓小体的示例性流式细胞术数据。。
图17示出了与膜联蛋白V一起孵育的有(浅数据点)和无(深数据点)钙的血栓小体的示例性直方图。
图18显示与抗CD62抗体(浅数据点)或与同种型对照(深数据点)一起孵育的血栓小体的示例性直方图。
图19示出了在含有组织因子和磷脂(实线和长划线)和对照脑磷脂(点)的PRP试剂的存在下血栓小体的凝血酶峰高度的图。
图20是未染色(黑色)或用同种型对照抗体(深灰色)或FITC标记的9F9抗体(浅灰色)染色的低血浆血栓小体的示例性直方图比较，以及显示两个重复的平均荧光强度的表。
图21是未染色(黑色)或用抗-PAC-1抗体染色(浅灰色)的低血浆血栓小体的示例性直方图比较，以及显示两个重复的平均荧光强度的表。
图22A是用各种浓度的标记的抗-CD47抗体或同种型对照处理的血栓小体(1×106个细胞)的平均荧光强度图。
图22B是未染色的(黑色)、用同种型对照抗体染色(深灰色)或用抗CD47抗体染色(浅灰色)的血栓小体的示例性直方图。
图22C是用各种浓度的标记的抗-CD47抗体或同种型对照处理的血栓小体(250,000个细胞)的平均荧光强度图。
图22D是未染色的(黑色)、用同种型对照抗体染色(深灰色)或用抗CD47抗体染色(浅灰色)的血栓小体的示例性直方图。
图23A是如通过动态光散射(DLS)测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次J)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图23B是如通过DLS测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次K)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图23C是是如通过DLS测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次L)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图24A是如通过DLS测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次D)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图24B是如通过DLS测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次E)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图24C是如通过DLS测定的不同半径的颗粒在人类现有储存的血小板(批次F)和由其衍生的血小板衍生物(冻干前)中的占据百分比的图。
图25A是病原体减少系统的示例性示意图。
图25B是反应容器的重量随时间变化的图。
图25C是反应容器中的压力随时间变化的图。
图26A是如通过DLS测定的经处理(批次N)或未经处理(批次M)以去除病原体的再水合血栓小体中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图26B是如通过DLS测定的经处理(批次K)或未经处理(批次J)以去除病原体的再水合血栓小体中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图27A是如通过DLS测定的经处理(批次N)或未经处理(批次M)以去除病原体的hIDSP中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图27B是如通过DLS测定的未经处理以去除病原体的hIDSP和衍生自其的血栓小体(批次M)中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图27C是如通过DLS法测定的经过处理以去除病原体的hIDSP和由其衍生的血栓小体(批次N)中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图28A是如通过DLS测定的经过处理(批次K)或未经处理(批次J)以去除病原体的hIDSP中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图28B是如通过DLS测定的未经处理以去除病原体的hIDSP和衍生自其的血栓小体(批次J)中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图28C是如通过DLS测定的经处理以去除病原体的hIDSP和衍生自其的血栓小体(批次K)中不同半径的颗粒的占据百分比的图。
图29A是使用光透射聚集法的血小板、血栓小体及其组合的透射率的条形图。
图29B是血小板、血栓小体及其组合在聚集后的血小板(和/或血栓小体)计数的条形图。
图29C是在光透射聚集法中血小板、血栓小体及其组合的透射率的条形图。
图30是存在和不存在GPRP的情况下凝血酶活化的血小板、血栓小体及其组合的透射率的条形图。
图31是存在和不存在RGDS的情况下PMA活化的血小板、血栓小体及其组合的聚集百分比的条形图。
图32A示出了活化的血小板的SEM(比例尺＝2μm)。
图32B示出了活化的血小板的SEM(比例尺＝1μm)。
图32C示出了再水合的人血栓小体的SEM(比例尺＝2μm)。
图32D示出了再水合的人血栓小体的SEM(比例尺＝1μm)。
图33A是在全血中在剪切下的血栓小体粘附的图。
图33B是在血浆中在剪切下血栓小体粘附的图。
图33C示出了在没有GPRP的情况下，微毛细管通道中纤维蛋白的形成。
图33D示出了在存在GPRP的情况下，在微毛细管通道中缺乏纤维蛋白的形成。
图33E是在血浆中在剪切下GPRP对血栓小体粘附的影响的图。
如本文和所附权利要求中所使用的，术语“血小板”可以包括全血小板、碎片血小板和血小板衍生物。
如此处和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个”、“一种”以及“所述(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另行规定。因此，例如，提及“血小板”包括多个这样的血小板。此外，可以使用等效术语描述的术语的使用包括这些等效术语的使用。因此，例如，术语“受试者”的使用应被理解为包括术语“患者”、“个体”和本领域中用于指示经受治疗的人的其他术语。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料均可用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文，以结合引用的出版物公开和描述方法和/或材料。本公开在一定程度上控制了其与任何并入的出版物的冲突。
具体实施方式
应当理解的是本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在进行限制。此外，在公开了值的范围的情况下，本领域技术人员将理解，所公开的范围内的所有其他特定值固有地由这些值和它们所代表的范围公开，而不需要在本文中公开每个特定值或范围。例如，1-10的公开范围包括1-9、1-5、2-10、3.1-6、1、2、3、4、5等。此外，每个公开的范围包括范围较低值最多低5％和范围较高值最多高5％。例如，4-10的公开范围包括3.8-10.5。这一概念在本文件中被术语“约”所捕获。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料均可用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文，以结合引用的出版物公开和描述方法和/或材料。本公开在一定程度上控制了其与任何并入的出版物的冲突。
如本文和所附权利要求中所使用的，术语“血小板”可以包括全血小板、碎片血小板、血小板衍生物或血栓小体。上述定义中的“血小板”可以包括，例如，全血中的血小板、血浆中的血小板、任选地补充有选择的血浆蛋白的缓冲液中的血小板、冷储存的血小板、干燥的血小板、低温冷冻保存的血小板、解冻的低温冷冻保存的血小板、再水合的干燥血小板、再水合的低温冷冻保存的血小板、冷冻保存的血小板、解冻的冷冻保存的血小板或再水合的冷冻保存的血小板。“血小板”可以是哺乳动物的“血小板”，诸如人的“血小板”，或诸如非人的哺乳动物的“血小板”。
如本文所使用的，“血栓小体”(有时也被称为Tsomes)是已经用制剂(例如，本文所述的任何制剂)处理并冷冻保存(诸如冷冻干燥)的血小板衍生物。在一些情况下，血栓小体可以由汇集的血小板制备。血栓小体在环境温度下以干燥形式可以具有2-3年的保质期，并且可以在几分钟内用无菌水再水合以用于立即输注。血栓小体的一个示例是
Figure BDA0003452031070000161
其在治疗血小板减少患者的急性出血的临床试验中。
输血相关的急性肺损伤(TRALI)是一种被认为是由输血产品中存在的抗体(例如，人类白细胞抗原(HLA)、人类中性粒细胞抗原(HNA)或粒细胞抗体)引起的病症，这些抗体可以与输血受体中的抗原发生反应。
来自被认为是高风险或其测试对于人类白细胞抗原(HLA)I类、II类和中性粒细胞特异性抗体呈阳性的供体的基于血浆的血液产品被禁止用于输血或生产人源性血小板产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)，因此从供体库中省略。
使用切向流过滤(TFF)或多道离心可以将血液产品中的抗体的量减少到例如目前FDA批准的测试方法无法检测到的限度。在一些情况下，某些血浆组分(例如，HLA抗体)的减少可以允许这一供体群体被接受用于生产血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)。在本文所述的一些实施例中，血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。
血栓小体或低温冷冻保存的血小板的生产可能受到在美国各地献血中心进行的许可单采血液采集可用性的限制。这些产品的竞争可能非常激烈，并且血液产品制造需求的分配的优先性通常低于患者护理需求。血液产品的制造(例如，扩大规模)可以通过来自以其他方式推迟的供体的单采血液收集来帮助。可以实现这一点的一种方法是通过利用切向流过滤(TFF)或离心和血浆去除来降低供体血浆中的游离抗体水平，以满足当前FDA批准的测试阈值。虽然通常比TFF更耗时，但原材料(例如，供体血浆)的离心对原材料具有类似的影响。在一些情况下，去除供体血浆并用缓冲液替代可以允许发明人制造和表征具有降低的蛋白质(例如抗体(例如，HLA抗体或HNA抗体))含量(例如，如通过在280nm处的吸光度测量的)的最终产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)。这种产品可以通过减少TRALI的输血相关原因来提高产品对接受者的安全性。
在一些实施例中，本文提供的材料和方法可以允许先前推迟的供体(诸如那些筛查出对HLA抗体阳性或其供体史存在阳性HLA风险的供体)进入用于制造血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)的原材料的供体池中。在本文所述的一些实施例中，血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。此外，来自原材料(例如，供体单采材料(例如，血小板或汇集的血小板))的HLA抗体的减少可以允许将最终产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)标记为HLA减少，这提高了产品对接受者的安全性。
在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以没有可检测水平的HLA抗体。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以没有可检测水平的选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以没有可检测水平的HLAI类抗体。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以没有可检测水平的HLA II类抗体。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以没有可检测水平的HNA抗体。在一些实施例中，抗体的检测可以使用监管机构批准的(例如，FDA批准的)测定进行。监管机构批准的测定可以是任何适当的监管机构批准的测定。在一些实施例中，监管机构批准的测试可以是One Lambda的LABSCREENTMMixed。在一些实施方式中，可以使用
Figure BDA0003452031070000181
100/200或
Figure BDA0003452031070000182
XY和HLA FUSIONTM软件进行监管机构批准的测试。在本文所述的一些实施例中，血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。
在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓形成体)的组合物)可以具有低于参考水平的的抗体水平，所述抗体选自由HLAI类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以具有低于参考水平的HLA I类抗体水平。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以具有低于参考水平的HLA II类抗体水平。在一些实施例中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以具有低于参考水平的HNA抗体水平。参考水平可以是任何合适的参考水平。在本文所述的一些实施例中，血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。
在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓形成体)的组合物)测试对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以测试对HLA类抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以测试对HLA II类抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，如本文提供的血液产品(例如，包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物)可以测试对HNA抗体呈阴性。在本文所述的一些实施例中，血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。监管机构批准的测定可以是任何适当的监管机构批准的测定。在一些实施例中，监管机构批准的测试可以是One Lambda的LABSCREENTMMixed。在一些实施方式中，可以使用
Figure BDA0003452031070000183
100/200或
Figure BDA0003452031070000184
XY和HLA FUSIONTM软件进行监管机构批准的测试。
本文提供了包含血小板和/或血小板衍生物(例如，血栓小体)和水性介质的组合物。在一些实施例中，水性介质可以包括制剂(例如，本文所述的任何制剂)。在一些实施例中，如本文提供的水性介质可以具有低于参考水平的抗体水平，所述抗体选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组。在一些实施例中，如本文提供的水性介质可以具有低于参考水平的HLA I类抗体水平。在一些实施例中，如本文提供的水性介质可以具有低于参考水平的HLA II类抗体水平。在一些实施例中，如本文提供的水性介质可以具有低于参考水平的HNA抗体水平。参考水平可以是任何合适的参考水平。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如FDA批准的测定)中，如本文提供的水性介质可以测试对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如FDA批准的测定)中，如本文提供的水性介质可以测试对HLA I类抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测试(例如FDA批准的测定)中，如本文提供的水性介质可以测试对HLA II类抗体呈阴性。在一些实施例中，在监管机构批准的测定(例如FDA批准的测定)中，如本文提供的水性介质可以测试对HNA抗体呈阴性。监管机构批准的测定可以是任何适当的监管机构批准的测定。在一些实施例中，监管机构批准的测试可以是OneLambda的LABSCREENTMMixed。在一些实施方式中，可以使用
Figure BDA0003452031070000191
100/200或
Figure BDA0003452031070000192
XY和HLA FUSIONTM软件进行监管机构批准的测试。
在一些实施例中，与供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)相比，水性介质可以具有减少量的残余血浆，其可以是残余血浆的百分比(例如，小于或等于约50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的残余血浆)。在一些实施例中，与供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)相比，水性介质可以具有减少量的残余血浆，其可以是残余血浆的百分比范围(例如，约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约15％、约5％至约10％、约10％至约20％、约7％至约15％、约7％至约10％、约8％至约15％、约8％至约10％、约0.1％至约5％、约0.1％至约3％、约0.1％至约1％、约0.5％至约3％、约0.5％至约1％或约1％至约3％的残余血浆)。在一些实施例中，水性介质可以具有小于或等于供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的蛋白质浓度的约50％(例如，小于或等于约40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的蛋白质浓度。在一些实施例中，水性介质可以具有供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的蛋白质浓度的约5％至约50％(例如，约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约15％、约5％至约10％、约10％至约20％、约7％至约15％、约7％至约10％、约8％至约15％或约8％至约10％)的蛋白质浓度。在一些实施例中，水性介质可以具有供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的蛋白质浓度的约0.1％至约5％(例如，约0.1％至约3％、约0.1％至约1％、约0.5％至约3％、约0.5％至约1％、约1％至约2％或约1％至约3％)的蛋白质浓度。蛋白质浓度可以通过任何合适的方法进行测量。在一些实施例中，可以通过在280nm处的吸光度(A280)来测量蛋白质浓度。在一些实施例中，水性介质可以具有小于1.70AU(例如，小于1.66、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1AU)的A280，其中路径长度为0.5cm。
在一些实施例中，水性介质可以具有小于供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的HLA I类抗体浓度的约70％(例如，小于约60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的HLA I类抗体浓度。HLA I类抗体浓度可以通过任何合适的方法进行测量。
在一些实施例中，水性介质可以具有小于供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的HLA II类抗体浓度的约50％(例如，小于约40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的HLA II类抗体浓度。HLA II类抗体浓度可以通过任何合适的方法进行测量。
在一些实施例中，水性介质可以具有小于供体单采血浆(例如，单供体单采血浆或汇集的供体单采血浆)的HNA抗体浓度的约50％(例如，小于约40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的HNA抗体浓度。HNA抗体浓度可以通过任何合适的方法进行测量。
在一些实施例中，如本文所述的组合物可以具有至少106(例如，至少5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109或1010)的血小板计数。在一些实施例中，如本文所述的组合物可以具有至少约200×103个血小板/μL(例如，至少约300×103、400×103、500×103、750×103、1000×103、1500×103、2000×103或2500×103个血小板/μL)的血小板计数。在一些实施例中，如本文所述的组合物可以具有至少约2000×103个血小板/μL(例如，至少约2050×103、2100×103、2150×103、2200×103、2250×103、2300×103、2350×103、2400×103、2450×103或2500×103个血小板/μL)的血小板计数。在一些实施例中，如本文所述的组合物可以具有小于或等于1000×104个血小板/μL的血小板计数。
在一些实施例中，如本文提供的组合物可以包括红细胞。在一些实施例中，如本文提供的组合物可以具有小于约1010(例如，小于5×109、109、5×108、108、5×107、107、5×106或106)的红细胞计数。在一些实施例中，红细胞计数可以小于0.2×106/μL(例如，小于0.1×106/μL、0.5×105/μL或0.1×105/μL)。
在一些情况下，流式细胞术可以用于评估如本文提供的组合物。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对包含血小板和水性介质的组合物测定的，选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对包含血小板和水性介质的组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对包含血小板和水性介质的组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对包含血小板和水性介质的组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。
在一些实施例中，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠对水性介质测定的，选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对水性介质测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对水性介质测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对水性介质测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于10％(例如，小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。
在一些实施例中，本文提供的组合物可以包括一种或多种另外的组分。在一些实施例中，本文提供的组合物可以包括制剂(例如，本文所述的任何制剂)。在一些实施例中，组合物可以包括缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂。缓冲剂可以是任何合适的缓冲剂。在一些实施例中，缓冲剂可以是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。碱基可以是任何合适的碱基。在一些实施例中，碱可以是碳酸氢钠。负载剂可以是任何合适的负载剂。在一些实施例中，负载剂可以是单糖、多糖或其组合。在一些实施例中，负载剂可以选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。在一些实施例中，负载剂可以是海藻糖。在一些实施例中，多糖可以是聚蔗糖。盐可以是任何合适的盐。在一些实施例中，盐可以是氯化钠、氯化钾或其组合。有机溶剂可以是任何合适的有机溶剂。在一些实施例中，有机溶剂可以选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。
制剂可以包括任何合适的组分。在一些实施例中，制剂可以包含液体介质。在一些实施例中，制剂可以包含一种或多种盐，所述盐选自磷酸盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和可以在血液或血液产品中发现的或已知可用于干燥血小板的任何其他盐，或这些中的两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，制剂包含一种或多种盐，诸如磷酸盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和可以在血液或血液产品中发现的任何其他盐。示例性的盐包括氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)及其组合。在一些实施例中，制剂包括约0.5mM至约100mM的一种或多种盐。在一些实施例中，制剂包括约0.5mM至约100mM(例如，约0.5mM至约2mM、约2mM至约90mM、约2mM至约6mM、约50mM至约100mM、约60mM至约90mM、约70mM至约85mM)的一种或多种盐。在一些实施例中，制剂包括约5mM、约75mM或约80mM的一种或多种盐。在一些实施例中，制剂包含浓度为约0.5mM至约2mM的一种或多种盐，所述盐选自钙盐、镁盐和两者的组合。
优选地，这些盐以与在全血中发现的量大致相同的量存在于包含血小板或血小板衍生物(例如，冻干的血小板)的组合物中。
在一些实施例中，制剂进一步包含载体蛋白。在一些实施例中，载体蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。在一些实施例中，载体蛋白以约0.05％至约1.0％(w/v)的量存在。
制剂可以是对血小板无毒的任何缓冲液，并且在本文提供的方法期间在溶液所暴露的温度下为溶液提供足够的缓冲能力。因此，缓冲液可以包括任何市售的已知生物相容性缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、碳酸氢盐/碳酸，诸如碳酸氢钠缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)和基于tris的缓冲液，诸如tris缓冲盐水(TBS)。同样，它可以包括下列缓冲液中的一种或多种：丙烷-1,2,3-三羧酸(丙三羧酸)；苯五羧酸；马来酸；2,2-二甲基琥珀酸；EDTA；3,3-二甲基戊二酸；双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)-甲烷(BIS-TRIS)；苯六羧酸(苯六甲酸)；N-(2-乙酰胺基)亚氨基-二乙酸(ADA)；丁烷-1,2,3,4-四羧酸；焦磷酸；1,1-环戊烷二乙酸(3,3-四亚甲基-戊二酸)；哌嗪-1,4-双-(2-乙磺酸)(PIPES)；N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)；1,1-环己烷二乙酸；3,6-内亚甲基-1,2,3,6-四氢邻苯二甲酸(EMTA；ENDCA)；咪唑；2-(氨乙基)三甲基氯化铵(CHOLAMINE)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；2-甲基丙烷-1,2,3-三羧酸(β-甲基丙三羧酸)；2-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)；磷酸；和N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)。在一些实施例中，制剂包括一种或多种缓冲液，例如N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)或碳酸氢钠(NaHCO3)。在一些实施例中，制剂包括约5至约100mM的一种或多种缓冲液。在一些实施例中，制剂包括约5至约50mM(例如，约5mM至约40mM、约8mM至约30mM、约10mM至约25mM)的一种或多种缓冲剂。在一些实施例中，制剂包括约10mM、约20mM、约25mM或约30mM的一种或多种缓冲液。
在一些实施例中，制剂包括一种或多种糖，诸如单糖和二糖，包括蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、右旋糖和木糖。在一些实施例中，糖是单糖。在一些实施例中，糖是二糖。在一些实施例中，糖是单糖、二糖或其组合。在一些实施例中，糖是非还原二糖。在一些实施例中，糖是蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖(例如，右旋糖)、甘露糖或木糖。在一些实施例中，糖包括海藻糖。在一些实施例中，制剂包括淀粉。在一些实施例中，制剂包括聚蔗糖、蔗糖和表氯醇的聚合物。在一些实施例中，制剂包括约10mM至约1,000mM的一种或多种糖。在一些实施例中，制剂包括约50至约500mM的一种或多种糖。在一些实施例中，一种或多种糖以10mM10至500mM的量存在。在一些实施例中，一种或多种糖以50mM至200mM的量存在。在一些实施例中，一种或多种糖以100mM至150mM的量存在。在一些实施例中，一种或多种糖是冻干剂；例如，在一些实施例中，冻干剂包含海藻糖、多糖或其组合。
在一些实施例中，包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物可以包含水或盐水溶液中的一种或多种。在一些实施例中，包含血小板或血小板衍生物(例如，冻干的血小板)的组合物可以包含DMSO。
在一些实施例中，制剂包括有机溶剂，诸如醇(例如乙醇)。在这种制剂中，溶剂的量可以在0.1％至5.0％(v/v)的范围内。在一些实施例中，有机溶剂可以在约0.1％(v/v)至约5.0％(v/v)，诸如约0.3％(v/v)至约3.0％(v/v)或约0.5％(v/v)至约2％(v/v)的范围内。
在一些实施例中，合适的有机溶剂包括但不限于醇、酯、酮、醚、卤化溶剂、烃、腈、二醇、烷基硝酸盐、水或其混合物。在一些实施例中，合适的有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、四氢呋喃、异丙醚(IPE)、叔丁基甲基醚、二噁烷(例如1,4-二噁烷)、乙腈、丙腈、二氯甲烷、氯仿、甲苯、苯甲醚、环己烷、己烷、庚烷、乙二醇、硝基甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺及其组合。在一些实施例中，有机溶剂选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)或其组合。在一些实施例中，有机溶剂包括乙醇、DMSO或其组合。有机溶剂(诸如乙醇)的存在可以有益于血小板、血小板衍生物或血栓小体(例如，冻干的血小板衍生物)的加工。
在一些实施例中，制剂不包括有机溶剂。在一些实施例中，制剂包含有机溶剂。在一些实施例中，制剂包含DMSO。
制剂可以具有任何合适的pH。例如，在一些实施例中，制剂可以具有约6.0至约7.4(例如，约6.5至约6.9或约6.6至约6.8)的pH。
在一些实施例中，一种或多种其他组分可以与血小板结合(例如，作为制剂的一部分)。示例性的组分可以包括前列腺素E1或前列环素和/或EDTA/EGTA，以防止血小板聚集和活化。
在一些实施例中，制剂可以是缓冲液A，如实例1中所示。在一些实施例中，制剂可以包含缓冲液A，如实例1中所示，其中一种或多种组分(例如，乙醇)以高达实例1所示量三倍的量存在。可以使用的制剂组合物的非限制性示例在表P1-P6中示出。
表P1
Figure BDA0003452031070000251
表P1.可以使用的制剂
表P2.
