TW202229228A - 可離子化脂質及其製造和使用方法 - Google Patents

可離子化脂質及其製造和使用方法 Download PDF

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米凱爾 佩基
蘇曼 亞利施堤
曼紐 卡拉斯科
穆罕默德加百列 阿拉梅赫
德魯 韋斯曼
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喬治梅森研究基金會
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Abstract

本發明涵蓋新穎的可離子化脂質化合物及其在脂質奈米顆粒遞送系統中之用途，該等脂質奈米顆粒遞送系統適用於將核酸遞送至哺乳動物受試者，可離子化脂質化合物可經納入以用作例如癌症疫苗、基因編輯療法、遞送編碼抗體之核酸（例如，mRNA）、感染性疾病之疫苗及蛋白質替代治療劑。此外，本發明涵蓋在脂質奈米顆粒中包含可離子化脂質的組合物及治療劑，以及該組合物及治療劑在製備醫藥組合物、尤其是疫苗中之用途（例如，用於預防或治療感染性疾病、腫瘤或癌症疾病、罕見疾病、過敏症或自體免疫疾病）。本發明涵蓋治療或預防上述疾病之方法。

Description

可離子化脂質及其製造和使用方法
相關申請案之交互參考
本申請案主張2020年10月14日申請之美國臨時申請案第63/091,616號；2021年4月26日申請之美國臨時申請案第63/179,885號；2020年10月14日申請之美國臨時申請案第63/091,603號及2021年4月26日申請之美國臨時申請案第63/179,872號之權益，該等臨時申請案各自以全文引用之方式併入本文中。
本發明涵蓋新穎的可離子化脂質化合物及其在脂質奈米顆粒遞送系統中之用途，該等脂質奈米顆粒遞送系統適用於將核酸遞送至哺乳動物受試者，該等可離子化脂質化合物可經納入以用作例如癌症疫苗、遞送基因編輯療法、遞送編碼抗體之核酸（例如，mRNA）、感染性疾病之疫苗及蛋白質替代治療劑。此外，本發明涵蓋在該等脂質奈米顆粒中包含可離子化脂質之組合物及治療劑，以及該組合物及治療劑用於製備醫藥組合物、尤其是疫苗（例如，用於預防或治療感染性疾病、腫瘤或癌症、罕見疾病、過敏症或自體免疫疾病）之用途。本發明亦涵蓋治療或預防上述疾病之方法。
基因療法及基因疫苗接種屬現代醫學中最有前景且發展最快之方法。它們可為多種疾病之療法提供高度特異性及個性化之選擇。作為基本的生物學概念，細胞機制利用mRNA作為資訊之瞬時載體來合成基因編碼之蛋白質。因此，自理論角度來看，mRNA應該能夠替代DNA或重組蛋白質用於治療目的。例如，RNA干擾(RNAi)劑諸如小干擾RNA (siRNA)及微RNA (miRNA) 作為治療劑具有強大潛力，可用於治療廣泛多種疾病，諸如惡性腫瘤、感染、自體免疫疾病以及與不良基因表現相關之神經性疾病。
對於此等滲透性差且易降解的大分子之全身投與，非常需要安全有效之遞送平台。由於高生物相容性、生物可降解性及臨床使用之可靠記錄，由脂質及/或磷脂製成之奈米載體已普遍用於促進RNA遞送（例如，脂質體、脂質奈米顆粒及脂質奈米乳液）。
基因疫苗接種引起對選定抗原諸如細菌表面之特徵組分、病毒顆粒、腫瘤抗原及其類似物之期望的免疫反應。基因疫苗（亦即用於基因疫苗接種之疫苗）通常由基因工程改造之核酸分子構成，此等核酸分子允許在活體內表現病原體或腫瘤抗原所特有的肽或蛋白質（亦即抗原）片段。基因疫苗在由靶細胞攝取後向患者投與時表現。所投與之核酸之表現導致所編碼蛋白質之產生。倘若此等蛋白質由患者之免疫系統識別為外來物，便會觸發免疫反應。
DNA以及RNA可用作核酸分子，用於在基因疫苗接種之背景下的投與。眾所周知，DNA相對穩定且易於處理。然而，使用DNA存在將所投與DNA片段不期望地插入患者基因組中的風險，這可能導致誘變事件，諸如受損基因之功能喪失。作為進一步之風險，可能會出現不需要的抗DNA抗體產生。另一個缺點係在DNA投與後可達成的編碼肽或蛋白質之有限表現水準，因為DNA必須進入細胞核才能在產生的mRNA經轉譯之前進行轉錄。除其他原因外，所投與DNA之表現水準將視調節DNA轉錄的特定轉錄因子之存在而定。在不存在此類因子之情況下，DNA轉錄不會產生令人滿意的RNA量。作為結果，獲得的轉譯肽或蛋白質之水準係有限的。
藉由使用RNA代替DNA進行基因療法及基因疫苗接種，可最大限度地降低或避免不希望的基因組整合及產生抗DNA抗體之風險。然而，RNA被視為一種相當不穩定之分子種類，很容易由普存之RNA酶降解。此項技術需要提供一種有效的mRNA投與方法（例如，用於疫苗接種），該方法允許引發適應性免疫反應，其中投與不會因抗原之早期降解或由於mRNA在細胞中之低效釋放所致的mRNA之低效轉譯而受到嚴重損害。此外，需要減少mRNA疫苗之劑量以減少潛在的安全問題並使得第三世界能夠負擔得起疫苗。
存在許多與核酸遞送相關之挑戰以影響在生物系統中的所需反應。基於核酸之治療劑(諸如疫苗)具有巨大的潛力，但仍需要更有效地將核酸遞送至細胞、組織或生物內的適當位點以實現此潛力。然而，目前在治療環境中使用寡核苷酸面臨三個問題。首先，游離RNA容易受到血漿中核酸酶之消化。其次，游離RNA進入相關轉譯機制所在的細胞內區室之能力有限。第三，僅一小部分內化的寡核苷酸釋放至細胞質中而變得具有生物活性。由本發明之可離子化脂質（如本文所定義）與其他脂質組分諸如中性脂質、類固醇、PEG、聚乙二醇化脂質及寡核苷酸組合形成的脂質奈米顆粒(LNP)已用於阻斷血漿中RNA之降解並促進寡核苷酸之細胞攝取。若設計正確，則它們可將治療水準之寡核苷酸釋放至細胞質中。
局部遞送造成RNA之全身存在，從而導致不需要的副作用及功效降低。疫苗通常經由肌內(IM)注射投與，並且經由IM途徑遞送至樹突狀細胞的LNP要求與靜脈內(IV)遞送至肝細胞不同。肝細胞靶向係由於LNP與ApoE相關聯，ApoE將LNP攝取靶向肝細胞LDL受體，而ApoE在IM投與中可能沒有相同的作用。LNP之第二靶向機制為它們的淨電荷。帶負電之LNP在IV注射時以脾臟為目標，而帶正電之LNP以肺臟為目標，且接近中性之LNP以肝臟為目標。沒有已發表的研究評估了LNP電荷在IM投與中之影響。
仍然需要用於遞送寡核苷酸的經改良之可離子化脂質及脂質奈米顆粒。
包含在脂質奈米顆粒中的本發明之可離子化脂質（如本文所定義）提供最佳藥物:脂質比，保護核酸免於降解，並在血清中清除，適用於全身或局部遞送，並提供核酸之細胞內遞送。此外，包含在脂質-核酸顆粒中的本發明之可離子化脂質具有良好的耐受性並提供足夠的治療指數，使得以有效劑量之核酸對患者進行的治療不會導致不可接受之毒性及/或對患者之風險。本發明提供此等及相關優勢。
本發明提供用於脂質奈米顆粒（LNP）中的本發明之可離子化脂質（如下所定義）的令人驚訝及出乎意料之發現，該等可離子化脂質提供在核酸遞送（例如，mRNA）上的增強之效力，以用於例如疫苗候選物中，此極大地促進滿足成功mRNA疫苗之三個標準的能力-(1)持久保護，(2)每年之大產量，以及(3)全球人口有機會並願意接種疫苗。由本發明之可離子化脂質提供的增強效力減少所需劑量及不良反應，同時藉由降低成本及提高製造能力保持功效並增強全球接種之能力。在某些實施例中，在此等相同劑量下提高之效力增強保護。
本發明者已驚人且意外地發現一類可用於LNP中之新型可離子化脂質，該等可離子化脂質藉由使用兩種方式設計脂質奈米顆粒來提高效力-意謂mRNA表現、免疫原性及保護(例如，當用於遞送疫苗時)： 1) 經改良之可離子化脂質設計及性能，以及 2) 經由控制LNP組裝產生更有效之脂質奈米顆粒。
在某些實施例中，效力增加之量度係本發明之LNP為獲得與代表先前臨床試驗中使用之彼等的標準LNP相同水準之針對病毒攻擊之保護而達成的劑量減少。
在某些實施例中，本發明涵蓋一種設計可離子化脂質之新型方法，其特徵在於已知控制遞送效率之三個結構特徵：(1)在胞內體pH範圍內之離子化，(2)在生理pH值下之淨電荷，以及(3)與分支及飽和/不飽和相關之脂質尾構象。
本發明亦涵蓋用於合成的候選物之電腦模擬分析，該分析能夠基於不適當的預測特性消除不需要之候選物。本發明涵蓋製備可離子化脂質之新穎合成方法。在其他實施例中，該等新穎方法藉由使用水溶性類似物之NMR表徵本發明之可離子化脂質的分子離子化並藉由在pH範圍(3-10)內量測LNP之ζ電位來遵循設計策略。在某些實施例中，候選物評估及闡明結構-功能關係(SFR)之方法係全面的，包括但不限於轉譯及毒性之活體外及活體內評估、細胞攝取之活體外評價、胞內體釋放及先天性免疫傳感器激活、分佈及細胞運輸之活體內表徵、免疫原性、以及在病毒攻擊研究中使用當前及進化的齧齒動物及非齧齒動物模型。
在某些實施例中，由於脂質與mRNA之混合濃度的增加，在組裝過程中達成mRNA LNP之活體內表現的增加（例如，＞5X）。在某些實施例中，克服與系統地檢查此等參數相關之關鍵技術難點及高成本。藉由將此發現推廣至一系列可離子化脂質，本發明可改變更有效的LNP之工業生產。
在某些實施例中，本發明涵蓋設計及合成有效的可離子化脂質，以用於mRNA疫苗之肌內遞送及向所需細胞、組織或器官之集中投與
在另一實施例中，本發明涵蓋可離子化脂質，其與先前遞送方法相比效力增加且劑量減少（例如，減少了至少2x、3x、4x、5x、10x、20x、50x或100x），同時保持相似的表現、免疫原性及針對病毒攻擊之保護。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質的多價頭部基團之離子化特性的優化，其在中性pH值下產生帶正電之LNP以限制全身性傳播並增加胞內體離子化，從而增強疫苗效力，同時產生高度分支及可降解之脂質尾部，其可進一步經由胞內體釋放增強效力，並且可離子化脂質之電荷及結構會影響LNP佐劑性。
在某些實施例中，本發明之LNP增強限制不良事件之效力、降低製造成本、並提高全球接種疫苗之能力。
在其他實施例中，本發明涵蓋可離子化脂質及LNP之設計及合成，用於評估物理化學及生物學特性，以鑑定更有效之系統及潛在的結構-功能關係(SFR)。
在另一實施例中，本發明涵蓋一種藉由使用包括ACDLabs Percepta之軟體預測本發明之可離子化脂質的pKa來顯著加速該可離子化脂質之設計的方法。
在其他實施例中，脂質的經預測之水性pKa均顯著高於由TNS所量測之值。在某些實施例中，自水性環境至LNP環境之pKa下降（例如，1-3點下降）先前在LNP文獻中並未得到認可，但已知的是脂質膜中之鹼性胺基酸。不希望受理論束縛，由於與水相相比脂質相中質子之溶劑合能更高以及來自陽離子LNP之質子的靜電排斥(它們可結合使水相至脂相的pKa降低1-3個點)，因此可找到合理的解釋。在某些實施例中，藉由檢查潛在候選物之pKa表並僅選擇具有適當pKa值之彼等，利用此能力來選擇特定的頭部基團及碳間隔基。以此方式可準確地消除大多數候選物，從而大大節省合成及測試時間與費用。
在某些實施例中，本發明涵蓋在脂質奈米顆粒(LNP)調配物中使用的經優化之本發明之可離子化脂質。示範性LNP包含本發明之可離子化脂質、第二脂質、類固醇、聚合物結合脂質及治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於LNP內或與LNP結合。
在某些實施例中，本發明者出乎意料地發現，本發明之可離子化脂質的優化調配物之特徵為與治療劑遞送相關之LNP性質提供了重要改良（例如，提高的穩定性及增強的遞送）。
在某些實施例中，包含在脂質奈米顆粒中的本發明之可離子化脂質係用於遞送核酸，諸如小干擾RNA、反義RNA、微RNA及/或傳信RNA。
因此，在一個實施例中，提供一種LNP，其包含：
i) 本發明之可離子化脂質；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑(例如，DNA或RNA)或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
另一實施例提供一種LNP，其包含：
i) 0.1至75莫耳百分比的本發明之可離子化脂質，其具有大於5.5之有效LNP pKa；
ii) 0至50莫耳百分比之中性或兩性離子脂質；
iii) 0至50莫耳百分比之陰離子脂質；
iv) 10至55莫耳百分比之類固醇；
v) 0.1至10莫耳百分比之聚合物結合脂質；及
vi) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合，
其中莫耳百分比係基於脂質奈米顆粒中存在的脂質之總莫耳數確定的。
另一實施例提供一種脂質奈米顆粒，其包含：
i) 具有有效pKa的本發明之可離子化脂質；
ii) 中性脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋用於脂質奈米顆粒中的包含本發明之可離子化脂質的醫藥組合物及其用於治療各種疾病或病狀(諸如由傳染性實體、癌症及/或蛋白質不足引起之彼等疾病或病狀)的方法。
在其他實施例中，本發明提供一種將治療劑靶向投與（例如，至特定組織或器官）至有此需要之患者的方法，該方法包含將本發明之可離子化脂質或包含其之醫藥組合物向受試者投與。
在某些特定實施例中，本發明涵蓋一種式V化合物：
Figure 02_image001
式 V
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環烷基環或雜芳環，
其中各R 3、R 4、R 13及R 14獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 15及R 16各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中w、x、y及z各自獨立地為0-10之整數；
其中各Q獨立地為O、NH、NR 1及S之原子；
其中各m為0至8之整數，較佳為0、1或2；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7)；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
一種式III化合物：
Figure 02_image003
式 III
其中各R 1’、R 1、R 2、R 11及R 12獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成環烷基環或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則與S或O連接之R 1為電子對；
其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9及R 10獨立地選自由以下組成之群： H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中x、y及z各自獨立地為0-10之整數；
其中G及Q各自獨立地為選自CH、O、N及S之原子；
其中m及n各自為0-8之整數；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 1R 2R 3)；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image005
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image007
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image009
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image011
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image013
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image015
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image017
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image019
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image021
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image023
。
在某些較佳實施例中，化合物具有以下結構：
Figure 02_image025
。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種脂質奈米顆粒，其包含：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的化合物；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑(例如mRNA)或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種脂質奈米顆粒，其包含：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的化合物；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種將核酸靶向遞送至受試者之方法，其包含向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的化合物；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑(例如mRNA或siRNA)或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種將核酸靶向遞送至受試者之方法，其包含向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的化合物；
ii) 第二脂質，例如，中性脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種脂質奈米顆粒，其包含：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的本發明之可離子化脂質；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種脂質奈米顆粒，其包含：
i) 具有以下結構之化合物：
Figure 02_image027
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種將核酸遞送至受試者之方法，其包含向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構所涵蓋的本發明之可離子化脂質；
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種將核酸遞送至受試者之方法，其包含向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構(例如，下式之化合物)所涵蓋的本發明之可離子化脂質；
Figure 02_image027
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
在其他實施例中，本發明涵蓋一種將包含治療性蛋白質、疫苗、基因編輯RNA之治療劑遞送至受試者之方法，該方法包含向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒：
i) 由式I、II、III、IV、V、VI或VII之結構(例如，具有以下結構之化合物)所涵蓋的本發明之可離子化脂質：
Figure 02_image027
ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質；
iii) 類固醇；
iv) 聚合物結合脂質；及
v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
V.1. [ 實施方式 ]
除非另有定義，或者除非具體上下文另有要求，否則本文所用的所有技術術語與相關技術領域之技術人員通常理解的含義相同。
在數字上下文中的百分比應理解為相對於各個項目之總數。在其他情況下，除非上下文另有說明，否則百分比應理解為重量百分比（wt.-%）或莫耳百分比（mol.-%）。
除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」應理解為包括複數個引用物。表述「一實施例」、「一特定實施例」、「一個實施例」及其類似表述意謂一具體特徵、性質或特性，或者特徵、性質或特性之一具體組或組合(當與相應表述組合提及時)存在於本發明之至少一個實施例中。在本說明書通篇之各個地方出現的此等表述不一定指代相同的實施例。此外，可在一或多個實施例中以任何適合之方式組合具體特徵、性質或特性。
如本文所用，「適應性免疫系統」由消除或阻止病原體生長及複製的高度特化的全身細胞及過程組成。適應性免疫反應為脊椎動物免疫系統提供識別及記憶特定病原體（例如，以產生免疫力）並在每次遇到病原體時發動更強大的攻擊之能力。由於體細胞超突變（體細胞突變頻率增加的過程）及V(D)J重組（抗原受體基因鏈段之不可逆基因重組），所以該系統具有高度的適應性。此機制允許少數基因產生大量不同的抗原受體，隨後在每個單獨的淋巴球上獨特地表現。由於基因重排造成每個細胞之DNA發生不可逆的變化，因此該細胞之所有後代（progeny/offspring）將繼承編碼相同受體特異性之基因，包括記憶B細胞及記憶T細胞，它們為長效特異性免疫之關鍵。免疫網絡理論為一種關於適應性免疫系統如何工作之理論，其係基於T細胞、B細胞受體之可變區與由具有可變區之T細胞及B細胞產生的分子之可變區之間的相互作用。如本文所用，術語「適應性免疫反應」通常應理解為抗原特異性的。抗原特異性允許產生專門針對特定抗原、病原體或病原體感染之細胞的反應。藉由「記憶細胞」在體內維持發動此等定製反應之能力。倘若病原體不止一次感染身體，則此等特定的記憶細胞便用於快速消除它。在此上下文中，適應性免疫反應之第一步為活化幼稚抗原特異性T細胞或不同的免疫細胞，此等細胞能夠藉由抗原呈遞細胞誘導抗原特異性免疫反應。這發生在幼稚T細胞不斷通過的淋巴組織及器官中。可充當抗原呈遞細胞之細胞類型尤其是樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞。此等細胞中之每種在引發免疫反應方面均具有獨特的功能。樹突狀細胞藉由吞噬作用及巨胞飲作用攝取抗原，並藉由與例如外來抗原接觸而經刺激以遷移至局部淋巴組織，在彼處它們分化為成熟的樹突狀細胞。巨噬細胞攝取顆粒抗原，諸如細菌，並由傳染原或其他適當的刺激物誘導以表現MHC分子。B細胞經由其受體結合及內化可溶性蛋白抗原之獨特能力對於誘導T細胞亦為重要的。在MHC分子上呈遞抗原會導致T細胞活化，從而誘導它們增殖並分化為經武裝之效應T細胞。效應T細胞最重要之功能為CD8+細胞毒性T細胞對感染細胞之殺滅及Th1細胞對巨噬細胞之活化，它們共同構成細胞介導之免疫，以及Th2及Th1細胞對B細胞之活化以產生不同種類之抗體，從而驅動體液免疫反應。T細胞經由它們的T細胞受體識別抗原，T細胞受體不直接識別及結合抗原，而是識別(例如病原體衍生之蛋白抗原的)短肽片段，此等抗原與其他細胞表面上的MHC分子結合。
如本文所用，最廣泛意義上之術語「佐劑或佐劑組分」通常為（例如，藥用或免疫）試劑或組合物，其可修飾(例如增強)其他試劑諸如藥物或疫苗之功效。習知地，該術語在本發明之上下文中係指用作免疫原及/或其他醫藥活性化合物之載劑或輔助物質的化合物或組合物。它應從廣義上解釋，並且係指能夠增加摻入或與相關佐劑共投與的抗原之免疫原性的廣譜物質。在本發明之上下文中，佐劑較佳將增強本發明活性劑之特定的免疫原性作用。通常，「佐劑」或「佐劑組分」具有相同含義並且可相互使用。佐劑可分為例如免疫增強劑、抗原遞送系統或甚至其組合。如本文所用，術語「佐劑」通常應理解為不包括自身賦予免疫力之試劑。佐劑非特異性地輔助免疫系統增強抗原特異性免疫反應，此係藉由例如促進抗原向免疫系統呈遞或誘導非特異性先天性免疫反應來達成。此外，佐劑較佳可藉由例如將佔優勢的基於Th2之抗原特異性反應轉變為更基於Th1之抗原特異性反應來例如調節抗原特異性免疫反應，反之亦然。因此，佐劑可有利地調節細胞介素表現/分泌、抗原呈遞、免疫反應類型等。
如本文所用，術語「烷基」意謂飽和、單價非支鏈或支鏈（經取代或未經取代之）烴鏈。烷基之實例包括但不限於(C 1-C 22)烷基，諸如甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基2-戊基、2,2-二甲基1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基及己基，以及更長烷基，諸如庚基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。
如本文所用，術語「烯基」意謂其中具有一或多個雙鍵之單價非支鏈或支鏈烴鏈。烯基之雙鍵可未經結合或與另一個不飽和基團結合。適合之烯基包括但不限於(C 2-C 22)烯基，諸如乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4- (2-甲基-3-丁烯)-戊烯基。烯基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。
如本文所用，術語「烷氧基」意謂-O-烷基，其中烷基如上文中所定義。烷氧基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，烷氧基之烷基鏈的長度為1至6個碳原子，在本文中稱為「(C 1-C 22)烷氧基」。
如本文所用，術語「烷氧羰基」意謂式-C(O)-烷基之單價基團。較佳地，烷氧羰基之烴鏈的長度為1至22個碳原子。
如本文所用，術語「炔基」意謂在其中具有一或多個參鍵之單價非支鏈或支鏈烴鏈。炔基之參鍵可未結合或結合至另一不飽和基團。適合之炔基包括但不限於(C 2-C 6)炔基，諸如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基及4-丁基-2-己炔基。炔基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。
如本文所用，在本發明之上下文中，「抗原」通常係指可由免疫系統(較佳由適應性免疫系統)識別並且能夠觸發抗原特異性免疫反應（例如，藉由形成抗體及/或抗原特異性T細胞作為適應性免疫反應之一部分）的物質。通常，抗原可為或可包含可由MHC呈遞給T細胞之肽或蛋白質。在本發明之意義上，抗原可為所提供的核酸分子(較佳如本文所定義之mRNA)之轉譯產物。在此上下文中，包含至少一個表位之肽及蛋白質的片段、變異體及衍生物亦應理解為抗原。
如本文所用，在本發明之上下文中的術語「提供抗原之mRNA」通常可為具有至少一個開放閱讀框之mRNA，該開放閱讀框可由具有該mRNA之細胞或生物轉譯。此轉譯之產物為一種肽或蛋白質，其可充當抗原，較佳充當免疫原。產物亦可為由一種以上免疫原構成之融合蛋白（例如，由兩個或更多個源自相同或不同病毒蛋白之表位、肽或蛋白質組成的融合蛋白），其中表位、肽或蛋白質可由連接子序列連接。
如本文所用，術語「人工mRNA（序列）」通常可理解為非天然存在之mRNA分子。換言之，人工mRNA分子可理解為非天然mRNA分子。此類mRNA分子可為非天然的，由於其單獨的序列（並非天然存在的）及/或由於其他修飾，例如並非天然存在的核苷酸之結構修飾。通常，人工mRNA分子可藉由基因工程方法設計及/或產生以對應於期望的人工核苷酸序列（異源序列）。在此情況下，人工序列通常為可能並非天然存在之序列，亦即它與野生型序列至少有一個核苷酸不同。術語「野生型」可理解為自然界中存在之序列。此外，術語「人工核酸分子」不限於表示「一個單一分子」，而是通常應理解為包含相同分子之集合。因此，它可能涉及包含在等分試樣中的複數個相同分子。
如本文所用，術語「芳基」意謂包含碳原子及氫原子之單環或多環芳族基團。適合之芳基的實例包括但不限於苯基、甲苯基、蒽基、茀基、茚基、薁基及萘基，以及苯并稠合碳環部分，諸如5,6,7,8-四氫萘基。芳基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，芳基為單環，其中該環包含6個碳原子，在本文中稱為「(C 6)芳基」。
如本文所用，術語「芳氧基」意謂-O-芳基，其中芳基如上所定義。芳氧基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，芳氧基之芳環為單環，其中該環包含6個碳原子，在本文中稱為「(C 6)芳氧基」。
如本文所用，術語「B細胞表位」通常為位於如本文所定義之（天然）蛋白質或肽抗原之外表面上的片段，較佳具有5至15個胺基酸、更佳具有5至12個胺基酸、甚至更佳具有6至9個胺基酸，其可由抗體識別，亦即以其天然形式。蛋白質或肽之此類表位亦可選自本文提及的此類蛋白質或肽之任何變異體。在此上下文中，抗原決定位可為構象或不連續表位，其係由本文所定義之蛋白質或肽之鏈段構成，此等片段在本文所定義之蛋白質或肽的胺基酸序列上係不連續的，但在三維結構上聚集在一起；或為由單一多肽鏈構成之連續或線性表位。
如本文所用，術語「苄基」意謂-CH 2-苯基。
如本文所用，術語「雙/多順反子mRNA」為通常可具有兩個（雙順反子）或更多個（多順反子）開放閱讀框（ORF）（編碼區或編碼序列）之mRNA。在此上下文中，開放閱讀框為可經轉譯成肽或蛋白質的若干核苷酸三聯體（密碼子）之序列。此類mRNA之轉譯產生兩個（雙順反子）或更多個（多順反子）不同轉譯產物（倘若ORF不相同）。為了在真核生物中表現，此類mRNA可例如包含內部核糖體進入位點(IRES)序列。
如本文所用，術語「CAP類似物」係指具有CAP功能性之非可聚合二核苷酸，因為其促進轉譯或定位及/或在摻入RNA分子之5'-末端時防止RNA分子降解。非可聚合意謂CAP類似物將僅在5'-末端處摻入，因為它沒有5'三磷酸，且因此不能藉由模板依賴性RNA聚合酶在3'-方向上延伸。在某些實施例中，5’-帽類似物利用Trilink Biotecchnologies CleanCap Technology - https://www.trilinkbiotech.com/cleancap。如本文所用，術語「CAP類似物」包括但不限於選自由以下組成之群的化學結構：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化之CAP類似物（例如GpppG）；二甲基化之CAP類似物（例如m2,7GpppG）、三甲基化之CAP類似物（例如m2,2,7GpppG）、二甲基化之對稱CAP類似物（例如m7Gpppm7G）或抗反向CAP類似物（例如ARCA；m7,2'OmeGpppG、 m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸衍生物）(Stepinski等人, 2001.RNA 7(10):1486-95)。其他CAP類似物先前已有描述(美國專利第7,074,596號、WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347及WO2013/059475)，其全文以引用之方式併入本文中。N7-(4-氯苯氧乙基)取代之二核苷酸CAP類似物之合成近期已有描述(Kore等人(2013) Bioorg. Med. Chem. 21(15): 4570-4)，其全文以引用之方式併入本文中。如本文所用，術語「5'-CAP結構」通常為添加至mRNA分子5'-末端的經修飾之核苷酸（CAP類似物），特別是鳥嘌呤核苷酸。較佳地，使用5′-5′-三磷酸鍵(亦稱為m7GpppN)添加5′-CAP。5′-CAP結構之進一步實例包括甘油基、反向去氧無鹼基殘基（部分）、4′,5′亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳環核苷酸、1,5-脫水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾之鹼基核苷酸、蘇-呋喃戊糖基核苷酸、非環3',4'-第二核苷酸、非環3,4-二羥基丁基核苷酸、非環3,5 二羥基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向無鹼基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、 胺基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或橋接或非橋接甲基膦酸酯部分。此等經修飾之5′-CAP結構可在本發明之上下文中用於修飾本發明組合物之mRNA序列。可在本發明之上下文中使用的進一步修飾之5'-CAP結構為CAP1（m7GpppN之相鄰核苷酸之核糖的額外甲基化）、CAP2（m7GpppN下游第2個核苷酸之核糖的額外甲基化）、CAP3 (m7GpppN下游第3個核苷酸之核糖的額外甲基化)、CAP4 (m7GpppN下游第4個核苷酸之核糖的額外甲基化)、ARCA(抗反向CAP類似物)、經修飾之ARCA(例如硫代磷酸酯修飾之ARCA)、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-去氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。在本發明之上下文中，亦可使用cCAP類似物在化學RNA合成或RNA活體外轉錄（共轉錄加帽）中形成5'-CAP結構，或者可使用加帽酶（例如市售加帽套組）在活體外形成CAP結構。
如本文所用，「胺甲醯基」意謂基團-C(O)N(R′) 2，其中R′係選自由氫、烷基及芳基組成之群。
如本文所用，「羰基」為式-C=(O)-之二價基團。
如本文所用，本發明之上下文中的術語「載劑」通常可為促進另一種化合物之運輸及/或複合的化合物。該載劑可與該其他化合物形成複合物。聚合載劑為由聚合物形成之載劑。
除非從特定上下文中清楚不同的含義，否則術語「陽離子的」意謂相應結構帶有正電荷，永久地或非永久地，但響應於某些條件（諸如pH值）。因此，術語「陽離子」涵蓋「永久陽離子」及「可陽離子化」。如本文所用，「永久陽離子的」意謂相應化合物或基團或原子在其環境之任何pH值或氫離子活性下帶正電。通常，正電荷係由第四氮原子之存在引起的。當化合物帶有複數個此類正電荷時，它可稱為永久多陽離子，其為永久陽離子之一子類。
如本文所用，術語「細胞免疫/細胞免疫反應」通常涉及巨噬細胞、自然殺手細胞(NK)、抗原特異性細胞毒性T淋巴球之活化，以及響應於抗原的各種細胞介素之釋放。更一般而言，細胞免疫與抗體無關，而是與免疫系統細胞之活化有關。細胞免疫反應之特徵在於例如活化抗原特異性細胞毒性T淋巴球，此等T淋巴球能夠誘導在其表面上顯示抗原表位之體細胞的凋亡，諸如病毒感染之細胞、具有胞內細菌之細胞及顯示腫瘤抗原之癌細胞；活化巨噬細胞及自然殺手細胞，使它們能夠消滅病原體；及刺激細胞分泌多種細胞介素，此等細胞介素會影響其他參與適應性免疫反應及先天性免疫反應之細胞的功能。
在本發明之上下文中，「組合物」係指其中特定成分可視情況與任何其他成分(通常與至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑)一起摻入的任何類型之組合物。因此，組合物可為乾組合物諸如粉末或顆粒，或固體單元諸如凍乾形式或錠劑。或者，組合物可呈液體形式，並且各成分可以溶解或分散（例如懸浮或乳化）形式獨立地摻入。在較佳實施例之一者中，組合物經調配成無菌固體組合物，諸如粉末或凍乾形式，以便用含水液體載劑復原。對於包含如下文進一步詳細描述之核酸貨物的彼等形式之組合物，此類調配物亦為較佳的。
如本文所用，「化合物」意謂化學物質（例如，本發明之可離子化脂質），其為由具有基本相同之化學結構及性質的分子組成之材料。對於小分子化合物，分子在其原子組成及結構構型方面通常係相同的。對於大分子或聚合化合物，化合物之分子高度相似，但不一定全部相同。例如，稱為由50個單體單元組成之聚合物鏈段亦可含有單個分子，例如具有48或53個單體單元。
除非上下文另有指示或要求，否則「包含」、「含有」及「包括」以及類似表述在本說明書及申請專利範圍中應在開放及包容之意義上解釋為「包括但不限於」。
如本文所用，術語「環烷基」意謂包含碳及氫原子且不具有碳-碳多重鍵之單環或多環飽和環。環烷基之實例包括但不限於(C 3-C 7)環烷基，諸如環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基，以及飽和環狀及雙環萜烯。環烷基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，環烷基為單環或雙環。
如本文所用，術語「肽或蛋白質之衍生物」通常應理解為一種分子，該分子衍生自另一分子諸如該肽或蛋白質。肽或蛋白質之「衍生物」亦涵蓋包含用於本發明中之肽或蛋白質的融合物。例如，融合物包含標記物，諸如表位，例如FLAG表位或V5表位。例如，表位為FLAG表位。此類標籤適用於例如純化融合蛋白。
如本文所用，術語「表位（亦稱為「抗原決定位」）：係指T細胞表位或蛋白質之部分在本發明之上下文中可包含較佳具有約6至約20個或甚至更多個胺基酸之長度的片段，例如由MHC I類分子加工及呈遞之片段，較佳具有約8至約10個胺基酸、例如8、9或10個（或甚至11或12個胺基酸）之長度；或由MHC II類分子加工及呈遞之片段，較佳具有約13個或更多個胺基酸、例如13、14、15、16、17、18、19、20個或甚至更多個胺基酸之長度，其中此等片段可選自胺基酸序列之任何部分。此等片段通常以由肽片段及MHC 分子組成之複合物形式由T細胞識別。
如本文所用，術語蛋白質或肽之「片段」在本發明之上下文中通常可包含如本文所定義之蛋白質或肽之序列，亦即就其胺基酸序列（或其編碼核酸分子）而言，與原始（天然）蛋白質（或其編碼核酸分子）之胺基酸序列相比，N端及/或C端經截短。因此，此類截短可發生在胺基酸層面上或相應地發生在核酸層面上。因此，關於如本文所定義之此類片段之序列一致性較佳可指如本文所定義之完整蛋白質或肽或此類蛋白質或肽之完整（編碼）核酸分子。在此上下文下，蛋白質之片段通常可包含與相應的天然存在之全長蛋白質的胺基酸序列具有至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%及最佳至少95%或甚至97%之序列一致性的胺基酸序列。
如本文所用，在本發明之上下文中的術語「蛋白質或肽之片段」亦可包含如本文所定義之蛋白質或肽的序列，其具有例如至少5個胺基酸之長度，較佳長度為至少6個胺基酸，較佳至少7個胺基酸，更佳至少8個胺基酸，甚至更佳至少9個胺基酸；甚至更佳至少10個胺基酸；甚至更佳至少11個胺基酸；甚至更佳至少12個胺基酸；甚至更佳至少13個胺基酸；甚至更佳至少14個胺基酸；甚至更佳至少15個胺基酸；甚至更佳至少16個胺基酸；甚至更佳至少17個胺基酸；甚至更佳至少18個胺基酸；甚至更佳至少19個胺基酸；甚至更佳至少20個胺基酸；甚至更佳至少25個胺基酸；甚至更佳至少30個胺基酸；甚至更佳至少35個胺基酸；甚至更佳至少50個胺基酸；或最佳至少100個胺基酸。例如，此類片段可具有約6至約20個或甚至更多個胺基酸之長度，例如，由MHC I類分子加工及呈遞之片段，較佳具有約8至約10個胺基酸、例如8、9或10個（或甚至6、7、11或12個胺基酸）之長度；或由MHC II類分子加工及呈遞之片段，較佳具有約13個或更多個胺基酸、例如13、14、15、16、17、18、19、20個或甚至更多個胺基酸之長度，其中此等片段可選自胺基酸序列之任何部分。此等片段通常以由肽片段及MHC分子組成之複合物形式由T細胞識別，亦即，該等片段通常不會以其天然形式被識別。蛋白質或肽之片段可包含彼等蛋白質或肽之至少一個表位。此外，蛋白質之結構域，如胞外結構域、胞內結構域或跨膜結構域以及蛋白質之縮短或截短形式亦可理解為包含蛋白質之片段。
如本文所用，如本文所用之術語「全長蛋白質」通常係指實質上包含天然存在之蛋白質的完整胺基酸序列之蛋白質。然而，胺基酸之取代(例如由於蛋白質中之突變所致)亦涵蓋在術語全長蛋白質中。
如本文所用，「鹵素」意謂氟、氯、溴或碘。因此，術語「鹵基」及「Hal」之含義涵蓋氟、氯、溴及碘。
如本文所用，術語「雜芳基」意謂包含碳原子、氫原子以及一或多個雜原子、較佳1至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的單環或多環芳環。雜芳基之說明性實例包括但不限於吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡唑基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基及(1,2,4)-三唑基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、呋喃基、苯基、異噁唑基及噁唑基。雜芳基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，雜芳基為單環，其中環包含2至5個碳原子及1至3個雜原子，在本文中稱為「(C 2-C 5)雜芳基」。
如本文所用，術語「雜環烷基」意謂包含碳原子及氫原子以及至少一個雜原子，較佳1至3個選自氮、氧及硫之雜原子且不具有不飽和度的單環或多環。雜環烷基之實例包括吡咯啶基、N-吡咯啶基、哌啶基、N-哌啶基、哌嗪基、N-哌嗪基、嗎啉基、N-嗎啉基、硫代嗎啉基、二氧戊環基、N-硫代嗎啉基及哌喃基。雜環烷基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，雜環烷基為單環或雙環，更佳為單環，其中該環包含3至6個碳原子及1至3個雜原子，在本文中稱為(C 1-C 6)雜環烷基。
如本文所用，術語「雜環基團」或「雜環」係指雜環烷基或雜芳基。
如本文所用，術語「體液免疫」通常係指抗體產生及可伴隨其之輔助過程。體液免疫反應之典型特徵可為例如Th2活化及細胞介素產生、生髮中心形成及同種型轉換、親和力成熟及記憶細胞生成。體液免疫通常亦可指抗體之效應功能，包括病原體及毒素中和、經典補體活化及調理素促進吞噬作用及病原體消除。
如本文所用，術語「水合物」意謂本發明之化合物或其鹽，其進一步包括化學計量或非化學計量之量的經由非共價分子間力結合之水。術語水合物包括溶劑合物，其為化學計量或非化學計量之量的經由非共價分子間力結合之溶劑。較佳溶劑為揮發性的、無毒的及/或為以痕量向人類投與可接受的。
如本文所用，術語「烴基」意謂選自(C 1-C 22)烷基、(C 2-C 22)烯基及(C 2-C 8)炔基之單價基團，視情況經一或兩個適合之取代基取代。較佳地，烴基之烴鏈長度為1至22個碳原子，在某些情況下在本文中稱為「(C 1-C 22)烴基」。
如本文所用，術語「序列一致性」意謂兩個序列(例如，如本文所定義之核酸序列或胺基酸序列，較佳由如本文所定義之聚合載劑之核酸序列編碼的胺基酸序列或胺基酸序列本身)相同之百分比，可比對序列以便隨後進行相互比較。因此，例如可將第一序列之位置與第二序列之相應位置進行比較。若第一序列中之某位置與第二序列中之某位置一樣由相同組分（殘基）佔據，則兩個序列在此位置上為相同的。若並非此情況，則此位置處之序列不同。若與第一序列相比，在第二序列中發生插入，則可將空位插入第一序列中以允許進一步比對。若與第一序列相比，在第二序列中出現缺失，則可將空位插入第二序列中以允許進一步比對。兩個序列相同之百分比為相同位置之數量除以包括僅在一個序列中被佔據之彼等位置的位置之總數的函數。可使用數學算法判定兩個序列相同之百分比。可使用之數學算法之較佳但非限制性實例為Karlin等人(1993), PNAS USA, 90:5873-5877或Altschul等人(1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402之算法。此類算法集成在BLAST程式中。藉由此程式可鑑定與本發明之序列在一定程度上相同之序列。
如本文所用，術語「免疫系統」可保護生物免受感染。若病原體突破生物之物理屏障並進入此生物，則先天性免疫系統會提供立即但非特異性反應。若病原體逃避此先天反應，則脊椎動物會擁有第二層保護，即適應性免疫系統。在此，免疫系統在感染期間調整其反應以提高其對病原體之識別。此經改善之反應會在病原體被清除後以免疫記憶形式保留下來，並允許適應性免疫系統在每次遇到此病原體時發起更快、更強之攻擊。據此，免疫系統包含先天性免疫系統及適應性免疫系統。該兩個部分各自皆包含所謂的體液及細胞組分。
如本文所用，術語「免疫反應」通常可為適應性免疫系統對特定抗原之特異性反應（所謂的特異性或適應性免疫反應）或先天性免疫系統之非特異性反應（所謂的非特異性或先天性免疫反應）。本發明係關於適應性免疫系統之特異性反應（適應性免疫反應）的核心。具體地，它涉及對病毒(例如像病流感毒)感染之適應性免疫反應。然而，此特異性反應可得到額外的非特異性反應（先天性免疫反應）之支持。因此，本發明亦涉及用於同時刺激先天性及適應性免疫系統以引起有效的適應性免疫反應之化合物。
如本文所用，在本發明之上下文中的術語「免疫刺激性RNA(isRNA)」通常可為能夠自身誘導先天性免疫反應之RNA。它通常沒有開放閱讀框，且因此不提供肽抗原或免疫原，但會例如藉由與特定種類之Toll樣受體(TLR)或其他合適的受體結合而引發先天性免疫反應。然而，當然，具有開放閱讀框並編碼肽/蛋白質（例如抗原功能）之mRNA亦可誘導先天性免疫反應。
如本文所用，術語「流感大流行或大流行性流感」可在非人類（新型）流感病毒獲得有效及持續的人際傳播能力繼之在全球傳播時出現。具有引起大流行潛力之流感病毒係稱為「具有大流行潛力之流感病毒」或「大流行性流感病毒」。具有大流行潛力之流感病毒之實例包括A型禽流感(H5N1)及A型禽流感(H7N9)，它們為兩種不同的「禽流感」病毒。它們為非人類病毒（亦即它們在人類中為新穎病毒，且在世界部分地區之鳥類中傳播），因此人類對此等病毒幾乎沒有免疫力。人類感染此等病毒之情況很少發生，但若此等病毒中之任一種發生變化，使其能夠輕易感染人類並易於在人與人之間傳播，則可能導致流感大流行。
如本文所用，術語「先天性免疫系統」亦稱為非特異性免疫系統，包含以非特異性方式保護宿主免受其他生物感染之細胞及機制。此意味著先天系統之細胞以通用方式識別病原體並對其做出反應，但與適應性免疫系統不同的是，它不會賦予宿主以持久或保護性免疫。先天性免疫系統可例如由病原體相關分子模式(PAMP)受體之配體活化，例如Toll樣受體(TLR)或其他輔助物質，諸如脂多醣、TNF-α、CD40配體或細胞介素、單核介素、淋巴介素、白細胞介素或趨化介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生長因子及hGH；人類Toll樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10之配體；鼠類Toll樣受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13之配體；NOD樣受體之配體、RIG-I樣受體之配體、免疫刺激性核酸、免疫刺激性RNA（isRNA）、CpG-DNA、抗細菌劑或抗病毒劑。典型地，先天性免疫系統之反應包括經由產生化學因子（包括稱為細胞介素之專門的化學介質）將免疫細胞募集至感染部位；補體級聯之活化；經由專門的白細胞鑑定並移除器官、組織、血液及淋巴中存在的外來物質；經由稱為抗原呈遞之過程活化適應性免疫系統；及/或充當傳染原之物理及化學屏障。
如本文所用，術語「可離子化」（例如，如在術語「本發明之可離子化脂質」中所用）意謂化合物或基團或原子在其環境之某個pH值下帶電而在其環境之另一pH值下不帶電。同樣，在無法判定pH值之非水環境中，可離子化之化合物、基團或原子在氫離子濃度高時帶正電，而在氫離子濃度或活性低時帶負電或不帶電。此視可離子化或可多離子化化合物之個別特性，特別是相應可離子化基團或原子之pKa而定，在該pH值或氫離子濃度下它帶電或不帶電。在經稀釋之水性環境中，可使用熟習此項技術者熟知之所謂的亨德森-哈瑟爾巴赫方程估計帶有電荷之可離子化化合物、基團或原子的分率。例如，在一些實施例中，若化合物或部分為可離子化的，則最好其在以下條件下帶正電：約1至9、較佳4至9、5至8或甚至6至8之pH值下，更佳等於或低於9、等於或低於8、等於或低於7之pH值下，最佳在生理pH值，例如約7.3至7.4下，亦即在生理條件下，特別是在活體內細胞之生理鹽條件下。在其他實施例中，可離子化化合物或部分在生理pH值(例如約7.0-7.4)下主要為中性的，但在較低pH值下帶正電。在一些實施例中，可陽離子化之化合物或部分的較佳pKa範圍為約5至約7。
如本文所用，片語「本發明之可離子化脂質」意謂本文所揭示之化合物，包括本文所揭示之可離子化脂質奈米顆粒化合物。本發明之特定化合物為式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX之化合物及其醫藥學上可接受之鹽、水合物、鏡像異構物、非鏡像異構物、外消旋物或立體異構物之混合物。因此，「本發明之可離子化脂質」統稱為式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX之化合物及其醫藥學上可接受之鹽、水合物、鏡像異構物、非鏡像異構物、外消旋物或立體異構物之混合物。本發明之可離子化脂質在本文中由它們的化學結構及/或化學名稱鑑定。當化合物由化學結構及化學名稱兩者提及且化學結構與化學名稱衝突時，以化學結構為主。術語「本發明之可離子化脂質」通常係指能夠帶電之分子，其例如在通常約1至9之pH值下帶正電（陽離子）。在一些實施例中，陽離子組分/化合物較佳在等於或低於9(例如5至9)、等於或低於8(例如5至8)、等於或低於7(例如5至7)之pH值下，最佳在生理pH值、例如約7.3至7.4下，以及體細胞pH值、例如約7至5下帶電。因此，根據本發明之一個實施例的陽離子肽、蛋白質、多醣、脂質或聚合物，在某些實施例中，在生理條件下，特別是在活體內細胞之生理鹽條件下帶正電。在另一較佳實施例中，根據本發明之脂質奈米顆粒、陽離子肽、蛋白質、多醣、脂質或聚合物在生理條件下，特別是在活體內細胞之生理鹽條件下不帶電、具有中性電荷或分別呈電中性的。陽離子肽或蛋白質較佳含有更大量之陽離子胺基酸，例如，比其他胺基酸殘基更多的Arg、His、Lys或Orn（特別是比陰離子胺基酸殘基如Asp或Glu多的陽離子胺基酸）或包含主要由陽離子胺基酸殘基形成之嵌段。表述「陽離子」亦可指「多陽離子」組分/化合物。陽離子組分/化合物亦可指能夠帶正電之陽離子脂質。示範性陽離子脂質包括一或多個帶有正電荷之胺基團。較佳陽離子脂質為可離子化的，使得它們可視pH值而以帶正電或中性形式存在。在不同pH值條件下，陽離子脂質之離子化會影響脂質奈米顆粒(LNP)之表面電荷。此電荷狀態會影響血漿蛋白質吸收、血液清除及組織分佈(Semple, S. C.,等人, Adv.Drug Deliv Rev 32:3-17 (1998))以及形成非雙層結構之能力(Hafez, I. M.,等人, Gene Ther 8:1188-1196 (2001))，這對核酸之胞內遞送至關重要。如別處所述，經調配之陽離子脂質的pKa與LNP遞送核酸之有效性相關(參見Jayaraman等人, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533；Semple等人, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010))。在本發明之一些實施例中，pKa之較佳範圍為約5至約7。在較佳實施例中，本發明之可離子化脂質具有中性電荷，在pH 7附近帶有輕微的正電荷或負電荷。本發明之可離子化脂質可含有一或多個對掌性中心及/或雙鍵，且因此以立體異構物形式存在，諸如雙鍵異構物（即幾何異構物）、鏡像異構物或非鏡像異構物。根據本發明，本文所描繪之化學結構及由此本發明之可離子化脂質涵蓋所有相應化合物之鏡像異構物及立體異構物，亦即立體異構純形式（例如幾何純、鏡像異構純或非鏡像異構純）以及鏡像異構物與立體異構物之混合物。當化合物相對於特定對掌性中心為約90% ee（鏡像異構過量）或更高、較佳等於或大於95% ee時，本發明之可離子化脂質被視為具有光學活性或相對於對掌性中心呈鏡像異構富集的（亦即，實質上呈R型或實質上呈S型）。當化合物相對於特定對掌性中心具有大於約1% ee、較佳大於約5% ee、更佳大於約10% ee之鏡像異構過量時，本發明之可離子化脂質被視為呈鏡像異構富集形式。當化合物相對於特定對掌性中心為約90% de（非鏡像異構過量）或更高、較佳等於或大於95% de時，本發明之可離子化脂質被視為相對於多個對掌性中心呈非鏡像異構純的。當化合物相對於特定對掌性中心具有大於約1% de、較佳大於約5% de、更佳大於約10% de之非鏡像異構過量時，本發明之可離子化脂質被視為呈非鏡像異構富集形式。如本文所用，外消旋混合物意謂相對於分子中的所有對掌性中心，約50%之一種鏡像異構物與約50%之其相應鏡像異構物。因此，本發明涵蓋式I至V化合物之所有鏡像異構純、鏡像異構富集、非鏡像異構純、非鏡像異構富集及外消旋混合物。鏡像異構物與非鏡像異構物混合物可藉由以下熟知之方法拆分成它們的組分鏡像異構物或立體異構物：諸如對掌性氣相層析、對掌性高效液相層析、化合物結晶成對掌性鹽複合物或化合物在對掌性溶劑中結晶。鏡像異構物及非鏡像異構物亦可藉由熟知之不對稱合成方法，由非鏡像異構或鏡像異構純的中間物、試劑及催化劑獲得。本發明之可離子化脂質在本文中由它們的化學結構及/或化學名稱定義。若化合物同時由化學結構與化學名稱提及且化學結構與化學名稱發生衝突，則化學結構決定化合物之身份。當向患者，例如向用於獸醫用途或供改良家畜用之動物，或向用於臨床用途之人類投與時，本發明之可離子化脂質以分離形式或作為醫藥組合物中之分離形式投與。如本文所用，「經分離之」意謂本發明化合物與以下之其他組分分離：(a)天然來源，諸如植物或細胞，較佳細菌培養物，或(b)合成有機化學反應混合物。較佳地，經由習知技術純化本發明之可離子化脂質。如本文所用，「經純化之」意謂當分離時，分離物含有以分離物之重量計至少95%、較佳至少98%本發明之單一羥基化合物。
如本文所用，術語「噴射注射」如本文所用係指無針注射方法，其中迫使含有至少一種本發明之mRNA序列及視情況選用之其他合適賦形劑的流體穿過孔口，從而產生能夠穿透哺乳動物皮膚且根據注射設置，能夠穿透皮下組織或肌肉組織之超細高壓液體流。原則上，液體流在皮膚上形成一個孔，液體流通過該孔被推入靶組織。較佳地，噴射注射係用於皮內、皮下或肌內注射根據本發明之mRNA序列。在一較佳實施例中，噴射注射係用於肌內注射根據本發明之mRNA序列。在又一較佳實施例中，噴射注射係用於皮內注射根據本發明之mRNA序列。
如本文所用，術語「類脂質化合物」，亦簡稱為類脂質，係脂質樣化合物，亦即具有脂質樣物理特性之兩親化合物。在本發明之上下文中，術語脂質被視為涵蓋類脂質。
如本文所用，術語「微針注射」係指用於跨越各種屏障遞送疫苗或其他藥物之顯微投與器：雖然經皮投與為微針最流行之用途，但眼內及耳蝸內微針藥物遞送系統正在興起。微針係藉由各種方法構建的，通常涉及光刻製程或微成型。此等方法包括將顯微結構蝕刻於樹脂或矽中以鑄造微針。微針由多種材料製成，包括矽、鈦、不銹鋼及聚合物。一些微針由有待遞送至身體之藥物製成，但經成型成針狀，因此它們可穿透皮膚。微針之尺寸、形狀及功能各不相同，但均用作其他遞送方法如習知皮下注射針或其他注射裝置之替代。
如本文所用，術語「單順反子mRNA」通常可為僅包含一個開放閱讀框（編碼序列或編碼區）之mRNA。在此上下文中，開放閱讀框為可經轉譯成肽或蛋白質的若干核苷酸三聯體（密碼子）之序列。
如本文所用，術語「核酸」意謂任何DNA或RNA分子。該術語可用於多核苷酸及/或寡核苷酸。無論在本文中何處提及編碼特定蛋白質及/或肽之核酸或核酸序列，該核酸或核酸序列分別較佳亦包含調控序列，其允許編碼特定蛋白質或肽之核酸序列在合適的宿主(例如人類)中表現，亦即轉錄及/或轉譯。
如本文所用，術語「核苷修飾」在本發明之上下文中，術語核苷修飾係指包含核苷之mRNA分子或化合物，其通常並非mRNA之一部分，較佳為非天然核苷。具體而言，該術語較佳係指除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶及在一些情況下胸腺嘧啶之外的mRNA核苷。
如本文所用，術語「肽」為至少兩種胺基酸單體之寡聚物或聚合物。通常單體經由肽鍵連接。術語「肽」不限制胺基酸聚合物鏈之長度。在本發明之一些實施例中，肽可例如含有少於50個單體單元。較長之肽亦稱為多肽，通常具有50至600個單體單元，更具體地具有50至300個單體單元。
如本文所述，「核苷」係定義為包含五碳糖分子(戊糖或核糖)或其衍生物及有機鹼、嘌呤或嘧啶或其衍生物之化合物。如本文所述，「核苷酸」係定義為由磷酸基團組成之核苷。在一些實施例中，化學修飾可包括胺基、硫醇基、烷基或鹵基。在一些實施例中，經修飾之核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、 5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。在一些實施例中、經修飾之核苷包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯胞苷、5-甲醯胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷 2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。在其他實施例中，經修飾之核苷包括2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤。在一些實施例中，經修飾之核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷(wyosine)、懷丁苷(wybutosine)、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受之鹽」包括但不限於可存在於本發明化合物中的酸性或鹼性基團之鹽。本質上呈鹼性之化合物能夠與各種無機酸及有機酸形成廣泛多種鹽。可用於製備此類鹼性化合物的醫藥學上可接受之酸加成鹽之酸為形成無毒酸加成鹽之彼等酸，亦即含有醫藥學上可接受之陰離子的鹽，包括但不限於硫酸、檸檬酸、順丁烯二酸、乙酸、草酸、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、葡萄糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽（亦即，1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。除上述酸外，包含胺基部分之本發明化合物亦可與各種胺基酸形成醫藥學上可接受之鹽。本質上呈酸性之本發明化合物能夠與各種藥理學上可接受之陽離子形成鹼鹽。此類鹽之實例包括鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，且具體包括鈣、鎂、鈉、鋰、鋅、鉀及鐵鹽。
如本文所用，在本發明之上下文中的術語「醫藥有效量」通常應理解為足以誘導免疫反應之量。
如本文所用，術語「苯基」意謂-C 6H 5。苯基可未經取代或經一或兩個適合之取代基取代，其中該取代基置換苯基之H。如本文所用，「Ph」表示苯基或經取代之苯基。
如本文所用，前綴「聚-」係指化合物中具有各自特性之複數個原子或基團。若置於括號中，則複數之存在為視情況可選的。例如，(多)陽離子意謂陽離子及/或多陽離子。然而，前綴之缺失不應解釋為排除複數個。例如，多陽離子化合物亦為陽離子化合物並且可如此提及。
如本文所用，術語「聚-A-尾」，亦稱為「3'-聚(A)尾或聚(A)序列」，通常為添加至RNA之3'-末端上的腺苷核苷酸之長序列，長達約400個腺苷核苷酸，例如 約25至約400、較佳約50至約400、更佳約50至約300、甚至更佳約50至約250、最佳約60至約250個腺苷核苷酸。此外，聚(A)序列或聚(A)尾可例如使用源自大腸桿菌或酵母之聚(A)聚合酶，藉由RNA之酶促多腺苷酸化在活體外生成。
如本文所用，術語「多腺苷酸化」通常應理解為將聚(A)序列添加至核酸分子，諸如RNA分子，例如至早熟mRNA中。多腺苷酸化可由所謂的多腺苷酸化訊號誘導。此訊號較佳位於有待多腺苷酸化的核酸分子(諸如RNA分子)之3'-末端處的一段核苷酸內。多腺苷酸化訊號通常包含由腺嘌呤及尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸組成的六聚物，較佳為六聚物序列AAUAAA。亦可想到其他序列，較佳六聚物序列。多腺苷酸化通常發生在前體mRNA（亦稱為早熟mRNA）之加工過程中。通常，RNA成熟（自前體mRNA至成熟mRNA）包括多腺苷酸化步驟。
如本文所用，術語「聚(C)序列」通常為胞嘧啶核苷酸之長序列，通常具有約10至約200個胞嘧啶核苷酸、較佳約10至約100個胞嘧啶核苷酸、更佳約10至約70個胞嘧啶核苷酸或甚至更佳約20至約50或甚至約20至約30個胞嘧啶核苷酸。聚(C)序列較佳可位於核酸所包含的編碼區之3′處。
如本文所用，術語「蛋白質」通常由折疊成3維形式以促進生物學功能的一或多種肽及/或多肽組成。
如本文所用，術語「Pyr」、「Pyrd」及「PyrD」可互換使用並且係指吡啶或吡啶基取代基。
如本文所用，RNA涵蓋傳訊RNA與經修飾之傳訊RNA，以及編碼（cRNA）與非編碼RNA（ncRNA），包括管家ncRNA（轉移RNA（亦即tRNA）及核糖體RNA（亦即rRNA））及調節性ncRNA，其 根據它們的大小進一步分類，包括至少有200個核苷酸之長ncRNA (lncRNA)及少於200個核苷酸之小ncRNA，包括微小RNA (miRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、小核RNA (snRNA)、小干擾RNA (siRNA)及PIWI相互作用RNA (piRNA)。
如本文所用，術語「RNA活體外轉錄」或「活體外轉錄」涉及其中在無細胞系統（活體外）中合成RNA的過程。DNA，尤其是質體DNA，係用作生成RNA轉錄物之模板。RNA可藉由適當的DNA模板之DNA依賴性活體外轉錄獲得，根據本發明，其較佳為線性化質體DNA模板。用於控制活體外轉錄之啟動子可為任何DNA依賴性RNA聚合酶之任何啟動子。DNA依賴性RNA聚合酶之具體實例為T7、T3及SP6 RNA聚合酶。用於活體外RNA轉錄之DNA模板可藉由選殖核酸，特別是對應於有待活體外轉錄之各個RNA的cDNA，並將其引入用於活體外轉錄之適當載體例如質體DNA中來獲得。在本發明之一較佳實施例中，DNA模板在活體外轉錄前用適合之限制性酶線性化。cDNA可藉由mRNA之反轉錄或化學合成獲得。此外，活體外合成RNA之DNA模板亦可藉由基因合成獲得。如本文所用，用於活體外轉錄之方法係此項技術已知的(參見，例如Geall等人 (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159；Brunelle等人 (2013) Methods Enzymol. 530:101-14)。用於該方法中之試劑通常包括：
1)線性化DNA模板，其啟動子序列對其各自的RNA聚合酶（諸如噬菌體編碼之RNA聚合酶）具有高結合親和力；
2)四種鹼基（腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿嘧啶）之核糖核苷三磷酸(NTP)；
3)視情況選用的如上定義之CAP類似物（例如，m7G(5′)ppp(5′)G (m7G)或10.1126/scitranslmed.aav5701）：使用帶有2'-O-甲基轉移酶（ScriptCap，CELLSCRIPT）之m7G加帽套組對RNA進行加帽以獲得cap1）；
4)能夠與線性化DNA模板內的啟動子序列結合的DNA依賴性RNA聚合酶（例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶）；
5)視情況選用之核糖核酸酶(RNase)抑制劑以滅活任何污染的RNase；
6)視情況選用之焦磷酸酶以降解焦磷酸，焦磷酸會抑制轉錄；
7)MgCl 2，其提供Mg2+離子作為聚合酶之輔因子；
8)維持適合的pH值之緩衝液，其亦可包含最佳濃度之抗氧化劑（例如DTT）及/或多胺，諸如亞精胺。
如本文所用，術語「穩定的核酸，較佳mRNA」通常呈現出增強對活體內降解（例如藉由外切或內切核酸酶之降解）及/或離體降解（例如藉由疫苗投與之前的製造過程，例如在有待投與之疫苗溶液之製備過程中之降解）之抗性的修飾。例如，可藉由提供5'-CAP-結構、聚-A-尾或任何其他UTR修飾來達成RNA之穩定化。其亦可藉由化學修飾或核酸之G/C含量的修飾來達成。各種其他方法為此項技術已知的並且在本發明之上下文中可想到。
如本文所用，「實質上」包含化合物之組合物意謂該組合物含有大於約80重量%、更佳大於約90重量%、甚至更佳大於約95重量%、且最佳大於約97重量%之該化合物。
如本文所用，「實質上完成」之反應意謂該反應含有大於約80重量%之所需產物、更佳大於約 90重量%之所需產物、甚至更佳大於約95%重量%之所需產物、且最佳大於約97重量%之所需產物。
如本文所用，「實質上不含」化合物之組合物意謂該組合物含有小於約20重量%、更佳小於約10重量%、甚至更佳小於約5重量%、且最佳小於約3重量%之該化合物。
如本文所用，「經取代之」或「取代基」各自意謂不會使本發明化合物或適用於製備它們之中間物的合成或藥學效用無效之基團。適合之取代基之實例包括但不限於：-NH 2；CN；鹵基；雜環烷基；雜環芳基；(C 1-C 22)烷基；(C 2-C 22)烯基；(C 2-C 22)炔基；(C 6)芳基；(C 2-C 5)雜芳基；(C 3-C 7)環烷基；(C 1-C 8)烷氧基；(C 6)芳氧基；-CN；-OH；側氧基；鹵基；-CO 2H；-NH 2；-NH((C 1-C 22)烷基)；-N((C 1-C 22)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-CHO；-CO((C 1-C 22)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 22)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 22)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)或可充當適合之取代基的本文所鑑定之任何基團。熟習此項技術者可易於根據本發明化合物之穩定性以及藥理及合成活性選擇合適的取代基。
如本文所用，術語「5'端寡嘧啶束(TOP)」通常為位於核酸分子之5'端區，諸如某些mRNA分子之5'端區或功能實體之5'端區(例如，某些基因之轉錄區)的一段嘧啶核苷酸。該序列以通常對應於轉錄起始位點之胞苷開始，且繼之為一段通常約3至30個嘧啶核苷酸之序列。例如，TOP可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或甚至更多個核苷酸。嘧啶段及由此5'-TOP在位於TOP下游的第一個嘌呤核苷酸之5'處以一個核苷酸終止。包含5'端寡嘧啶束之傳訊RNA通常稱為TOP mRNA。因此，提供此類傳訊RNA之基因係稱為TOP基因。TOP序列已例如見於編碼肽延伸因子及核糖體蛋白之基因及mRNA中。
如本文所用，術語「TOP模體」為對應於如上所定義之5'-TOP的核酸序列。因此，在本發明之上下文中的TOP模體較佳為一段長度達3-30個核苷酸之嘧啶核苷酸。較佳地，TOP模體由至少3個嘧啶核苷酸、較佳至少4個嘧啶核苷酸、較佳至少5個嘧啶核苷酸、更佳至少6個核苷酸、更佳至少7個核苷酸、最佳至少8個嘧啶核苷酸組成，其中嘧啶核苷酸段較佳在其5'-末端以胞嘧啶核苷酸開始。在TOP基因及TOP mRNA中，TOP模體較佳在其5'-末端以轉錄起始位點開始，並在該基因或mRNA中第一個嘌呤殘基之5′處以一個核苷酸終止。在本發明之意義上的TOP模體較佳位於代表5'-UTR的序列之5'-末端或編碼5'-UTR的序列之5'-末端。因此，較佳地，若一段3個或更多個嘧啶核苷酸之序列位於相應序列(諸如本發明mRNA、本發明mRNA之5′-UTR元件或源自如本文所述的TOP基因之5'-UTR的核酸序列)之5′末端，則此段序列在本發明之意義上係稱作「TOP模體」。換言之，若一段3個或更多個嘧啶核苷酸之序列不位於5'-UTR或5'-UTR元件之5'-末端，而是位於5'-UTR或5'-UTR元件內的任何位置，則其最好不稱作「TOP模體」。
如本文所用，術語「TOP基因」通常以存在5'-端寡嘧啶束為特徵。此外，大多數TOP基因之特徵為與生長相關之轉譯調控。然而，具有組織特異性轉譯調控之TOP基因亦為已知的。如上所定義，TOP基因之5'-UTR對應於源自TOP基因的成熟mRNA之5'-UTR的序列，其較佳自位於5'-CAP之3'的核苷酸延伸至位於起始密碼子之5'的核苷酸。TOP基因之5'-UTR通常不包含任何起始密碼子，較佳不包含上游AUG (uAUG)或上游開放閱讀框(uORF)。其中，上游AUG及上游開放閱讀框通常應理解為出現在待轉譯的開放閱讀框之起始密碼子(AUG)之5'處的AUG及開放閱讀框。TOP基因之5'-UTR通常相當短。TOP基因之5'-UTR的長度可在20個核苷酸至500個核苷酸之間變化，且通常小於約200個核苷酸、較佳小於約150個核苷酸、更佳小於約100個核苷酸。在本發明之意義上，TOP基因之示範性5'-UTR為自根據以下之序列中的位置5處的核苷酸延伸至位於緊鄰起始密碼子(例如ATG)之5'處的核苷酸之核酸序列：國際專利申請案WO2013/143700之SEQ ID NO: 1-1363、SEQ ID NO: 1395、SEQ ID NO: 1421及SEQ ID NO: 1422或其同源物或變異體，該申請案之揭示內容以引用之方式併入於此。在此上下文中，TOP基因之5'-UTR的特別較佳片段為缺少5'-TOP模體的TOP基因之5'-UTR。術語「TOP基因之5'-UTR」較佳係指天然存在之TOP基因的5'-UTR。
