ITRM20130054A1 - Piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e microparticelle derivate da dette piastrine trasfettate, metodo per la loro preparazione e loro usi. - Google Patents

Description

Piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e microparticelle derivate da dette piastrine trasfettate, metodo per la loro preparazione e loro usi

La presente invenzione riguarda piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e microparticelle derivate da dette piastrine trasfettate, metodo per la loro preparazione e loro usi. Più in particolare, l’invenzione concerne piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e microparticelle derivate da dette piastrine trasfettate aventi una elevata percentuale di trasfezione e in grado di veicolare e trasfettare cellule accettrici con materiale genetico e quindi di essere impiegate ad esempio in terapia genica. L’invenzione concerne ulteriormente un metodo per la preparazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e microparticelle derivate da dette piastrine trasfettate che consente di ottenere elevate percentuali di trasfezione.

I micro RNA, e il loro corrispettivo sintetico i siRNA, sono piccoli RNA non codificanti che rappresentano un importante meccanismo di regolazione dell’espressione genica a livello post-trascrizionale mediante la repressione della traduzione o l’induzione del decadimento di specifici mRNA.

E’ noto che l’utilizzo di siRNA per uso terapeutico necessita di metodi sempre più efficienti per la veicolazione di questi ultimi nel circolo sanguigno (Yoo et al, Bio-inspired, bioengineered and biomimetic drug delivery carriers, Nature Review, Vol 10; 2011). A questo scopo sono stati sviluppati metodi che utilizzano come veicolo batteri, virus, strutture sintetiche artificiali (micelle, microsomi, ecc.) ed anche cellule umane (eritrociti, macrofagi, linfociti e cellule staminali).

Alcuni studi clinici si sono focalizzati sul rilascio di siRNA in vivo da parte di cellule prelevate dal paziente, modificate con siRNA e poi reimpiantate o reinfuse; questo metodo à ̈ stato utilizzato ad esempio per il rilascio di shRNA veicolato da lentivirus per il trattamento dell'AIDS, o per incrementare la risposta immunitaria contro alcuni dei più comuni tipi di cancro.

Sono già stati condotti più di 30 clinical trials che hanno utilizzato 21 differenti tipi di siRNA o shRNA e particolare attenzione à ̈ stata rivolta a studi volti a migliorare il sistema di rilascio dei siRNA per massimizzarne la specificità e, allo stesso tempo, minimizzarne la tossicità e la degradazione.

Freedman et al. (Blood 2012 119; 6288-6295) e Sahler J et al (J Thromb Haemost. 2012 Oct 5) hanno studiato aspetti che concernono il trasferimento di materiale genetico o di proteine da parte di platelet like particles nel primo o da micro-particelle prodotte da megacariociti nel secondo verso altre cellule (endoteliali e leucocitarie). Questi autori non trasfettano direttamente le particelle o i megacariociti, ma utilizzano un metodo già conosciuto in letteratura per la trasfezione dei megacariociti. In particolare, nel primo articolo gli autori trasfettano una linea cellulare megacariocitaria (Meg-01) attraverso l’utilizzo di “Nucleofector†, uno strumento per la trasfezione delle colture primarie mediante elettroporazione. Nel secondo articolo gli autori trasfettano linee cellulari megacariocitarie (Meg-01 e Dami) e megacariociti prelevati dal midollo osseo di topi C57BL/6 utilizzando lentivirus, un altro mezzo di trasfezione ben noto.

È stata recentemente descritta in letteratura la presenza di microRNA nelle piastrine umane (Landry et al, Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets, Nat Struct Mol Biol, 2009; 16(9):961-966), ma non à ̈ stata descritta la possibilità di silenziare in maniera efficiente un gene di interesse nelle piastrine introducendo un siRNA né la capacità di trasferire siRNA ad altre cellule sfruttando le piastrine come trasportatori.

In un altro lavoro (Hong et al. Transfection of human platelet with short interfering RNA; Clin Transl Sci. 2011) Ã ̈ stato descritto il tentativo di realizzare un silenziamento di mRNA piastrinico utilizzando i comuni metodi di trasfezione cellulare.

I risultati ottenuti hanno però mostrato una bassa efficienza di trasfezione (inferiore al 9%) e, pertanto, non hanno permesso di ottenere un soddisfacente silenziamento degli mRNA di interesse. In particolare, nel suddetto articolo viene dimostrato che i siRNA inseriti nelle piastrine sono capaci di silenziare solo in parte un mRNA target presente nella piastrina stessa.

Pertanto, i risultati si riferiscono ad un silenziamento che non si può considerare biologicamente rilevante, come à ̈ stato confermato sperimentalmente dagli inventori della presente invenzione, in effetti nel complesso à ̈ stato ottenuto solo circa il 2% di silenziamento nell'intera popolazione piastrinica.

Il silenziamento può ritenersi sufficiente solo se l’efficienza di trasfezione supera almeno il 20%, secondo prove effettuate dagli inventori della presente invenzione su piastrine umane. In generale viene identificata come ottimale una trasfezione che abbia un’efficienza di almeno l’80%.

Nel suddetto articolo si descrive l'utilizzo di mezzi capaci di indurre “cationic-lipid mediated delivery†, quali la lipofectamina, utilizzati per trasfettare le piastrine. Un lipide cationico ha la caratteristica, tipica dei lipidi, di essere apolare/idrofobico, ma contiene anche un catione in grado di conferirgli caratteristiche di polarità/idrofilia. La penetrazione attraverso la membrana di siRNA à ̈ mediata dalle sue caratteristiche fisiche-chimiche. Alla luce di quanto sopra, l'osservazione di Hong può essere riferita esclusivamente alla trasfezione mediata da una molecola con quelle specifiche caratteristiche fisico-chimiche e non alla trasfezione ottenuta con altre molecole, come ad esempio con una miscela di molecole di natura diversa dal lipide cationico.