Figure BDA0003452031070000252
表P2.可以使用的制剂
表P3
Figure BDA0003452031070000253
Figure BDA0003452031070000261
表P3.可以使用的制剂
表P4
Figure BDA0003452031070000262
表P4.当孵育血小板时可以使用缓冲液B，例如用于流式细胞术。这种孵育可以在室温下在黑暗中进行。白蛋白是缓冲液B的任选组分。
表P5
Figure BDA0003452031070000263
Figure BDA0003452031070000271
表P5示出了缓冲液B中HEPES和盐的浓度。可以使用NaOH将pH调节至7.4。白蛋白是缓冲液B的任选组分。
表P6.
Figure BDA0003452031070000272
表P6是另一种示例性的制剂。
在一些实施例中，将包含血小板或血小板衍生物的组合物再水合包括向血小板中加入水性液体。在一些实施例中，水性液体是水。在一些实施例中，水性液体是水溶液(例如，缓冲液)。在一些实施例中，水性液体是盐水溶液。在一些实施例中，水性液体是悬浮液。
在一些实施例中，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)具有小于约10％，诸如小于约8％，诸如小于约6％，诸如小于约4％，诸如小于约2％，诸如小于约0.5％的血小板膜通过膜上存在的蛋白质和/或脂质的交联。在一些实施例中，再水合的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)具有少于约10％，诸如少于约8％，诸如少于约6％，诸如少于约4％，诸如少于约2％，诸如少于约0.5％的血小板膜通过存在于膜上的蛋白质和/或脂质的交联。
在一些实施例中，血小板或汇集的血小板可以在TFF之前被酸化至约6.0至约7.4的pH，或用制剂稀释。在一些实施例中，所述方法包括将血小板酸化至约6.5至约6.9的pH。在一些实施例中，所述方法包括将血小板酸化至约6.6至约6.8的pH。在一些实施例中，酸化包括向汇集的血小板中加入包含酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)的溶液。
在一些实施例中，在TFF之前分离血小板或用制剂稀释血小板。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过使用离心来分离血小板。在一些实施例中，离心在约1000×g至约2000×g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施例中，离心在约1300×g至约1800×g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施例中，离心在约1500×g的相对离心力(RCF)下进行。在一些实施例中，离心进行约1分钟至约60分钟。在一些实施例中，离心进行约10分钟至约30分钟。在一些实施例中，离心进行约30分钟。
在一些实施例中，在治疗受试者之前，例如在液体介质中分离血小板。
在一些实施例中，血小板是供体来源的血小板。在一些实施例中，血小板通过包括单采步骤的方法获得。在一些实施例中，血小板是汇集的血小板。
在一些实施例中，从多个供体汇集血小板。此类从多个供体汇集的血小板在本文中也可以被称为汇集的血小板。在一些实施例中，供体多于5个，诸如多于10个，诸如多于20个，诸如多于50个，诸如至多约100个供体。在一些实施例中，供体为约5至约100个，诸如约10至约50个，诸如约20至约40个，诸如约25至约35个。汇集的血小板可以用于制备本文所述的任何组合物。
在一些实施例中，血小板是体外衍生的。在一些实施例中，血小板是在培养物中衍生或制备的。在一些实施例中，制备血小板包括从巨核细胞的培养物衍生或生长血小板。在一些实施例中，制备血小板包括从人多能干细胞(PSC)的培养物衍生或生长血小板(或巨核细胞)，所述人多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和/或诱导的多能干细胞(iPSC)。
因此，在一些实施例中，在如本文所述治疗受试者之前制备血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)。在一些实施例中，将血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)冻干。在一些实施例中，将血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)低温冷冻保存。例如，在一些实施例中，血小板或血小板衍生物可以在血浆和DMSO(例如，3-9％的DMSO(例如，6％的DMSO))中低温冷冻保存。在一些实施例中，血小板或血小板衍生物如在2020年2月13日公布的美国专利申请公开第2020/0046771A1号(其通过引用整体并入本文)中所述被低温冷冻保存。
在一些实施例中，血小板(例如，单采血小板、从全血分离的血小板、汇集的血小板或其组合)在制剂中形成悬浮液，所述制剂包含浓度为10,000个血小板/μL至10,000,000个血小板/μL，诸如50,000个血小板/μL至2,000,000个血小板/μL，诸如100,000个血小板/μL至500,000个血小板/μL，诸如150,000个血小板/μL至300,000个血小板/μL，诸如200,000个血小板/μL的液体介质。
在一些实施例中，所述方法进一步包括干燥血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)。在一些实施例中，干燥步骤包括冻干血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)。在一些实施例中，干燥步骤包括冷冻干燥血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)。在一些实施例中，所述方法进一步包括将从干燥步骤获得的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)再水合。
在一些实施例中，在用于疗法或功能测定之前，将血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)冷藏、低温冷冻保存或冻干(例如，以产生血栓小体)。
根据本公开，可以使用任何已知的用于干燥血小板的技术，只要该技术可以实现小于5％的最终残余水分含量。优选地，该技术实现小于2％(例如1％、0.5％或0.1％)的最终残余水分含量。合适技术的非限制性示例是冷冻干燥(冻干)和喷雾干燥。合适的冻干方法在表LA中呈现。另外的示例性冻干方法可以在美国专利第7,811,558号、美国专利第8,486,617号和美国专利第8,097,403号中找到。一种示例性的喷雾干燥方法包括：将作为干燥气体的氮气与根据本公开的制剂组合，然后将混合物引入到具有双流体喷嘴构造的来自GEA加工工程公司(GEA Processing Engineering,Inc.)(美国马里兰州哥伦比亚)的GEA移动式小型喷雾干燥器中，在150℃至190℃范围内的入口温度，在65℃至100℃范围内的出口温度，在0.5至2.0巴的范围内的原子速率，在5至13kg/小时的范围内的原子速率，在60至100kg/小时的范围内的氮用量，以及10至35分钟的运行时间下喷雾干燥混合物。喷雾干燥中的最后一步是优先收集干燥的混合物。在一些实施例中，干燥的组合物在-20℃或更低至90℃或更高的温度下稳定持续至少六个月。
表LA：示例性的冻干方案
Figure BDA0003452031070000291
Figure BDA0003452031070000301
在一些实施例中，干燥如本文所公开获得的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的步骤，诸如冷冻干燥如本文所公开获得的血小板和/或血小板衍生物的步骤，包括将血小板和/或血小板衍生物与冻干剂(例如，非还原二糖)一起孵育。因此，在一些实施例中，用于制备血小板和/或血小板衍生物的方法进一步包括将血小板与冻干剂一起孵育。在一些实施例中，冻干剂是糖。在一些实施例中，糖是二糖，诸如非还原性二糖。
在一些实施例中，将血小板和/或血小板衍生物与冻干剂在合适的温度下一起孵育足够长的时间，以使血小板与冻干剂一起孵育。合适的冻干剂的非限制性示例是糖，诸如单糖和二糖，包括蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖(例如，右旋糖)、甘露糖和木糖。在一些实施例中，冻干剂的非限制性示例包括血清白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、淀粉和羟乙基淀粉(HES)。在一些实施例中，示例性的冻干剂可以包括高分子量聚合物。“高分子量”是指平均分子量为约或高于70kDa且最高达1,000,000kDa的聚合物。非限制性的示例是蔗糖和表氯醇的聚合物(例如，聚蔗糖)。在一些实施例中，冻干剂是聚蔗糖。尽管可以使用任何量的高分子量聚合物作为冻干剂，但优选的是使用达到约3％至10％(w/v)(诸如3％至7％，例如6％)的最终浓度的量。
用于本文公开的组合物的示例性的糖是海藻糖。无论糖的特性如何，它都可以以任何合适的量存在于组合物中。例如，它可以以1mM至1mM的量存在。在实施例中，它以10mM10至500mM的量存在。在一些实施例中，它以20mM至200mM的量存在。在实施例中，它以40mM至100mM的量存在。在各种实施例中，糖以在上述范围内的不同特定浓度存在，并且本领域技术人员可以立即理解各种浓度，而不需要在本文具体列举每一种。在组合物中存在多于一种糖的情况下，每种糖可以以根据上述范围和特定浓度的量存在。
在一些情况下，血栓小体的制备进一步包括在美国专利第8,486,617号(诸如，例如实例1-5)和第8,097,403号(诸如，例如实例1-3)(它们通过引用以其整体并入本文)中描述的程序中的一种或多种。在一些情况下，起始材料(例如，一个或多个供体血小板单位)最初被汇集到共同的血管中。在一些实施例中，起始材料可以包含一个或多个供体血小板单元。在一些实施例中，起始材料可以包括供体血浆。在离心前，起始材料可以使用或可以不使用抗凝血缓冲液(即ACD-A)酸化。在离心后，血浆可以从血小板沉淀中吸出。在将细胞重新悬浮到悬浮液中之前，可以将含有冷冻保护剂的细胞相容性缓冲液(例如，负载缓冲液，其可以类似于或相同于制剂)添加到血小板沉淀中。如果需要，可以使用或可以不使用缓冲液将血小板稀释至预定浓度(例如，2200k/ul至2800k/ul)。缓冲液中的血小板可以在18℃至37℃的孵育温度下孵育0分钟至240分钟。可以向缓冲液中的血小板中添加冻干保护剂膨胀剂(例如，聚蔗糖)，以达到1％w/v至10％w/v(优选6％w/v)的最终膨胀剂浓度。然后，可以将离心的处理后的血小板装入小瓶中，冻干并热处理。
在一些实施例中，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)具有至少约0.5μm(例如，至少约0.6μm、至少约0.7μm、至少约0.8μm、至少约0.9μm、至少约1.0μm、至少约1.2μm、至少约1.5μm、至少约2.0μm、至少约2.5μm或至少约5.0μm)的粒径(例如，直径、最大尺寸)。在一些实施例中，粒径小于约5.0μm(例如，小于约2.5μm、小于约2.0μm、小于约1.5μm、小于约1.0μm、小于约0.9μm、小于约0.8μm、小于约0.7μm、小于约0.6μm、小于约0.5μm、小于约0.4μm或小于约0.3μm)。在一些实施例中，粒径为约0.5μm至约5.0μm(例如，约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.6μm至约2.0μm、约0.7μm至约1.0μm、约0.5μm至约0.9μm或约0.6μm至约0.8μm)。
在一些实施例中，至少50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)具有在约0.5μm至约5.0μm(例如，约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.6μm至约2.0μm、约0.7μm至约1.0μm、约0.5μm至约0.9μm或约0.6μm至约0.8μm)的范围内的粒径。在一些实施例中，至多99％(例如，至多约95％、至多约80％、至多约75％、至多约70％、至多约65％、至多约60％、至多约55％或至多约50％)的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)在约0.5μm至约5.0μm(例如，约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.6μm至约2.0μm、约0.7μm至约1.0μm、约0.5μm至约0.9μm或约0.6μm至约0.8μm)的范围内。在一些实施例中，约50％至约99％(例如，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约85％、约70％至约80％)的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)在约0.5μm至约5.0μm(例如，约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.6μm至约2.0μm、约0.7μm至约1.0μm、约0.5μm至约0.9μm或约0.6μm至约0.8μm)的范围内。
在一些情况下，微粒可以是粒径(例如，直径、最大尺寸)小于约0.5μm(小于约0.45μm或0.4μm)的颗粒在一些情况下，微粒可以是粒径为约0.01μm至约0.5μm(例如，约0.02μm至约0.5μm)的颗粒。
包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物，诸如根据本文所述方法制备的那些，的微粒含量对组合物中半径为约1nm至约60,000nm的所有颗粒的总散射强度的贡献可以小于约5.0％(例如，小于约4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％或0.5％)。如本文所使用的，“通过散射强度”的微粒的含量是指基于组合物中半径为约1nm至约60,000nm的所有颗粒的散射强度的微粒含量。微粒含量可以通过任何合适的方法来测量，例如通过动态光散射(DLS)来测量。在一些情况下，用于DLS的样品的粘度可以为约1.060cP(或可以被调整为1.060cP)，因为这是血浆的近似粘度。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有细胞表面标记物。细胞表面标记物的存在可以使用任何合适的方法来确定。在一些实施例中，细胞表面标记物的存在可以使用对一种或多种细胞表面标记物特异的结合蛋白(例如，抗体)和流式细胞术(例如，作为阳性百分比，例如，使用约2.7×105个血栓小体/μL；和约4.8μL的抗CD41抗体、约3.3μL的抗CD42抗体、约1.3μL的膜联蛋白V或约2.4μL的抗CD62抗体)来确定。细胞表面标记物的非限制性示例包括CD41(也被称为糖蛋白IIb或GPIIb，其可以使用例如抗-CD41抗体来测定)、CD42(其可以使用例如抗-CD42抗体来测定)、CD62(也被称为CD62P或P-选择素，其可以使用例如抗-CD62抗体来测定)、磷脂酰丝氨酸(其可以使用例如膜联蛋白V(AV)来测定)和CD47(其用于自我识别；缺少这种标记物在一些情况下可能导致吞噬作用)。任何细胞表面标记物的阳性百分比可以是任何适当的阳性百分比。例如，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)，诸如通过本文所述的方法制备的那些，可以具有至少55％(例如，至少60％、至少65％、至少67％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)的平均CD41阳性百分比。作为另一个示例，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)，诸如本文所述的那些，可以具有至少65％(例如，至少67％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)的平均CD42阳性百分比。作为另一个示例，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)，例如通过本文所述的方法制备的那些，可以具有至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％或至少95％)的平均CD62阳性百分比。作为又一个示例，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)，诸如通过本文所述的方法制备的那些，可以具有至少25％(例如，至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99)的平均膜联蛋白V阳性。作为另一个示例，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)，例如通过本文所述方法制备的那些，可以具有至少约8％(例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％)的平均CD47阳性百分比。
糖蛋白VI(GPVI)是胶原蛋白的血小板受体，并且胶原蛋白与GVPI的结合使血小板活化。与新鲜的血小板相比，受体结合在血栓小体中明显减少。不受任何特定理论的束缚，据信，制造方法阻断或破坏了血栓小体中这一受体的一些拷贝，可能导致血栓小体中胶原结合相对于新鲜血小板的减少。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有与细胞膜相关的纤维蛋白原。活化的血小板的聚集由GPIIb/IIIa复合物的形成介导，所述复合物可以结合至纤维蛋白原(也被称为因子1)并形成凝块。GPIIb/IIIa是血小板纤维蛋白原受体，也被称为CD41/CD61复合物。GPIIb/IIIa克隆PAC-1与GPIIb/IIIa的活性形式结合。不受任何特定理论的束缚，据信，在细胞膜上纤维蛋白原的存在可能表明血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)能够形成凝块。类似地，不受任何特定理论的束缚，据信，抗PAC1抗体与血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(诸如通过本文所述方法制备的血小板或血小板衍生物)缺乏结合，可以指示纤维蛋白原结合至GPIIb/GPIIIa的活性形式，因为PAC-1结合至相同的复合物。在一些情况下，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(诸如通过本文所述方法制备的血小板或血小板衍生物)当它们保留较高量的残余血浆时，可以具有较大量的结合的纤维蛋白原。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)能够产生凝血酶，例如，当存在含有组织因子和磷脂的试剂时。例如，在一些情况下，当存在含有组织因子(例如，在0.25pM、0.5pM、1pM、2pM、5pM或10pM)和任选地磷脂的试剂时，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(例如，浓度为约4.8×103个颗粒/μL)可以产生至少25nM(例如，至少30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、52nM、54nM、55nM、56nM、58nM、60nM、65nM、70nM、75nM或80nM)的凝血酶峰高(TPH)。例如，在一些情况下，当存在含有组织因子(例如，在0.25pM、0.5pM、1pM、2pM、5pM或10pM)和任选地磷脂的试剂时，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(例如，浓度为约4.8×103个颗粒/μL)可以产生约25nM至约100nM(例如，约25nM至约50nM、约25至约75nM、约50至约100nM、约75至约100nM、约35nM至约95nM、约45至约85nM、约55至约75nM或约60至约70nM)的TPH。在一些情况下，当存在PRP试剂(来自Thrombinoscope的cat#TS30.00)时，例如使用包含20μL的PRP试剂和80μL的包含约4.8×103个颗粒/μL血小板或血小板衍生物(例如血栓小体)的组合物的条件，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(例如，浓度为约4.8×103个颗粒/μL)可以产生至少25nM(例如，至少30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、52nM、54nM、55nM、56nM、58nM、60nM、65nM、70nM、75nM或80nM)的TPH。在一些情况下，当存在PRP试剂(来自Thrombinoscope的cat#TS30.00)时，例如使用包含20μL的PRP试剂和80μL的包含约4.8×103个颗粒/μL血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物的条件，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)(例如，浓度为约4.8×103个颗粒/μL)可以产生约25nM至约100nM(例如，约25nM至约50nM、约25至约75nM、约50至约100nM、约75至约100nM、约35nM至约95nM、约45至约85nM、约55至约75nM或约60至约70nM)的TPH。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)能够产生凝血酶，例如，当存在含有组织因子和磷脂的试剂时。例如，在一些情况下，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有每106个颗粒至少1.2(例如，至少1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5)个凝血酶生成效价单位(TGPU)的效力。例如，在一些情况下，血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有每106个颗粒1.2至2.5个TPGU的效力(例如，每106个颗粒1.2至2.0、1.3至1.5、1.5至2.25、1.5至2.0、1.5至1.75、1.75至2.5、2.0至2.5或2.25至2.5个TPGU)。TPGU可以计算如下：TGPU/百万颗粒＝[以nM计的TPH]*[以IU/(nM)计的效价系数]/[孔内57.6万个颗粒]。类似地，凝血酶样品的效价系数可以计算如下：效价系数＝计算的校准品活性(IU)/有效校准品活性(nM)。在一些情况下，校准品活性可以基于WHO国际凝血酶标准。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)能够聚集，如例如通过使用总血栓形成分析系统
Figure BDA0003452031070000351
所确定的。在一些情况下，如本文所述的血小板或血小板衍生物，当浓度为至少70×103个颗粒/μL(例如，至少73×103、100×103、150×103、173×103、200×103、250×103或255×103个颗粒/μL)时，可以导致小于14分钟(例如，小于13.5、13、12.5、12、11.5或11分钟)的T-TAS闭塞时间(例如，达到80kPa的时间)，例如在血小板减少的柠檬酸化全血中。在一些情况下，如本文所述的血小板或血小板衍生物，当浓度为至少70×103个颗粒/μL(例如，至少73×103、100×103、150×103、173×103、200×103、250×103或255×103个颗粒/μL)时，可以导致曲线下面积(AUC)为至少1300(例如，至少1380、1400、1500、1600或1700)，例如在血小板减少的柠檬酸化全血中。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)能够聚集，例如，在聚集激动剂的存在下。聚集激动剂的非限制性示例包括凝血酶和胶原。在一些情况下，在存在聚集激动剂的情况下，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、67％、70％、75％、85％、90％或99％)的聚集百分比。在一些情况下，在存在聚集激动剂的情况下，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以具有约25％至约100％(例如，约25％至约50％、约25％至约75％、约50％至约100％、约75％至约100％、约40％至约95％、约55％至约80％或约65％至约75％)的聚集百分比。聚集百分比可以通过任何合适的方法(例如，光透射聚集法)来确定。
如本文所述的包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物可以具有适当条件和适当量的细胞底物和/或代谢物，诸如pH、pCO2、pO2、HCO3浓度、总二氧化碳(TCO2)、sO2和乳酸盐浓度。乳酸盐可以是糖酵解的产物。不受任何特定理论的束缚，起始材料可以具有高乳酸盐浓度，因为直到制造时，它已经被离体储存、呼吸和进行糖酵解持续一段时间(例如，约3天)。例如，在一些情况下，pH可以为约6.0至约7.5(例如，约6.0至约7.4、约6.9至约7.5或约7.0至约7.3)。作为另一个示例，pCO2可以是约10至约20mmHg(例如，约10至约15mmHg、约15至约20mmHg或约17至约19mmHg)。pO2可以是约140至约165mmHg(例如，约140至约150mmHg、约150至约160mmHg或约160至约165mmHg)。HCO3浓度可以是约4.5至约6.5mmol/L(例如，约5.0至约6.0mmol/L)。总二氧化碳可以为约4至约8mmol/L(例如，约5至约7mmol/L)。sO2可以是至少约98％(例如，至少约99％)。乳酸盐浓度可以小于约2.0mmol/L(例如，小于1.5mmol/L或1.0mmol/L)。乳酸盐浓度可以是约0.4至约1.3mmol/L(例如，约0.5至约0.6mmol/L、约0.5至约1.0mmol/L或约0.8至约1.3mmol/L)。