如本文所用，「3'-非轉譯區（3'-UTR）」通常為位於蛋白質編碼區（亦即開放閱讀框）與mRNA之聚(A)序列之間的mRNA部分。mRNA之3'-UTR不翻譯成胺基酸序列。3'-UTR序列通常由基因編碼，該基因在基因表現過程中轉錄為相應的mRNA。基因組序列首先轉錄成早熟mRNA，其包含可選的內含子。接著在成熟過程中將早熟mRNA進一步加工成成熟mRNA。此成熟過程包括以下步驟：5'-加帽、剪接早熟mRNA以切除可選的內含子及3'端之修飾，諸如對早熟mRNA之3'端的多腺苷酸化以及可選的內切或外切核酸酶切割等。在本發明之上下文中，3'-UTR對應於成熟mRNA之序列，其位於蛋白質編碼區之終止密碼子的3'端，較佳緊鄰蛋白質編碼區之終止密碼子的3'端，且其延伸至聚(A)序列之5'側，較佳延伸至緊鄰聚(A)序列之5'的核苷酸。術語「對應於」意謂3'-UTR序列可為RNA序列，諸如在用於定義3'-UTR序列之mRNA序列中，或對應於此類RNA序列之DNA序列。在本發明之上下文中，術語「基因之3'-UTR」，諸如「白蛋白基因之3'-UTR」，為對應於源自此基因之成熟mRNA的3'-UTR之序列，亦即藉由基因轉錄及早熟mRNA之成熟獲得的mRNA。術語「基因之3'-UTR」涵蓋3'-UTR之DNA序列及RNA序列。
如本文所用，術語「5'-非轉譯區（5'-UTR）」通常應理解為傳訊RNA（mRNA）之特定部分。它位於mRNA開放閱讀框之5′處。通常，5'-UTR自轉錄起始位點開始，並在開放閱讀框之起始密碼子前的一個核苷酸處結束。5'-UTR可包含用於控制基因表現之元件，亦稱為調控元件。此類調控元件可為例如核糖體結合位點或5'-端寡嘧啶束。5'-UTR可經轉錄後修飾，例如藉由添加5'-CAP。在本發明之上下文中，5'-UTR對應於位於5'-CAP與起始密碼子之間的成熟mRNA之序列。較佳地，5'-UTR對應於自位於5'-CAP之3'的核苷酸、較佳自位於緊鄰5'-CAP之3'的核苷酸延伸至位於蛋白質編碼區之起始密碼子之5'的核苷酸 、較佳至位於緊鄰蛋白質編碼區之起始密碼子之5'的核苷酸。位於緊鄰成熟mRNA之5'-CAP之3'的核苷酸通常對應於轉錄起始位點。術語「對應於」意謂5'-UTR序列可為RNA序列，諸如在用於定義5'-UTR序列之mRNA序列中，或對應於此類RNA序列之DNA序列。在本發明之上下文中，術語「基因之5'-UTR」，諸如「TOP基因之5'-UTR」，為對應於源自此基因之成熟mRNA的5'-UTR之序列 ，亦即藉由基因轉錄及早熟mRNA之成熟獲得的mRNA。術語「基因之5'-UTR」涵蓋5'-UTR之DNA序列及RNA序列。
如本文所用，術語「疫苗」通常應理解為提供至少一種抗原或抗原功能之預防或治療材料。抗原或抗原功能可刺激身體之適應性免疫系統以提供適應性免疫反應。如本文所用，術語「大流行性流感/流感之疫苗或大流行性流感/流感疫苗」係指針對大流行性流感病毒之疫苗，在本文中稱為大流行性流感/流感之疫苗或大流行性流感/流感疫苗。如本文所用，術語「季節性流感/流感之疫苗或季節性流感/流感疫苗」係指針對流感季節中季節性出現之流感病毒的疫苗，在本文中稱為「季節性流感/流感之疫苗或季節性流感/流感疫苗」。
如本文所用，可生成如本發明之上下文中定義的蛋白質或肽之術語「變異體」，其在一或多個突變中具有不同於原始序列之胺基酸序列，諸如一或多個經取代、插入及/或缺失之胺基酸。較佳地，與全長天然蛋白質相比，此等片段及/或變異體具有相同的生物學功能或比活性，例如其特異性抗原特性。如本發明之上下文中定義的蛋白質或肽之「變異體」與其天然(亦即非突變之)生理序列相比，可包含保守胺基酸取代。彼等胺基酸序列以及它們的編碼核苷酸序列特別屬如本文所定義之術語變異體。源自相同類別之胺基酸相互交換的取代稱為保守取代。具體而言，它們為具有脂肪族側鏈、帶正電或帶負電側鏈、側鏈中有芳族基團的胺基酸或如下胺基酸，該胺基酸之側鏈可進入氫橋，例如具有羥基官能基之側鏈。這意味著例如具有極性側鏈之胺基酸經具有同樣極性側鏈之另一胺基酸置換，或例如以疏水性側鏈為特徵之胺基酸經具有同樣疏水性側鏈之另一胺基酸取代（例如絲胺酸(蘇胺酸)經蘇胺酸（絲氨酸）取代，或白胺酸（異白胺酸）經異白胺酸（白胺酸）取代）。插入及取代為可能的，特別是在不引起三維結構改變或不影響結合區之彼等序列位置處。藉由插入或缺失對三維結構之修改可例如使用CD光譜（圓二色光譜）(Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, 於：Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger等人(編), Elsevier, Amsterdam中)容易地確定。
如本文所用，術語蛋白質或肽之「變異體」在該種蛋白質或肽一段10、20、30、50、75或100個胺基酸內可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%胺基酸一致性。此外，可由核酸分子編碼的如本文所定義之蛋白質或肽之變異體亦可包含彼等序列，其中編碼核酸序列之核苷酸根據遺傳密碼之簡並性進行交換，而不導致蛋白質或肽之相應胺基酸序列的改變，亦即，胺基酸序列或其至少部分在上述含義內的一或多個突變中可與原始序列沒有區別。
如本文所用，術語「媒劑」意謂試劑，例如載劑，其通常可用於醫藥組合物或疫苗中以促進向個體投與醫藥組合物或疫苗之組分。 V.2. 本發明之示範性可離子化脂質
本發明者已發現一類新型可離子化脂質，亦即本發明之可離子化脂質，其經合成以包括兩個或更多個可離子化之胺頭部基團、兩個或更多個可降解之連接子基團及兩個或更多個飽和或不飽和或支鏈烷基尾部。
在其最廣泛之實施例中，本發明之可離子化脂質具有式I之結構：
Figure 02_image029
式 I
其中pKa可經調節以實現對身體之特定組織或器官的靶向遞送。
在某些實施例中，示範性尾部基團、頭部基團及連接子基團各自獨立地選自下表1中各個類別中鑑定之取代基。下表中描述的取代基R基團包括本文中允許及定義之任何取代基R基團。 表 1
Figure 02_image031
表 1a – 示範性頭部基團
Figure 02_image033
表 1c – 示範性尾部基團
Figure 02_image035
表 1c ( 續 )
Figure 02_image037
在某些實施例中，間隔基為視情況選用的且為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。在較佳實施例中，各間隔基獨立地為經取代或未經取代之C 1碳、經取代或未經取代之C 2碳、經取代或未經取代之C 3碳、經取代或未經取代之C 4碳、經取代或未經取代之C 5碳、經取代或未經取代之C 6碳、經取代或未經取代之C 7碳、經取代或未經取代之C 8碳、經取代或未經取代之C 9碳、經取代或未經取代之C 10碳、經取代或未經取代之C 11碳、經取代或未經取代之C 12碳、經取代或未經取代之C 13碳、經取代或未經取代之C 14碳、經取代或未經取代之C 15碳、經取代或未經取代之C 16碳、經取代或未經取代之C 17碳、經取代或未經取代之C 18碳、經取代或未經取代之C 19碳、經取代或未經取代之C 20碳、經取代或未經取代之C 21碳或經取代或未經取代之C 22碳。
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質包括關於以下之候選頭部基團結構：DL=二亞麻油酸，ADDE=氮烷二基二乙基，Cx/Cy =碳間隔基，DMA=二甲胺，Pyr=吡啶，PipZ=哌嗪，PipD=哌啶，DIPA=二異丙胺，DM=二甲基，BOD=雙辛基癸基頭部基團及pKa之感知預測值。
在某些實施例中，二甲胺(表2)、哌啶(表3)、吡咯啶(表4)及哌嗪(表5)各自之示範性非限制性頭部基團在下文中說明。在某些實施例中，可調整兩種胺之pKa以獲得特定值，從而促進向特定組織或器官之遞送。對於經典算法，pKa之Percepta預測顯示為黑色，而對於Galas算法則顯示為紅色。由於帶電位點之間的靜電排斥減少，使胺彼此遠離會使兩個pKa更接近。使內部胺遠離酯鍵會提高其pKa，因為胺之質子結合自由電子對進一步自吸電子酯中移除。選擇具有適當pKa之頭部基團結構有望實現用於IM定位之輕微正電荷或中性LNP，以及在低於pH 7下強力增加正電荷以實現內溶酶體釋放能力。 表 2 ： 在頭部基團與連接子之間具有 C1-C7 間隔基的二甲胺頭部基團（來自 ACD 軟體之 pKa 示於氮原子上）
Figure 02_image039
表 3: 在頭部基團與連接子之間具有 C1-C7 間隔基的哌啶頭部基團（來自 ACD 軟體之 pKa 示於氮原子上）
Figure 02_image041
表 4 ： 在頭部基團與連接子之間具有 C1-C7 間隔基的吡咯啶頭部基團（來自 ACD 軟體之 pKa 示於氮原子上）
Figure 02_image043
表 5 ： 在頭部基團與連接子之間具有 C1-C7 間隔基的哌嗪頭部基團（來自 ACD 軟體之 pKa 示於氮原子上）
Figure 02_image045
在某些實施例中，可選擇額外的二價頭部基團以及表2、4及5中所示之二甲胺、吡咯啶及哌嗪，其中可改變碳間隔基以產生特定的分子pKa。除了特定的離子化特性外，一些頭部基團亦可具有增加的免疫佐劑性。 表 6
Figure 02_image047
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質包含一或多個連接子基團，較佳2、3、4、5、6、7、8、9或10個連接子基團。
示範性連接子在下表7A-7E中說明。 表 7A
Figure 02_image049
表 7B
Figure 02_image051
表 7C
Figure 02_image053
表 7D
Figure 02_image055
表 7E
Figure 02_image057
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質的烷基尾部之形狀較佳為錐形及發散的，以藉由生成非雙層倒六邊形或其他結構來促進內溶酶體釋放。示範性烷基尾部在表8A、8B及8C中說明。在某些實施例中，此可藉由添加飽和鍵或分支來達成。在其他實施例中，添加酯鍵可經由更快速的降解提高耐受性。 表 8A
Figure 02_image059
表 8B
Figure 02_image061
表 8C
Figure 02_image063
具有二甲胺、吡咯啶及哌嗪頭部基團、酯連接子、C 4間隔基及烷基/伸烷基尾部的本發明之可離子化脂質之示範性非限制性實例在表9中說明並且可具有允許在pH 7.4下帶正電之LNP的pKa以供IM定位及具有接近6.5之pKa的第二內部胺，其可在胞內體酸化期間進一步離子化並提供釋放。 表 9
Figure 02_image065
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式II：
Figure 02_image067
式 II
其中R 1及R 2各自獨立地選自由以下組成之群： H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基或視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基，或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環或雜芳環；
其中R 3及R 4各自獨立地選自由以下組成之群： 視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，或其中R 1與R 2一起包含3-7員雜環或雜芳環；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9及R 10各自獨立地選自由以下組成之群： H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中x、y及z各自獨立地為0-10之整數；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；二側氧基并吡咯啶-二酮；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 22)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 22)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 22)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
本發明之可離子化脂質可視情況在第一氮與第二氮之間(亦即在以上式II中之CR 5R 6)且在第二氮與酯連接子之間(亦即在以上式II中之CR 7R 8及CR 9R 10)包含碳間隔基。在某些實施例中，尾部係對稱的，包括例如二亞麻油酸(DL)及支鏈雙辛基癸基(BOD)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些較佳實施例中，R 3及/或R 4上之取代基包括末端二氧戊環基團。
在某些實施例中，R 5為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式III：
Figure 02_image069
式 III
其中各R 1’、R 1、R 2、R 11及R 12獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成環烷基環或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則與S或O連接之R 1為電子對；
其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9及R 10各自獨立地選自由以下組成之群： H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中x、y及z各自獨立地為0-20之整數；
其中G及Q各自獨立地為選自CH、O、N及S之原子；
其中m及n各自為0-4之整數；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；-SO 2((C 6)芳基)；及二硫鍵。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(R 1R 2R 3)
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為N。
在某些實施例中，G為CH。
在某些實施例中，G為O。
在某些實施例中，G為S。
在某些實施例中，G為N。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式IV：
Figure 02_image070
式 IV
其中R 1選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基及視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基；
其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9及R 10各自獨立地選自由以下組成之群： H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中x、y及z各自獨立地為0-10之整數；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7)；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式V：
Figure 02_image072
式 V
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環或雜芳環；
其中R 3、R 4、R 13及R 14各自獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 15及R 16各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中w、x、y及z各自獨立地為0-10之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S之原子或二硫鍵；
其中各m為0-4之整數，較佳為0、1或2；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C2-C22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式VI：
Figure 02_image073
式 VI
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環或雜芳環；
其中R 3、R 4、R 23及R 24各自獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 11、R 12、R 13、R 17、R 18、R 34、R 35、R 36各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、x、y及z各自獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S之原子或二硫鍵；
其中各m為0-4之整數，較佳為0、1或2；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C2-C22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代之-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為–CH2-O-或–CH2-CH3-O-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式VII：
Figure 02_image075
式 VII
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環烷基環或雜芳環；
其中R 5、R 6、R 5’、R 6’、R 5”及R 6”各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15及R 16各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、y及z各自獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S之原子或二硫鍵；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C2-C22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為 -CO 2(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式VIII：
Figure 02_image077
式 VIII
其中
R 1及R 2各自獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基或視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基；
R 3及R 4各自獨立地為視情況經取代之C 10-C 22烷基、視情況經取代之C 10-C 22烯基、視情況經取代之C 10-C 22炔基，或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環或雜芳環
X為OH或NR 1R 2；並且
Z為0至5之整數。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image079
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image081
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image083
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image085
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image087
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image089
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image091
。
在某些實施例中，式VIII之可離子化脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image093
。
在另一實施例中，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質，其具有式IX：
Figure 02_image095
式 IX
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、電子對、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成3-7員雜環或雜芳環；
其中R 5、R 6、R 5’、R 6’、R 5”及R 6”各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15及R 16各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、y及z各自獨立地為0-20之整數；
其中X為O、S或N；並且
其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R1為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C2-C22炔基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 7-C 10芳烷基。
在某些實施例中，R2為經取代或未經取代之C 5-C 10雜芳烷基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R5為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R5為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R6為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R6為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R7為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R7為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R8為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R8為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R9為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R9為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R10為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R10為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R11為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R11為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代之C 1-C 22烷基、經取代或未經取代之C 2-C 22烯基、或經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
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在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
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在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基并吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，X為O。
在某些實施例中，X為S。
在某些實施例中，X為N。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。 V.3. 本發明之說明性可離子化脂質
本發明之可離子化脂質之說明性非限制性實例在表10中說明（標題「方法」之縱行係指合成特定化合物之方法，如下文部分V.4.製備本發明之可離子化脂質的方法中所述)。 表 10
Figure 02_image097
表 10( 續 )
Figure 02_image099
表 10( 續 )
Figure 02_image101
表 10( 續 )
Figure 02_image103
表 10( 續 )
Figure 02_image105
表 10( 續 )
Figure 02_image107
表 10( 續 )
Figure 02_image109
表 10( 續 )
Figure 02_image111
表 10( 續 )
Figure 02_image113
表 10( 續 )
Figure 02_image115
表 10( 續 )
Figure 02_image117
表 10( 續 )
Figure 02_image119
表 10( 續 )
Figure 02_image121
表 10( 續 )
Figure 02_image123
表 10( 續 )
Figure 02_image125
表 10( 續 )
Figure 02_image127
表 10( 續 )
Figure 02_image129
表 10( 續 )
Figure 02_image131
在本發明之另一實施例中，調節本發明之可離子化脂質的pKa可指導脂質奈米顆粒-核酸複合物(LNP-NA)向特定組織或器官之投與。本發明者驚奇地發現，使用軟體例如ACDLabs Percepta預測可離子化脂質之pKa可顯著加速本發明之可離子化脂質的設計。本發明者發現可離子化脂質之經預測的水性pKa均顯著高於藉由TNS所量測之值。在某些實施例中，自水性環境至LNP環境之pKa下降先前在文獻中未得到承認。不希望受理論束縛，由於與水相相比，脂質相中質子之溶劑合能更高，以及來自LNP中的本發明之可離子化脂質的質子之靜電排斥，可找到合理的解釋，以上兩個理由可結合以使自水相至脂質相之pKa降低1-3點。在某些實施例中，此預測能力可用於藉由檢查潛在候選物之pKa表並僅選擇具有適當pKa值之彼等來選擇特定的頭部基團及碳間隔基。以此方式可準確地消除候選物，從而大大節省合成及測試時間與費用。
在某些實施例中，LNP中包含的本發明之可離子化脂質的pKa係藉由陰離子親脂染料TNS與含有可離子化脂質之LNP結合的螢光增強來量測的。先前研究顯示，TNS pKa需要接近6.5，才能在IV投與後有效遞送至肝臟。水相中之pKa可藉由ACDLabs Percepta等軟體來預測，導致pKa高於TNS pKa。鑒於LNP pKa在確定其效率方面之重要性，開發了新方法（ζ電位、 1H NMR、建模）將可離子化脂質之內在pKa與LNP離子化特性聯繫起來，以便合理地設計用於mRNA遞送之有效系統。 表 11a ：已知的可離子化脂質之 pKa
Figure 02_image133
表 11b ： 具有內部 pKa 之可離子化脂質（包括本發明之示範性可離子化脂質及已知脂質）
Figure 02_image135
Figure 02_image137
Figure 02_image139
Figure 02_image141
Figure 02_image143
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Figure 02_image147
Figure 02_image149
Figure 02_image151
Figure 02_image153
在某些實施例中，本發明涵蓋一類新型可離子化脂質(本發明之可離子化脂質)，其經合成以帶有兩個可離子化之胺及兩個可降解之酯連接子，該等連接子連接至亞麻油酸尾或分支尾。DL=二亞麻油酸，ADDE=氮烷二基二乙基，Cx/Cy =碳間隔基，DMA=二甲胺，Pyr=吡啶，PipZ=哌嗪， PipD=哌啶，DIPA= 二異丙胺，DM=二甲基，BOD= 雙辛基癸基。大多數ADDE可離子化脂質在活體外成功轉染HEK 293細胞，但下面列出的4種例外，它們無活性，可能係由於它們的頭部基團龐大且構象受限。 表 12: 本發明之說明性可離子化脂質的 pKa
Figure 02_image155
表 12( 續 )
Figure 02_image157
表 12( 續 )
Figure 02_image159
表 12( 續 )
Figure 02_image161
在某些實施例中，合成額外的可離子化脂質，其帶有一個可離子化胺及兩個亞麻油酸尾部，它們經由可降解之酯連接至頭部基團諸如異戊胺(IP)、乙醇(EA)、丙醇(PA)，如表13A所示。 表 13A
Figure 02_image163
在某些實施例中，第二類之脂質含有一個可離子化基團(DMA)及兩個不同連接子：可降解之酯及不可降解之八磺醯胺基(OSA)。另外，此等脂質含有線性（亞麻油醯基）或分支尾（十八烷基），如表13B所示。 表 13B
Figure 02_image165
在某些實施例中，第三類可離子化脂質具有一個可離子化胺及一個亞麻油酸(L)尾部，兩者皆經由不可降解之醯胺連接至頭部基團，諸如（胺基乙烷(AE)、二甲胺及胺乙基二磺醯基(AEDS))，如表13C所示。 表 13C
Figure 02_image167
在某些實施例中，包括烷基脂質之示範性本發明可離子化脂質用來自ACD Classic及ACD Galas的經預測之pKa來說明，包括合成方法，如表13D所示。 表 13D
Figure 02_image169
表 13D( 續 )
Figure 02_image171
表 13D( 續 )
Figure 02_image173
表 13D( 續 )
Figure 02_image175
表 13D( 續 )
Figure 02_image177
表 13D( 續 )
Figure 02_image179
表 13D( 續 )
Figure 02_image181
表 13D( 續 )
Figure 02_image183
表 13D( 續 )
Figure 02_image185
Figure 02_image187
表 13D( 續 )
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表 13D( 續 )
Figure 02_image191
表 13D( 續 )
Figure 02_image193
Figure 02_image195
表 13D( 續 )
Figure 02_image197
表 13D( 續 )
Figure 02_image199
表 13D( 續 )
Figure 02_image201
表 13D( 續 )
Figure 02_image203
表 13D( 續 )
Figure 02_image205
表 13D( 續 )
Figure 02_image207
表 13D( 續 )
Figure 02_image209
表 13D( 續 )
Figure 02_image211
V.4. 製備本發明之可離子化脂質的說明性方法
本發明之可離子化脂質可使用市售試劑，藉由各種途徑合成。以下方法提供製備本發明之可離子化脂質的說明性技術。 一般反應方案 1
Figure 02_image213
具有兩種可降解酯的本發明之可離子化脂質（例如化合物A-7）之說明性實施例可根據一般反應方案1（「方法A」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或飽和/不飽和鏈及雙層尾（對稱及不對稱），n為1至6之整數。參考一般反應方案1，結構A-1之化合物可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。將A-1在溶劑乙醇中之混合物用催化量之硫酸處理以得到酯A-2，接著將A-2用LAH（例如氫化鋁鋰）在無水THF中處理9-10小時以得到醇衍生物A-3。經純化之A-3與丙烯醯氯衍生物（其中Ra = CH 3、C 2H 5及/或異丙基）A-4、鹼（例如三乙胺）在二氯甲烷中反應4-5小時，得到經取代之醯化產物A-5。在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，將醯化產物與頭部基團(R1) N,N-二甲基二胺A-6之混合物在足以產生A-7之溫度及時間下加熱。 一般反應方案 2
Figure 02_image215
在連接子與內部胺之間具有增加的碳間隔基的本發明之可離子化脂質（例如化合物B-3）之說明性實施例可根據一般反應方案2（「方法B」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數。參考一般反應方案2，根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備結構A-2之化合物。將B-1與A-2以二氯甲烷為溶劑之混合物用催化量之N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC•HCl)、羥基苯并三唑(HOBt)及鹼諸如三乙胺處理，得到酯衍生物B-2，接著將B-2與A-6之混合物用鹼（例如 N,N-二異丙基乙胺或1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯)在無水THF中處理，在任何必要的後處理及/或純化步驟後，在足以產生B-3之溫度及時間下加熱2-5天。 一般反應方案 3
Figure 02_image217
本發明之可離子化脂質（與4個酯基對稱）（例如化合物C-4）之說明性實施例可根據一般反應方案3（「方法C」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，其中m為-1至2之整數，n為1至6之整數。參考一般反應方案3，根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備結構A-2之化合物。將C-1與A-2之混合物在用氮氣吹掃（保持在無水條件下）之施倫克管(Schlenk tube)中用無溶劑條件及催化量之有機催化劑1,5,7-三氮雜雙環[4.4.0]癸- 5-烯(TBD)處理，在一定溫度下加熱，得到酯衍生物C-2。在三乙胺之存在下，使用二氯甲烷作為溶劑將經純化之C-2與丙烯醯氯A-4混合。隨後將反應在室溫下攪拌直至起始材料消耗，得到C-3。在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，將醯化產物與頭部基團C-3及N，N-二甲基二胺A-6之混合物在足以產生C-4之溫度及時間下加熱。 一般反應方案 4
Figure 02_image219
本發明之可離子化脂質（與4個酯基不對稱）（例如化合物C-7）之說明性實施例可根據一般反應方案4（「方法-C1」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，其中m為-1至2之整數，n為1至6之整數。參考一般反應方案4，根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備結構A-2之化合物。將C-1與A-2之混合物在用氮氣吹掃（保持在無水條件下）之施倫克管中用無溶劑條件及催化量之有機催化劑1,5,7-三氮雜雙環[4.4.0]癸- 5-烯(TBD)處理，在一定溫度下加熱，得到酯衍生物C-2。在三乙胺之存在下，使用二氯甲烷作為溶劑將經純化之C-2與丙烯醯氯A-4混合。將反應在室溫下攪拌直至起始材料消耗以獲得C-3。等量之醯化C-3產物與頭部基團N，N-二甲基二胺A-6之混合物在足以產生C-5之溫度及時間的加熱下反應。將進一步經純化之C-5用相同當量之C-6(雙層尾)處理，並在任何必要的後處理及/或純化步驟後在足以產生C-7之溫度及時間下加熱。 一般反應方案 5
Figure 02_image221
具有六種可降解酯的本發明之可離子化脂質（例如化合物D-8）之說明性實施例可根據一般反應方案5（「方法D」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數，R 2為烷基、環狀、雜環取代基，且R 4為具有烷基鏈之酯衍生物。參考一般反應方案5，結構B-1、A-1、A-2、A-5及A-6之化合物可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。將B-1在乙醇存在下使用催化量之硫酸進行酯化，得到D-1。此外，藉由經典芬克爾斯坦(Finkelstein)反應，用碘化鈉之丙酮溶液將烷基溴轉化為相應的烷基碘D-2。將D-2與D-3之混合物與乙醇鈉(NaOEt)在乙醇中在回流下反應，繼之酸化至低pH值以獲得D-4。在步驟4中，在N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC•HCl)及催化量之4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)存在下在二氯甲烷中酯化隔夜，得到D-5。在硼氫化鈉(NaBH 4)存在下，進一步將D-5還原為相應的醇，得到D-6。經純化之D-6與丙烯醯氯衍生物（其中Ra = CH 3、C 2H 5及/或異丙基）A-5在鹼（例如三乙胺）存在下在四氫呋喃溶劑中反應4-5小時，獲得經取代之醯化產物D-7。在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，將醯化產物D-7與頭部基團(R1)N，N-二甲基二胺A-6之混合物在足以產生D-8之溫度及時間下加熱。 一般反應方案 6
Figure 02_image223
具有可降解及不可降解酯的本發明之可離子化脂質（例如化合物 E、F及G）之說明性實施例可根據一般反應方案6（「方法E」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數，R 2為烷基、環狀、雜環取代基。參考一般反應方案6，結構E-1、A-4、E-2、A-5及A-6之化合物可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。在試劑三乙胺之存在下，E-1與丙烯醯氯A-4在二氯甲烷中反應，得到E-2。在步驟2中，A-6與A-5反應以原位獲得單烷基化產物。在無溶劑條件下進一步逐滴添加A-5，繼之在任何必要的後處理及/或純化步驟之後加熱足以產生E-3之時間。在步驟3中，A-6在氮氣氣氛下在無溶劑條件下與2當量之丙烯醯胺反應，繼之在任何必要的後處理及/或純化步驟之後在足以產生化合物F之溫度及時間下加熱。在步驟4中，A-6與1當量之E-2反應以獲得單烷基化產物，並在任何必要的後處理及/或純化步驟之後進一步與烷基磺醯氯反應以獲得不可降解之連接子衍生物G。 一般反應方案 7
Figure 02_image225
具有螺二氧戊環衍生物的本發明之可離子化脂質（例如化合物H）之說明性實施例係根據一般反應方案7（「方法H」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數，R 2為烷基、環狀、雜環取代基。參考一般反應方案5，結構A-6、H-1、H-5之化合物及必要的催化劑可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。順丁烯二酸酐與3-(二甲胺基)-1-丙胺(DMAPA)反應，生成3-(N,N-二甲胺基)丙基順丁烯醯胺酸H-2。該反應在氯仿中藉由在室溫下將胺添加至順丁烯二酸酐中隨後加熱至60℃來進行。純化後，H-2在乙酸酐中與醋酸鈉反應並在任何必要的後處理及/或純化步驟後在足以產生G-3之溫度及時間下加熱。在步驟3中，使用四氧化鋨在無水THF中進行羥基化反應隔夜，得到H-4。將H-4與H-5之混合物溶解於甲苯溶劑中，且圓底燒瓶裝有迪安-斯達克(Dean-Stark)裝置，隨後將反應加熱至回流並持續8小時，隨著反應繼續進行，在單獨的燒瓶中收集迪安-斯達克裝置中得到的水 ，直至在任何必要的後處理及/或純化步驟後消耗起始材料以獲得H-6。 一般反應方案 8
Figure 02_image227
具有螺二氧戊環衍生物的本發明之可離子化脂質（例如化合物I）之說明性實施例係根據一般反應方案8（「方法I」）製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數，R 2為烷基、環狀、雜環取代基。參考一般反應方案8，結構I-1、I-5之化合物及必要的催化劑可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。I-1、1,2,5-戊三醇及對甲苯磺酸吡啶鎓在甲苯中之混合物在氮氣下用迪安-斯達克裝置回流隔夜以移除水並使反應回流直至反應物完全消耗以獲得I-2。在步驟2中進行酯化，I-2與不同的烷基飽和/不飽和直鏈或雙層酸以及EDC•HCl及4-DMAP等試劑在二氯甲烷中反應隔夜，獲得I-3。胺之去保護得到I-4衍生物。在步驟3中，I-4與I-5在EDC•HCl、HOBt及DMAP或三乙胺之存在下反應。將所有此等混合物溶解於二甲基甲醯胺中並允許在室溫下攪拌直至在任何必要的後處理及/或純化步驟之後消耗起始材料以獲得I-6。 一般反應方案 9
Figure 02_image229
具有兩種可降解酯的脂質(例如化合物A-5)之說明性實施例可根據一般反應方案9製備，其中R 1為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數。參考一般反應方案9，結構A-1之化合物可自商業來源購買及/或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。A-1與A-2丙烯醯氯衍生物（其中 Ra = CH 3、C 2H 5及/或異丙基）及催化量之鹼（例如三乙胺）在二氯甲烷溶劑中反應4-5小時，得到經取代之醯化產物A-3。醯化產物與頭部基團(R1) N,N-二甲基二胺及/或一級胺取代基（諸如N-烷基、無環、環狀、雜環、芳族胺）A-4之混合物在任何必要的後處理及/或純化步驟之後在足以產生A-5之溫度及時間下加熱。 一般反應方案 10
Figure 02_image231
在連接子與內部胺之間具有增加的碳間隔基的脂質（例如化合物B-2）之說明性實施例可根據一般反應方案10製備，其中R 1及R 2為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至6之整數。參考一般反應方案10，結構B-2之化合物係根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。將B-1與B-2在作為溶劑之二氯甲烷中的混合物用化學計量之量的N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC•HCl）或DCC二環己基碳二亞胺、羥基苯并三唑（HOBt）及鹼諸如三乙胺處理，得到酯衍生物B-3，接著將B-3與A-4之混合物在無水乙腈溶劑中用鹼（例如N,N-二異丙基乙胺）處理，在任何必要的後處理及/或純化後在67℃之溫度下加熱16小時，產生B-4。 一般反應方案 11
Figure 02_image233
具有可降解/不可降解的脂質(例如化合物C-2)之說明性實施例可根據一般反應方案11製備，其中R尾部為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至8之整數。參考一般反應方案11，結構A-4之化合物可自商業來源購買及/或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。在任何必要的後處理及/或純化步驟後，A-4與C-1在催化量之鹼（例如，碳酸鉀、N,N-二異丙基乙胺、碘化鉀）存在下在乙腈溶劑中在67℃之溫度下反應16小時，產生C-2。 一般反應方案 12
Figure 02_image235
具有可降解/不可降解的脂質(例如化合物D-4)之說明性實施例可根據一般反應方案12製備，其中R尾部為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至12之整數。參考一般反應方案12，結構A-4之化合物可自商業來源購買及/或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。在任何必要的後處理及/或純化步驟後，過量當量之A-4與1當量之C-1在催化量之鹼（例如碳酸鉀、N,N-二異丙基乙胺、碘化鉀）存在下在乙腈溶劑中在67℃溫度下反應16小時，產生D-1。隨後D-1與D-2以與步驟1相同之方式反應，產生D-3。A-3與D-3在無溶劑條件下反應，產生D-4，以用於按照方案1之程序。此外，N, N-烷基化係藉由與B-3及D-3以與一般反應方案10相同之程序進行反應來完成。 一般反應方案 13
Figure 02_image237
具有可降解/不可降解的脂質(例如化合物E-2)之說明性實施例可根據一般反應方案13製備，其中R尾部為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至12之整數。參考一般反應方案13，結構A-4及E-1之化合物可自商業來源購買及/或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，過量當量之E-1與1當量之A-4在化學計量之量的三乙醯氧基硼氫化鈉存在下在二氯甲烷溶劑中反應4-5小時，產生E-2。 一般反應方案 14
Figure 02_image239
具有可降解/不可降解的脂質(例如化合物F-2)之說明性實施例可根據一般反應方案14製備，其中R尾部為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至14之整數。參考一般反應方案14，結構A-4及F-1之化合物可自商業來源購買及/或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，過量當量之F-1與1當量之A-4在催化量之四丁基氟化銨存在下在四氫呋喃溶劑中於80℃下反應3天，產生F-2。 一般反應方案 15
Figure 02_image241
具有六種可降解酯的脂質(例如化合物D-8)之說明性實施例可根據一般反應方案15製備，其中R尾部為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n為1至8之整數，R頭部為烷基、環狀、雜環取代基。參考一般反應方案7，結構B-1及A-4之化合物可自商業來源購買或根據普通熟習此項技術者熟悉之方法製備。B-1在乙醇存在下使用催化量之硫酸進行酯化，獲得G-1。此外，藉由經典芬克爾斯坦反應，用碘化鈉之丙酮溶液將烷基溴轉化為相應的烷基碘G-2。將G-2與G-3之混合物與乙醇鈉(NaOEt)在乙醇中在回流下反應，繼之酸化至低pH值，得到G-4。在步驟4中，在N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC•HCl)及催化量之4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)存在下在二氯甲烷中進行費雪(Fischer)酯化反應隔夜，得到G-5。在硼氫化鈉(NaBH4)存在下，進一步將G-5還原為相應的還原胺化，得到G-6。經純化之G-6在鹼（例如三乙胺）存在下，在四氫呋喃溶劑中與醯基或磺醯氯衍生物G-8反應4-5小時，得到經取代之醯化產物G-9，在任何必要的後處理及/或純化步驟之後，在足以產生D-8之溫度及時間下。 一般反應方案 16
Figure 02_image243
在連接子與內部胺之間具有增加的碳間隔基的脂質（例如化合物H-4）之說明性實施例可根據一般反應方案16製備，其中R1及R2為具有直鏈之飽和或不飽和C 1-C 18烷基，或具有雙層尾（對稱及不對稱）之飽和/不飽和基團，n及n1為1至6之整數。參考一般反應方案16，結構H-4之化合物係根據普通熟習此項技術者熟悉之方法來製備。將B-1與B-2在作為溶劑之二氯甲烷中的混合物用化學計量之量的N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC•HCl)或DCC二環己基碳二亞胺、羥基苯并三唑(HOBt)及鹼諸如三乙胺處理，得到酯衍生物B-3。另一態樣，胺H-1之保護係根據前述方法完成，產生H-1，繼之將B-3與H-1之混合物用鹼（例如N,N-二異丙基乙胺）在無水乙腈溶劑中處理，在67℃溫度下加熱16小時，產生H-3，接著在酸介質存在下進行去保護，隨後在任何必要的後處理及/或純化後進行N-烷基化以產生H-4。 V.5. 包含本發明之可離子化脂質的 LNP 之靶向遞送
在某些實施例中，令人驚訝地發現，當本發明之可離子化脂質用於肌內(IM)注射之疫苗中時，經由IM途徑遞送至樹突狀細胞的LNP需要不同於向肝細胞之靜脈內(IV)遞送。在某些實施例中，肝細胞靶向係由於LNP與ApoE相關聯，ApoE將LNP攝取靶向肝細胞LDL受體，而ApoE在IM投與中可能沒有相同的作用。在某些實施例中，LNP之第二靶向機制為它們的淨電荷。在某些實施例中，帶負電之LNP在IV投與時靶向脾臟，而帶正電之LNP靶向肺臟，接近中性之LNP靶向肝臟。然而，本發明者基於以下結果驚奇地發現顯著的電荷效應：先前已知的LNP在IM投與後迅速播散並全身表現，而在LNP中使用的本發明之可離子化脂質可經調整為在生理pH值下具有輕微的正電荷或接近中性，並且不會播散，並在肌肉及引流淋巴結中局部表現，以藉由靶向遞送產生強大的免疫反應。在某些實施例中，表現之定位可藉由避免脫靶表現來提高效力並減少全身不良事件。
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質及分支脂質尾部的質子化促進胞內體釋放，並且LNP電荷影響靶向。在其他實施例中，本發明之可離子化脂質影響LNP結構對其佐劑性的作用。在某些實施例中，當與蛋白質次單元抗原一起遞送時，不對稱可離子化脂質LNP充當強的Th2偏向佐劑。
在某些實施例中，此等LNP驅動之佐劑效應的多樣性激發控制此等特性的結構功能關係(SFR)之鑑定，該等特性可能涉及頭部基團之環狀對比直鏈性質。
不希望受理論束縛，本發明涵蓋本發明之可離子化脂質及有效LNP，例如用於mRNA疫苗中，基於對將LNP離子化、電荷及結構與在向其他遞送部位之潛在應用下肌內投與之遞送效率、靶向性及佐劑性聯繫起來的SFR之理解。
在某些實施例中，對於可離子化脂質，pKas係由ACDLabs Percepta獲得，而對於含有可離子化脂質之LNP，係藉由ζ電位及TNS獲得。在其他實施例中，LNP等電pI係由ζ電位獲得，且LNP直徑為來自DLS之數均值。每個LNP之平均mRNA拷貝係使用分子體積模型及DLS直徑來計算，並且與LNP體積成比例。
在某些實施例中，本發明涵蓋由式I之結構所涵蓋的本發明之可離子化脂質：
Figure 02_image245
式 I
其中pKa可經調節以實現對身體之特定組織或器官的靶向遞送。普通熟習此項技術者將認識到，式I-IX的本發明之可離子化脂質及其特定實施例可用於LNP之靶向遞送。
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質可經調整以在生理pH值下具有輕微的正電荷或接近中性，由此它們不會全身性播散並在局部例如在肌肉及引流淋巴結中表現，以經由靶向遞送產生強大的免疫反應。在某些實施例中，表現之定位可藉由避免脫靶表現來提高效力並減少全身不良事件。
在某些實施例中，用於LNP中的本發明之可離子化脂質中的分支脂質尾部的質子化及利用促進胞內體釋放，並且LNP電荷影響靶向——第三SFR係LNP結構對其佐劑性之影響。在某些實施例中，當與蛋白質次單元抗原一起遞送時，LNP中的本發明之不對稱可離子化脂質充當強的Th2偏向佐劑，並且LNP mRNA疫苗驅動Tfh偏向反應，從而刺激Tfh及生髮中心B細胞之增殖及有效的持久中和抗體反應。
在某些實施例中，本發明之可離子化脂質經設計成具有三個已知控制遞送效率之結構特徵-在胞內體pH範圍內的離子化、在生理pH值下的淨電荷以及與分支及飽和/不飽和相關之脂質尾構象。在某些實施例中，候選物評估及闡明結構-功能關係(SFR)之方法包括轉譯及毒性之活體外及活體內評估；細胞攝取、胞內體釋放及先天性免疫傳感器激活之活體外評估；分佈及細胞運輸之活體內表徵；免疫原性；以及在病毒挑戰研究中使用當前及進化的齧齒動物及非齧齒動物模型。
在某些實施例中，由於組裝期間脂質與mRNA之混合濃度增加，本發明之可離子化脂質具有增加的mRNA LNP活體內表現(＞5X)。
在某些實施例中，包含本發明之可離子化脂質的LNP之靶向遞送包括：1) 優化多價頭部基團之離子化特性，該等頭部基團在生理pH值下可產生輕微帶正電或接近中性之LNP，以限制全身播散並增加胞內體離子化，從而提高疫苗效力。在其他實施例中，包含本發明之可離子化脂質的LNP之靶向遞送涉及高度分支及可降解之脂質尾部，其可經由胞內體釋放進一步提高效力。在其他實施例中，包含本發明之可離子化脂質的LNP之靶向遞送涉及可影響LNP佐劑性的本發明之可離子化脂質的電荷及結構。
在某些實施例中，LNP效力提高以限制不良事件、降低製造成本並提高為大量人群接種疫苗之能力。
在某些實施例中，本發明涵蓋一種優於當前LNP之LNP遞送系統，與疫苗中之當前LNP相比，其具有在更低劑量下之保護、更低的反應原性、更低的全身分佈及更大的儲存穩定性。在某些實施例中，就所有此等特性而言，第一代C24 LNP優於MC3，亦即此項技術中之標準參考LNP ，並且在其臨床前研究中超過了所公佈的疫苗中和效價。在某些實施例中，使用最新的第二代LNP與所揭示之疫苗調配物進行頭對頭比較，該等LNP比C24有所改良。在某些實施例中，本發明涵蓋鑑定參與疫苗反應之細胞類型及細胞反應的作用機制。在某些實施例中，藉由將電荷介導之靶向(以消除脫靶肝臟表現並增加脾臟靶向)與配體介導之靶向(針對T細胞中之特定細胞攝取)相結合，將精確靶向遞送至脾臟T細胞。在某些實施例中，對多樣化及獨特的高效可離子化脂質文庫之系統篩選將允許鑑定其他幾種可達成的細胞特異性靶標，該等靶標將經由電荷及配體介導之靶向以及調配及製造過程參數進行優化。
在某些實施例中，本發明涵蓋使用3種mRNA編碼之報告基因、螢光素酶、mCherry及Cre重組酶以及一種mRNA編碼之免疫原，亦即S2P SARS-Cov-2免疫原。在某些實施例中，此等構築體足以開發mRNA脂質奈米顆粒之表現、靶向及毒性的一般原理及模型。在某些實施例中，其他RNA序列之取代，無論係小(siRNA)抑或大(自擴增RNA、多價疫苗、基因編輯設計)，均需要對LNP調配物及製造進行相對較小或適度的修改。
在某些實施例中，本發明涵蓋鑑定預測靶向性能屬性之LNP特徵的方法並提供量測它們之方法。在某些實施例中，經改良之製造過程允許鑑定適當的過程控制(IPC)，以確保一致地製造高效LNP。在某些實施例中，該等方法可在需要靶向遞送治療劑或預防劑之各種系統上實施。
在某些實施例中，本發明涵蓋一種在結構及理論離子化特性方面具有系統變化的可離子化脂質之新穎文庫。在某些實施例中，本文所述之一系列計劃模組允許獲取資料集，此等資料集將允許預測模型將LNP之性能決定特性與分子、調配物及製造參數相關聯（下面三個最左側框中的每個箭頭均有多個模型）。
Figure 02_image247
在某些實施例中，有些模型為涉及機器學習方法之統計模型，而有些則為機械模型。在某些實施例中，LNP之性能已經表徵為當前理解的影響性能之特徵（在上面的中間框中且如上所述進行預測）。在某些實施例中，所量測之活體外及活體內性能包括表現效率、器官及細胞靶向、毒性、可降解性及免疫原性（上面最右側框）。
在某些實施例中，基於活體外細胞培養之表徵及動物模型中之活體內性能表徵由LNP特徵（自中央框至上方最右側框之箭頭）預測LNP性能。
在某些實施例中，活體內mRNA-LNP表現及靶向之決定因素包括但不限於LNP淨電荷(NCLNP)、表面電荷(SCLNP)、胞內體質子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可離子化脂質膜破壞能力(MDIL) )、可離子化脂質RNA釋放能力(RRIL)、靶向配體密度(ρL)及結合親和力(KL)。在某些實施例中，此等參數依次由可離子化脂質之離子化及結構特性以及調配參數（例如脂質類型及莫耳比）、製造製程（例如濃度、緩衝液、pH值、溶劑比、流率）及配體結合決定。在某些實施例中，該等模型根據可離子化脂質特性、調配參數及製造過程參數預測以及預測LNP中之mRNA穩定性的模型NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL及KL。
在一個實施例中，LNP淨電荷(NCLNP)、表面電荷(SCLNP)及胞內體質子化(EPLNP)預測係衍生自可離子化脂質之結構及離子化特性。在一個實施例中，本發明涵蓋一種由單質子可離子化脂質之分子離子化常數在理論上預測LNP離子化特性之方法，並擴展至多質子可離子化脂質，其具有更大的控制LNP之胞內體質子化及淨電荷之潛能。
在一個實施例中，脂質尾部之結構對於mRNA LNP之遞送、釋放及表現效率很重要，並且被認為係由於它們的胞內體膜破壞及RNA釋放能力。
在某些實施例中，本發明涵蓋評估在LNP中儲存期間之mRNA切割的方法。在一個實施例中，可離子化脂質經由此反應之動力學的pH值依賴性影響切割速率。
在一個實施例中，LNP淨電荷(NCLNP)、表面電荷(SCLNP)、胞內體質子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可離子化脂質膜破壞能力(MDIL)及RNA釋放能力(RRIL)預測係由LNP調配物獲得。在一個實施例中，LNP電荷可藉由改變調配物比例、添加第5種脂質以及將特定的離子化特性設計至可離子化脂質中來修改。在一個實施例中，不同的PEG脂質結構亦會影響表現及靶向。
在一個實施例中，在混合及自組裝之前製備脂質溶液及mRNA溶液之方法形成LNP，根據活體外及活體內報告基因表現，它們為更有效之遞送媒劑。在一個實施例中，此等新穎溶液在自組裝過程中具有更高濃度之脂質及mRNA，以及用於質子化可離子化脂質之特定方法。在一個實施例中，統計機器學習模型將製造參數與LNP特性相關聯。
在一個實施例中，靶向配體直接與完整LNP之結合顯示出細胞特異性靶向的大量增加。
在其他實施例中，對於某些LNP，ApoE吸附為細胞攝取LNP所必需的。在某些實施例中，肝細胞中具有較高PEG-脂質含量的LNP活性降低導致ApoE與LNP之結合減少。在某些實施例中，與含1.5% PEG-脂質之LNP相比，含5% PEG-脂質之LNP與ApoE的結合親和力較低。在某些實施例中，藉由將獨特的靶向配體引入高度聚乙二醇化LNP中，可阻斷ApoE介導之細胞攝取並達成LNP之選擇性遞送。
在某些實施例中，甘露糖結合之奈米顆粒已在各種靶向遞送研究中進行研究，並且此等奈米顆粒已經證明係安全的。為了在LNP表面引入甘露糖部分，使用甘露糖-PEG脂質。 V.6. 含有本發明之可離子化脂質的脂質奈米顆粒
在某些實施例中，本發明涵蓋脂質奈米顆粒，其包含一或多種本發明之可離子化脂質。在某些實施例中，LNP包含第二脂質。在某些實施例中，LNP包含類固醇。在其他實施例中，LNP包含聚乙二醇化脂質。在其他實施例中，LNP包含核酸，較佳mRNA。
如本文所用，術語「脂質奈米顆粒」，亦稱為LNP，係指具有奈米量級（例如，1-1,000 nm）的至少一個尺度之顆粒，其包含本發明之可離子化脂質，例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵蓋的本發明之可離子化脂質或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，此類脂質奈米顆粒包含例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵蓋的本發明之可離子化脂質以及一或多種選自中性脂質、帶電脂質、類固醇及聚合物結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)之賦形劑。在一些實施例中，核酸(較佳mRNA)或其一部分係封裝在脂質奈米顆粒之脂質部分或由脂質奈米顆粒之一些或全部脂質部分包覆的水性空間中，從而保護其免受酶促降解或由宿主生物或細胞之機制誘導的其他不希望有的效應，例如不良免疫反應。在一些實施例中，mRNA或其一部分與脂質奈米顆粒結合。
在本發明之上下文中，脂質奈米顆粒不限於任何特定形態，並且應解釋為包括當由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵蓋的本發明之可離子化脂質與視情況選用之一或多種其他脂質在例如水性環境中及/或在核酸化合物存在下合併時產生的任何形態。例如，脂質體、脂質複合物、脂質複合體及其類似物均在脂質奈米顆粒之範疇內。
在各個實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm，並且實質上無毒。在某些實施例中，當存在於脂質奈米顆粒中時，mRNA在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。如本文所用，平均直徑可由藉由動態光散射測定的數量加權平均值表示。
LNP可包含由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)及(IX)所涵蓋的本發明之任何可離子化脂質，其能夠形成顆粒，一或多個核酸分子附著於該顆粒上，或者一或多個核酸分子封裝於其中。術語「脂質」係指一組有機化合物，其為脂肪酸之衍生物（例如，酯），且特徵通常為不溶於水但可溶於許多有機溶劑。脂質通常可分為至少三種類別：(1) 「簡單脂質」，其包括脂肪及油以及蠟；(2) 「複合脂質」，其包括磷脂及醣脂；以及(3) 「衍生脂質」，諸如類固醇。
在一個實施例中，含mRNA之LNP包含由如本文定義之式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵蓋的一或多種本發明之可離子化脂質，以及一或多種穩定脂質。穩定脂質包括中性脂質及聚乙二醇化脂質。
如所提及，LNP包含例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵蓋的本發明之可離子化脂質。在某些實施例中，本發明之可離子化脂質較佳為可陽離子化的（亦即，當pH值低於脂質之可離子化基團的pKa值時，它變得質子化），但在較高pH值下逐漸變得更中性。在某些實施例中，當帶正電時，脂質能夠與帶負電之核酸結合。在某些實施例中，本發明之可離子化脂質包含在pH值降低時呈現正電荷之兩性離子脂質。LNP可包含任何能夠形成顆粒之脂質，一或多個核酸分子附著於該顆粒上或一或多個核酸分子封裝於該顆粒中。
在某些實施例中，LNP可包含另一種陽離子或可陽離子化脂質，(亦即，在選擇性pH值諸如生理pH值下攜帶淨正電荷的許多脂質種類中之任一種)。此類脂質之實例包括但不限於N,N-二油醯基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)；N-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）；N-(2,3二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)；3-(N-(N',N'二甲胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)N-2-(精胺甲醯胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸銨(DOSPA)、雙十八烷基醯胺基甘胺醯羧精胺(DOGS)、1,2-二油醯基-3-二甲基丙烷銨(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油醯氧基)丙胺(DODMA)及N-(1,2二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)。
另外，可在本發明中使用許多市售的脂質製劑。它們包括例如LIPOFECTIN® (市售陽離子脂質體，包含DOTMA及1,2-二油醯基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)，來自GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.)；LIPOFECTAMINE®（市售陽離子脂質體，包含N-(1-(2,3二油醯氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲醯胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸銨(DOSPA)及(DOPE)，來自 GIBCO/BRL)；以及TRANSFECTAM® (市售陽離子脂質，包含乙醇中之雙十八烷基醯胺基甘胺醯羧精胺(DOGS)，來自Promega Corp., Madison, Wis.)。以下脂質為陽離子脂質，並且在低於生理pH值時具有正電荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)。
在又一實施例中，其他脂質為胺基脂質。適用於本發明中的適合之胺基脂質包括WO2012/016184中描述之彼等，該文獻以全文引用之方式併入本文。代表性胺基脂質包括但不限於1,2-二亞油醯氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油醯氧基-3嗎啉并丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油醯基硫基-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油醯氧基-3 二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油醯氧基-3-三甲胺基丙烷氯化物鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲胺基丙烷 氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油醯氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-( N,N二亞油醯基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油醯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油醯氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)及2,2-二亞油醯基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)。
在某些實施例中，LNP包含一或多種在顆粒形成過程中穩定顆粒之形成的額外脂質。
適合之穩定脂質包括中性脂質及陰離子脂質。術語「中性脂質」係指在生理pH值下以不帶電或中性兩性離子形式存在的許多脂質種類中之任一種。代表性中性脂質包括二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。
示範性中性脂質包括例如二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯磷脂醯甘油（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯基-磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯-磷脂醯乙醇胺（POPE )及二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE 、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯磷脂醯乙醇胺(SOPE)及1,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(transDOPE)。在一個實施例中，中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3磷酸膽鹼(DSPC)。
在一些實施例中，LNP包含選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM之中性脂質。在各個實施例中，本發明之可離子化脂質（例如，式(I)、(II)、(III)、(IV)、 (V)、(VI)或(VII)之結構所涵蓋的脂質）與中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。在某些實施例中，莫耳比為2:1、2.5:1、3:1.、3.5:1、4:1; 4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1; 7.5:1; 8:1; 8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、15:1、20:1、30:1、50:1及此等範圍內包括之所有莫耳比。