Alla luce di quanto sopra esposto risulta, pertanto, evidente l’esigenza di poter disporre di un nuovo metodo di veicolazione e trasfezione di materiale genetico che superi gli svantaggi dei metodi noti.

Gli inventori della presente invenzione hanno ora messo a punto una nuova metodica per l'inserimento (trasfezione) di materiale genetico estraneo, ad esempio RNA (siRNA, shRNA, ceRNA ed in generale altro materiale genetico, come ad esempio plasmidi, all'interno di piastrine ematiche umane. Più specificatamente, à ̈ stata messa a punto una procedura che parte dall'isolamento di piastrine umane dal sangue periferico di un donatore, passando per l'ottenimento di piastrine risospese in un mezzo di risospensione, sia esso lo stesso plasma del donatore o un tampone di risospensione, per arrivare alla trasfezione delle piastrine stesse con un materiale genetico come ad esempio uno small interfering RNA (siRNA) diretto contro un mRNA target specifico. La metodica dell’invenzione permette di trasfettare le piastrine anche con tipi di materiale genetico diversi dai siRNA (ad esempio shRNA o plasmidi) che possono rappresentare ulteriori vie per ottenere il silenziamento genico o per introdurre nuovo materiale genico con il fine di migliorare l'efficacia delle terapie geniche attualmente in uso o in sperimentazione o di introdurne di nuove.

Mediante il metodo della presente invenzione à ̈ possibile ottenere piastrine o microparticelle di derivazione piastrinica in grado di contenere una concentrazione di materiale genetico sufficiente per silenziare mRNA di interesse all’interno delle piastrine stesse o in altre cellule con cui le piastrine o microparticelle di origine piastrinica vengano in contatto. Le piastrine o microparticelle dell’invenzione possono quindi essere vantaggiosamente impiegate in campo medico.

E’ nota in letteratura la capacità di microparticelle, quali microparticelle, microvescicole, esosomi, prodotte da cellule nucleate, di veicolare materiale genetico verso altre cellule “accettrici†. Il metodo della presente invenzione consente di produrre microparticelle di origine piastrinica da piastrine trasfettate con materiale genetico, quale ad esempio siRNA specifici, direttamente da piastrine umane. Le microparticelle possono essere utilizzate come trasportatrici di materiale genetico, quale ad esempio siRNA, al fine di silenziare o manipolare geni di interesse nei globuli bianchi, nell’endotelio, o in altre cellule di organi e tessuti.

La presente invenzione trova applicazione in numerosi settori medici. La trasfezione di specifici siRNA all'interno delle piastrine rende possibile interferire, ad esempio, con i meccanismi che regolano la partecipazione diretta delle piastrine alla malattia ischemica cardiovascolare, all’infiammazione, alla metastatizzazione, al danno tessutale o, in medicina trasfusionale, favorire la conservazione e l’efficacia emostatica delle piastrine prevenendo la cosidetta Platelet Storage Lesion.

Inoltre, la nota capacità delle piastrine di interagire strettamente con altre cellule, tra le quali le cellule endoteliali, le cellule muscolari lisce della parete vascolare, diverse sottopopolazioni di globuli bianchi e le cellule tumorali, fa sì che le molecole trasfettate nelle piastrine vengano trasferite alle cellule sopra elencate permettendo così di modularne l'espressione genica, interferendo con condizioni patologiche nelle quali le piastrine non sono direttamente coinvolte, come ad esempio, diversi tipi di cancro, malattie da patogeni eucarioti e virali, rigetto post-trapianto.

Il metodo dell’invenzione permette di ottenere la trasfezione di materiale genetico a scelta del ricercatore, quale ad esempio siRNA, in piastrine umane con elevata efficienza. Il silenziamento di mRNA piastrinici, così ottenuto, à ̈ stabile e perdura per l'intera durata di vita delle piastrine trasfettate. Infatti, le piastrine mancano di nucleo e non sono pertanto in grado di sintetizzare nuovo mRNA. Le piastrine trasfettate possono quindi essere impiegate per silenziare geni di interesse fisio-patologico nelle piastrine umane in modo da bloccarne la partecipazione in diverse malattie. In particolare, impiegando siRNA, à ̈ stata ottenuta un’ottima percentuale di trasfezione (intorno al 95%).

Gli inventori della presente invenzione hanno, inoltre, dimostrato che siRNA trasfettati nelle piastrine vengono poi trasferiti alle microparticelle prodotte dalle piastrine stesse. Sia le microparticelle sia le piastrine trasfettate con il materiale genetico sono in grado di trasferire detto materiale a cellule “accettrici†in vivo e, in particolare, a cellule coinvolte in patologie nelle quali le piastrine non svolgono un ruolo primario, potendo così modulare, attraverso le microparticelle piastriniche, o le piastrine, patologie non derivate primariamente dalle piastrine stesse.

Il veloce turn-over delle piastrine nel circolo permette, inoltre, di minimizzare la permanenza del siRNA nel sangue dopo il rilascio verso le cellule “target†, riducendo il rischio di non selettività dell’intervento terapeutico.

I brevi tempi di trasfezione del metodo dell’invenzione permettono, inoltre, di reinfondere per via endovenosa le piastrine trasfettate nello stesso soggetto da cui sono state prelevate nel corso di un'unica seduta, eliminando così il rischio di alloimmunizzazione e di rigetto delle piastrine trasfettate.

La pratica, utilizzata in medicina trasfusionale, di separare da un donatore le piastrine e il plasma (separatamente o entrambe) reinfondendo al donatore la restante parte del sangue separato (parte corpuscolata), direttamente nello stesso ciclo di trasfusione (piastrino-plasmaferesi), può permettere di prelevare le piastrine, trasfettarle, rispospenderle nel plasma e reinfonderle.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche (frammenti di piastrine) ottenute da dette piastrine trasfettate, in cui la percentuale di piastrine trasfettate varia da 20% a 100%, preferibilmente da 50% a 100% e ancora più preferibilmente da 80% a 100% rispetto all’intera popolazione piastrinica. Il materiale genetico con cui le piastrine possono essere trasfettate può essere scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, ceRNA, DNA, plasmidi e in generale materiali di natura genetica.