如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以保留一些代谢活性，例如，如通过乳酸脱氢酶(LDH)活性所证明的。在一些情况下，如本文所述的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以保留供体单采血小板的至少约10％(例如，至少约12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％)的LDH活性。不受任何特定理论的束缚，据信，增加量的聚蔗糖的加入增加了剩余的LDH活性的量(例如，具有8％聚蔗糖的制剂的产品比具有4％聚蔗糖的制剂的产品具有更多的保留的LDH活性)。类似地，不受任何特定理论的束缚，据信，对包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的冻干组合物进行热处理增加了保留的LDH活性的量。作为另一个示例，代谢活性可以通过保留的酯酶活性来证明，诸如细胞裂解羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)上的乙酸酯基团以暴露荧光团的能力。
在血液产品中病原体的减少通常是期望的。不受任何特定理论的束缚，据信，一些减少病原体的方法可导致在处理过的血液产品中形成微粒。一种减少病原体的方法涉及使用光敏核酸嵌入化合物，以在用适当波长照射时改变病原体的核酸。
Figure BDA0003452031070000361
系统(由Cerus制造)使用amotosalen(一种在用UVA照射时在核酸中形成交联的核酸嵌入化合物)。
如本文所述的最终血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))可以通过任何合适的方法来制备。如本文所述的最终血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))可以通过如本文公开的方法来制备。在本文所述的一些实施例中，最终血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。在一些实施例中，最终血液产品可以是冷冻干燥包含血小板和水性介质的组合物的结果，如本文所述。在一些实施例中，最终血液产品可以使用起始材料(例如，未加工的血液产品(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))或部分加工的血液产品(例如，已经经历过滤的血液产品))的切向流过滤(TFF)来制备。在一些实施例中，最终血液产品可以使用起始材料(例如，未加工的血液产品(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))或部分加工的血液产品(例如，已经经历过滤的血液产品))的离心来制备。应当理解，虽然本文所述的方法通常是在起始材料为单采材料的情况下描述的，但是也可以使用其他材料，诸如体外培养的血小板或全血。在一些情况下，血小板可以从全血(例如，汇集的全血)中分离出来。
起始材料可以是任何合适的起始材料。在一些实施例中，起始材料可以具有约60至约80mg/mL的蛋白质浓度。在一些实施例中，蛋白质浓度可以基于全血的血浆中的蛋白质浓度。在一些实施例中，蛋白质浓度可以基于供体单采血浆的蛋白质浓度。在一些实施例中，起始材料可以是供体血液产品(例如，全血或分级血液)。在一些实施例中，起始材料可以是汇集的供体血液产品(例如，汇集的全血或汇集的分级血液)。在一些实施例中，起始材料可以包括供体单采血浆。在一些实施例中，起始材料可以来源于供体单采血浆。如本文所使用的，“供体单采血浆”可以指单采材料的血浆组分，无论该材料是否包含血小板或其他血细胞。
在一些实施例中，起始材料可以是供体单采材料(例如，供体血小板或供体血小板池)。在一些实施例中，基于监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)，起始材料对HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体中的一种或多种呈阳性。在一些实施例中，可在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，测试起始材料对HLA I类抗体呈阳性。在一些实施例中，可以在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，测试起始材料对HLA II类抗体呈阳性。在一些实施例中，可以在监管机构批准的测定(例如，FDA批准的测定)中，测试起始材料对HNA抗体呈阳性。监管机构批准的测定可以是任何适当的监管机构批准的测定。在一些实施例中，监管机构批准的测试可以是One Lambda的LABSCREENTMMixed。在一些实施方式中，可以使用
Figure BDA0003452031070000371
100/200或
Figure BDA0003452031070000372
XY和HLA FUSIONTM软件进行监管机构批准的测试。
在一些实施例中，起始材料可以经历病原体减少步骤，例如，核酸嵌入化合物，其在用UVA照射时在核酸中形成交联。
在一些实施例中，起始材料(例如，一个或多个单位的供体血小板)可以最初被汇集到共同的血管中。起始材料可以最初用或可以最初不用酸化的洗涤缓冲液(例如，对照缓冲液)稀释。不受任何特定理论的束缚，据信，使用酸化的洗涤缓冲液洗涤可以降低加工期间的血小板活化。在一些情况下，起始材料可以经历两种一般的加工途径；或者用对照缓冲液洗涤(例如，使用TFF)，直到达到所需的残留组分(例如，残留供体血浆的百分比)，然后浓缩至最终浓度；或者可以在用对照缓冲液洗涤(例如，使用TFF)之前将起始材料浓缩至最终浓度，直到达到所需的残余组分(例如，残余供体血浆的百分比)。然后，可以将TFF加工的材料装入小瓶中，冻干并热处理。
在一些实施例中，所述方法可以包括初始稀释步骤，例如，起始材料(例如，未加工的血液产品(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))可以用制剂(例如，本文所述的任何制剂)稀释以形成经稀释的起始材料。在一些情况下，初始稀释步骤可以包括用制剂进行稀释，其中制剂的质量等于起始材料的质量的至少约10％(例如，起始材料的质量的至少约15％、25％、50％、75％、100％、150％或200％)。在一些实施例中，可以使用TFF设备进行初始稀释步骤。
在一些实施例中，所述方法可以包括浓缩(例如，浓缩血小板)(例如，浓缩起始材料或稀释的起始材料)以形成浓缩的血小板组合物。例如，浓缩可以包括浓缩至约1000×103至约4000×103个血小板/μL(例如，约1000×103至约2000×103、约2000×103至约3000×103或约4000×103个血小板/μL)。在一些实施例中，可以使用TFF设备进行浓缩步骤。
血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的浓度可以通过任何合适的方法来测定。例如，计数器可以用于使用阻抗(例如，Beckman Coulter AcT 10或AcT diff 2)来定量悬浮液中的血细胞浓度。
在一些实施例中，TFF可以包括起始材料、稀释的起始材料、浓缩的血小板组合物或其组合的渗滤(有时被称为“洗涤”)。在一些实施例中，渗滤可以包括用至少2(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多)个渗滤体积进行洗涤。在一些实施例中，TFF可以包括缓冲液交换。在一些实施例中，可以在TFF中使用缓冲液。缓冲液可以是任何合适的缓冲液。在一些实施例中，缓冲液可以是制剂(例如，本文所述的任何制剂)。在一些实施例中，缓冲液可以是与用于稀释的制剂相同的制剂。在一些实施例中，缓冲液可以是与用于稀释的制剂不同的制剂。在一些实施例中，缓冲液可以包括冻干剂，包括缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂，诸如选自由以下组成的群组中的有机溶剂：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)或其组合组成的群组。缓冲剂可以是任何合适的缓冲剂。在一些实施例中，缓冲剂可以是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。碱可以是任何合适的碱基。在一些实施例中，碱可以是碳酸氢钠。在一些实施例中，糖可以是单糖。在一些实施例中，负载剂可以是糖。在一些实施例中，糖可以包括蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖(例如，右旋糖)、甘露糖或木糖。在一些实施例中，单糖可以是海藻糖。在一些实施例中，负载剂可以包括聚蔗糖。盐可以是任何合适的盐。在一些实施例中，盐可以选自由氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)或其组合组成的群组。
在一些实施例中，孔径为约0.1μm至约1μm(例如，约0.1μm至约1μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.2μm至约0.45μm、约0.45μm至约1μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.45μm、约0.65μm或约1μm)的膜可以用于TFF。膜可以由任何合适的材料制成。在一些情况下，膜可以是亲水性膜。在一些实施例中，膜可以是疏水性膜。在一些实施例中，标称分子量界限(NMWCO)为至少约100kDa(例如，至少约200kDa、300kDa、500kDa或1000kDa)的膜可以用于TFF。TFF可以在任何合适的温度下进行。在一些实施例中，TFF可以在约20℃至约37℃(例如，约20℃至约25℃，约20℃至约30℃，约25℃至约30℃，约30℃至约35℃，约30℃至约37℃，约25℃至约35℃，或约25℃至约37℃)的温度下进行。在一些实施例中，TFF可以以约100ml/分钟至约800ml/分钟(例如，约100至约200ml/分钟、约100至约400ml/分钟、约100至约600ml/分钟、约200至约400ml/分钟、约200至约600ml/分钟、约200至约800ml/分钟、约400至约600ml/分钟、约400至约800ml/分钟、约600至约800ml/分钟、约100ml/分钟、约200ml/分钟、约300ml/分钟、约400ml/分钟、约500ml/分钟、约600ml/分钟、约700ml/分钟或约800ml/分钟)的流速(例如，循环流速)进行。
在一些实施例中，可以进行TFF直到达到特定终点，形成TFF处理的组合物。终点可以是任何适当的终点。在一些实施例中，终点可以是残余血浆的百分比(例如，残余血浆的小于或等于约50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，终点可以是在280nm处的相对吸光度(A280)。例如，终点可以是A280(例如，使用0.5cm的路径长度)，其小于或等于在TFF之前(例如，起始材料或稀释的起始材料)的A280(例如，使用0.5cm的路径长度)的约50％(例如，小于或等于约40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)。在一些实施例中，A280可以相对于测量7.5％血浆＝1.66AU的系统。在一些实施例中，用于测量A280的仪器可以如下配置：0.5cm间隙流动池可以被附接到TFF系统的滤液管线。流动池可以被连接到光度计，其中光纤电缆被连接到流动池的每一侧(光源电缆和光检测器电缆)。流动池可以在光纤电缆的每一侧上用石英玻璃透镜制成。在一些实施例中，终点可以是绝对A280(例如，使用0.5cm的路径长度)。例如，终点可以是小于或等于1.70AU(例如，小于或等于1.66、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1AU)的A280(例如，使用0.5cm的路径长度)。在一些实施例中，基于包含血小板和水性介质的组合物的水性介质，可以测定残余血浆的百分比、相对A280或A280。在一些实施例中，可以基于与A280的已知相关性来确定残余血浆的百分比。在一些实施例中，终点可以是血小板浓度，因为TFF可以包括样品的浓度或稀释(例如，使用制剂)。例如，终点可以是至少约2000×103个血小板/μL(例如，至少约2050×103、2100×103、2150×103、2200×103、2250×103、2300×103、2350×103、2400×103、2450×103或2500×103个血小板/μL)的血小板浓度。作为另一个示例，终点可以是约1000×103至约2500个血小板/μL(例如，约1000×103至约2000×103、约1500×103至约2300×103或约1700×103至约2300×103个血小板/μL)的血小板浓度。在一些实施例中，终点可以包括多于一个标准(例如，残余血浆的百分比和血小板浓度，相对A280和血小板浓度，或绝对A280和血小板浓度)。
通常，经TFF处理的组合物随后被冻干，任选地具有热处理步骤，以形成最终血液产物(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))。然而，在一些情况下，经TFF处理的组合物可以被视为最终血液产品。
在一些实施例中，血液产品可以使用血液产品(例如，未经处理的血液产品(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))或部分处理的血液产品(例如，已经经历TFF的血液产品))的离心来制备。在一些实施例中，血液产品可以在不离心血液产品(例如，未经处理的血液产品(例如，供体单采材料)，或部分处理的血液产品(例如，已经经历TFF的血液产品))的情况下制备。离心可以包括任何适当的步骤。在一些实施例中，离心可以包括缓慢加速、缓慢减速或其组合。在一些实施例中，离心可以包括以约1400×g至约1550×g(例如，约1400至约1450×g、约1450至约1500×g或1500至约1550×g、约1400×g、约1410×g、约1430×g、约1450×g、约1470×g、约1490×g、约1500×g、约1510×g、约1530×g或约1550×g)的离心。在一些实施例中，离心的持续时间可以是约10分钟至约30分钟(例如，约10分钟至约20分钟、约20分钟至约30分钟、约10分钟、约20分钟或约30分钟)。
在一些实施例中，可以使用TFF和离心两者(例如，TFF后离心或离心后TFF)来制备最终血液产品。
本文还提供了通过本文所述的任何方法制备的组合物。
在一些实施例中，如本文所述的组合物可以在处理期间的多个点处进行分析。在一些实施例中，可以分析起始材料(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在一些实施例中，可以分析起始材料(例如，供体单采材料(例如，汇集的供体单采材料))的蛋白质浓度(例如，通过在280nm处的吸光度(例如，使用0.5cm的路径长度))。在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的组合物(例如，当蛋白质浓度降低至小于或等于未经处理的血液产品的蛋白质浓度的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在一些实施例中，与起始材料的抗体含量相比，在处理的中间步骤中的血液产品的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，可以分析最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在本文所述的一些实施例中，最终血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。在一些实施例中，与起始材料的抗体含量相比，最终血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)在一些实施例中，最终血液产品可以没有可检测水平的选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体。在一些实施例中，如本文所述的组合物的水性介质可以如本文所述进行分析。
在一些实施例中，如本文所述的组合物可以在处理期间的多个点处进行分析。在一些实施例中，可以分析供体单采血浆的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在一些实施例中，可以分析供体单采血浆的蛋白质浓度(例如，通过在280nm处的吸光度)。在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的组合物(例如，当蛋白质浓度降低至小于或等于未处理的血液产品的蛋白质浓度的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在一些实施例中，与供体单采血浆的抗体含量相比，在处理的中间步骤中的血液产品的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，可以分析最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)。在本文所述的一些实施例中，最终血液产品可以是包含血小板和水性介质的组合物。在一些实施例中，与供体单采血浆的抗体含量相比，最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，最终血液产品可以没有可检测水平的选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体。在一些实施例中，如本文所述的组合物的水性介质可以如本文所述进行分析。
血液产品的蛋白质浓度可以通过任何适当的方法来测量。在一些实施例中，可以使用在280nm处的吸光度来测量血液产品的蛋白质浓度。
血液产品的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以通过任何合适的方法来测量。
在一些实施例中，可以使用来自One Lambda、Thermo Fisher Scientific的FLOWPRATMScreening或LABScreen Multi测试试剂盒作为HLA检测的方法。可以在TFF或离心方法之前对原材料进行测试，以测定人白细胞抗原(HLA)和人中性粒细胞抗原(HNA)的I类和II类抗体的基线水平。在处理后，可以通过离心或TFF来重复测试，以测量HLA和HNA的去除率。可以在整个TFF程序中执行额外的测试点，以保持过程控制。冻干和退火后，可以从批次中选择随机样品，并进行定性的HLA/HNA抗体测试，以确保减少并符合当前FDA的测试和验收要求。
在一些实施例中，两种血液产品的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)可以通过测定对标记物(例如，分别与HLA或HNA抗体结合的HLA或HNA包被的珠)呈阳性的珠的百分比来比较。可以使用任何适当的比较方法。在一些实施例中，可以使用如本文所述的方法来比较两种血液产品的抗体含量。在一些实施例中，这种方法可以如下执行。可以获得血浆(例如，约1mL)贫血小板血浆的等分试样。在一些实施例中，可以获得经过滤(例如，使用0.2μm过滤器)的贫血小板血浆(PPP)(例如，约1mL)的等分试样。可以将包被有I类HLA的珠和/或包被有II类HLA的珠添加到血浆中(例如，将约5μL的每种类型的珠添加到约20μL的PPP中)，以形成PPP和珠的混合物。PPP和珠的混合物可以被涡旋。可以将PPP和珠的混合物孵育以形成孵育的混合物。可以使用任何合适的孵育条件。例如，在一些实施例中，孵育可以在其他条件的情况下(例如，在黑暗中)在一定温度下(例如，在室温下)进行一段时间(例如，约30分钟)以形成孵育的混合物。在一些实施例中，孵育可以包括搅动(例如，轻柔摇动)。可以使用任何合适的条件来洗涤孵育的混合物中的珠。在一些实施例中，可以用洗涤缓冲液来洗涤孵育的混合物中的珠。可以通过任何合适的方法从孵育的混合物中分离经洗涤的珠。在一些实施例中，可以通过离心(例如，以9,000×g持续2分钟)来分离经洗涤的珠，以获得沉淀的珠。在一些实施例中，可以重复洗涤步骤。可以将珠重新悬浮以形成珠溶液。可以将与可检测部分缀合的抗体(例如，将与所测定的抗体含量(例如，HLA或HNA抗体含量)结合的抗体)添加到珠溶液中(例如，与荧光报告物缀合的αIgG，诸如FITC)。抗体可以在任何合适的条件下与珠溶液一起孵育。在一些实施例中，抗体可以在其他条件的情况下(例如，在黑暗中)在一定温度(例如，在室温下)孵育一段时间(例如，约30分钟)以形成标记的珠。可以洗涤标记的珠，以除去与可检测部分缀合的未结合的抗体。可以使用任何合适的条件来洗涤标记的珠。在一些实施例中，可以用洗涤缓冲液来洗涤标记的珠。经洗涤的标记的珠可以通过任何合适的方法进行分离。在一些实施例中，可以通过离心(例如，以9,000g持续2分钟)来分离经洗涤的标记的珠，以获得沉淀的标记的珠。在一些实施例中，可以重复洗涤步骤。可以通过任何合适的方法来检测标记的珠。在一些实施例中，可以通过流式细胞术来检测标记的珠。在一些实施例中，检测可以包括测量与阴性对照相比对可检测部分呈阳性的珠的百分比。在一些实施例中，使用已知对抗体(例如HLA I类、HLA II类或HNA抗体)呈阴性的PPP样品，可以如上制备阴性对照。
在一些实施例中，血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))可以在处理期间的多个点处进行分析。在一些实施例中，可以分析起始材料(例如，供体单采材料)以确定阳性珠(例如，HNA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，可以分析起始材料(例如，供体单采材料)的蛋白质浓度(例如，通过在280nm处的吸光度)。在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的血液产品(例如，当蛋白质浓度降低到起始材料的蛋白质浓度的小于或等于75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的血液产品(例如，当蛋白质浓度降低到起始材料的蛋白质浓度的小于或等于75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，与来自起始材料的阳性珠的百分比相比，在处理的中间步骤中来自血液产品的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，在处理的中间步骤中来自血液产品的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以小于或等于珠的总量的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，可以分析最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，与来自起始材料的阳性珠的百分比相比，来自最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，来自最终血液产品的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以小于或等于珠的总量的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，如本文所述的组合物的水性介质可以如本文所述进行分析。
在一些实施例中，血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))可以在处理期间的多个点处进行分析。在一些实施例中，可以分析供体单采血浆以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，可以分析供体单采血浆的蛋白质浓度(例如，通过在280nm处的吸光度)。在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的血液产品(例如，当蛋白质浓度降低到起始材料的蛋白质浓度的小于或等于75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。
在一些实施例中，可以分析在处理的中间步骤中的血液产品(例如，当蛋白质浓度降低到起始材料的蛋白质浓度的小于或等于75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低)时)以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。
在一些实施例中，与来自供体单采血浆的阳性珠的百分比相比，在处理的中间步骤中来自血液产品的阳性珠粒(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，在处理的中间步骤中来自血液产品的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以小于或等于珠的总量的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，可以分析最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))以确定阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比。在一些实施例中，与来自供体单采材料的阳性珠的百分比相比，来自最终血液产品(例如，(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冷冻干燥的血小板(例如，血栓小体))的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以降低至少5％(例如，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，来自最终血液产品的阳性珠(例如，HLA或HNA包被的珠)的百分比可以小于或等于珠的总量的75％(例如，小于或等于70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)。在一些实施例中，如本文所述的组合物的水性介质可以如本文所述进行分析。