在各個實施例中，LNP進一步包含類固醇或類固醇類似物。
在某些實施例中，類固醇或類固醇類似物為膽固醇。在此等實施例之一些中，本發明之可離子化脂質（例如，式(I)、(II)、(III)、(IV)、 (V)、(VI)或(VII)之結構所涵蓋的脂質）與類固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在某些實施例中，莫耳比為2:1、2.5:1、3:1.、3.5:1、4:1; 4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1; 7.5:1; 8:1; 8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、15:1、20:1、30:1、50:1及此等範圍內包括之所有莫耳比。
術語「陰離子脂質」係指在生理pH值下帶負電之任何脂質。此等脂質包括磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、正十二烷醯磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯磷脂醯乙醇胺、離胺醯磷脂醯甘油、棕櫚油醇磷脂醯甘油(POPG)及連接至中性脂質的其他陰離子修飾基團。
在某些實施例中，LNP包含醣脂（例如，單唾液酸神經節苷脂GM1）。
在一些實施例中，LNP包含聚合物結合脂質。術語「聚合物結合脂質」係指包含脂質部分及聚合物部分之分子。聚合物結合脂質之一實例為聚乙二醇化脂質。術語「聚乙二醇化脂質」係指包含脂質部分及聚乙二醇部分之分子。聚乙二醇化脂質為此項技術已知的並且包括1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-s-DMG)及其類似物。
在某些實施例中，LNP包含額外的穩定脂質，其為聚乙二醇-脂質（聚乙二醇化脂質）。合適的聚乙二醇脂質包括PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、PEG修飾之磷脂酸、PEG修飾之神經醯胺（例如PEG-CerC14或PEG-CerC20）、PEG修飾之二烷基胺、PEG修飾之二醯基甘油、PEG修飾之二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂質包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA及PEG-s-DMG。在一個實施例中，聚乙二醇-脂質為N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一個實施例中，聚乙二醇-脂質為PEG-c-DOMG)。在其他實施例中，LNP包含聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG)，諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二醯基甘油(PEG-S-DAG)，諸如4-O-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基胺甲酸酯，諸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺甲酸酯。在各個實施例中，陽離子脂質與聚乙二醇化脂質之莫耳比在約400:1至約10:1範圍內。
如所提及，包含脂質奈米顆粒之mRNA可包含具有以下結構之聚乙二醇化脂質：
Figure 02_image249
或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物或立體異構物，其中：
R 8及R 9各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中烷基鏈視情況由一或多個酯鍵中斷；且w具有在30至60範圍內之平均值。
在聚乙二醇化脂質之先前實施例之一些中，當w為42時，R 8及R 9不皆為正十八烷基。在一些其他實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有10至18個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有12個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有14個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在其他實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有16個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在更多實施例中，R 8及R 9各自獨立地為含有18個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在其他實施例中，R 8為含有12個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，且R 9為含有14個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。
在各個實施例中，w跨越選定之範圍，使得PEG部分具有約400至約6000 g/mol之平均分子量。在一些實施例中，w平均為約50。
在某些實施例中，相對於奈米顆粒之總脂質含量，PEG脂質以約1至約10莫耳百分比之量存在於LNP中。在一個實施例中，PEG脂質以約1至約5莫耳百分比之量存在於LNP中。在一個實施例中，PEG脂質以約1莫耳百分比或約1.5莫耳百分比存在於LNP中。
在某些實施例中，LNP包含一或多個能夠將LNP靶向細胞或細胞群之靶向部分。例如，在一個實施例中，靶向部分為將LNP引導至見於細胞表面上之受體的配體。
在某些實施例中，LNP包含一或多個內化結構域。例如，在一個實施例中，LNP包含一或多個與細胞結合以誘導LNP之內化的結構域。例如，在一個實施例中，一或多個內化結構域與見於細胞表面上之受體結合以誘導受體介導之LNP攝取。在某些實施例中，LNP能夠在活體內結合生物分子，接著結合LNP之生物分子可由細胞表面受體識別以誘導內化。例如，在一個實施例中，LNP結合全身ApoE，造成LNP及相關貨物之攝取。
其他示範性LNP及其製造在此項技術中有所描述，例如在美國專利申請公開案第US20120276209號；Semple等人, 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176；Akinc等人, 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364；Basha等人, 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200；Leung等人, 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450；Lee等人, 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90；Belliveau等人, 2012, Mol Ther nucleic Acids, 1: e37；Jayaraman等人, 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533；Mui等人, 2013, Mol Ther Nucleic Acids.2, e139；Maier等人, 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578；及Tam等人, 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74，其各自以全文引用之方式併入。
在較佳實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、或約30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm，且實質上無毒。如所提及，平均直徑可對應於藉由動態光散射測定之數量加權平均值。
在本發明之另一較佳實施例中，脂質奈米顆粒分別具有在約50 nm至約300 nm、或約60 nm至約250 nm、約60 nm至約150 nm、或約60 nm至約120 nm範圍內之流體動力學直徑。
在某些實施例中，當存在於脂質奈米顆粒中時，mRNA在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。
脂質奈米顆粒中mRNA之總量會有所不同，並且可根據mRNA與總脂質之w/w比率來定義。在某些實施例中，奈米顆粒比率為2至10。在本發明之一個實施例中，mRNA與總脂質之比率小於0.06 w/w，較佳介於0.03與0.04 w/w之間。
在一些實施例中，LNP包含由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)結構中之任一者所涵蓋的本發明之可離子化脂質；如上定義之mRNA化合物、中性脂質、類固醇及聚乙二醇化脂質。
在某些實施例中，LNP包含一或多個能夠將LNP靶向細胞或細胞群之靶向部分。例如，在一個實施例中，靶向部分為將LNP引導至見於細胞表面上之受體的配體。
在某些實施例中，LNP包含一或多個內化結構域。例如，在一個實施例中，LNP包含一或多個與細胞結合以誘導LNP之內化的結構域。例如，在一個實施例中，一或多個內化結構域與見於細胞表面上之受體結合以誘導受體介導之LNP攝取。在某些實施例中，LNP能夠在活體內結合生物分子，接著結合LNP之生物分子可由細胞表面受體識別以誘導內化。例如，在一個實施例中，LNP結合全身ApoE，造成LNP及相關貨物之攝取。
具體而言，本發明係關於以下非限制性特定實施例。
在一較佳實施例中，本發明係關於一種包含脂質奈米顆粒之mRNA，該脂質奈米顆粒包含根據如上定義之式(I)、(II)、(II)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的本發明之可離子化脂質及包含編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列的mRNA化合物、以及DSPC、膽固醇及PEG脂質，其比率為約50:10:38.5:1。
在一特定較佳實施例中，本發明係關於一種包含脂質奈米顆粒之mRNA，該脂質奈米顆粒包含本發明之可離子化脂質、PEG-脂質、包含編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列的mRNA化合物、類固醇及中性脂質，其中較佳在約50:10:38.5:1.5之比率下，封裝未經修飾之、1-甲基假尿苷修飾之或密碼子優化之mRNA。較佳地，抗原肽或蛋白質來源於致病性抗原、腫瘤抗原、過敏性抗原或自體免疫性自身抗原或其片段或變異體。
在某些實施例中，本發明涵蓋一種包括本發明之可離子化脂質的50-100 nm直徑之LNP，該LNP由核酸及以下4種脂質構成：具有胺基的本發明之可離子化脂質(50%)、第二脂質（例如，1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC））（10%）、類固醇（例如膽固醇）（38.5%）及聚乙二醇化脂質（例如，1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG2000)) (1.5%)（括號中為莫耳比）。
在某些實施例中，包含在LNP中的本發明之可離子化脂質之量為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9、40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9、50、55、60、65、70或75莫耳百分比。
在某些實施例中，包含在LNP中的第二脂質之量為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9或40莫耳百分比。
在某些實施例中，包含在LNP中的類固醇之量為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9、40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9、50、55、60、65、70或75莫耳百分比。
在某些實施例中，包含在LNP中的聚乙二醇化脂質之量為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20莫耳百分比。
在某些實施例中，親水性DMG-PEG形成LNP之殼。核酸之量由可離子化脂質上的胺與核酸骨架上的磷酸基團之NP莫耳比表示，且通常為3-6。在某些實施例中，LNP之pKa在6-7範圍內，對應於早期胞內體中之pH值。LNP中可離子化脂質之pKa與基因沉默效率之間的聯繫表明，6-7範圍內之LNP pKa對可離子化脂質DLinDMA產生更多沉默並與促進脂質結構有關，這可能會破壞胞內體之膜。使用陰離子染料TNS螢光增強之pH值依賴性量測LNP之pKa。在某些實施例中，pKa依賴性胞內體釋放機制係描述為陽離子質子化可離子化脂質與陰離子胞內體磷脂之間的離子配對事件，其中可離子化脂質之發散錐形脂質尾部促進膜破裂。
在特別較佳實施例中，脂質奈米顆粒包括包含在脂質奈米顆粒中之mRNA，其中較佳地，抗原肽或蛋白質源自流感病毒之血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)、非結構蛋白2 (NS2)、核輸出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶鹼性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶鹼性蛋白2 (PB2)或其片段或變異體。更佳地，抗原肽或蛋白質源自流感病毒之血球凝集素(HA)或神經胺糖酸酶(NA)或其片段或變異體。甚至更佳地，抗原肽或蛋白質為流感病毒之血球凝集素(HA)之至少一種全長蛋白質及/或神經胺糖酸酶(NA)之至少一種全長蛋白質或其變異體。在又一較佳實施例中，流感病毒選自A型、B型或C型流感病毒。在一特別較佳實施例中，A型流感病毒選自以血球凝集素(HA)為特徵之流感病毒，該血球凝集素係選自由以下組成之群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18，且/或A型流感病毒選自以神經胺糖酸酶(NA)為特徵之流感病毒，該神經胺糖酸酶係選自由以下組成之群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10及N11。較佳地，A型流感病毒係選自由以下組成之群：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2及H10N7，較佳選自H1N1、H3N2、H5N1。最佳地，mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質及至少一種源自流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。在一特別較佳實施例中，mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質及/或至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，該A型流感病毒係選自由以下組成之群： H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2及H10N7，較佳選自H1N1、H3N2、H5N1或其片段或變異體。 V.7. 製備本發明之 LNP 的方法
本發明進一步係關於一種製備脂質奈米顆粒之方法，其包含以下步驟：
(i) 將以下各物合併
(a) 如上定義的本發明之可離子化脂質或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，
(b) PEG脂質；
(c) 至少一種mRNA化合物，其包含編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列；及
(d) 視情況選用之類固醇；以及
(e) 視情況選用之中性脂質；
(ii) 將可離子化脂質及/或PEG脂質及視情況選用之中性脂質及/或類固醇或類固醇衍生物溶解於乙醇中；
(iii) 將乙醇脂質溶液與包含mRNA多核苷酸之水溶液混合
(iv) 移除乙醇以形成封裝或結合mRNA多核苷酸之脂質奈米顆粒；及視情況
(v) 經由稀釋、透析或過濾調節pH值；
(vi) 分離或純化脂質奈米顆粒。
乙醇可藉由不會對脂質或所形成的脂質奈米顆粒產生負面影響的任何適合之方法移除。在本發明之一個實施例中，乙醇係藉由透析移除。在一替代實施例中，乙醇係藉由透析過濾移除。
脂質奈米顆粒之分離及最佳純化亦可能藉由任何適合之方法進行。較佳地，對脂質奈米顆粒進行過濾，更佳地，經由無菌過濾器，藉由過濾分離或純化脂質奈米顆粒。 V.8. 本發明之醫藥組合物
本發明亦涵蓋包含本發明之可離子化脂質及核酸的醫藥組合物及/或疫苗。
在一較佳實施例中，包含mRNA的根據本發明之醫藥組合物或疫苗包含脂質奈米顆粒，其莫耳比為約50:10:38.5:1.5、較佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7(亦即，本發明之可離子化脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質之比例(莫耳％)；溶解於乙醇中)。在另一實施例中，莫耳比為48:12:38:2。
本發明進一步係關於一種醫藥組合物，其包含至少一種根據本發明之脂質奈米顆粒。在某些實施例中，脂質奈米顆粒包含mRNA化合物，該mRNA化合物包含編碼至少一種如本文所定義之抗原肽或蛋白質的序列。
在本發明之一個實施例中，mRNA序列編碼一種抗原肽或蛋白質。在本發明之一替代實施例中，mRNA序列編碼多於一種抗原肽或蛋白質。
在本發明之一個實施例中，醫藥組合物包含根據本發明之脂質奈米顆粒，其中該脂質奈米顆粒包含多於一種mRNA化合物，其各自包含編碼抗原肽或蛋白質的不同mRNA序列。
在本發明之一替代實施例中，醫藥組合物包含第二脂質奈米顆粒，其中該第二脂質奈米顆粒所包含之mRNA化合物不同於第一脂質奈米顆粒所包含之mRNA化合物。
在又一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含含有至少一個如本文所定義之編碼區的mRNA序列；及醫藥學上可接受之載劑。根據本發明之組合物較佳作為醫藥組合物或疫苗提供。
根據一較佳實施例，根據本發明之醫藥組合物或疫苗包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含至少一種含有至少一個如上定義之mRNA序列的mRNA，其中該至少一個mRNA序列之至少一個編碼區編碼至少一種抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質較佳源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質，較佳為血球凝集素(HA)或神經胺糖酸酶(NA)蛋白或醣蛋白中之任一者，或此等蛋白質中任一者之片段或變異體。
較佳地，根據本發明之醫藥組合物或疫苗包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含至少一種含有至少一個如上定義之mRNA序列的mRNA，其中該至少一個mRNA序列之至少一個編碼序列包含核酸序列或由核酸序列組成,該核酸序列編碼至少一種抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質較佳源自流感病毒之蛋白質，較佳為血球凝集素(HA)或神經胺糖酸酶(NA)蛋白中之任一者或其片段或變異體，其中源自流感病毒之蛋白質的蛋白質較佳包含或由胺基酸序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。或者，抗原肽或蛋白質源自狂犬病病毒，較佳源自狂犬病病毒之醣蛋白或此等序列中之任一者之片段或變異體。
較佳地，根據本發明之醫藥組合物或疫苗包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含至少一種含有至少一個如上定義之mRNA序列的mRNA，其中該mRNA序列之至少一個編碼序列包含核酸序列或由核酸序列組成，該核酸序列編碼至少一種源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質，其中該抗原肽或蛋白質源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質。
因此，根據本發明之醫藥組合物或疫苗可包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含至少一種mRNA，該mRNA包含至少一個含有至少一個編碼區之mRNA序列，該編碼區編碼至少一種抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，其中該至少一個mRNA序列之至少一個編碼區編碼一種特定的抗原肽或蛋白質，例如源自本文所定義的流感病毒之蛋白質或其片段或變異體。
或者，本發明之醫藥組合物或疫苗可包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含至少一種含有至少一個根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物，其中該至少一個mRNA序列編碼至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種不同的抗原肽或蛋白質，例如源自如本文所定義的流感病毒之蛋白質或其片段或變異體。
在此上下文中，特別較佳地，包含在醫藥組合物或疫苗中的至少一種mRNA化合物為雙順反子或多順反子mRNA，其編碼至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種不同的抗原肽或蛋白質，例如源自流感病毒之蛋白質。亦設想此等實施例之間的混合物，諸如包含多於一個mRNA序列之組合物，其中至少一個mRNA序列可為單順反子，而至少一個其他mRNA序列可為雙順反子或多順反子。
根據本發明之醫藥組合物或疫苗，較佳其中包含的mRNA序列之至少一個編碼序列，因此可包含如本文所定義之核酸序列的任何組合。
較佳地，醫藥組合物或疫苗包含含有脂質奈米顆粒之mRNA，該等脂質奈米顆粒包含複數個或多於一個根據本發明之mRNA序列，其中每個mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種抗原肽或蛋白質，源自流感病毒之蛋白質或其片段或變異體。
在一特別較佳實施例中，該組合物包含至少2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100個不同的mRNA序列，每個序列編碼至少一種抗原肽或蛋白質，例如源自如上所定義的流感病毒之蛋白質或其片段或變異體，例如源自流感病毒之血球凝集素（HA）或神經胺糖酸酶（NA）或其片段或變異體。
在另一實施例中，該組合物包含4個不同的mRNA序列，每個序列編碼至少一種抗原肽或蛋白質，較佳源自如上所定義的流感病毒之蛋白質或其片段或變異體，例如，源自流感病毒之血球凝集素(HA)或神經胺糖酸酶(NA) 或其片段或變異體。
在此上下文中，特別較佳地，每個mRNA序列編碼至少一種不同的抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質源自相同病原體(例如流感病毒)之蛋白質，其中特別較佳地，該抗原肽或蛋白質源自相同病原體(例如流感病毒)之不同蛋白質。較佳地，該組合物包含至少兩個mRNA序列，其中至少一個mRNA序列編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，並且至少一個mRNA序列編碼至少一種源自相同流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質。
在另一較佳實施例中，每個mRNA序列編碼至少一種不同的抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質源自不同病原體(例如流感病毒)之蛋白質。較佳地，每個mRNA序列編碼至少一種源自不同流感病毒之血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質。
較佳地，根據本發明之醫藥組合物或疫苗包含複數個mRNA序列，每個mRNA序列編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中源自2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100種不同流感病毒之血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)的至少一種抗原肽或蛋白質係由複數個mRNA序列編碼。
在此上下文中，特別較佳地，醫藥組合物或疫苗包含至少一種mRNA，該mRNA包含含有mRNA化合物之脂質奈米顆粒，該mRNA化合物包含：編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒H1之蛋白質，較佳源自血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)；至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒H3之蛋白質，較佳源自血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)；至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒H5之蛋白質，較佳源自血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)；及視情況至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒H7之蛋白質，較佳源自血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)；及/或視情況至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒H9之蛋白質，較佳源自血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)。
較佳地，醫藥組合物或疫苗包含至少一種mRNA， 該mRNA包含含有mRNA化合物之脂質奈米顆粒，該mRNA化合物包含：編碼至少一種源自A型流感病毒H1之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H1之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H3之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H3之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H5之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H5之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；及視情況至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H7之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H7之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；及/或視情況至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H9之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H9之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列。
在一特定實施例中，醫藥組合物或疫苗包含至少一種mRNA， 該mRNA包含含有mRNA化合物之脂質奈米顆粒，該mRNA化合物包含：編碼至少一種源自A型流感病毒H1N1之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H1N1之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H3N2之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H3N2之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列；至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H5N1之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自A型流感病毒H5N1之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列。
另外，醫藥組合物或疫苗較佳進一步包含至少一種mRNA， 該mRNA包含含有mRNA化合物之脂質奈米顆粒，該mRNA化合物包含編碼至少一種源自至少一種B型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列及/或至少一個編碼至少一種源自至少一種B型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質之mRNA序列，該等mRNA序列封裝或與包含根據本發明之脂質奈米顆粒的mRNA結合。 V.9. 用於本發明之 LNP 中的核酸
本發明基於令人驚訝之發現，即編碼包含在脂質奈米顆粒(LNP)中的至少一種抗原肽或蛋白質之核酸（例如，m-RNA）在低劑量及給藥方案下非常有效地誘導針對所編碼之抗原肽或蛋白質之抗原特異性免疫反應，而不需要頻繁投藥。
編碼包含在脂質奈米顆粒(LNP)中的至少一種抗原肽或蛋白質的本發明mRNA之另一優點為：誘導強烈的體液免疫反應；誘導b細胞記憶；免疫保護之更快啟動；所誘導免疫反應之耐久性；誘導廣泛的細胞性t細胞反應；誘導（局部及瞬時）促炎環境；不誘導全身細胞介素或趨化介素反應；耐受性好、無副作用、無毒；有利的穩定性特徵；與許多不同抗原相容之調配物；基於相同（生產）技術可行的更大抗原混合物；無載體免疫，亦即技術可用於針對多種（不同）抗原對同一受試者多次接種；生產之速度、適應性、簡便性及可擴展性。
具體而言，本發明係關於脂質奈米顆粒及其用途。在某些實施例中，該等脂質奈米顆粒至少包含：
(i) 本發明之可離子化脂質及/或PEG-脂質；及
(ii) mRNA化合物，其包含編碼抗原肽或蛋白質之mRNA序列。
在某些實施例中，包含mRNA之脂質奈米顆粒可包含其他化合物，諸如一或多種中性脂質、類固醇及該等化合物之組合。適合之化合物將在下文中詳細描述。
在某些實施例中，包含編碼抗原肽或蛋白質之mRNA序列的mRNA化合物可為mRNA分子。在本發明之一個實施例中，mRNA化合物為天然及未經修飾之mRNA。在本發明之上下文中，天然及未經修飾之mRNA涵蓋活體外產生的mRNA，沒有化學修飾或序列變化。
在本發明之一替代實施例中，mRNA化合物包含人工mRNA。在本發明之上下文中，人工mRNA涵蓋具有化學修飾、序列修飾或非天然序列之mRNA。
在本發明之一較佳實施例中，mRNA化合物不包含核苷修飾，具體而言不包含鹼基修飾。在又一實施例中，mRNA化合物不包含1-甲基假尿苷修飾。在一個較佳實施例中，mRNA僅包含天然存在之核苷。在又一較佳實施例中，mRNA化合物不包含任何化學修飾且視情況包含序列修飾。在本發明之又一較佳實施例中，mRNA化合物僅包含天然存在之核苷腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶。
根據本發明之某些實施例，mRNA序列為單順反子、雙順反子或多順反子，較佳如本文所定義。雙順反子或多順反子mRNA中的編碼序列較佳編碼如本文所定義之不同肽或蛋白質或其片段或變異體。較佳地，編碼兩種或更多種肽或蛋白質之編碼序列可在雙順反子或多順反子mRNA中由至少一個IRES（內部核糖體進入位點）序列分隔開，如下所定義。因此，術語「編碼兩種或更多種肽或蛋白質」可意謂但不限於雙順反子或甚至多順反子mRNA可編碼例如至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個（較佳不同的）在本文所提供之定義內的肽或蛋白質或其片段或變異體。更佳地但不限於此，雙順反子或甚至多順反子mRNA可編碼例如至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個（較佳不同的）如本文所定義之肽或蛋白質或如本文所定義之其片段或變異體。
在此上下文中，如上所定義之所謂的IRES（內部核糖體進入位點）序列可用作唯一的核糖體結合位點，但其亦可用於提供如上所定義之雙順反子或甚至多順反子mRNA，它編碼幾種肽或蛋白質，它們係由相互獨立的核糖體轉譯。可根據本發明使用的IRES序列之實例為來自以下病毒之彼等序列：小核糖核酸病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰質炎病毒(PV)、腦心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、C型肝炎病毒(HCV)、典型豬瘟病毒(CSFV)、小鼠白血病病毒(MLV)、猴類免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。吾等使用之TEV、煙草蝕刻病毒 5' UTR為IRES。
根據又一實施例，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區可編碼至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種及更多種如本文所定義之肽或蛋白質（或其片段及衍生物），它們在有或無胺基酸連接子序列下連接，其中該連接子序列可包括剛性連接子、柔性連接子、可切割連接子（例如，自切割肽）或其組合。其中，肽或蛋白質可為相同或不同或其組合。具體的肽或蛋白質組合可由編碼至少兩種如本文所說明之肽或蛋白質的該mRNA（在本文中亦稱為「多抗原構築體/mRNA」）編碼。
在本發明之一具體態樣中，脂質奈米顆粒包含mRNA化合物，該mRNA化合物包含編碼抗原肽或蛋白質或其片段、變異體或衍生物之mRNA序列。
此等抗原肽或蛋白質可源自致病性抗原、腫瘤抗原、過敏性抗原或自體免疫性自身抗原，較佳如本文所定義。在本發明之上下文中，抗原肽或蛋白質較佳排除螢光素酶。 V.9.1. 致病性抗原
此類致病性抗原源自致病性生物，特別是細菌、病毒或原生動物（多細胞）致病性生物，其引起受試者、具體地哺乳動物受試者、更具體地人類之免疫反應。更具體地，致病性抗原較佳為表面抗原，例如位於病毒或細菌或原生動物生物之表面上的蛋白質（或蛋白質片段，例如表面抗原之外部部分）。
致病性抗原為較佳源自與感染性疾病相關之病原體的肽或蛋白質抗原，其較佳選自源自以下病原體之抗原：鮑曼氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、邊蟲屬(Anaplasma genus)、嗜吞噬細胞邊蟲(Anaplasma phagocytophilum)、巴西鉤蟲(Ancylostoma braziliense)、十二指腸鉤蟲(Ancylostoma duodenale)、溶血隱秘桿菌(Arcanobacterium haemolyticum)、人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、曲黴菌屬(Aspergillus genus)、星狀病毒科(Astroviridae)、焦蟲屬(Babesia genus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、臘狀桿菌(Bacillus cereus)、巴爾通氏體(Bartonella henselae)、BK病毒、人芽囊原蟲(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、百日咳嗜血桿菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、疏螺旋體屬(Borrelia genus)、疏螺旋體某些種(Borrelia spp)、(布氏桿菌屬(Brucella genus)、馬來血絲蟲(Brugia malayi)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae family)、洋蔥伯克氏菌(Burkholderia cepacia)及其他伯克氏菌菌種、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、杯狀病毒科(Caliciviridae family)、彎曲桿菌屬(Campylobacter genus)、白色念珠菌(Candida albicans)、念珠菌某些種(Candida spp)、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae)、鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci)、CD朊病毒、中華肝吸蟲(Clonorchis sinensis)、肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)、困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌某些種(Clostridium spp)、破傷風梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani)、球孢子菌某些種(Coccidioides spp)、冠狀病毒(coronaviruses)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、伯納特氏柯克斯氏體(Coxiella burnetii)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium genus)、巨細胞病毒(CMV)、登革熱病毒(Dengue viruse) (DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆弱雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、埃博拉病毒(Ebolaviru)(EBOV)、絛蟲屬(Echinococcus genus)、查菲艾利希體(Ehrlichia chaffeensis)、伊氏艾利希體(Ehrlichia ewingii)、艾利希體屬(Ehrlichia genus)、溶組織阿米巴(Entamoeba histolytica)、腸球菌屬(Enterococcus genus)、腸病毒屬(Enterovirus genus)、腸病毒，主要是A型柯薩奇(Coxsackie)病毒及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌某些種(Epidermophyton spp)、EB病毒(Epstein-Barr Virus) (EBV)、大腸桿菌O157:H7、O111及O104:H4、肝片吸蟲(Fasciola hepatica)及巨片吸蟲(Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、絲蟲目超科(Filarioidea superfamily)、黃病毒(Flaviviruses)、土拉文氏桿菌(Francisella tularensis)、細梭菌屬(Fusobacterium genus)、白地絲黴菌(Geotrichum candidum)、腸鞭毛蟲(Giardia intestinalis)、顎口蟲某些種(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒(Guanarito virus)、杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、亨德拉·尼帕病毒(Henipavirus)(亨德拉病毒尼帕病毒)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum)、HIV (人類免疫缺陷病毒)、威尼克何德黴(Hortaea werneckii)、人類波卡病毒(bocavirus)(HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流感病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、Junin病毒、金格金氏桿菌(Kingella kingae)、肉芽腫克雷伯菌(Klebsiella granulomatis)、Kuru朊病毒、賴薩病毒(Lassa virus)、退伍軍人嗜肺病菌(Legionella pneumophila)、利什曼原蟲屬(Leishmania genus)、鉤端螺旋體屬(Leptospira genus)、李斯特單胞菌(Listeria monocytogenes)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、馬丘波病毒(Machupo virus)、馬拉色菌某些種(Malassezia spp)、馬堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲(Metagonimus yokagawai)、微孢子目門(Microsporidia phylum)、傳染性軟疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)及肉瘤分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、變形纖毛蟲(Naegleria fowleri)、美洲鈎蟲(Necator americanus)、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、星形土壤絲菌(Nocardia asteroides)、土壤絲菌某些種(Nocardia spp)、盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)、恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae family)(流感)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、肺吸蟲某些種(Paragonimus spp)、衛氏肺吸蟲(Paragonimus westermani)、微小病毒B19、巴氏桿菌屬(Pasteurella genus)、瘧原蟲屬(Plasmodium genus)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次體(Rickettsia akari)、立克次體屬(Rickettsia genus)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)、傷寒立克次體(Rickettsia typhi)、Rift谷熱病毒、輪狀病毒、德國麻疹病毒(Rubella virus)、薩比亞病毒(Sabia virus)、沙門桿菌屬(Salmonella genus)、疥蟎(Sarcoptes scabiei)、SARS冠狀病毒、血吸蟲屬(Schistosoma genus)、志賀桿菌屬(Shigella genus)、辛諾柏病毒(Sin Nombre virus)、漢坦病毒(Hantavirus)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌屬、葡萄球菌屬、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、糞擬圓蟲(Strongyloides stercoralis)、絛蟲屬(Taenia genus)、有鉤絛蟲(Taenia solium)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、犬蛔蟲(Toxocara canis)或貓蛔蟲(Toxocara cati)、弓蟲(Toxoplasma gondii)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、旋毛蟲(Trichinella spiralis)、陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)、髮癬菌某些種(Trichophyton spp)、毛首鞭蟲(Trichuris trichiura)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、尿素黴漿菌(Ureaplasma urealyticum)、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV)、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、西尼羅病毒(West Nile virus)、西部馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus)、潘氏絲狀蟲(Wuchereria bancrofti)、黃熱病毒、小腸大腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)及假性結核病耶氏桿菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
在此上下文中，特別較佳為來自選自以下之病原體的抗原：流感病毒、SARS-COV-2、呼吸道融合病毒(RSV)、單純疱疹病毒(HSV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、瘧原蟲、困難梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、登革熱病毒、砂眼披衣菌、布氏桿菌、巨細胞病毒(CMV)、B型肝炎病毒(HBV)、結核分枝桿菌、狂犬病病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒及黃熱病病毒。
此外，致病性抗原（源自與感染性疾病相關之病原體的抗原）可較佳選自以下抗原：外膜蛋白A OmpA、生物膜相關蛋白Bap、轉運蛋白MucK (鮑曼氏不動桿菌，不動桿菌感染))；可變表面醣蛋白VSG、微管-相關蛋白MAPP15、轉唾液酸酶TSA (布氏錐蟲，非洲昏睡病(非洲錐蟲病))；HIV p24抗原、HIV包膜蛋白(Gp120、Gp41、Gp160)、多蛋白GAG、負因子蛋白Nef、轉錄反式活化因子Tat (HIV (人類免疫缺陷病毒)，AIDS (獲得性免疫缺陷症候群))；半乳糖可抑制黏著蛋白GIAP、29 kDa抗原Eh29、Gal/GalNAc凝集素、蛋白CRT、125 kDa免疫顯性抗原、蛋白M17、黏附素ADH112、蛋白STIRP (溶組織阿米巴，阿米巴病)；主要表面蛋白 1-5 (MSP1a、MSP1b、MSP2、MSP3、MSP4、MSP5)、IV型分泌系統蛋白 (VirB2、VirB7、VirB11、VirD4) (邊蟲屬，邊蟲病)；保護性抗原PA、水腫因子EF、致死因子LF、S-層同源蛋白SLH (炭疽芽孢桿菌，炭疽)；溶血素、磷脂酶D、膠原-結合蛋白CbpA (溶血隱秘桿菌，溶血隱秘桿菌感染)；核蛋白殼蛋白NP、醣蛋白前驅物GPC、醣蛋白GP1、醣蛋白GP2 (Junin病毒，阿根廷出血熱)；幾丁質蛋白層蛋白、14 kDa表面抗原A14、主要精子蛋白MSP、MSP聚合組織蛋白MPOP、MSP纖維蛋白2 MFP2、MSP聚合活化激酶MPAK、ABA-1樣蛋白ALB、蛋白ABA-1、殼脂蛋白CUT-1 (人蛔蟲，蛔蟲病)；41 kDa過敏原Asp v13、過敏原Asp f3、主要分生孢子表面蛋白小桿A、蛋白酶Pep1p、GPI-錨定蛋白Gel1p、GPI-錨定蛋白Crf1p (曲黴菌屬，曲黴菌病)；家族VP26蛋白、VP29蛋白(星狀病毒科，星狀病毒感染)；棒狀體-相關蛋白1 RAP-1、裂殖子表面抗原MSA-1、MSA-2 (a1、a2、b、c)、12D3、11C5、21B4、P29、變異紅血球表面抗原VESA1、頂端 膜抗原1 AMA-1 (焦蟲屬，焦蟲病)；溶血素、腸毒素C、PXO1-51、乙醇酸氧化酶、ABC-轉運蛋白、青黴素-結合蛋白、鋅轉運蛋白家族蛋白、假尿苷合成酶Rsu、質體複製蛋白RepX、寡內肽酶F、原噬菌體膜蛋白、蛋白HemK、鞭毛抗原H、28.5-kDa細胞表面抗原(臘狀桿菌，臘狀桿菌感染)；大T抗原LT、小T抗原、殼蛋白VP1、殼蛋白VP2 (BK病毒，BK病毒感染)；29 kDa-蛋白、凋亡蛋白酶-3-樣抗原、醣蛋白(人芽囊原蟲，人芽囊原蟲感染)；酵母表面黏附素WI-1 (皮炎芽生菌，芽生菌病)；核蛋白N、聚合酶L、基質蛋白Z、醣蛋白GP (馬丘波病毒，玻利維亞出血熱)；外表面蛋白A OspA、外表面蛋白OspB、外表面蛋白OspC、飾膠蛋白聚糖結合蛋白A DbpA、飾膠蛋白聚糖結合蛋白B DbpB、鞭毛絲41 kDa核心蛋白Fla、鹼性膜蛋白A前驅物BmpA (免疫顯性抗原P39)、外表面22 kDa脂蛋白前驅物(抗原IPLA7)、可變表面脂蛋白vlsE (疏螺旋體屬，疏螺旋體感染)；肉毒桿菌神經毒素BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、重組肉毒桿菌毒素F He域FHc (肉毒梭狀芽孢桿菌，肉毒桿菌中毒(及嬰兒型肉毒桿菌中毒))；核蛋白殼、醣蛋白前驅物(薩比亞病毒，巴西出血熱)；銅/鋅超氧化物歧化酶SodC、細菌鐵蛋白Bfr、50S核糖體蛋白RplL、含OmpA樣跨膜域之蛋白Omp31、免疫原性39-kDa蛋白M5 P39、鋅ABC轉運蛋白周質鋅-結合蛋白znuA、周質免疫原性蛋白Bp26、30S核糖體蛋白S12 RpsL、甘油醛-3-磷酸去氫酶Gap、25 kDa外膜免疫原性蛋白前驅物Omp25、入侵蛋白B lalB、觸發因子Tig、分子伴護蛋白DnaK、推定的肽基-脯胺醯基順反異構酶SurA、脂蛋白Omp19、外膜蛋白MotY Omp16、保守外膜蛋白D15、蘋果酸去氫酶Mdh、IV型分泌系統(T4SS) VirJ之組分、未知功能之脂蛋白BAB1_0187 (布氏桿菌屬，布氏桿菌病)；ABC轉運蛋白家族之成員(LolC、OppA及PotF)、推定的脂蛋白釋放系統跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞內運動性A BimA、細菌延長因子-Tu EF-Tu、17 kDa OmpA樣蛋白、boaA編碼蛋白、boaB編碼蛋白(洋蔥伯克氏菌及其他伯克氏菌菌種，伯克氏菌感染)；分枝醯基-轉移酶Ag85A、熱休克蛋白Hsp65、蛋白TB10.4、19 kDa抗原、蛋白PstS3、熱休克蛋白Hsp70 (潰瘍分枝桿菌，Buruli氏潰瘍)；諾羅病毒主要及次要病毒殼蛋白VP1及VP2、基因組多蛋白、劄幌病毒殼蛋白VP1、蛋白Vp3、geome多蛋白(杯狀病毒科，杯狀病毒感染(諾羅病毒及劄幌病毒))；主要外膜蛋白PorA、鞭毛蛋白FlaA、表面抗原CjaA、纖維連接蛋白結合蛋白CadF、天冬胺酸/麩胺酸-結合ABC轉運蛋白Peb1A、蛋白FspA1、蛋白FspA2 (彎曲桿菌屬，彎曲桿菌病)；醣解酶烯醇酶、分泌型天冬胺醯基蛋白酶SAP1-10、醣磷脂酸肌醇(GPI)連接之細胞壁蛋白、蛋白Hyr1、補體受體3-相關蛋白CR3-RP、黏附素Als3p、熱休克蛋白90 kDa hsp90、細胞表面疏水性蛋白CSH (通常為白色念珠菌及其他念珠菌物種，念珠菌病)；17-kDa抗原、蛋白P26、三聚自轉運蛋白黏附素TAAs、巴爾通氏體黏附素A BadA、可變表現之外膜蛋白Vomps、蛋白Pap3、蛋白HbpA、外膜相關蛋白酶HtrA、蛋白OMP89、蛋白GroEL、蛋白LalB、蛋白OMP43、二氫硫辛醯胺琥珀醯基轉移酶SucB (巴爾通氏體，貓抓病)；無鞭毛體表面蛋白-2、無鞭毛體-特異性表面蛋白SSP4、cruzipain、轉唾液酸酶TS、錐鞭毛體表面醣蛋白TSA-1、補體調節蛋白CRP-10、蛋白G4、蛋白G2、副軸桿蛋白PAR2、副鞭毛桿組分Par1、黏液素相關表面蛋白 MPSP (克氏錐蟲，卻格司氏病(Chagas Disease)(美洲錐蟲病))；包膜醣蛋白(gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL) (水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，水痘)；主要外膜蛋白MOMP、可能外膜蛋白PMPC、外膜複合蛋白B OmcB、熱休克蛋白Hsp60 HSP10、蛋白IncA、來自III型分泌系統之蛋白、核糖核苷酸還原酶小鏈蛋白NrdB、質體蛋白Pgp3、披衣菌外蛋白N CopN、抗原CT521、抗原CT425、抗原CT043、抗原TC0052、抗原TC0189、抗原TC0582、抗原TC0660、抗原TC0726、抗原TC0816、抗原TC0828 (砂眼披衣菌，衣原體)；低鈣反應蛋白E LCrE、披衣菌外蛋白N CopN、絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶PknD、醯基載體蛋白S-丙二醯轉移酶FabD、單鏈DNA-結合蛋白Ssb、主要外膜蛋白MOMP、外膜蛋白2 Omp2、多型膜蛋白家族(Pmp1、Pmp2、Pmp3、Pmp4、Pmp5、Pmp6、Pmp7、Pmp8、Pmp9、Pmp10、Pmp11、Pmp12、Pmp13、Pmp14、Pmp15、Pmp16、Pmp17、Pmp18、Pmp19、Pmp20、Pmp21) (肺炎嗜衣原體，肺炎嗜衣原體感染)；霍亂毒素B CTB、毒素共調節菌毛蛋白A TcpA、毒素共調節菌毛蛋白TcpF、毒素共調節菌毛生物合成蛋白F TcpF、霍亂腸毒素次單元A、霍亂腸毒素次單元B、耐熱性腸毒素ST、甘露糖敏感性血球凝集素MSHA、外膜蛋白U孔蛋白ompU、Poring B蛋白、多型膜蛋白-D (霍亂弧菌，霍亂)；丙醯基-CoA羧化酶PCC、14-3-3蛋白、抑制素、半胱胺酸蛋白酶、麩胱甘肽轉移酶、凝溶膠蛋白、組織蛋白酶L蛋白酶CatL、外被al蛋白20.8 kDa TP20.8、外被al蛋白31.8 kDa TP31.8、溶血磷脂酸磷酸酶LPAP、(中華肝吸蟲，肝吸蟲病)；表面層蛋白SLPs、麩胺酸去氫酶抗原GDH、毒素A、毒素B、半胱胺酸蛋白酶Cwp84、半胱胺酸蛋白酶Cwp13、半胱胺酸蛋白酶Cwp19、細胞壁蛋白CwpV、鞭毛蛋白FliC、鞭毛蛋白FIiD、Zmp-1、CdeM、CdeC (困難梭狀芽孢桿菌，困難梭狀芽孢桿菌感染)；鼻病毒：殼蛋白VP1、VP2、VP3、VP4；冠狀病毒：穗蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、核蛋白殼蛋白N (通常為鼻病毒及冠狀病毒，普通感冒(急性病毒性鼻咽炎；急性鼻炎))；朊病毒蛋白Prp (CJD 朊病毒，庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD))；包膜蛋白Gc、包膜蛋白Gn、核蛋白殼蛋白 (克裡米亞-剛果出血熱病毒，克裡米亞-剛果出血熱(CCHF))；毒力相關DEAD-匣RNA解旋酶VAD1、半乳木甘露聚糖-蛋白GalXM、葡糖醛酸木甘露聚糖GXM、甘露糖蛋白MP (新型隱球菌，隱球菌病)；酸性核糖體蛋白P2 CpP2、粘液蛋白抗原Muc1、Muc2、Muc3 Muc4、Muc5、Muc6、Muc7、表面黏著蛋白CP20、表面黏著蛋白CP23、表面蛋白CP12、表面蛋白CP21、表面蛋白CP40、表面蛋白CP60、表面蛋白CP15、表面相關醣肽gp40、表面相關醣肽gp15、卵囊壁蛋白AB、抑制蛋白(profilin)PRF、腺三磷雙磷酸酶(隱孢子蟲屬，隱孢子蟲病)；脂肪酸及視黃醇結合蛋白-1 FAR-1、金屬蛋白酶TIMP之組織抑制劑(TMP)、半胱胺酸蛋白酶ACEY-1、半胱胺酸蛋白酶ACCP-1、表面抗原Ac-16、分泌性蛋白2ASP-2、金屬蛋白酶1 MTP-1、天冬胺醯基蛋白酶抑制劑API-1、表面相關抗原SAA-1、成人特異性分泌因子Xa絲胺酸蛋白酶抑制劑抗凝劑AP、組織蛋白酶D樣天冬胺酸蛋白酶ARR-1 (通常為巴西鉤蟲；多種其他寄生蟲，皮膚幼蟲移行症(CLM))；組織蛋白酶L樣蛋白酶、53/25-kDa抗原、8 kDa家族成員、具有邊緣胰蛋白酶樣活性之囊蟲蛋白TsAg5、六鉤蚴蛋白TSOL18、六鉤蚴蛋白TSOL45-1A、乳酸去氫酶A LDHA、乳酸去氫酶B LDHB (有鉤絛蟲，囊蟲症)；pp65 抗原、膜蛋白pp15、殼-近端外被蛋白pp150、蛋白M45、DNA聚合酶UL54、解旋酶UL105、醣蛋白gM、醣蛋白gN、醣蛋白H、醣蛋白B gB、蛋白UL83、蛋白UL94、蛋白UL99 (巨細胞病毒(CMV)，巨細胞病毒感染)；殼蛋白C、膜前蛋白prM、膜蛋白M、包膜蛋白E (域I、域II、域II)、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白NS2B、蛋白NS3、蛋白NS4A、蛋白2K、蛋白NS4B、蛋白NS5 (登革熱病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)-黃病毒，登革熱)；39 kDa蛋白(脆弱雙核阿米巴，雙核阿米巴病)；白喉毒素前驅物Tox、白喉毒素DT、菌毛蛋白-特異性分選酶SrtA、軸菌毛蛋白蛋白SpaA、頂端菌毛蛋白蛋白SpaC、次要菌毛蛋白蛋白SpaB、表面-相關蛋白DIP1281 (白喉桿菌，白喉)；醣蛋白GP、核蛋白NP、次要基質蛋白VP24、主要基質蛋白VP40、轉錄活化因子VP30、聚合酶輔因子VP35、RNA聚合酶L (埃博拉病毒(EBOV)，埃博拉出血熱)；朊病毒蛋白(vCOD朊病毒，變異庫賈氏病(vCOD、nvCOD))；UvrABC系統蛋白B、蛋白Flp1、蛋白Flp2、蛋白Flp3、蛋白TadA、血紅素受體HgbA、外膜蛋白TdhA、蛋白CpsRA、調節因子CpxR、蛋白SapA、18 kDa抗原、外膜蛋白NcaA、蛋白LspA、蛋白LspA1、蛋白LspA2、蛋白LspB、外膜組分DsrA、凝集素DltA、脂蛋白Hip、主要外膜蛋白OMP、外膜蛋白OmpA2 (杜克雷嗜血桿菌，輭下疳)；天冬胺醯基蛋白酶1 Pep1、磷脂酶B PLB、α-甘露糖苷酶1 AMN1、葡聚糖基轉移酶GEL1、尿素酶URE、過氧化酶體基質蛋白Pmp1、富含脯胺酸之抗原Pra、人類T細胞反應性蛋白TcrP (粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及波薩達斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)，球孢子菌病)；過敏原Tri r 2、熱休克蛋白60 Hsp60、真菌肌動蛋白Act、抗原Tri r2、抗原Tri r4、抗原Tri t1、蛋白IV、甘油-3-磷酸去氫酶Gpd1、滲透傳感因子HwSho1A、滲透傳感因子HwSho1B、組胺酸激酶 HwHhk7B、過敏原Mala s 1、過敏原Mala s 11、硫氧還蛋白Trx Mala s 13、過敏原Mala f、過敏原Mala s (通常為髮癬菌某些種、表皮癬菌某些種、馬拉色菌某些種、威尼克何德黴，皮癬菌病)；蛋白EG95、蛋白EG10、蛋白EG18、蛋白EgA31、蛋白EM18、抗原EPC1、抗原B、抗原5、蛋白P29、蛋白14-3-3、8-kDa蛋白、親肌肉抗原、熱休克蛋白20 HSP20、醣蛋白GP-89、脂肪酸結合蛋白FAPB (絛蟲屬，絛蟲病)；主要表面蛋白2 MSP2、主要表面蛋白4 MSP4、MSP變異SGV1、MSP變異SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19 OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510編碼蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE 130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(艾利希體屬，艾利希體症)；分泌型抗原SagA、sagA-l樣蛋白SalA及SalB、膠原黏附素Scm、表面蛋白Fms1 (EbpA(fm)、Fms5 (EbpB(fm)、Fms9 (EpbC(fm)及Fms10、蛋白EbpC(fm)、96 kDa免疫保護醣蛋白G1 (腸球菌屬，腸球菌感染)；基因組多蛋白、聚合酶3D、病毒殼蛋白VP1、病毒殼蛋白VP2、病毒殼蛋白VP3、病毒殼蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C (腸病毒屬，腸病毒感染)；外膜蛋白OM、60 kDa外膜蛋白、細胞表面抗原OmpA、細胞表面抗原OmpB (sca5)、134 kDa外膜蛋白、31 kDa外膜蛋白、29.5 kDa外膜蛋白、細胞表面蛋白SCA4、細胞表面蛋白Adr1 (RP827)、細胞表面蛋白Adr2 (RP828)、細胞表面蛋白SCA1、入侵蛋白invA、細胞分裂蛋白fts、分泌蛋白sec 0家族、毒力蛋白virB、tlyA、tlyC、細小蛋白樣蛋白Pip、前蛋白轉位酶SecA、120-kDa表面蛋白抗原 SPA、138 kD複合抗原、主要100-kD蛋白(蛋白I)、細胞漿內蛋白D、保護性表面蛋白抗原SPA (普氏立克次體，流行性斑疹傷寒)；EB核抗原(EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前導蛋白(EBNA-LP))、潛伏膜蛋白(LMP-1、LMP-2A、LMP-2B)、早期抗原EBV-EA、膜抗原EBV-MA、病毒殼抗原EBV-VCA、鹼性核酸酶EBV-AN、醣蛋白H、醣蛋白gp350、醣蛋白gp110、醣蛋白gp42、醣蛋白gHgL、醣蛋白gB (EB病毒(EBV)，EB病毒感染性單核白血球增多症)；殼蛋白VP2、殼蛋白VP1、主要蛋白NS1 (微小病毒B19，傳染性紅斑(第五疾病))；pp65抗原、醣蛋白105、主要殼蛋白、包膜醣蛋白H、蛋白U51 (人類皰疹病毒6 (HHV-6)及人類皰疹病毒7 (HHV-7)，幼兒急疹)；硫氧還蛋白-麩胱甘肽還原酶TGR、組織蛋白酶L1及L2、孔尼茲型(Kunitz-type)蛋白KTM、白胺酸胺基肽酶LAP、半胱胺酸蛋白酶Fas2、皂素樣蛋白-2 SAP-2、硫氧還蛋白過氧化酶TPx、Prx-1、Prx-2、組織蛋白酶I半胱胺酸蛋白酶CL3、蛋白酶組織蛋白酶L CL1、磷酸甘油酸激酶PGK、27-kDa分泌蛋白、60 kDa蛋白HSP35α、麩胱甘肽轉移酶GST、28.5 kDa外被al抗原28.5 kDa TA、組織蛋白酶B3 蛋白酶CatB3、I型胱抑素stefin-1、組織蛋白酶L5、組織蛋白酶Llg及組織蛋白酶B、脂肪酸結合蛋白FABP、白胺酸胺基肽酶LAP (肝片吸蟲及巨片吸蟲，片吸蟲病)；朊病毒蛋白(FFI朊病毒，致命家族性失眠(FFI))；毒液過敏原同源物樣蛋白VAL-1、豐幼蟲轉錄本ALT-1、豐幼蟲轉錄本ALT-2、硫氧還蛋白過氧化酶TPX、胡蜂過敏原同源物VAH、硫氧還蛋白過氧化酶 2 TPX-2、抗原蛋白SXP (肽N、N1、N2、及N3)、活化相關蛋白-1 ASP-1、硫氧還蛋白TRX、轉麩醯胺酸酶BmTGA、麩胱甘肽-S-轉移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂過敏原同源物VAH、175 kDa膠原酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶GAPDH、角質層膠原Col-4、分泌型幼蟲酸性蛋白SLAPs、幾丁質酶CHI-1、麥芽糖結合蛋白MBP、醣解酶果糖-1、6-雙磷酸醛縮酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、線蟲特異性基因產物OvB20、盤尾半胱胺酸蛋白酶抑制蛋白(onchocystatin)CPI-2、Cox-2(絲蟲目超科，絲蟲病)；磷脂酶C PLC、不耐熱腸毒素B、Iota 毒素組分Ib、蛋白CPE1281、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶、延長因子G EF-G、穿孔素O Pfo、甘油醛-3-磷酸去氫酶GapC、果糖-雙磷酸醛縮酶Alf2、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌腸毒素CPE、α毒素AT、α類毒素ATd、 ε-類毒素ETd、蛋白HP、大細胞毒素TpeL、內-β-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶Naglu、磷甘油酸變位酶Pgm (產氣莢膜梭狀芽孢桿菌，由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的食物中毒)；白血球毒素IktA、黏附FadA、外膜蛋白RadD、高分子量精胺酸-結合蛋白(細梭菌屬、細梭菌感染)；磷脂酶C PLC、不耐熱腸毒素B、Iota毒素組分Ib、蛋白CPE1281、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶、延長因子G EF-G、穿孔素O Pfo、甘油醛-3-磷酸去氫酶GapC、果糖-雙磷酸醛縮酶Alf2、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌腸毒素CPE、α毒素AT、α類毒素ATd、 ε-類毒素ETd、蛋白HP、大細胞毒素TpeL、內-β-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶Naglu、磷甘油酸變位酶Pgm (通常為產氣莢膜梭狀芽孢桿菌；其他梭狀芽孢桿菌物種、氣性壞疽(Clostridial myonecrosis))；脂肪酶A、脂肪酶B、過氧化酶Dec1 (白地絲黴菌，地絲黴菌病)；朊病毒蛋白(GSS 朊病毒，Gerstmann-Sträussler-Scheinker症候群(GSS))；囊壁蛋白CWP1、CWP2、CWP3、變異表面蛋白VSP、VSP1、VSP2、VSP3、VSP4、VSP5、VSP6、56 kDa 抗原、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶PFOR、醇去氫酶E ADHE、α-賈第素(giardin)、α8-賈第素、α1-賈第素、β-賈第素、半胱胺酸蛋白酶、麩胱甘肽-S-轉移酶GST、精胺酸去亞胺酶ADI、果糖-1、6-雙磷酸醛縮酶FBA、賈第鞭毛蟲滋養體抗原GTA (GTA1、GTA2)、鳥胺酸羧基轉移酶OCT、橫紋纖維組裝蛋白樣蛋白SALP、尿苷磷醯基樣蛋白UPL、α-微管蛋白、β-微管蛋白(腸鞭毛蟲，梨形鞭毛蟲病)；ABC轉運蛋白家族之成員(LolC、OppA及PotF)、推定的脂蛋白釋放系統跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞內運動性A BimA、細菌延長因子-Tu EF-Tu、17 kDa OmpA樣蛋白、boaA編碼蛋白(鼻疽伯克氏菌，鼻疽)；親環素CyP、24 kDa第三階段幼蟲蛋白GS24、排泄-分泌產物ESPs (40、80、120及208 kDa) (棘顎口蟲(Gnathostoma spinigerum)及剛棘顎口線蟲(Gnathostoma hispidum)，頜口蟲病)；菌毛蛋白蛋白、次要菌毛蛋白相關次單元pilC、主要菌毛蛋白次單元及變異體pilE、pilS、相變異蛋白porA、孔蛋白B PorB、蛋白TraD、萘瑟球菌外膜抗原H.8、70 kDa抗原、主要外膜蛋白PI、外膜蛋白PIA及PIB、W抗原、表面蛋白A NspA、轉鐵蛋白結合蛋白TbpA、轉鐵蛋白結合蛋白TbpB、PBP2、mtrR編碼蛋白、ponA編碼蛋白、膜通透酶FbpBC、FbpABC蛋白系統、LbpAB蛋白、外膜蛋白Opa、外膜轉運蛋白FetA、鐵抑制調節劑MpeR (淋病雙球菌，淋病)；外膜蛋白A OmpA、外膜蛋白C OmpC、外膜蛋白K17 OmpK17 (肉芽腫克雷伯菌，腹股溝肉芽腫(Donovanosis))；纖維連接蛋白-結合蛋白Sfb、纖維連接蛋白/纖維蛋白原-結合蛋白FBP54、纖維連接蛋白-結合蛋白FbaA、M蛋白1型Emm1、M蛋白6型Emm6、免疫球蛋白-結合蛋白35 Sib35、表面蛋白R28 Spr28、超氧化物歧化酶SOD、C5a肽酶 ScpA、抗原I/II AgI/II、黏附素AspA、G相關α2-巨球蛋白-結合蛋白GRAB、表面原纖蛋白M5 (釀膿鏈球菌，A組鏈球菌感染)；C蛋白P3抗原、精胺酸去亞胺酶蛋白、黏附素BibA、105 kDA蛋白BPS、表面抗原c、表面抗原R、表面抗原X、胰蛋白酶抗性蛋白R1、胰蛋白酶抗性蛋白R3、胰蛋白酶抗性蛋白R4、表面免疫原性蛋白Sip、表面蛋白Rib、富含白胺酸之重複蛋白LrrG、富含絲胺酸之重複蛋白Srr-2、C蛋白α-抗原 Bca、Β抗原Bag、表面抗原 ε、α樣蛋白ALP1、α樣蛋白ALP5表面抗原δ、α樣蛋白ALP2、α樣蛋白ALP3、α樣蛋白ALP4、Cβ蛋白Bac (無乳鏈球菌，B組鏈球菌感染)；轉鐵蛋白-結合蛋白2 Tbp2、磷酸酶P4、外膜蛋白P6、肽聚糖相關脂蛋白Pal、蛋白D、蛋白E、黏著及滲透蛋白Hap、外膜蛋白26 Omp26、外膜蛋白P5 (Fimbrin)、外膜蛋白D15、外膜蛋白OmpP2、5′-核苷酸酶NucA、外膜蛋白P1、外膜蛋白P2、外膜脂蛋白Pcp、脂蛋白E、外膜蛋白P4、岩藻糖激酶FucK、[Cu,Zn]-超氧化物歧化酶SodC、蛋白酶HtrA、蛋白0145、α-半乳糖苷基神經醯胺(流感嗜血桿菌，流感嗜血桿菌感染)；聚合酶3D、病毒殼蛋白VP1、病毒殼蛋白VP2、病毒殼蛋白VP3、病毒殼蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C (腸病毒，主要是A型柯薩奇及腸病毒71 (EV71)，手足口病(HFMD))；RNA 聚合酶L、蛋白L、醣蛋白Gn、醣蛋白Gc、核蛋白殼蛋白S、包膜醣蛋白G1、核蛋白NP、蛋白N、多蛋白M (辛諾柏病毒、漢坦病毒，漢坦病毒肺症候群(HPS))；熱休克蛋白HspA、熱休克蛋白HspB、檸檬酸合成酶 GltA、蛋白UreB、熱休克蛋白Hsp60、嗜中性球-活化蛋白NAP、過氧化氫酶KatA、空泡細胞毒素VacA、尿素酶α UreA、尿素酶β Ureb、蛋白Cpn10、蛋白groES、熱休克蛋白Hsp10、蛋白MopB、細胞毒性相關10 kDa蛋白CAG、36 kDa抗原、β-內醯胺酶HcpA、Β-內醯胺酶HcpB (幽門螺旋桿菌，幽門螺旋桿菌感染)；整合膜蛋白、易聚集蛋白、O-抗原、毒素-抗原Stx2B、毒素-抗原Stx1B、黏附-抗原片段Int28、蛋白EspA、蛋白EspB、Intimin、蛋白Tir、蛋白IntC300、蛋白Eae (大腸桿菌O157:H7、O111及O104:H4、溶血性尿毒癥候群(HUS))；RNA聚合酶L、蛋白L、醣蛋白Gn、醣蛋白Gc、核蛋白殼蛋白S、包膜醣蛋白G1、核蛋白NP、蛋白N、多蛋白 M (布尼亞病毒科，腎症候群出血熱(HFRS))；醣蛋白G、基質蛋白M、核蛋白N、融合蛋白F、聚合酶L、蛋白W、蛋白C、磷蛋白p、非結構蛋白V (亨德拉·尼帕病毒(亨德拉病毒尼帕病毒)，亨德拉·尼帕病毒感染)；多蛋白、醣蛋白Gp2、A型肝炎表面抗原HBAg、蛋白2A、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、蛋白P1B、蛋白P2A、蛋白P3AB、蛋白P3D (A型肝炎病毒，A型肝炎)；B型肝炎表面抗原HBsAg、B型肝炎核心抗原HbcAg、聚合酶、蛋白Hbx、preS2中間表面蛋白、表面蛋白L、大S蛋白、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4 (B型肝炎病毒(HBV)，B型肝炎)；包膜醣蛋白E1 gp32 gp35、包膜醣蛋白E2 NS1 gp68 gp70、殼蛋白C、核心蛋白Core、多蛋白、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、抗原G、蛋白NS3、蛋白NS5A、(C型肝炎病毒，C型肝炎)；病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、大肝炎δ抗原、小肝炎δ抗原(D型肝炎病毒，D型肝炎)；病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、殼蛋白E2 (E型肝炎病毒，E型肝炎)；醣蛋白L UL1、尿嘧啶-DNA醣苷酶UL2、蛋白UL3、蛋白UL4、DNA複製蛋白UL5、門脈蛋白UL6、病毒體成熟蛋白UL7、DNA解旋酶UL8、複製起點-結合蛋白UL9、醣蛋白M UL10、蛋白UL11、鹼性核酸外切酶UL12、絲胺酸-蘇胺酸蛋白激酶UL13、外被蛋白UL14、末端酶UL15、外被蛋白UL16、蛋白UL17、殼蛋白VP23 UL18、主要殼蛋白VP5 UL19、膜蛋白UL20、外被蛋白UL21、醣蛋白H (UL22)、胸苷激酶UL23、蛋白UL24、蛋白UL25、殼蛋白P40 (UL26、VP24、VP22A)、醣蛋白B (UL27)、ICP18.5蛋白(UL28)、主要DNA-結合蛋白ICP8 (UL29)、DNA聚合酶UL30、核基質蛋白UL31、包膜醣蛋白UL32、蛋白UL33、內核膜蛋白UL34、殼蛋白VP26 (UL35)、大外被蛋白UL36、殼組裝蛋白UL37、VP19C蛋白(UL38)、核糖核苷酸還原酶(大次單元) UL39、核糖核苷酸還原酶(小次單元) UL40、外被蛋白/病毒體宿主關閉VHS蛋白(UL41)、DNA聚合酶進行性因子UL42、膜蛋白UL43、醣蛋白C (UL44)、膜蛋白UL45、外被蛋白VP11/12 (UL46)、外被蛋白VP13/14 (UL47)、病毒體成熟蛋白VP16 (UL48、Α-TIF)、包膜蛋白UL49、dUTP二磷酸酶UL50、外被蛋白UL51、DNA 解旋酶/引子酶複合蛋白UL52、醣蛋白K (UL53)、轉錄調控蛋白IE63 (ICP27、UL54)、蛋白UL55、蛋白UL56、病毒複製蛋白ICP22 (IE68、US1)、蛋白US2、絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶US3、醣蛋白G (US4)、醣蛋白J (US5)、醣蛋白D (US6)、醣蛋白I (US7)、醣蛋白E (US8)、外被蛋白US9、殼/外被蛋白US10、Vmw21蛋白(US11)、ICP47蛋白(IE12、US12)、主要轉錄活化子ICP4 (IE175、RS1)、E3泛素連接酶ICPO (IE110)、潛伏期相關蛋白1 LRP1、潛伏期相關蛋白2 LRP2、神經毒力因子RL1 (ICP34.5)、潛伏期相關轉錄本LAT (單純皰疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)，單純皰疹)；熱休克蛋白Hsp60、細胞表面蛋白H1C、二肽基肽酶IV型DppIV、M抗原、70 kDa蛋白、17 kDa組蛋白樣蛋白(莢膜組織漿菌，組織漿菌症)；脂肪酸及視黃醇結合蛋白-1 FAR-1、金屬蛋白酶之組織抑制劑TIMP (TMP)、半胱胺酸蛋白酶ACEY-1、半胱胺酸蛋白酶ACCP-1、表面抗原Ac-16、分泌性蛋白2 ASP-2、金屬蛋白酶1 MTP-1、天冬胺醯基蛋白酶抑制劑API-1、表面相關抗原SAA-1、表面相關抗原SAA-2、成人特異性分泌因子Xa、絲胺酸蛋白酶抑制劑抗凝劑AP、組織蛋白酶D樣天冬胺酸蛋白酶ARR-1、麩胱甘肽S-轉移酶GST、天冬胺酸蛋白酶APR-1、乙醯基膽鹼酯酶AChE (十二指腸鉤蟲及美洲鈎蟲，鉤蟲感染)；蛋白NS1、蛋白NP1、蛋白VP1、蛋白VP2、蛋白VP3 (人類波卡病毒(HBoV)，人類波卡病毒感染)；主要表面蛋白2 MSP2、主要表面蛋白4 MSP4、MSP變異SGV1、MSP變異SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19 OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510編碼蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA 主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE 130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(伊氏艾利希體，人類伊氏艾利希體病)；主要表面蛋白1-5 (MSP1a、MSP1b、MSP2、MSP3、MSP4、MSP5)、IV型分泌系統蛋白VirB2、VirB7、VirB11、VirD4 (嗜吞噬細胞邊蟲，人類顆粒球性邊蟲病(HGA))；蛋白NS1、小疏水性蛋白NS2、SH蛋白、融合蛋白F、醣蛋白G、基質蛋白M、基質蛋白M2-1、基質蛋白M2-2、磷蛋白P、核蛋白N、聚合酶L (人類間質肺炎病毒(hMPV)，人類間質肺炎感染)；主要表面蛋白2 MSP2、主要表面蛋白4 MSP4、MSP變異SGV1、MSP變異SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19 OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510編碼蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE 130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(查菲艾利希體，人類單核球艾利希體病)；複製蛋白E1、調節蛋白E2、蛋白E3、蛋白E4、蛋白E5、蛋白E6、蛋白E7、蛋白E8、主要殼蛋白L1、次要殼蛋白L2 (人類乳頭狀瘤病毒(HPV)，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染)；融合蛋白F、血球凝集素-神經胺糖酸酶HN、醣蛋白G、基質蛋白M、磷蛋白P、核蛋白N、聚合酶L (人類副流感病毒(HPIV)，人類副流感病毒感染)；血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白(NEP蛋白：核輸出蛋白)、PA蛋白、PB1蛋白(聚合酶鹼性1蛋白)、PB1-F2蛋白及PB2蛋白(正黏病毒科，流感病毒(flu))；基因組多蛋白、蛋白E、蛋白M、殼蛋白C (日本腦炎病毒，日本腦炎)；RTX毒素、IV型pili、主要pilus次單元PilA、調節轉錄因子PilS及PilR、蛋白sigma54、外膜蛋白(金格金氏桿菌，金格金氏桿菌感染)；朊病毒蛋白(Kuru朊病毒，Kuru)；核蛋白N、聚合酶L、基質蛋白Z、醣蛋白GP (賴薩病毒，賴薩熱)；肽聚糖相關脂蛋白PAL、60 kDa陪伴蛋白Cpn60 (groEL、HspB)、IV型菌毛蛋白PilE、外膜蛋白MIP、主要外膜蛋白MompS、鋅金屬蛋白酶MSP (退伍軍人嗜肺病菌，退伍軍人桿菌病(退伍軍人病，龐蒂亞克熱))；P4核酸酶、蛋白WD、核糖核苷酸還原酶M2、表面膜醣蛋白Pg46、半胱胺酸蛋白酶 CP、葡萄糖調節蛋白78 GRP-78、階段特異性S抗原樣蛋白A2、ATPase F1、β-微管蛋白、熱休克蛋白70 Hsp70、KMP-11、醣蛋白GP63、蛋白BT1、核苷水解酶NH、細胞表面蛋白B1、核糖體蛋白P1樣蛋白P1、固醇24-c-甲基轉移酶SMT、LACK蛋白、組織蛋白H1、SPB1蛋白、硫醇特異性抗氧化劑TSA、蛋白抗原STI1、訊號肽酶SP、組織蛋白H2B、表面抗原PSA-2、半胱胺酸蛋白酶 b Cpb (利什曼原蟲屬，利什曼原蟲病)；主要膜蛋白I、富含絲胺酸之抗原-45 kDa、10 kDa伴護蛋白GroES、HSP kDa抗原、胺基-側氧基壬酸酯合成酶AONS、蛋白重組酶A RecA、乙醯基-/丙醯基-輔酶A羧化酶α、丙胺酸消旋酶、60 kDa陪伴蛋白2、ESAT-6樣蛋白EcxB (L-ESAT-6)、蛋白Lsr2、蛋白ML0276、肝素-結合血球凝集素 HBHA、熱休克蛋白65 Hsp65、mycP1或ML0041編碼蛋白、htrA2或ML0176編碼蛋白、htrA4或ML2659編碼蛋白、gcp或ML0379編碼蛋白、clpC或ML0235編碼蛋白(麻風分枝桿菌及肉瘤分枝桿菌，麻風)；外膜蛋白LipL32、膜蛋白LIC10258、膜蛋白LP30、膜蛋白LIC12238、Ompa樣蛋白Lsa66、表面蛋白LigA、表面蛋白LigB、主要外膜蛋白OmpL1、外膜蛋白LipL41、蛋白LigAni、表面蛋白LcpA、黏附蛋白LipL53、外膜蛋白UpL32、表面蛋白Lsa63、鞭毛蛋白 FlaB1、膜脂蛋白LipL21、膜蛋白pL40、螺旋體性表面黏附素Lsa27、外膜蛋白OmpL36、外膜蛋白OmpL37、外膜蛋白OmpL47、外膜蛋白OmpL54、醯基轉移酶LpxA (鉤端螺旋體屬，鉤端螺旋體病)；李斯特菌溶胞素O前驅物Hly (LLO)、入侵-相關蛋白Iap (P60)、李斯特菌溶胞素調節蛋白PrfA、鋅金屬蛋白酶 Mpl、磷脂酸肌醇-特異性磷脂酶C PLC (PlcA、PlcB)、O-乙醯基轉移酶Oat、ABC-轉運蛋白通透酶Im.G_1771、黏附蛋白LAP、LAP受體Hsp60、黏附素LapB、溶血素李斯特菌溶胞素O LLO、蛋白ActA、內化素A InlA、蛋白InlB (李斯特單胞菌，李氏菌病)；外表面蛋白A OspA、外表面蛋白OspB、外表面蛋白OspC、飾膠蛋白聚糖結合蛋白A DbpA、飾膠蛋白聚糖結合蛋白B DbpB、鞭毛絲41 kDa核心蛋白Fla、鹼性膜蛋白A BmpA (免疫顯性抗原P39)、外表面22 kDa脂蛋白前驅物(抗原IPLA7)、可變表面脂蛋白vlsE (通常為伯氏疏螺旋體及其他疏螺旋體物種，萊姆病(萊姆疏螺旋體病))；毒液過敏原同源物樣蛋白VAL-1、豐幼蟲轉錄本ALT-1、豐幼蟲轉錄本ALT-2、硫氧還蛋白過氧化酶TPX、胡蜂過敏原同源物VAH、硫氧還蛋白過氧化酶2 TPX-2、抗原蛋白SXP (肽N、N1、N2及N3)、活化相關蛋白-1 ASP-1、硫氧還蛋白TRX、轉麩醯胺酸酶BmTGA、麩胱甘肽-S-轉移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂過敏原同源物VAH、175 kDa膠原酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶GAPDH、角質層膠原Col-4、分泌型幼蟲酸性蛋白SLAPs、幾丁質酶CHI-1、麥芽糖結合蛋白MBP、醣解酶果糖-1、6-雙磷酸醛縮酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、線蟲特異性基因產物OvB20、盤尾半胱胺酸蛋白酶抑制蛋白CPI-2、蛋白Cox-2 (潘氏絲狀蟲及馬來血絲蟲，淋巴絲蟲病(象皮病))；醣蛋白GP、基質蛋白Z、聚合酶L、核蛋白N (淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎)；血小板反應蛋白相關匿名蛋白TRAP、SSP2孢子體表面蛋白2、頂端膜抗原1 AMA1、棒狀體膜抗原RMA1、酸性鹼性重複抗原ABRA、細胞穿越蛋白PF、蛋白Pvs25、裂殖子表面蛋白1 MSP-1、裂殖子表面蛋白2 MSP-2、環感染紅血球表面抗原RESALiver階段抗原3 LSA-3、蛋白Eba-175、絲胺酸重複抗原5 SERA-5、環子孢子蛋白CS、裂殖子表面蛋白3 MSP3、裂殖子表面蛋白8 MSP8、烯醇酶 PF10、肝細胞紅血球蛋白17 kDa HEP17、紅血球膜蛋白1 EMP1、蛋白Kβ裂殖子表面蛋白4/5 MSP 4/5、熱休克蛋白Hsp90、富含麩胺酸之蛋白GLURP、裂殖子表面蛋白4 MSP-4、蛋白STARP、環孢子體蛋白相關抗原前驅物CRA (瘧原蟲屬，瘧疾)；核蛋白N、膜-相關蛋白VP24、次要核蛋白VP30、聚合酶輔因子VP35、聚合酶L、基質蛋白VP40、包膜醣蛋白GP (馬堡病毒、馬堡出血熱(MHF))；蛋白C、基質蛋白M、磷蛋白P、非結構蛋白V、血球凝集素 醣蛋白H、聚合酶L、核蛋白N、融合蛋白F (麻疹病毒，麻疹)；ABC轉運蛋白家族之成員(LolC、OppA及PotF)、推定的脂蛋白釋放系統跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞內運動性A BimA、細菌延長因子-Tu EF-Tu、17 kDa OmpA樣蛋白、boaA編碼蛋白、boaB編碼蛋白(假鼻疽伯克氏菌，類鼻疽(惠特莫爾氏病))；菌毛蛋白蛋白、次要菌毛蛋白相關次單元pilC、主要菌毛蛋白次單元及變異體pilE、pilS、相變異蛋白porA、孔蛋白B PorB、蛋白TraD、萘瑟球菌外膜抗原H.8、70 kDa抗原、主要外膜蛋白PI、外膜蛋白PIA及PIB、W抗原、表面蛋白A NspA、轉鐵蛋白結合蛋白TbpA、轉鐵蛋白結合蛋白TbpB、PBP2、mtrR編碼蛋白、ponA編碼蛋白、膜通透酶FbpBC、FbpABC蛋白系統、LbpAB蛋白、外膜蛋白Opa、外膜轉運蛋白FetA、鐵抑制調節劑MpeR、因子H-結合蛋白fHbp、黏附素NadA、蛋白NhbA、抑制因子FarR (腦膜炎雙球菌，腦膜炎球菌病)；66 kDa蛋白、22 kDa蛋白(通常為橫川後殖吸蟲，偏殖器吸蟲病)；極管蛋白 (微胞子蟲中34、75及170 kDa，胞內原蟲中35、55及150 kDa)、致動蛋白-相關蛋白、RNA聚合酶II最大次單元、類似的ot整合膜蛋白YIPA、抗沉默蛋白1、熱休克轉錄因子HSF、蛋白激酶、胸苷激酶、NOP-2樣核仁蛋白(微孢子目門，微孢子蟲病)；CASP8及FADD樣凋亡調節因子、麩胱甘肽過氧化酶GPX1、RNA解旋酶NPH-II NPH2、Poly(A)聚合酶催化次單元PAPL、主要包膜蛋白P43K、早期轉錄因子 70 kDa次單元VETFS、早期轉錄因子82 kDa次單元VETFL、金屬內肽酶G1型、核苷三磷酸酶I NPH1、複製蛋白A28樣MC134L、RNA聚合酶7 kDa次單元RPO7 (傳染性軟疣病毒(MCV)，傳染性軟疣(MC))；基質蛋白M、磷蛋白P/V、小疏水蛋白SH、核蛋白N、蛋白V、融合醣蛋白F、血球凝集素-神經胺糖酸酶HN、RNA聚合酶L (腮腺炎病毒，腮腺炎)；外膜蛋白OM、細胞表面抗原OmpA、細胞表面抗原OmpB (sca5)、細胞表面蛋白SCA4、細胞表面蛋白SCA1、細胞漿內蛋白D、結晶表面層蛋白SLP、保護性表面蛋白抗原SPA (傷寒立克次體，鼠斑疹傷寒(地方性斑疹傷寒))；黏附素P1、黏附P30、蛋白p116、蛋白P40、細胞骨架蛋白HMW1、細胞骨架蛋白HMW2、細胞骨架蛋白HMW3、MPN152編碼蛋白、MPN426編碼蛋白、MPN456編碼蛋白、MPN-500編碼蛋白(肺炎黴漿菌，黴漿菌肺炎)；NocA、鐵依賴性調節蛋白、VapA、VapD、VapF、VapG、溶酪蛋白蛋白酶、絲尖端相關 43-kDa蛋白、蛋白P24、蛋白P61、15-kDa蛋白、56-kDa蛋白(通常為星形土壤絲菌及其他土壤絲菌物種，奴卡菌病)；毒液過敏原同源物樣蛋白VAL-1、豐幼蟲轉錄本ALT-1、豐幼蟲轉錄本ALT-2、硫氧還蛋白過氧化酶TPX、胡蜂過敏原同源物VAH、硫氧還蛋白過氧化酶2 TPX-2、抗原蛋白SXP (肽N、N1、N2、及N3)、活化相關蛋白-1 ASP-1、硫氧還蛋白TRX、轉麩醯胺酸酶BmTGA、麩胱甘肽-S-轉移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂 過敏原同源物VAH、175 kDa膠原酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶GAPDH、角質層膠原Col-4、分泌型幼蟲酸性蛋白SLAPs、幾丁質酶CHI-1、麥芽糖結合蛋白MBP、醣解酶果糖-1、6-雙磷酸醛縮酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、線蟲特異性基因產物OvB20、盤尾半胱胺酸蛋白酶抑制蛋白CPI-2、Cox-2 (盤尾絲蟲，蟠尾絲蟲病(河盲症))；43 kDa分泌型醣蛋白、醣蛋白gp0、醣蛋白gp75、抗原Pb27、抗原Pb40、熱休克蛋白Hsp65、熱休克蛋白Hsp70、熱休克蛋白Hsp90、蛋白P10、磷酸丙糖異構酶TPI、N-乙醯基-葡萄胺糖-結合凝集素副球菌素、28 kDa蛋白Pb28 (巴西副球孢子菌，巴西副球孢子菌病(南美芽生菌病))；28-kDa cruzipain樣半胱胺酸蛋白酶Pw28CCP (通常為衛氏肺吸蟲及其他肺吸蟲種，肺吸蟲病)；外膜蛋白OmpH、外膜蛋白Omp28、蛋白PM1539、蛋白PM0355、蛋白PM1417、修復蛋白MutL、蛋白BcbC、prtein PM0305、甲酸去氫酶-N、蛋白PM0698、蛋白PM1422、DNA旋轉酶、脂蛋白PlpE、黏附蛋白Cp39、血紅素採集系統受體HasR、39 kDa莢膜蛋白、鐵調節的OMP IROMP、外膜蛋白OmpA87、菌毛蛋白Ptf、菌毛次單元蛋白PtfA、轉鐵蛋白結合蛋白Tbpl、酯酶MesA、敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)毒素PMT、黏附蛋白Cp39 (巴氏桿菌屬，巴氏桿菌症)；“絲狀血球凝集素FhaB、腺苷酸環化酶CyaA、百日咳毒素次單元4前驅物PtxD、百日咳桿菌粘附素前驅物Prn、毒素次單元1 PtxA、蛋白Cpn60、蛋白brkA、百日咳毒素次單元2前驅物PtxB、百日咳毒素次單元3前驅物PtxC、百日咳毒素次單元5 前驅物 PtxE、百日咳桿菌粘附素Prn、蛋白Fim2、蛋白Fim3；“(百日咳嗜血桿菌，百日咳(Whooping cough))；“F1莢膜抗原、毒力-相關V抗原、分泌型效應蛋白LcrV、V抗原、外膜蛋白酶Pla、分泌型效應蛋白YopD、推定的分泌型蛋白-酪胺酸e 磷酸酶YopH、針複合物主要次單元YscF、蛋白激酶YopO、推定的自轉運蛋白YapF、內膜ABC-轉運蛋白YbtQ (Irp7)、推定的糖結蛋白YP00612、熱休克蛋白90 HtpG、推定的硫酸酯酶蛋白YdeN、外膜脂蛋白載體蛋白LolA、分泌伴護蛋白YerA、推定的脂蛋白YP00420、溶血素活化因子蛋白HpmB、鼠疫菌素/耶爾森桿菌素外膜受體Psn、分泌型效應蛋白YopE、分泌型效應蛋白YopF、分泌型效應蛋白YopK、外膜蛋白YopN、外膜蛋白YopM、凝固酶/血纖維蛋白溶酶前驅物Pla；“(鼠疫耶氏桿菌，鼠疫)；蛋白PhpA、表面黏附素PsaA、肺炎球菌溶血素Ply、ATP依賴性蛋白酶Clp、硫辛酸蛋白連接酶LplA、細胞壁表面錨定蛋白psrP、分選酶SrtA、麩胺醯基-tRNA合成酶GltX、膽鹼結合蛋白A CbpA、肺炎球菌表面蛋白A PspA、肺炎球菌表面蛋白C PspC、6-磷酸葡萄糖酸去氫酶Gnd、鐵-結合蛋白PiaA、胞壁質水解酶LytB、proteon LytC、蛋白酶A1 (肺炎鏈球菌，肺炎球菌感染)；主要表面蛋白B、kexin-樣蛋白酶KEX1、蛋白A12、55 kDa抗原P55、主要表面醣蛋白Msg (耶氏肺孢子菌，肺囊蟲肺炎(PCP))；基因組多蛋白、聚合酶3D、病毒殼蛋白VP1、病毒殼蛋白VP2、病毒殼蛋白VP3、病毒殼蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C (脊髓灰質炎病毒、脊髓灰質炎)；蛋白質Nfa1、exendin-3、分泌脂肪酶、組織蛋白酶B樣蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、組織蛋白酶、過氧環蛋白、蛋白Cry1Ac (通常為變形纖毛蟲，原發性阿米巴腦膜炎(PAM))；agnoprotein、大T抗原、小T抗原、主要殼蛋白VP1、次要殼蛋白Vp2 (JC病毒，進行性多灶性白質腦病)；低鈣反應蛋白E LCrE、披衣菌外蛋白N CopN、絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶PknD、醯基載體蛋白S-丙二醯轉移酶FabD、單鏈DNA-結合蛋白Ssb、主要外膜蛋白MOMP、外膜蛋白2 Omp2、多型膜蛋白家族(Pmp1、Pmp2、Pmp3、Pmp4、Pmp5、Pmp6、Pmp7、Pmp8、Pmp9、Pmp10、Pmp11、Pmp12、Pmp13、Pmp14、Pmp15、Pmp16、Pmp17、Pmp18、Pmp19、Pmp20、Pmp21) (鸚鵡熱嗜衣原體，鸚鵡熱)；外膜蛋白P1、熱休克蛋白B HspB、肽ABC轉運蛋白、GTP-結合蛋白、蛋白IcmB、核糖核酸酶R、磷酸酶SixA、蛋白DsbD、外膜蛋白TolC、DNA-結合蛋白PhoB、ATPase DotB、熱休克蛋白B HspB、膜蛋白Com1、28 kDa蛋白、DNA-3-甲基腺嘌呤糖苷酶I、p外膜蛋白OmpH、外膜蛋白AdaA、甘胺酸切割系統T蛋白(伯納特氏柯克斯氏體，Q熱病)；核蛋白N、大結構蛋白L、磷蛋白P、基質蛋白M、醣蛋白G (狂犬病病毒，狂犬病)；融合蛋白F、核蛋白N、基質蛋白M、基質蛋白M2-1、基質蛋白M2-2、磷蛋白P、小疏水性蛋白SH、主要表面醣蛋白G、聚合酶L、非結構蛋白1 NS1、非結構蛋白2 NS2 (呼吸道融合病毒(RSV)，呼吸道融合病毒感染)；基因組多蛋白、聚合酶3D、病毒殼蛋白VP1、病毒殼蛋白VP2、病毒殼蛋白VP3、病毒殼蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C (鼻病毒、鼻病毒感染)；外膜蛋白OM、細胞表面抗原OmpA、細胞表面抗原OmpB (sca5)、細胞表面蛋白SCA4、細胞表面蛋白SCA1、蛋白PS120、細胞漿內蛋白D、保護性表面蛋白抗原 SPA (痘立克次體，立克次體感染)；外膜蛋白OM、細胞表面抗原OmpA、細胞表面抗原OmpB (sca5)、細胞表面蛋白SCA4、細胞表面蛋白SCA1、細胞漿內蛋白D (痘立克次體，立克次體痘)；包膜醣蛋白GP、聚合酶L、核蛋白N、非結構蛋白NSS (Rift穀熱病毒，Rift穀熱(RVF))；外膜蛋白OM、細胞表面抗原OmpA、細胞表面抗原OmpB (sca5)、細胞表面蛋白SCA4、細胞表面蛋白SCA1、細胞漿內蛋白D (立氏立克次體，落磯山斑點熱(RMSF))；非結構蛋白6 NS6、非結構蛋白2 NS2、中間殼蛋白VP6、內殼蛋白VP2、非結構蛋白3 NS3、RNA-導向的RNA聚合酶L、蛋白VP3、非結構蛋白1 NS1、非結構蛋白5 NS5、外殼醣蛋白VP7、非結構醣蛋白4 NS4、外殼蛋白VP4；(輪狀病毒，輪狀病毒感染)；多蛋白P200、醣蛋白E1、醣蛋白E2、蛋白NS2、殼蛋白C (德國麻疹病毒，德國麻疹)；陪伴蛋白 GroEL (MopA)、肌醇磷酸磷酸酶SopB、熱休克蛋白HslU、伴護蛋白蛋白DnaJ、蛋白TviB、蛋白IroN、鞭毛蛋白FliC、入侵蛋白SipC、醣蛋白gp43、外膜蛋白LamB、外膜蛋白PagC、外膜蛋白TolC、外膜蛋白NmpC、外膜蛋白FadL、轉運蛋白SadA、轉移酶WgaP、效應蛋白SifA、SteC、SseL、SseJ及SseF (沙門桿菌屬，沙門桿菌病)；“蛋白14、非結構蛋白NS7b、非結構蛋白NS8a、蛋白9b、蛋白3a、核蛋白N、非結構蛋白NS3b、非結構蛋白NS6、蛋白7a、非結構蛋白NS8b、膜蛋白M、包膜小膜蛋白EsM、複製酶 多蛋白1a、刺突醣蛋白S、複製酶多蛋白lab；SARS冠狀病毒，SARS (嚴重急性呼吸道症候群))；絲胺酸蛋白酶、非典型疥癬蟲抗原1 ASA1、麩胱甘肽S-轉移酶GST、半胱胺酸蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、apo脂蛋白(疥蟎，疥癬)；麩胱甘肽S-轉移酶GST、副肌凝蛋白、血紅蛋白酶(hemoglbinase)SM32、主要蟲卵抗原、14 kDa脂肪酸-結合蛋白Sm14、主要幼蟲表面抗原P37、22.6 kDa 外被al 抗原、鈣蛋白酶CANP、三磷酸異構酶Tim、表面蛋白9B、外殼蛋白VP2、23 kDa整合膜蛋白Sm23、Cu/Zn-超氧化物歧化酶、醣蛋白Gp、肌凝蛋白(血吸蟲屬，血吸蟲病(血吸蟲症))；60 kDa陪伴蛋白、56 kDa型特異性抗原、丙酮酸磷酸二激酶、4-羥基苯甲酸辛烯基轉移酶(恙蟲病東方體，叢林性斑疹傷寒)；去氫酶GuaB、入侵蛋白Spa32、侵襲素IpaA、侵襲素IpaB、侵襲素IpaC、侵襲素IpaD、侵襲素IpaH、侵襲素IpaJ (志賀桿菌屬，志賀桿菌病(桿菌性痢疾))；蛋白P53、病毒體蛋白US10同源物、轉錄調節因子IE63、轉錄反式活化因子IE62、蛋白酶P33、α轉導因子74 kDa蛋白、去氧尿苷5′-三磷酸核苷酸水解酶、轉錄反式活化因子IE4、膜蛋白UL43同源物、核磷蛋白UL3同源物、核蛋白UL4同源物、複製起點-結合蛋白、膜蛋白2、磷蛋白32、蛋白57、DNA 聚合酶進行性因子、門脈蛋白54、DNA引子酶、外被蛋白UL14同源物、外被蛋白UL21同源物、外被蛋白UL55同源物、三重末端酶次單元UL33同源物、三重末端酶次單元UL15同源物、殼-結合蛋白44、病毒體-包裝蛋白43 (水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，帶狀皰疹(Shingles))；截短的3-β羥基-5-烯類固醇去氫酶同源物、病毒體膜蛋白A13、蛋白A19、蛋白A31、截短蛋白A35同源物、蛋白A37.5同源物、蛋白A47、蛋白A49、蛋白A51、腦訊號蛋白樣蛋白A43、絲胺酸蛋白酶抑制劑1、絲胺酸蛋白酶抑制劑2、絲胺酸蛋白酶抑制劑3、蛋白A6、蛋白B15、蛋白C1、蛋白C5、蛋白C6、蛋白F7、蛋白F8、蛋白F9、蛋白F11、蛋白F14、蛋白F15、蛋白F16 (大天花或小天花，天花(痘))；黏附素/醣蛋白gp70、蛋白酶(申克氏孢子絲菌，孢子絲菌病)；血質鐵結合蛋白IsdB、膠原黏附素Cna、凝集因子A ClfA、蛋白MecA、纖維連接蛋白-結合蛋白A FnbA、A型腸毒素EntA、B型腸毒素EntB、C型腸毒素EntC1、C型腸毒素EntC2、D型腸毒素EntD、E型腸毒素EntE、毒性休克症候群毒素-1 TSST-1、葡萄球菌激酶、青黴素 結合蛋白2a PBP2a (MecA)、分泌抗原SssA (葡萄球菌屬，葡萄球菌食物中毒)；血質鐵結合蛋白IsdB、膠原黏附素Cna、凝集因子A ClfA、蛋白MecA、纖維連接蛋白-結合蛋白A FnbA、A型腸毒素EntA、B型腸毒素EntB、C型腸毒素EntC1、C型腸毒素EntC2、D型腸毒素EntD、E型腸毒素EntE、毒性休克症候群毒素-1 TSST-1、葡萄球菌激酶、青黴素結合蛋白2a PBP2a (MecA)、分泌抗原SssA (葡萄球菌屬，例如金黃色葡萄球菌，葡萄球菌感染)；抗原Ss-IR、抗原NIE、強力黴素、Na+-K+ ATPase Sseat-6、原肌球蛋白SsTmy-1、蛋白LEC-5、41 kDa a抗原 P5、41-kDa 幼蟲蛋白、31-kDa 幼蟲蛋白、28-kDa幼蟲蛋白(糞擬圓蟲，擬圓蟲病)；甘油磷酸二酯磷酸二酯酶GlpQ (Gpd)、外膜蛋白TmpB、蛋白Tp92、抗原TpF1、重複蛋白Tpr、重複蛋白F TprF、重複蛋白G TprG、重複蛋白I TprI、重複蛋白J TprJ、重複蛋白K TprK、密螺旋體膜蛋白A TmpA、脂蛋白、15 kDa Tpp15、47 kDa膜抗原、微鐵蛋白TpF1、黏附素Tp0751、脂蛋白TP0136、蛋白TpN17、蛋白TpN47、外膜蛋白TP0136、外膜蛋白TP0155、外膜蛋白TP0326、外膜蛋白TP0483、外膜蛋白TP0956 (梅毒螺旋體，梅毒)；組織蛋白酶L樣蛋白酶、53/25-kDa抗原、8 kDa家族成員、具有邊緣胰蛋白酶樣活性之囊尾幼蟲蛋白TsAg5、六鉤蚴蛋白TSOL18、六鉤蚴蛋白TSOL45-1A、乳酸去氫酶A LDHA、乳酸去氫酶B LDHB (絛蟲屬，絛蟲病)；破傷風毒素TetX、破傷風毒素C TTC、140 kDa S層蛋白、黃素蛋白β-次單元CT3、磷脂酶(卵磷脂酶)、磷酸載體蛋白HPr (破傷風梭狀芽孢桿菌、破傷風(Lockjaw))；基因組多蛋白、蛋白E、蛋白M、殼蛋白C (蜱傳腦炎病毒(TBEV)，蜱傳腦炎)；58-kDa抗原、68-kDa抗原、弓蛔蟲幼蟲排泄-分泌抗原TES、32-kDa醣蛋白、醣蛋白TES-70、醣蛋白GP31、排泄-分泌抗原TcES-57、腸周液抗原Pe、可溶性提取物抗原Ex、排泄/分泌幼蟲抗原ES、抗原TES-120、多蛋白過敏原TBA-1、組織蛋白酶L樣半胱胺酸蛋白酶c-cpl-1、26-kDa蛋白(犬蛔蟲或貓蛔蟲，蛔蟲症(眼幼蟲移行症(OLM)及內臟性幼蟲移行症(VLM)))；微線體蛋白 (MIC1、MIC2、MIC3、MIC4、MIC5、MIC6、MIC7、MIC8)、棒狀體蛋白Rop2、棒狀體蛋白 (Rop1、Rop2、Rop3、Rop4、Rop5、Rop6、Rop7、Rop16、Rjop17)、蛋白SRi、表面抗原P22、主要抗原p24、主要表面抗原p30、緻密顆粒蛋白 (GRA1、GRA2、GRA3、GRA4、GRA5、GRA6、GRA7、GRA8、GRA9、GRA10)、28 kDa抗原、表面抗原SAG1、SAG2相關抗原、核苷-三磷酸酶1、核苷-三磷酸酶2、蛋白Stt3、含HesB域之蛋白、菱形樣蛋白酶5、毒胰蛋白酶1 (弓蟲，弓蟲症)；43 kDa分泌型醣蛋白、53 kDa分泌型醣蛋白、副肌凝蛋白、抗原Ts21、抗原Ts87、抗原p46000、TSL-1 抗原、小凹蛋白-1 CAV-1、49 kDa新生幼蟲抗原、鞘脂激活蛋白原(prosaposin)同源物、絲胺酸蛋白酶、絲胺酸蛋白酶抑制劑、45-kDa醣蛋白Gp45 (旋毛蟲，旋毛蟲症)；Myb樣轉錄因子(Myb1、Myb2、Myb3)、黏附蛋白AP23、黏附蛋白AP33、黏附素蛋白AP33-3、黏附素AP51、黏附素AP65、黏附蛋白AP65-1、α-肌動蛋白原、致動蛋白相關蛋白、teneurin、62 kDa蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶SUB1、半胱胺酸蛋白酶基因3 CP3、α-烯醇酶烯醇、半胱胺酸蛋白酶CP30、熱休克蛋白(Hsp70、Hsp60)、免疫原性蛋白P270、(陰道滴蟲，滴蟲病)；β-微管蛋白、47-kDa蛋白、分泌白血球樣蛋白酶-1 SLP-1、50-kDa蛋白TT50、17 kDa抗原、43/47 kDa蛋白(毛首鞭蟲，鞭蟲病(鞭蟲感染))；蛋白ESAT-6 (EsxA)、10 kDa濾液抗原EsxB、分泌型抗原85-B FBPB、纖維連接蛋白-結合蛋白A FbpA (Ag85A)、絲胺酸蛋白酶PepA、PPE家族蛋白PPE18、纖維連接蛋白-結合蛋白D FbpD、免疫原性蛋白MPT64、分泌性蛋白MPT51、過氧化氫酶-過氧化酶-過氧化亞硝酸酶T KATG、周質磷酸-結合脂蛋白PSTS3 (PBP-3、Phos-1)、鐵調節肝素結合血球凝集素Hbha、PPE家族蛋白PPE14、PPE家族蛋白PPE68、蛋白Mtb72F、蛋白Apa、免疫原性蛋白MPT63、周質磷酸-結合脂蛋白PSTS1 (PBP-1)、分子伴護蛋白DnaK、細胞表面脂蛋白Mpt83、脂蛋白P23、磷酸轉運系統通透酶蛋白pstA、14 kDa抗原、纖維連接蛋白-結合蛋白C FbpC1、丙胺酸去氫酶TB43、麩醯胺酸合成酶1、ESX-1蛋白、蛋白CFP10、TB10.4蛋白、蛋白MPT83、蛋白MTB12、蛋白MTB8、Rpf樣蛋白、蛋白MTB32、蛋白MTB39、晶體蛋白、熱休克蛋白HSP65、蛋白PST-S(通常為結核分枝桿菌，結核病)；外膜蛋白FobA、外膜蛋白FobB、細胞內生長基因座IgIC1、細胞內生長基因座IgIC2、胺基轉移酶Wbt1、陪伴蛋白GroEL、17 kDa主要膜蛋白TUL4、脂蛋白LpnA、幾丁質酶家族18蛋白、異檸檬酸去氫酶、Nif3家族蛋白、IV型pili醣化蛋白、外膜蛋白tolC、FAD結合家族蛋白、IV型菌毛蛋白多聚體外膜蛋白、雙組分感應蛋白KdpD、伴護蛋白蛋白DnaK、蛋白ToIQ (土拉文氏桿菌，土拉文氏桿菌病)；“MB抗原、尿素酶、蛋白GyrA、蛋白GyrB、蛋白ParC、蛋白ParE、脂質相關膜蛋白LAMP、胸苷激酶TK、磷脂酶PL-A1、磷脂酶PL-A2、磷脂酶PL-C、表面表現之96-kDa抗原；“(尿素黴漿菌，尿素黴漿菌感染)；非結構多蛋白、結構多蛋白、殼蛋白CP、蛋白E1、蛋白E2、蛋白E3、蛋白酶P1、蛋白酶P2、蛋白酶P3 (委內瑞拉馬腦炎病毒，委內瑞拉馬腦炎)；醣蛋白GP、基質蛋白Z、聚合酶L、核蛋白N (瓜納瑞托病毒，瓜納瑞托出血熱)；多蛋白、蛋白E、蛋白M、殼蛋白C、蛋白酶NS3、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白AS2B、brotein NS4A、蛋白NS4B、蛋白NS5 (西尼羅病毒，西尼羅熱)；衣殼蛋白CP、蛋白E1、蛋白E2、蛋白E3、蛋白酶P2 (西部馬腦炎病毒，西部馬腦炎)；基因組多蛋白、蛋白E、蛋白M、殼蛋白C、蛋白酶NS3、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白AS2B、蛋白NS4A、蛋白NS4B、蛋白NS5 (黃熱病病毒，黃熱病)；推定的Yop靶向蛋白YobB、效應蛋白YopD、效應蛋白YopE、蛋白YopH、效應蛋白YopJ、蛋白轉位蛋白YopK、效應蛋白YopT、蛋白YpkA、鞭毛生物合成蛋白FlhA、肽酶M48、鉀外排系統KefA、轉錄調節因子RovA、黏附素Ifp、轉位蛋白LcrV、蛋白PcrV、侵襲素Inv、外膜蛋白OmpF樣孔蛋白、黏附素YadA、蛋白激酶C、磷脂酶C1、蛋白PsaA、甘露糖基轉移酶樣蛋白WbyK、蛋白YscU、抗原YPMa (假性結核病耶氏桿菌，假性結核病耶氏桿菌感染)；效應蛋白YopB、60 kDa陪伴蛋白、蛋白WbcP、酪胺酸-蛋白磷酸酶YopH、蛋白YopQ、腸毒素、半乳糖苷通透酶、還原酶NrdE、蛋白YasN、侵襲素Inv、黏附素YadA、外膜孔蛋白F OmpF、蛋白UspA1、蛋白EibA、蛋白Hia、細胞表面蛋白Ail、伴護蛋白SycD、蛋白LcrD、蛋白LcrG、蛋白LcrV、蛋白SycE、蛋白YopE、調節蛋白TyeA、蛋白YopM、蛋白YopN、蛋白YopO、蛋白YopT、蛋白YopD、蛋白酶ClpP、蛋白MyfA、蛋白FilA及蛋白PsaA (小腸大腸炎耶氏桿菌，腸道耶氏症)。
前一部分中之括號指示具體病原體或抗原來源之病原體家族以及與病原體相關之感染性疾病。
在本發明之第一態樣之一特別較佳實施例中，mRNA化合物包含含有編碼區之mRNA序列，該編碼區編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)、非結構蛋白2 (NS2)、核輸出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶鹼性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶鹼性蛋白2 (PB2)或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。
在此上下文中，至少一種抗原肽或蛋白質之胺基酸序列可選自源自流感病毒之血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)、非結構蛋白2 (NS2)、核輸出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶鹼性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶鹼性蛋白2 (PB2)的任何肽或蛋白質或其片段或變異體，或來自任何合成工程改造之流感病毒肽或蛋白質。
在本發明之一較佳實施例中，編碼區編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。在此上下文中，血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)可選自相同流感病毒或不同流感病毒。
在此上下文中，特別較佳地，至少一個編碼區編碼流感病毒之血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)、非結構蛋白2 (NS2)、核輸出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶鹼性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶鹼性蛋白2 (PB2)的至少一種全長蛋白或其變異體。
在特別較佳實施例中，至少一個編碼區編碼流感病毒之血球凝集素(HA)之至少一種全長蛋白及/或神經胺糖酸酶(NA)之至少一種全長蛋白或其變異體。
如本文所用，術語「全長蛋白」通常係指實質上包含天然存在之蛋白質之完整胺基酸序列的蛋白質。
在特定實施例中，流感病毒肽或蛋白質源自A型、B型或C型流感病毒（毒株）。
在特定實施例中，病毒肽或蛋白質源自冠狀病毒，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS等（毒株）。
A型流感病毒可選自以血球凝集素(HA)為特徵之A型流感病毒，該血球凝集素係選自由以下組成之群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18。較佳地，A型流感病毒選自以血球凝集素(HA)為特徵之流感病毒，該血球凝集素係選自由H1、H3、H5或H9組成之群。
此外，特別較佳為以神經胺糖酸酶(NA)為特徵之A型流感病毒，該神經胺糖酸酶係選自由以下組成之群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10及N11。最佳地，A型流感病毒以神經胺糖酸酶(NA)為特徵，該神經胺糖酸酶係選自由N1、N2及N8組成之群。
在特別較佳實施例中，A型流感病毒係選自由以下組成之群：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8及H10N7，較佳選自H1N1、H3N2、H5N1及H5N8。
在此上下文中，特別較佳地，本發明mRNA序列之至少一個編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質及/或至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，該A型流感病毒係選自由以下組成之群：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8及H10N7，較佳選自H1N1、H3N2、H5N1、H5N8或其片段或變異體。
在本發明之上下文中，由根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區編碼的蛋白質之片段或其變異體通常可包含與相應的天然存在之全長蛋白質或其變異體的胺基酸序列具有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%序列一致性的胺基酸序列。
在特定實施例中，抗原肽或蛋白質源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)蛋白。
此外，在此上下文中，編碼至少一種源自流感病毒之血球凝集素(HA)及/或神經胺糖酸酶(NA)或其片段、變異體或衍生物的抗原肽或蛋白質之編碼區可選自包含編碼區之任何核酸序列，該編碼區編碼源自任何流感病毒分離株之血球凝集素(HA)或神經胺糖酸酶(NA)或其片段或變異體。
在本發明之第一態樣之一特別較佳實施例中，包含mRNA序列之mRNA化合物包含編碼區，該編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白G或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。
在此上下文中，至少一種抗原肽或蛋白質之胺基酸序列可選自源自狂犬病病毒之醣蛋白或其片段或變異體的任何肽或蛋白質，或選自任何合成工程改造之狂犬病病毒肽或蛋白質。
在本發明之一較佳實施例中，編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。
在此上下文中，特別較佳地，至少一個編碼區編碼狂犬病病毒之醣蛋白的至少一種全長蛋白質或其變異體。
如本文所用，術語「全長蛋白質」較佳係指本發明之序列表中指示的全長蛋白質序列。
在此上下文中，進一步較佳地，本發明之mRNA序列的至少一個編碼序列編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白或其片段或變異體的抗原肽或蛋白質。狂犬病病毒之每種醣蛋白係由相應蛋白質之資料庫登錄號來鑑定（參見序列表數字識別符＜223＞，其指示蛋白質或核酸登錄號（GenBank））。若在序列表中進一步搜索相應的蛋白質或核酸登錄號 (GenBank)，則在數字識別符＜223＞下展示該蛋白質或核酸登錄號(GenBank)的下一個SEQ ID NO:對應於編碼該蛋白質的野生型mRNA之核酸序列。
此外，在此上下文中，編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白或其片段、變異體或衍生物的抗原肽或蛋白質之編碼區可選自包含編碼區之任何核酸序列，該編碼區編碼源自任何狂犬病病毒分離株之醣蛋白或其片段或變異體的醣蛋白。
埃博拉病毒及遺傳相關之馬堡病毒為導致嚴重疾病之人類病原體。埃博拉病毒及馬堡病毒為絲狀病毒，它們為具有負鏈RNA基因組之包膜病毒。絲狀病毒科包括三個屬：埃博拉病毒、馬堡病毒及奎瓦病毒(Cuevavirus)。奎瓦病毒屬以及馬堡病毒屬僅包括一個物種，分別亦即洛維奎瓦病毒(Lloviu cuevavirus)（洛維病毒-LLOV）及馬堡馬堡病毒(Marburg marburgvirus)，細分為馬堡病毒（MARV）與拉文病毒（RAVV）。埃博拉病毒屬包括五個已知物種，亦即本迪布焦埃博拉病毒（Bundibugyo virus-BDBV）、雷斯頓埃博拉病毒（Reston virus-RESTV）、蘇丹埃博拉病毒（Sudanvirus-SUDV）、塔伊森林埃博拉病毒（Tai Forest virus-TAFV）（=Côte d'Ivoire ebolavirus）及紮伊爾埃博拉病毒（埃博拉病毒-EBOV）。雖然已自蝙蝠中分離出奎瓦病毒並且它們作為人類病原體之潛力仍然未知，但埃博拉病毒及馬堡病毒皆為人類病原體，分別引起埃博拉病毒病(EVD)及馬堡病毒病，其特徵為出血熱與極高的死亡率。在本發明之上下文中，屬或與上述科及屬之病毒相關或源自上述科及屬之病毒的任何病毒、病毒成員、病毒株、病毒類型、病毒亞型、病毒分離株、病毒變種、或病毒血清型或病毒之基因重配體均被視為「埃博拉病毒」。
在本發明之第一態樣之一特別較佳實施例中，包含mRNA序列之mRNA化合物包含編碼至少一種抗原肽或蛋白質的編碼區，該抗原肽或蛋白質源自埃博拉病毒屬或馬堡病毒屬之病毒的醣蛋白(GP)及/或基質蛋白40(VP40)及/或核蛋白(NP)或其片段、變異體或衍生物。
在此上下文中，至少一種抗原肽或蛋白質之胺基酸序列可選自源自以下之任何肽或蛋白質：醣蛋白(GP)及/或基質蛋白40 (VP40)及/或核蛋白(NP)、埃博拉病毒之醣蛋白或其片段或變異體，或選自任何合成工程改造之埃博拉病毒肽或蛋白質。
在本發明之一較佳實施例中，編碼區編碼至少一種抗原肽或蛋白質，該抗原肽或蛋白質源自埃博拉病毒之醣蛋白或其片段或變異體。在此上下文中，特別較佳地，至少一個編碼區編碼埃博拉病毒之醣蛋白的至少一種全長蛋白或其變異體。
在特別較佳實施例中，mRNA序列包含至少一個編碼埃博拉病毒之醣蛋白的編碼區。在特別較佳實施例中，mRNA序列包含至少一個編碼埃博拉病毒之VP40的編碼區。在特別較佳實施例中，mRNA序列包含至少一個編碼埃博拉病毒之NP的編碼區。
在特別較佳實施例中，mRNA序列包含至少一個編碼埃博拉病毒之抗原肽或蛋白質的編碼區，該編碼區包含選自以下RNA序列之RNA序列：
編碼埃博拉病毒之GP蛋白的mRNA：專利申請案WO2016097065之SEQ ID NO: 37-39，或此等序列之片段或變異體。在此上下文中，WO2016097065之SEQ ID NO: 37-39及有關WO2016097065之SEQ ID NO: 37-39的揭示內容以引用之方式併入本文。
編碼埃博拉病毒之VP40的mRNA：專利申請案WO2016097065之SEQ ID NO: 40-42，或此等序列之片段或變異體。在此上下文中，WO2016097065之SEQ ID NO: 40-42及有關WO2016097065之SEQ ID NO: 40-42的揭示內容以引用之方式併入本文。
編碼埃博拉病毒之NP的mRNA：專利申請案WO2016097065之SEQ ID NO: 43-44，或此等序列之片段或變異體。在此上下文中，WO2016097065之SEQ ID NO: 43-44及有關WO2016097065之SEQ ID NO: 43-44的揭示內容以引用之方式併入本文。 V.9.3. 腫瘤抗原
較佳地，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物之至少一個編碼序列編碼腫瘤抗原(較佳如本文所定義)或其片段或變異體，其中該腫瘤抗原較佳選自由以下組成之群：1A01_HLA-A/m；1A02；5T4；ACRBP；AFP；AKAP4；α-輔肌動蛋白-_4/m；α-甲基醯基-輔酶_A_消旋酶；ANDR；ART-4；ARTC1/m；AURKB；B2MG；B3GN5；B4GN1；B7H4；BAGE-1；BASI；BCL-2；bcr/abl；β-鏈蛋白/m；BING-4；BIRC7；BRCA1/m；BY55；鈣網伴護蛋白；CAMEL；CASP-8/m；CASPA；組織蛋白酶_B；組織蛋白酶_L；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D；CD1E；CD20；CD22；CD276；CD33；CD3E；CD3Z；CD44_同功型_1；CD44_同功型_6；CD4；CD52；CD55；CD56；CD80；CD86；CD8A；CDC27/m；CDE30；CDK4/m；CDKN2A/m；CEA；CEAM6；CH3L2；CLCA2；CML28；CML66；COA-1/m；毛狀蛋白樣_蛋白；膠原蛋白_XXIII；COX-2；CP1B1；CSAG2；CT45A1；CT55；CT-_9/BRD6；CTAG2_同功型_LAGE-1A；CTAG2_同功型_LAGE-1B；CTCFL；Cten；週期蛋白_B1；週期蛋白_D1；cyp-B；DAM-10；DEP1A；E7；EF1A2；EFTUD2/m；EGFR；EGLN3；ELF2/m；EMMPRIN；EpCam；EphA2；EphA3；ErbB3；ERBB4；ERG；ETV6；EWS；EZH2；FABP7；FCGR3A_型式_1；FCGR3A_型式_2；FGF5；FGFR2；纖維連接蛋白；FOS；FOXP3；FUT1；G250；GAGE-1；GAGE-2；GAGE-3；GAGE-4；GAGE-5；GAGE-6；GAGE7b；GAGE-8_(GAGE-2D)；GASR；GnT-V；GPC3；GPNMB/m；GRM3；HAGE；絲胺酸蛋白酶；Her2/neu；HLA-A2/m；同源匣_NKX3.1；HOM-TES-85；HPG1；HS71A；HS71B；HST-2；hTERT；iCE；IF2B3；IL10；IL-13Ra2；IL2-RA；IL2-RB；IL2-RG；IL-5；IMP3；ITA5；ITB1；ITB6；血管舒緩素-2；血管舒緩素-4；KI20A；KIAA0205；KIF2C；KK-LC-1；LDLR；LGMN；LIRB2；LY6K；MAGA5；MAGA8；MAGAB；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-A1；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-B10；MAGE-B16；MAGE-B17；MAGE-_B1；MAGE-B2；MAGE-B3；MAGE-B4；MAGE-B5；MAGE-B6；MAGE-C1；MAGE-C2；MAGE-C3；MAGE-D1；MAGE-D2；MAGE-D4；MAGE-_E1；MAGE-E1_(MAGE1)；MAGE-E2；MAGE-F1；MAGE-H1；MAGEL2；乳腺珠蛋白_A；MART-1/melan-A；MART-2；MC1_R；M-CSF；間皮素；MITF；MMP1_1；MMP7；MUC-1；MUM-1/m；MUM-2/m；MYCN；MYO1A；MYO1B；MYO1C；MYO1D；MYO1E；MYO1F；MYO1G；MYO1H；NA17；NA88-A；Neo-PAP；NFYC/m；NGEP；NPM；NRCAM；NSE；NUF2；NY-ESO-1；OA1；OGT；OS-9；骨鈣化素；骨鈣化素；p53；PAGE-4；PAI-1；PAI-2；PAP；PATE；PAX3；PAX5；PD1L1；PDCD1；PDEF；PECA1；PGCB；PGFRB；Pim-1_-激酶；Pin-1；PLAC1；PMEL；PML；POTEF；POTE；PRAME；PRDX5/m；PRM2；prostein；蛋白酶-3；PSA；PSB9；PSCA；PSGR；PSM；PTPRC；RAB8A；RAGE-1；RARA；RASH；RASK；RASN；RGS5；RHAMM/CD168；RHOC；RSSA；RU1；RU2；RUNX1；S-100；SAGE；SART-_1；SART-2；SART-3；SEPR；SERPINB5；SIA7F；SIA8A；SIAT9；SIRT2/m；SOX10；SP17；SPNXA；SPXN3；SSX-1；SSX-2；SSX3；SSX-4；ST1A1；STAG2；STAMP-1；STEAP-1；Survivin-2B；存活素；SYCP1；SYT-SSX-1；SYT-SSX-2；TARP；TCRg；TF2AA；TGFB1；TGFR2；TGM-4；TIE2；TKTL1；TPI/m；TRGV11；TRGV9；TRPC1；TRP-p8；TSG10；TSPY1；TVC_(TRGV3)；TX101；酪胺酸酶；TYRP1；TYRP2；UPA；VEGFR1；WT1；及XAGE1。
適用於本發明之其他抗原如下所示（基因名稱之後的括號內為蛋白質登錄號）：
1A01_HLA-A/m (UniProtKB: P30443)；1A02 (UniProtKB: P01892)；5T4 (UniProtKB: Q13641)；ACRBP (UniProtKB: Q8NEB7)；AFP (UniProtKB: P02771)；AKAP4 (UniProtKB: Q5JQC9)；α-輔肌動蛋白-_4/m (UniProtKB: B4DSX0)；α-輔肌動蛋白-_4/m (UniProtKB: B4E337)；α-輔肌動蛋白-_4/m (UniProtKB: 043707)；α-甲基醯基-輔酶A_消旋酶(UniProtKB: AOA024RE16)；α-甲基醯基-輔酶A_消旋酶(UniProtKB: A8KAC3)；ANDR (UniProtKB: P10275)；ART-4 (UniProtKB: Q9ULX3)；ARTCi/m (UniProtKB: P52961)；AURKB (UniProtKB: Q96GD4)；B2MG (UniProtKB: P61769)；B3GN5 (UniProtKB: Q9BYG0)；B4GN1 (UniProtKB: Q00973)；B7H4 (UniProtKB: Q7Z7D3)；BAGE-1 (UniProtKB: Q13072)；BASI (UniProtKB: P35613)；BCL-2 (UniProtKB: A9QXG9)；bcr/abl (UniProtKB: A9UEZ4)；bcr/abl (UniProtKB: A9UEZ7)；bcr/abl (UniProtKB: A9UEZ8)；bcr/abl (UniProtKB: A9UEZ9)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF00)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF01)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF03)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF04)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF05)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF06)；bcr/abl (UniProtKB: A9UF08)；β-鏈蛋白/m (UniProtKB: P35222)；β-鏈蛋白/m (UniProtKB: Q8WYA6)；BING-4 (UniProtKB: 015213)；BIRC7 (UniProtKB: Q96CA5)；BRCA1/m (UniProtKB: AOA024R1V0)；BRCA1/m (UniProtKB: AOA024R1V7)；BRCA1/m (UniProtKB: AOA024RIZ8)；BRCA1/m (UniProtKB: AOA068BFX7)；BRCA1/m (UniProtKB: C6YB45)；BRCA1/m (UniProtKB: C6YB47)；BRCA1/m (UniProtKB: G3XAC3)；BY55 (UniProtKB: 095971)；鈣網伴護蛋白(UniProtKB: B4DHR1)；鈣網伴護蛋白(UniProtKB: B4E2Y9)；鈣網伴護蛋白(UniProtKB: P27797)；鈣網伴護蛋白(UniProtKB: Q96L12)；CAMEL (UniProtKB: 095987)；CASP-8/m (UniProtKB: Q14790)；CASPA (UniProtKB: Q92851-4)；組織蛋白酶_B (UniProtKB: AOA024R374)；組織蛋白酶_B (UniProtKB: P07858)；組織蛋白酶_L (UniProtKB: AOA024R276)；組織蛋白酶_L (UniProtKB: P07711)；組織蛋白酶_L (UniProtKB: Q9HBQ7)；CD1A (UniProtKB: P06126)；CD1B (UniProtKB: P29016)；CD1C (UniProtKB: P29017)；CD1D (UniProtKB: P15813)；CD1E (UniProtKB: P15812)；CD20 (UniProtKB: P11836)；CD22 (UniProtKB: 060926)；CD22 (UniProtKB: P20273)；CD22 (UniProtKB: Q0EAF5)；CD276 (UniProtKB: Q5ZPR3)；CD33 (UniProtKB: B4DF51)；CD33 (UniProtKB: P20138)；CD33 (UniProtKB: Q546G0)；CD3E (UniProtKB: P07766)；CD3Z (UniProtKB: P20963)；CD44_同功型_1 (UniProtKB: P16070)；CD44_同功型_6 (UniProtKB: P16070-6)；CD4 (UniProtKB: P01730)；CD52 (UniProtKB: P31358)；CD52 (UniProtKB: Q6IBD0)；CD52 (UniProtKB: V9HWN9)；CD55 (UniProtKB: B1AP15)；CD55 (UniProtKB: D3DT85)；CD55 (UniProtKB: D3DT86)；CD55 (UniProtKB: P08174)；CD56 (UniProtKB: P13591)；CD80 (UniProtKB: A0N0P2)；CD80 (UniProtKB: P33681)；CD86 (UniProtKB: P42081)；CD8A (UniProtKB: P01732)；CDC27/m (UniProtKB: G5EA36)；CDC27/m (UniProtKB: P30260)；CDE30 (UniProtKB: P28908)；CDK4/m (UniProtKB: AOA024RBB6)；CDK4/m (UniProtKB: P11802)；CDK4/m (UniProtKB: Q6LC83)；CDK4/m (UniProtKB: Q96BE9)；CDKN2A/m (UniProtKB: D1LYX3)；CDKN2A/m (UniProtKB: G3XAG3)；CDKN2A/m (UniProtKB: K7PML8)；CDKN2A/m (UniProtKB: L8E941)；CDKN2A/m (UniProtKB: Q8N726)；CEA (RefSeq: NP_004354)；CEAM6 (UniProtKB: P40199)；CH3L2 (UniProtKB: Q15782)；CLCA2 (UniProtKB: Q9UQC9)；CML28 (UniProtKB: Q9NQT4)；CML66 (UniProtKB: Q96RS6)；COA-1/m (UniProtKB: Q5T124)；毛狀蛋白樣_蛋白 (UniProtKB: Q14019)；膠原蛋白_XXIII (UniProtKB: L8EAS4)；膠原蛋白_XXIII (UniProtKB: Q86Y22)；COX-2 (UniProtKB: Q6ZYK7)；CP1B1 (UniProtKB: Q16678)；CSAG2 (UniProtKB: Q9Y5P2-2)；CSAG2 (UniProtKB: Q9Y5P2)；CT45A1 (UniProtKB: Q5HYN5)；CT55 (UniProtKB: Q8WUE5)；CT-_9/BRD6 (UniProtKB: Q58F21)；CTAG2_同功型_LAGE-1A (UniProtKB: 075638-2)；CTAG2_同功型_LAGE-1B (UniProtKB: 075638)；CTCFL (UniProtKB: Q8NI51)；Cten (UniProtKB: Q8IZW8)；週期蛋白_B1 (UniProtKB: P14635)；週期蛋白_D1 (UniProtKB: P24385)；cyp-B (UniProtKB: P23284)；DAM-10 (UniProtKB: P43366)；DEP1A (UniProtKB: Q5TB30)；E7 (UniProtKB: P03129)；E7 (UniProtKB: P06788)；E7 (UniProtKB: P17387)；E7 (UniProtKB: P06429)；E7 (UniProtKB: P27230)；E7 (UniProtKB: P24837)；E7 (UniProtKB: P21736)；E7 (UniProtKB: P26558)；E7 (UniProtKB: P36831)；E7 (UniProtKB: P36833)；E7 (UniProtKB: Q9QCZ1)；E7 (UniProtKB: Q81965)；E7 (UniProtKB: Q80956)；EF1A2 (UniProtKB: Q05639)；EFTUD2/m (UniProtKB: Q15029)；EGFR (UniProtKB: A0A0B4J1Y5)；EGFR (UniProtKB: E7BSV0)；EGFR (UniProtKB: L0R6G1)；EGFR (UniProtKB: P00533-2)；EGFR (UniProtKB: P00533)；EGFR (UniProtKB: Q147T7)；EGFR (UniProtKB: Q504U8)；EGFR (UniProtKB: Q8NDU8)；EGLN3 (UniProtKB: Q9H6Z9)；ELF2/m (UniProtKB: B7Z720)；EMMPRIN (UniProtKB: Q54A51)；EpCam (UniProtKB: P16422)；EphA2 (UniProtKB: P29317)；EphA3 (UniProtKB: P29320)；EphA3 (UniProtKB: Q6P4R6)；ErbB3 (UniProtKB: B3KWG5)；ErbB3 (UniProtKB: B4DGQ7)；ERBB4 (UniProtKB: Q15303)；ERG (UniProtKB: P11308)；ETV6 (UniProtKB: P41212)；EWS (UniProtKB: Q01844)；EZH2 (UniProtKB: F2YMM1)；EZH2 (UniProtKB: G3XAL2)；EZH2 (UniProtKB: L0R855)；EZH2 (UniProtKB: Q15910)；EZH2 (UniProtKB: S4S3R8)；FABP7 (UniProtKB: 015540)；FCGR3A_型式_1 (UniProtKB: P08637)；FCGR3A_型式_2 (CCDS: CCDS1232.1)；FGF5 (UniProtKB: P12034)；FGF5 (UniProtKB: Q60518)；FGFR2 (UniProtKB: P21802)；纖維連接蛋白(UniProtKB: AOA024R5I6)；纖維連接蛋白(UniProtKB: AOA024RB01)；纖維連接蛋白(UniProtKB: AOA024RDT9)；纖維連接蛋白(UniProtKB: AOA024RDV5)；纖維連接蛋白(UniProtKB: A6NH44)；纖維連接蛋白(UniProtKB: A8K6A5)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B2R627)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B3KXM5)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DIC5)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DN21)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DS98)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DTH2)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DTK1)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B4DU16)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B7Z3W5)；纖維連接蛋白(UniProtKB: B7Z939)；纖維連接蛋白(UniProtKB: G5E9X3)；纖維連接蛋白(UniProtKB: Q9H382)；FOS (UniProtKB: P01100)；FOXP3 (UniProtKB: Q9BZS1)；FUT1 (UniProtKB: P19526)；G250 (UniProtKB: Q16790)；GAGE-1 (Genbank: AAA82744)；GAGE-2 (UniProtKB: Q6NT46)；GAGE-3 (UniProtKB: Q13067)；GAGE-4 (UniProtKB: Q13068)；GAGE-5 (UniProtKB: Q13069)；GAGE-6 (UniProtKB: Q13070)；GAGE7b (UniProtKB: 076087)；GAGE-8_(GAGE-2D) (UniProtKB: Q9UEU5)；GASR (UniProtKB: P32239)；GnT-V (UniProtKB: Q09328)；GPC3 (UniProtKB: I6QTG3)；GPC3 (UniProtKB: P51654)；GPC3 (UniProtKB: Q8IYG2)；GPNMB/m (UniProtKB: AOA024RA55)；GPNMB/m (UniProtKB: Q14956)；GPNMB/m (UniProtKB: Q8IXJ5)；GPNMB/m (UniProtKB: Q96F58)；GRM3 (UniProtKB: Q14832)；HAGE (UniProtKB: Q9NXZ2)；絲胺酸蛋白酶(UniProtKB: B2ZDQ2)；絲胺酸蛋白酶(UniProtKB: P05981)；Her2/neu (UniProtKB: B4DTR1)；Her2/neu (UniProtKB: L8E8G2)；Her2/neu (UniProtKB: P04626)；Her2/neu (UniProtKB: Q9UK79)；HLA-A2/m (UniProtKB: Q95387)；HLA-A2/m (UniProtKB: Q9MYF8)；同源匣_NKX3.1 (UniProtKB: Q99801)；HOM-TES-85 (UniProtKB: B2RBQ6)；HOM-TES-85 (UniProtKB: Q9P127)；HPG1 (Pubmed: 12543784)；HS71A (UniProtKB: P0DMV8)；HS71B (UniProtKB: P0DMV9)；HST-2 (UniProtKB: P10767)；hTERT (UniProtKB: 094807)；iCE (UniProtKB: 000748)；IF2B3 (UniProtKB: 000425)；IL10 (UniProtKB: P22301)；IL-13Ra2 (UniProtKB: Q14627)；IL2-RA (UniProtKB: P01589)；IL2-RB (UniProtKB: P14784)；IL2-RG (UniProtKB: P31785)；IL-5 (UniProtKB: P05113)；IMP3 (UniProtKB: Q9NV31)；ITA5 (UniProtKB: P08648)；ITB1 (UniProtKB: P05556)；ITB6 (UniProtKB: P18564)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: AOA024R4J4)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: AOA024R4N3)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: B0AZU9)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: B4DU77)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: P20151)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: Q6T774)；血管舒緩素-2 (UniProtKB: Q6T775)；血管舒緩素-4 (UniProtKB: A0A0C4DFQ5)；血管舒緩素-4 (UniProtKB: Q5BQA0)；血管舒緩素-4 (UniProtKB: Q96PTO)；血管舒緩素-4 (UniProtKB: Q96PT1)；血管舒緩素-4 (UniProtKB: Q9Y5K2)；KI20A (UniProtKB: 095235)；KIAA0205 (UniProtKB: Q92604)；KIF2C (UniProtKB: Q99661)；KK-LC-1 (UniProtKB: Q5H943)；LDLR (UniProtKB: 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發現了負調節性T細胞表面分子，它們在經活化之T細胞中上調以抑制其活性，從而降低該等經活化之T細胞殺死腫瘤細胞之有效性。由於此等抑制分子與T細胞共刺激分子CD28具有同源性，因此它們係稱為負共刺激分子。此等蛋白質(亦稱為免疫檢查點蛋白)在多種路徑中發揮作用，包括減弱早期激活訊號、競爭正共刺激及直接抑制抗原呈遞細胞(Bour-Jordan等人, 2011.Immunol Rev. 241(1):180-205)。