Secondo la presente invenzione, pertanto, il materiale genetico esogeno viene impiegato per trasfettare e modificare geneticamente piastrine umane e/o microparticelle piastriniche. Quindi l’invenzione concerne l’uso della popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo l’invenzione come vettore nella veicolazione di materiale genetico e/o nella trasfezione di materiale genetico a cellule accettrici.

1) Inoltre, costituisce oggetto della presente invenzione una popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo l’invenzione per l’uso nella terapia genica. In particolare, il gene target della terapia genica può essere un gene delle piastrine stesse o di cellule accettrici. Ad esempio, quando detto materiale genetico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, oppure in detti siRNA, shRNA contenuti in plasmidi, la terapia genetica consiste nel silenziamento post trascrizionale di un gene target che può appartenere alle piastrine stesse o alle cellule accettrici.

Il metodo di trasfezione secondo la presente invenzione può essere utilizzato, ad esempio, per inserire un siRNA diretto contro l’mRNA della Trombospondina-1 (TSP-1) all'interno delle piastrine umane per regolare la quantità dello stesso mRNA in pazienti con tumori solidi (Platelet-derived thrombospondin-1 is a critical negative regulator and potential biomarker of angiogenesis. Blood, 2011).

In effetti questo mRNA à ̈ stato osservato svolgere un ruolo importante nell'angiogenesi tumorale; il trasferimento di un siRNA anti mRNA per TSP-1 dalle piastrine, trasfettate con esso, alle cellule tumorali in vivo potrebbe rappresentare una “chemioterapia†selettiva, volta ad evitare recidive tumorali dopo interventi.

I siRNA che sono stati utilizzati negli esperimenti descritti di seguito sono siRNA DICER induced commercialmente disponibili e venduti da numerose aziende del settore. Sono note, altresì, numerose sequenze di siRNA utilizzati per trial clinici diretti contro oncogeni o sequenze caratteristiche di genomi di patogeni (HIV-1). La loro efficiente trasfezione in piastrine rappresenta quindi un mezzo terapeutico innovativo ed efficace contro malattie del sistema cardiovascolare (aterosclerosi, ipertrofia e fibrosi cardiaca, aritmogenesi cardiaca); neoplasie (tumori solidi di diversa origine, leucemie, mielomi); malattie dovute a patogeni eucarioti (micosi, malaria) o virali (AIDS, epatiti virali).

Pertanto, le piastrine trasfettate secondo la presente invenzione e le microparticelle da esse ottenute possono essere utilizzate nel trattamento delle malattie menzionate sopra.

Per quanto concerne shRNA o plasmidi, gli utilizzi sono analoghi, chiaramente con il vantaggio di poter ottenere silenziamenti con una durata più lunga rispetto a quella che si può ottenere con i siRNA.

A seconda del tipo di patologia e soprattutto alle caratteristiche genetiche della malattia, verranno inseriti all'interno delle piastrine siRNA con diverse sequenze in modo da silenziare mRNA che, se tradotti, risultano essere fondamentali per l'evoluzione e la diffusione della patologia.

In tabella 1 sono elencati una serie di siRNA utilizzabili contro comuni oncogeni e trasfettabili nelle piastrine secondo la presente invenzione (siRNA e miRNA gene silencing-Humana Press). Nella colonna a destra della tabella 1 sono riportate le sequenze dei siRNA indicando entrambi i filamenti del RNA (la sequenza superiore rappresenta l’mRNA e la sequenza inferiore il siRNA diretto contro l’mRNA); nella colonna di sinistra sono indicati i nomi dei geni a cui il siRNA à ̈ diretto; se si tratta di “point mutation†à ̈ specificata anche la mutazione espressa come cambiamento del singolo amminoacido. Le categorie in cui à ̈ suddivisa la tabella si riferiscono alla tipologia di oncogene: “point mutation†, ovvero le più comuni mutazioni puntiformi che determinano il passaggio di quel determinato protooncogene ad oncogene, e “fusion gene†ove l’oncogene si genera per traslocazione.

Tabella 1

Oncogene

MLL/AFF1 AAAAGCAGACCUACUCCAAUG (SEQ ID NO:1) UGUUUUCGUCUGGAUGAGGUUAC (SEQ ID NO:2)

MLL/AFF1 ACUUUAAGCAGACCUACUCCA (SEQ ID NO:3) CCUGAAAUUCGUCUGGAUGAGGU (SEQ ID NO:4)

MLL/AFF1 AAGAAAAGCAGACCUACUCCA (SEQ ID NO:5) UUUUCUUUUCGUCUGGAUGAGGU (SEQ ID NO:6)

NPM1/ALK CACUUAGUAGUGUACCGCCtt (SEQ ID NO:7) ttGUGAAUCAUCACAUGGCGG (SEQ ID NO:8)

NPM1/ALK CAGCACUUAGUAGUGUACCGC (SEQ ID NO:9) CUGUCGUGAAUCAUCACAUGG (SEQ ID NO:10)

NPM1/ALK CUUAGUAGUGUACCGCCGCUU (SEQ ID NO:11) UUGAAUCAUCACAUGGCGGCG (SEQ ID NO:12)

RUNX1/RUNX1T1 CCUCGAAAUCGUACUGAGAAG (SEQ ID NO:13)

UUGGAGCUUUAGCAUGACUCU (SEQ ID NO:14)

Point Mutation

BRAF E599V GCUACAGAGAAAUCUCGAUUU (SEQ ID NO:15)

UUCGAUGUCUCUUUAGAGCUA (SEQ ID NO:16)