可以使用任何合适的方法来测定阳性珠的百分比。在一些实施例中，与阴性对照样品相比，可以确定阳性珠。阴性对照样品可以是任何适当的阴性对照样品。在一些实施例中，阴性对照样品可以用于确定阳性门控，使得小于一定百分比(例如，约0.01％至约1％(例如，约0.01％至约0.05％，约0.05％至约0.1％，约0.1％至约0.5％，约0.5％至约1％，约0.01％，约0.05％，约0.1％，约0.5％，或约1％)的阴性对照样品存在于阳性门控内。在一些实施例中，阴性对照样品可以是缓冲液(例如，PBS)。在一些实施例中，阴性对照样品可以是合成的血浆组合物。在一些实施例中，阴性对照样品可以是已知对所测定的抗体(例如，HLA或HNA抗体)呈阴性的血液产品。
本文还提供了一种降低包含血小板的组合物(例如，血液产品)中抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)的百分比的方法，所述方法包括通过切向流过滤来过滤所述组合物。本文还提供了一种减少包含血小板的组合物(例如，血液产品)中抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)的量的方法，所述方法包括通过切向流过滤来过滤所述组合物。本文还提供了一种降低对包含血小板的组合物(例如，血液产品)中的抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLAII类抗体)或HNA抗体)呈阳性的珠的百分比的方法，所述方法包括通过切向流过滤来过滤所述组合物。
本文还提供了一种降低包含血小板的组合物(例如，血液产品)中抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLAII类抗体)或HNA抗体)的百分比的方法，所述方法包括通过离心来过滤所述组合物。本文还提供了一种减少包含血小板的组合物(例如，血液产品)中抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)的量的方法，所述方法包括通过离心来过滤所述组合物。本文还提供了一种降低对包含血小板的组合物(例如，血液产品)中的抗体(例如，HLA抗体(例如HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)呈阳性的珠的百分比的方法，所述方法包括通过离心来过滤所述组合物。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，组合物(例如，血液产品)中抗体(例如HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)的量可以降低到低于参考水平。参考水平可以是任何合适的参考水平。在本文所述的任何方法的一些实施例中，与经历本文所述的方法之前的血液产品相比，对组合物(例如，血液产品)中的抗体(例如，HLA抗体(例如，HLA I类抗体或HLA II类抗体)或HNA抗体)呈阳性的珠的百分比可以降低。对抗体呈阳性的珠的百分比可以降低任何适当的量。在一些实施例中，与经历本文所述的任何方法之前的血液产品相比，对抗体阳性的珠的百分比可以降低至少5％(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。
在一些实施例中，如本文所述的组合物可以经历任何合适的附加方法步骤。在一些实施例中，如本文所述的组合物可以是冻干的。在一些实施例中，冻干的血小板可以被热处理(例如，在约80℃下持续约24小时)。
例如，在一些实施例中，组合物可以被低温冷冻保存或冷冻干燥。在一些实施例中，可以用混合物处理第一组合物(例如，如本文所述的包含血小板和水性介质的组合物)。在一些实施例中，混合物可以包括冻干剂，包括碱、负载剂和任选地至少一种有机溶剂，诸如选自由以下组成的群组中的有机溶剂：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)或其组合，以形成包含血小板的第二组合物。在一些实施例中，负载剂可以是糖。在一些实施例中，糖可以是单糖。在一些实施例中，糖可以是蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖(例如，右旋糖)、甘露糖或木糖。在一些实施例中，负载剂可以是聚蔗糖。
在一些实施例中，第一组合物或第二组合物可以被干燥。在一些实施例中，第一组合物或第二组合物可以用冷冻保护剂进行干燥。在一些实施例中，冷冻保护剂可以包括糖、任选地碱和任选地至少一种有机溶剂，诸如选自由以下组成的群组中的有机溶剂：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)或其组合，以形成第三组合物。在一些实施例中，冷冻保护剂可以是聚蔗糖。
在一些实施例中，第一组合物或第二组合物可以被冷冻干燥。在一些实施例中，第一组合物或第二组合物可以用冷冻保护剂进行冷冻干燥。在一些实施例中，冷冻保护剂可以包括糖、任选地碱和任选地至少一种有机溶剂，诸如选自由以下组成的群组中的有机溶剂：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)或其组合，以形成第四组合物。在一些实施例中，冷冻干燥可以在约-40℃至约5℃的温度下进行。在一些实施例中，冷冻干燥可以在一定梯度(例如，约-40℃至约5℃)下进行。在一些实施例中，可以进行二次干燥步骤(例如，在约20℃至约40℃下)。
本文还提供了通过本文所述的任何方法制备的血液产品(例如，血小板、低温冷冻保存的血小板、冻干的血小板(例如，血栓小体))。
在一些实施例中，与未通过包括对包含血小板的组合物进行切向流过滤、对包含血小板的组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNAs的珠对如本文所述的组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)。
在一些实施例中，与未通过包括对包含血小板的组合物进行切向流过滤、对包含血小板的组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠对如本文所述的组合物测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比降低至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)。
在一些实施例中，与未通过包括对包含血小板的组合物进行切向流过滤、对包含血小板的组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠对如本文所述的组合物测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比降低至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)。
在一些实施例中，与未通过包括对包含血小板的组合物进行切向流过滤、对包含血小板的组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠对如本文所述的组合物测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比降低至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)。
在本文提供的用于制备本文提供的组合物的方法中，任选添加冻干剂可以是干燥前的最后一步。然而，在一些实施例中，冻干剂可以与组合物的其他组分诸如盐、缓冲液、任选地冷冻保护剂或其他组分同时或在它们之前加入。在一些实施例中，将冻干剂加入到制剂中，充分混合以形成干燥溶液，分配到干燥容器(例如，玻璃或塑料血清小瓶、冻干袋)中，并经受允许干燥经TFF处理的组合物的条件，以形成干燥的组合物。
在各种实施例中，冻干袋是气体可渗透袋，其被构造成在处理期间允许气体通过袋的至少一部分或所有部分。气体可渗透袋可以允许袋内部的气体与周围环境中存在的大气气体交换。气体可渗透袋可以是气体(诸如氧气、氮气、水、空气、氢气和二氧化碳)可渗透的，从而允许在本文提供的组合物中发生气体交换。在一些实施例中，气体可渗透袋通过允许二氧化碳透过其壁而允许去除存在于袋内部的一些二氧化碳。在一些实施例中，从袋中释放二氧化碳可以有利于保持袋中所包含组合物的所需pH水平。
在一些实施例中，本文所述方法的容器是封闭或密封的气体可渗透容器。在一些实施例中，容器是封闭或密封的且其一部分是气体可渗透的容器。在一些实施例中，可以调节封闭或密封的容器(例如，袋)的气体可渗透部分的表面积相对于容器中所包含产品的体积(以下被称为“SA/V比”)以改善本文提供的组合物的pH保持。例如，在一些实施例中，容器的SA/V比可以是至少约2.0cm2/mL(例如，至少约2.1cm2/mL、至少约2.2cm2/mL、至少约2.3cm2/mL、至少约2.4cm2/mL、至少约2.5cm2/mL、至少约2.6cm2/mL、至少约2.7cm2/mL、至少约2.8cm2/mL、至少约2.9cm2/mL、至少约3.0cm2/mL、至少约3.1cm2/mL、至少约3.2cm2/mL、至少约3.3cm2/mL、至少约3.4cm2/mL、至少约3.5cm2/mL、至少约3.6cm2/mL、至少约3.7cm2/mL、至少约3.8cm2/mL、至少约3.9cm2/mL、至少约4.0cm2/mL、至少约4.1cm2/mL、至少约4.2cm2/mL、至少约4.3cm2/mL、至少约4.4cm2/mL、至少约4.5cm2/mL、至少约4.6cm2/mL、至少约4.7cm2/mL、至少约4.8cm2/mL、至少约4.9cm2/mL或至少约5.0cm2/mL。在一些实施例中，容器的SA/V比可以为至多约10.0cm2/mL(例如，至多约9.9cm2/mL、至多约9.8cm2/mL、至多约9.7cm2/mL、至多约9.6cm2/mL、至多约9.5cm2/mL、至多约9.4cm2/mL、至多约9.3cm2/mL、至多约9.2cm2/mL、至多约9.1cm2/mL、至多约9.0cm2/mL、至多约8.9cm2/mL、至多约8.8cm2/mL、至多约8.7cm2/mL、至多约8.6cm2/mL、至多约8.5cm2/mL、至多约8.4cm2/mL、至多约8.3cm2/mL、至多约8.2cm2/mL、至多约8.1cm2/mL、至多约8.0cm2/mL、至多约7.9cm2/mL、至多约7.8cm2/mL、至多约7.7cm2/mL、至多约7.6cm2/mL、至多约7.5cm2/mL、至多约7.4cm2/mL、至多约7.3cm2/mL、至多约7.2cm2/mL、至多约7.1cm2/mL、至多约6.9cm2/mL、至多约6.8cm2/mL、至多约6.7cm2/mL、至多约6.6cm2/mL、至多约6.5cm2/mL、至多约6.4cm2/mL、至多约6.3cm2/mL、至多约6.2cm2/mL、至多约6.1cm2/mL、至多约6.0cm2/mL、至多约5.9cm2/mL、至多约5.8cm2/mL、至多约5.7cm2/mL、至多约5.6cm2/mL、至多约5.5cm2/mL、至多约5.4cm2/mL、至多约5.3cm2/mL、至多约5.2cm2/mL、至多约5.1cm2/mL、至多约5.0cm2/mL、至多约4.9cm2/mL、至多约4.8cm2/mL、至多约4.7cm2/mL、至多约4.6cm2/mL、至多约4.5cm2/mL、至多约4.4cm2/mL、至多约4.3cm2/mL、至多约4.2cm2/mL、至多约4.1cm2/mL或至多约4.0cm2/mL。在一些实施例中，容器的SA/V比的范围可以为约2.0至约10.0cm2/mL(例如，约2.1cm2/mL至约9.9cm2/mL、约2.2cm2/mL至约9.8cm2/mL、约2.3cm2/mL至约9.7cm2/mL、约2.4cm2/mL至约9.6cm2/mL、约2.5cm2/mL至约9.5cm2/mL、约2.6cm2/mL至约9.4cm2/mL、约2.7cm2/mL至约9.3cm2/mL、约2.8cm2/mL至约9.2cm2/mL、约2.9cm2/mL至约9.1cm2/mL、约3.0cm2/mL至约9.0cm2/mL、约3.1cm2/mL至约8.9cm2/mL、约3.2cm2/mL至约8.8cm2/mL、约3.3cm2/mL至约8.7cm2/mL、约3.4cm2/mL至约8.6cm2/mL、约3.5cm2/mL至约8.5cm2/mL、约3.6cm2/mL至约8.4cm2/mL、约3.7cm2/mL至约8.3cm2/mL、约3.8cm2/mL至约8.2cm2/mL、约3.9cm2/mL至约8.1cm2/mL、约4.0cm2/mL至约8.0cm2/mL、约4.1cm2/mL至约7.9cm2/mL、约4.2cm2/mL至约7.8cm2/mL、约4.3cm2/mL至约7.7cm2/mL、约4.4cm2/mL至约7.6cm2/mL、约4.5cm2/mL至约7.5cm2/mL、约4.6cm2/mL至约7.4cm2/mL、约4.7cm2/mL至约7.3cm2/mL、约4.8cm2/mL至约7.2cm2/mL、约4.9cm2/mL至约7.1cm2/mL、约5.0cm2/mL至约6.9cm2/mL、约5.1cm2/mL至约6.8cm2/mL、约5.2cm2/mL至约6.7cm2/mL、约5.3cm2/mL至约6.6cm2/mL、约5.4cm2/mL至约6.5cm2/mL、约5.5cm2/mL至约6.4cm2/mL、约5.6cm2/mL至约6.3cm2/mL、约5.7cm2/mL至约6.2cm2/mL或约5.8cm2/mL至约6.1cm2/mL)。
气体可渗透的封闭容器(例如，袋)或其部分可以由一种或多种各种气体可渗透材料制成。在一些实施例中，气体可渗透袋可以由一种或多种聚合物制成，所述聚合物包括含氟聚合物(诸如聚四氟乙烯(PTFE)和全氟烷氧基(PFA)聚合物)、聚烯烃(诸如低密度聚乙烯(LDPE)、高密度聚乙烯(HDPE))、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯(PVC)、硅酮及其任意组合。
在一些实施例中，干燥的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)可以经历热处理。加热可以在高于约25℃(例如，大于约40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或更高)的温度下进行。在一些实施例中，加热在约70℃至约85℃之间(例如，在约75℃至约85℃之间，或在约75℃或80℃下)进行。用于加热的温度可以结合加热待进行的时间长度来选择。尽管可以使用任何合适的时间，但通常将冻干的血小板加热至少1小时，但不超过36小时。因此，在实施例中，加热进行至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少20小时、至少24小时或至少30小时。例如，可以冻干的血小板加热18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时或30小时。非限制性的示例性组合包括：在高于30℃的温度下加热干燥的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)持续至少30分钟；在高于50℃的温度下加热干燥的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)持续至少10小时；在高于75℃的温度下加热干燥的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)持续至少18小时；以及在80℃下加热干燥的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)持续24小时。在一些实施例中，加热可以在密封的容器(诸如有盖的小瓶)中进行。在一些实施例中，密封的容器在加热之前先抽真空。已经发现，热处理步骤，特别是在存在冷冻保护剂(诸如白蛋白或聚蔗糖)的情况下，可以改善冻干的血小板的稳定性和保存期。实际上，与没有热处理步骤的那些冷冻保护剂相比，使用血清白蛋白或聚蔗糖和冻干后热处理步骤的特定组合已经获得了有利的结果。冷冻保护剂(例如，蔗糖)可以以任何合适的量(例如，以血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的质量或体积计，约3％至约10％)存在。
在一些情况下，包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物可以在约室温下用水(例如，注射用无菌水)再水合约10分钟。一般而言，再水合体积约等于干燥前用于填充每小瓶血栓小体的体积。
在一些实施例中，如本文所公开制备的血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的储存稳定性至少约等于制备前血小板的储存稳定性。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板或血小板衍生物之前低温冷冻保存血小板或血小板衍生物(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)之前，干燥包含血小板或血小板衍生物的组合物(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在干燥步骤后加热所述组合物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在冷冻干燥步骤或加热步骤之后将所述组合物再水合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)之前，冷冻干燥包含血小板或血小板衍生物的组合物(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在冷冻干燥步骤后加热所述组合物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在冷冻干燥步骤或加热步骤之后将所述组合物再水合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板、血小板衍生物或血栓小体之前冷藏血小板、血小板衍生物或血栓小体(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)。
储存条件包括，例如，标准室温储存(例如，在约20至约30℃的范围内的温度下储存)或冷藏(例如，在约1至约10℃的范围内的温度下储存)。在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)之前，将包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物低温冷冻保存、冷冻干燥、解冻、再水合及其组合(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)。例如，在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)之前，干燥(例如，冷冻干燥)包含血小板或血小板衍生物的组合物(例如，用制剂，例如本文所述的制剂)(例如，以形成血栓小体)。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括将从干燥步骤获得的组合物再水合。
在一些实施例中，本文提供了一种用于制备包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的组合物的方法。所述方法可以包括用约等重量(±10％)的制剂(例如，如实例1中提供的缓冲液A)稀释包含血小板的起始材料，将血小板浓缩至约2250×103个细胞/μL(±250×103)，然后用2-4个渗滤体积(DV)(例如，约2个渗滤体积)的制剂洗涤以形成TFF处理的组合物。残余血浆百分比可以小于约15％的相对血浆(如由血浆蛋白含量确定的)。在洗涤后，如果经TFF处理的组合物中细胞的浓度不是约2000×103个细胞/μL(±300×103)，则细胞可以用制剂稀释或者可以被浓缩以落入该范围。所述方法可以进一步包括冻干经TFF处理的组合物，并且随后在约80℃下处理包含血小板或血小板衍生物(例如，血栓小体)的冻干组合物持续约24小时。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括病原体减少步骤，例如，在稀释起始材料之前。
本文还提供了通过本文描述的任何方法生产的组合物。
在一些实施例中，本文提供的任何组合物可以通过本文描述的方法制备。
本文公开的具体实施例可以在权利要求中使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言进一步限制。
示例性的实施例
实施例1是一种组合物，所述组合物包含血小板或血小板衍生物和水性介质，其中水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
实施例2是实施例1所述的组合物，其中水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。
实施例3是实施例1或2所述的组合物，其中水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)I类抗体的浓度小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)I类抗体浓度的30％。
实施例4是实施例1至3中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)II类抗体的浓度小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)II类抗体浓度的30％。
实施例5是实施例1至4中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人中性粒细胞抗原(HNA)抗体的浓度小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的30％。
实施例6是实施例1至5中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。
实施例7是实施例1至6中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的10％。
实施例8是实施例1至7中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的10％。
实施例9是实施例1至8中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的10％。
实施例10是实施例1至9中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的5％。
实施例11是实施例1至10中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的5％。
实施例12是实施例1至11中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的5％。
实施例13是实施例1至12中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的5％。
实施例14是实施例1至13中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的3％。
实施例15是实施例1至14中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的3％。
实施例16是实施例1至15中任一项所述的组合物，其中其中水性介质具有的人HLAII类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的3％。
实施例17是实施例1至16中任一项所述的组合物，其中其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的3％。
实施例18是实施例1至17中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的1％。
实施例19是实施例1至18中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的1％。
实施例20是实施例1至19中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HLA II类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的1％。
实施例21是实施例1至20中任一项所述的组合物，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的1％。
实施例22是实施例1至21中任一项所述的组合物，其中通过在280纳米(nm)处的吸光度来测定蛋白质浓度，其中路径长度为0.5cm。
实施例23是实施例22所述的组合物，其中在280nm处的吸光度小于或等于1.7AU。
实施例24是实施例22所述的组合物，其中在280nm处的吸光度小于或等于1.66AU。
实施例25是实施例22所述的组合物，其中在280nm处的吸光度小于或等于1.6AU。
实施例26是实施例1至25中任一项所述的组合物，其中血小板计数为至少200×103个血小板/μL。
实施例27是实施例26所述的组合物，其中血小板计数为至少2250×103个血小板/μL。
实施例28是实施例1至27中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有小于0.2×106个红细胞/μL的红细胞计数。