在本發明之上下文中，檢查點調節劑通常為分子，諸如蛋白質（例如抗體）、顯性負性受體、誘餌受體、或配體或其片段或變異體，它調節免疫檢查點蛋白之功能，例如，它抑制或降低檢查點抑制劑（或抑制性檢查點分子）之活性，或它刺激或提高檢查點刺激劑（或刺激性檢查點分子）之活性。因此，如本文所定義之檢查點調節劑影響檢查點分子之活性。
在此上下文中，抑制性檢查點分子係定義為檢查點抑制劑並且可同義使用。另外，刺激性檢查點分子係定義為檢查點刺激劑並且可同義使用。
較佳地，檢查點調節劑選自促效性抗體、拮抗性抗體、配體、顯性負性受體及誘餌受體或其組合。
生成及使用mRNA編碼之抗體的方法為此項技術已知的（例如WO2008/083949或PCT/EP2017/060226）。
在本發明之上下文中，可受檢查點調節劑抑制之較佳抑制性檢查點分子為PD-1、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3/HAVCR2、2B4、A2aR、B7H3、B7H4、BTLA、CD30、CD160、CD155、GAL9、HVEM、IDO1、IDO2、KIR、LAIR1及VISTA。
在本發明之上下文中，可受檢查點調節劑刺激之較佳刺激性檢查點分子為CD2、CD27、CD28、CD40、CD137、CD226、CD276、GITR、ICOS、OX40及CD70。
根據一較佳實施例，包含本發明之RNA的醫藥組合物或疫苗係用於如本文所述之用途，其中該用途包括——作為另外的醫藥活性成分——選自由以下組成之群的檢查點調節劑：PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑、PD-L2抑制劑、CTLA-4抑制劑、LAG3抑制劑、TIM3抑制劑、TIGIT抑制劑、OX40刺激劑、4-1BB刺激劑、CD40L刺激劑、CD28刺激劑及GITR刺激劑。
根據一較佳實施例，如本文所用之檢查點調節劑靶向PD-1路徑之成員。PD-1路徑之成員通常為與PD-1訊號傳導相關之蛋白質。一方面，此群包括在PD-1上游誘導PD-1訊號傳導之蛋白質，例如PD-1、PD-L1及PD-L2之配體，以及訊號轉導受體PD-1。另一方面，此群包括PD-1受體下游之訊號轉導蛋白。在本發明之上下文中，特別較佳作為PD-1路徑之成員的為PD-1、PD-L1及PD-L2。
在本發明之上下文中，PD-1路徑拮抗劑(或PD-1抑制劑)在本文中較佳定義為能夠削弱PD-1路徑訊號傳導、較佳由PD-1受體介導之訊號傳導的化合物。因此，PD-1路徑拮抗劑可為針對能夠拮抗PD-1路徑訊號傳導的PD-1路徑之任何成員的任何拮抗劑。
在一較佳實施例中，本文所用之檢查點調節劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑，其中PD-1抑制劑較佳為針對PD-1之拮抗性抗體，而PD-L1抑制劑較佳為針對PD-L1之拮抗性抗體。
在此上下文中，拮抗劑可為本文所定義之拮抗性抗體，靶向PD-1路徑之任何成員，較佳為針對PD-1受體、PD-L1或PD-L2之拮抗性抗體。該種拮抗性抗體亦可由核酸編碼。再者，PD-1路徑拮抗劑可為阻斷PD1配體之活性的PD-1受體之片段。B7-1或其片段亦可充當PD1拮抗配體。另外，PD-1路徑拮抗劑可為包含（或編碼）能夠結合PD-1但例如藉由抑制PD-1及B7-H1或B7-DL相互作用阻止PD-1訊號傳導之胺基酸序列的蛋白質(核酸)(WO 2014/127917；WO2012062218)。
特別較佳為抗PD1抗體納武單抗(MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538), (Brahmer等人, 2010. J Clin Oncol. 28(19):3167-75；PMID: 20516446)；匹地利珠單抗(Pidilizumab)(CT-011), (Berger等人, 2008. Clin Cancer Res. 14(10):3044-51；PMID: 18483370)；派姆單抗(MK-3475, SCH 900475)；AMP-224及MEDI0680 (AMP-514)。
特別較佳亦為抗PD-L1抗體MDX-1105/BMS-936559 (Brahmer等人 2012. N Engl J Med. 366(26):2455-65；PMID: 22658128)；阿特珠單抗(atezolizumab)(MPDL3280A/RG7446)；度伐單抗(durvalumab)(MEDI4736)；及阿維魯單抗(avelumab)(MSB0010718)。
根據另一實施例，本文所用之檢查點調節劑為OX40刺激劑。OX40為TNFR受體超家族之成員，並且在抗原活化之哺乳動物 CD4+及CD8+T淋巴球表面上表現。OX40配體（OX40L，亦稱為gp34、ACT-4-L及CD252）為與OX40受體特異性相互作用之蛋白質。術語OX40L包括整個OX40配體、可溶性OX40配體及融合蛋白，其包含與第二部分例如蛋白質結構域共價連接的OX40配體之功能活性部分。OX40L之定義中亦包括胺基酸序列與天然存在之OX40L不同但保留與OX40受體特異性結合之能力的變異體。OX40L之定義中進一步包括其變異體，該變異體提高OX40之生物活性。OX40促效劑為誘導或提高OX40之生物活性(例如，OX40介導之訊號轉導)的分子。Ox40促效劑在本文中較佳定義為能夠與OX40特異性結合之結合分子。因此，OX40促效劑可為與OX40結合並能夠刺激OX40訊號傳導之任何促效劑。在此上下文中，OX40促效劑可為與OX40結合之促效性抗體。
OX40促效劑及抗0X40單株抗體描述於WO1995/021251、WO1995/012673及WO1995/21915中。特別較佳為抗0X40抗體9B12，亦即一種針對人類OX40胞外域之鼠抗0X40單株抗體(Weinberg等人, 2006. J. Immunother. 29(6):575-585)。
在另一實施例中，如本文所用之檢查點調節劑為選自由以下組成之群的拮抗性抗體：抗CTLA4、抗PD1、抗PD-L1、抗Vista、抗Tim-3、抗TIGIT、抗LAG-3及抗BTLA。
較佳地，可用作檢查點調節劑之抗CTLA4抗體係針對細胞毒性T淋巴球抗原4 (CTLA-4)。CTLA-4主要在T細胞之細胞內區室中表現。在經由T細胞受體(TCR)對幼稚T細胞進行有效或持久刺激後，CTLA-4被轉運至細胞表面並集中在免疫突觸處。CTLA-4隨後與CD28競爭CD80/CD86並經由對Akt訊號傳導之效應下調TCR訊號傳導。因此，CTLA-4在生理上起到訊號阻尼器之作用(Weber, J. 2010. Semin. Oncol. 37(5):430-9)。
在較佳實施例中，包含本發明之RNA的醫藥組合物或疫苗係用於如本文所述之用途，其中該用途包括——作為另外的醫藥活性成分——CTLA4拮抗劑，其較佳為針對CTLA4之拮抗性抗體（抗CTLA4抗體）。如本文所用，術語「CTLA4拮抗劑」包括拮抗CTLA4之生理功能的任何化合物，諸如抗體。在本發明之上下文中，術語「抗CTLA4抗體」可指代針對CTLA4之拮抗性抗體（或該抗體之功能片段或變異體）或編碼該拮抗性抗體（或其功能片段）之核酸，較佳RNA。抗CTLA4抗體之功能片段或變異體較佳充當CTLA4拮抗劑。更佳地，術語「抗CTLA4抗體」係指針對CTLA4之單株抗體（或此類抗體之功能片段或變異體）或編碼針對CTLA4之單株抗體（或此類抗體之功能片段或變異體）的核酸。如本文所用，術語「抗CTLA4抗體」可分別指代抗體重鏈或輕鏈，或亦指代抗體鏈（重鏈及輕鏈），或此等鏈中任一條之片段或變異體。較佳地，如本文所用之抗CTLA4抗體之片段或變異體為功能片段或變異體，較佳如本文所述。
特別較佳為抗CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)(Yervoy®)、曲美木單抗(tremelimumab)及AGEN-1884。如本文所用，進一步較佳之抗CTLA4抗體包括BMS 734016；BMS-734016；BMS734016；MDX 010；MDX 101；MDX-010；MDX-101；MDX-CTLA-4；MDX-CTLA4；MDX010；Winglore；及Yervoy；或此等抗體中任一者之功能片段或變異體。
根據又一實施例，如本文所用之檢查點調節劑為表1中描述之至少一種抗體或其片段或變異體。 V.5. 組合癌症療法
更佳地，接受包含本發明之RNA的醫藥組合物或疫苗、其組合或包含該(等)RNA之醫藥組合物或疫苗的受試者為患有本文所述之腫瘤或癌症疾病並且已接受或接受化療（例如一線或二線化療）、放療、放化療（化療與放療之組合）、激酶抑制劑、抗體療法及/或檢查點調節劑（例如CTLA4抑制劑、PD1路徑抑制劑）的患者，或在接受上述一或多種治療後已達到部分反應或疾病穩定之患者。更佳地，受試者為患有如本文所述之腫瘤或癌症疾病並且已接受或接受習知用於本文所述之任何此等疾病的化合物之患者，更佳為接受或已接受檢查點調節劑之患者。
以下化合物為較佳化合物，其較佳用於標準療法中並且可與包含本發明之RNA的醫藥組合物或疫苗組合應用：西妥昔單抗（愛必妥(Erbitux)）、白蛋白結合型紫杉醇(Abraxane)、(吉莫斯特(gimeracil)+奧替拉西(oteracil)+喃氟啶(tegafur)) (TS-1)、多西紫杉醇(Docetaxel、Doxel、Taxotere、多西紫杉醇An、Docel、Nanoxel M、Tautax、多西紫杉醇-AS、多西紫杉醇-M、Qvidadotax、Relidoce、Taxelo、Oncodocel、Doxotel、Pacancer、Docetrust、Dodetax、Dodabur、Soulaxcin、Taxedol、Docefim、Docetaxel、Ribodocel、Critidoc、Asodoc、Chemodoc、Docelibbs、Docenat、Dincilezan、Dostradixinol、Docefrez、Camitotic、Oncotaxel、Somatixel、Belotaxel、Qvidadotax、Taxceus、Cetadocure、多西紫杉醇CT、Tevaxter、Docirena、Eurotere、Axtere、Celotax、Taxanit、Drobanos、Cetado、Doxocad、Taxceus、Egidox、Tedocad、Docecad、Docelex、Docetax、Docetaxel、Docetere、Dotax、Taxuba、Monotaxel、Taceedo、Detaxl、Docet、Docetaxel、Ferdotax、Wintaxel)、(喃氟啶+尿嘧啶) (Uft、Uft E、Tefudex、Unitoral、Luporal、Tagracil)、氟尿嘧啶(5-FU)、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶) ODT (TS-1組合OD)、硫酸博萊黴素(Tecnomicina、Cinaleo、Bleomycin、Bloicin-S、Bonar、Bleocin、Bleomycin Sulfate、Bleo、Bleocel、Bleotex、Oncobleo、Bleonco、Bleosol、Lyoble、Bleomycin Sulfate、Blenamax、Bleomycin、Blenoxane、Bleomicina、Bleomycine Bellon、Bleoprim)、卡鉑(Carboplatin、Platamine CS、Carbaccord、Carboplatina、Carboplatino、Paraplatin、Carbosin、Tecnocarb、Carbomerck、Paract、Carboplatine CTRS、Carboplatine Intsel Chimos、Carboplatin、Carbokem、Carbotinol、Fauldcarbo、Evocarb、Citoplatina、Platin)、賽普沙辛(Hypoflox、Ufexil)、鹽酸賽普沙辛(Ciprofloxacin Pharma、Prodin、Ciproxin)、順鉑(Cisplatin、Stritin、Ifapla、Accocit、Unistin、Cancertin、Cisplan、Citoplax、Nuoxin、Placis、Cisplatino、Displanor、Randa、Cispla、Fauldcispla、Briplatin、Platinex、Platinol、Platinex、Riboplatin、Cisplatine、Platistine CS、Platosin、Accocit、Cisplatino)、環磷醯胺(Endoxan、Cyclophosphamide)、去氧氟尿苷(Doxifluridine、May Vladimir)、多柔比星(鹽酸多柔比星、Adriamycin RDF、Doxorubicin、Doxorubicin PFS)、鹽酸表柔比星(Brecila、Cloridrato De Epirrubicina、Epirubicin、Farmorubicina、Nuovodox、Adnexa、4-Eppedo、Favicin)、氟尿嘧啶(Agicil、Fluorouracil、Fauldfluor、Oncourcil、Flocil、5 Flucel)、葉酸+胺甲喋呤(Truxofol)、人類腺病毒5型(重組) (Oncorine)、羥基尿素(Oxyrea、Durea、Myelostat、Riborea、Unidrea、Ondrea、Hydran、Leukocel、Hydroxyurea、Hydrea)、依弗醯胺(Holoxan、Ifosfamide Eg)、左旋咪唑(Zirsol)、胺甲喋呤(Tratoben、Methotrexate、Fresexate、Neometho、Fauldmetro、Methotrexate Sodium、Methocel、Hytas、Methaccord、Methofill、Metotrexato、Traxacord、Plastomet、Tevatrex、Metrex、Caditrex、Carditrex、Vibzi、Imutrex、Biotrexate、Methorex、Mexate、Neotrexate、Oncotrex、Remtrex、Trixilem、Hi-Trex、Metorex、Trex、Unitrexate、Ebetrexac、Fauldexato、Lantarel、Maxtrex、Miantrex CS、Rheumatrex、Folex、Folex PFS、Abitrexate、Tevametho、Trexall、Emthexate、Abitrexate、Meadow)、絲裂黴素(絲裂黴素C、Mitomycin、Mitonco、Lyomit)、奈達鉑(Jiebaishu、Aoxianda、Aqupla)、尼美舒利(Nimulid)、尼妥珠單抗(Biomab EGFR, Laedemab)、硝基呋喃妥因 (Furatsilin)、氧氟沙星(Entof)、紫杉醇(Paclitaxel、Taxol)、硫酸匹萊黴素(Pepleo)、沙培林(Picibanil)、吡柔比星(鹽酸吡柔比星、Therarubicin、Pinorubin)、甘胺雙唑鈉(CMNa)、喃氟啶(Utefos、Icarus、Futraful、Tegafur Gimeracil Oteracil Potassium)、替莫卟吩(Foscan)、鹽酸拓撲替康(Topotecan)、烏苯美司(Ubenimex)、硫酸長春花鹼(Vinblastine、Vblastin)、硫酸長春新鹼(Vincristine、Vincristine Sulfate、Vincristin、Sutivin、vindesine sulfate (Eldisine)、卡鉑(Carboplatine Qualimed、Carboplatine、Carboplatino、Carboplatin)、順鉑(Cisplatin)、多西紫杉醇(Kamdocon、Naltoxater、Docetaxel)、氟尿嘧啶 (Fluorouracil、Fluorouracile、Fluorouracil)、胺甲喋呤(胺甲喋呤鈉、Mexate、Mexate Aq、Biometrox、Medsatrexate、Otaxem)、硫酸長春新鹼(Oncovin)、氟尿嘧啶、蘋果酸舒尼替尼、阿維A酸、纖維蛋白密封劑、西妥昔單抗、西妥昔單抗、埃羅替尼、順鉑；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、未經揭露之抗癌藥物、吉非替尼(gefitinib)、普伐他汀鈉(pravastatin sodium)、西羅莫司(sirolimus)、未經揭露之化療、順鉑；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、西羅莫司、氟尿嘧啶；未經揭露之紫杉烷、鹽酸胺基戊酮酸甲酯、順鉑；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、鹽酸埃羅替尼、西妥昔單抗、咪喹莫特、未經揭露之中草藥、阿司匹林；馬來酸伊那拉普利(enalapril maleate)、未經揭露之化療、西妥昔單抗、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)；卡鉑；順鉑、順鉑；氟尿嘧啶；尼妥珠單抗、卡鉑；白蛋白結合型紫杉醇、順鉑；奈達鉑、博萊黴素、奈達鉑、順鉑；紫杉醇、白蛋白結合型紫杉醇、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)、博萊黴素；未經揭露之化療、阿帕替尼；多西紫杉醇、未經揭露之免疫調節補充劑、BCM-95、鹽酸胺酮戊酸、奈達鉑、順鉑；帕利夫明(palifermin)、西妥昔單抗、吉非替尼、貝伐單抗、belagenpumatucel-L、順鉑；替拉紮明(tirapazamine)、順鉑；替拉紮明、順鉑；吉西他濱(gemcitabine)；紫杉醇；拓撲替康；長春瑞濱、順鉑；氟尿嘧啶、帕尼單抗、卡鉑；多西紫杉醇；鹽酸吉西他濱；酒石酸長春瑞濱、胺磷汀；氟尿嘧啶、順鉑；氟尿嘧啶、卡鉑；紫杉醇、替拉紮明、順鉑；阿法依伯汀、菲妥珠單抗(figitumumab)、美法侖(melphalan)；腫瘤壞死因子α、順鉑、順鉑；氟尿嘧啶、順鉑；未經揭露之化療、多西紫杉醇、拉康舒集(contusugene ladenovec),順鉑；氟尿嘧啶；紫杉醇、多西紫杉醇、人類乳頭狀瘤病毒[血清型16、18] (二價)疫苗、異維甲酸、順鉑；氟尿嘧啶、米索硝唑(misonidazole)、紫杉醇、帕利夫明(palifermin)、內皮抑素(endostatin)、 匹魯卡品(pilocarpine)、順鉑；多西紫杉醇；非格司亭(filgrastim)；氟尿嘧啶；紫杉醇、順鉑；多西紫杉醇；非格司亭；氟尿嘧啶；紫杉醇、順鉑；鹽酸伊立替康、順鉑；吉西他濱、順鉑；表柔比星；氟尿嘧啶；未經揭露之化療、鹽酸胺基戊酮酸甲酯、卡鉑；紫杉醇、卡波金(carbogen)；二氧化碳；菸鹼醯胺、順鉑；氟尿嘧啶、talimogene laherparepvec、阿法依泊汀、順鉑；氟尿嘧啶；帕尼單抗、順鉑；氟尿嘧啶、順鉑；氟尿嘧啶、阿地白介素(aldesleukin)、順鉑；氟尿嘧啶、順鉑；紫杉醇、順鉑；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶；甲醯四氫葉酸；樂巴鉑(lobaplatin)、順鉑、順鉑；乙硫醇；依弗醯胺；美司鈉(mesna)；二溴衛矛醇(mitolactol)、多柔比星；左旋咪唑、(喃氟啶+尿嘧啶)、順鉑；氟尿嘧啶、順鉑；長春瑞濱、卡鉑；順鉑；鹽酸吉西他濱、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)；多柔比星、卡培他濱(capecitabine)；順鉑；氟尿嘧啶；紫杉醇、氟尿嘧啶；甲醯四氫葉酸；胺甲喋呤、rAd-p53、西妥昔單抗；順鉑；多西紫杉醇、PV-10、鹽酸胺基戊酮酸甲酯、順鉑；氟尿嘧啶、紫杉醇；鹽酸拓撲替康、卡鉑；順鉑；紫杉醇、順鉑；鹽酸拓撲替康、順鉑；依託泊苷、多西紫杉醇；氟尿嘧啶、阿司匹林、順鉑；吉西他濱、短乳酸桿菌CD2、順鉑；多西紫杉醇、三木甲胺康布瑞汀(fosbretabulin tromethamine)、帕尼單抗、氟尿嘧啶、紫杉醇、卡鉑；順鉑；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、鹽酸埃羅替尼、順鉑；未經揭露之化療；長春瑞濱、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)；卡鉑、西妥昔單抗、拉康舒集、西妥昔單抗、鹽酸胺基戊酮酸甲酯、環磷醯胺、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)；順鉑、白蛋白結合型紫杉醇、卡鉑；紫杉醇、順鉑；吉西他濱、卡培他濱；順鉑、多西紫杉醇、Z-100、順鉑；依弗醯胺；紫杉醇、尼妥珠單抗、鹽酸伊立替康、塞來昔布；胺甲喋呤、Nutrison、卡鉑；順鉑；氟尿嘧啶；紫杉醇、順鉑；紫杉醇、順鉑；多西紫杉醇；長春瑞濱、紫杉醇、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)；順鉑、卡鉑；紫杉醇、鹽酸胺基戊酮酸甲酯、Aibin、順鉑；氟尿嘧啶、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、卡鉑；順鉑；生育三烯酚(tocotrienol)；長春瑞濱、(吉莫斯特+奧替拉西+喃氟啶)；順鉑；紫杉醇、多西紫杉醇、伊匹單抗、順鉑、VB-4847、塞來昔布；沙利度胺(thalidomide)、順鉑；表柔比星；氟尿嘧啶、順鉑；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡鉑；紫杉醇、西妥昔單抗；順鉑；多西紫杉醇、自體細介素誘導之殺手細胞、順鉑；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、順鉑；表柔比星；氟尿嘧啶、tergenpumatucel-L、西妥昔單抗；順鉑；多西紫杉醇、愛倫多(Elental)、順鉑；尼妥珠單抗；紫杉醇、二十碳五烯酸；未經揭露之營養補充劑、帕博西林(palbociclib)、派姆單抗(pembrolizumab)(Keytruda)、尼妥珠單抗、阿帕托森(apatorsen)及達可替尼(dacomitinib)。
如本文所用，術語「腫瘤」、「癌症」或「癌症疾病」係指惡性疾病，其較佳選自由以下組成之群：腺囊癌（腺樣囊性癌）、腎上腺皮質癌、艾滋病相關癌症、艾滋病相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦腫瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、視覺路徑及下視丘神經膠質瘤、乳癌、支氣管腺瘤/類癌、伯基特淋巴瘤、兒童類癌、胃腸道類癌、不明原發癌、原發性中樞神經系統淋巴瘤、兒童小腦星形細胞瘤、兒童腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴球性白血病、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤，包括蕈狀肉芽腫及赛扎里氏症候群(Sezary Syndrome)、結締組織增生性小圓細胞瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文家族腫瘤中之尤文氏肉瘤、兒童顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌、胃腸道間質瘤 (GIST)、顱外、性腺外或卵巢生殖細胞腫瘤、妊娠滋養細胞腫瘤、腦幹神經膠質瘤、兒童大腦星形細胞瘤、兒童視覺路徑及下視丘神經膠質瘤、胃癌、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細胞（肝癌）、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、人乳頭狀瘤病毒（HPV）相關癌症、下嚥癌、兒童下視丘及視覺路徑神經膠質瘤、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌（內分泌胰腺）、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌（腎細胞癌）、喉癌、唇癌及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相關淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、兒童髓母細胞瘤、黑色素瘤、眼內（眼）黑色素瘤、默克爾細胞癌、成人惡性間皮瘤、兒童間皮瘤、頭頸癌、口腔癌、兒童多發性內分泌瘤症候群、多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤、多發性骨髓瘤（骨髓癌）、鼻腔及鼻竇癌、 鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/惡性骨纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌（表面上皮間質瘤）、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤、胰腺癌、胰島細胞胰腺癌、鼻竇及鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體生殖細胞瘤、兒童松果體母細胞瘤及小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、垂體腺瘤、漿細胞瘤/漿細胞瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎癌）、腎盂及輸尿管癌、視網膜母細胞瘤、兒童橫紋肌肉瘤、唾液腺癌症、尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、皮膚癌（非黑色素瘤）、皮膚癌（黑色素瘤）、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、鱗狀細胞癌、轉移性鱗狀頸癌伴隱匿性原發性軟組織肉瘤 (STS)、兒童小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、睾丸癌（精原細胞瘤及非精原細胞瘤）、喉癌、兒童胸腺瘤、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、兒童甲狀腺癌、腎盂及輸尿管移行細胞癌、妊娠滋養細胞腫瘤、尿道癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、陰道癌、兒童視覺路徑及下視丘神經膠質瘤、外陰癌及兒童維爾姆斯瘤（腎癌）。 V.9. 過敏性抗原
與過敏或過敏性疾病相關之抗原（過敏原或過敏性抗原）較佳來源於選自由以下組成之清單的來源：
毛囊蟲屬某些種(Aca s 1、Aca s 10、Aca s 10.0101、Aca s 13、Aca s 13.0101、Aca s 2、Aca s 3、Aca s 7、Aca s 8)、刺鮁屬某些種(Aca so 1)、棘唇線蟲某些種(Aca v 3、Aca v 3.0101)、毛蝦屬某些種(Ace ja 1)、獼猴桃屬某些種(Act a 1、Act c 1、Act c 10、Act c 10.0101、Act c 2、Act c 4、Act c 5、Act c 5.0101、Act c 8、Act c 8.0101、Act c幾丁質酶、Act d 1、Act d 1.0101、Act d 10、Act d 10.0101、Act d 10.0201、Act d 11、Act d 11.0101、Act d 2、Act d 2.0101、Act d 3、Act d 3.0101、Act d 3.02、Act d 4、Act d 4.0101、Act d 5、Act d 5.0101、Act d 6、Act d 6.0101、Act d 7、Act d 7.0101、Act d 8、Act d 8.0101、Act d 9、Act d 9.0101、Act d幾丁質酶、Act e 1、Act e 5)、管蚜屬某些種(Acy pi 7、Acy pi 7.0101、Acy pi 7.0102)、西番蓮屬(Adenia)某些種(Ade v RIP)、斑蚊屬某些種(Aed a 1、Aed a 1.0101、Aed a 2、Aed a 2.0101、Aed a 3、Aed a 3.0101、Aed a 4、Aed a 7、Aed a 7.0101、Aed a 7.0102、Aed a 7.0103、Aed a 7.0104、Aed a 7.0105、Aed a 7.0106、Aed a 7.0107、Aed a 7.0108、Aed a 7.0109、Aed a 7.0110、Aed a 7.0111、Aed al 1、Aed al 3、Aed al 37 kD、Aed v 37 kD、Aed v 63 kD)、山羊草屬某些種(Aeg ta 28、Aeg ta α_麥膠蛋白、Aeg um 28、Aeg un 28)、煙鱸屬某些種(Aet ro 1)、冰草屬某些種(Agr c 7)、小糠草屬某些種(Agr ca 1、Agr ca 5、Agr g 1、Agr g 4、Agr s 5)、農桿菌屬某些種(Agr sp CP4 EPSPS)、貓熊屬某些種(Ail me卵黃高磷蛋白、Ail me TCTP)、鴛鴦某些種(Aix ga 1、Aix sp 1)、食粉蟎屬某些種(Ale o 1、Ale o 10、Ale o 10.0101、Ale o 10.0102、Ale o 13、Ale o 14、Ale o 2、Ale o 20、Ale o 3、Ale o 5、Ale o 7、Ale o 8、Ale o 9)、蒜屬某些種(All a 3、All a蒜胺酸解離酶、All c 3、All c 30 kD、All c 4、All c蒜胺酸解離酶、All p蒜胺酸解離酶、All s蒜胺酸解離酶)、赤楊屬某些種(Aln g 1、Aln g 1.0101、Aln g 1/Bet v 1/Cor a 1 TPC7、Aln g 1/Bet v 1/Cor a 1 TPC9、Aln g 2、Aln g 4、Aln g 4.0101)、埃及雁屬某些種(Alo ae 1)、看麥娘屬某些種(Alo p 1、Alo p 5)、鏈格孢菌屬某些種(Alt a 1、Alt a 1.0101、Alt a 1.0102、Alt a 10、Alt a 10.0101、Alt a 12、Alt a 12.0101、Alt a 13、Alt a 13.0101、Alt a 2、Alt a 3、Alt a 3.0101、Alt a 4、Alt a 4.0101、Alt a 5、Alt a 5.0101、Alt a 6、Alt a 6.0101、Alt a 7、Alt a 7.0101、Alt a 70 kD、Alt a 8、Alt a 8.0101、Alt a 9、Alt a MnSOD、Alt a NTF2、Alt a TCTP、Alt ar 1、Alt arg 1、Alt b 1、Alt bl 1、Alt br 1、Alt c 1、Alt ca 1、Alt ce 1、Alt ch 1、Alt ci 1、Alt co 1、Alt cr 1、Alt ct 1、Alt cu 1、Alt cy 1、Alt d 1、Alt du 1、Alt e 1、Alt et 1、Alt eu 1、Alt ga 1、Alt gr 1、Alt j 1、Alt I 1、Alt lo 1、Alt m 1、Alt me 1、Alt mi 1、Alt mo 1、Alt o 1、Alt p 1、Alt ph 1、Alt po 1、Alt ps 1、Alt r 1、Alt s 1、Alt se 1、Alt sm 1、Alt so 1、Alt su 1、Alt t 1、Alt te 1、Alt to 1)、莧屬某些種(Ama r 2、Ama r 2.0101、Ama v 2、Ama v 2.0101、Ama v 2.0201)、豬草屬某些種(Amb a 1、Amb a 1.0101、Amb a 1.0201、Amb a 1.0202、Amb a 1.0301、Amb a 1.0302、Amb a 1.0303、Amb a 1.0304、Amb a 1.0305、Amb a 1.0401、Amb a 1.0402、Amb a 1.0501、Amb a 1.0502、Amb a 10、Amb a 10.0101、Amb a 3、Amb a 3.0101、Amb a 4、Amb a 4.0101、Amb a 5、Amb a 5.0101、Amb a 6、Amb a 6.0101、Amb a 7、Amb a 7.0101、Amb a 8、Amb a 8.0101、Amb a 8.0102、Amb a 9、Amb a 9.0101、Amb a 9.0102、Amb a CPI、Amb p 1、Amb p 5、Amb p 5.0101、Amb p 5.0201、Amb t 5、Amb t 5.0101、Amb t 8)、菊苣屬某些種(Ammothea spp)(Amm h 7、Amm h 7.0101)、粗飾蚶屬某些種(Ana br 1)、鳳梨屬某些種(Ana c 1、Ana c 1.0101、Ana c 2、Ana c 2.0101、Ana c 2.0101 (MUXF3))、鴨屬某些種(Ana ca 1)、狼魚屬某些種(Ana I 1)、檟如樹屬某些種(Ana o 1、Ana o 1.0101、Ana o 1.0102、Ana o 2、Ana o 2.0101、Ana o 3、Ana o 3.0101)、鴨屬某些種(Ana p 1、Ana p 2、Ana p 3)、鰻鱺屬某些種(Ang a 1、Ang j 1)、胃線蟲屬某些種(Ani s 1、Ani s 1.0101、Ani s 10、Ani s 10.0101、Ani s 11、Ani s 11.0101、Ani s 12、Ani s 12.0101、Ani s 2、Ani s 2.0101、Ani s 24 kD、Ani s 3、Ani s 3.0101、Ani s 4、Ani s 4.0101、Ani s 5、Ani s 5.0101、Ani s 6、Ani s 6.0101、Ani s 7、Ani s 7.0101、Ani s 8、Ani s 8.0101、Ani s 9、Ani s 9.0101、Ani s CCOS3、Ani s細胞色素B、Ani s FBPP、Ani s NADHDS4L、Ani s NARaS、Ani s PEPB、Ani s肌鈣蛋白)、番荔枝屬某些種(Ann c幾丁質酶)、瘧蚊屬某些種(Ano da 17、Ano da 17.0101、Ano da 27、Ano da 27.0101、Ano da 7、Ano da 7.0101、Ano g 7、Ano g 7.0101)、雁屬某些種(Ans a 1、Ans a 2、Ans a 3、Ans in 1)、春茅屬某些種(Ant o 1、Ant o 1.0101、Ant o 12、Ant o 13、Ant o 2、Ant o 4、Ant o 5、Ant o 6、Ant o 7)、蜜蜂某些種(Api c 1、Api c 1.0101、Api c 10、Api c 2、Api c 4、Api d 1、Api d 1.0101、Api d 4、Api fl 4)、芹菜某些種(Api g 1、Api g 1.0101、Api g 1.0201、Api g 2、Api g 2.0101、Api g 3、Api g 3.0101、Api g 4、Api g 4.0101、Api g 5、Api g 5.0101、Api g 6、Api g 6.0101)、蜜蜂某些種(Api m 1、Api m 1.0101、Api m 10、Api m 10.0101、Api m 11、Api m 11.0101、Api m 11.0201、Api m 13 kD、Api m 2、Api m 2.0101、Api m 3、Api m 3.0101、Api m 4、Api m 4.0101、Api m 5、Api m 5.0101、Api m 6、Api m 6.0101、Api m 7、Api m 7.0101、Api m 8、Api m 8.0101、Api m 9、Api m 9.0101、Api m A1-A2、Api m A1-A2-A3、Api m蜂王漿白蛋白1、Api m蜂王漿白蛋白2、Api me 1、Api me 4)、落花生屬某些種(Ara d 2、Ara d 6、Ara f 3、Ara f 4、Ara h 1、Ara h 1.0101、Ara h 10、Ara h 10.0101、Ara h 10.0102、Ara h 11、Ara h 11.0101、Ara h 2、Ara h 2.0101、Ara h 2.0102、Ara h 2.0201、Ara h 2.0202、Ara h 3、Ara h 3.0101、Ara h 4、Ara h 4.0101、Ara h 5、Ara h 5.0101、Ara h 6、Ara h 6.0101、Ara h 7、Ara h 7.0101、Ara h 7.0201、Ara h 7.0202、Ara h 8、Ara h 8.0101、Ara h 8.0201、Ara h 9、Ara h 9.0101、Ara h 9.0201、Ara h凝集素、Ara h油質蛋白18 kD、Ara i 2、Ara i 6)、擬南芥屬某些種(Ara t 3、Ara t 8、Ara t GLP)、羊鯛屬某些種(Arc pr 1)、古河豚屬(Archaeopotamobius)某些種(Arc s 8、Arc s 8.0101)、差海扇屬(Aequipecten)某些種(Arg i 1)、銳緣壁蝨屬某些種(Arg r 1、Arg r 1.0101)、擬海鯰屬某些種(Ari fe 1)、辣根某些種(Arm r HRP)、燕麥草屬某些種(Arr e 1、Arr e 5)、蒿屬某些種(Art a 1、Art ap 1)、豐年蝦屬某些種(Art fr 1、Art fr 1.0101、Art fr 5、Art fr 5.0101)、關節桿菌屬某些種(Art gl CO)、頭癬菌屬某些種(Art gy 7)、波羅蜜屬某些種(Art h 17 kD、Art h 4)、節旋藻屬某些種(Art p1 β_藻藍素)、艾屬某些種(Art v 1、Art v 1.0101、Art v 1.0102、Art v 1.0103、Art v 1.0104、Art v 1.0105、Art v 1.0106、Art v 1.0107、Art v 2、Art v 2.0101、Art v 3、Art v 3.0101、Art v 3.0201、Art v 3.0202、Art v 3.0301、Art v 4、Art v 4.0101、Art v 4.0201、Art v 47 kD、Art v 5、Art v 5.0101、Art v 6、Art v 6.0101、Art v 60 kD)、節皮菌屬某些種(Art va 4)、蛔蟲屬某些種(Asc 1 3、Asc 1 3.0101、Asc 1 3.0102、Asc I 34 kD、Asc s 1、Asc s 1.0101、Asc s 3、Asc s 3.0101、Asc s GST)、麴菌屬某些種(Asp aw葡萄糖澱粉酶、Asp c 22、Asp f 1、Asp f 1.0101、Asp f 10、Asp f 10.0101、Asp f 11、Asp f 11.0101、Asp f 12、Asp f 12.0101、Asp f 13、Asp f 13.0101、Asp f 15、Asp f 15.0101、Asp f 16、Asp f 16.0101、Asp f 17、Asp f 17.0101、Asp f 18、Asp f 18.0101、Asp f 2、Asp f 2.0101、Asp f 22、Asp f 22.0101、Asp f 23、Asp f 23.0101、Asp f 27、Asp f 27.0101、Asp f 28、Asp f 28.0101、Asp f 29、Asp f 29.0101、Asp f 3、Asp f 3.0101、Asp f 34、Asp f 34.0101、Asp f 4、Asp f 4.0101、Asp f 5、Asp f 5.0101、Asp f 56 kD、Asp f 6、Asp f 6.0101、Asp f 7、Asp f 7.0101、Asp f 8、Asp f 8.0101、Asp f 99、Asp f 9.0101、Asp f AfCalAp、Asp f AT_V、Asp f過氧化氫酶、Asp f幾丁聚糖酶、Asp f CP、Asp f DPPV、Asp f FDH、Asp f γ_肌動蛋白、Asp f葡萄糖苷酶、Asp f GPI、Asp f GST、Asp f GT、Asp f IAO、Asp f IPMI、Asp f LPL1、Asp f LPL3、Asp f甘露糖苷酶、Asp f MDH、Asp f PL、Asp f PUP、Asp f RPS3、Asp f SXR、Asp fl 13、Asp fl 13.0101、Asp fl 18、Asp fl 2、Asp fl 21、Asp fl 3、Asp fl 4、Asp fl 7、Asp fl 8、Asp fl 9、Asp me蜂蜜麯黴蛋白酶、Asp n 14、Asp n 14.0101、Asp n 18、Asp n 18.0101、Asp n 25、Asp n 25.0101、Asp n 30、Asp n葡萄糖澱粉酶、Asp n半纖維素酶、Asp n Pectinase、Asp o 13、Asp o 13.0101、Asp o 21、Asp o 21.0101、Asp o 3、Asp o 4、Asp o 7、Asp o 8、Asp o乳糖酶、Asp o脂肪酶、Asp oc 13、Asp r 1、Asp sa AP、Asp sp葡萄糖澱粉酶、Asp sp葡萄糖氧化酶、Asp sp PL、Asp sp PME、Asp sy 13、Asp v 13、Asp v 13.0101、Asp v過氧化氫酶A、Asp v烯醇酶、Asp v GAPDH、Asp v MDH、Asp v SXR)、蘆荀屬某些種(Aspa o 1、Aspa o 1.01、Aspa o 1.02、Aspa o 17 kD、Aspa o 4)、麴菌屬某些種(Aspe ni 2、Aspe ni 3、Aspe ni 4、Aspe ni 7、Aspe ni 8、Aspe ni 9)、燕麥屬某些種(Ave s 1、Ave s 12、Ave s 13、Ave s 2、Ave s 4、Ave s 5、Ave s 7)、東風螺屬某些種(Bab ja 1)、桿菌屬某些種(Bac al枯草桿菌蛋白酶、Bac cl枯草桿菌蛋白酶、Bac I枯草桿菌蛋白酶、Bac li aA、Bac li枯草桿菌蛋白酶)、桿角屬石某些種(Bac ol 27、Bac ol 27.0101)、桿菌屬某些種(Bac sp aA1、Bac sp aA3、Bac sp去羧酶、Bac st amyM、Bac su枯草桿菌蛋白酶、Bac t Cry1Ab、Bac t Cry1Fa、Bac t Cry3Bb1、Bac t Cry9c)、海鱨屬某些種(Bag ma 1)、鱗魨屬某些種(Bal ca 1)、藤壺屬某些種(Bal r 1、Bal r 1.0101)、白僵菌屬某些種(Bea b Aid、Bea b Enol、Bea b f2、Bea b Hex)、巴西栗某些種(Ber e 1、Ber e 1.0101、Ber e 2、Ber e 2.0101)、金眼鯛屬某些種(Ber sp 1)、樺木屬某些種(Bet ab 1、Bet al 1、Bet ch 1、Bet co 1、Bet da 1、Bet gr 1、Bet hu 1、Bet le 1、Bet me 1、Bet n 1、Bet p 1、Bet pa 1、Bet po 1、Bet pu 1、Bet pu 2、Bet pu 4、Bet pu 6、Bet pu 7、Bet sc 1、Bet ut 1、Bet v 1、Bet v 1 B1-B1-B1、Bet v 1 fv Mal 4x、Bet v 1.0101、Bet v 1.0102、Bet v 1.0103、Bet v 1.0201、Bet v 1.0301、Bet v 1.0401、Bet v 1.0402、Bet v 1.0501、Bet v 1.0601、Bet v 1.0602、Bet v 1.0701、Bet v 1.0801、Bet v 1.0901、Bet v 1.1001、Bet v 1.1101、Bet v 1.1201、Bet v 1.1301、Bet v 1.1401、Bet v 1.1402、Bet v 1.1501、Bet v 1.1502、Bet v 1.1601、Bet v 1.1701、Bet v 1.1801、Bet v 1.1901、Bet v 1.2001、Bet v 1.2101、Bet v 1.2201、Bet v 1.2301、Bet v 1.2401、Bet v 1.2501、Bet v 1.2601、Bet v 1.2701、Bet v 1.2801、Bet v 1.2901、Bet v 1.3001、Bet v 1.3101、Bet v 2、Bet v 2.0101、Bet v 3、Bet v 3.0101、Bet v 4、Bet v 4.0101、Bet v 6、Bet v 6.0101、Bet v 6.0102、Bet v 7、Bet v 7.0101、Bet v 8、Bet v聚葡萄糖酶)、菾屬某些種(Beta v 1、Beta v 1.0101、Beta v 2、Beta v 2.0101)、小蠊屬某些種(Bla g 1、Bla g 1.0101、Bla g 1.0102、Bla g 1.0103、Bla g 1.0201、Bla g 1.0202、Bla g 2、Bla g 2.0101、Bla g 2.0201、Bla g 36 kD、Bla g 4、Bla g 4.0101、Bla g 4.0201、Bla g 5、Bla g 5.0101、Bla g 5.0201、Bla g 6、Bla g 6.0101、Bla g 6.0201、Bla g 6.0301、Bla g 7、Bla g 7.0101、Bla g 8、Bla g 8.0101、Bla g 9、Bla g烯醇酶、Bla g GSTD1、Bla g RACK1、Bla g TPI、Bla g胰蛋白酶、Bla g卵黃生成素)、蜚蠊屬某些種(Bla o 1、Bla o 7)、無爪蟎屬某些種(Blo t 1、Blo t 1.0101、Blo t 1.0201、Blo t 10、Blo t 10.0101、Blo t 10.0102、Blo t 11、Blo t 11.0101、Blo t 12、Blo t 12.0101、Blo t 12.0102、Blo t 13、Blo t 13.0101、Blo t 14、Blo t 15、Blo t 18、Blo t 19、Blo t 19.0101、Blo t 2、Blo t 2.0101、Blo t 2.0102、Blo t 2.0103、Blo t 20、Blo t 21、Blo t 21.0101、Blo t 3、Blo t 3.0101、Blo t 4、Blo t 4.0101、Blo t 5、Blo t 5.0101、Blo t 6、Blo t 6.0101、Blo t 7、Blo t 8、Blo t 9、Blo t HSP70)、熊蜂屬某些種(Bom ar 4、Bom hy 4、Bom p 1、Bom p 1.0101、Bom p 2、Bom p 3、Bom p 4、Bom p 4.0101、Bom t 1、Bom t 1.0101、Bom t 4、Bom t 4.0101)、家蠶屬某些種(Bomb m 1、Bomb m 1.0101、Bomb m 7、Bomb m 7.0101、Bomb m 7.0102、Bomb m 7.0103、Bomb m 7.0104、Bomb m 7.0105、Bomb m 7.0106)、牛尾壁蝨屬某些種(Boo m 1、Boo m 7、Boo m 7.0101)、牛屬某些種(Bos d 2、Bos d 2.0101、Bos d 2.0102、Bos d 2.0103、Bos d 3、Bos d 3.0101、Bos d 4、Bos d 4.0101、Bos d 5、Bos d 5.0101、Bos d 5.0102、Bos d 6、Bos d 6 (MDA)、Bos d 6.0101、Bos d 7、Bos d 7.0101、Bos d 8、Bos d 8 αS1、Bos d 8 αS2、Bos d 8 β、Bos d 8κ、Bos d α2I、Bos d α2I.0101、Bos d凝乳酶、Bos d血纖維蛋白、Bos d明膠、Bos d HG、Bos d胰島素、Bos d乳鐵蛋白、Bos d乳過氧化酶、Bos d肌紅蛋白、Bos d OBP、Bos d OSCP、Bos d卵黃高磷蛋白、Bos d PLA2、Bos d PRVB、Bos d凝血酶、Bos d TI、Bos gr ALA、Bos gr肌紅蛋白)、矛頭蝮蛇屬(Bothrops)某些種(Bot as 1、Bot at 1)、格蘭馬草屬(Bouteloua)某些種(Bou g 1)、咬蝨屬(Biting)某些種(Bov ov 1)、烏魴屬某些種(Bra du 1)、芸苔屬某些種(Bra j 1、Bra j 1.0101、Bra n 1、Bra n 1.0101、Bra n 4、Bra n 7、Bra n 8、Bra n PG、Bra ni 8、Bra o 3、Bra o 3.0101、Bra r 1、Bra r 1.0101、Bra r 2、Bra r 2.0101、Bra r 3、Bra r 4、Bra r 7)、雀麥屬某些種(Bro a 1、Bro a 4)、單鰭鱈屬某些種(Bro br 1)、雀麥屬某些種(Bro i 1、Bro i 5、Bro i 7)、血絲蟲屬某些種(Bru m 3、Bru m 3.0101、Bru m Bm33)、水牛屬某些種(Bub b ALA、Bub b BLG、Bub b酪蛋白、Bub b酪蛋白 αS1、Bub b酪蛋白 αS2、Bub b酪蛋白β、Bub b酪蛋白κ)、隱桿線蟲屬某些種(Cae b 3、Cae b 3.0101、Cae br 3、Cae br 3.0101、Cae e 3、Cae e 3.0101、Cae e 3.0102、Cae re 13、Cae re 13.0101)、木豆屬某些種(Caj c 1)、魚虱屬某些種(Cal cl 1、Cal cl 1.0101、Cal cl 1.0102)、菖蒲屬某些種(Cal le 1)、美青蟹屬某些種(Cal s 2)、駱駝屬某些種(Cam d ALA、Cam d酪蛋白、Cam d酪蛋白 αS1、Cam d酪蛋白 αS2、Cam d酪蛋白 β、Cam d酪蛋白κ)、弓背蟻屬某些種(Cam fl 7、Cam fl 7.0101)、犬屬某些種(Can f 1、Can f 1.0101、Can f 2、Can f 2.0101、Can f 3、Can f 3.0101、Can f 4、Can f 4.0101、Can f 5、Can f 5.0101、Can f 6、Can f 6.0101、Can f Feld1樣、Can f Homs2樣、Can f卵黃高磷蛋白、Can f TCTP)、疣鱗魨屬某些種(Can ma 1)、黃道蟹屬某些種(Can mg 2、Can p 1)、大麻屬某些種(Can s 3)、念珠菌屬某些種(Cand a 1、Cand a 1.0101、Cand a 3、Cand a 3.0101、Cand a CAAP、Cand a CyP、Cand a烯醇酶、Cand a FPA、Cand a MnSOD、Cand a PGK、Cand b 2、Cand b 2.0101、Cand b FDH、Cand r脂肪酶)、辣椒某些種(Cap a 1、Cap a 1.0101、Cap a 17 kD、Cap a 2、Cap a 2.0101、Cap a 30 kD、Cap a聚葡萄糖酶、Cap ch 17 kD)、麥稈蟲某些種(Cap e 1)、山羊屬某些種(Cap h ALA、Cap h BLG、Cap h酪蛋白、Cap h酪蛋白 αS1、Cap h酪蛋白 αS2、Cap h酪蛋白 β、Cap h酪蛋白κ、Cap h GSA)、頭狀花某些種(Cap m 1)、鯽屬某些種(Car au 1)、鵝耳櫪屬某些種(Car b 1、Car b 1.0101、Car b 1.0102、Car b 1.0103、Car b 1.0104、Car b 1.0105、Car b 1.0106、Car b 1.0107、Car b 1.0108、Car b 1.0109、Car b 1.0110、Car b 1.0111、Car b 1.0112、Car b 1.0113、Car b 1.0201、Car b 1.0301、Car b 1.0302、Car b 2、Car b 4)、鯵屬某些種(Car cr 1)、山核桃屬某些種(Car i 1、Car i 1.0101、Car i 2、Car i 4、Car i 4.0101)、真蟹屬某些種(Car ma 2)、魚尾葵屬某些種(Car mi 2)、番瓜樹屬某些種(Car p 1、Car p幾丁質酶、Car p木瓜凝乳酶、Car p蛋白內切酶)、栗屬某些種(Cas c 24 kD、Cas s 1、Cas s 1.0101、Cas s 1.0102、Cas s 1.0103、Cas s 2、Cas s 5、Cas s 5.0101、Cas s 8、Cas s 8.0101、Cas s 9、Cas s 9.0101)、長春花屬某些種(Cat r 1、Cat r 1.0101、Cat r 17 kD、Cat r 2)、莖方頭魚屬某些種(Cau ch 1)、豚鼠屬某些種(Cav p 1、Cav p 1.0101、Cav p 2、Cav p 2.0101、Cav p 3、Cav p 3.0101、Cav p明膠、Cav p GSA)、鋸鮨屬某些種(Cen s 1)、鱠屬某些種(Cep so 1)、蟳屬某些種(Cha f 1、Cha f 1.0101)、棘白鯧屬某些種(Cha fa 1)、扁柏屬某些種(Cha o 1、Cha o 1.0101、Cha o 2、Cha o 2.0101)、藜屬某些種(Che a 1、Che a 1.0101、Che a 2、Che a 2.0101、Che a 3、Che a 3.0101)、搖蚊屬某些種(Chi k 1、Chi k 10、Chi k 10.0101)、絨鼠屬某些種(Chi I 21 kD_a、Chi I 21 kD_b)、雪蟹屬某些種(Chi o 1、Chi o 1.0101、Chi o 2、Chi o 4、Chi o 6、Chi o α_肌動蛋白、Chi o SERCA)、搖蚊屬某些種(Chi t 1、Chi t 1.0101、Chi t 1.0201、Chi t 2、Chi t 2.0101、Chi t 2.0102、Chi t 3、Chi t 3.0101、Chi t 4、Chi t 4.0101、Chi t 5、Chi t 5.0101、Chi t 6、Chi t 6.0101、Chi t 6.0201、Chi t 7、Chi t 7.0101、Chi t 8、Chi t 8.0101、Chi t 9、Chi t 9.0101)、錦海扇蛤屬某些種(Chl n 1)、草雁屬某些種(Chl pi 1)、嗜渣蟎屬某些種(Cho a 10)、葉甲屬某些種(Chr tr 7、Chr tr 7.0101)、鷹嘴豆屬某些種(Cic a 2S白蛋白、Cic a白蛋白)、菊苣屬某些種(Cic i 1)、臭蟲屬某些種(Cim I載氮蛋白)、柑橘屬某些種(Cit I 1、Cit I 3、Cit I 3.0101)、西瓜屬某些種(Cit la 2、Cit la MDH、Cit la TPI)、柑橘屬某些種(Cit r 3、Cit r 3.0101、Cit s 1、Cit s 1.0101、Cit s 2、Cit s 2.0101、Cit s 3、Cit s 3.0101、Cit s 3.0102、Cit s IFR)、分枝孢子菌屬某些種(Cla c 14、Cla c 14.0101、Cla c 9、Cla c 9.0101、Cla h 1、Cla h 10、Cla h 10.0101、Cla h 12、Cla h 12.0101、Cla h 2、Cla h 2.0101、Cla h 42 kD、Cla h 5、Cla h 5.0101、Cla h 6、Cla h 6.0101、Cla h 7、Cla h 7.0101、Cla h 8、Cla h 8 CSP、Cla h 8.0101、Cla h 9、Cla h 9.0101、Cla h abH、Cla h GST、Cla h HCh1、Cla h HSP70、Cla h NTF2、Cla h TCTP)、梭狀芽孢桿菌屬某些種(Clo hi膠原酶、Clo t類毒素)、鯡屬某些種(Clu h 1、Clu h 1.0101、Clu h 1.0201、Clu h 1.0301)、椰子屬某些種(Coc n 2、Coc n 4、Coc n 5)、球孢子菌屬某些種(Coc po 8)、咖啡樹屬某些種(Cof a 1、Cof a 1.0101)、鴿屬某些種(Col I PSA)、一夜蕈屬某些種(Cop c 1、Cop c 1.0101、Cop c 2、Cop c 2.0101、Cop c 3、Cop c 3.0101、Cop c 4、Cop c 5、Cop c 5.0101、Cop c 6、Cop c 7、Cop c 7.0101)、榛屬某些種(Cor a 1、Cor a 1.0101、Cor a 1.0102、Cor a 1.0103、Cor a 1.0104、Cor a 1.0201、Cor a 1.0301、Cor a 1.0401、Cor a 1.0402、Cor a 1.0403、Cor a 1.0404、Cor a 10、Cor a 10.0101、Cor a 11、Cor a 11.0101、Cor a 12、Cor a 12.0101、Cor a 13、Cor a 13.0101、Cor a 14、Cor a 14.0101、Cor a 2、Cor a 2.0101、Cor a 2.0102、Cor a 8、Cor a 8.0101、Cor a 9、Cor a 9.0101)、棒狀桿菌屬某些種(Cor d Toxoid)、榛屬某些種(Cor he 1)、鯕鰍屬某些種(Cor hi 1)、胡荽屬某些種(Cor s 1、Cor s 11 kD、Cor s 2)、鋪地蜈蚣屬某些種(Cot I 3)、褐蝦屬某些種(Cra c 1、Cra c 1.0101、Cra c 2、Cra c 2.0101、Cra c 4、Cra c 4.0101、Cra c 5、Cra c 5.0101、Cra c 6、Cra c 6.0101、Cra c 8、Cra c 8.0101)、巨蠣屬某些種(Cra g 1)、倉鼠屬某些種(Cri c HSA)、Crivellia某些種(Cri pa 1)、番紅花屬某些種(Cro s 1、Cro s 1.0101、Cro s 2、Cro s 2.0101、Cro s 3、Cro s 3.01、Cro s 3.02)、柳杉屬某些種(Cry j 1、Cry j 1.0101、Cry j 1.0102、Cry j 1.0103、Cry j 2、Cry j 2.0101、Cry j 2.0102、Cryj 3、Cryj 3.1、Cryj 3.2、Cryj 3.3、Cryj 3.4、Cryj 3.5、Cryj 3.6、Cryj 3.7、Cryj 3.8、Cryj 4、Cryj AP、Cry j幾丁質酶、Cry j CPA9、Cry j IFR、Cry j LTP、Cry j P1-P2)、叢赤殼屬某些種(Cry p AP)、櫛頭蚤屬某些種(Cte f 1、Cte f 1.0101、Cte f 2、Cte f 2.0101、Cte f 3、Cte f 3.0101)、草魚屬某些種(Cte id 1)、甜瓜屬某些種(Cuc m 1、Cuc m 1.0101、Cuc m 2、Cuc m 2.0101、Cuc m 3、Cuc m 3.0101、Cuc m Lec17、Cuc m MDH)、南瓜屬某些種(Cuc ma 18 kD、Cuc ma 2、Cuc p 2、Cuc p AscO)、甜瓜屬某些種(Cuc s 2)、糠蚊屬某些種(Cul n 1、Cul n 10、Cul n 11、Cul n 2、Cul n 3、Cul n 4、Cul n 5、Cul n 6、Cul n 7、Cul n 8、Cul n 9、Cul n HSP70)、家蚊屬某些種(Cul q 28 kD、Cul q 35 kD、Cul q 7、Cul q 7.0101、Cul q 7.0102)、糠蚊屬某些種(Cul so 1)、小茴香屬某些種(Cum c 1、Cum c 2)、柏木屬某些種(Cup a 1、Cup a 1.0101、Cup a 1.02、Cup a 2、Cup a 3、Cup a 4、Cup a 4.0101、Cup s 1、Cup s 1.0101、Cup s 1.0102、Cup s 1.0103、Cup s 1.0104、Cup s 1.0105、Cup s 3、Cup s 3.0101、Cup s 3.0102、Cup s 3.0103、Cup s 8)、旋孢腔菌屬某些種(Cur I 1、Cur I 1.0101、Cur I 2、Cur I 2.0101、Cur I 3、Cur I 3.0101、Cur I 4、Cur I 4.0101、Cur I ADH、Cur I GST、Cur I MnSOD、Cur I Oryzin、Cur I Trx、Cur I ZPS1)、藍翅雁(Cyanochen)某些種(Cya cy 1)、犬牙石首魚屬某些種(Cyn ar 1)、洋狗尾草屬某些種(Cyn cr 1、Cyn cr 5)、狗牙根屬某些種(Cyn d 1、Cyn d 1.0101、Cyn d 1.0102、Cyn d 1.0103、Cyn d 1.0104、Cyn d 1.0105、Cyn d 1.0106、Cyn d 1.0107、Cyn d 1.0201、Cyn d 1.0202、Cyn d 1.0203、Cyn d 1.0204、Cyn d 10、Cyn d 11、Cyn d 12、Cyn d 12.0101、Cyn d 13、Cyn d 15、Cyn d 15.0101、Cyn d 2、Cyn d 22、Cyn d 22.0101、Cyn d 23、Cyn d 23.0101、Cyn d 24、Cyn d 24.0101、Cyn d 4、Cyn d 5、Cyn d 6、Cyn d 7、Cyn d 7.0101)、犬牙石首魚屬某些種(Cyn ne 1)、草原犬鼠屬某些種(Cyn sp脂質運載蛋白)、鯉屬某些種(Cyp c 1、Cyp c 1.01、Cyp c 1.02)、山蝰屬某些種(Dab ru 1)、鴨茅屬某些種(Dac g 1、Dac g 1.01、Dac g 1.0101、Dac g 1.02、Dac g 12、Dac g 13、Dac g 2、Dac g 2.0101、Dac g 3、Dac g 3.0101、Dac g 4、Dac g 4.0101、Dac g 5、Dac g 5.0101、Dac g 7)、黇鹿屬某些種(Dam d CSA)、丹尼魚某些種(Dan re 1、Dan re 2、Dan re α2I、Dan re CK)、土魟屬某些種(Das ak 1、Das am 1、Das sa 1)、胡蘿蔔屬某些種(Dau c 1、Dau c 1.0101、Dau c 1.0102、Dau c 1.0103、Dau c 1.0104、Dau c 1.0105、Dau c 1.0201、Dau c 1.0301、Dau c 3、Dau c 4、Dau c 4.0101、Dau c CyP)、單離鰭鰺屬某些種(Dec ru 1)、棘穗軟珊瑚某些種(Den n 1、Den n 1.0101)、表皮蟎屬某些種(Der f 1、Der f 1.0101、Der f 1.0102、Der f 1.0103、Der f 1.0104、Der f 1.0105、Der f 1.0106、Der f 1.0107、Der f 1.0108、Der f 1.0109、Der f 1.0110、Der f 10、Der f 10.0101、Der f 10.0102、Der f 11、Der f 11.0101、Der f 13、Der f 13.0101、Der f 14、Der f 14.0101、Der f 15、Der f 15.0101、Der f 16、Der f 16.0101、Der f 17、Der f 17.0101、Der f 18、Der f 18.0101、Der f 2、Der f 2.0101、Der f 2.0102、Der f 2.0103、Der f 2.0104、Der f 2.0105、Der f 2.0106、Der f 2.0107、Der f 2.0108、Der f 2.0109、Der f 2.0110、Der f 2.0111、Der f 2.0112、Der f 2.0113、Der f 2.0114、Der f 2.0115、Der f 2.0116、Der f 2.0117、Der f 20、Der f 21、Der f 22、Der f 22.0101、Der f 3、Der f 3.0101、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 6.0101、Der f 7、Der f 7.0101、Der f 8、Der f 9、Der f HSP70)、刺皮蟎屬某些種(Der g 10、Der g 10.0101)、表皮蟎屬某些種(Der m 1、Der m 1.0101、Der p 1、Der p 1.0101、Der p 1.0102、Der p 1.0103、Der p 1.0104、Der p 1.0105、Der p 1.0106、Der p 1.0107、Der p 1.0108、Der p 1.0109、Der p 1.0110、Der p 1.0111、Der p 1.0112、Der p 1.0113、Der p 1.0114、Der p 1.0115、Der p 1.0116、Der p 1.0117、Der p 1.0118、Der p 1.0119、Der p 1.0120、Der p 1.0121、Der p 1.0122、Der p 1.0123、Der p 1.0124、Der p 10、Der p 10.0101、Der p 10.0102、Der p 10.0103、Der p 11、Der p 11.0101、Der p 13、Der p 14、Der p 14.0101、Der p 15、Der p 18、Der p 2、Der p 2.0101、Der p 2.0102、Der p 2.0103、Der p 2.0104、Der p 2.0105、Der p 2.0106、Der p 2.0107、Der p 2.0108、Der p 2.0109、Der p 2.0110、Der p 2.0111、Der p 2.0112、Der p 2.0113、Der p 2.0114、Der p 2.0115、Der p 20、Der