HRAS G12V GGGCGCCGUCGGUCUGGGCAAG (SEQ ID NO:17)

UUCCCGCGGCAGCCACACCCGUUC(SEQ ID NO:18)

KRAS G12C GUUGGAGCUUGUGCCGUAGUU (SEQ ID NO:19)

UUCAACCUCGAACACCGCAUC (SEQ ID NO:20)

KRAS G12N GUUGGAGCUGAUGGCGUAGUU (SEQ ID NO:21)

UUCAACCUCGACUACCGCAUC (SEQ ID NO:22)

KRAS G12V GUUGGAGCUGUUGGCGUAGUU (SEQ ID NO:23)

UUCAACCUCGACAACCGCAUG (SEQ ID NO:24)

NRAS Q61R CGAGAAGAGUACAGUGCCAUGtt (SEQ ID NO:25)

ttGCUCUUCUCAUGUCACGGUA (SEQ ID NO:26)

TP53 R248W GCAUGAACUGGAGGCCCAUtt (SEQ ID NO:27) ttCGUACUUGACCUCCGGGUA (SEQ ID NO:28)

Fusion Gene

BCR/ABL1 GCAGAGUUCAAAAGCCCUUtt (SEQ ID NO:29) ttCGUCUCAAGUUUUCGGGAA (SEQ ID NO:30)

BCR/ABL1 CAGAGUUCAAAAGCCGUUCAG (SEQ ID NO:31)

UCGUCUCAAGUUUUCGGGAAGUC (SEQ ID NO:32)

BCR/ABL1 AAUAAGGAAGAAGCCCUUCAG (SEQ ID NO:33)

AGUUAUUCCUUCUUCGGGAGUC (SEQ ID NO:34)

BCR/ABL1 AUGAAUAAGGAAGAAGCCCUU (SEQ ID NO:35)

GGUAGUUAUUCGUUGUUCGGGAA (SEQ ID NO:36)

BCR/ABL1 GGAGACGCAGAAGCCCUUCAG (SEQ ID NO:37)

UACCUCUGCGUCUUCGGGAAGUC (SEQ ID NO:38)

ETV6/PDGFRB AUGAAGAAGCGUUGCCCUUUU (SEQ ID NO:39) UUUACUUCUUCGGAACGGGAA (SEQ ID NO:40)

EWSR1/FL11 GCAGCAGAACCCUUCUUAUtt (SEQ ID NO:41) ttCGUCGUCUUGGGAAGAAUA (SEQ ID NO:42)

EWSR1/FL11 GGCAGCAGAACCCUUCUUAcg (SEQ ID NO:43) gcCCGUCGUCUUGGGAAGAAU (SEQ ID NO:44)

EWSR1/FL11 GCAGAACCCUUCUUAUGACUU (SEQ ID NO:45)

UUCGUCUUGGUCAGAAUACUG (SEQ ID NO:46)

Sulla base di quanto esposto sopra, la presente invenzione riguarda anche piastrine trasfettate con siRNA elencati nella tabella 1, microparticelle da esse ottenute e relativi usi nel trattamento delle malattie correlate ai geni elencati.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione, un metodo per la trasfezione di piastrine con materiale genetico esogeno, detto metodo comprendendo o essendo consistente nelle seguenti fasi:

a) aggiungere una miscela comprendente o consistente in materiale genetico e un mezzo di trasfezione, detto mezzo di trasfezione comprendendo alcol etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, polietilenimmina, a una sospensione di piastrine isolate sospese in un adatto mezzo di sospensione, ad esempio plasma; e

b) lasciare incubare fino a ottenimento di una percentuale di piastrine trasfettate pari ad almeno il 20%, preferibilmente da 50 a 100%, ancora più preferibilmente da 80 a 100%, rispetto all’intera popolazione piastrinica, interrompere la trasfezione e isolare le piastrine trasfettate. I metodi per la determinazione della percentuale di trasfezione sono ben noti all’esperto del ramo. Ad esempio, può essere impiegata la citofluorimetria, con l’uso di sonde fluorescenti o realtime PCR. I tempi di incubazione possono variare da 1 minuto a 24 ore, generalmente variano da 1 minuto a 3 ore, preferibilmente da 5 minuti a 30 minuti, ancora più preferibilmente da 5 a 10 minuti.

La presente invenzione concerne inoltre un metodo per la preparazione di microparticelle piastriniche derivate da piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno, detto metodo comprendendo o essendo consistente nelle seguenti fasi: a) aggiungere una miscela comprendente o consistente in materiale genetico e un mezzo di trasfezione, detto mezzo di trasfezione comprendendo alcol etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, polietilenimmina, a una sospensione di piastrine isolate sospese in un adatto mezzo di sospensione, ad esempio plasma; e b) lasciare incubare, eventualmente stimolando l’attivazione piastrinica, fino a ottenimento di microparticelle, interrompere la trasfezione e isolare le microparticelle o una miscela di piastrine e micro particelle. I metodi per la determinazione della formazione di microparticelle sono ben noti all’esperto del ramo, ad esempio la loro formazione può essere verificata mediante citofluorimetria con tecniche standard.

La stimolazione dell’attivazione piastrinica ha lo scopo di indurre una maggiore produzione di micro particelle e può essere condotta ad esempio mediante aggiunta di trombina ad una concentrazione finale di 1 unità/millilitro oppure utilizzando collegene, TRAP, acido arachidonico e/o altri stimoli, ben noti all’esperto del ramo.

Come menzionato sopra, il materiale genetico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, ceRNA, DNA, plasmidi e altri materiali di natura genetica. E’ consigliabile che il materiale genetico da trasfettare sia utilizzato ad una concentrazione tra i 20-200 nM, similmente a quanto utilizzato per qualsiasi trasfezione cellulare.