实施例29是实施例1至27中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含红细胞。
实施例30是实施例29所述的组合物，其中红细胞计数小于0.2×106个红细胞/μL。
实施例31是实施例1至30中任一项所述的组合物，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HLA类抗体呈阴性。
实施例32是实施例1至31中任一项所述的组合物，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HLA II类抗体呈阴性。
实施例33是实施例1至32中任一项所述的组合物，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HNA抗体呈阴性。
实施例34是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例35是实施例1至34中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例36是实施例1至35中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例37是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例38是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例39是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例40是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例41是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例42是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例43是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例44是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例45是实施例1至33中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例46是实施例1至45中任一项所述的组合物，其中水性介质进一步包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂。
实施例47是实施例46所述的组合物，其中缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。
实施例48是实施例46至47中任一项所述的组合物，其中碱是碳酸氢钠。
实施例49是实施例46至48中任一项所述的组合物，其中所述负载剂是单糖、多糖或其组合。
实施例50是实施例49所述的组合物，其中单糖选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。
实施例51是实施例49所述的组合物，其中单糖是海藻糖。
实施例52是实施例49至51中任一项所述的组合物，其中所述多糖为聚蔗糖。
实施例53是实施例46至52中任一项所述的组合物，其中所述盐是氯化钠、氯化钾或其组合。
实施例54是实施例46至53中任一项所述的组合物，其中有机溶剂选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。
实施例55是实施例1至54中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过包括对包含血小板的起始材料进行切向流过滤(TFF)、对包含血小板的起始材料进行离心或其组合的方法来制备。
实施例56是实施例55所述的组合物，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLAI类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少50％。
实施例57是实施例55所述的组合物，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLAI类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少75％。
实施例58是实施例55所述的组合物，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLAI类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少90％。
实施例59是实施例55所述的组合物，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLAI类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少95％。
实施例60是实施例55至59中任一项所述的组合物，其中起始材料：
a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阳性；
b)基于监管机构批准的测试，对HLAII类抗体呈阳性；
c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阳性；或者
d)a)、b)或c)中的一种或多种。
实施例61是实施例55至60中任一项所述的组合物，其中起始材料具有约60至约80mg/ml的蛋白质浓度。
实施例62是实施例55至61中任一项所述的组合物，其中起始材料包括供体血液产品。
实施例63是实施例62所述的组合物，其中供体血液产品是汇集的供体血液产品。
实施例64是实施例62至63中任一项所述的组合物，其中起始材料包括供体单采材料。
实施例65是实施例55至64中任一项所述的组合物，其中TFF包括浓缩。
实施例66是实施例55至65中任一项所述的组合物，其中TFF包括渗滤。
实施例67是实施例66所述的组合物，其中渗滤包括用至少两个渗滤体积进行渗滤。
实施例68是实施例55至67中任一项所述的组合物，其中TFF包括缓冲液交换。
实施例69是实施例55至68中任一项所述的组合物，其中使用孔径为约0.2μm至约1μm的膜进行TFF。
实施例70是实施例55至68中任一项所述的组合物，其中使用孔径为约0.2μm至约0.45μm的膜进行TFF
实施例71是实施例55至70中任一项所述的组合物，其中TFF在约20℃至约37℃的温度下进行。
实施例72是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的50％。
实施例73是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的30％。
实施例74是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的10％。
实施例75是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的5％。
实施例76是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的3％。
实施例77是实施例55至71中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的1％。
实施例78是实施例55至77中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.70AU。
实施例79是实施例55至77中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.66AU。
实施例80是实施例55至77中任一项所述的组合物，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.60AU。
实施例81是实施例55至80中任一项所述的组合物，其中进行TFF直到血小板浓度为至少约2000×103个血小板/μL。
实施例82是实施例55至80中任一项所述的组合物，其中进行TFF直到血小板浓度为至少约2250×103个血小板/μL。
实施例83是实施例55至82中任一项所述的组合物，其中TFF包括将缓冲液交换成包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的制剂。
实施例84是实施例83所述的组合物，其中缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。
实施例85是实施例83至84中任一项所述的组合物，其中碱是碳酸氢钠。
实施例86是实施例83至85中任一项所述的组合物，其中所述负载剂是单糖、多糖或其组合。
实施例87是实施例86所述的组合物，其中单糖选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成的群组。
实施例88是实施例86所述的组合物，其中单糖为海藻糖。
实施例89是实施例86至88中任一项所述的组合物，其中多糖为聚蔗糖。
实施例90是实施例83至89中任一项所述的组合物，其中所述盐是氯化钠、氯化钾或其组合。
实施例91是实施例83至90中任一项所述的组合物，其中有机溶剂选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。
实施例92是实施例55至91中任一项所述的组合物，其中离心包括以1400×g至约1550×g离心。
实施例93是实施例55至91中任一项所述的组合物，其中离心包括以1450×g至约1500×g离心。
实施例94是实施例55至91中任一项所述的组合物，其中所述方法不包括离心包含血小板的组合物。
实施例95是实施例1至94中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于5.0％(以散射强度计)的微粒。
实施例96是实施例1至94中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于4.5％(以散射强度计)的微粒。
实施例97是实施例1至94中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于4.0％(以散射强度计)的微粒。
实施例98是实施例1至94中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于3.5％(以散射强度计)的微粒。
实施例99是实施例1至98中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少55％的CD41阳性百分比。
实施例100是实施例1至98中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少60％的CD41阳性百分比。
实施例101是实施例1至98中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少65％的CD41阳性百分比。
实施例102是实施例1至101中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少65％的CD42阳性百分比。
实施例103是实施例1至101中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD42阳性百分比。
实施例104是实施例1至101中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少90％的CD42阳性百分比。
实施例105是实施例1至104中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约10％的乳酸脱氢酶活性。
实施例106是实施例1至104中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约15％的乳酸脱氢酶活性。
实施例107是实施例1至104中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约20％的乳酸脱氢酶活性。
实施例108是实施例1至107中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少25％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例109是实施例1至107中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少50％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例110是实施例1至107中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少70％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例111是实施例1至110中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少8％的CD47阳性百分比。
实施例112是实施例1至110中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少10％的CD47阳性百分比。
实施例113是实施例1至110中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少15％的CD47阳性百分比。
实施例114是实施例1至110中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少20％的CD47阳性百分比。
实施例115是实施例1至114中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少10％的CD62阳性百分比。
实施例116是实施例1至114中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少50％的CD62阳性百分比。
实施例117是实施例1至114中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD62阳性百分比。
实施例118是实施例1至114中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有至少90％的CD62阳性百分比。
实施例119是实施例1至118中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有与细胞膜结合的纤维蛋白原。
实施例120是实施例1至119中任一项所述的组合物，其中所述水性介质具有小于2.0mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例121是实施例1至119中任一项所述的组合物，其中所述水性介质具有小于1.5mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例122是实施例1至121中任一项所述的组合物，其中所述水性介质具有约0.4至约1.3mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例123是实施例1至121中任一项所述的组合物，其中所述水性介质具有约0.5至约1.0mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例124是实施例1至123中任一项所述的组合物，其中血小板衍生物包含血栓小体。
实施例125是实施例1或22至124中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约50％。
实施例126是实施例1至5或22至125中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约30％。
实施例127是实施例1至5或22至126中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约15％。
实施例128是实施例1至9或22至127中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约8％至约10％。
实施例129是实施例1至9或22至128中任一项所述的组合物，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约7％至约10％。
实施例130是实施例1至129中任一项所述的组合物，其中当在含有组织因子和磷脂的试剂存在下时，血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少25nM的凝血酶峰高(TPH)。
实施例131是实施例1至129中任一项所述的组合物，其中当在含有组织因子和磷脂的试剂存在下时，血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少50nM的凝血酶峰高(TPH)。
实施例132是实施例1至129中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物具有每106个颗粒至少1.5个凝血酶生成效力单位(TGPU)的效力。
实施例133是实施例1至129中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于14分钟的闭塞时间。
实施例134是实施例1至129中任一项所述的组合物，其中血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于12分钟的闭塞时间。
实施例135是一种用于制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物的方法，所述方法包括：
对包含血小板的起始材料、包含血小板的稀释的起始材料、浓缩的血小板组合物或其组合进行切向流过滤(TFF)，从而制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物，
其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
实施例136是实施例125所述的方法，其中起始材料：
a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阳性；
b)基于监管机构批准的测试，对HLAII类抗体呈阳性；
c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阳性；或者
d)a)、b)和c)中的一种或多种。
实施例137是实施例135至136中任一项所述的方法，其中起始材料具有约60至约80mg/mL的蛋白质浓度。
实施例138是实施例135至137中任一项所述的方法，其中起始材料包括供体血液产品。
实施例139是实施例138所述的方法，其中供体血液产品是汇集的供体血液产品。
实施例140是实施例135至139中任一项所述的方法，其中起始材料包括供体单采材料。
实施例141是实施例135至140中任一项所述的方法，其中TFF包括浓缩。
实施例142是实施例135至141中任一项所述的方法，其中TFF包括渗滤。
实施例143是实施例142所述的方法，其中渗滤包括具有至少两个渗滤体积的渗滤。
实施例144是实施例135至143中任一项所述的方法，其中TFF包括缓冲液交换。
实施例145是实施例135至144中任一项所述的方法，其中使用孔径为约0.2μm至约1μm的膜进行TFF。
实施例146是实施例135至145中任一项所述的方法，其中使用孔径为约0.2μm至约0.45μm的膜进行TFF。
实施例147是实施例135至146中任一项所述的方法，其中在约20℃至约37℃的温度下进行TFF。
实施例148是实施例135至147中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的50％。
实施例149是实施例135至148中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的30％。
实施例150是实施例135至149中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的10％。
实施例151是实施例135至150中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的5％。
实施例152是实施例135至151中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的3％。
实施例153是实施例135至152中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于起始材料在280nm处的吸光度的1％。
实施例154是实施例135至153中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.70AU。
实施例155是实施例135至154中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.66AU。
实施例156是实施例135至155中任一项所述的方法，其中使用0.5cm的路径长度进行TFF，直到水性介质在280nm处的吸光度小于或等于1.60AU。
实施例157是实施例135至156中任一项所述的方法，其中进行TFF直到血小板浓度为至少约2000×103个血小板/μL。
实施例158是实施例135至156中任一项所述的方法，其中进行TFF直到血小板浓度为至少约2250×103个血小板/μL。
实施例159是实施例135至158中任一项所述的方法，其中TFF包括用制剂渗滤，所述制剂包括缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂。
实施例160是实施例135至159中任一项所述的方法，其中TFF包括将缓冲液交换成包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的制剂。
实施例161是实施例149至160中任一项所述的方法，其中缓冲剂为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。
实施例162是实施例149至161中任一项所述的方法，其中碱是碳酸氢钠。
实施例163是实施例149至162中任一项所述的方法，其中负载剂是单糖、多糖或其组合。
实施例164是实施例163所述的方法，其中单糖选自由蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、木糖及其组合组成的群组。
实施例165是实施例163所述的方法，其中单糖是海藻糖。
实施例166是实施例163至165中任一项所述的方法，其中多糖是聚蔗糖。
实施例167是实施例159至166中任一项所述的方法，其中所述盐是氯化钠、氯化钾或其组合。
实施例168是实施例159至167中任一项所述的方法，其中有机溶剂选自由以下组成的群组：乙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、甲醇、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMAC)及其组合。
实施例169是实施例135至168中任一项所述的方法，其中所述方法不包括离心包含血小板的起始材料、包含血小板的稀释的起始材料、浓缩的血小板组合物或其组合。
实施例170是实施例135至169中任一项所述的方法，其中所述方法不包括离心包含血小板的组合物。
实施例171是实施例135至170中任一项所述的方法，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少50％。
实施例172是实施例135至170中任一项所述的方法，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少75％。
实施例173是实施例135至170中任一项所述的方法，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少90％。
实施例174是实施例135至170中任一项所述的方法，其中与未通过包括对血液产品组合物进行切向流过滤、对血液产品组合物进行离心或其组合的方法制备的类似组合物相比，如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对所述组合物测定的，对选自由HLA I类抗体、HLA II类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比降低至少95％。
实施例175是实施例135至174中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。
实施例176是实施例135至175中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)I类抗体的浓度小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)I类抗体浓度的30％。
实施例177是实施例135至176中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人白细胞抗原(HLA)II类抗体的浓度小于供体单采血浆中人白细胞抗原(HLA)II类抗体浓度的30％。
实施例178是实施例135至17中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人中性粒细胞抗原(HNA)抗体的浓度小于供体单采血浆中HNA抗体浓度的30％。
实施例179是实施例135至178中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。