p 20.0101、Der p 21、Der p 21.0101、Der p 23、Der p 23.0101、Der p 3、Der p 3.0101、Der p 4、Der p 4.0101、Der p 5、Der p 5.0101、Der p 5.0102、Der p 6、Der p 6.0101、Der p 7、Der p 7.0101、Der p 8、Der p 8.0101、Der p 9、Der p 9.0101、Der p 9.0102、Der p P1-P2、Der p P2-P1、Der s 1、Der s 2、Der s 3)、石竹屬某些種(Dia c RIP)、芒萁屬某些種(Dic I 2S白蛋白)、柿樹屬某些種(Dio k 17 kD、Dio k 4、Dio k IFR)、山藥屬某些種(Dio p TSP)、重牙鯛屬某些種(Dip ho 1)、鹽草屬某些種(Dis s 1、Dis s 7)、海鮒屬某些種(Dit te 1)、長黃胡蜂屬某些種(Dol a 1、Dol a 2、Dol a 5、Dol a 5.0101)、扁豆屬某些種(Dol b凝集素)、長黃胡蜂屬某些種(Dol m 1、Dol m 1.0101、Dol m 1.02、Dol m 2、Dol m 2.0101、Dol m 5、Dol m 5.0101、Dol m 5.02)、果蠅屬某些種(Dro an 7、Dro an 7.0101、Dro er 7、Dro er 7.0101、Dro er 7.0102、Dro gr 7、Dro gr 7.0101、Dro gr 7.0102、Dro m 7、Dro m 7.0101、Dro m 7.0102、Dro m 7.0103、Dro m 7.0104、Dro m 7.0105、Dro m 7.0106、Dro m 7.0107、Dro m 7.0108、Dro m 7.0109、Dro m 7.0110、Dro m 7.0111、Dro m 7.0112、Dro m 7.0113、Dro m 9、Dro m MnSOD、Dro mo 7、Dro mo 7.0101、Dro pp 7、Dro pp 7.0101、Dro se 7、Dro se 7.0101、Dro si 7、Dro si 7.0101、Dro si 7.0102、Dro vi 7、Dro vi 7.0101、Dro wi 7、Dro wi 7.0101、Dro y 7、Dro y 7.0101、Dro y 7.0102、Dro y 7.0103)、藍薊屬某些種(Ech p細胞色素 C)、油棕屬某些種(Ela g 2、Ela g Bd31 kD)、海鰱屬某些種(Elo sa 1)、埃裡格孢屬某些種(Emb a 1、Emb i 1、Emb nz 1、Emb t 1)、鯷屬某些種(Eng e 1)、章魚屬某些種(Ent d 1)、石斑屬某些種(Epi bl 1、Epi co 1、Epi fl 1、Epi mc 1、Epi mo 1)、附球菌屬某些種(Epi p 1、Epi p 1.0101、Epi p 12 kD、Epi p GST)、石斑魚屬某些種(Epi po 1、Epi un 1)、木賊屬某些種(Equ a 17 kD)、馬屬某些種(Equ as 4、Equ as DSA、Equ bu 4、Equ c 1、Equ c 1.0101、Equ c 2、Equ c 2.0101、Equ c 2.0102、Equ c 3、Equ c 3.0101、Equ c 4、Equ c 4.0101、Equ c 5、Equ c 5.0101、Equ c ALA、Equ c BLG、Equ c酪蛋白、Equ c酪蛋白 β、Equ c酪蛋白κ、Equ c PRVB、Equ he 4、Equ z ZSA)、毛甲蟹屬某些種(Eri i 1、Eri i 1.0101、Eri i 1.0102)、絨螯蟹屬某些種(Eri s 1、Eri s 1.0101、Eri s 2)、歐文氏菌屬某些種(Erw ch天冬醯胺酸酶)、埃希氏桿菌屬某些種(Esc c天冬醯胺酸酶、Esc c β GAL)、狗魚屬某些種(Eso I 1)、磷蝦屬某些種(Eup p 1、Eup p 1.0101)、磷蝦屬某些種(Eup s 1、Eup s 1.0101)、嗜黴蟎屬某些種(Eur m 1、Eur m 1.0101、Eur m 1.0102、Eur m 1.0103、Eur m 10、Eur m 14、Eur m 14.0101、Eur m 2、Eur m 2.0101、Eur m 2.0102、Eur m 3、Eur m 3.0101、Eur m 4、Eur m 4.0101)、犁齒鯛屬某些種(Evy j 1)、蕎麥屬某些種(Fag e 1、Fag e 1.0101、Fag e 10 kD、Fag e 19 kD、Fag e 2、Fag e 2.0101、Fag e TI)、山毛櫸屬某些種(Fag s 1、Fag s 1.0101、Fag s 2、Fag s 4)、蕎麥屬某些種(Fag t 1、Fag t 10 kD、Fag t 2、Fag t 2.0101)、貓屬某些種(Fel d 1、Fel d 1.0101、Fel d 2、Fel d 2.0101、Fel d 3、Fel d 3.0101、Fel d 4、Fel d 4.0101、Fel d 5、Fel d 5.0101、Fel d 6、Fel d 6.0101、Fel d 7、Fel d 7.0101、Fel d 8、Fel d 8.0101、Fel d IgG)、明對蝦屬某些種(Fen c 1、Fen c 2、Fen me 1、Fen me 1.0101)、牛毛草屬某些種(Fes e 1、Fes e 13、Fes e 4、Fes e 5、Fes e 7、Fes p 1、Fes p 13、Fes p 4、Fes p 4.0101、Fes p 5、Fes r 1、Fes r 5)、無花果屬某些種(Fic c 17 kD、Fic c 4、Fic c無花果蛋白酶)、茴香屬某些種(Foe v 1、Foe v 2)、連翹屬某些種(For s 1)、鋏蠓屬某些種(For t 1、For t 1.0101、For t 2、For t 2.0101、For t 7、For t FPA、For t肌凝蛋白、For t TPI)、草莓屬某些種(Fra a 1、Fra a 1.0101、Fra a 3、Fra a 3.0101、Fra a 3.0102、Fra a 3.0201、Fra a 3.0202、Fra a 3.0203、Fra a 3.0204、Fra a 3.0301、Fra a 4、Fra a 4.0101、Fra c 1)、白蠟樹屬某些種(Fra e 1、Fra e 1.0101、Fra e 1.0102、Fra e 1.0201、Fra e 12、Fra e 2、Fra e 3、Fra e 9)、草莓屬某些種(Fra v 1)、鐮菌屬某些種(Fus c 1、Fus c 1.0101、Fus c 2、Fus c 2.0101、Fus c 3、Fus s 1、Fus s 45 kD、Fus sp脂肪酶)、鱈屬某些種(Gad c 1、Gad c 1.0101、Gad c APDH、Gad m 1、Gad m 1.0101、Gad m 1.0102、Gad m 1.0201、Gad m 1.0202、Gad m 45 kD、Gad m明膠、Gad ma 1)、原雞屬某些種(Gal d 1、Gal d 1.0101、Gal d 2、Gal d 2.0101、Gal d 3、Gal d 3.0101、Gal d 4、Gal d 4.0101、Gal d 5、Gal d 5.0101、Gal d 6、Gal d 6.0101、Gal d Apo I、Gal d Apo VI、Gal d GPI、Gal d HG、Gal d IgY、Gal d L-PGDS、Gal d Ovo黏液素、Gal d卵黃高磷蛋白、Gal d PRVB、Gal la 4)、蠟蛾屬某些種(Gal m 18 kD、Gal m 24 kD)、原雞屬某些種(Gal so 4)、鉤蝦屬某些種(Gam s TM)、白樹屬某些種(Gel m RIP)、澤蟹屬某些種(Geo de 1)、舌蠅屬某些種(Glo m 5、Glo m 5.0101、Glo m 7、Glo m 7.0101、Glo m 7.0102、Glo m 7.0103)、大豆屬某些種(Gly a Bd30K、Gly ar Bd30K、Gly ca Bd30K、Gly cl Bd30K、Gly cu Bd30K、Gly cy Bd30K)、食甜蟎屬某些種(Gly d 10、Gly d 10.0101、Gly d 13、Gly d 2、Gly d 2.0101、Gly d 2.0201、Gly d 2.03、Gly d 2/Lep d 2 L1、Gly d 2/Lep d 2 L2、Gly d 2/Lep d 2 L3、Gly d 2/Lep d 2 L4、Gly d 2/Lep d 2 R1、Gly d 2/Lep d 2 R2、Gly d 2/Lep d 2 R3、Gly d 2/Lep d 2 R4、Gly d 2/Lep d 2 R5、Gly d 20、Gly d 3、Gly d 5、Gly d 5.01、Gly d 5.02、Gly d 7、Gly d 8)、大豆屬某些種(Gly f Bd30K、Gly I Bd30K、Gly m 1、Gly m 1.0101、Gly m 1.0102、Gly m 2、Gly m 2.0101、Gly m 2S白蛋白、Gly m 3、Gly m 3.0101、Gly m 3.0102、Gly m 39 kD、Gly m 4、Gly m 4.0101、Gly m 5、Gly m 5.0101、Gly m 5.0201、Gly m 5.0301、Gly m 5.0302、Gly m 50 kD、Gly m 6、Gly m 6.0101、Gly m 6.0201、Gly m 6.0301、Gly m 6.0401、Gly m 6.0501、Gly m 68 kD、Gly m凝集素、Gly m Bd28K、Gly m Bd30K、Gly m Bd60K、Gly m CPI、Gly m EAP、Gly m TI、Gly mi Bd30K、Gly s Bd30K、Gly t Bd30K、Gly to Bd30K)、棉屬某些種(Gos h蠶豆球蛋白)、嗜血桿菌屬某些種(Hae in P6)、血蜱屬某些種(Hae I 7、Hae I 7.0101、Hae q 7、Hae q 7.0101)、鮑魚屬某些種(Hal a 1、Hal d 1、Hal di 1、Hal di PM、Hal m 1、Hal m 1.0101、Hal r 1、Hal r 49 kD、Hal ru 1)、瓢蟲屬某些種(Har a 1、Har a 1.0101、Har a 2、Har a 2.0101)、掠猛蟻屬某些種(Har sa 7、Har sa 7.0101、Har sa 7.0102)、向日葵屬某些種(Hel a 1、Hel a 1.0101、Hel a 2、Hel a 2.0101、Hel a 2S白蛋白、Hel a 3、Hel a 3.0101、Hel a 4)、蝸牛屬某些種(Hel ap 1、Hel as 1、Hel as 1.0101)、螺旋線蟲某些種(Hel p 3、Hel p 3.0101)、向日葵屬某些種(Hel tu 1)、銀花鮨屬某些種(Hem le 1)、角螺屬某些種(Hem t 1)、異皮線蟲屬某些種(Het g 3、Het g 3.0101)、橡膠樹屬某些種(Hev b 1、Hev b 1.0101、Hev b 10、Hev b 10.0101、Hev b 10.0102、Hev b 10.0103、Hev b 11、Hev b 11.0101、Hev b 11.0102、Hev b 12、Hev b 12.0101、Hev b 13、Hev b 13.0101、Hev b 14、Hev b 14.0101、Hev b 2、Hev b 2.0101、Hev b 3、Hev b 3.0101、Hev b 4、Hev b 4.0101、Hev b 5、Hev b 5.0101、Hev b 6、Hev b 6.01、Hev b 6.02、Hev b 6.0202、Hev b 6.03、Hev b 7、Hev b 7.01、Hev b 7.02、Hev b 7.D2、Hev b 7.S2、Hev b 8、Hev b 8.0101、Hev b 8.0102、Hev b 8.0201、Hev b 8.0202、Hev b 8.0203、Hev b 8.0204、Hev b 9、Hev b 9.0101、Hev b檸檬酸結合蛋白、Hev b GAPDH、Hev b HSP80、Hev b IFR、Hev b蛋白酶體次單元、Hev b旋轉異構酶、Hev b SPI、Hev b Trx、Hev b UDPGP)、六線魚屬某些種(Hex ot 1)、庸鰈屬某些種(Hip h 1)、擬庸鰈屬某些種(Hip pl 1)、庸鰈屬某些種(Hip st 1)、水蛭屬某些種(Hir me Hirudin)、絨毛草屬某些種(Hol I 1、Hol I 1.0101、Hol I 1.0102、Hol I 2、Hol I 4、Hol I 5、Hol I 5.0101、Hol I 5.0201)、Holocnemus某些種(Hol p1 9、Hol p1血藍蛋白)、螯龍蝦屬某些種(Hom a 1、Hom a 1.0101、Hom a 1.0102、Hom a 1.0103、Hom a 3、Hom a 3.0101、Hom a 4、Hom a 6、Hom a 6.0101、Hom g 1、Hom g 2)、人類某些種(Hom s 1、Hom s 1.0101、Hom s 2、Hom s 2.0101、Hom s 3、Hom s 3.0101、Hom s 4、Hom s 4.0101、Hom s 5、Hom s 5.0101、Hom s AAT、Hom s ACTH、Hom s阿達木單抗、Hom s ALA、Hom s α_肌動蛋白、Hom s α-半乳糖苷酶、Hom s APDH、Hom s芳基硫酸酯酶 B、Hom s酪蛋白、Hom s CyP A、Hom s CyP B、Hom s CyP C、Hom s DSF70、Hom s DSG3、Hom s eIF6、Hom s依那西普(Etanercept)、Hom s因子IX、Hom s因子VII、Hom s因子VIII、Hom s G-CSF、Hom s葡萄糖腦苷脂酶、Hom s葡萄糖苷酶、Hom s HLA-DR-α、Hom s HSA、Hom s艾杜糖醛酸酶、Hom s艾度硫酸酯酶、Hom s IgA、Hom s胰島素、Hom s乳鐵蛋白、Hom s 層連結蛋白γ_2、Hom s MnSOD、Hom s催產素、Hom s P2、Hom s卵黃高磷蛋白、Hom s抑制蛋白、Hom s PSA、Hom s RP1、Hom s TCTP、Hom s TL、Hom s TPA、Hom s TPO、Hom s轉醛醇酶、Hom s Trx、Hom s微管蛋白-α、Hom s/Mus m巴利昔單抗、Hom s/Mus m西妥昔單抗、Hom s/Mus m西妥昔單抗(Gal-Gal)、Hom s/Mus m英夫利昔、Hom s/Mus m那他珠單抗、Hom s/Mus m奧馬珠單抗、Hom s/Mus m帕利珠單抗、Hom s/Mus m利妥昔單抗、Hom s/Mus m托珠單抗、Hom s/Mus m曲妥珠單抗)、棘胸鯛屬某些種(Hop a 1)、大麥屬某些種(Hor v 1、Hor v 12、Hor v 12.0101、Hor v 13、Hor v 14、Hor v 15、Hor v 15.0101、Hor v 16、Hor v 16.0101、Hor v 17、Hor v 17.0101、Hor v 18 kD、Hor v 2、Hor v 21、Hor v 21.0101、Hor v 28、Hor v 33、Hor v 4、Hor v 5、Hor v 5.0101、Hor v BDAI、Hor v BTI)、腐殖黴屬某些種(Hum in纖維素酶)、蛇麻屬某些種(Hum j 1、Hum j 1.0101、Hum j 10 kD、Hum j 2)、鰉屬某些種(Hus h 1)、量天尺屬某些種(Hyl un LTP)、膜首鱈屬某些種(Hym st 1)、櫛鯧屬某些種(Hyp by 1)、鰱屬某些種(Hyp mo 1)、鰱屬某些種(Hyp no 1)、真鮰屬某些種(Ict fu 1、Ict p 1)、白茅屬某些種(Imp c 4、Imp c 5、Imp c VIIIel)、真壁虱屬某些種(Ixo r 2、Ixo sc 7、Ixo sc 7.0101)、岩龍蝦屬某些種(Jas la 1、Jas la 1.0101、Jas la 1.0102)、胡桃屬某些種(Jug ca 1、Jug ca 2、Jug ci 1、Jug ci 2、Jug n 1、Jug n 1.0101、Jug n 2、Jug n 2.0101、Jug r 1、Jug r 1.0101、Jug r 2、Jug r 2.0101、Jug r 3、Jug r 3.0101、Jug r 4、Jug r 4.0101、Jug r 5)、刺柏屬某些種(Jun a 1、Jun a 1.0101、Jun a 1.0102、Jun a 2、Jun a 2.0101、Jun a 3、Jun a 3.0101、Jun c 1、Jun o 1、Jun o 4、Jun o 4.0101、Jun r 3、Jun r 3.1、Jun r 3.2、Jun v 1、Jun v 1.0101、Jun v 1.0102、Jun v 3、Jun v 3.0101、Jun v 3.0102、Jun v 4)、鰹屬某些種(Kat p 1)、舵魚屬某些種(Kyp se 1)、毛唇隆頭魚屬某些種(Lac ma 1)、巨蝮屬某些種(Lac mu 1)、萵苣屬某些種(Lac s 1、Lac s 1.0101)、河魨屬某些種(Lag la 1)、鷗屬某些種(Lar a 1、Lar a 2、Lar a 3)、黃魚屬某些種(Lar po 1)、尖吻鱸屬某些種(Lat c 1)、花鱸屬某些種(Lat ja 1)、香豌豆某些種(Lat oc凝集素)、平口石首魚屬某些種(Lei xa 1)、扁豆某些種(Len c 1、Len c 1.0101、Len c 1.0102、Len c 1.0103、Len c 2、Len c 2.0101、Len c 3、Len c 3.0101、Len c凝集素)、美洲豹貓某些種(Leo p 1)、蟎屬某些種(Lep d 10、Lep d 10.0101、Lep d 12、Lep d 13、Lep d 13.0101、Lep d 2、Lep d 2.0101、Lep d 2.0102、Lep d 2.0201、Lep d 2.0202、Lep d 3、Lep d 39 kD、Lep d 5、Lep d 5.0101、Lep d 5.0102、Lep d 5.0103、Lep d 7、Lep d 7.0101、Lep d 8、Lep d α微管蛋白)、太陽魚屬某些種(Lep gi 1)、馬鮁屬某些種(Lep i 1)、太陽魚屬某些種(Lep ma 1)、衣魚屬某些種(Lep s 1、Lep s 1.0101、Lep s 1.0102)、瘡痂魚虱屬某些種(Lep sa 1、Lep sa 1.0101、Lep sa 1.0102、Lep sa 1.0103)、藪貓屬某些種(Lep se 1)、鱗鮃屬某些種(Lep w 1、Lep w 1.0101)、田鼈屬某些種(Let in 7、Let in 7.0101、Let in 7.0102)、雅羅魚屬某些種(Leu ce 1)、李維菌屬某些種(Lew in 1)、女貞屬某些種(Lig v 1、Lig v 1.0101、Lig v 1.0102、Lig v 2)、百合屬某些種(Lil I 2、Lil I PG)、黃蓋鰈屬某些種(Lim fe 1)、大頭蛙屬某些種(Lim m 1)、鱟屬某些種(Lim p 1、Lim p 1.0101、Lim p 2、Lim p LPA)、書虱屬某些種(Lip b 1、Lip b 1.0101)、荔枝屬某些種(Lit c 1、Lit c 1.0101、Lit c IFR、Lit c TPI)、牛蛙屬某些種(Lit ca 1)、濱對蝦屬某些種(Lit se 1、Lit v 1、Lit v 1.0101、Lit v 2、Lit v 2.0101、Lit v 3、Lit v 3.0101、Lit v 4、Lit v 4.0101)、絲蟲某些種(Loa lo 3、Loa lo 3.0101)、松鯛屬某些種(Lob su 1)、蝗蟲屬某些種(Loc m 7、Loc m 7.0101)、魷魚屬某些種(Lol b 1、Lol e 1)、黑麥草屬某些種(Lol m 2、Lol m 5、Lol p 1、Lol p 1.0101、Lol p 1.0102、Lol p 1.0103、Lol p 10、Lol p 11、Lol p 11.0101、Lol p 12、Lol p 13、Lol p 2、Lol p 2.0101、Lol p 3、Lol p 3.0101、Lol p 4、Lol p 4.0101、Lol p 5、Lol p 5.0101、Lol p 5.0102、Lol p 7、Lol p CyP、Lol p FT、Lol p豆球蛋白)、蠶蛾屬某些種(Lon o 7、Lon o 7.0101)、秋沙鴨屬某些種(Lop cu 1)、鳳頭鴨屬某些種(Lop sp 1)、羽扇豆屬某些種(Lup a 1、Lup a α_羽扇豆蛋白、Lup a δ_羽扇豆蛋白、Lup a γ_羽扇豆蛋白、Lup an 1、Lup an 1.0101、Lup an α_羽扇豆蛋白、Lup an δ_羽扇豆蛋白、Lup an γ_羽扇豆蛋白、Lup I 17 kD)、笛鯛屬某些種(Lut a 1、Lut c 1、Lut cy 1、Lut gr 1、Lut gu 1、Lut jo 1)、獺蛤屬某些種(Lut p 1)、笛鯛屬某些種(Lut pu 1、Lut sy 1)、番茄某些種(Lyc e 1、Lyc e 1.0101、Lyc e 11S球蛋白、Lyc e 2、Lyc e 2.0101、Lyc e 2.0102、Lyc e 3、Lyc e 3.0101、Lyc e 4、Lyc e 4.0101、Lyc e ARP60S、Lyc e幾丁質酶、Lyc e聚葡萄糖酶、Lyc e過氧化酶、Lyc e PG、Lyc e PME、Lyc e PR23、Lyc e Vicilin)、曼粉蚧屬某些種(Mac h 7、Mac h 7.0101)、尖尾無鬚鱈屬某些種(Mac ma 1、Mac n 1)、美國刺桑屬某些種(Mac po 17 kD)、沼蝦屬某些種(Mac ro 1、Mac ro 1.0101、Mac ro 血藍蛋白)、大袋鼠屬某些種(Macr s明膠)、蘋果屬某些種(Mal d 1、Mal d 1.0101、Mal d 1.0102、Mal d 1.0103、Mal d 1.0104、Mal d 1.0105、Mal d 1.0106、Mal d 1.0107、Mal d 1.0108、Mal d 1.0109、Mal d 1.0201、Mal d 1.0202、Mal d 1.0203、Mal d 1.0204、Mal d 1.0205、Mal d 1.0206、Mal d 1.0207、Mal d 1.0208、Mal d 1.0301、Mal d 1.0302、Mal d 1.0303、Mal d 1.0304、Mal d 1.0401、Mal d 1.0402、Mal d 1.0403、Mal d 2、Mal d 2.0101、Mal d 3、Mal d 3.0101、Mal d 3.0102、Mal d 3.0201、Mal d 3.0202、Mal d 3.0203、Mal d 4、Mal d 4.0101、Mal d 4.0102、Mal d 4.0201、Mal d 4.0202、Mal d 4.0301、Mal d 4.0302)、金虎尾屬某些種(Mal g 4、Mal g Hevein)、蘋果屬某些種(Mal p 1)、馬拉色菌屬某些種(Mala f 2、Mala f 2.0101、Mala f 3、Mala f 3.0101、Mala f 4、Mala f 4.0101、Mala g 10、Mala s 1、Mala s 1.0101、Mala s 10、Mala s 10.0101、Mala s 11、Mala s 11.0101、Mala s 12、Mala s 12.0101、Mala s 13、Mala s 13.0101、Mala s 5、Mala s 5.0101、Mala s 6、Mala s 6.0101、Mala s 7、Mala s 7.0101、Mala s 8、Mala s 8.0101、Mala s 9、Mala s 9.0101)、木薯屬某些種(Man e 5、Man e 5.0101、Man e FPA、Man e GAPDH)、芒果屬某些種(Man i 1、Man i 14 kD、Man i 2、Man i 3、Man i 3.01、Man i 3.02、Man i幾丁質酶)、囊對蝦屬某些種(Mar j 1、Mar j 1.0101、Mar j 2、Mar j 4)、香菊屬某些種(Mat c 17 kD)、紡織娘屬某些種(Mec e 7)、魴屬某些種(Meg am 2、Meg am CK)、巨也匙蟲戚(Megathura)某些種(Meg c血藍蛋白)、大眼幼蟲某些種(Meg sp 1)、黑線鱈屬某些種(Mel a 1)、白點魨(Meleagris)某些種(Mel g 1、Mel g 2、Mel g 3、Mel g PRVB、Mel g TSA)、溝對蝦屬某些種(Mel I 1)、無鰾石首魚屬某些種(Men am 1)、山靛屬某些種(Mer a 1、Mer a 1.0101)、無須鱈屬某些種(Mer ap 1、Mer au 1、Mer bi 1、Mer ca 1、Mer ga 1、Mer hu 1)、牙鱈屬某些種(Mer me 1)、無須鱈屬某些種(Mer mr 1、Mer pa 1、Mer po 1、Mer pr 1、Mer se 1)、沙漠鼠屬某些種(Mer un 23 kD)、綠僵菌屬某些種(Met a 30)、赤蝦屬某些種(Met ba 1)、對蝦屬某些種(Met e 1、Met e 1.0101、Met e 2)、水杉屬某些種(Met gl 2)、對蝦屬某些種(Met j 1、Met j 2)、後海螯蝦屬某些種(Met ja 1)、赤蝦屬某些種(Met la 1)、後海螯蝦屬某些種(Met t 2)、藍鱈屬某些種(Mic po 1)、絨須石首魚屬某些種(Mic un 1)、類櫛孔扇貝屬某些種(Mim n 1)、苦瓜屬某些種(Mom c RIP)、桑屬某些種(Mor a 17 kD、Mor a 4)、狼鱸屬某些種(Mor am 1)、桑屬某些種(Mor n 3、Mor n 3.0101)、狼鱸屬某些種(Mor sa 1、Mor sc 1)、鯔屬某些種(Mug c 1)、鰻鱗鱈屬某些種(Mur mi 1)、巴蕉屬某些種(Mus a 1、Mus a 1.0101、Mus a 2、Mus a 2.0101、Mus a 3、Mus a 3.0101、Mus a 4、Mus a 4.0101、Mus a 5、Mus a 5.0101、Mus a 5.0102)、小鼠屬某些種(Mus m 1、Mus m 1.0101、Mus m 1.0102、Mus m 2、Mus m明膠、Mus m IgG、Mus m MSA、Mus m莫羅單抗、Mus m卵黃高磷蛋白)、鼬屬某些種(Mus p 17 kD)、巴蕉屬某些種(Mus xp 1、Mus xp 2、Mus xp 5)、喙鱸屬某些種(Myc bo 1、Myc mi 1、Myc ph 1)、毀絲黴屬某些種(Myc sp Laccase)、公牛蟻屬某些種(Myr p 1、Myr p 1.0101、Myr p 2、Myr p 2.0101、Myr p 2.0102、Myr p 3、Myr p 3.0101)、貽貝屬某些種(Myt e 1、Myt g 1、Myt g PM)、瘤蚜屬某些種(Myz p 7、Myz p 7.0101)、Nemorhedus某些種(Nae go Hya)、鉤蟲屬某些種(Nec a鈣網伴護蛋白)、金線魚屬某些種(Nem vi 1)、新薩托菌屬某些種(Neo fi 1、Neo fi 22)、Neochen某些種(Neo ju 1)、新園蛛屬某些種(Neo n 7、Neo n 7.0101)、韶子屬某些種(Nep I GAPDH)、海螯蝦屬某些種(Nep n 1、Nep n DF9)、香螺屬某些種(Nep po 1、Nep po 1.0101)、煙草屬某些種(Nic t 8、Nic t滲調蛋白、Nic t絨毛蛋白)、假格鏈格孢屬某些種(Nim c 1、Nim s 1)、日圓線蟲屬某些種(Nip b Agl)、懶猴屬某些種(Nyc c 1)、章魚某些種(Oct f 1、Oct I 1、Oct v 1、Oct v 1.0101、Oct v PM)、敏尾笛鯛屬某些種(Ocy ch 1)、洋橄欖屬某些種(Ole e 1、Ole e 1.0101、Ole e 1.0102、Ole e 1.0103、Ole e 1.0104、Ole e 1.0105、Ole e 1.0106、Ole e 1.0107、Ole e 10、Ole e 10.0101、Ole e 11、Ole e 11.0101、Ole e 11.0102、Ole e 12、Ole e 13、Ole e 2、Ole e 2.0101、Ole e 3、Ole e 3.0101、Ole e 36 kD、Ole e 4、Ole e 4.0101、Ole e 5、Ole e 5.0101、Ole e 6、Ole e 6.0101、Ole e 7、Ole e 7.0101、Ole e 8、Ole e 8.0101、Ole e 9、Ole e 9.0101)、柔魚屬某些種(Omm b 1、Omm b 1.0101)、大麻哈魚屬某些種(Onc ke 1、Onc ke 18 kD、Onc ke α2I、Onc ke卵黃生成素、Onc m 1、Onc m 1.0101、Onc m 1.0201、Onc m α2I、Onc m魚精蛋白、Onc m卵黃生成素、Onc ma 1、Onc ma FPA、Onc ma FSA、Onc ma TPI、Onc n 1)、蟠尾絲蟲屬某些種(Onc o 3、Onc o 3.0101)、鮭魚屬某些種(Onc ts 1)、蟠尾絲蟲屬某些種(Onc v 3、Onc v 3.0101)、口蝦蛄屬某些種(Ora o 1、Ora o 1.0101)、口孵麗鯛某些種(Ore a 1、Ore mo 1、Ore mo 2、Ore mo FPA、Ore mo SCAF7145、Ore ni 1、Ore ni 18 kD、Ore ni 45 kD)、禽刺蟎屬某些種(Orn sy 10、Orn sy 10.0101、Orn sy 10.0102)、穴兔屬某些種(Ory c 1、Ory c 1.0101、Ory c 2、Ory c酪蛋白、Ory c卵黃高磷蛋白、Ory c RSA)、稻屬某些種(Ory s 1、Ory s 1.0101、Ory s 11、Ory s 12、Ory s 12.0101、Ory s 13、Ory s 14、Ory s 17 kD、Ory s 19 kD、Ory s 2、Ory s 23、Ory s 3、Ory s 7、Ory s aA_TI、Ory s GLP52、Ory s GLP63、Ory s乙二醛酶I、Ory s NRA)、鐵木屬某些種(Ost c 1、Ost c 1.0101)、羊屬某些種(Ovi a ALA、Ovi a BLG、Ovi a酪蛋白、Ovi a酪蛋白 αS1、Ovi a酪蛋白 αS2、Ovi a酪蛋白 β、Ovi a酪蛋白κ、Ovi a卵黃高磷蛋白、Ovi a SSA)、粗針蟻屬某些種(Pac c 3)、赤鯛屬某些種(Pag m 1、Pag pa 1)、鯧屬某些種(Pam ar 1、Pam c 1)、長額蝦屬某些種(Pan b 1、Pan b 1.0101)、巨鯰屬某些種(Pan bo 1)、長額蝦屬某些種(Pan e 1、Pan e 1.0101、Pan e 4)、龍蝦屬某些種(Pan h 1、Pan hy 1)、巨鯰屬某些種(Pan hy 18 kD、Pan hy 45 kD)、龍蝦屬某些種(Pan j 1)、豹屬某些種(Pan I 1、Pan o 1、Pan p 1)、龍蝦屬某些種(Pan s 1、Pan s 1.0101)、豹屬某些種(Pan t 1)、黑猩猩屬某些種(Pan tr TCTP)、罌粟屬某些種(Pap s 17 kD、Pap s 2、Pap s 34 kD)、鳳蝶屬某些種(Pap xu 7、Pap xu 7.0101、Pap xu 7.0102)、牙鮃屬某些種(Par a 1)、鯰屬某些種(Par as 1、Par c 1)、擬石蟹屬某些種(Par c 1.0101、Par c 1.0102、Par f 1)、銀膠菊屬某些種(Par h 1)、牆草屬某些種(Par j 1、Par j 1.0101、Par j 1.0102、Par j 1.0103、Par j 1.0201、Par j 2、Par j 2.0101、Par j 2.0102、Par j 3、Par j 3.0101、Par j 3.0102、Par j 4、Par j 4.0101、Par j J1-J2)、牙鮃屬某些種(Par le 1)、牆草屬某些種(Par m 1、Par o 1、Par o 1.0101)、牙鮃屬某些種(Par ol 1、Par ol α2I)、Parahucho某些種(Par pe 卵黃生成素)、西番蓮屬某些種(Pas e幾丁質酶、Pas e Hevein)、雀稗屬某些種(Pas n 1、Pas n 1.0101、Pas n 13)、盤海扇屬某些種(Pat y 1)、虱屬某些種(Ped h 7、Ped h 7.0101)、對蝦屬某些種(Pen a 1、Pen a 1.0101、Pen a 1.0102、Pen a 1.0102 (103-117)、Pen a 1.0102 (109-123)、Pen a 1.0102 (1-15)、Pen a 1.0102 (115-129)、Pen a 1.0102 (121-135)、Pen a 1.0102 (127-141)、Pen a 1.0102 (13-27)、Pen a 1.0102 (133-147)、Pen a 1.0102 (139-153)、Pen a 1.0102 (145-159))、美對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (151-165))、對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (157-171)、Pen a 1.0102 (163-177)、Pen a 1.0102 (169-183)、Pen a 1.0102 (175-189)、Pen a 1.0102 (181-195)、Pen a 1.0102 (187-201)、Pen a 1.0102 (193-207)、Pen a 1.0102 (19-33)、Pen a 1.0102 (199-213)、Pen a 1.0102 (205-219)、Pen a 1.0102 (211-225)、Pen a 1.0102 (217-231)、Pen a 1.0102 (223-237)、Pen a 1.0102 (229-243))、美對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (235-249))、對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (241-255)、Pen a 1.0102 (247-261)、Pen a 1.0102 (253-267)、Pen a 1.0102 (25-39)、Pen a 1.0102 (259-273)、Pen a 1.0102 (265-279)、Pen a 1.0102 (270-284)、Pen a 1.0102 (31-45)、Pen a 1.0102 (37-51)、Pen a 1.0102 (43-57)、Pen a 1.0102 (49-63))、美對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (55-69))、對蝦屬某些種(Pen a 1.0102 (61-75)、Pen a 1.0102 (67-81)、Pen a 1.0102 (7-21)、Pen a 1.0102 (73-87)、Pen a 1.0102 (79-93)、Pen a 1.0102 (85-99)、Pen a 1.0102 (91-105)、Pen a 1.0102 (97-111)、Pen a 1.0103)、青黴菌屬某些種(Pen b 13、Pen b 13.0101、Pen b 26、Pen b 26.0101、Pen c 1、Pen c 13、Pen c 13.0101、Pen c 18、Pen c 19、Pen c 19.0101、Pen c 2、Pen c 22、Pen c 22.0101、Pen c 24、Pen c 24.0101、Pen c 3、Pen c 3.0101、Pen c 30、Pen c 30.0101、Pen c 32、Pen c 32.0101、Pen c MnSOD、Pen ch 13、Pen ch 13.0101、Pen ch 18、Pen ch 18.0101、Pen ch 20、Pen ch 20.0101、Pen ch 31、Pen ch 31.0101、Pen ch 33、Pen ch 33.0101、Pen ch 35、Pen ch 35.0101、Pen ch MnSOD)、對蝦屬某些種(Pen i 1、Pen i 1.0101、Pen m 1、Pen m 1.0101、Pen m 1.0102、Pen m 2、Pen m 2.0101、Pen m 3、Pen m 3.0101、Pen m 4、Pen m 4.0101、Pen m 6、Pen m 6.0101)、青黴菌屬某些種(Pen o 18、Pen o 18.0101)、對蝦屬某些種(Pena o 1、Pena o 1.0101)、大蠊屬某些種(Per a 1、Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0103、Per a 1.0104、Per a 1.0105、Per a 1.0201、Per a 10、Per a 10.0101、Per a 2、Per a 3、Per a 3.0101、Per a 3.0201、Per a 3.0202、Per a 3.0203、Per a 4、Per a 5、Per a 6、Per a 6.0101、Per a 7、Per a 7.0101、Per a 7.0102、Per a 7.0103、Per a 9、Per a 9.0101、Per a組織蛋白酶、Per a FABP、Per a胰蛋白酶、Per f 1、Per f 7、Per f 7.0101)、股蛤屬某些種(Per v 1)、鱷梨屬某些種(Pers a 1、Pers a 1.0101、Pers a 4)、歐芹屬某些種(Pet c 1、Pet c 2、Pet c 3)、虉草屬某些種(Pha a 1、Pha a 1.0101、Pha a 5、Pha a 5.0101、Pha a 5.02、Pha a 5.03、Pha a 5.04)、菜豆屬某些種(Pha v 3、Pha v 3.0101、Pha v 3.0201、Pha v aAI、Pha v aAI.0101、Pha v幾丁質酶、Pha v PHA、Pha v菜豆素)、梯牧草屬某些種(Phl p 1、Phl p 1.0101、Phi p 1.0102、Phi p 11、Phi p 11.0101、Phi p 12、Phi p 12.0101、Phi p 12.0102、Phi p 12.0103、Phi p 13、Phl p 13.0101、PhI p 2、Phi p 2.0101、Phi p 3、Phi p 3.0101、PhI p 3.0102、Phi p 4、Phi p 4.0101、Phi p 4.0102、Phl p 4.0201、Phl p 4.0202、Phl p 4.0203、Phl p 4.0204、Phl p 5、Phl p 5.0101、Phl p 5.0102、Phl p 5.0103、Phl p 5.0104、Phl p 5.0105、Phl p 5.0106、Phl p 5.0107、Phl p 5.0108、Phl p 5.0109、Phl p 5.0201、Phl p 5.0202、Phl p 5.0203、Phl p 5.0204、Phl p 5.0205、Phl p 5.0206、Phl p 5.0207、Phl p 6、Phl p 6.0101、Phl p 6.0102、Phl p 7、Phl p 7.0101、Phl p P1-P2-P5-P6、Phl p P2-P6、Phl p P5-P1、Phl p P6-P2)、Phoenix某些種(Pho d 2、Pho d 2.0101、Pho d 40 kD、Pho d 90 kD)、毛足鼠屬某些種(Pho s 21 kD)、莖點黴屬某些種(Pho t 1)、蘆葦屬某些種(Phr a 1、Phr a 12、Phr a 13、Phr a 4、Phr a 5)、商陸屬某些種(Phy a RIP)、茴芹屬某些種(Pim a 1、Pim a 2)、珧蛤屬某些種(Pin a 1)、胡椒屬某些種(Pip n 14 kD、Pip n 28 kD)、豌豆屬某些種(Pis s 1、Pis s 1.0101、Pis s 1.0102、Pis s 2、Pis s 2.0101、Pis s 5、Pis s凝集素、Pis s白蛋白)、黃連木屬某些種(Pis v 1、Pis v 1.0101、Pis v 2、Pis v 2.0101、Pis v 2.0201、Pis v 3、Pis v 3.0101、Pis v 4、Pis v 4.0101、Pis v 5、Pis v 5.0101)、懸鈴木屬某些種(Pla a 1、Pla a 1.0101、Pla a 2、Pla a 2.0101、Pla a 3、Pla a 3.0101、Pla a 8)、江鰈屬某些種(Pla f 1)、車前屬某些種(Pla I 1、Pla I 1.0101、Pla I 1.0102、Pla I 1.0103、Pla I細胞色素C)、懸鈴木屬某些種(Pla oc 1、Pla or 1、Pla or 1.0101、Pla or 2、Pla or 2.0101、Pla or 3、Pla or 3.0101、Pla or 4、Pla or CyP、Pla r 1)、鰓棘鱸屬某些種(Pie ar 1)、格孢腔菌屬某些種(Pie h 1)、鰓棘鱸屬某些種(Pie le 1)、穀斑螟屬某些種(Plo i 1、Plo i 1.0101、Plo i 2、Plo i 2.0101)、早熟禾屬某些種(Poa p 1、Poa p 1.0101、Poa p 10、Poa p 12、Poa p 13、Poa p 2、Poa p 4、Poa p 5、Poa p 5.0101、Poa p 6、Poa p 7)、馬蜂屬某些種(Pol a 1、Pol a 1.0101、Pol a 2、Pol a 2.0101、Pol a 5、Pol a 5.0101、Pol d 1、Pol d 1.0101、Pol d 1.0102、Pol d 1.0103、Pol d 1.0104、Pol d 4、Pol d 4.0101、Pol d 5、Pol d 5.0101、Pol e 1、Pol e 1.0101、Pol e 2、Pol e 4、Pol e 4.0101、Pol e 5、Pol e 5.0101、Pol f 5、Pol f 5.0101、Pol g 1、Pol g 1.0101、Pol g 2、Pol g 4、Pol g 5、Pol g 5.0101、Pol he MLT、Pol m 5、Pol m 5.0101)、多足搖蚊屬某些種(Pol n 1)、龜足屬某些種(Pol po 1)、青鱈屬某些種(Pol vi 1)、黃蜂(Polybia)某些種(Poly p 1、Poly p 1.0101、Poly p 2、Poly p 5、Poly s 5、Poly s 5.0101)、鯥屬某些種(Pom sa 1)、猩猩屬某些種(Pon ab HSA)、Pontastacus某些種(Pon I 4、Pon I 4.0101、Pon I 7、Pon I 7.0101)、梭子蟹屬某些種(Por s 1、Por s 1.0101、Por s 1.0102、Por tr 1、Por tr 1.0101)、Protortonia某些種(Pro ca 38 kD)、原蝲蛄屬某些種(Pro cl 1、Pro cl 1.0101、Pro cl 21 kD)、牧豆樹屬某些種(Pro j 20 kD)、李屬某些種(Pru ar 1、Pru ar 1.0101、Pru ar 3、Pru ar 3.0101、Pru av 1、Pru av 1.0101、Pru av 1.0201、Pru av 1.0202、Pru av 1.0203、Pru av 2、Pru av 2.0101、Pru av 3、Pru av 3.0101、Pru av 4、Pru av 4.0101、Pru c 1、Pru d 1、Pru d 2、Pru d 3、Pru d 3.0101、Pru d 4、Pru du 1、Pru du 2、Pru du 2S白蛋白、Pru du 3、Pru du 3.0101、Pru du 4、Pru du 4.0101、Pru du 4.0102、Pru du 5、Pru du 5.0101、Pru du 6、Pru du 6.0101、Pru du 6.0201、Pru du羽扇豆蛋白、Pru p 1、Pru p 1.0101、Pru p 2、Pru p 2.0101、Pru p 2.0201、Pru p 2.0301、Pru p 3、Pru p 3.0101、Pru p 3.0102、Pru p 4、Pru p 4.0101、Pru p 4.0201、Pru sa 3)、光蓋傘屬某些種(Psi c 1、Psi c 1.0101、Psi c 2、Psi c 2.0101)、癢蟎屬某些種(Pso o 1、Pso o 10、Pso o 10.0101、Pso o 11、Pso o 13、Pso o 14、Pso o 2、Pso o 21、Pso o 3、Pso o 5、Pso o 7)、美洲豹某些種(Pum c 1)、石榴屬某些種(Pun g 3)、梨屬某些種(Pyr c 1、Pyr c 1.0101、Pyr c 3、Pyr c 3.0101、Pyr c 4、Pyr c 4.0101、Pyr c 5、Pyr c 5.0101、Pyr py 2)、櫟屬某些種(Que a 1、Que a 1.0101、Que a 1.0201、Que a 1.0301、Que a 1.0401、Que a 2、Que a 4)、軍曹魚屬某些種(Rac ca 1)、蛙屬某些種(Ran e 1、Ran e 1.0101、Ran e 2、Ran e 2.0101)、蛙蟹屬某些種(Ran ra 1)、馴鹿屬某些種(Ran t BLG)、鼠屬某些種(Rat n 1、Rat n 1.0101、Rat n酪蛋白、Rat n明膠、Rat n IgG、Rat n卵黃高磷蛋白、Rat n RSA、Rat n轉鐵蛋白)、根毛黴屬某些種(Rhi m AP)、根黴某些種(Rhi nv脂肪酶、Rhi o脂肪酶)、翼齒鯛屬某些種(Rho au 1)、紅酵母屬某些種(Rho m 1、Rho m 1.0101、Rho m 2、Rho m 2.0101)、蓖麻某些種(Ric c 1、Ric c 1.0101、Ric c 2、Ric c 3、Ric c 8、Ric c RIP)、溪鱂屬某些種(Riv ma 1)、刺槐屬某些種(Rob p 2、Rob p 4、Rob p聚葡萄糖酶)、薔薇屬某些種(Ros r 3)、大王椰子屬某些種(Roy e 2)、懸鉤子屬某些種(Rub i 1、Rub i 1.0101、Rub i 3、Rub i 3.0101、Rub i幾丁質酶、Rub i CyP)、酵母屬某些種(Sac c羧肽酶 Y、Sac c CyP、Sac c烯醇酶、Sac c葡萄糖苷酶、Sac c轉化酶、Sac c MnSOD、Sac c P2、Sac c抑制蛋白)、紅點鮭屬某些種(Sal f 1)、豬毛菜某些種(Sal k 1、Sal k 1.0101、Sal k 1.0201、Sal k 1.0301、Sal k 1.0302、Sal k 2、Sal k 2.0101、Sal k 3、Sal k 3.0101、Sal k 4、Sal k 4.0101、Sal k 4.0201、Sal k 5、Sal k 5.0101)、紅點鮭屬某些種(Sal le卵黃生成素)、大西洋鮭魚某些種(Sal s 1、Sal s 1.0101、Sal s 1.0201、Sal s 2、Sal s 2.0101、Sal s明膠)、接骨木屬某些種(Sam n 1)、檀香某些種(San lu 1)、肥皂草屬某些種(Sap o RIP)、擬沙丁魚屬某些種(Sar m 1)、瘤鴨屬某些種(Sar ml 1)、沙丁魚屬某些種(Sar p 1)、疥蟎屬某些種(Sar s 1、Sar s 14、Sar s 3、Sar s GST、Sar s PM)、擬沙丁魚屬某些種(Sar sa 1、Sar sa 1.0101)、住血吸蟲屬某些種(Sch j GST、Sch j PM、Sch j Sj22、Sch j Sj67、Sch ma Sm20、Sch ma Sm21、Sch ma Sm22、Sch ma Sm31)、石首魚屬某些種(Sci oc 1)、鯖魚屬某些種(Sco a 1)、馬鮫屬某些種(Sco ca 1)、鰆屬某些種(Sco g 1)、鯖魚屬某些種(Sco j 1、Sco ma 1、Sco s 1)、蜈蚣某些種(Sco y 7、Sco y 7.0101)、青蟹屬某些種(Scy o 1、Scy o 1.0101、Scy o 2、Scy pa 1、Scy pa 2、Scy s 1、Scy s 1.0101、Scy s 2)、平鮋屬某些種(Seb fa 1、Seb in 1、Seb m 1、Seb m 1.0101、Seb m 1.0201)、黑麥屬某些種(Sec c 1、Sec c 12、Sec c 13、Sec c 2、Sec c 20、Sec c 20.0101、Sec c 20.0201、Sec c 28、Sec c 3、Sec c 4、Sec c 4.0101、Sec c 4.0201、Sec c 5、Sec c 5.0101、Sec c aA_TI、Sec c aA_TI.0101)、千里光屬某些種(Sen j MDH、Sen j PL)、烏賊屬某些種(Sep e 1、Sep e 1.0101)、擬烏賊屬某些種(Sep I 1、Sep 1 1.0101)、烏賊屬某些種(Sep m 1)、甘鰺屬某些種(Ser d 1、Ser la 1)、櫻蝦屬某些種(Ser lu 1)、甘鰺屬某些種(Ser q 1、Ser ri 1)、胡麻屬某些種(Ses i 1、Ses i 1.0101、Ses i 2、Ses i 2.0101、Ses i 3、Ses i 3.0101、Ses i 4、Ses i 4.0101、Ses i 5、Ses i 5.0101、Ses i 6、Ses i 6.0101、Ses i 7、Ses i 7.0101、Ses i 8)、志賀桿菌屬某些種(Shi bo GST、Shi dy GST)、Simulia某些種(Sim vi 1、Sim vi 2、Sim vi 3、Sim vi 4、Sim vi 70 kD)、白芥屬某些種(Sin a 1、Sin a 1.0101、Sin a 1.0104、Sin a 1.0105、Sin a 1.0106、Sin a 1.0107、Sin a 1.0108、Sin a 2、Sin a 2.0101、Sin a 3、Sin a 3.0101、Sin a 4、Sin a 4.0101)、縊蟶屬某些種(Sin c 1、Sin c 1.0101)、火蟻屬某些種(Sol g 2、Sol g 2.0101、Sol g 3、Sol g 3.0101、Sol g 4、Sol g 4.0101、Sol g 4.0201、Sol i 1、Sol i 1.0101、Sol i 2、Sol i 2.0101、Sol i 3、Sol i 3.0101、Sol i 4、Sol i 4.0101)、管鞭蝦屬某些種(Sol me 1)、火蟻屬某些種(Sol r 1、Sol r 2、Sol r 2.0101、Sol r 3、Sol r 3.0101、Sol s 2、Sol s 2.0101、Sol s 3、Sol s 3.0101、Sol s 4)、鰨屬某些種(Sol so 1、Sol so TPI)、茄屬某些種(Sola t 1、Sola t 1.0101、Sola t 2、Sola t 2.0101、Sola t 3、Sola t 3.0101、Sola t 3.0102、Sola t 4、Sola t 4.0101、Sola t 8、Sola t聚葡萄糖酶)、高粱屬某些種(Sor b 1、Sor h 1、Sor h 1.0101、Sor h 12、Sor h 7)、鯛屬某些種(Spa a 1)、雙髻鯊屬某些種(Sph ti 1)、螺旋藻屬某些種(Spi mx β_藻藍素)、菠菜屬某些種(Spi o 2、Spi o RuBisCO)、蝦蛄屬某些種(Squ ac 1、Squ ac 1.0101、Squ o 1、Squ o 1.0101)、葡萄球菌屬某些種(Sta a FBP、Sta a SEA、Sta a SEB、Sta a SEC、Sta a SED、Sta a SEE、Sta a TSST)、葡萄穗黴屬某些種(Sta c 3、Sta c 3.0101、Sta c纖維素酶、Sta c溶血素、Sta c SchS34、Sta c Stachyrase A)、匍柄黴屬某些種(Ste b 1、Ste c 1、Ste v 1)、小公魚屬某些種(Sto i 1)、鴕鳥某些種(Str c 1、Str c 2、Str c 3)、鏈球菌屬某些種(Str dy鏈球菌激酶)、鏈黴菌屬某些種(Str g Pronase)、鏈球菌屬某些種(Str pn PspC)、紫海膽屬某些種(Str pu 18 kD、Str pu卵黃生成素)、鏈球菌屬某些種(Str py SPEA、Str py SPEC、Str py鏈球菌激酶)、擬圓蟲屬某些種(Str st 45 kD)、鏈黴菌屬某些種(Str v PAT)、柄海鞘屬某些種(Sty p 1)、皺皮蟎屬某些種(Sui m 1、Sui m 13、Sui m 2、Sui m 3、Sui m 5、Sui m 5.01、Sui m 5.02、Sui m 5.03、Sui m 6、Sui m 7、Sui m 8、Sui m 9)、野豬屬某些種(Sus s ACTH、Sus s ALA、Sus s澱粉酶、Sus s BLG、Sus s酪蛋白、Sus s酪蛋白 αS1、Sus s酪蛋白 αS2、Sus s酪蛋白 β、Sus s酪蛋白κ、Sus s明膠、Sus s HG、Sus s胰島素、Sus s脂肪酶、Sus s胃蛋白酶、Sus s卵黃高磷蛋白、Sus s PRVB、Sus s PSA、Sus s TCTP)、Syntelopodeuma某些種(Syn y 7、Syn y 7.0101)、丁香屬某些種(Syr v 1、Syr v 1.0101、Syr v 1.0102、Syr v 1.0103、Syr v 2、Syr v 3、Syr v 3.0101)、牛虻屬某些種(Tab y 1、Tab y 1.0101、Tab y 2、Tab y 2.0101、Tab y 5、Tab y 5.0101)、麻鴨屬某些種(Tad ra 1)、籃狀菌屬某些種(Tal st 22、Tal st 3、Tal st 8)、蒲公英屬某些種(Tar o 18 kD)、水松屬某些種(Tax d 2)、隅蛛屬某些種(Teg d 血藍蛋白)、背帶線蟲屬某些種(Tel ci 3)、異舟蛾屬某些種(Tha p 1、Tha p 1.0101、Tha p 2、Tha p 2.0101)、狹鱈屬某些種(The c 1)、嗜熱真菌屬某些種(The I脂肪酶、The sp脂肪酶、The sp木膠多糖酶)、鮪屬某些種(Thu a 1、Thu a 1.0101、Thu a膠原、Thu al 1、Thu at 1、Thu o 1、Thu o膠原)、側柏屬某些種(Thu oc 3、Thu p 1)、鮪屬某些種(Thu t 1、Thu to 1)、杖魚屬某些種(Thy at 1)、Thyrophygus某些種(Thy y 7、Thy y 7.0101)、褶柔魚屬某些種(Tod p 1、Tod p 1.0101、Tod p 1.0102)、桔蚜屬某些種(Tox c 7、Tox c 7.0101)、蛔蟲屬某些種(Tox ca TES120、Tox ca TES26、Tox ca TES30)、弓蟲屬某些種(Tox g HSP70)、鷹爪蝦屬某些種(Tra c 1)、鯧鯵屬某些種(Tra ca 1)、真鯵屬某些種(Tra j 1、Tra j明膠、Tra tr明膠)、小麥屬某些種(Tri a 1、Tri a 10 kD、Tri a 12、Tri a 12.0101、Tri a 12.0102、Tri a 12.0103、Tri a 12.0104、Tri a 13、Tri a 14、Tri a 14.0101、Tri a 14.0201、Tri a 15、Tri a 15.0101、Tri a 18、Tri a 18.0101、Tri a 19、Tri a 19.0101、Tri a 2、Tri a 21、Tri a 21.0101、Tri a 23kd、Tri a 25、Tri a 25.0101、Tri a 26、Tri a 26.0101、Tri a 27、Tri a 27.0101、Tri a 28、Tri a 28.0101、Tri a 29、Tri a 29.0101、Tri a 29.0201、Tri a 3、Tri a 30、Tri a 30.0101、Tri a 31、Tri a 31.0101、Tri a 32、Tri a 32.0101、Tri a 33、Tri a 33.0101、Tri a 34、Tri a 34.0101、Tri a 35、Tri a 35.0101、Tri a 36、Tri a 36.0101、Tri a 37、Tri a 37.0101、Tri a 4、Tri a 4.0101、Tri a 4.0201、Tri a 5、Tri a 7、Tri a aA_SI、Tri a α_麥膠蛋白、Tri a bA、Tri a Bd36K、Tri a β_麥膠蛋白、Tri a幾丁質酶、Tri a CM16、Tri a DH、Tri a Endo幾丁質酶、Tri a γ_麥膠蛋白、Tri a Germin、Tri a麥膠蛋白、Tri a GST、Tri a LMW Glu、Tri a LMW-GS B16、Tri a LMW-GS P42、Tri a LMW-GS P73、Tri a LTP2、Tri a omega2_麥膠蛋白、Tri a過氧化酶、Tri a過氧化酶 1、Tri a SPI、Tri a TLP、Tri a麥芽凝集素、Tri a XI)、麥軸梗黴屬某些種(Tri al 蛋白酶 K)、擬穀盜屬某些種(Tri ca 17、Tri ca 17.0101、Tri ca 7、Tri ca 7.0101)、毛樣線蟲屬某些種(Tri co 3、Tri co 3.0101)、髮癬菌某些種(Tri eq 4)、毛樣線蟲屬某些種(Tri fg 1、Tri fg 2、Tri fg 3、Tri fg 4)、栝樓屬某些種(Tri k RIP)、帶魚屬某些種(Tri le 1)、小麥屬某些種(Tri m過氧化酶)、髮癬菌屬某些種(Tri me 2、Tri me 4)、三毛草屬某些種(Tri p 1、Tri p 5)、旋毛蟲屬某些種(Tri ps 3、Tri ps 3.0101)、髮癬菌屬某些種(Tri r 2、Tri r 2.0101、Tri r 4、Tri r 4.0101)、木黴屬某些種(Tri rs纖維素酶)、小麥屬某些種(Tri s 14)、髮癬菌屬某些種(Tri sc 2、Tri sc 4、Tri so 2)、旋毛蟲屬某些種(Tri sp 3、Tri sp 3.0101、Tri sp 3.0102、Tri sp 3.0103、Tri sp 3.0104、Tri sp 3.0105、Tri sp 3.0106)、髮癬菌屬某些種(Tri t 1、Tri t 1.0101、Tri t 4、Tri t 4.0101)、小麥屬某些種(Tri td 14、Tri td aA_TI)、木黴屬某些種(Tri v纖維素酶)、髮癬菌某些種(Tri ve 4)、錐鼻蟲屬某些種(Tria p 1、Tria p 1.0101)、白梧桐屬某些種(Trip s 1)、蠑螺屬某些種(Tur c 1、Tur c PM)、酪食蟎屬某些種(Tyr p 1、Tyr p 10、Tyr p 10.0101、Tyr p 10.0102、Tyr p 13、Tyr p 13.0101、Tyr p 2、Tyr p 2.0101、Tyr p 24、Tyr p 24.0101、Tyr p 3、Tyr p 3.0101、Tyr p 4、Tyr p 5、Tyr p 5.01、Tyr p 5.02、Tyr p 5.03、Tyr p 7、Tyr p α微管蛋白)、細基格孢屬某些種(Ulo a 1、Ulo at 1、Ulo b 1、Ulo c 1、Ulo co 1、Ulo cu 1、Ulo mu 1、Ulo ob 1、Ulo se 1、Ulo su 1、Ulo tu 1)、雪豹屬某些種(Unc u 1)、長鰭鱈屬某些種(Uro te 1)、苔莓屬某些種(Vac m 3)、瓦蟎屬某些種(Var j 13 kD)、蛤仔屬某些種(Ven ph 1、Ven ph 1.0101)、黃胡蜂屬某些種(Ves f 1、Ves f 2、Ves f 5、Ves f 5.0101、Ves g 1、Ves g 2、Ves g 5、Ves g 5.0101、Ves m 1、Ves m 1.0101、Ves m 2、Ves m 2.0101、Ves m 5、Ves m 5.0101、Ves m MLT、Ves p 1、Ves p 2、Ves p 5、Ves p 5.0101、Ves s 1、Ves s 1.0101、Ves s 2、Ves s 5、Ves s 5.0101、Ves v 1、Ves v 1.0101、Ves v 2、Ves v 2.0101、Ves v 2.0201、Ves v 3、Ves v 3.0101、Ves v 5、Ves v 5.0101、Ves v 5-Pol a 5、Ves vi 5、Ves vi 5.0101)、胡蜂屬某些種(Vesp c 1、Vesp c 1.0101、Vesp c 2、Vesp c 5、Vesp c 5.0101、Vesp c 5.0102、Vesp m 1、Vesp m 1.0101、Vesp m 5、Vesp m 5.0101、Vesp ma 1、Vesp ma 2、Vesp ma 5、Vesp ma MLT、Vesp v MLT)、缸豆屬某些種(Vig r 1、Vig r 1.0101、Vig r 17 kD、Vig r 5、Vig r 8S球蛋白、Vig r白蛋白、Vig r β-伴大豆球蛋白)、葡萄屬某些種(Vit v 1、Vit v 1.0101、Vit v 4、Vit v 5、Vit v聚葡萄糖酶、Vit v TLP)、旗魚屬某些種(Xip g 1、Xip g 1.0101、Xip g 25 kD)、玉蜀黍屬某些種(Zea m 1、Zea m 1.0101、Zea m 11、Zea m 12、Zea m 12.0101、Zea m 12.0102、Zea m 12.0103、Zea m 12.0104、Zea m 12.0105、Zea m 13、Zea m 14、Zea m 14.0101、Zea m 14.0102、Zea m 2、Zea m 20S、Zea m 22、Zea m 25、Zea m 25.0101、Zea m 27 kD Zein、Zea m 3、Zea m 4、Zea m 5、Zea m 50 kD Zein、Zea m 7、Zea m幾丁質酶、Zea m G1、Zea m G2、Zea m PAO、Zea m Zm13)、海魴屬某些種(Zeu fa 1)、棗屬某些種(Ziz m 1、Ziz m 1.0101)、綿鳚屬某些種(Zoa a ISP III)、肉蒺藜屬某些種(Zyg f 2)。
在此上下文中，括號中之術語指示來自具體來源之特別較佳的過敏性抗原（過敏原）。
最佳地，過敏性抗原較佳源自來源（例如植物（例如草或樹）、天然產物（例如牛奶、堅果等）、真菌來源（例如麯黴屬）或細菌來源或來自動物來源或動物毒素（例如貓、狗、蜜蜂毒液等），較佳選自由以下組成之清單：草花粉（例如黑麥花粉）、樹木花粉（例如榛子樹、樺樹、榿木、梣樹之花粉）、花朵花粉、草本花粉（例如艾蒿之花粉）、塵蟎（例如Der f 1、Der p 1、Eur m 1、Der m 1 Der f 2、Der p 2、Eur m 2、Tyr p 2、Lep d 2）、黴菌（例如頂頭孢屬、麯黴屬、枝孢屬、鐮刀菌屬、毛黴屬、青黴屬、根黴屬、葡萄孢屬、木黴屬或鏈格孢屬之過敏原）、動物（例如貓之Fel d1、Fel d 2、Fel d3或Fel d4）、食物（例如魚（例如鱸魚、鱈魚、比目魚）、海鮮（例如螃蟹、龍蝦、蝦）、雞蛋、小麥、堅果（例如花生、杏仁、腰果、核桃）、大豆、牛奶等）或昆蟲毒液之過敏原（例如來自黃蜂、蜜蜂、大黃蜂、螞蟻、蚊子或蜱之毒液的過敏原）。 自體免疫性自身抗原
自體免疫性自身抗原，亦即與自體免疫疾病相關之抗原或自體抗原，可能與影響以下器官系統中之至少一或多者的自體免疫疾病有關：循環系統、消化系統、內分泌系統、排泄系統、免疫系統、外皮系統、肌肉系統、神經系統、生殖系統、呼吸系統、骨骼系統，較佳心血管系統、神經內分泌系統、肌肉骨骼系統或胃腸系統。其中，循環系統為器官系統，它能夠經由心臟、血液及血管將血液幫浦及輸送至身體及肺部。消化系統能夠經由唾液腺、食道、胃、肝臟、膽囊、胰腺、腸、結腸、直腸及肛門消化並加工食物。內分泌系統使用由諸如下視丘、垂體或垂體腺、松果體或松果體腺、甲狀腺、副甲狀腺及腎上腺之內分泌腺產生的激素實現體內交流。排泄系統包括腎臟、輸尿管、膀胱及尿道，並參與體液平衡、電解質平衡及尿液排泄。免疫系統包括參與組織與血流、淋巴及淋巴結與血管之間的淋巴轉移之結構，此等結構可負責免疫系統之細胞及體液組分的運輸。它負責防禦致病因子，並且尤其包括白血球、扁桃體、腺樣體、胸腺及脾臟。外皮系統包括皮膚、頭髮及指甲。肌肉系統使肌肉與骨骼系統一起運動，骨骼系統包括骨骼、軟骨、韌帶及肌腱，並提供結構支撐。神經系統負責收集、傳遞及處理資訊，並且包括大腦、脊髓及神經。生殖系統包括性器官，諸如卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睾丸、輸精管、精囊、前列腺及陰莖。呼吸系統包括用於呼吸之器官、咽、喉、氣管、支氣管、肺及橫膈膜，並且與循環系統共同發揮作用。
自體免疫性自身抗原（與自體免疫疾病相關之抗原或自體抗原）係選自與選自以下之自體免疫疾病相關的自體抗原：阿狄森氏病（自體免疫性腎上腺炎，Morbus Addison）、斑禿、阿狄森氏貧血（Morbus Biermer）、自體免疫性溶血性貧血（AIHA）、冷型自體免疫性溶血性貧血（AIHA）（冷血球凝集素病、冷性自體免疫性溶血性貧血（AIHA）（冷凝集素病）、（CHAD））、自體免疫性溶血性貧血（AIHA）、溫型（暖型AIHA、暖型自體免疫性溶血貧血(AIHA))、自體免疫性溶血性 Donath-Landsteiner貧血（陣發性冷血紅素尿）、抗磷脂症候群（APS）、動脈粥樣硬化、自體免疫性關節炎、顳動脈炎、Takayasu動脈炎（高安氏病、主動脈弓病）、顳動脈炎/巨細胞自體免疫性慢性胃炎、自體免疫性不孕症、自體免疫性內耳病(AIED)、巴塞多氏病 (Morbus Basedow)、貝希德萊氏病（Morbus Bechterew、僵直性脊柱炎、強直性脊柱炎）、白塞氏症候群（Morbus Behcet）、腸病，包括自體免疫性炎性腸病（包括潰瘍性結腸炎（Morbus Crohn、克羅恩氏病）、心肌病，特別是自體免疫性心肌病，特發性擴張性心肌病（DCM）、乳糜瀉口炎性皮炎(麩質介導之腸病)、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)、慢性多發性關節炎、Churg-Strauss症候群、瘢痕性類天皰瘡、Cogan症候群、CREST症候群(皮膚鈣沉著、雷諾現象(Raynaud phenomenon)、食道運動障礙、sklerodaktylia及毛細血管擴張之症候群）、克羅恩氏病（Morbus Crohn、潰瘍性結腸炎）、疱疹樣皮炎、皮膚自體免疫疾病、皮肌炎、糖尿病、1型糖尿病（I型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病）、2型糖尿病（II型糖尿病）、原發性混合性冷凝球蛋白血症、原發性混合性冷凝球蛋白血症、纖維肌痛、纖維肌炎、古巴士德氏(Goodpasture)症候群（抗GBM介導之腎小球性腎炎）、移植物抗宿主疾病、格林-巴利症候群（GBM、多發性神經炎）、血液自體免疫疾病、橋本(Hashimoto)甲狀腺炎、血友病、獲得性血友病、肝炎、自體免疫性肝炎，尤其是自體免疫性慢性肝炎、特發性肺纖維化(IPF)、特發性血小板減少性紫癜、免疫血小板減少性紫癜 (Morbus Werlhof；ITP)、IgA腎病、不孕症、自體免疫性不孕症、幼年型類風濕性關節炎（Morbus Still、Still症候群）、Lambert-Eaton症候群、扁平苔蘚、硬化性苔蘚、紅斑狼瘡、全身性紅斑狼瘡（SLE）、紅斑狼瘡（盤狀）、萊姆關節炎（萊姆疾病、疏螺旋體關節炎）、梅尼埃病（Morbus Meniere）；混合性結締組織病（MCTD）、多發性硬化症（MS、播散性腦脊髓炎、Charcot氏病）、重症肌無力（肌無力、MG）、肌炎、多發性肌炎、神經自體免疫疾病、神經性皮炎、尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、瘢痕形成類天皰瘡；結節性多動脈炎（periarteiitis nodosa）、多軟骨炎（panchondritis）、多腺（自體免疫性）症候群（PGA症候群、施密特症候群）、風濕性多發性肌痛、原發性無γ球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化PBC、原發性自體免疫性膽管炎）、進行性全身性硬化症(PSS)、牛皮癬、尋常型牛皮癬、雷諾氏現象、賴特症候群（Morbus Reiter、尿道結膜滑膜症候群）、類風濕性關節炎（RA、慢性多發性關節炎、關節風濕病、風濕熱）、類肉瘤病（Morbus Boeck、Besnier-Boeck-Schaumann病）、僵人症候群、硬皮病、硬皮症、Sjögren氏症候群、交感神經性眼炎；瞬時麩質不耐受、移植器官排斥、葡萄膜炎、自體免疫性葡萄膜炎、血管炎、白斑病（白癜風、花斑皮膚）及韋格納病（Morbus Wegner、韋格納肉芽腫病）。