La trasfezione avviene in maniera ottimale impiegando una miscela di alcool etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, polietilenimmina. Oltre a questi componenti possono essere aggiunti lipidi o estratti di fosfolipidi piastrinici. L’efficienza di trasfezione à ̈ principalmente dipendente dalla miscela alcool etilico e polilisina, mentre gli estratti di fosfolipidi piastrinici sembrano avere un moderato effetto potenziante la trasfezione e attenuante gli effetti citotossici della miscela di trasfezione. La concentrazione di alcool etilico può variare da 0,5% a 3,5%, preferibilmente da 2 a 3%, ancora più preferibilmente 3%. L’efficienza di trasfezione, per ciò che concerne la concentrazione di alcol nel medium, à ̈ dose dipendente, raggiungendo l'efficienza massima al 3%. Per ciò che concerne le poliammine, preferibilmente la polilisina e la polietilenimmina, la loro concentrazione varia da 100 a 150 µl di una soluzione di polilisina o di polietilenimmina diluita allo 0,1% in acqua, preferibilmente da 110 a 140 µl, ancora più preferibilmente 120 µl.

La concentrazione di lipidi può variare da 10 e 20 µl, preferibilmente da 12 a 16 µl, ancora più preferibilmente 15,6 µl.

La trasfezione ottimale à ̈ stata ottenuta con una quantità di 120 µl di una soluzione di polisina diluita allo 0,1% in acqua aggiunta al mix di reazione e 15,6 microlitri di estratti fosfolipidici di piastrine (Platelet Extract Reagent).

Pertanto, la presente invenzione concerne anche un mezzo di trasfezione di piastrine con materiale genetico esogeno, in cui detto mezzo di trasfezione comprende o consiste in alcool etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, polietilenimmina, ed, eventualmente, lipidi o estratti di fosfolipidi.

Un rendimento di trasfezione paragonabile a quello ottenuto con il mezzo di trasfezione della presente invenzione si ottiene impiegando un reagente commerciale denominato Ribojuice (Merck).

La concentrazione delle piastrine in sospensione della fase a) può essere preferibilmente superiore a 20.000 piastrine per microlitro e minore di 2 milioni, preferibilmente da 200.000 a 1.000.000 al microlitro, ancora più preferibilmente 250.000-350.000, ancora più preferibilmente 300.000 al microlitro.

I mezzi di sospensione delle piastrine utilizzati negli esperimenti sono stati RPMI 1640 e IMDM ed entrambi si sono dimostrati egualmente efficaci.

I tempi di incubazione utilizzabili per la trasfezione piastrinica vanno dai 5 minuti fino ad un'ora; Ã ̈ preferibile comunque utilizzare tempi brevi (ad es. 5 minuti) per diminuire gli effetti citotossici del reagente di trasfezione sulle piastrine. I tempi per la trasfezione piastrinica con produzione di microparticelle invece vanno dalle 24 alle 48 ore di incubazione.

Il metodo secondo la presente invenzione garantisce un'elevata efficienza di trasfezione di siRNA nelle piastrine umane e anche un’elevata capacità di microparticelle derivate da piastrine e trasfettate con siRNA di trasferire i siRNA di interesse ad altre cellule, in vitro ed in vivo.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

Figura 1 mostra: A. Analisi al citofluorimetro della popolazione piastrinica dopo trasfezione. L’utilizzo degli scatter in scala logaritmica permette la visualizzazione della popolazione piastrinica su base morfologica. B. Analisi al citofluorimetro della percentale di piastrine positive al siRNA marcato con fluorescenza. C. Confronto in citofluorimetria tra piastrine non trasfettate (curva di sinistra) con piastrine trasfettate (curva di destra). Lo spostamento verso valori in ascissa maggiori corrispondenti ad una maggiore fluorescenza, ci permette di definire la percentuale di piastrine positive al siRNA marcato. FS - forward scatter; SS - side scatter; Fl2 - banda di emissione del fluoroforo del siRNA.

Figura 2 mostra le percentuali di piastrine positive al siRNA fluorescente in relazione ai tempi di incubazione con il terreno di trasfezione.

Figura 3 mostra la percentuale di espressione del mRNA del gene HPRT1 in piastrine lavate e coincubate con siRNA contro mRNA di HPRT1 misurato tramite PCR semi-quantitativa.

Figura 4 mostra PCR semiquantitiva di confronto dopo trasfezione effettuata con siRNA diretto contro HPRT1 tra il gene target e un gene di controllo (B2M). Nella figura A, la PCR à ̈ stata effettuata amplificando il gene HPRT1, nella figura B con il gene B2M (β-2 Microglobulina). L-Ladder; P-piastrine lavate; P1 piastrine lavate coincubate con siRNA; P2 piastrine trasfettate con siRNA.

Figura 5 mostra i risultati dell’analisi al citofluorimetro di microparticelle prodotte dopo 24h di incubazione di piastrine lavate con terreno di trasfezione addizionato con siRNA marcato fluorescente. Nella figura A à ̈ indicata la regione morfologica dove sono comprese le microparticelle settata precedentemente con sfere di dimensioni opportune (Megamix Beads). I: 0,5 µm; J: 0,9 µm; G: I+J. Nella figura B à ̈ evidenziata la presenza nelle microparticelle di CD61 (in ascissa-Fl1 Log) per indicare l'origine piastrinica delle microparticelle e la presenza di siRNA marcato fluorescente (in ordinata-Fl2).

Figura 6 mostra i risultati dell’analisi al citofluorimetro di cellule endoteliali (HUVEC) coincubate con microparticelle di origine piastrinica per 6 ore; le microparticelle piastriniche sono state preparate partendo da una sospensione di piastrine in terreno di trasfezione addizionato con siRNA marcato fluorescente, il quale, dopo 24 h, à ̈ stato ultracentrifugato per 1 h per permettere l’isolamento e la risospensione delle microparticelle in RPMI 1640. Il 38% delle cellule endoteliali risulta positivo per il siRNA precedentemente trasfettato nelle piastrine.