实施例180是实施例135至179中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的10％。
实施例181是实施例135至180中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLAII类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的10％。
实施例182是实施例135至181中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的10％。
实施例183是实施例135至182中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的5％。
实施例184是实施例135至183中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的5％。
实施例185是实施例135至184中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLAII类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的5％。
实施例186是实施例135至185中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的5％。
实施例187是实施例135至186中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的3％。
实施例188是实施例135至187中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的3％
实施例189是实施例135至188中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLAII类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的3％。
实施例190是实施例135至189中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的3％。
实施例191是实施例135至190中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的1％。
实施例192是实施例135至191中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLA I类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA I类抗体浓度的1％。
实施例193是实施例135至192中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HLAII类抗体的浓度低于供体单采血浆中HLA II类抗体浓度的1％。
实施例194是实施例135至193中任一项所述的方法，其中水性介质具有的人HNA抗体的浓度低于供体单采血浆中HNA抗体浓度的1％。
实施例195是实施例135至194中任一项所述的方法，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HLA类抗体呈阴性。
实施例196是实施例135至195中任一项所述的方法，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HLA II类抗体呈阴性。
实施例197是实施例135至196中任一项所述的方法，其中基于监管机构批准的测试，所述组合物对HNA抗体呈阴性。
实施例198是实施例135至197中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例199是实施例135至198中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例200是实施例135至199中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用分别包被有I类HLA、II类HLA或HNA的珠针对组合物所测定的，对选自由HLA I类抗体、HLAII类抗体和HNA抗体组成的群组的抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例201是实施例135至200中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例202是实施例135至201中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例203是实施例135至202中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有I类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA I类抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例204是实施例135至203中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例205是实施例135至204中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例206是实施例135至205中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有II类HLA的珠针对组合物所测定的，对HLA II类抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例207是实施例135至206中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于5％。
实施例208是实施例135至207中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于3％。
实施例209是实施例135至208中任一项所述的方法，其中如通过流式细胞术使用包被有HNA的珠针对组合物所测定的，对HNA抗体呈阳性的珠的百分比小于1％。
实施例210是实施例135至209中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于5.0％(以散射强度计)的微粒。
实施例211是实施例135至209中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于4.5％(以散射强度计)的微粒。
实施例212是实施例135至209中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于4.0％(以散射强度计)的微粒。
实施例213是实施例135至209中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于3.5％(以散射强度计)的微粒。
实施例214是实施例135至213中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少55％的CD41阳性百分比。
实施例215是实施例135至213中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少60％的CD41阳性百分比。
实施例216是实施例135至213中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少65％的CD41阳性百分比。
实施例217是实施例135至216中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少65％的CD42阳性百分比。
实施例218是实施例135至216中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD42阳性百分比。
实施例219是实施例135至216中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少90％的CD42阳性百分比。
实施例220是实施例135至219中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约10％的乳酸脱氢酶活性。
实施例221是实施例135至219中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约15％的乳酸脱氢酶活性。
实施例222是实施例135至219中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物保留供体单采血小板的至少约20％的乳酸脱氢酶活性。
实施例223是实施例135至222中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少25％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例224是实施例135至222中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少50％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例225是实施例135至222中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少75％的膜联蛋白V阳性百分比。
实施例226是实施例135至225中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少8％的CD47阳性百分比。
实施例227是实施例135至225中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少10％的CD47阳性百分比。
实施例228是实施例135至225中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少15％的CD47阳性百分比。
实施例229是实施例135至225中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少20％的CD47阳性百分比。
实施例230是实施例135至229中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少10％的CD62阳性百分比。
实施例231是实施例135至229中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少50％的CD62阳性百分比。
实施例232是实施例135至229中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD62阳性百分比。
实施例233是实施例135至229中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有至少90％的CD62阳性百分比。
实施例234是实施例135至233中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有与细胞膜结合的纤维蛋白原。
实施例235是实施例135至234中任一项所述的方法，其中水性介质具有小于2.0mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例236是实施例135至234中任一项所述的方法，其中水性介质具有小于1.5mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例237是实施例135至236中任一项所述的方法，其中所述水性介质具有约0.4至约1.3mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例238是实施例135至236中任一项所述的方法，其中所述水性介质具有约0.5至约1.0mmol/L的乳酸盐浓度。
实施例239是实施例135至238中任一项所述的方法，其中血小板衍生物包含血栓小体。
实施例240是实施例135至239中任一项所述的方法，进一步包括病原体减少步骤。
实施例241是实施例240所述的方法，其中病原体减少步骤在TFF之前。
实施例242是实施例135至241中任一项所述的方法，进一步包括冻干包含血小板或血小板衍生物的组合物。
实施例243是实施例135至241中任一项所述的方法，进一步包括低温冷冻保存包含血小板或血小板衍生物的组合物。
实施例244是实施例135至243中任一项所述的方法，进一步包括热处理包含血小板或血小板衍生物的组合物。
实施例245是实施例135至148、154至174或195至244中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约50％。
实施例246是实施例135至149、154至178或195至245中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约30％。
实施例247是实施例135至148、154至178或195至246中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约15％。
实施例248是实施例135至148、154至182或195至247中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约8％至约10％。
实施例249是实施例135至148、154至182或195至248中任一项所述的方法，其中蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约7％至约10％。
实施例250是实施例135至249中任一项所述的方法，其中当存在含有组织因子和磷脂的试剂时，血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少25nM的凝血酶峰高(TPH)。
实施例251是实施例135至249中任一项所述的方法，其中当存在含有组织因子和磷脂的试剂时，血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少50nM的凝血酶峰高(TPH)。
实施例252是实施例135至249中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物具有每106个颗粒至少1.5个凝血酶生成效力单位(TGPU)的效力。
实施例253是实施例135至249中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于14分钟的闭塞时间。
实施例254是实施例135至249中任一项所述的方法，其中血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于12分钟的闭塞时间。
实施例255是一种通过实施例135至254中任一项所述的方法制备的包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物。
实施例256是一种用于制备冻干的血小板所述的方法，包括：
a)使用实施例135至254中任一项所述的方法来制备包含血小板和水性介质的组合物；和
b)冷冻干燥包含血小板和水性介质的组合物。
实施例257是一种通过实施例235所述的方法制备的包含冻干的血小板的组合物。
实施例258是一种用于制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物的方法，所述方法包括：
稀释包含血小板的起始材料以形成稀释的起始材料；
浓缩稀释的起始材料，使得血小板具有约2250×103个细胞/μL(±250×103)的浓度，以形成浓缩的血小板组合物；以及
用至少2个渗滤体积(DV)的制剂洗涤浓缩的血小板组合物以形成经TFF处理的组合物。
实施例259是实施例258的方法，其中稀释包括用约等重量(±10％)的制剂稀释。
实施例260是实施例258至259中任一项所述的方法，进一步包括病原体减少步骤。
实施例261是实施例260的方法，其中病原体减少步骤发生在稀释起始材料之前。
实施例262是实施例258至261中任一项所述的方法，其中残余血浆百分比小于或等于约15％的相对血浆(如通过血浆蛋白含量测定的)。
实施例263是实施例258至262中任一项所述的方法，其中在洗涤后，如果经TFF处理的组合物中的细胞的浓度不是约2000×103个细胞/μL(±300×103)，则稀释所述制剂或可以浓缩至落入该范围内。
实施例264是实施例258至263中任一项所述的方法，进一步包括冻干经TFF处理的组合物以形成冻干的组合物。
实施例265是实施例264的方法，进一步包括在约80℃下处理冻干的组合物约24小时。
实施例266是一种通过实施例258至265中任一项所述的方法制备的包含血小板或血小板衍生物的组合物。
实施例267是一种在需要其的受试者中治疗凝血相关疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的实施例1至134、255或266中任一项所述的组合物。
实施例268是实施例267的方法，其中所述凝血相关疾病或病症选自由以下组成的群组：冯维勒布兰德氏病(Von Willebrand Disease)、血友病、血栓栓塞症、血小板减少症、血小板减少性紫癜、创伤或其组合。
实施例269是一种在需要其的受试者中治疗凝血相关疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的通过实施例135至254中任一项所述的方法制备的组合物。
实施例270是实施例269所述的方法，其中所述凝血相关疾病或病症选自由以下组成的群组：冯维勒布兰德氏病、血友病、血栓栓塞症、血小板减少症、血小板减少性紫癜、创伤或其组合。
实施例271是一种在需要其的受试者中治疗凝血相关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的通过实施例258至266中任一项所述的方法制备的组合物。
实施例272是实施例271的方法，其中所述凝血相关疾病或病症选自由以下组成的群组：冯维勒布兰德氏病、血友病、血栓栓塞症、血小板减少症、血小板减少性紫癜、创伤或其组合。
实例
实例1.切向流过滤(TFF)法
单采血小板按照标准操作程序进行切向流过滤，包括以下方法步骤：血小板稀释、血小板浓缩和血小板洗涤。
最初将血小板供体单位汇集到共用的容器中。血小板最初可以用或者可以不用酸化的洗涤缓冲液(例如，对照缓冲液)稀释，以减少处理期间的血小板活化。血小板可以经历两种处理途径；先用对照缓冲液洗涤直到达到所需的残余组分(例如，供体血浆)，再浓缩至最终产物浓度之前，或者先将血小板浓缩至最终产物浓度，再用对照缓冲液洗涤直到达到所需的残余组分(例如，供体血浆)。然后将经TFF处理的血小板装入小瓶中，冻干并热处理。
一个特定的方案如下。
对于本实例中TFF方法的所有步骤，使用缓冲液A。该方法在18-24℃的温度下进行。
缓冲液A
组分 值(±1％)
HEPES 7.6mM
NaCl 60mM
KCl 3.84mM
右旋糖 2.4mM
NaHCO<sub>3</sub> 9.6mM
海藻糖 80mM
乙醇 0.8％
聚蔗糖 6％(w/v)
pH 6.6-6.8
将血小板装载到使用Repligen TFF盒(XPM45L01E)制备的TFF(PendoTECH控制器系统)上。用等重量(±10％)的缓冲液A稀释血小板。将血小板浓缩至约2250×103个细胞/μL(±250×103)，然后用大约2个渗滤体积(DV)的缓冲液A洗涤。目标血浆百分比通常小于15％的相对血浆(如通过血浆蛋白含量测定的)。血浆蛋白的去除通过280nm UV吸光度相对于已知相关性进行监测。在洗涤后，如果细胞浓度不是2000×103个细胞/μL(±300×103)，则细胞用缓冲液A稀释或被浓缩至落入该范围内。然后通常将细胞冻干，随后在80℃下热处理24小时，从而形成血栓小体，但有时在冻干前使用细胞(有时被称为血栓小体“pre-lyo”)。血栓小体通常在室温下在10分钟内用水再水合。一般而言，再水合体积等于干燥前用于填充每小瓶血栓小体的体积。
在一些情况下，在与约51％相对血浆体积、约8.1％相对血浆体积、约6.0％相对血浆体积和约1.3％相对血浆读数相关的UV读数下抽取样品。在每个处理步骤中，使用约6.0％及以下的样品对低体积等分试样进行取样。
实例2.测试计划和测定方案
测试计划：
通过实例1中所述的TFF法，按照血小板供应商报告，使用从高αHLA滴度供体采集的单采血小板来生产A批次血栓小体。
采集了单独的供体单位、供体池和沿TFF过程的时间点，用于αHLA测试。将血浆加入到HLA珠中(One Lambda FLOWPRATM筛选试验)，用αIgG二级抗体染色，并通过流式细胞术(Novocyte 3005配置)评估αHLA-IgG结合。
评估了两种珠类型：一种包被有HLA I类抗原，另一种包被有HLA II类抗原。如FLOWPRATM筛选试验说明中所述进行珠门控。根据George King(GK)PPP(贫血小板血浆)阴性对照和单个供体新鲜抽取阴性对照对“αHLA阳性”人群进行门控。在生产后收集额外的阴性对照，以确认这些阳性门控的理想位置。
使用Spherotech COMPtrol补偿珠上与FITC和PE缀合的小鼠IgG来建立补偿设置。HLA II类珠在PE中发出荧光，并且用于IgG检测的二级抗体与FITC缀合。
测定方案：
1.将One Lambda FLOWPRATM筛选试验试剂盒部件解冻至4℃。
2.从每个所需的样品点获得0.2μm过滤的PPP的约1mL等分试样。
3.向1.7mL微量离心管中移液5μL的I类HLA珠和5μL的II类HLA珠。加入20μL过滤的测试血浆。涡旋以混合。
4.在室温下在黑暗中在轻轻摇晃/搅动的情况下，将血浆与HLA包被的珠一起孵育30分钟。
5.用去离子水将10倍清洗缓冲液稀释至1倍工作储液的适当体积。
6.用1mL清洗缓冲液清洗珠。以9,000g×2分钟涡旋并离心，以使珠沉淀。吸取上清液。
7.重复步骤6。
8.用清洗缓冲液将100×αIgG-FITC稀释至1倍工作储液的适当体积。
9.将100μL1倍αIgG-FITC加入到含有经洗涤的HLA珠的管中。涡旋以混合。
10.在室温下，在黑暗中轻轻摇晃/搅动，同时将HLA珠与αIgG-FITC一起孵育30分钟。
11.重复步骤6和7，以洗掉未结合的αIgG-FITC。
12.将洗涤的HLA珠重新悬浮在200μL的PBS中。涡旋以混合。
13.将约100μL的HLA珠悬浮液移液至96孔U形底部微孔板的适当孔中，并停靠在NovoSampler上。
14.使用NovoCyte以通过流式细胞术收集事件。
a.在先前确定的FLOWPRATM珠门控中缓慢收集10,000个事件，其中FSC-H阈值为10,000。
b.二级停止条件为2分钟运行时间和40μL总样品体积。
c.在每份样品之间清洗SIP，以使孔之间的残留最小化。在每个一式三份组之间运行PBS的孔，以使测试点之间的残留最小化。
结果
实例3.门控位置和阴性对照
用于识别I类和II类HLA珠的初始门控位置使用PBS中的FLOWPRATM珠来确定。(图1A和图1B)
使用GK PPP和新鲜供体PPP(一式三份)来建立背景/非特异性结合。(示例性的数据在图2A、图2B、图3A和图3B中示出)。应当注意，与新鲜供体血浆相比，GK PPP在FITC-H上偏移较高。这可能是由于供体可变性或对GK血浆的冷冻/解冻效应。额外的取样是必要的。阳性门控被放置成使得＜1％的GK PPP返回FITC阳性。
实例4.单个供体结果
针对每个样品给出了来自每个HLA类别的代表性FITC-H直方图。阳性＞1％为阳性。相对于GK PPP阴性对照(I类和II类珠FITC-H强度)报告了荧光比率。荧光比率＞1.0为阳性。随着额外的阴性对照被收集，这些阳性门控和荧光比率将被更新。
如果对于该珠类型阳性百分比和荧光比率均≤1，则群体对于HLA I类或II类抗体均为阴性。
1号供体：HLA II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为0.2％，其中荧光比率为0.3；II类的平均阳性率为16.5％，其中荧光比率为1.6。(示例性的数据在图4A和图4B中示出)。
2号供体：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为1.3％，其中荧光比率为1.4；II类的平均阳性率为20.3％，其中荧光比率为1.9。(示例性的数据在图5A和图5B中示出)。
3号供体：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为85.2％，其中荧光比率为14.4。II类的平均阳性率为12.0％，其中荧光比率为0.8。(示例性的数据在图6A和图6B中示出)。
4号供体：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为83.5％，其中荧光比率为14.5。II类的平均阳性率为12.6％，其中荧光比率为0.8。(示例性的数据在图7A和图7B中示出)。
5号供体：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为4.9％，其中荧光比率为1.2。II类的平均阳性率为1.3％，其中荧光比率为0.8。(示例性的数据在图8A和图8B中示出)。
6号供体：HLA I类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为2.7％，其中荧光比率为0.9。II类的平均阳性率为0.3％，其中荧光比率为0.7。(示例性的数据在图9A和图9B中示出)。
7号供体：HLA II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为0.7％，其中荧光比率为0.5。II类的平均阳性率为9.0％，其中荧光比为1.3。(示例性的数据在图10A和图10B中示出)。
在表1中还示出了供体1-7的结果。
表1.