充當自體免疫性自身抗原之此等及其他蛋白質應理解為是治療性的，因為它們意在藉由用由哺乳動物(例如人類)自身表現並觸發不希望有的免疫反應(而此反應不會在健康受試者中產生)之自身抗原接種疫苗來治療受試者，特別是哺乳動物，更特別是人類。因此，充當自身抗原之此類蛋白質通常為哺乳動物來源的，特別是人類來源的。
在此上下文中，特別較佳的為選自以下之自體免疫性自身抗原（自體抗原）：
髓鞘鹼性蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白(PLP)及髓鞘寡樹突狀細胞醣蛋白(MOG)，在各情況下與多發性硬化症(MS)相關；
CD44、前胰島素原、胰島素原、胰島素、麩胺酸脫羧酶(GAD65)、酪胺酸磷酸酶樣胰島素瘤抗原2 (IA2)、鋅轉運蛋白((ZnT8)及熱休克蛋白60 (HSP60)，在各情況下與I型糖尿病相關；
與自體免疫性葡萄膜炎相關之光感受器間類視色素結合蛋白（IRBP）；
乙醯膽鹼受體AchR及胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)，在各情況下與重症肌無力相關；
與風濕熱相關的來自β-溶血性鏈球菌（假自體抗原）之M蛋白；
與關節炎相關之巨噬細胞遷移抑制因子；
Ro/LaRNP複合物、α-及β-胞影蛋白、胰島細胞自體抗原、聚(ADP)核糖聚合酶（PARP）、NuMA、NOR-90、Ro60自體抗原及p27抗原，在各情況下與Sjögren氏症候群相關；
Ro60自體抗原、低密度脂蛋白、U-1小核核糖核蛋白複合物之Sm抗原（B/B'、D1、D2、D3、E、F、G）及RNP核糖核蛋白，在各情況下與紅斑狼瘡相關；
oxLDL、β(2)GPI、HSP60/65及oxLDL/β(2)GPI，在各情況下與動脈粥樣硬化相關；
與特發性擴張性心肌病(DCM)相關之心臟β(1)-腎上腺素性受體；
與肌炎相關之組胺醯基-tRNA合成酶(HisRS)；
與硬皮病相關之拓撲異構酶I。
此外，在其他實施例中，該自體免疫性自身抗原與相應的自體免疫疾病相關，例如像IL-17、熱休克蛋白及/或任何獨特型致病性T細胞或趨化介素受體，其由參與該自體免疫疾病（諸如本文所述之任何自體免疫疾病）中之自體免疫反應的免疫細胞表現。
較佳地，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物之至少一個編碼區包含至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個核酸序列，該等核酸序列與在序列表中（或分別在PCT/EP2016/075843之表1-5或第20-24圖中）揭示之任一核酸序列或該等核酸序列中之任一者之片段或變異體至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%相同或具有此序列一致性。
較佳地，包含至少一個如本文所定義之編碼區的mRNA序列通常包含約50至約20000、或100至約20000個核苷酸、較佳約250至約20000個核苷酸、更佳約500至約10000、甚至更佳約500至約5000之長度。
根據又一實施例，根據本發明之mRNA序列為如本文所定義之人工mRNA序列。
根據又一實施例，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物為經修飾之mRNA序列，較佳如本文所述的經修飾之mRNA序列。在此上下文中，如本文所定義之修飾較佳造成根據本發明之mRNA序列的穩定化。更佳地，本發明因此提供包含至少一個如本文所定義之編碼區的穩定的mRNA序列。
根據一個實施例，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物因此可作為「穩定的mRNA序列」提供，亦即作為基本上抵抗活體內降解（例如藉由外切或內切核酸酶）之mRNA。該種穩定可受到例如本發明之mRNA的經修飾之磷酸骨架的影響。與本發明有關之骨架修飾為其中包含在mRNA中的核苷酸骨架之磷酸酯經化學修飾的修飾。就此而言可較佳使用的核苷酸包含例如硫代磷酸酯修飾之磷酸骨架，較佳地，磷酸骨架中包含的磷酸氧中之至少一個經硫原子置換。穩定的mRNA可進一步包括，例如：非離子磷酸酯類似物，例如膦酸烷酯及膦酸芳酯，其中帶電膦酸酯之氧經烷基或芳基置換；或磷酸二酯及烷基磷酸三酯，其中帶電氧殘基以烷基化形式存在。此類骨架修飾通常包括但不限於來自由以下組成之群的修飾：甲基膦酸酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯（例如胞苷-5′-O-(1-硫磷酸））。
在下文中，描述了特定的修飾，其較佳能夠「穩定」如本文所定義之mRNA。 V.9. 化學修飾
如本文所用，術語「mRNA修飾」可指代化學修飾，包括骨架修飾以及糖修飾或鹼基修飾。
在此上下文中，如本文所定義的經修飾之mRNA（序列）可包含核苷酸類似物/修飾，例如骨架修飾、糖修飾或鹼基修飾。與本發明有關之骨架修飾為一種修飾，其中包含在含有本文所定義之mRNA序列的mRNA化合物中的核苷酸骨架之磷酸酯經化學修飾。與本發明有關之糖修飾為包含如本文所定義之mRNA序列的mRNA化合物之核苷酸的糖之化學修飾。此外，與本發明有關之鹼基修飾為包含mRNA序列的mRNA化合物之核苷酸的鹼基部分之化學修飾。在此上下文中，核苷酸類似物或修飾較佳選自適用於轉錄及/或轉譯之核苷酸類似物。
可併入包含如本文所述之mRNA序列的經修飾之mRNA化合物中的經修飾之核苷及核苷酸可在糖部分中經修飾。例如，2'羥基(OH)可用許多不同的「氧基」或「去氧」取代基修飾或置換。「氧基」-2'羥基修飾之實例包括但不限於烷氧基或芳氧基（-OR，例如，R=H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖）；聚乙二醇(PEG)，—O(CH 2CH 2) nCH 2CH 2OR；「經鎖定之」核酸 (LNA)，其中2'羥基藉由例如亞甲基橋連接至同一核糖之4'碳；以及胺基（-O-胺基，其中胺基，例如NRR，可為烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳胺基、二芳胺基、雜芳胺基或二雜芳胺基、乙二胺、聚胺基）或胺基烷氧基。
「去氧」修飾包括氫、胺基（例如，NH2；烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳胺基、二芳胺基、雜芳胺基、二雜芳胺基或胺基酸）；或者胺基可經由連接子連接至糖上，其中連接子包含原子C、N及O中之一或多者。
糖基團亦可含有一或多個碳，該一或多個碳之立體化學構型與核糖中相應碳之立體化學構型相反。因此，經修飾之mRNA可包括含有例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。
磷酸骨架可在經修飾之核苷及核苷酸中進一步經修飾，它們可併入包含如本文所述之mRNA序列的經修飾之mRNA化合物中。可藉由用不同取代基置換一或多個氧原子來修飾骨架之磷酸酯基團。此外，經修飾之核苷及核苷酸可包括用本文所述的經修飾之磷酸酯完全置換未經修飾之磷酸酯部分。經修飾之磷酸酯基團之實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、膦酸氫酯、胺基磷酸酯、膦酸烷酯或膦酸芳酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯之兩個非連接氧皆由硫置換。磷酸酯連接子亦可藉由用氮（橋連之胺基磷酸酯）、硫（橋連之硫代磷酸酯）及碳（橋連之亞甲基-膦酸酯）置換連接氧來修飾。
可併入包含如本文所述之mRNA序列的經修飾之mRNA化合物中的經修飾之核苷及核苷酸可在核鹼基部分中進一步經修飾。見於mRNA中的核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。
例如，本文所述之核苷及核苷酸可在大溝面上進行化學修飾。在一些實施例中，大溝化學修飾可包括胺基、硫醇基、烷基或鹵基。
在本發明之特別較佳實施例中，核苷酸類似物/修飾係選自鹼基修飾，其較佳選自2-胺基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-胺基嘌呤-核苷-5'-三磷酸、2-胺基腺苷-5'-三磷酸、2'-胺基-2'-去氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸、4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮雜胞苷-5'-三磷酸、6-氮雜尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-去氮腺苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸、8-疊氮基腺苷-5'-三磷酸、本並咪唑-核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鳥苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、或嘌呤黴素-5'-三磷酸、黃苷-5'-三磷酸。特別較佳為用於鹼基修飾之核苷酸，其係選自由以下鹼基修飾之核苷酸組成之群：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸及假尿苷-5'-三磷酸。
在一些實施例中，經修飾之核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。
在一些實施例中，經修飾之核苷包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯胞苷、5-甲醯胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基- 假異胞苷及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。
在其他實施例中，經修飾之核苷包括2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤。
在其他實施例中，經修飾之核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫鳥苷、N2-甲基-6-硫鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫鳥苷。
在一些實施例中，核苷酸可在大溝面上經修飾並且可包括用甲基或鹵基置換尿嘧啶之C-5上的氫。在特定實施例中，經修飾之核苷為5′-O-(1-硫磷酸)-腺苷、5′-O-(1-硫磷酸)-胞苷、5′-O-(1-硫磷酸)-鳥苷、5′-O-(1-硫磷酸)-尿苷或5′-O-(1-硫磷酸)-假尿苷。
在其他特定實施例中，經修飾之mRNA可包含選自以下之核苷修飾：6-氮雜-胞苷、2-硫基-胞苷、α-硫基-胞苷、假異胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫基-尿苷、4-硫基-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫基-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-胞苷、8-側氧基-鳥苷、7-去氮-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、假-異-胞苷、 6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫基-腺苷、8-疊氮基-腺苷、7-去氮-腺苷。
在本發明之一極特定實施例中，mRNA化合物不包含如上所述之鹼基修飾。
根據又一實施例，包含如本文所定義之mRNA序列的經修飾之mRNA化合物可含有脂質修飾。此類脂質修飾之mRNA通常包含如本文所定義之mRNA。如本文所定義的此類脂質修飾之mRNA通常進一步包含至少一個與該mRNA共價連接之連接子，及至少一種與相應連接子共價連接之脂質。替代地，脂質修飾之mRNA包含至少一種如本文所定義之mRNA及至少一種與該mRNA共價連接（無連接子）之（雙功能）脂質。根據第三替代方案，脂質修飾之mRNA包含如本文所定義之mRNA分子、至少一個與該mRNA共價連接之連接子及至少一種與相應連接子共價連接之脂質，以及至少一種與該mRNA共價連接（無連接子）之（雙功能）脂質。在此上下文中，特別較佳地，脂質修飾存在於線性mRNA序列之末端處。
根據另一實施例，包含脂質奈米顆粒之mRNA包含含有mRNA序列之mRNA化合物，該mRNA序列可藉由修飾包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物之mRNA序列(較佳至少一個編碼區)之鳥苷/胞嘧啶(G/C)含量來修飾，並由此穩定。
在本發明之一特別較佳實施例中，與相應野生型mRNA(亦即未經修飾之mRNA)的編碼區之G/C含量相比，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物之編碼區之G/C含量經修飾，具體係增加的。與由相應野生型mRNA編碼之胺基酸序列相比，由mRNA編碼之胺基酸序列較佳未經修飾。本發明之mRNA序列之此修飾係基於以下實情：待轉譯之任何mRNA區域的序列對於該mRNA之有效轉譯而言很重要。因此，mRNA之組成及各種核苷酸之序列係重要的。具體而言，具有增加的G（鳥苷）/C（胞嘧啶）含量之序列比具有增加的A（腺苷）/U（尿嘧啶）含量之序列更穩定。根據本發明，與相應的野生型mRNA相比，mRNA之密碼子因此改變，同時保留所轉譯之胺基酸序列，使得它們包括增加量之G/C核苷酸。關於若干密碼子編碼同一個胺基酸之事實（所謂的遺傳密碼簡並），可確定最有利於穩定性之密碼子（所謂的替代密碼子使用）。與野生型序列相比，視待由mRNA編碼之胺基酸而定，mRNA序列有多種修飾可能性。對於由排他地含有G或C核苷酸之密碼子編碼的胺基酸，不需要密碼子修飾。因此，Pro（CCC或CCG）、Arg（CGC或CGG）、Ala（GCC或GCG）及Gly（GGC或GGG）之密碼子不需要修飾，因為不存在A或U。相反，含有A及/或U核苷酸之密碼子可藉由其他密碼子之取代來修飾，該等其他密碼子編碼相同的胺基酸但不含A及/或U。它們之實例為：Pro之密碼子可自CCU或CCA修飾為CCC或CCG；Arg之密碼子可自CGU或CGA或AGA或AGG修飾為CGC或CGG；Ala之密碼子可自GCU或GCA修飾為GCC或GCG；Gly之密碼子可自GGU或GGA修飾為GGC或GGG。在其他情況下，雖然不能自密碼子中消除A或U核苷酸，但可藉由使用含有較低A及/或U核苷酸含量之密碼子來減少A及U之含量。它們之實例為：Phe之密碼子可自UUU修飾為UUC；Leu之密碼子可自UUA、UUG、CUU或CUA修飾為CUC或CUG；Ser之密碼子可自UCU或UCA或AGU修飾為UCC、UCG或AGC；Tyr之密碼子可自UAU修飾為UAC；Cys之密碼子可自UGU修飾為UGC；His之密碼子可自CAU修飾為CAC；Gin之密碼子可自CAA修飾為CAG；Ile之密碼子可自AUU或AUA修飾為AUC；Thr之密碼子可自ACU或ACA修飾為ACC或ACG；Asn之密碼子可自AAU修飾為AAC；Lys之密碼子可自AAA修飾為AAG；Val之密碼子可自GUU或GUA修飾為GUC或GUG；Asp之密碼子可自GAU修飾為GAC；Glu之密碼子可自GAA修飾為GAG；終止密碼子UAA可修飾為UAG或UGA。另一方面，對於Met (AUG)及Trp (UGG)之密碼子，則沒有序列修飾之可能性。上面列出之取代可單獨使用或以所有可能的組合使用，以增加本發明之mRNA序列與其特定野生型mRNA（亦即原始序列）相比之G/C含量。因此，例如，可將野生型序列中出現的Thr之所有密碼子修飾為ACC（或ACG）。然而，較佳地，例如，使用上述取代可能性之組合：
原始序列（野生型mRNA）中編碼Thr之所有密碼子取代為ACC（或ACG），並且原始編碼Ser之所有密碼子取代為UCC（或UCG或AGC）；
原始序列中編碼Ile之所有密碼子取代為AUC並且
原始編碼Lys之所有密碼子取代為AAG並且
原始編碼Tyr之所有密碼子取代為UAC；
原始序列中編碼Val之所有密碼子取代為GUC (或GUG)並且
原始編碼Glu之所有密碼子取代為GAG並且
原始編碼Ala之所有密碼子取代為GCC (或GCG)並且
原始編碼Arg之所有密碼子取代為CGC (或CGG)；
原始序列中編碼Val之所有密碼子取代為GUC (或GUG)並且
原始編碼Glu之所有密碼子取代為GAG並且
原始編碼Ala之所有密碼子取代為GCC (或GCG)並且
原始編碼Gly之所有密碼子取代為GGC (或GGG)並且
原始編碼Asn之所有密碼子取代為AAC；
原始序列中編碼Val之所有密碼子取代為GUC (或GUG)並且
原始編碼Phe之所有密碼子取代為UUC並且
原始編碼Cys之所有密碼子取代為UGC並且
原始編碼Leu之所有密碼子取代為CUG (或CUC)並且
原始編碼Gin之所有密碼子取代為CAG並且
原始編碼Pro之所有密碼子取代為CCC (或CCG)；等
較佳地，與野生型RNA之編碼區的G/C含量相比，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物之編碼區的G/C含量增加了至少7%、更佳至少15%、特別較佳至少20%，其編碼如本文所定義之抗原或其片段或變異體。根據一特定實施例，在編碼如本文所定義之肽或蛋白質或其片段或變異體或野生型mRNA序列之整個序列的區域中至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%且最佳至少90%、95%或甚至 100%之可取代密碼子經取代，從而增加該序列之GC/含量。在此上下文中，特別較佳地將本發明之mRNA序列的G/C含量，較佳本發明之mRNA序列的至少一個編碼區之G/C含量與野生型序列相比增加至最大(亦即，100%之可取代密碼子)。根據本發明，本發明之mRNA序列之又一較佳修飾係基於以下發現：轉譯效率亦由細胞中tRNA出現之不同頻率決定。因此，若本發明之mRNA序列中存在所謂的「稀有密碼子」之程度增加，則相應經修飾之mRNA序列的轉譯程度明顯低於密碼子編碼相對「頻繁」之tRNA的情況。根據本發明，在本發明之經修飾之mRNA序列中，與野生型mRNA序列之相應區域相比，編碼本文所定義之肽或蛋白質或其片段或變異體的區域經修飾，以使得野生型序列之至少一個密碼子(其編碼在細胞中相對罕見之tRNA)交換為一個密碼子，該密碼子編碼在細胞中相對頻繁之tRNA，並攜帶與相對罕見之tRNA相同的胺基酸。藉由此修飾，本發明之mRNA的序列經修飾，以使得插入頻繁出現之tRNA可用的密碼子。換言之，根據本發明，藉由此修飾，編碼細胞中相對罕見之tRNA的野生型序列之所有密碼子在各情況下均可交換為編碼tRNA之密碼子，該tRNA在細胞中相對常見並在各情況下均攜帶與相對罕見之tRNA相同的胺基酸。熟習此項技術者已知哪些tRNA在細胞中相對頻繁地出現，而哪些相對罕見地出現；參看，例如Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666。特別較佳的為用於特定胺基酸之密碼子(最頻繁出現之tRNA)，例如使用在(人類)細胞中最頻繁出現之tRNA的Gly密碼子。根據本發明，特別較佳地將在本發明的經修飾之mRNA序列中增加、具體而言最大化的連續G/C含量與「頻繁」密碼子相關聯，而不修飾由mRNA序列之編碼區編碼的蛋白質之胺基酸序列。此較佳實施例允許提供本發明之特別有效轉譯及穩定(修飾)的mRNA序列。可使用WO02/098443中說明之計算機程式進行如上所述的本發明之經修飾之mRNA序列的測定（增加的G/C含量；tRNA之交換）——其揭露內容以其全部範疇包括在本發明中。使用此計算機程式，可藉助於遺傳密碼或其簡並性修飾任何所需mRNA序列之核苷酸序列，以使得結合使用編碼細胞中儘可能頻繁出現之tRNA的密碼子，得到最大的G/C含量，與未經修飾之序列相比，由經修飾之mRNA序列編碼的胺基酸序列較佳不經修飾。替代地，與原始序列相比，亦可能僅修改G/C含量或僅修改密碼子使用。Visual Basic 6.0中之原始碼（所使用之開發環境：Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Servicepack 3) 在WO02/098443中亦有描述。在本發明之又一較佳實施例中，本發明之mRNA序列的核糖體結合位點環境中的A/U含量與其相應野生型mRNA之核糖體結合位點環境中的A/U含量相比係增加的。此修飾（核糖體結合位點周圍增加的A/U含量）提高核糖體與mRNA結合之效率。核糖體與核糖體結合位點之有效結合(Kozak序列： SEQ ID NO: 224307或SEQ ID NO: 224308，AUG形成起始密碼子) 反之亦具有mRNA有效轉移之作用。根據本發明之又一實施例，本發明之mRNA序列可關於潛在去穩之序列元件經修飾。具體地，與相應野生型mRNA相比，此mRNA序列之編碼區及/或5'及/或3'非轉譯區可經修飾，以使得它不含去穩序列元件，經修飾之mRNA序列的編碼胺基酸序列與其相應的野生型mRNA相比較佳不經修飾。眾所周知，例如在真核mRNA序列中，會出現去穩序列元件(DSE)，訊號蛋白與該元件結合並在活體內調節mRNA之酶促降解。為了進一步穩定化經修飾之mRNA序列，視情況在編碼至少一種如本文所定義之肽或蛋白質或其片段或變異體的區域中，與野生型mRNA之相應區域相比，可因此進行一或多種此類修飾，使得在彼處不含或實質上不含去穩序列元件。根據本發明，亦可藉由此類修飾自本發明之mRNA序列中消除存在於非轉譯區(3'-及/或5'-UTR)中的DSE。此類去穩序列為例如富含AU之序列(AURES)，其出現在許多不穩定的mRNA之3'-UTR部分中(Caput等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670至1674)。因此，與相應野生型mRNA相比，本發明之mRNA序列較佳經修飾，以使得本發明之mRNA序列不包含此類去穩定序列。此亦適用於彼等由可能的核酸內切酶識別之序列模體，例如序列GAACAAG，其包含在編碼轉鐵蛋白受體的基因之3'-UTR鏈段中(Binder等人, EMBO J. 1994, 13: 1969至1980)。較佳在本發明之mRNA序列中亦移除此等序列模體。
根據一較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，其中該編碼區包含或由如在具有數字識別符＜223＞之序列表或分別在PCT/EP2016/075843（其以引用之方式併入本文）之表1-5或第20-24圖之「縱行C」中所揭示的(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成，該數字識別符＜223＞係如下開頭：「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt1）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt2）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt3）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt4）」或「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt5）」。
根據一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
在又一較佳實施例中，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含RNA序列或由RNA序列組成，該RNA序列與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%相同或具有此序列一致性。
根據一特別較佳實施例，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含或由與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體具有至少80%之序列一致性的RNA序列組成。
根據本發明，含有包含在包含本發明之脂質奈米顆粒的mRNA之mRNA中的mRNA序列之mRNA化合物的又一較佳修飾係基於以下發現：編碼相同胺基酸之密碼子通常以不同頻率出現。根據本發明，在包含本發明之mRNA序列的經修飾之mRNA化合物中，與相應野生型mRNA之相應編碼區相比，如本文所定義之編碼區較佳經修飾，以使得編碼相同胺基酸之密碼子的頻率根據人類密碼子使用，對應於該密碼子之天然出現頻率。
例如，在由包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物之至少一個編碼區編碼的胺基酸序列中存在的胺基酸丙胺酸(Ala)之情況下，野生型編碼區較佳適於以下方式：密碼子「GCC」以0.40之頻率使用，密碼子「GCT」以0.28之頻率使用，密碼子「GCA」以0.22之頻率使用，且密碼子「GCG」以0.10之頻率使用等。
根據一較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義的mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自埃博拉病毒之抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列之片段或變異體組成。
在又一較佳實施例中，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含RNA序列或由RNA序列組成，該RNA序列與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%相同或具有此序列一致性。
根據一特別較佳實施例，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含或由與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體具有至少80%之序列一致性的RNA序列組成。
如上所述，根據本發明較佳地，編碼細胞中相對罕見之tRNA的野生型序列之所有密碼子交換成編碼細胞中相對頻繁且在各情況下均攜帶與相對罕見之tRNA相同的胺基酸之tRNA的密碼子。該種優化程序增加密碼子適應指數(CAI)並最終使CAI最大化。在本發明之上下文中，CAI增加或最大化之序列通常稱為「密碼子優化之」序列及/或CAI增加及/或最大化之序列。根據一較佳實施例，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物包含至少一個編碼區，其中該編碼區/序列係如本文所述經密碼子優化的。更佳地，至少一個編碼序列之密碼子適應指數(CAI)為至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最佳地，至少一個編碼序列之密碼子適應指數(CAI)為1。
例如，在由根據本發明之RNA的至少一個編碼序列編碼的胺基酸序列中存在的胺基酸丙胺酸(Ala)之情況下，野生型編碼序列以最頻繁之人類密碼子「GCC」總用於該胺基酸之方式進行適應，或者對於胺基酸半胱胺酸（Cys）而言，野生型序列以最頻繁之人類密碼子「TGC」總用於該胺基酸之方式進行適應，等等。
根據一較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
在又一較佳實施例中，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含RNA序列或由RNA序列組成，該RNA序列與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%相同或具有此序列一致性。
根據一特別較佳實施例，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含或由與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體具有至少80%之序列一致性的RNA序列組成。
根據另一實施例，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物可藉由修改、較佳增加mRNA序列(較佳mRNA序列之編碼區)的胞嘧啶(C)含量來修飾。
在本發明之一特別較佳實施例中，與相應野生型mRNA，亦即未經修飾之mRNA的編碼區之C含量相比，本發明之mRNA序列的編碼區之C含量經修改，較佳係增加的。與由相應野生型mRNA編碼之胺基酸序列相比，由本發明之mRNA序列的至少一個編碼區編碼之胺基酸序列較佳不經修飾。
在本發明之一較佳實施例中，經修飾之mRNA序列經修飾以使得達成至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%、或至少90%理論上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量。
在其他較佳實施例中，靶mRNA野生型序列之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%密碼子(它們為「胞嘧啶含量可優化的」) 由比野生型序列中存在的密碼子具有更高胞嘧啶含量之密碼子置換。
在又一較佳實施例中，野生型編碼序列之一些密碼子可另外經修飾，以使得細胞中相對罕見之tRNA的密碼子由細胞中相對頻繁之tRNA的密碼子交換，限制條件為相對頻繁tRNA的經取代之密碼子 攜帶與原始野生型密碼子之相對罕見tRNA相同的胺基酸。較佳地，相對罕見tRNA之所有密碼子均由細胞中相對頻繁tRNA之密碼子置換，編碼排他地由不含任何胞嘧啶之密碼子編碼的胺基酸之密碼子除外，或由兩個密碼子編碼之麩醯胺(Gln)除外，這兩個密碼子各自含有相同數量之胞嘧啶。
在本發明之又一較佳實施例中，經修飾之靶mRNA經修飾以使得藉助於密碼子達成至少80%或至少90%理論上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量，該等密碼子編碼細胞中相對頻繁之tRNA，其中胺基酸序列保持不變。
由於遺傳密碼的天然存在之簡並性，多於一個密碼子可編碼特定的胺基酸。因此，20個天然存在之胺基酸中有18個由一個以上密碼子，例如由2個密碼子（例如Cys、Asp、Glu）、由3個密碼子（例如Ile）、由4個密碼子（例如A1、Gly、Pro）或由6個密碼子（例如Leu、Arg、Ser）編碼（其中Tryp及Met為例外）。然而，並非所有編碼相同胺基酸之密碼子在活體內條件下均以相同頻率使用。視每個單一生物而定，建立典型的密碼子使用譜。
在本發明之上下文中使用的術語「胞嘧啶含量可優化之密碼子」係指與編碼相同胺基酸之其他密碼子相比呈現出更低的胞嘧啶含量之密碼子。因此，任何野生型密碼子當可由編碼相同胺基酸並在該密碼子內呈現出更高數量之胞嘧啶的另一密碼子置換時，被視為胞嘧啶可優化的（C可優化的）。由野生型編碼區內特定的C優化密碼子對C可優化野生型密碼子之任何此類取代增加了其總體C含量並反映了富含C的經修飾之mRNA序列。根據一較佳實施例，本發明之mRNA序列，較佳地，本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含或由C最大化之mRNA序列組成，該C最大化之mRNA序列含有所有潛在C優化密碼子的C優化之密碼子。因此，100%或所有理論上可置換之C可優化密碼子較佳在編碼區之整個長度上由C優化密碼子置換。
在此上下文中，胞嘧啶含量可優化之密碼子為含有比編碼相同胺基酸之其他密碼子更少數量之胞嘧啶的密碼子。
密碼子GCG、GCA、GCU中之任一者編碼胺基酸Ala，其可由編碼相同胺基酸之密碼子GCC交換，及/或
編碼Cys之密碼子UGU可由編碼相同胺基酸之密碼子UGC交換，及/或
編碼Asp之密碼子GAU可由編碼相同胺基酸之密碼子GAC交換，及/或
編碼Phe之密碼子UUU可由編碼相同胺基酸之密碼子UUC交換，及/或
編碼Gly之密碼子GGG、GGA、GGU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子GGC交換，及/或
編碼His之密碼子CAU可由編碼相同胺基酸之密碼子CAC交換，及/或
編碼Ile之密碼子AUA、AUU中之任一者可由密碼子AUC交換，及/或
編碼Leu之密碼子UUG、UUA、CUG、CUA、CUU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子CUC交換，及/或
編碼Asn之密碼子AAU可由編碼相同胺基酸之密碼子AAC交換，及/或
編碼Pro之密碼子CCG、CCA、CCU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子CCC交換，及/或
編碼Arg之密碼子AGG、AGA、CGG、CGA、CGU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子CGC交換，及/或
編碼Ser之密碼子AGU、AGC、UCG、UCA、UCU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子UCC交換，及/或
編碼Thr之密碼子ACG、ACA、ACU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子ACC交換，及/或
編碼Val之密碼子GUG、GUA、GUU中之任一者可由編碼相同胺基酸之密碼子GUC交換，及/或
編碼Tyr之密碼子UAU可由編碼相同胺基酸之密碼子UAC交換。
在任何上述情況下，每個交換密碼子之胞嘧啶數量增加1。編碼區之所有非C優化密碼子（對應於C可優化密碼子）的交換產生C最大化之編碼序列。在本發明之上下文中，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區內的至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%之非C優化密碼子由C優化密碼子置換。
可能較佳地，對於一些胺基酸，由C優化密碼子置換的C可優化密碼子之百分比小於70%，而對於其他胺基酸，所置換密碼子之百分比高於70%以滿足C優化之總體百分比達編碼區之所有C可優化野生型密碼子的至少70%。
較佳地，在本發明之C優化mRNA序列中，任何給定胺基酸的C可優化野生型密碼子之至少50%由C優化密碼子置換，例如，任何經修飾之富含C的mRNA序列較佳在C可優化野生型密碼子位置處含有至少50%、較佳至少60%的C優化密碼子，其編碼上述胺基酸Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val及Tyr中之任一者。
在此上下文中，編碼胺基酸之密碼子無需任何進一步的選擇過程即可使用，該等胺基酸不為胞嘧啶含量可優化的，但由至少兩個密碼子編碼。然而，編碼細胞(例如人類細胞)中相對罕見tRNA之野生型序列的密碼子可交換為編碼細胞中相對頻繁tRNA之密碼子，其中兩者編碼相同的胺基酸。因此，編碼Glu之相對罕見密碼子GAA可由編碼相同胺基酸之相對頻繁密碼子GAG交換，及/或
編碼Lys之相對罕見密碼子AAA可由編碼相同胺基酸之相對頻繁密碼子AAG交換，及/或
編碼Gin之相對罕見密碼子CAA可由編碼相同胺基酸之相對頻繁密碼子CAG交換。
在此上下文中，僅由一個密碼子編碼之胺基酸Met (AUG)及Trp (UGG)保持不變。終止密碼子不為胞嘧啶含量優化的，然而，相對罕見之終止密碼子mber、ochre (UAA, UAG)可由相對頻繁之終止密碼子opal (UGA)交換。
上面列出之單個取代可單獨使用，亦可以所有可能的組合使用，以便與野生型mRNA序列相比，優化經修飾之mRNA序列的胞嘧啶含量。
因此，與相應野生型mRNA之編碼區相比，至少一個本文所定義之編碼序列可如此改變，使得胺基酸由至少兩個或更多個密碼子編碼，其中一個密碼子包含一個額外的胞嘧啶，該種密碼子可由包含一個額外胞嘧啶之C優化密碼子交換，其中與野生型序列相比，該胺基酸較佳未經改變。
根據一較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自A型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自B型流感病毒之神經胺糖酸酶(NA)的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
根據又一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含如本文所定義之mRNA序列，該mRNA序列包含至少一個編碼區，該編碼區編碼至少一種源自狂犬病病毒之醣蛋白的抗原肽或蛋白質，其中該編碼區包含或由（經修飾之）RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成。
在又一較佳實施例中，根據本發明之mRNA序列的至少一個編碼區包含RNA序列或由RNA序列組成，該RNA序列與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、較佳至少70%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、甚至更佳至少90%且最佳至少95%或甚至97%相同或具有此序列一致性。
根據一特別較佳實施例，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物之至少一個編碼區包含或由與(經修飾之)RNA序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體具有至少80%之序列一致性的RNA序列組成。
根據一特別較佳實施例，本發明提供包含脂質奈米顆粒之mRNA，其中該mRNA包含含有至少一個如本文所定義之編碼區的mRNA序列，其中該mRNA序列之至少一個編碼區的G/C含量與相應野生型mRNA之相應編碼區的G/C含量相比係增加的，及/或
其中該mRNA序列之至少一個編碼區的C含量與相應野生型mRNA之相應編碼區的C含量相比係增加的，及/或
其中該mRNA序列之至少一個編碼區中的密碼子適於人類密碼子使用，其中密碼子適應指數(CAI)在該mRNA序列之至少一個編碼區中較佳為增加的或最大化，
且其中與由相應野生型mRNA編碼之胺基酸序列相比，由mRNA序列編碼之胺基酸序列較佳未經修飾。
根據本發明之另一較佳實施例，如本文所定義的經修飾之mRNA序列可藉由添加所謂的「5′-CAP結構」來修飾，該結構較佳穩定如本文所述之mRNA。5'-CAP為實體，通常為經修飾之核苷酸實體，它通常為成熟mRNA之5'-端「加帽」。5'-CAP通常可由經修飾之核苷酸、具體由鳥嘌呤核苷酸之衍生物形成。較佳地，5'-CAP經由5'-5'-三磷酸鍵連接至5'-端。5'-CAP可經甲基化，例如m7GpppN，其中N為攜帶5'-CAP 的核酸之末端5'核苷酸，通常為mRNA之5'-端。m7GpppN為5'-CAP結構，其天然存在於由聚合酶II轉錄之mRNA中，且因此較佳不被視為包含於在此上下文中經修飾之mRNA中的修飾。因此，本發明的經修飾之mRNA序列可包含m7GpppN作為5'-帽，但另外，經修飾之mRNA序列通常包含至少一個如本文所定義之其他修飾。
5′-CAP結構之進一步實例包括甘油基、反向去氧無鹼基殘基（部分）、4′,5′亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳環核苷酸、1,5-脫水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾之鹼基核苷酸、蘇-呋喃戊糖基核苷酸、非環3',4'-第二核苷酸、非環3,4-二羥基丁基核苷酸、非環3,5 二羥基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向無鹼基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、 胺基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或橋接或非橋接甲基膦酸酯部分。此等經修飾之5'-CAP結構在此上下文中被視為至少一種修飾。
特別較佳的經修飾之5′-CAP結構為cap1（m7G之相鄰核苷酸之核糖的甲基化）、cap2（m7G下游第2核苷酸之核糖的額外甲基化）、cap3（m7G下游第3核苷酸之核糖的額外甲基化）、cap4（m7G下游第4核苷酸之核糖的甲基化）、ARCA（抗反向CAP類似物、經修飾之ARCA（例如硫代磷酸酯修飾之ARCA）、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-去氮- 鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。因此，根據本發明之RNA較佳包含5'-CAP結構。
根據又一較佳實施例，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物可在3'-端含有聚A尾，其通常具有約10至200個腺苷核苷酸、較佳約10至100個腺苷核苷酸、更佳約40至80個腺苷核苷酸或甚至更佳約50至70個腺苷核苷酸。
較佳地，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物中之聚(A)序列藉由RNA活體外轉錄衍生自DNA模板。替代地，聚(A)序列亦可藉由化學合成之常用方法在活體外獲得，而不必由DNA前驅物轉錄。此外，可使用可市售之多腺苷酸化套組及此項技術已知的相應方案，藉由根據本發明之RNA的酶促多腺苷酸化生成聚(A)序列或聚(A)尾。
替代地，如本文所述之mRNA視情況包含多腺苷酸化訊號，其在本文中定義為藉由特定蛋白質因子（例如切割及多腺苷酸化特異性因子（CPSF）、切割刺激因子（CstF）、切割因子I及II (CF I及CF II)、聚(A)聚合酶(PAP)）將多腺苷酸化傳遞至（所轉錄之）RNA的訊號。在此上下文中，較佳為包含NN(U/T)ANA共有序列之共有多腺苷酸化訊號。在一特別較佳態樣中，多腺苷酸化訊號包含以下序列之一：AA(U/T)AAA 或A(U/T)(U/T)AAA （其中尿苷通常存在於RNA中，而胸苷通常存在於DNA中）。
根據又一較佳實施例，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物可在3'-端含有聚(C)尾，其通常具有約10至200個胞嘧啶核苷酸、較佳約10至100個胞嘧啶核苷酸、更佳約20至70個胞嘧啶核苷酸或甚至更佳約20至60或甚至10至40個胞嘧啶核苷酸。
在一個較佳實施例中，包含mRNA序列之mRNA化合物較佳在5'-至3'-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼區，其編碼至少一種抗原肽或蛋白質，
c) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約125個腺苷、且最佳約 85至約95個腺苷, 並且在某些實施例中，95個腺苷；
d) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。；
在一更佳實施例中，mRNA序列較佳在5'-至3'-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之編碼區，該抗原肽或蛋白質源自流感或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，
c) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約95個腺苷, 並且在某些實施例中，95個腺苷；
d) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。
在一特別較佳實施例中，mRNA序列較佳在5′-至3′-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之編碼區，該抗原肽或蛋白質源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，該編碼區較佳包含或由如具有數字識別符＜223＞之序列表中所揭示的核酸序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成，該序列係如下開頭：「經衍生及/或經修飾之CDS序列(wt)」或「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt1）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt2）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt3）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt4）」或「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt5）」，
c) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約105個腺苷, 並且在某些實施例中，97至101個腺苷；
d) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。
在一較佳實施例中，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物包含至少一個5'-或3'-UTR元件。在此上下文中，UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自任何天然存在基因之5'-或3'-UTR，或源自基因之5'-或3'-UTR之片段、同源物或變異體。較佳地，根據本發明使用之5'-或3'-UTR元件與本發明之mRNA序列的至少一個編碼區為異源的。即使源自天然存在之基因的5'-或3'-UTR元件為較佳的，在本發明之上下文中亦可使用合成工程改造之UTR元件。
術語「3'-UTR元件」通常係指核酸序列，其包含或由源自3'-UTR或源自3'-UTR之變異體的核酸序列組成。在本發明之意義上的3'-UTR元件可代表RNA(較佳mRNA)之3'-UTR。因此，在本發明之意義上，較佳地，3'-UTR元件可為RNA(較佳mRNA)之3'-UTR，或其可為RNA之3'-UTR的轉錄模板。因此，3'-UTR元件較佳為對應於RNA之3'-UTR，較佳對應於mRNA諸如藉由經基因工程改造之載體構築體的轉錄獲得之mRNA的3'-UTR之核酸序列。較佳地，3'-UTR元件實現3'-UTR之功能或編碼實現3'-UTR之功能的序列。
較佳地，至少一個3'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自脊索動物基因、較佳脊椎動物基因、更佳哺乳動物基因、最佳人類基因之3'-UTR，或源自脊索動物基因、較佳脊椎動物基因、更佳哺乳動物基因、最佳人類基因之3'-UTR的變異體。
較佳地，包含本發明之mRNA序列的mRNA化合物包含3'-UTR元件，其可源自與具有延長半衰期（由此提供穩定的mRNA）之mRNA相關的基因，例如，如下文定義及描述之3'-UTR元件。較佳地，3'-UTR元件為源自基因之3'-UTR或該基因之同源物、片段或變異體的核酸序列，該基因較佳編碼穩定的mRNA。
在一特別較佳實施例中，3'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自選自由以下組成之群的基因之3′-UTR：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、 酪胺酸羥化酶基因、脂肪加氧酶基因及膠原蛋白α基因，諸如膠原蛋白α1(I)基因；或源自選自由以下組成之群的基因之3′-UTR之變異體：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪胺酸羥化酶基因、脂肪加氧酶基因及膠原蛋白α基因，諸如根據專利申請案WO2013/143700(其揭露內容以引用之方式併入本文)之SEQ ID NO: 1369-1390的膠原蛋白α1(I)基因；或源自該等基因之同源物、片段或變異體。在一特別較佳實施例中，3'-UTR元件包含或由源自白蛋白基因、較佳脊椎動物白蛋白基因、更佳哺乳動物白蛋白基因之3'-UTR的核酸序列組成。
術語「核酸序列，其衍生自[ . . . ]基因之3′-UTR」較佳係指核酸序列，該核酸序列係基於[ . . . ]基因之3′-UTR序列或其部分，諸如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪胺酸羥化酶基因、脂肪加氧酶基因或膠原蛋白α基因諸如膠原蛋白α1(I)基因、較佳白蛋白基因之3′-UTR或其部分。此術語包括對應於基因之整個3'-UTR序列(亦即全長3'-UTR序列)的序列，以及對應於基因之3'-UTR序列之片段的序列，該基因為諸如白蛋白基因，α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪胺酸羥化酶基因、脂肪加氧酶基因或膠原蛋白α基因，諸如膠原蛋白α1(I)基因，較佳為白蛋白基因。
術語「核酸序列，其衍生自[ . . . ]基因之3′-UTR之變異體」較佳係指核酸序列，該核酸序列係基於基因之3′-UTR序列之變異體，諸如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪胺酸羥化酶基因、脂肪加氧酶基因或膠原蛋白α基因諸如膠原蛋白α1(I)基因之3′-UTR之變異體，或基於如上所述之其部分。此術語包括對應於基因之3'-UTR的變異體之整個序列(亦即基因之全長變異3'-UTR序列)的序列，以及對應於基因之變異3'-UTR序列之片段的序列。在此上下文中，片段較佳由對應於全長變異3'-UTR中的連續核苷酸段的連續核苷酸段組成，該連續核苷酸段代表至少20%、較佳至少30%、更佳至少40%、更佳至少50%、甚至更佳至少60%、甚至更佳至少70%、甚至更佳至少80%且最佳至少90%之全長變異3'-UTR。在本發明之意義上，變異體之此類片段較佳為如本文所述之變異體之功能片段。
根據一較佳實施例，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物包含5'-CAP結構及/或至少一個3'-非轉譯區元件（3'-UTR元件），較佳如本文所定義。更佳地，RNA進一步包含如本文所定義之5'-UTR元件。
在一個較佳實施例中，包含mRNA序列之mRNA化合物較佳在5'-至3'-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼區，其編碼至少一種抗原肽或蛋白質，
c) 視情況選用之3'-UTR元件，較佳包含或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或變異體之核酸序列組成；
d) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約105個腺苷, 並且在某些實施例中，97至101個腺苷；
e) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。
在一較佳實施例中，mRNA序列較佳在5'-至3'-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之編碼區，該抗原肽或蛋白質較佳源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，
c) 視情況選用之3'-UTR元件，較佳包含或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或變異體之核酸序列組成；
d) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約105個腺苷, 並且在某些實施例中，97至101個腺苷；
e) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。
在一特別較佳實施例中，mRNA序列較佳在5′-至3′-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppAm(Cap1)及m7GpppA(Cap0)；
b) 至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之編碼區，該抗原肽或蛋白質較佳源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，或此等序列中之任一者之片段或變異體，
c) 視情況選用之3'-UTR元件，較佳包含或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或變異體之核酸序列組成；
d) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約105個腺苷, 並且在某些實施例中，97至101個腺苷；
e) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。
在一特別較佳實施例中，包含mRNA序列之至少一種mRNA化合物包含至少一個5′-非轉譯區元件(5′-UTR元件)。較佳地，至少一個5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自TOP基因之5'-UTR或源自TOP基因之5'-UTR的片段、同源物或變異體。
特別較佳地，5'-UTR元件不包含如上所定義之TOP模體或5'-TOP。
在一些實施例中，源自TOP基因之5'-UTR的5'-UTR元件之核酸序列在其3'-末端處以位於其所來源的基因或mRNA之起始密碼子(例如A(U/T)G)上游之位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處的核苷酸終止。因此，5'-UTR元件不包含蛋白質編碼區之任何部分。因此，較佳地，至少一個mRNA序列之唯一蛋白質編碼部分由編碼區提供。
源自TOP基因之5'-UTR的核酸序列較佳源自真核TOP基因、較佳植物或動物TOP基因、更佳脊索動物TOP基因、甚至更佳脊椎動物TOP基因、最佳哺乳動物TOP基因，諸如人類TOP基因。
例如，5'-UTR元件較佳選自包含核酸序列或由核酸序列組成之5'-UTR元件。
在一較佳實施例中，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物之5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列來源於自核苷酸位置5（亦即位於序列中之位置5處的核苷酸）延伸至緊鄰起始密碼子5'之核苷酸位置（位於序列之3'-端）的核酸序列。
在一特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自編碼核糖體蛋白的TOP基因之5'-UTR或源自編碼核糖體蛋白的TOP基因之5'-UTR的變異體。例如，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自根據專利申請案WO2013/143700之SEQ ID NO: 67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138及1284-1360中之任一者的核酸序列之5′-UTR、如本文所述之相應RNA序列、其同源物或其變異體，較佳缺乏5′-TOP模體。如上所述，自位置5延伸至緊鄰ATG 5'之核苷酸（位於序列之3'端）的序列對應於該序列之5'-UTR。
較佳地，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自編碼核糖體大蛋白(RPL)的TOP基因之5'-UTR或源自編碼核糖體大蛋白(RPL)的TOP基因之5'-UTR的同源物或變異體。例如，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自根據PCT專利申請公開案WO2013/143700(其以引用之方式併入本文)之SEQ ID NO: 67、259、1284-1318、1344、1346、1348-1354、1357、1358、1421及1422中之任一者的核酸序列之5′-UTR、如本文所述之相應RNA序列、其同源物或其變異體，較佳缺乏5′-TOP模體。
在一特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自核糖體大蛋白32基因、較佳源自脊椎動物核糖體大蛋白32 (L32)基因、更佳源自哺乳動物核糖體大蛋白32 (L32)基因、最佳源自人類核糖體大蛋白32 (L32)基因之5'-UTR，或源自核糖體大蛋白32基因、較佳源自脊椎動物核糖體大蛋白32 (L32)基因、更佳源自哺乳動物核糖體大蛋白32 (L32)基因、最佳源自人類核糖體大蛋白32 (L32)基因之5'UTR的變異體，其中較佳地，5'-UTR元件不包含該基因之5'-TOP。
因此，在一特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列與專利申請案WO2013/143700)之相應SEQ ID NO:1368或較佳與相應RNA序列具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%、甚至更佳至少約99%之一致性，或其中至少一個5′-UTR元件包含或由核酸序列之片段組成，該核酸序列片段具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%之一致性，其中較佳地，該片段如上所述，亦即為代表全長5'-UTR之至少20%等的連續核苷酸段。較佳地，該片段之長度為至少約20個核苷酸或更多、較佳至少約30個核苷酸或更多、更佳至少約40個核苷酸或更多。較佳地，該片段為如本文所述之功能片段。
在一些實施例中，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物包含5'-UTR元件，該5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列組成，該核酸序列源自脊椎動物TOP基因，諸如哺乳動物，例如人類TOP基因之5'-UTR，該基因係選自RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB或其同源物或變異體，其中較佳地，5'-UTR元件不包含TOP模體或該基因之5'-TOP，且其中視情況5'-UTR元件在其5'-末端以位於5'-端寡嘧啶束(TOP)下游之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處的核苷酸開始，且其中進一步視情況，源自TOP基因之5′-UTR的5′-UTR元件在其3′-末端以位於其所源自的基因之起始密碼子(A(U/T)G)上游之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處的核苷酸終止。
在其他特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列源自以下基因之5'-UTR：核糖體大蛋白32基因(RPL32)、核糖體大蛋白35基因(RPL35)、核糖體大蛋白21基因(RPL21)、ATP合酶、H+轉運、線粒體F1複合物、α次單元1、心肌(ATP5A1)基因、羥類固醇(17-β)去氫酶4基因(HSD17B4)、雄激素誘導之1基因(AIG1)、細胞色素c氧化酶次單元VIc基因(COX6C)或N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶（酸性神經醯胺酶）1基因(ASAH1)或其變異體，較佳來自脊椎動物核糖體大蛋白32基因(RPL32)、脊椎動物核糖體大蛋白35基因(RPL35)、脊椎動物核糖體大蛋白21基因(RPL21)、脊椎動物ATP合酶、H+轉運、線粒體F1複合物、α次單元1、心肌(ATP5A1)基因、脊椎動物羥類固醇(17-β)去氫酶4基因(HSD17B4)、脊椎動物雄激素誘導之1基因(AIG1)、脊椎動物細胞色素c氧化酶次單元VIc基因(COX6C)或脊椎動物N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶(酸性神經醯胺酶) 1基因(ASAH1)或其變異體，更佳來自哺乳動物核糖體大蛋白32基因(RPL32)、核糖體大蛋白35基因(RPL35)、核糖體大蛋白21基因(RPL21)、哺乳動物ATP合酶、H+轉運、線粒體F1複合物、α次單元1、心肌(ATP5A1)基因、哺乳動物羥類固醇(17-β)去氫酶4基因(HSD17B4)、哺乳動物雄激素誘導之1基因(AIG1)、哺乳動物細胞色素c氧化酶次單元VIc基因(COX6C)或哺乳動物N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶(酸性神經醯胺酶) 1基因(ASAH1)或其變異體，最佳來自人類核糖體大蛋白32基因(RPL32)、人類核糖體大蛋白35基因(RPL35)、人類核糖體大蛋白21基因(RPL21)、人類ATP合酶、H+轉運、線粒體F1複合物、α次單元1、心肌(ATP5A1)基因、人類羥類固醇(17-β)去氫酶4基因(HSD17B4)、人類雄激素誘導之1基因(AIG1)、人類細胞色素c氧化酶次單元VIc基因(COX6C)或人類N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶(酸性神經醯胺酶) 1基因(ASAH1)或其變異體，其中較佳地，5′-UTR元件不包含該基因之5′-TOP。
因此，在一特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列與根據專利申請案WO2013/143700之SEQ ID NO:1368或SEQ ID NO: 1412-1420之核酸序列或相應RNA序列具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%、甚至更佳至少約99%之一致性，或其中至少一個5′-UTR元件包含或由核酸序列之片段組成，該核酸序列片段與根據專利申請案WO2013/143700之SEQ ID NO:1368或SEQ ID NO: 1412-1420之核酸序列具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%、甚至更佳至少約99%之一致性，其中較佳地，該片段如上所述，亦即為代表全長5'-UTR之至少20%等的連續核苷酸段。較佳地，該片段之長度為至少約20個核苷酸或更多、較佳至少約30個核苷酸或更多、更佳至少約40個核苷酸或更多。較佳地，該片段為如本文所述之功能片段。
因此，在一特別較佳實施例中，5'-UTR元件包含或由核酸序列組成，該核酸序列與根據SEQ ID NO:224289 (缺乏5′-端寡嘧啶束的ATP5A15′-UTR之：GCGGCTCGGCCATGTCCCAGTACAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCGGAGTAACTGCAAAG；對應於專利申請案WO2013/143700之SEQ ID NO: 224289)之核酸序列或相應的RNA序列(SEQ ID NO: 224290)具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%、甚至更佳至少約99%之一致性，或其中至少一個5′-UTR元件包含或由核酸序列之片段組成，該核酸序列片段與根據SEQ ID NO:224289之核酸序列或更佳與相應的RNA序列(SEQ ID NO: 224290)具有至少約40%、較佳至少約50%、較佳至少約60%、較佳至少約70%、更佳至少約80%、更佳至少約90%、甚至更佳至少約95%、甚至更佳至少約99%之一致性，其中較佳地，該片段如上所述，亦即為代表全長5'-UTR之至少20%等的連續核苷酸段。較佳地，該片段之長度為至少約20個核苷酸或更多、較佳至少約30個核苷酸或更多、更佳至少約40個核苷酸或更多。較佳地，該片段為如本文所述之功能片段。
較佳地，至少一個5'-UTR元件與至少一個3'-UTR元件協同作用以增加如上所述的至少一個mRNA序列之蛋白質產量。
根據一較佳實施例，包含根據本發明之mRNA序列的mRNA化合物較佳在5'-至3'-方向上包含：
a) 5′-CAP結構，較佳m7GpppN；
b) 視情況選用之5′-UTR元件，其較佳包含或由源自TOP基因之5′-UTR的核酸序列或其同源物、片段或變異體組成，更佳包含或由根據SEQ ID NO: 224287之核酸序列的RNA序列（如SEQ ID NO: 224288所示）或其同源物、片段或變異體組成；
c) 至少一個編碼至少一種抗原肽或蛋白質之編碼區，該抗原肽或蛋白質較佳源自流感病毒或狂犬病病毒之蛋白質或其片段或變異體，較佳包含或由如具有數字識別符＜223＞之序列表或分別在PCT/EP2016/075843 (其以引用之方式併入本文)之表1-5或第20-24圖的「縱行B」或「縱行C」、SEQ ID NO: 32013-64024或SEQ ID NO: 64025-224084中所揭示的核酸序列中之任一者或此等序列中之任一者之片段或變異體組成，該數字識別符＜223＞係如下開頭：「經衍生及/或經修飾之CDS序列(wt)」或「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt1）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt2）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt3）」、「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt4）」或「經衍生及/或經修飾之CDS序列（opt5）」，
d) 視情況選用之3'-UTR元件，其較佳包含或由源自提供穩定mRNA之基因的核酸序列組成，該核酸序列較佳包含或由核酸序列之相應RNA序列或其同源物、片段或變異體組成；
e) 視情況選用之聚(A)序列，較佳包含約50至約250個腺苷、更佳約75至約100個腺苷、且最佳約 85至約105個腺苷, 並且在某些實施例中，97至101個腺苷；以及
f) 視情況選用之聚(C)序列，較佳包含約10至約100個胞嘧啶、更佳約20至約50個胞嘧啶、且最佳約 25至約35個腺苷胞嘧啶, 並且在某些實施例中，30個胞嘧啶。 訊號肽
根據另一特別較佳實施例，根據本發明之mRNA序列可另外或替代地編碼分泌訊號肽。此類訊號肽為通常呈現出約15至30個胺基酸之長度且較佳位於所編碼肽之N-端的序列，但不限於此。如本文所定義之訊號肽較佳允許由至少一個mRNA序列編碼的抗原、抗原性蛋白質或抗原性肽轉運至確定的細胞區室中，較佳轉運至細胞表面、內質網(ER)或胞內體-溶酶體區室中。如本文所定義之分泌訊號肽序列之實例包括但不限於經典或非經典MHC分子之訊號序列（例如，MHC I及II分子之訊號序列，例如，MHC I類分子HLA-A*0201之訊號序列)、如本文所定義之細胞介素或免疫球蛋白的訊號序列、如本文所定義之免疫球蛋白或抗體之恆定鏈的訊號序列、Lamp1、Tapasin、Erp57、Calretikulin、Calnexin以及其他膜相關蛋白或與內質網(ER)或胞內體-溶酶體區室相關之蛋白質的訊號序列。最佳地，根據本發明可使用MHC I類分子HLA-A*0201之訊號序列。例如，較佳使用源自HLA-A之訊號肽以促進如本文所定義之編碼抗原或其片段或變異體的分泌。更佳地，HLA-A訊號肽與如本文所定義之編碼抗原或其片段或變異體融合。 mRNA 之產生
可使用此項技術已知之任何方法製備根據本發明之mRNA，包括合成方法，諸如例如固相RNA合成；以及活體外方法，諸如RNA活體外轉錄反應，特別如實例中所述。
如所述的，根據本發明之mRNA化合物經封裝於脂質奈米顆粒中或與脂質奈米顆粒結合。 本發明之佐劑