Figura 7 mostra i risultati dell’analisi al citofluorimetro di leucociti murini ottenuti da topi NOS/SCID 24 h dopo l'inoculo di piastrine umane trasfettate con siRNA fluorescente. Immagine A: leucociti controllo, il topo à ̈ stato inoculato con piastrine umane non trasfettate; nel grafico a sinistra il campione non à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; a destra il campione à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; 2,08% di positività. Immagine B: leucociti trasfettati, il topo à ̈ stato inoculato con piastrine umane trasfettate con siRNA fluorescente; nel grafico a sinistra il campione non à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; a destra il campione à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; 7,83% di positività. Immagine C: leucociti ottenuti da topo dopo iniezione in vivo di agenti attivanti le piastrine. Il topo à ̈ stato inoculato con piastrine umane trasfettate con siRNA fluorescente e stimolato, dopo un'ora dall'inoculo, tramite iniezione di 0,1 ml di una soluzione contenente 150µg/ml di Collagene e 0,9 µg/ml di epinefrina; nel grafico a sinistra il campione non à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; a destra il campione à ̈ stato incubato con anticorpo antiCD45; 13,81% di positività.

Figura 8 mostra: Immagine A: controllo effettuato con piastrine non trasfettate; Immagine B: piastrine trasfettate con plasmide Pmax (Lonza), il 10,6% Ã ̈ risultato positivo ed esprime quindi una GFP attiva.

ESEMPIO 1: Metodo di trasfezione di piastrine o microparticelle e valutazione della percentuale di trasfezione

Materiali e metodi

Metodo di trasfezione di piastrine o microparticelle

Sangue periferico venoso viene prelevato e raccolto in provette contenenti 3,8% di sodio citrato come anticoagulante (1:9 citrato-sangue v/v).

1 Il prelievo viene centrifugato a 120 g per 10 minuti per ottenere PRP (Plasma Ricco di Piastrine).

2 Si procede all'isolamento delle piastrine del plasma tramite metodi comuni (lavaggio piastrinico o gel-filtrazione).

3 Le piastrine, così isolate, vengono risospese in RPMI 1640 addizionato con antibiotici (100 U di Penicillina e 100 U di Streptomicina) ad una concentrazione compresa tra le 2x10<5>e 1x10<6>per microlitro, scendendo al massimo al limite inferiore di concentrazione di 130.000 piastrine/microlitro, oppure nel plasma stesso del donatore, e aliquote da un millilitro vengono trasferite nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e messe in incubazione a 37°C in atmosfera controllata di CO2 al 5%.

4 Di seguito, viene preparato il medium di trasfezione, inserendo in una provetta 32,4 microlitri di alcool etilico assoluto, 120 microlitri di una soluzione di polilisina (0,1% in acqua) e 47,6 microlitri di terreno RPMI 1640 oppure 32 microlitri di Ribojuice (Merck-Millipore) e 168 microlitri di RPMI 1640 così da raggiungere, in entrambi i casi, la quantità totale di 200 microlitri.

5 Dopo 5 minuti di attesa viene aggiunto alla suddetta miscela il siRNA di interesse alla concentrazione massima di 200 nM e dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente la soluzione viene trasferita nel pozzetto dove precedentemente era stata posto 1 ml di sospensione piastrinica.

6 Dopo 5 minuti di incubazione a 37°C, viene interrotta la trasfezione: mediante centrifugazione delle piastrine (a 3.000 g per 10 minuti in presenza di PGI2 0,2 microM e, di seguito, risospendendole in 3 ml di terreno di coltura RPMI 1640) oppure per diluizione del terreno di trasfezione con terreno di coltura RPMI 1640 fino a raggiungere una quantità totale di 7 millilitri.

7 Entro 2 ore dall’interruzione della reazione di trasfezione à ̈ possibile evidenziare (tramite PCR o rt-PCR) la degradazione del mRNA di interesse, target specifico del siRNA inserito precedentemente, nelle piastrine.

Per ottenere, invece, microparticelle piastriniche contenenti il siRNA precedentemente trasfettato nelle piastrine à ̈ necessario effettuare le operazioni precedentemente descritte fino al punto 5 per poi proseguire nel seguente modo:

1 lasciare la sospensione piastrinica in incubazione a 37°C in atmosfera controllata di CO2al 5% insieme al terreno di trasfezione per 24/48 h. O alternativamente stimolarle con 2,5 mM di CaCl2, 20 µg/ml di Collagene e 1 U/ml di Trombina per 30 minuti a 37°C e fermare lo stimolo con 2,5 mM di EDTA.

2 Centrifugare le piastrine a 3.000 g per 10 minuti.

3 Recuperare il sovranatante e centrifugarlo ulteriormente a 12.000 g per 10 minuti per rimuovere le eventuali piastrine rimaste.

4 Centrifugare il sovranatante a 160.000 g per 1 ora a 4°C.

5 Rimuovere il sovranatante e risospendere il pellet di microparticelle in 1 millilitro di RPMI 1640 (verificare la concentrazione delle microparticelle utilizzando un citofluorimetro). La composizione del terreno RPMI 1640 Ã ̈ (grammi/litro): Lista componenti espressa in grammi/litro

L-Arginine 0.2

L-Asparagine 0.05

L-Aspartic Acid 0.02

L-Cystine·2HCl 0.0652

L-Glutamic Acid 0.02

L-Glutamine 0.3

Glycine 0.01

L-Histidine 0.015

Hydroxy-L-Proline 0.02

L-Isoleucine 0.05

L-Leucine 0.05

L-Lysine·HCl 0.04

L-Methionine 0.015

L-Phenylalanine 0.015

L-Proline 0.02

L-Serine 0.03

L-Threonine 0.02

L-Tryptophan 0.005

L-Tyrosine·2Na·2H2O 0.02883

L-Valine 0.02

Biotin 0.0002

Choline Chloride 0.003

Folic Acid 0.001

myo-Inositol 0.035

Niacinamide 0.001

D-Pantothenic Acid Hemicalcium 0.00025

PABA 0.001

Pyridoxine·HCl 0.001

Riboflavin 0.0002

Thiamine·HCl 0.001

Vitamin B12 0.000005

Calcium Nitrate·4 H2O 0.1

Magnesium Sulfate 0.04884

Potassium Chloride 0.4

Sodium Chloride 6.0

Sodium Phosphate Dibasic 0.8

D-Glucose 2.0

Glutathione, Reduced 0.001

Phenol Red·Na 0.0053

Rilevazione piastrine e microparticelle tramite citofluorimetria (Figura 1 e 5).