Figure BDA0003452031070000761
由于在GK PNP池中可能存在HLA阳性供体，表2示出了相对于N＝1的HLA阴性供体的结果。
表2.
Figure BDA0003452031070000762
实例5.过滤结果
池：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为61.1％，其中荧光比率为4.6。II类的平均阳性率为9.0％，其中荧光比率为1.1。(示例性的数据在图11A和图11B中示出)。
初始稀释(51％)：HLA I类和II类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为48.2％，其中荧光比率为4.2。II类的平均阳性率为5.9％，其中荧光比率为0.9。(示例性的数据在图12A和图12B中示出)。
“20％”血浆(8.1％)：HLA I类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为2.4％，其中荧光比率为1.0。II类的平均阳性率为0.2％，其中荧光比率为0.5。(示例性的数据在图13A和图13B中示出)。
“＜10％”血浆(6.0％)：临界HLA类阳性。来自I类的三份数据的平均阳性率为1.1％，其中荧光比率为1.0。II类的平均阳性率为0.2％，其中荧光比率为0.5。(示例性的数据在图14A和图14B中示出)。
“＜3％”血浆(1.3％)：HLA阴性。来自I类的三份数据的平均阳性率为0.4％，其中荧光比率为0.2。II类的平均阳性率为0.1％，其中荧光比率为0.4。(示例性的数据在图15A和图15B中示出)。
过滤结果也在表3A和3B中示出。
表3A.
Figure BDA0003452031070000771
表3B.在计算平均荧光强度的降低百分比(抗体结合减少的一种量度)之前，从样品荧光中减去使用PBS中的HLA珠测定的背景荧光。
Figure BDA0003452031070000772
值≥100％表明与指定珠结合的可检测HLA抗体完全减少。
由于在GK PNP池中可能存在HLA阳性供体，表4示出了相对于N＝1的HLA阴性供体的结果。
表4.
Figure BDA0003452031070000781
实例6.表面标记物和凝血酶生成。
通过实例1中所述的TFF法来生产血栓小体批次，并使用流式细胞术测定细胞表面标记物表达。
使用流式细胞术来评估血栓小体中CD41、CD62和磷脂酰丝氨酸(PS)的表达。在染色期间，样品包含大约270,000/μL的血栓小体，并且在血细胞计数器中分析样品之前，先将样品稀释约1:34。将血栓小体样品再水合，并在去离子水中以1:2稀释。通过将47.6μL的抗体添加至52.4μL的HMTA中来稀释抗CD41的储备液。通过向10μL的HMTA和10μL稀释的CD41抗体中加入10μL稀释的血栓小体来制备用抗CD41染色的样品。通过将12μL的抗CD62与23.8μL的抗CD41和64.2μL的HMTA组合来制备抗CD62主混合物。以相同方式来制备同种型对照混合物。通过向20μL的抗CD62主混合物中加入10μL稀释的血栓小体来制备用抗CD62染色的样品。同种型主混合物用于以相同方式来制备同种型对照样品。通过将11.7μL的AV与83.3μL的抗CD41和80μL的HMTA组合来制备膜联蛋白V(AV)主混合物。通过将20μL的含有50mM GPRP的稀释的血栓小体添加到20μL的含有15mM CaCl2和20μL的AV主混合物的HMTA中来制备用AV染色的样品。使用不含钙的HMTA以相同方式来制备阴性门控对照样品，以防止AV与PS结合。所有样品均在室温下孵育20分钟。在孵育后，向所有样品中加入1mL的HBS。用于稀释AV测试样品的HBS包含5mM CaCl2。使用抗CD41结合来鉴定目标群体。通过CD41阳性人群中的抗CD62和AV结合来评估CD62表达和PS表达。
使用抗CD41抗体(4.8μL，Beckman Coulter part#IM1416U)来测定糖蛋白IIb(GPIIb，也被称为抗原CD41)的表达。测定的血栓小体显示CD41阳性(表5；图16)
表5.
Figure BDA0003452031070000782
Figure BDA0003452031070000791
使用膜联蛋白V(AV)(1.3μL,BD Biosciences目录号550475)来测定磷脂酰丝氨酸(PS)的表达。AV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白。测定的血栓小体显示AV阳性(表6；图17)。
表6.
批次 AV阳性(％)
1 96.7
2 89.9
3 95.3
4 95.4
5 95.9
6 96.2
7 93.5
平均值 94.7
使用抗CD62P抗体(2.4μL，BD Bioscience目录号550888)来测定P-选择素(也被称为CD62P)的表达。测定的血栓小体显示CD62阳性(表7，图18)
表7.
批次 CD62阳性(％)
1 94.2
2 93.1
3 89.8
4 92.4
5 92.5
6 87.3
7 90.7
平均值 91.4
使用以下方案，在含有组织因子和磷脂的PRP试剂的存在下，以4.8×103个血栓小体/μl来测量凝血酶生成。血栓小体样品的凝血酶峰高(TPH)平均为60.3nM。使用脑磷脂作为阳性对照。(表8；图19)
对于每个测试的小瓶，使用对照缓冲液中的30％的Octaplas溶液，基于流式细胞术颗粒计数，将血栓小体的再水合样品稀释至7,200个颗粒/μL。在96孔板中，通过添加20μL的PRP试剂(Diagnostica Stago目录号86196)和80μL稀释的血栓小体来产生样品孔。通过将20μL的凝血酶校准品试剂(Diagnostica Stago目录号86197)添加到80μL稀释的血栓小体中来产生校准品孔。将板装入板读取器中，并在40℃下在黑暗中孵育10分钟。在样品孵育期间，通过将40μL的FluCa底物(Diagnostica Stago目录号86197)加入到1.6mL的加热至37℃并涡旋混合的Fluo-Buffer(Diagnostica Stago目录号86197)中制备FluCa溶液。将FluCa溶液抽吸到分配注射器中，并将20μL机械分配到每个反应孔中，使每个孔中的最终血栓小体浓度达到4,800个颗粒/μL，并且开始凝血酶生成反应。在75分钟的时间内，通过荧光在每个孔中测量凝血酶生成量。
示例性的逐步方案如下：
1.打开CAT软件；设置仪器；并根据制造商指南准备PRP试剂(包括组织因子和一些磷脂)、校准品、荧光缓冲液和荧光底物。
2.将Octaplas和TGA稀释缓冲液在37℃水浴中解冻10分钟。
3.将解冻的Octaplas添加到TGA稀释缓冲液中，以制成含有30％的Octaplas的缓冲液。
4.使用30％的Octaplas混合物以1:50稀释重组的脑磷脂，用作阳性对照。
5.用细胞培养级水将血栓小体再水合10分钟，然后用30％的Octaplas稀释至7,200个血栓小体/μL。
6.使用多通道移液器，向每个测试孔中加入20μL的PRP试剂。向每个校准孔中添加20μL的校准品。
7.将80μL的样品添加到每个测试和校准孔中。将80μL的30％的Octaplas添加到阴性对照孔中，并且将1:50脑磷脂添加到阳性对照孔中。
8.将板插入托盘中并在40℃下孵育10分钟。在孵育后，将荧光缓冲液和荧光底物混合物(包括荧光标记的肽，当被凝血酶切割时其会产生荧光信号)分配到活性孔中。
9.以20秒的间隔读取板75分钟以获取完整的凝血酶生成谱。
表8.
Figure BDA0003452031070000801
Figure BDA0003452031070000811
在表9中汇总了来自这些测定的数据。
表9.
Figure BDA0003452031070000812
1如使用流式细胞术前向散射上的尺寸节拍所评估的颗粒直径。
实例7.9F9和PAC-1结合。
活化的血小板的聚集由GPIIb/IIIa复合物的形成介导，所述复合物可以结合至纤维蛋白原(也被称为因子1)并形成凝块。GPIIb/IIIa是血小板纤维蛋白原受体，也被称为CD41/CD61复合物。在此过程中，ADP促进了GPIIb/IIIa复合物的活性形式。抗体9F9结合至与细胞膜相关的纤维蛋白原。因此，细胞膜上纤维蛋白原的存在表明血栓小体能够形成血凝块。
使用10mL的去离子水将根据实例1制备的一小瓶血栓小体再水合。使用HMTA(HEPES修饰的Tyrode’s蛋白)将血栓小体的等分试样稀释至1×105个颗粒/μL的最终浓度。如表11所示制备样品。通过将10μL稀释的血栓小体加入到20μL的HMTA中来制备未染色的样品。通过将10μL稀释的血栓小体加入到10μL的同种型对照抗体(BD Biosciences目录号555748)和10μL的HMTA中来制备FITC同种型对照样品。通过将10μL稀释的血栓小体加入到10μL的9F9抗体(BD Biosciences目录号340507)和10μL的HMTA中来制备用9F9染色的样品。通过将10μL稀释的血栓小体加入到5μL的同种型对照抗体和15μL的HMTA中来制备用PAC-1染色的样品。使用每个反应混合物总计1×106个颗粒，一式两份制备所有样品。将样品在室温下避光孵育20分钟。在孵育后，所有样品用1mL的HBS稀释，并且使用ACEA NovoCyte流式细胞仪采集。由PAC-1产生的荧光信号用于确定在没有结合的纤维蛋白原的情况下活化的GPIIb/IIIa受体的表达。来自9F9的荧光信号用于确定纤维蛋白原与血栓小体上的表面受体的结合。
HTMA(HEPES修饰的Tyrode’s白蛋白)。
Figure BDA0003452031070000821
表10.
未染色的 FITC Iso 9F9 PAC-1
细胞(uL) 10 10 10 10
HMTA(uL) 20 10 10 15
抗体(uL) 0 10 10 5
通过流式细胞术来测定样品，并且证明在再水合后存在表面结合的纤维蛋白原(图20)，而抗PAC-1抗体显示无显著的结合(图21)。这进一步证明，通过TFF制备的血栓小体包括与活性形式的GPIIb/GPIIIa结合的纤维蛋白原，因为PAC-1与同一复合物结合。
实例8.CD47结合的评价
CD47是用于自我识别的细胞表面标记物。在一些情况下，缺少这一标记物会导致吞噬作用。
将一小瓶如实例1所述制备的血栓小体用10mL注射用无菌水再水合，并用与太平洋蓝(Pacific Blue)(BD Biosciences目录号561564)或相应的同种型对照(BDBiosciences目录号560373)缀合的增加体积的抗CD47抗体染色。所有样品均含有100万个细胞。这一滴定产生的最大荧光信号相对于背景是约5倍(图22A)，并且总体CD47阳性率为约40％(表12)。在图22B中示出了示例性的直方图。
以1:10、1:5和1:2的HMTA稀释度来制备与V450缀合的CD47抗体的等分试样。使用AcT diff 2测定血栓小体样品的初始浓度，并使用HMTA将1mL等分试样的浓度调整至100×103/μL。通过向10μL稀释的血栓小体中加入10μL的抗体，在每次抗体稀释时对TFF血栓小体以一式两份进行染色。以相同方式产生用未稀释的抗体染色的样品。通过向10μL稀释的血栓小体中加入10μL的HMTA来制备未染色的对照样品。使用同种型对照抗体代替抗-CD47来重复此样品制备。所有样品在室温避光下孵育20分钟。在孵育后，用500μL的HBS稀释样品，并使用ACEA NovoCyte流式细胞仪对每个样品采集15,000个事件。测试样品中的V450荧光用于评估血栓小体表面上与CD47结合的抗体。使用同种型对照样品的V450荧光来监测非特异性结合。
表11示出了含有不同量抗体(抗-CD47或同种型对照)的样品的平均荧光强度。
表11.
Figure BDA0003452031070000831
表12示出了不同浓度的抗CD47抗体的CD47阳性百分比。
表12.
Figure BDA0003452031070000832
将来自不同批次的第二小瓶TFF血栓小体再水合，并用与太平洋蓝或相应的同种型对照缀合的增加体积的抗CD47进行染色。所有样品包含250,000个细胞。同样，荧光信号相对于背景为约5至6倍(图22C)，并且总体CD47阳性为约50％(表15)。在图22D中示出了示例性的直方图。
使用增加量的抗体和减少数量的每个样品的血栓小体，对新的TFF血栓小体样品进行第二轮测试，以便改善由抗-CD47与血栓小体结合引起的信号强度。使用AcT diff 2测定血栓小体样品的初始浓度，并使用HMTA将1mL等分试样的浓度调整为25×103/μL。根据下表13，用增加量的抗体对样品以一式两份进行染色。每份样品的最终体积保持恒定在40μL。每份样品中的血栓小体的总数量保持恒定在250×103/μL。使用同种型对照抗体代替抗-CD47来重复此样品制备。
表13.
血栓小体的体积 AB的体积(μL) HMTA的体积(μL) 总计
10 0 30 40
10 5 25 40
10 15 15 40
10 25 5 40
10 30 0 40
所有样品在室温避光下孵育20分钟。在孵育后，用500μL的HBS稀释样品，使用ACEANovoCyte流式细胞仪对每个样品采集15,000个事件。测试样品中的V450荧光用于评估抗体与血栓小体表面上的CD47的结合。使用同种型对照样品的V450荧光来监测非特异性结合。
表14示出了含有不同量的抗体(抗-CD47或同种型对照)的样品的平均荧光强度。
表14.
Figure BDA0003452031070000841
表15示出了不同浓度的抗CD47抗体的CD47阳性百分比。
表15.
Figure BDA0003452031070000842
实例9.微粒含量减少
使用动态光散射比较了与根据实例1制备(但未冻干)的血栓小体相比的人类保质期储存的血小板(hIDSP)的微粒含量。结果在图23A-C和表16中示出。图23A-C是直方图，其被归一化为相对强度，使得每个数据点的强度总和等于1.0。例如，如果特定的数据点具有0.1的y轴值，则通常可以解释为该数据点占样品散射强度的10％。
对用于制造一批血栓小体的单采单元池进行分析。此样品类型被表示为“hIDSP”。取此hIDSP(人类保质期储存的血小板)池的1mL等分试样用于动态光散射(DLS；Thrombolux-Light Integra)分析。然后将来自该等分试样的样品抽入毛细管中并插入DLS仪器中。将毛细管在仪器中放置1分钟，以允许温度和移动达到平衡。机器的内部温度为37℃。在平衡1分钟后，选择样品的粘度设置。DLS仪器具有用于血浆中样品的内置粘度设置，例如单采单元。该粘度设置用于hIDSP样品。此设置的粘度为1.060cP(厘泊)。在选择血浆粘度设置后，对样品进行分析。从同一份hIDSP等分试样中，将第2份和第3份样品抽取到毛细管中，并使用该hIDSP方案进行分析，以进行一式三份分析。然后根据数据确定微粒百分比。
“Pre-Lyo”样品是来自血栓小体制造过程的过程中样品。此样品类型是刚好在冻干前采集的材料。进行了样品的粘度测量，以便使用DLS分析这些样品。粘度计(RheosenseμVISC)具有内置烘箱，用于将样品加热至DLS仪器的温度(37℃)。在进行样品的粘度分析前，必须将烘箱加热至37℃。为了测定pre-lyo样品的粘度，将400-350μL的样品抽入注射器并插入粘度计中。在将样品插入粘度计中后，仪器温度需要再次达到37℃。在烘箱达到37℃后，使用AUTO上的所有设置(除了设置为400μL的“测量体积”外)来分析样品。此粘度用于同一样品的DLS测量。取此pre-lyo样品的1mL等分试样用于动态光散射(DLS；Thrombolux-LightIntegra)分析。然后将来自此等分试样中的样品抽入毛细管中并插入DLS仪器中。将毛细管在仪器中放置1分钟，以允许温度和移动达到平衡。机器的内部温度为37℃。在平衡1分钟后，将先前测量的粘度置于DLS仪器的粘度设置中。在输入粘度后，对样品进行分析。从相同的pre-lyo等分试样中，将第2份和第3份样品抽取到毛细管中，并使用此Pre-Lyo方案进行分析，以进行一式三份分析。然后根据数据确定微粒百分比。
根据标准方案对血栓小体进行再水合，并在SeraSub(CST Technologies,Inc.)和ACD的混合物中以1:5稀释。SeraSub/ACD稀释剂由1:9的在SeraSub中的ACD稀释液组成。制备1mL的1:5稀释的血栓小体用于通过DLS进行分析。将血栓小体稀释样品抽入毛细管中并插入DLS仪器中。将毛细管在仪器中放置1分钟，以允许温度和移动达到平衡。机器的内部温度为37℃。在平衡1分钟后，选择样品的粘度设置。用于样品的粘度为1.200cP。在输入粘度后，对样品进行分析。将第2、第3和第4份样品抽取到毛细管中，并使用该血栓小体方案进行分析，以进行一式四份分析。然后根据数据(和血小板半径，如适用)来确定微粒百分比。
表16.
批次号 hIDSP％MP Pre-Lyo％MP
批次J 9.47％ 0.49％
批次K 7.55％ 0.65％
批次L 7.73％ 0.59％
平均值 8.25％ 0.58％
在另外的实验中，使用动态光散射(DLS)比较了与根据实例1制备的再水合的血栓小体相比的人保质期储存的血小板(hIDSP)的微粒含量。在图24A-C和表17中示出了结果。
表17.