Per il rilevamento delle microparticelle attraverso citofluorimetria, Ã ̈ stato settato il gate dimensionale corrispondente alle microparticelle calibrando lo strumento con l'aiuto di Megamix (American Diagnostic) una mistura di microsfere di 3 differenti dimensioni (0,5; 0,9 e 3 micron).

Le microparticelle, preparate come indicato in materiali metodi, sono state marcate incubandole per 30 minuti con l’anticorpo fluorescente anti-CD61 (Beckman Coulter), antigene a localizzazione esclusivamente piastrinica.

Le piastrine sono state analizzate settando il gate morfologico con un controllo senza trasfezione preparato come descritto in materiali e metodi, e utilizzando un anticorpo fluorescente anti-CD61 (Beckman Coulter)-fitc e rilevando la fluorescenza emessa dal siRNA TYE 563 DS Transfection Control (IDT). Tutte le prove sono state realizzate utilizzando il citofluorimetro FC500 (Beckman Coulter).

RT-PCR su piastrine trasfettate con siRNA (Fig. 4)

Le piastrine trasfettate sono state preparate come specificato nei materiali e metodi, dal punto 1 al punto 7, utilizzando un siRNA diretto contro HPRT1 alla concentrazione di 200nM.

Il controllo à ̈ stato ottenuto lavando le piastrine secondo il metodo precedentemente descritto ed interrompendo la preparazione al punto 3 ed inserendo nel terreno 200 nM di siRNA diretto contro HPRT1.

La RT-PCR à ̈ stata realizzata come segue: RNA totale à ̈ stato estratto dalle preparazioni di piastrine utilizzando TRIzol (Invitrogen) secondo la metodica d'estrazione in cloroformio/isopropanolo.

L'RNA totale à ̈ stato retrotrascritto utilizzando iScript (Biorad) seguendo le indicazioni del costruttore.

La PCR Ã ̈ stata realizzata utilizzando i seguenti primers: HPRT (for: TGAGGATTTGGAAAGGGTGT (SEQ ID NO: 47) rev: TGTAATCCAGCAGGTCAGCA(SEQ ID NO: 48)); Beta 2 Microglobulina (for: TGACTTTGTCACAGCCCAAGATAG (SEQ ID NO: 49) rev: CTCTAAGTTGCCACCCCTCCTAG(SEQ ID NO: 50)).

Rilevazione di cellule endoteliali (HUVEC) tramite citofluorimetria (figura 6)

Cellule endoteliali HUVEC (Lonza) sono state messe in coltura in terreno EBM2 Bullet Kit (Lonza) in piastre da 12 pozzetti fino al raggiungimento del 75% circa di confluenza.

Microparticelle di derivazione piastrinica, ottenute come precedentemente descritto dopo 48 ore di incubazione delle piastrine, sono state risospese in 1 ml di terreno RPMI 1640 ed aggiunte alla coltura di cellule endoteliali.

Dopo 6 ore di coincubazione, Ã ̈ stato allontanato il novranatante, le cellule endoteliali sono state lavate due volte in PBS e poi sono state rimosse dalle piastre tramite blanda tripsinizzazione, risospese in 1ml di PBS per l'analisi citofluorimetrica.

Il gate morfologico à ̈ stato settato utilizzando cellule HUVEC di controllo non preincubate con microparticelle.

È stata rilevata la fluorescenza emessa da siRNA TYE 563 DS Transfection Control (IDT).

Tutte le prove sono state realizzate utilizzando il citofluorimetro FC500 (Beckman Coulter).

Risultati

Scrambled-siRNA fluorescente (Integrated DNA Techonologies) Ã ̈ stato inserito all'interno di piastrine umane lavate (3,5x10<5>) secondo la procedura sopra descritta, per verificare l'efficienza di trasfezione.

Con prove di citofluorimetria abbiamo dimostrato un’elevata efficienza di trasfezione (Figura 1). In particolare, abbiamo dimostrato che dopo 1h di incubazione si raggiunge una percentuale di efficienza di trasfezione pressoché ottimale (circa 97% di efficienza) (Figura 2).

Un'elevata efficienza di trasfezione (> del 95%) si ottiene anche incubando le piastrine per soli 30 minuti, riducendo in questo modo lo stress cellulare indotto dalla trasfezione.

Abbiamo effettuato prove di silenziamento di mRNA piastrinici, valutando la degradazione del mRNA del gene HPRT1 (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) in piastrine lavate (3x10<5>) e trasfettate con 200 nM di siRNA diretto contro HPRT1 (HPRT-S1 DS Positive Control IDT).

Il silenziamento del mRNA Ã ̈ stato verificato tramite PCR semi-quantitativa.

E’ stata ottenuta un'efficacia di silenziamento dell’mRNA di interesse pari al 94% (Figure 3 e 4). Inoltre, piastrine umane lavate sono state indotte a produrre microparticelle tramite la metodica precedentemente descritta ed à ̈ stato valutato tramite citofluorimetria se il siRNA fluorescente, precedentemente trasfettato nelle piastrine stesse, viene trasferito all'interno delle microparticelle prodotte (Figura 5). E’ stato in effetti dimostrato che il 96% delle microparticelle contengono il siRNA precedentemente trasfettato (Figura 5). Cellule endoteliali umane sono state co-incubate in coltura (HUVEC) con le microparticelle derivate da piastrine trasfettate con siRNA ed à ̈ stato verificato che il siRNA fluorescente, derivato dalle piastrine da cui sono state prodotte, viene trasferito all'interno di circa il 38% delle cellule HUVEC (Figura 6).

ESEMPIO 2: Studio su leucociti di topo NOD/SCID dopo inoculo e.v. di piastrine umane trasfettate con siRNA fluorescente e valutazione della capacità di silenziamento delle piastrine o delle microparticelle trasfettate con siRNA

Topi NOD/SCID, immunodeficienti, e quindi incapaci di reagire immunologicamente all’infusione di piastrine umane, sono stati inoculati, tramite iniezione endovenosa, con 200 µl di una sospensione di 5x10<8>di piastrine umane trasfettate secondo il metodo descritto precedentemente con siRNA fluorescente.

Dopo 24 ore dall'inoculo i topi sono stati sacrificati ed à ̈ stato effettuato un prelievo cardiaco di sangue intero.

Il sangue intero di topo à ̈ stato coincubato per 30 minuti con anticorpo anti-CD45 murino (BD Pharmingen).

È stata rilevata la fluorescenza emessa da siRNA TYE 563 DS Transfection Control (IDT) nei leucociti di topo marcati con anticorpo anti-CD45 (BD Pharmingen) dopo 30 minuti di incubazione.

Tutte le prove sono state realizzate utilizzando il citofluorimetro FC500 (Beckman Coulter). I risultati sperimentali in vivo, nell’animale da esperimento, che dimostrano la persistenza nel circolo sanguigno di piastrine “trasfettate†con siRNA ed il trasferimento di questi ultimi ai leucociti murini sono mostrati in Figura 7.

ESEMPIO 3: Rilevazione GFP su piastrine umane trasfettate tramite citofluorimetria (Figura 8).

Un totale di 1 µg di plasmide contenente la sequenza di GFP (Pmax, Lonza) Ã ̈ stato inserito all'interno di piastrine umane utilizzando il metodo precedentemente descritto, sostituendo il plasmide al siRNA nella metodica sopra dettagliata.

Le piastrine sono state, in seguito, analizzate, settando il gate morfologico con una sospensione piastrinica di controllo senza trasfezione preparata come descritto in materiali e metodi, e rilevando la fluorescenza emessa dalla GFP prodotta dal plasmide Pmax (max emissione 509 nm). Tutte le prove sono state realizzate utilizzando lo strumento FC500 (Beckman Coulter). E’ stato osservato tramite cifluorimetria che la trasfezione di piastrine umane con plasmide ricombinante contenente la sequenza per GFP (Green Fluorescent Protein) ne causava la traduzione e quindi l’espressione del prodotto del plasmide (Figura 8).

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche ottenute da dette piastrine trasfettate, in cui la percentuale di piastrine trasfettate varia da 20% a 100%, preferibilmente da 50% a 100%, ancora più preferibilmente da l’80% a 100% rispetto all’intera popolazione piastrinica.
2. 2) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche da esse derivate secondo la rivendicazione 1, in cui detto materiale genetico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, ceRNA, DNA, plasmidi.
3. 3) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, per l’uso come vettore nella veicolazione e nella trasfezione di materiale genetico a cellule accettrici.
4. 4) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, per l’uso nella terapia genica.
5. 5) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo la rivendicazione 4, per l’uso secondo la rivendicazione 4, in cui il gene target della terapia genica à ̈ un gene delle piastrine stesse o di cellule accettrici.
6. 6) Popolazione di piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno e/o microparticelle piastriniche secondo la rivendicazione 4, per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni 4-5, in cui quando detto materiale genetico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, oppure in detti siRNA e shRNA contenuti in plasmidi, la terapia genetica consiste nel silenziamento post trascrizionale di un gene target.
7. 7) Metodo per la trasfezione di piastrine con materiale genetico esogeno, detto metodo comprendendo o essendo consistente nelle seguenti fasi: a) aggiungere una miscela comprendente o consistente in materiale genetico e un mezzo di trasfezione, detto mezzo di trasfezione comprendendo alcol etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, a una sospensione di piastrine isolate sospese in un adatto mezzo di sospensione; e b) lasciare incubare fino a ottenimento di una percentuale di piastrine trasfettate pari ad almeno il 20%, preferibilmente da 50% a 100%, ancora più preferibilmente da 80% a 100%, rispetto all’intera popolazione piastrinica, interrompere la trasfezione e isolare le piastrine trasfettate.
8. 8) Metodo per la preparazione di microparticelle piastriniche derivate da piastrine trasfettate con materiale genetico esogeno, detto metodo comprendendo o essendo consistente nelle seguenti fasi: a) aggiungere una miscela comprendente o consistente in materiale genetico e un mezzo di trasfezione, detto mezzo di trasfezione comprendendo alcol etilico e almeno una poliammina, preferibilmente polilisina, a una sospensione di piastrine isolate sospese in un adatto mezzo di sospensione; e b) lasciare incubare, eventualmente stimolando l’attivazione piastrinica, fino a ottenimento di microparticelle, interrompere la trasfezione e isolare le microparticelle.
9. 9) Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 7-8, in cui la concentrazione delle piastrine in sospensione della fase a) varia da 20.000 piastrine per microlitro a 2 milioni, preferibilmente da 200.000 a 1.000.000 al microlitro, ancora più preferibilmente 250.000-350.000, ancora più preferibilmente 300.000 al microlitro.
10. 10) Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 7-9, in cui il materiale genetico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in siRNA, shRNA, ceRNA, DNA, plasmidi.