Figure BDA0003452031070000861
实例12.代谢物分析
表18示出了在如实例1所述的血栓小体制备过程中存在的pH和代谢物的分析，包括在初始稀释之后、在血小板衍生物被浓缩之后以及在渗滤过程结束之后的血小板原材料的分析，如使用i-STAT手持式血液分析仪和CG4+滤芯测定的。
用于iStat分析的血小板样品在不同处理步骤中以小体积(1ml)采集。在将血小板供体单位汇集在一起之后但在进行任何处理之前，采集了用于iStat分析的命名为“原材料”的初始样品。命名为“初始稀释”，在对血小板进行TFF处理之前，用对照缓冲液以1:1稀释汇集的血小板单位。在TFF的浓缩阶段结束时，从血小板产品中抽取“浓缩结束”样品。在洗涤细胞后，抽取“DV结束(Pre-Lyo)”样品作为进入冻干机的产品的代表。
表18.
Figure BDA0003452031070000871
实例11.病原体减少
在血液产品中病原体的减少通常是期望的。一种减少病原体的方法涉及使用光敏核酸嵌入化合物，以在用适当波长照射时改变病原体的核酸。
Figure BDA0003452031070000872
系统(由Cerus制造)使用amotosalen(一种在用UVA照射时在核酸中形成交联的核酸嵌入化合物)。在表19中示出了用于此系统的示例性参数，并且在图25A中示出了系统的示意图，而在图25B-C中示出了在198分钟内2.6L的加工材料的示例性加工数据(大约14/分钟平均值)。
如实例9所述进行DLS。
表19.
Figure BDA0003452031070000873
Figure BDA0003452031070000881
在表20中示出了如实例1中制备的血栓小体在使用或不使用
Figure BDA0003452031070000884
系统处理的情况下的pH和代谢物的示例性比较数据。
表20.
Figure BDA0003452031070000882
功能表征(AcT计数和聚集参数)和细胞表面标记物的示例性比较数据显示在表21(hIDSP)、22(在冻干之前)和表23(在10mL注射用无菌水中冻干和再水合至约1.8×106/μL的浓度后(单独的样品计数在表23中示出)。
表21.
Figure BDA0003452031070000883
Figure BDA0003452031070000891
表22.
Figure BDA0003452031070000892
表23.
Figure BDA0003452031070000893
如实例9所述，还测定了在血栓小体制备的各阶段的微粒含量。图26A-B示出了在有和没有病原体减少处理的情况下制备的再水合的血栓小体的相似性。在表24中示出了这些数据的汇总。图27A示出了在有或没有病原体减少处理的情况下hiDSP的微粒含量。图27B-C比较了图29A所示的hiDSP和由其制备的再水合的血栓小体的微粒含量。在表25中示出了这些数据的汇总。图28A示出了在有或没有病原体减少处理的情况下hiDSP的微粒含量。图28B-C比较了图28A所示的hiDSP和由其制备的再水合的血栓小体的微粒含量。在表26中示出了这些数据的汇总。
表24.
Figure BDA0003452031070000901
表25.
Figure BDA0003452031070000902
表26.
Figure BDA0003452031070000903
Figure BDA0003452031070000911
实例12.血小板和血栓小体之间的相互作用。
在本实例中，“血小板”是在采集后约3小时从柠檬酸化的全血中分离的血小板。血栓小体是批次D，其通过实例1中所述的方法制备。表27是本实例中实验的样品布局。
表27.
Figure BDA0003452031070000912
血小板和血栓小体共聚集通过光透射聚集测定法进行评估。用4β-佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)通过聚集测定法+/-血小板活化来共孵育和评价血小板和血栓小体。对于从全血中分离的新鲜血小板，使用100ng/mL的PMA。对于储存的血小板(即单采血小板)，使用1000ng/ml的PMA。
从ACD抗凝全血中分离新鲜血小板，洗涤，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。根据标准方案对血栓小体进行再水合，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。将HMTA中的血小板和HMTA中的血栓小体的各等分试样以等比例混合。响应于佛波醇-肉豆蔻酸酯-乙酸酯(PMA；100ng/mL)活化，通过光透射聚集测定法(Helena AggRAM)来评估血小板、血栓小体和混合的样品。混合的样品在使用和不使用搅拌棒的情况下进行评估，以评估搅拌诱导的剪切对观察到的血小板-血栓小体共聚集的影响。
图29A示出了表30中样品在有激动剂和没有激动剂情况下的透射率。正剪切和负激动剂(黑色)混合，血栓小体和新鲜抽取的血小板诱导血小板活化和聚集。PMA(灰色)活化的血小板和Δ透射率的幅度表明与血栓小体混合聚集。在没有剪切的情况下，没有活化或共聚集小于图29A中观察到的幅度。
还评估了聚集测定前和聚集测定后的血小板和血栓小体AcT计数。图29B示出了聚合后的计数。白条大于其他条的情况表明血栓小体合并到血小板聚集体中。对于没有激动剂的情况(黑色)，颗粒计数的绝对减少尤其显著且出乎意料。
还评价了剪切对聚集的影响。在使用和不使用搅拌棒的情况下重复混合聚集测定法(1:1血小板：血栓小体(按计数))。结果显示在图29C中。这些结果表明，在不存在血小板激动剂的情况下，剪切对于可观察到的共聚集是必要的。与缓冲液相比，在血浆中测量的计数和共聚集+/-激动剂的幅度略有降低。
实例13.用GPRP抑制纤维蛋白捕获。
在本实例中，“血小板”在收集后约1小时从全血中分离。血栓小体是批次H，其通过实例1中描述的方法制备。
从ACD抗凝全血中分离新鲜血小板，洗涤，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。根据标准方案对血栓小体进行再水合，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。将HMTA中的血小板和HMTA中的血栓小体的各等分试样以等比例混合。每组血小板、血栓小体或混合的悬浮液均等地分配；一组用1mM的GPRP处理以抑制纤维蛋白聚合，一组保持未处理。肽Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP；Sigma-Aldrich货号G1895)是一种防止纤维蛋白聚合的肽。响应于凝血酶(2.5U/mL)活化，通过光透射聚集测定法(Helena AggRAM)来评估血小板、血栓小体和混合的样品。
图30示出了在存在或不存在GPRP(1mM)的情况下使用血小板、血栓小体以及血小板和血栓小体的2:1和1:1混合物(均被凝血酶活化)的共聚集实验的结果。在混合情况下，总的测量的聚集随着血栓小体群体的增加而减少，这表明血小板和血栓小体的相互作用部分地是由纤维蛋白捕获引起的。然而，大部分共聚集相互作用是血小板介导的，并且不依赖于纤维蛋白捕获，如甚至用GPRP通过高的测量的聚集所证明的。
实施例12-13显示在有(以及在较小程度上，没有)血小板活化的情况下，血小板和血栓小体在剪切下共聚集。纤维蛋白聚合抑制剂GPRP仅轻微抑制凝血酶活化后的血小板-血栓小体共聚集。
实例14.共聚集的RGDS抑制。
在本实例中，“血小板”在收集后约1小时从全血中分离。血栓小体是批次H，其通过实例1中描述的方法制备。
从ACD抗凝全血中分离新鲜血小板，洗涤，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。根据标准方案对血栓小体进行再水合，并在HMTA中稀释至250,000个细胞/μL。将HMTA中的血小板和HMTA中的血栓小体的各等分试样以等比例混合。每组血小板、血栓小体或混合的悬浮液均等地分配；一组用100μM的RGDS处理以抑制纤维蛋白原与血小板的结合，一组保持未处理。RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser；Cayman Chemical货号15359)是一种结合血小板表面整联蛋白，特别是GPIIb/IIIa的肽序列。它抑制血小板与纤维蛋白原和其他粘附蛋白的结合。响应于佛波醇肉豆蔻酸酯-乙酸酯(PMA；100ng/mL)活化，通过光透射聚集测定法来评估血小板、血栓小体和混合的样品。
用100μM的RGDS进行共聚集实验并用PMA活化以研究相互作用是否由血小板与血栓小体之间的纤维蛋白原桥接引起。结果在图31中示出。RGDS阻断了＞50％的测量的共聚集，表明血小板与血栓小体之间的相互作用在很大程度上可能是由纤维蛋白原结合引起的。
实施例12-14示出了血栓小体容易与活化的血小板共聚集(例如，如光透射聚集测定法所证明的)。自发共聚集是由剪切引起的。血小板-血栓小体的相互作用在缓冲液和血浆中都很明显。虽然共聚集基本上不被GPRP抑制，但共聚集却被RGDS基本上抑制。这表明活性血小板-纤维蛋白原结合在共聚集机制中的关键作用，并且共聚集不仅仅由被动纤维蛋白捕获引起。
实例15.扫描电子显微镜(SEM)。
将再水合的血栓小体的10mL等分试样以2000RPM离心30分钟。将离心机样品的上清液移除至1mL并丢弃。轻轻搅动样品以重新悬浮血栓小体。浓缩的血栓小体用在pH为7.4的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中的3％戊二醛处理2小时，其中每15分钟搅拌一次。将血栓小体用无菌水冲洗三次，并转移到1％四氧化锇溶液中持续1小时，其中每15分钟搅拌一次。然后用无菌水冲洗样品超过三次，并将0.5mL液滴转移到聚砜滤膜上。安装的样品用液氮冷冻并在真空下干燥，然后使用扫描电子显微镜进行金溅射和成像。
图32A-D显示血小板和人血栓小体的SEM。新鲜活化的血小板显示在图32A(比例尺＝2μm)和图32B(比例尺＝1μm)中。如实例1中制备的再水合的人血栓小体显示在图32C(比例尺＝2μm)和图32D(比例尺＝1μm)中。
实例16.
Figure BDA0003452031070000931
血栓小体数据。
在总血栓形成分析系统(
Figure BDA0003452031070000932
FUJIMORI KOGYO CO.,LTD)中，使用矿物油迫使样品通过胶原包被的微通道。压力的变化用于评估血栓形成。闭塞开始时间是达到Δ10kPa所需的时间，而闭塞时间＝使用AR芯片(Zacros货号TC0101)达到每个Δ80kPa所需的时间。
根据FUJIMORI KOGYO CO.,LTD，AR芯片可以用于分析主要由纤维蛋白和活化的血小板组成的混合白色血栓的形成。它具有包被有胶原蛋白和组织因子的流动路径(300μm宽×50μm高)，并且可以用于分析凝血功能和血小板功能。相比之下，PL芯片可以用于分析主要由活化的血小板组成的血小板血栓的形成。PL芯片具有仅包被有胶原蛋白的流动路径并且可以用于分析血小板功能。
Figure BDA0003452031070000941
试剂(CaCTI，AR芯片)被加热到37℃，并且根据标准方案使血栓小体再水合。通过以3900g×10分钟离心来洗涤再水合的血栓小体的等分试样，并在柠檬酸钠抗凝贫血小板血浆(PPP)中重新悬浮至约300,000个细胞/μL。将CaCTI(20μL)与PPP(480μL)中的血栓小体混合，并在高剪切下穿过T-TAS AR芯片。在30分钟内监测系统中的压力，或直到达到通道中的最大背压。
根据制造商的说明准备使用
Figure BDA0003452031070000942
仪器。将AR芯片(Diapharma目录号TC0101)和AR Chip钙玉米胰蛋白酶抑制剂(CaCTI；Diapharma目录号TR0101)加热至室温。将300uL的再水合的血栓小体转移到1.7mL微量离心管中，并以3900g×10分钟离心以沉淀。将血栓小体沉淀重新悬浮在George King(GK)汇集的正常人血浆或包含或不包含自体血小板的自体血浆中至大约100,000-450,000/uL的浓度，如通过AcT计数(Beckman Coulter AcT Diff2Cell Counter)测定的。将20uL的CaCTI与GK血浆中的480uL的血栓小体样品通过轻柔移液混合。根据制造商的说明，在
Figure BDA0003452031070000943
上加载和运行样品。
表28示出了在根据制造商的说明使用AR芯片和高剪切仪器设置运行的实验中来自柠檬酸化全血、补充有如实例1中制备的不同浓度的血栓小体的减少血小板的柠檬酸化全血和补充有如实例1中制备的不同浓度的血栓小体的George King贫血小板血浆(GKPPP)的
Figure BDA0003452031070000944
结果。
表28.
Figure BDA0003452031070000945
Figure BDA0003452031070000951
*测试在快速下降之前达到约75kPa的峰值。可能的错误结果。
Figure BDA0003452031070000952
测试超时。
在图33A-B中示出了经过时间的结果。如通过缩短的闭塞时间所测量的，增加血小板减少的全血中血栓小体的浓度促进了更稳健的血栓形成(图33A)。如通过缩短的闭塞时间所测量的，增加贫血小板血浆(PPP)中血栓小体的浓度促进了更稳健的血栓形成(图33B)。
还测定了GPRP(1mM)对闭塞活性的影响。表29示出了在存在和不存在GPRP的情况下，有和没有血栓小体的贫血小板血浆的
Figure BDA0003452031070000953
结果。添加GPRP以防止纤维蛋白原形成并不能阻止含有血栓小体的样品达到闭塞压力。虽然向血浆中的血栓小体样品中添加GPRP阻止了微毛细血管通道中纤维蛋白的形成(图33C(无GPRP)和33D(GPRP)，均在GK PPP中)，但向血栓小体(PPP)中添加GPRP并没有防止血栓形成(图33E)。
表29.
Figure BDA0003452031070000954
Figure BDA0003452031070000955
测试超时
虽然本发明的实施例可以有各种修改和替代形式，但是特定的实施例已经通过附图中的示例示出，并且在下面详细描述。然而，目的不是将本发明限制于所描述的特定实施例。相反，本发明旨在覆盖落入如由所附权利要求限定的本发明范围内的所有修改、等同物和替代物。

Claims (53)

1.一种用于制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物的方法，所述方法包括：
对包含血小板的起始材料、包含血小板的稀释的起始材料、浓缩的血小板组合物或其组合进行切向流过滤(TFF)，从而制备包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物，
其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括病原体减少步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病原体减少步骤在TFF之前。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述起始材料具有约60至约80mg/mL的蛋白质浓度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中TFF包括用至少两个渗滤体积渗滤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中TFF包括用包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的制剂渗滤。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中TFF包括将缓冲液交换成包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂的制剂。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的方法，其中所述制剂包含缓冲剂、碱、和负载剂，所述缓冲剂包含4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，所述碱包含碳酸氢钠，所述负载剂包含海藻糖、聚蔗糖或其组合。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述制剂包含有机溶剂，所述有机溶剂包含乙醇、DMSO或其组合。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述水性介质的蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约15％。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述水性介质的蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约7％至约10％。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述组合物包含小于5.0％(以散射强度计)的微粒。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述组合物包含小于4.0％(以散射强度计)的微粒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，进一步包括冻干和/或低温冷冻保存包含血小板或血小板衍生物的所述组合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，进一步包括热处理包含血小板或血小板衍生物的所述组合物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少55％的CD41阳性百分比。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD42阳性百分比。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少70％的膜联蛋白V阳性百分比。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少8％的CD47阳性百分比。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD62阳性百分比。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有与所述细胞膜结合的纤维蛋白原。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中当存在含有组织因子和磷脂的试剂时，所述血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少25nM的凝血酶峰高(TPH)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物具有每106个颗粒至少1.5个凝血酶生成效力单位(TGPU)的效力。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于14分钟的闭塞时间。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述血小板衍生物包括血栓小体。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述起始材料是：
a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阳性；
b)基于监管机构批准的测试，对HLA II类抗体呈阳性；
c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阳性；或者
d)a)、b)和c)中的一种或多种。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述组合物：
a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阴性；
b)基于监管机构批准的测试，对HLA II类抗体呈阴性；
c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阴性；或者
d)a)、b)和c)中的一种或多种。
30.一种通过权利要求1至29中任一项所述的方法制备的包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物。
31.一种包含血小板或血小板衍生物和水性介质的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的50％。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的30％。
33.根据权利要求31至32中任一项所述的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度小于或等于供体单采血浆的蛋白质浓度的10％。
34.根据权利要求31至32中任一项所述的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约5％至约15％。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的组合物，其中所述水性介质的蛋白质浓度为供体单采血浆的蛋白质浓度的约8％至约10％。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的组合物，其中所述水性介质进一步包含缓冲剂、碱、负载剂、任选地盐和任选地至少一种有机溶剂。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述水性介质包含缓冲剂、碱和负载剂，所述缓冲剂包含4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，所述碱包含碳酸氢钠，所述负载剂包含海藻糖、聚蔗糖或其组合。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述水性介质包含有机溶剂，所述有机溶剂包含乙醇、DMSO或其组合。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于5.0％(以散射强度计)的微粒。
40.根据权利要求31至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于4.0％(以散射强度计)的微粒。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少55％的CD41阳性百分比。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD42阳性百分比。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少70％的膜联蛋白V阳性百分比。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少8％的CD47阳性百分比。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有至少80％的CD62阳性百分比。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有与所述细胞膜结合的纤维蛋白原。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的组合物，其中当存在含有组织因子和磷脂的试剂时，所述血小板或血小板衍生物当在约4.8×103个颗粒/μL的浓度下时产生至少50nM的凝血酶峰高(TPH)。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物具有每106个颗粒至少1.5个凝血酶生成效力单位(TGPU)的效力。
49.根据权利要求31至48中任一项所述的组合物，其中所述血小板或血小板衍生物当在至少约70×103个颗粒/μL的浓度下时，在总血栓形成分析系统(T-TAS)测定中产生小于14分钟的闭塞时间。
50.根据权利要求31至49中任一项所述的组合物，其中所述血小板衍生物包含血栓小体。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的组合物，其中所述组合物：
a)基于监管机构批准的测试，对HLA I类抗体呈阴性；
b)基于监管机构批准的测试，对HLA II类抗体呈阴性；
c)基于监管机构批准的测试，对HNA抗体呈阴性；或者
d)a)、b)和c)中的一种或多种。
52.一种在需要其的受试者中治疗凝血相关疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求30至51中任一项所述的组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述凝血相关疾病或病症选自由以下组成的群组：冯维勒布兰德氏病(Von Willebrand Disease)、血友病、血栓栓塞症、血小板减少症、血小板减少性紫癜、创伤或其组合。
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