適合之佐劑亦可選自具有式GIXmGn之核酸，其中：G為鳥苷、尿嘧啶或鳥苷或尿嘧啶之類似物；X為鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸之類似物；I為1至40之整數，其中當I = 1時，G為鳥苷或其類似物，當I ＞ 1時，至少50%之核苷酸為鳥苷或其類似物；m為整數且為至少3；其中當m=3時，X為尿嘧啶或其類似物，當m ＞3時，出現至少3個連續尿嘧啶或尿嘧啶之類似物；n為1至40之整數，其中當n=1時，G為鳥苷或其類似物，當n ＞1時，至少50%之核苷酸為鳥苷或其類似物，或下式之核酸：(NuGIXmGnNv)a，其中：G為鳥苷(鳥嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)之類似物，較佳為鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；X為鳥苷（鳥嘌呤）、尿苷（尿嘧啶）、腺苷（腺嘌呤）、胸苷（胸腺嘧啶）、胞苷（胞嘧啶）或此等核苷酸（核苷）之類似物，較佳為尿苷（尿嘧啶）或其類似物；N為具有約4至50、較佳約4至40、更佳約4至30或4至20個核酸之長度的核酸序列，各N獨立地選自鳥苷（鳥嘌呤）、尿苷（尿嘧啶）、腺苷（腺嘌呤）、胸苷（胸腺嘧啶）、胞苷（胞嘧啶）或此等核苷酸（核苷）之類似物；a為1至20、較佳1至15、最佳1至10之整數；I為1至40之整數，其中當I=1時，G為鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當I ＞1時，至少50%之此等核苷酸（核苷）為鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；m為整數且為至少3；其中當m=3時，X為尿苷(尿嘧啶)或其類似物，且當m ＞3時，出現至少3個連續尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)之類似物；n為1至40之整數，其中當n=1時，G為鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當n ＞1時，至少50%之此等核苷酸（核苷）為鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；u、v可彼此獨立地為0至50之整數，較佳其中當u=0時，v ＞1, 或當v=0時，u ＞1；其中式(NuGIXmGnNv)a之核酸分子具有至少50個核苷酸、較佳至少100個核苷酸、更佳至少150個核苷酸、甚至更佳至少200個核苷酸且最佳至少250個核苷酸之長度。
在某些實施例中，本發明之離子化脂質具有佐劑效果。在具體實施例中，本發明之離子化脂質亦可充當佐劑。
在一些實施例中，佐劑為例如：montanide ISA-51 (Seppic Inc., Fairfield, N.J., United States of America)；QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals.Inc., Framingham, Mass., United States of America)；Arlacel A；油酸(oeleic acid)；破傷風輔助肽(諸如但不限於QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 2376)及/或AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 2377)；GM-CSF；環磷醯胺；卡介苗(BCG)；短小棒狀桿菌(Corynbacterium parvum)；左旋咪唑、阿齊美宗(azimezone)；異丙肌苷；二硝基氯苯(DNCB)；鎖孔血藍蛋白(KLH)；弗氏佐劑(Freunds adjuvant)(完全及不完全)；礦物凝膠；氫氧化鋁(Alum)；溶血卵磷脂；普朗多醇；多陰離子；肽；油乳液；核酸(諸如但不限於可溶性鏈RNA；dsRNA)二硝基酚；白喉毒素(DT)；類鐸受體(TLR；諸如但不限於TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及/或TLR9)促效劑(包括但不限於內毒素，諸如脂多醣(LPS)；單磷醯基脂質A (MPL)；及/或聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC/HILTONOL.RTM.；Oncovir, Inc., Washington, D.C., United States of America)；IMO-2055；葡萄哌喃糖苷脂質A (GLA)；QS-21 (自皂樹樹皮中提取之皂苷，亦稱為皂樹皮樹或Soapbark)；瑞喹莫德(resiquimod)(TLR7/8促效劑)；CDX-1401 (一種融合蛋白，由全人類單株抗體組成，對與NY-ESO-1腫瘤抗原連接之樹突狀細胞受體DEC-205具有特異性)；Juvaris之陽離子脂質-DNA複合物；伐克沙星(Vaxfectin)；及其組合。在一個實施例中，使用源自明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)R595之異質單磷醯脂質A (MPL)的佐劑係用於誘導針對動物及人類疫苗中之異源蛋白質的Th-1型免疫反應。示範性單磷醯基脂質A型佐劑如下所示：
Figure 02_image251
其他適合的佐劑亦可選自具有下式之核酸：CIXmCn，其中：C為胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的類似物；X為鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸之類似物；I為1至40之整數，其中當I=1時，C為胞嘧啶或其類似物，當I ＞1時，至少50%之核苷酸為胞嘧啶或其類似物；m為整數且為至少3；其中當m=3時，X為尿嘧啶或其類似物，當m ＞3時，出現至少3個連續尿嘧啶或尿嘧啶之類似物；n為1至40之整數，其中當n=1時，C為胞嘧啶或其類似物，當n ＞1時，至少50%之核苷酸為胞嘧啶或其類似物。
在此上下文中，WO2008/014979及WO2009/095226之揭露內容亦以引用之方式併入本文。
在又一態樣中，本發明提供一種疫苗，其係基於包含根據本發明之脂質奈米顆粒的mRNA，該脂質奈米顆粒包含至少一種mRNA化合物，該mRNA化合物包含含有如本文所定義之編碼區的mRNA序列。根據本發明之疫苗較佳為如本文所定義之(醫藥)組合物。
因此，根據本發明之疫苗係基於與本文所述之（醫藥）組合物相同的組分。就此而言，可參考如本文所提供的（醫藥）組合物之描述。較佳地，根據本發明之疫苗包含至少一種包含脂質奈米顆粒之mRNA，該脂質奈米顆粒包含至少一個如本文所定義之mRNA序列，及醫藥學上可接受之載劑。在其中疫苗包含封裝於包含脂質奈米顆粒之mRNA中的多於一個mRNA序列（諸如複數個根據本發明之RNA 序列，其中各自較佳編碼不同的抗原肽或蛋白質）的實施例中，疫苗可以物理上分開的形式提供並且可藉由單獨投藥步驟投與。根據本發明之疫苗可對應於如本文所述之(醫藥)組合物，尤其是當mRNA序列由一種單一組合物提供時。然而，本發明疫苗亦可在物理上分開提供。例如，在其中疫苗包含多於一個封裝於包含如本文所定義之脂質奈米顆粒之mRNA中的mRNA序列/種類的實施例中，可提供此等RNA種類以使得提供例如兩種、三種、四種、五種或六種單獨的組合物，該等組合物各自可含有至少一個mRNA種類/序列（例如，三個不同的mRNA種類/序列），各自編碼不同的抗原肽或蛋白質，它們可經組合或可不經組合。本發明疫苗亦可為至少兩種不同組合物之組合，每種組合物包含至少一種編碼如本文所定義之抗原肽或蛋白質中之至少一者的mRNA。替代地，疫苗可作為至少一種mRNA，較佳至少兩種、三種、四種、五種、六種或更多種mRNA之組合提供，每種mRNA編碼本文所定義之抗原肽或蛋白質中之一者。疫苗可經組合以在其使用之前提供一種單一組合物，或者可使用它以使得需要多於一次投藥來投與編碼封裝於包含如本文所定義之脂質奈米顆粒之mRNA中的任何抗原肽或蛋白質的不同mRNA序列/種類。若疫苗含有至少一種包含脂質奈米顆粒之mRNA，該脂質奈米顆粒通常包含至少兩個mRNA序列，該等mRNA序列編碼本文所定義之抗原組合，則該疫苗可例如藉由單次投藥（組合所有mRNA種類/序列）、藉由至少兩次單獨投藥進行投與。因此，編碼至少一種抗原肽或蛋白質或如本文所定義之抗原（及視情況選用之其他抗原）之任何組合的單順反子、雙順反子或多順反子mRNA之任何組合係作為單獨的實體（含有一種mRNA種類）或經組合之實體（含有多於一種mRNA種類）提供，其應理解為根據本發明之疫苗。根據本發明疫苗之一特別較佳實施例，至少一種抗原，較佳由本發明組合物整體編碼的至少兩種、三種、四種、五種、六種或更多種抗原的如本文所定義之組合係作為單獨的（單順反子）mRNA提供，將其單獨投與。
對於根據本發明之（醫藥）組合物，疫苗實體可以液體及/或乾燥（例如凍乾）形式提供。它們可含有其他組分，特別是允許其醫藥用途之其他組分。疫苗或（醫藥）組合物可例如另外含有醫藥學上可接受之載劑及/或其他輔助物質及添加劑及/或佐劑。
疫苗或（醫藥）組合物通常包含安全及有效量的如本文所定義之本發明之mRNA化合物，其編碼如本文所定義之抗原肽或蛋白質或其片段或變異體或抗原之組合，它們封裝於脂質奈米顆粒中及/或與脂質奈米顆粒結合。如本文所用，「安全及有效量」意謂足以顯著誘導癌症或與癌症相關之疾病或病症之積極緩解的mRNA之量。然而，與此同時，「安全及有效量」足夠小以避免嚴重的副作用，換言之，允許優勢與風險之間存在合理的關係。此等限制之判定通常在合理的醫學判斷範疇內。關於本發明之疫苗或（醫藥）組合物，表述「安全及有效量」較佳意謂適於以一定方式刺激適應性免疫系統的mRNA（及由此所編碼抗原）之量，該方式不達成過度或破壞性免疫反應，但較佳，亦沒有低於可量測水準的此類免疫反應。此外，可視mRNA例如單順反子、雙順反子或甚至多順反子mRNA之類型來選擇本文所定義之(醫藥)組合物或疫苗的mRNA之此類「安全及有效量」，因為雙順反子mRNA或甚至多順反子mRNA可能導致所編碼抗原之表現明顯高於使用等量單順反子mRNA。如上所定義之（醫藥）組合物或疫苗的mRNA之「安全及有效量」將進一步根據待治療之具體病狀以及待治療患者之年齡及身體狀況、病狀之嚴重性、治療持續時間、伴隨療法之性質、所用的具體醫藥學上可接受之載劑之性質以及類似因素在隨行醫生之知識及經驗範圍內變化。根據本發明之疫苗或組合物可根據本發明用於人類以及獸醫醫學目的，作為醫藥組合物或作為疫苗。
在一較佳實施例中，包含根據本發明之(醫藥)組合物、疫苗或部分套組之脂質奈米顆粒的mRNA係以凍乾形式提供。較佳地，包含脂質奈米顆粒之凍乾mRNA在投與之前在合適的緩衝液中復原，該緩衝液有利地基於水性載劑，例如林格氏(Ringer)-乳酸鹽溶液、林格氏溶液、磷酸鹽緩衝溶液。在一較佳實施例中，根據本發明之（醫藥）組合物、疫苗或部分套組包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種mRNA化合物，其可作為單一種類之脂質奈米顆粒提供，或針對各LNP種類單獨提供，視情況以凍乾形式（視情況與至少一種其他添加劑一起）並且較佳在它們使用之前在合適的緩衝液（諸如林格氏-乳酸鹽溶液）中單獨復原，以允許單獨投與每一種（單順反子）mRNA。
根據本發明之疫苗或(醫藥)組合物通常可包含醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，表述「醫藥學上可接受之載劑」較佳包括本發明疫苗之液體或非液體基質。若本發明疫苗以液體形式提供，則載劑將為水，通常為無熱原水；等滲鹽水或緩衝（水）溶液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽等緩衝溶液。特別是對於本發明疫苗之注射，可使用水或較佳緩衝液，更佳水性緩衝液，其含有鈉鹽，較佳至少50 mM之鈉鹽；鈣鹽，較佳至少0.01 mM之鈣鹽；及視情況選用之鉀鹽，較佳至少3 mM之鉀鹽。根據一較佳實施例，鈉鹽、鈣鹽及視情況選用之鉀鹽可以如下形式存在：其鹵化物形式，例如氯化物、碘化物或溴化物；其氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽等形式，但不限於此，鈉鹽之實例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na 2CO 3、NaHCO 3、Na 2SO 4，視情況選用之鉀鹽之實例包括例如KCl、KI、KBr、K 2CO 3、KHCO 3、K 2SO 4，且鈣鹽之實例包括例如CaCl 2)、CaI 2、CaBr 2、CaCO 3、CaSO 4、Ca(OH) 2。此外，上述陽離子之有機陰離子可包含在緩衝液中。根據一更佳實施例，適合於如上所定義之注射目的之緩衝液可含有選自氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl 2))及視情況選用之氯化鉀(KCl)的鹽，其中除了氯化物之外亦可存在其他陰離子。CaCl 2)亦可用另一種鹽如KCl來代替。通常，注射緩衝液中之鹽以至少50 mM氯化鈉 (NaCl)、至少3 mM氯化鉀(KCl)及至少0.01 mM氯化鈣(CaCl 2))之濃度存在。注射緩衝液相對於特定參考介質可為高滲的、等滲的或低滲的，亦即相對於特定的參考介質，緩衝液可具有更高、相同或更低的鹽含量，其中較佳地，可使用該種濃度之上述鹽，其不會因滲透或其他濃度效應導致細胞損傷。參考介質為例如在「活體內」方法中出現之液體，諸如血液、淋巴液、胞質液或其他體液；或例如 液體，其可在「活體外」方法中用作參考介質，諸如常見的緩衝液或液體。該種常見緩衝液或液體為熟習此項技術者已知的。
然而，亦可使用一或多種相容固體或液體填充劑或稀釋劑或封裝化合物，它們適於向人投與。如本文所用，術語「相容的」意謂本發明疫苗之成分能夠以不發生相互作用之方式與如本文所定義之本發明mRNA混合，這會實質上降低在典型使用條件下本發明疫苗之藥學效力。醫藥學上可接受之載劑、填充劑及稀釋劑當然必須具有足夠高的純度及足夠低的毒性以使其適合向待治療之人投與。可用作醫藥學上可接受之載劑、填充劑或其成分的化合物之一些實例為糖，諸如像乳糖、葡萄糖、海藻糖及蔗糖；澱粉，諸如像玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；右旋葡萄糖；纖維素及其衍生物，諸如像羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、醋酸纖維素；黃蓍膠粉；麥芽；明膠；脂；固體助滑劑，諸如像硬脂酸、硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，諸如像花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及可可豆油；多元醇，諸如像聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；藻酸。
醫藥學上可接受之載劑的選擇原則上由根據本發明之醫藥組合物或疫苗的投與方式決定。組合物或疫苗可例如全身或局部投與。全身投藥途徑一般包括例如經皮、經口、非經口途徑，包括皮下、靜脈內、肌內、動脈內、皮內及腹膜內注射及/或鼻內投藥途徑。局部投藥途徑一般包括例如局部投藥途徑以及皮內、經皮、皮下或肌內注射或病灶內、顱內、肺內、心內及舌下注射。更佳地，本發明之組合物或疫苗可藉由皮內、皮下或肌內途徑投與，較佳藉由注射投與，該注射可為無針注射及/或針注射。因此，組合物/疫苗較佳以液體或固體形式調配。待投與的本發明疫苗或組合物之合適量可藉由常規實驗，例如藉由使用動物模型測定。此類模型包括但不限於兔、綿羊、小鼠、大鼠、狗及非人類靈長類動物模型。較佳之注射用單位劑型包括水、生理鹽水或其混合物之無菌溶液。此類溶液之pH值應調節至生理上可耐受之pH值，諸如約7.4。合適的注射用載劑包括水凝膠、用於控制或延遲釋放之裝置、聚乳酸及膠原蛋白基質。用於局部投與之合適的醫藥學上可接受之載劑包括適用於洗劑、霜劑、凝膠及其類似物之彼等載劑。若本發明之組合物或疫苗將要口服投與，則錠劑、膠囊及其類似物為較佳的單位劑型。用於製備可用於經口投與之單位劑型的醫藥學上可接受之載劑為先前技術中熟知的。其選擇將視諸如味道、成本及可儲存性之次要考慮因素而定，它們對於本發明之目的並不關鍵，並且熟習此項技術者可以毫無困難地進行。
本發明之疫苗或組合物可另外含有一或多種輔助物質以進一步增強免疫原性。由此較佳地達成本發明組合物中所含的mRNA與輔助物質之協同作用，該輔助物質可視情況與如上所述之本發明疫苗或組合物共同調配(或單獨調配)。視各種類型之輔助物質而定，不同機制可在此態樣中發揮作用。例如，允許樹突狀細胞(DC)成熟之化合物，例如脂多醣、TNF-α或CD40配體，形成第一類合適的輔助物質。通常，可能使用以「危險訊號」（LPS、GP96等）或細胞介素（諸如GM-CFS）之方式影響免疫系統的任何試劑作為輔助物質，它們允許由本發明之免疫刺激性佐劑產生的免疫反應以靶向方式得到增強及/或受到影響。特別較佳之輔助物質為細胞介素，諸如單核介素、淋巴介素、白細胞介素或趨化介素--除了由所編碼之至少一種抗原誘導適應性免疫反應之外，它們亦促進先天免疫反應--諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生長因子，諸如hGH。較佳地，此類免疫原性增強劑或化合物係單獨提供（不與本發明之疫苗或組合物共調配）並單獨投與。
可包含在本發明疫苗或組合物中的其他添加劑為乳化劑，諸如像Tween；潤濕劑，諸如像月桂基硫酸鈉；著色劑；呈味劑、醫藥載劑；制錠劑；穩定劑；抗氧化劑；防腐劑。
本發明疫苗或組合物亦可另外含有任何其他化合物，已知其由於對人類類鐸受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10之結合親和力，或由於對鼠類類鐸受體TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13之結合親和力（作為配體）而具有免疫刺激性。
在此上下文中，可添加至本發明疫苗或組合物中的另一類化合物可為CpG核酸，特別是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可為單鏈CpG-DNA (ss CpG-DNA)、雙鏈CpG-DNA (dsDNA)、單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙鏈CpG-RNA (ds CpG-RNA)。CpG核酸較佳呈CpG-RNA形式，更佳呈單鏈CpG-RNA(ss CpG-RNA)形式。CpG核酸較佳含有至少一或多個（促有絲分裂）胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸序列（CpG模體）。根據第一較佳替代方案，此等序列中包含的至少一個CpG模體，亦即CpG模體之C（胞嘧啶）及G（鳥嘌呤）係未甲基化的。視情況包含在此等序列中的所有其他胞嘧啶或鳥嘌呤可為甲基化或未甲基化的。然而，根據又一較佳替代方案，CpG模體之C（胞嘧啶）及G（鳥嘌呤）亦可以甲基化形式存在。
根據本發明之另一態樣，本發明亦提供一種套組，特別是部分套組，其包含含有如本文所定義之mRNA序列的mRNA化合物及至少一種如上所定義的式(I)、(II)、(III)或(IV)之脂質。在又一實施例中，該套組包含如上所定義之脂質奈米顆粒或含有如上所定義之脂質奈米顆粒的（醫藥）組合物，及/或根據本發明之疫苗，視情況選用的用於溶解之液體媒劑及視情況選用的具有包含脂質奈米顆粒之mRNA、組合物及/或疫苗的投與及劑量資訊的技術說明書。技術說明書可含有關於包含脂質奈米顆粒之mRNA、組合物及/或疫苗的投與及劑量之資訊。此類套組(較佳部分套組)可應用於例如任何上述應用或用途，較佳用於根據本發明之脂質奈米顆粒（用於製備本發明之藥劑，較佳疫苗）在治療或預防流感病毒感染或與其相關之疾病或病症中的用途。該等套組亦可應用於本文所定義之脂質奈米顆粒、組合物或疫苗（用於製備本發明之疫苗）在治療或預防流感病毒感染或與其相關之疾病或病症中的用途，其中脂質奈米顆粒、組合物及/或疫苗可能能夠在如上所定義之哺乳動物中誘導或增強免疫反應。此類套組可進一步應用於如本文所定義之脂質奈米顆粒、組合物或疫苗（用於製備本發明之疫苗）在用於調節、較佳用於引發、例如誘導或增強如上所定義之哺乳動物中的免疫反應中的用途，並且較佳用於支持流感病毒感染或與其相關之疾病或病症的治療或預防。部分套組作為套組之特殊形式可在套組之不同部分中包含一或多種相同或不同的如本文所述之組合物及/或一或多種相同或不同的如本文所述之疫苗。部分套組亦可在套組之不同部分中含有（例如一種）組合物、（例如一種）疫苗及/或包含根據本發明之脂質奈米顆粒的mRNA，例如，套組之各部分包含含有如本文所定義之脂質奈米顆粒的mRNA，較佳編碼不同抗原。較佳地，套組或部分套組含有用於溶解根據本發明之mRNA的媒劑作為一部分，該媒劑視情況為林格氏-乳酸鹽溶液。任何上述套組均可用於如上所定義之治療或預防中。
在此態樣之另一實施例中，根據本發明之套組可另外含有至少一種佐劑。在又一實施例中，根據本發明之套組可另外含有至少一種其他醫藥活性組分，較佳含有適用於治療及/或預防癌症或相關病症之治療化合物。此外，在另一實施例中，套組可另外含有對於投與根據本發明之組合物或疫苗而言必需或適合的部分及/或裝置，包括針、施藥器、貼片、注射裝置。
在又一態樣中，本發明係關於包含脂質奈米顆粒之mRNA或醫藥組合物作為藥劑之用途。在一替代實施例中，本發明係關於醫藥組合物或包含脂質之mRNA在製備藥劑中之用途。具體而言，該藥劑係用於治療性或預防性地提高有此需要之受試者的免疫反應。
在一較佳實施例中，該藥劑係用於預防或治療癌症或腫瘤疾病、感染性疾病、過敏症或自體免疫疾病或與其相關之病症。
具體而言，該藥劑係用於治療受試者，較佳脊椎動物。在一較佳實施例中，受試者為哺乳動物，較佳選自包含以下之群：山羊、牛、豬、狗、貓、驢、猴、猿、齧齒動物諸如小鼠、倉鼠、兔，且尤其是人類。
在一特別較佳實施例中，該藥劑為疫苗，較佳腫瘤、流感或狂犬病疫苗。在一特定實施例中，該藥劑為用於治療狂犬病之狂犬病疫苗。
該藥劑可能以任何合適的方式投與。較佳地，該藥劑係用於非經口投與，特別是注射。
本發明進一步係關於一種在有此需要之受試者中引發或增強免疫反應的方法，該方法包含向受試者投與如上所定義之脂質奈米顆粒或如上定義之醫藥組合物。
在又一態樣中，本發明係關於一種在有此需要之受試者中預防或治療癌症或腫瘤疾病、感染性疾病、過敏症或自體免疫疾病或與其相關之病症的方法，該方法包含向受試者投與如上所定義之脂質奈米顆粒或如上所定義之醫藥組合物。
根據本發明之一個態樣，包含脂質奈米顆粒之mRNA、（醫藥）組合物或疫苗可根據本發明（用於製備藥劑）用於治療或預防癌症或腫瘤疾病、感染性疾病、過敏症或自體免疫疾病或與其相關之病症。在此上下文中，特別較佳的是流感病毒或狂犬病病毒感染之治療或預防。
此外，本發明亦包括治療或預防癌症或腫瘤疾病、感染性疾病、過敏症或自體免疫疾病或與其相關之病症(較佳如本文所定義)的方法，藉由向有此需要之受試者投與醫藥學上有效量的包含脂質奈米顆粒之mRNA、根據本發明之(醫藥)組合物或疫苗。該種方法通常包含製備包含本脂質奈米顆粒之mRNA、本發明之組合物或疫苗的視情況選用之第一步，以及包含向有此需要之患者/受試者投與（醫藥學上有效量的）該組合物或疫苗的第二步。有此需要之受試者通常為哺乳動物。在本發明之上下文中，哺乳動物較佳選自包含但不限於以下之群：例如， 山羊、牛、豬、狗、貓、驢、猴、猿、齧齒動物諸如小鼠、倉鼠、兔子，且尤其是人類。在本發明之一些實施例中，受試者為鳥，較佳為雞。
在此上下文中，本發明較佳包括治療或預防流感病毒或狂犬病病毒感染或與其相關之病症的方法。
本發明亦係關於包含脂質奈米顆粒之mRNA、根據本發明之組合物或疫苗的用途，較佳用於在哺乳動物中引發免疫反應，較佳用於治療或預防癌症或腫瘤疾病、感染性疾病、過敏症或自體免疫疾病或與其相關之病症，較佳流感病毒或狂犬病病毒感染或如本文所定義之相關病狀。
本發明此外包括如本文所定義的包含脂質奈米顆粒之mRNA、根據本發明之（醫藥）組合物或疫苗用於調節、較佳用於誘導或增強如本文所定義之哺乳動物中的免疫反應的用途，更佳用於預防及/或治療流感病毒感染或與其相關之疾病或病症。在此上下文中，治療或預防流感病毒感染之支持可為習知流感療法方法之任何組合，諸如使用抗病毒藥物諸如神經胺糖酸酶抑制劑（例如奧司他韋及紮那米韋）及M2蛋白抑制劑（例如金剛烷衍生物）之療法，以及使用如本文所定義之RNA或醫藥組合物之療法。在本文所定義之任何其他實施例中亦可設想治療或預防流感病毒感染之支持。因此，包含脂質奈米顆粒之mRNA、根據本發明之（醫藥）組合物或疫苗與任何其他方法，較佳一或多種上述治療方法之共同療法，特別是與抗病毒藥物組合的任何用途均在本發明之範疇內。
對於投藥，較佳可使用如本文所定義之任何投藥途徑。具體而言，使用一種投藥途徑，其適用於治療或預防如本文所定義之流感病毒感染或與其相關之疾病或病症，藉由基於包含根據本發明之脂質奈米顆粒的mRNA編碼的抗原誘導或增強適應性免疫反應來實現。根據本發明之組合物及/或疫苗的投與則可在投與如本文所定義之另一種組合物及/或疫苗之前、同時及/或之後進行，其可——另外——含有另一種包含脂質奈米顆粒之mRNA或包含脂質奈米顆粒之mRNA的組合，該等脂質奈米顆粒編碼不同抗原或抗原之組合，其中由根據本發明之mRNA序列編碼的每種抗原較佳適用於治療或預防流感病毒感染及與其相關之疾病或病症。在此上下文中，如本文所定義之治療亦可包含調節與流感病毒感染相關之疾病及與其相關之疾病或病症。
根據本發明之此態樣之一較佳實施例，本發明之(醫藥)組合物或疫苗係藉由注射投與。可使用此項技術已知的任何適合之注射技術。較佳地，本發明組合物係藉由注射投與，較佳藉由無針注射，例如藉由噴射注射投與。
在一個實施例中，本發明組合物包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種如本文所定義之mRNA，其各自較佳單獨注射，較佳藉由無針注射。替代地，本發明組合物包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種mRNA，其中至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種mRNA作為混合物較佳藉由如本文所定義之注射投與。
在又一態樣中，本發明係關於一種針對抗原或抗原組合對受試者進行免疫之方法。
用於針對如本文所定義之抗原或至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種抗原之組合對受試者進行免疫之免疫方案通常包含一系列單劑量或多劑量的根據本發明之（醫藥）組合物或疫苗。如本文所用，單一劑量分別係指初始/第一劑量、第二劑量或任何其他劑量，它們較佳被投與以「加強」免疫反應。在此上下文中，每個單一劑量較佳包含投與如本文所定義之相同抗原或該等抗原之相同組合，其中兩次單一劑量投與之間的間隔可在以下範圍內變化：至少一天、較佳2、3、4、5、6或7天至至少1週、較佳2、3、4、5、6、7或8週。單一劑量之間的間隔可為恆定的或在免疫方案過程中變化，例如，間隔在方案開始時可能會更短，而在方案結束時可能會更長。視單一給藥總數及單一給藥之間的間隔而定，免疫方案可延長一段時間，較佳持續至少一週，更佳若干週（例如2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11或12週），甚至更佳若干個月（例如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24個月）。每個單一劑量較佳涵蓋投與抗原，較佳至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種如本文所定義之抗原之組合，且因此可包括至少一次，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次注射。在一些情況下，根據本發明之組合物或疫苗作為單一劑量通常在一次注射中投與。在其中根據本發明之疫苗包含編碼如本文所定義之不同抗原的單獨mRNA調配物之情況下，在投與單一劑量期間進行的最小注射次數對應於疫苗之單獨組分的數量。在某些實施例中，單一劑量之投與可涵蓋針對疫苗之每個組分進行一次以上注射（例如，包含編碼例如本文所定義之一種抗原肽或蛋白質的mRNA之特定mRNA調配物）。例如，疫苗之單個組分的總體積之一部分可注射至不同的身體部位，因此涉及多於一次注射。在一更特定的實例中，包含四種單獨的mRNA調配物之單劑量疫苗包括八次注射，其中每種調配物在兩個不同的身體部位投與。通常，單一劑量包含投與疫苗之所有組分所需的所有注射，其中單一組分可能涉及多於一次的如上所述之注射。在其中單劑量的根據本發明之疫苗之投與包括多於一次注射之情況下，注射基本上同時或併發，亦即通常在行醫者所需的時間框內以時間交錯之方式進行，以便一個接一個地進行單個注射步驟。因此，單劑量之投與較佳持續幾分鐘之時間段，例如2、3、4、5、10、15、30或60分鐘。
包含如本文所定義之脂質奈米顆粒的mRNA、根據本發明之(醫藥)組合物或疫苗之投與可在時間交錯之治療中進行。時間交錯之治療可為例如在流感病毒感染或與其相關之疾病或病症的習知療法之前、同時及/或之後投與包含脂質奈米顆粒之mRNA、組合物或疫苗，例如，藉由在適用於治療或預防流感病毒感染或與其相關之疾病或病症的療法或治療劑投與之前、同時及/或之後投與包含脂質奈米顆粒之mRNA、組合物或疫苗來達成。該種時間交錯之治療可使用例如套組，較佳如本文所定義之部分套組進行。
時間交錯之治療可另外或替代地亦包括以一種形式投與包含如本文所定義之脂質奈米顆粒的mRNA、根據本發明之（醫藥）組合物或疫苗，其中編碼如本文所定義之抗原肽或蛋白質或其片段或變異體的該mRNA（較佳形成組合物或疫苗之一部分）在包含如上所定義之脂質奈米顆粒的另一mRNA之同時、之前或之後投與，該另一mRNA較佳形成相同的本發明組合物或疫苗之一部分。較佳地，(所有包含脂質奈米顆粒之mRNA的)投與在一小時內、更佳在30分鐘內、甚至更佳在15、10、5、4、3或2分鐘內或甚至在1分鐘內進行。該種時間交錯之治療可使用例如套組，較佳如本文所定義之部分套組進行。
在一較佳實施例中，重複投與本發明之醫藥組合物或疫苗，其中每次投與較佳包括單獨投與本發明組合物或疫苗的至少一種包含脂質奈米顆粒之mRNA。在各投藥時間點，至少一種mRNA可投與多於一次（例如2次或3次）。在本發明之一特別較佳實施例中，至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個mRNA序列（各自編碼一種不同的如本文所定義之抗原）用包含如上所定義之脂質奈米顆粒的mRNA封裝或與其結合，其中mRNA序列為具有相同或不同脂質奈米顆粒的mRNA化合物之一部分，該等經封裝或結合之mRNA序列係在各時間點投與，其中每種mRNA藉由注射投與兩次，分佈在四肢上。 本發明之可離子化脂質的另外應用 基因編輯
本發明亦涵蓋用於遞送核酸、較佳RNA、更佳單嚮導RNA(sgRNA)及用於基因表現改變、基因組操縱及基因參與遺傳病症的基於工程化CRISPR/CRISPR相關(Cas)9之組合物的組合物及方法。已發現它可用於修正或減小突變之效應。在某些實施例中，基於CRISPR/Cas9之系統包含Cas9蛋白及至少一種嚮導RNA（該嚮導RNA提供系統之DNA靶向特異性）並使用包含一或多種本發明之可離子化脂質的LNP來遞送。
具體而言，本揭露內容描述Cas9融合蛋白，其將基於CRISPR/Cas9之DNA序列靶向功能與另外的活性相整合，從而允許改變的基因表現及/或表觀遺傳背景。此系統亦可用於修正或減輕基因組操縱及基因突變之影響。
本揭露內容亦提供用於遞送靶向基於CRISPR/CRISPR相關(Cas)9之系統的多種gRNA及一或多種包含LNP之內源基因的某些組合物及方法，該LNP包含一或多種本發明之可離子化脂質。靶向單個啟動子之多種sgRNA的共轉染允許協同活化，但是，由於拷貝數量差異導致表現含量，多種質體之共轉染在各細胞中可能會有所不同。此外，轉染後之基因活化為瞬時的，因為質體DNA會隨著時間之推移而稀釋。此外，許多細胞類型不容易轉染，並且瞬時基因表現可能不足以引起治療效果。
包含一或多種本發明之可離子化脂質的此LNP組合物能夠控制CRISPR/Cas9依賴性基因調控之幅度及時間。此外，包含一或多種本發明之可離子化脂質的LNP組合物提供促進CRISPR/Cas9系統在原代細胞中之治療用途的強且持久的基因表現含量。最終，包含一或多種本發明之可離子化脂質的LNP組合物可用於同時編輯多種基因（例如，用於同時剔除幾個致癌基因）。
本發明進一步係關於一種修正細胞中之突變基因的方法。該方法包含向含有DNA靶向系統之細胞投與經分離之多核苷酸及包含本發明之可離子化脂質的LNP的步驟。突變基因之修正可包括同源定向修復。該方法可進一步包括向細胞投與供體DNA之步驟。突變基因可包括提前終止密碼子及導致截短基因產物之移碼突變。突變基因之修飾可包括核酸酶介導之異源末端連接。突變基因之修飾可包括提前終止密碼子之刪除、剪接受體位點之破壞、一或多個外顯子之刪除或剪接供體序列之破壞。一或多個外顯子之刪除可導致閱讀框之修正。
在某些實施例中，本發明係關於一種治療有此需要的攜帶突變型抗肌萎縮蛋白基因之受試者的方法。該方法包含向受試者投與DNA靶向系統、經分離之多核苷酸或載體的步驟。在某些實施例中，受試動物可罹患杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)。
本發明係關於一種修正細胞中之突變型抗肌萎縮蛋白基因的方法。該方法包含向含有突變型抗肌萎縮蛋白基因之細胞投與DNA靶向系統、經分離之多核苷酸、載體或細胞的步驟。突變型抗肌萎縮蛋白基因可包括未成熟終止密碼子、由遺傳缺陷破壞之閱讀框、異常剪接受體位點或異常剪接供體位點，其中靶區域為未成熟終止密碼子，破壞。位於所定義閱讀框、異常剪接受體位點或異常剪接供體位點之上游或下游。突變型抗肌萎縮蛋白基因之修飾可包括同源定向修復。該方法可進一步包括向細胞投與供體DNA之步驟。突變型抗肌萎縮蛋白基因可包括提前終止密碼子及導致截短基因產物之移碼突變。突變型抗肌萎縮蛋白基因之修飾可包括核酸酶介導之異源末端連接。突變型抗肌萎縮蛋白基因之修飾可包括提前終止密碼子之刪除、破壞的閱讀框之修飾或藉由剪接受體位點之破壞或剪接供體序列之破壞對剪接之調節。突變型抗肌萎縮蛋白基因之修飾可包括外顯子45-55或外顯子51之刪除。
本發明係關於一種套組，其包含融合蛋白、DNA靶向系統、經分離之多核苷酸、載體或細胞。
本發明係關於一種調節細胞中哺乳動物基因表現之方法。該方法包含使細胞與編碼DNA靶向系統之多核苷酸接觸。DNA靶向系統包含融合蛋白及至少一種包括在包含本發明之可離子化脂質的LNP中的嚮導RNA (gRNA)。
DNA靶向系統可包括1至10個不同的gRNA。不同的gRNA可與靶基因內的不同區域結合。靶區域可由至少一個核苷酸隔開。靶區域可由約15至約700個鹼基對隔開。不同的gRNA各自可結合至少一種不同的靶基因。不同靶基因可位於同一條染色體上。不同靶基因可位於不同染色體上。至少一個靶區域可位於非開放染色質區域、開放染色質區域、靶基因啟動子區域、靶基因強化子區域、靶基因轉錄區域或靶基因轉錄起始位點上游的區域中。至少一個靶區域可位於靶基因轉錄起始位點上游約1至約1000個鹼基對處。至少一個靶區域可位於靶基因轉錄起始位點上游約1至約600個鹼基對處。可誘導基因表現。DNA靶向系統由2種不同的gRNA、3種不同的gRNA、4種不同的gRNA、5種不同的gRNA、6種不同的gRNA、7種不同的gRNA、8種不同的gRNA、9種不同的gRNA或10種不同的gRNA組成。可包括在內。至少一種嚮導RNA可靶向選自由以下組成之群的基因之啟動子區域：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2及MYOD1。至少一個靶區域可在靶基因之內含子或外顯子內。
本發明係關於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物。該組合物包含融合蛋白及至少一種包括在包含本發明之可離子化脂質的LNP中的嚮導RNA (gRNA)。
本發明係關於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物。該組合物包含編碼融合蛋白的經分離之多核苷酸序列及至少一種嚮導RNA (gRNA)。至少一種嚮導RNA可靶向選自由以下組成之群的基因之啟動子區域：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2及MYOD1。
本發明係關於含有上述組合物之細胞，該等組合物在細胞中誘導哺乳動物基因表現。
本發明係關於用於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物，或包含含有用於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物的細胞之套組。
本發明係關於一種用於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之套組。該套組包含用於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物或含有用於在細胞中誘導哺乳動物基因表現之組合物的細胞。 蛋白質替代療法
在一些實施例中，如本文所揭示之方法、組合物及套組可經定製以用於活體內蛋白質替代療法之方法中。在一些實例中，在治療需要蛋白質表現的多種不同疾病之方法中，可將編碼感興趣之蛋白質的合成修飾之RNA遞送至組織及/或器官以用於活體內蛋白質表現。在一些實例中，疾病可為如本文所揭示之功能喪失疾病，例如但不限於肌肉萎縮症、囊性纖維化及其他疾病，其中特定蛋白質之蛋白質表現水準不足及/或基因表現產生非功能性蛋白質。
另外，使用包含本發明之可離子化脂質的LNP來活體內遞送合成修飾之RNA以供如本文所揭示之活體內蛋白質表現的方法可用於創建動物模型平台，該平台可用於研究整個器官及全身病理生理學。在一些實例中，如本文所揭示之方法提供一種活體內系統，其使用小型及大型動物模型，諸如靈長類動物及豬模型，用於測試及/或開發用於人類患者之臨床用途的治療劑。
在一些實例中，使用包括在包含本發明之可離子化脂質的LNP中的合成修飾之RNA進行活體內蛋白質表現的如本文所揭示之方法及組合物及套組可用於疾病或病症之發展及治療。在一些實例中，疾病或病症為遺傳性及/或獲得性病症，其為特定蛋白質之表現不足或失效版本之蛋白質表現的結果。在一些實例中，疾病或病症為獲得性病症，例如本文所揭示之心血管疾病或病症。
在另一實例中，使用包括在包含本發明之可離子化脂質的LNP中的合成修飾之RNA進行活體內蛋白質表現的如本文所揭示之方法及組合物及套組亦可用於再生醫學策略中。例如，在一些實例中，包含至少一種編碼感興趣之蛋白質的合成修飾之RNA的組合物亦可包含感興趣之細胞群。換言之，在一些實施例中，本揭露內容提供用於再生細胞療法之方法，其包含向受試者投與至少一種合成修飾之RNA與感興趣之細胞群的組合。在一些實例中，細胞群為幹細胞群，且在一些實例中，幹細胞群為心臟前體細胞或心臟前驅細胞群。在一些實例中，幹細胞為Isl1+幹細胞群，或為血管前驅細胞群。此類細胞群為此項技術中熟知的，包括但不限於國際專利申請案WO/2008/054819、WO2010/144678、WO2010/042856及美國專利申請案 2010/0166714、US2011/0033430、US2010/021713及US2011/0003327，其各自以引用方式併入本文。 細胞程式設計及細胞療法
在另一實施例中，本發明涵蓋，本文所揭示之發明係關於一種用於刺激人類宿主免疫系統而無GVH毒性的同種異體細胞療法，且藉此該等同種異體細胞隨後由宿主免疫系統排斥。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中選擇同種異體細胞而不考慮與受體之HLA匹配，或允許HLA單倍型與預期患者群體之最大錯配，從而確保最大的同種異體潛能及隨後宿主對該產物之免疫反應。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞在輸注至未接受過先前同種異體BMT之患者中時，能夠刺激針對腫瘤之有效宿主免疫反應。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞在輸注至未接受過免疫抑制調理方案之患者中時，能夠刺激針對腫瘤之有效宿主免疫反應。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞療法藉由刺激宿主中炎性「1型」單核介素及淋巴介素之產生來刺激患者之免疫反應。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞療法藉由激活宿主先天性及/或Th1適應性免疫之組分來刺激患者之免疫反應。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞療法刺激細胞介素之產生，該等細胞介素增強腫瘤之免疫原性。
本文所揭示之發明亦係關於一種上述產物，其中同種異體細胞直接殺死腫瘤，從而使腫瘤相關抗原可用於刺激宿主1型適應性免疫。
本文所揭示之發明亦係關於一種產生上述產物之方法，其中產物中包含的同種異體T細胞處於增強活化之狀態。
本文所揭示之發明亦係關於一種用於刺激宿主免疫系統之方法，該方法藉由以下步驟來實現：自無關供體收集單核細胞、激活單核細胞群內的T細胞及將活化之T細胞向具有宿主免疫系統之宿主投與，從而活化之T細胞由宿主免疫系統排斥，同時刺激宿主免疫系統以介導針對常駐疾病之有效免疫反應。宿主可能患有常駐疾病，諸如血液系統惡性腫瘤、實體腫瘤、已轉移之實體腫瘤或病毒感染。選擇供體時不考慮與宿主之組織相容性，並且最大組織相容性不匹配為較佳的。宿主亦較佳不應具有先前的骨髓移植且較佳不應接受任何旨在允許同種異體供體細胞輸注之植入的免疫抑制化學療法及/或放射調理方案。
該方法進一步包括，T細胞較佳為CD4+ T細胞且大多數CD4+ T細胞在離體活化後自CD45RA+、CD62Lhi幼稚細胞分化為CD45RO+、CD62Llo記憶細胞，且其中此類細胞產生1型細胞介素，諸如IL-2、IFN-γ、TNF-α，而不產生2型細胞介素，諸如IL-4、IL-10及TGF-β。
本文所揭示之發明亦包括此類CD4+ T細胞，其在離體活化後在細胞表面上表現CD40L及/或TRAIL。較佳地，T細胞藉由施加於T細胞之細胞表面上的的抗CD3與抗CD28 mAb之交聯而活化。較佳地，施加於該等T細胞之表面上的抗CD3及抗CD28 mAb藉由與包被有對該等mAb有反應性之試劑的生物可降解微球體結合而交聯。
本文所揭示之發明亦包括其中大於90%之T細胞在接觸宿主免疫系統之前及接觸宿主免疫系統之時處於活化狀態，並且在較佳實施例中，大於95%之T細胞在向宿主投與之時並且在即將接觸宿主之前經活化。
該方法亦包括其中T細胞在輸注於宿主中之前至少六天連續暴露於活化刺激。T細胞較佳經活化，同時維持在至少107個細胞/ml之細胞密度下以最大化細胞與細胞之接觸。該種細胞與細胞之接觸用於增強同種異體T細胞之活化狀態。
在另一實施例中，該方法包括其中T細胞與施加於同種異體T細胞表面上的抗CD3及抗CD28 mAb一起投與，且其中mAb藉由與包被有對mAb有反應性之試劑的生物可降解微球體結合及包涵而交聯。
該方法亦包括其中T細胞投與刺激1型細胞介素之產生，且此類細胞介素包括以下至少一種：IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、TNF-α及TNF-β。此類細胞介素刺激免疫，包括宿主先天免疫功能。該方法亦包括其中經活化之T細胞的投與活化宿主樹突狀細胞及/或巨噬細胞。
本發明亦包括其中經活化之同種異體T細胞的投與及經活化T細胞之後續排斥刺激針對宿主駐留疾病之免疫反應。
本發明亦包括一種方法，其中在調配及向宿主投與之前將離體活化之同種異體T細胞冷凍保存。
本發明亦包括一種用抗CD3及抗CD28 mAb標記之同種異體T細胞的組合物，該等mAb與包被有對該等mAb有反應性之試劑的生物可降解微球體交聯。經標記之同種異體T細胞及相關生物可降解微球體懸浮在適用於靜脈內輸注之介質中。此類T細胞及相關生物可降解微球體以107個細胞/ml或更高之細胞密度懸浮，並且較佳在柔性容器或注射器中。用抗CD3及抗CD28標記之T細胞亦可在調配及投與之前冷凍保存。
本發明亦包括一種同種異體細胞材料，當與載有腫瘤之宿主免疫系統接觸時，引發宿主抗腫瘤(HVT)及宿主抗移植物(HVG)反應，而不會引發毒性移植物抗宿主(GVH)反應。同種異體細胞材料含有離體活化之T細胞且其中該等經活化之T細胞較佳為CD4+T細胞。
本發明亦包括一種同種異體細胞材料，該材料在向載有腫瘤之宿主投與時引起腫瘤細胞凋亡。同種異體細胞材料含有活化的同種異體T細胞，且此類T細胞較佳為CD4+細胞。此類CD4+細胞應在細胞表面上表現FasL及/或TRAIL，較佳以高密度表現。此類活化的T細胞較佳在離體活化後分化成表現CD45RO及CD63Llo之記憶細胞。此類同種異體T細胞應表現以下細胞介素中之一或多者：IL-2、IL-15、IFN-γ及TNF-α，並在向宿主投與後，表現表面FasL及/或TRAIL。
本發明亦包括一種包含治療有效量之同種異體細胞群之組合物，其中至少一部分為T細胞且藉此該等T細胞用活化有效量之一或多種單株抗體或其部分標記；以及交聯有效量之對單株抗體有反應性之試劑。該種組合物之T細胞較佳用抗CD3及抗CD28 mAb標記。對mAb有反應性之試劑較佳在可降解之微球體上包被。同種異體T細胞及相關生物可降解微球體懸浮於適用於靜脈內輸注之介質中。此類經標記之T細胞及相關交聯生物可降解微球體以107個細胞/ml或更高之細胞密度懸浮於柔性容器或注射器中。組合物可在輸注前冷凍保存。
在較佳實施例中，本發明中使用的同種異體細胞為已經離體活化之純化的T細胞，較佳為CD4+ T細胞，更佳為已分化成效應細胞或記憶細胞之CD4+ T細胞，它們產生高水準之1型細胞介素，諸如IL-2、IL-15、IFN-γ、TNF-α，並且亦在細胞表面上表現，較佳以高密度表現效應分子，諸如CD40L、TRAIL及FasL。
在另一較佳實施例中，用於輸注之同種異體T細胞藉由使細胞保持高細胞密度（107個細胞/ml或更高）與T細胞活化劑連續接觸之方法進行離體處理。
在另一較佳實施例中，用於輸注之同種異體T細胞在適於輸注之培養基中調配，其中含有活化劑作為自收穫至輸注保持T細胞活化狀態的手段。
在另一較佳實施例中，大於90%或較佳大於95%所輸注之同種異體T細胞在輸注至患者體內時繼續處於活化增強之狀態。 VI. 本發明之實例 實例 1 ：新穎的可離子化脂質在 200 ng/ 孔之活體外劑量下具有高遞送效率（研究 TRANS-14 ）。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為 25/5/19.25/0.75 mM）並連續稀釋以獲得27.74 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到1 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.56 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的50-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第7圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第8圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第9圖中說明。
D ：基於 Presto Blue HS 活力試劑之毒性檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞與預熱的Presto Blue HS試劑(10% v/v)在37℃下培育15分鐘。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex540/Em590)。結果在第10圖中說明。 實例 2 ：示範性可離子化脂質在活體外劑量為 200 ng/ 孔下具有高遞送效率（研究 TRANS-16 ）。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為 25/5/19.25/0.75 mM）並連續稀釋以獲得27.74 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到1 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.56 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的50-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第11圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第12圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第13圖中說明。
實例 3 ：示範性可離子化脂質在活體外劑量為 200 ng/ 孔下具有高遞送效率（研究 TRANS-18 ）。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為25/5/19.25/0.75 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到3.6 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並將12K HEK293細胞用相同的200 ng劑量轉染。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第14圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第15圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第16圖中說明。
D ：基於 Presto Blue HS 活力試劑之毒性檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞與預熱的Presto Blue HS試劑(10% v/v)在37℃下培育15分鐘。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex540/Em590)。結果在第17圖中說明。
實例 4 ：示範性可離子化脂質在活體外劑量為 100-200 ng/ 孔時具有高遞送效率（研究 TRANS-22 ）。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為25/5/19.25/0.75 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到3.6 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在50 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的50-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第18圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第19圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第20圖中說明。
實例 5 ：示範性可離子化脂質在活體外劑量為 100-200 ng/ 孔及活體內劑量為 2.5 μg 時具有高遞送效率 (Study InVivo-1) 。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為25/5/19.25/0.75 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到3.6 mg/ml。將mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在50 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置5中混合24 μl脂質混合物與48 μl mRNA溶液，並注入72µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的144 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的50-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。第一代DL-ADDE LNP在活體外及活體內具有與MC3相似之效率，MC3為先前技術LNP中使用的標準參考脂質。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第21圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第22圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第23圖中說明。
D ：在BALB/c小鼠中注射後4小時的mRNA Fluc之活體內轉譯。經透析之DL-ADDE LNP及MC3 LNP經由3種投藥途徑注射 - 血管內(IV)、肌內(IM)、皮內(ID)。注射總體積為50 µL，含有2.5 µg具有Fluc mRNA之LNP(2 X 25µLl，對於MC3 ID)。注射後4小時腹膜內投與螢光素，並藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。DL-ADDE-C2/C2-PipZ LNP將在注射後4小時之表現定位至IM注射部位，並根據輻射的感興趣區域 (ROI) 分析以約50%之MC3水準表現螢光素酶。與定位於肌肉的DL-ADDE表現相反，MC3及其他公開的脂質在IM注射後4小時造成在肝臟中快速播散的表現。DL-ADDE LNP之IM局部表現可能係由於它們在生理pH值下帶有輕微的正電荷，而MC3及其他公開的LNP則帶負電，並且可能產生更大的免疫原性，同時有降低的反應原性及減少的全身不良事件。顯然，即使IV注射時，DL-ADDE LNP亦不會在肝臟中表現。以下兩種LNP（DL-ADDE-C2/C2-PYR、DL-ADDE-C2/C2-PIPZ）符合通過/不通過標準，以便使用表現SARS-CoV-2之mRNA進行免疫原性測試，如下實例9中進一步展示。結果在第24圖中說明。
實例 6 ：示範性 DL-ADDE 可離子化脂質在 100-200 ng/ 孔之劑量下具有高遞送效率，而 BOD-ADDE 可離子化脂質在 25-200ng 下活體外有效的（研究 TRANS-30 ）
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為 25/5/19.25/0.75 mM）並連續稀釋以獲得27.74 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到3.6 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.56 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的25-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第25圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第26圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第27圖中說明。
實例 7 ：示範性 DL-ADDE 可離子化脂質在 100-200 ng/ 孔之劑量下具有高遞送效率，而 BOD-ADDE 可離子化脂質在 25-200ng 下活體外有效的（研究 TRANS-31 ）
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為 25/5/19.25/0.75 mM）並連續稀釋以獲得27.74 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到3.6 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.56 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有200 ng，並用相同的25-200 ng劑量轉染12K HEK293細胞。第一代DL-ADDE LNP具有與MC3及KC2相似的效率，MC3及KC2為在mRNA LNP文獻中使用的標準參考脂質。
A ：用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第28圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第29圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第30圖中說明。
實例 8 ：用於快速微流體混合的 50 mM 新穎可離子化脂質與 1 mg/ml mRNA 顯示出獨特的膠態離子化特性（研究 LNP-19 ）、高活體外遞送效率（研究 Trans 31 ）及遞送 SARS-CoV-2 免疫原時的高免疫原性（活體內研究 2 ）。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為25/5/19.25/0.75 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)及2019-nCoV Wuhan S-2P (Covid)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到≥ 3 mg/ml。將mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在50 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。將ADDE脂質與標準脂質像KC2及MC3進行比較。第31-33圖
示範性 ADDE 可離子化脂質。pKa對於可離子化脂質係由ACDLabs Percepta獲得，且對於含有可離子化脂質之LNP係藉由ζ電位及TNS獲得。LNP等電pI係由ζ電位獲得。LNP直徑為來自DLS之數均值。每個LNP之平均mRNA拷貝係使用分子體積模型及DLS直徑來計算，並且與LNP體積成比例。 表 14
Figure 02_image253
1. 自上述結構中最左邊之N原子開始的N原子之pKa。
A ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第34圖中說明。
B ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第35圖中說明。
C ： LNP 電荷之 ζ 電位、 pKa 及 pI 。將LNP在75 mM TNS緩衝液（甘胺醯甘胺酸、乙酸鹽、咪唑各10 mM、20 mM硼酸鹽、25 mM NaCl）中稀釋，使其在800 ul TNS緩衝液中含有0.8 mg總mRNA，並轉移至Folded Capillary Zeta Cell (DTS1070)中以藉由動態光散射(DLS)量測尺寸並藉由電泳光散射(ELS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中量測電泳移動率。ζ電位係在控制電壓之條件下量測的，以限制溶液中的歐姆加熱，該溶液具有4種緩衝液，其中pKa分佈在pH範圍3-10內，間隔為0.5。LNP pKa係藉由將亨德森-哈瑟爾巴赫方程擬合至ζ電位數據來計算的。LNP pI係藉由將ζ電位內插為零來找出。使用電動力學模型來計算LNP之亨利函數及電荷。結果在第36圖中說明。
D ： LNP pKa 之 TNS 檢定。將LNP稀釋以在75 mM TNS緩衝液（甘胺醯甘胺酸、乙酸鹽、咪唑各10 mM、20 mM硼酸鹽、25 mM NaCl）中保持75 uM可離子化脂質及6 uM TNS之總濃度，以保持TNS/可離子化比率為0.08。螢光TNS在具有4種緩衝液之溶液中量測，pKa分佈在pH範圍3-10內，間隔為0.5。LNP之pKa係使用陰離子染料TNS螢光增強之pH值依賴性量測的，在較低pH值下強度較高，而在高pH值下強度較低。LNP pKa係藉由將亨德森-哈瑟爾巴赫方程擬合至來自TNS檢定之螢光數據來計算的。結果在第37圖中說明。
實例 9 ：示範性可離子化脂質在活體內具有高遞送效率 (Study InVivo-4) 。
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為25/5/19.25/0.75 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到4 mg/ml。將mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在50 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置5中混合24 μl脂質混合物與48 μl mRNA溶液，並注入72µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的144 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。將LNP濃縮以注射5 ug經封裝之mRNA 50 ul以供肌內投與。
A ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第38圖中說明。
B ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第39圖中說明。
C ：在 IM 投與時的活體內螢火蟲螢光素酶表現。將5 ug經封裝之mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。在注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時及24小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。結果在第40A-40H圖中說明。
D ： SARS-CoV-2 S 特異性結合抗體效價。將BALB/c小鼠（n=5/組）在第0週及第3週用0.1 μg及1 μg劑量的S-2P mRNA編碼之免疫原在3種不同的LNP MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BOD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ中進行免疫。在Prime後3週及Boost後5週，藉由ELISA評估血清之SARS-CoV-2 S特異性IgG。在MC3及BOD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ初接觸後發現劑量依賴性及高結合抗體效價。在此等年幼動物中加強後發現所有LNP之效價均很高。
實例 10 ：經由莫耳比調整進一步優化 LNP 活體外遞送效率。 (TRANS-36)
概述：使用50-52 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含可離子化 BODD-C2C4-PipZ/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-70:8-14:29-49:1-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以達到50-52 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到4.6 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在20 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第41圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第42圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第43圖中說明。
實例 11 ：對用於快速微流體混合的在 50 mM 總脂質濃度下與 1 mg/ml 之 mRNA 混合的可離子化脂質之篩選提高活體外 LNP 遞送效率 (TRANS-40)
概述：使用50 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將四種脂質合併以獲得50 mM總脂質濃度（分別為24/6.5/18.5/1 mM）。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第44圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第45圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第46圖中說明。
實例 12 ：液體形式之示範性可離子化脂質調配物在 4 ℃ 及室溫下之穩定性 (TRANS-42)
概述：使用約75 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得75 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15-25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6 x 1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ：使用螢火蟲螢光素酶檢定，基於活體外效力之穩定性檢定。在第0、2、4、7、14及28天轉染細胞。每天進行螢火蟲檢定並記錄。結果在第47圖中說明。
B：針對LNP尺寸之動態光散射(DLS)及針對LNP封裝效率之Ribogreen檢定。在第0、2、4、7、14及28天測定LNP，並記錄。結果在第48圖中說明。
實例 13 ：用於快速微流體混合的低 0.25 mg/ml 及高 1.5 mg/ml 混合濃度之示範性可離子化脂質調配物在活體外顯示出高遞送效率及效力 (TRANS-43)
概述：使用12.5-75 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得75 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到12.5 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第49圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第50圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第51圖中說明。
實例 14 ： Moderna 緩衝液有助於比 PBS 更好地冷凍可離子化脂質調配物，並在活體外顯示出相同的遞送效率及效力 (TRANS-45)
概述：使用12.33-77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50-47:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到12.33 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到6.3 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。將LNP在Moderna冷凍緩衝液20 mM Tris緩衝液中分成一半進行透析持續6小時，該緩衝液含有87 mg/mL (254 mM)蔗糖及10.7 mM醋酸鈉，pH 7.5（Moderna Protocol第47頁）。隨後將每組LNP (新鮮PBS、新鮮Moderna、冷凍PBS、冷凍Moderna)稀釋，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第52圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第53圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第54圖中說明。
實例 15 ：用於快速微流體混合的 1.5 mg/ml 高 mRNA 混合濃度下的示範性可離子化脂質調配物 BODD C2C4 PipZ 與標準混合濃度 0.2 mg/ml 下的參考脂質 MC3 相比顯示出較高的活體內遞送效率及效力 (InVivo-7)
概述：使用10-75 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得75 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到10 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15-25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第55圖中說明。
B ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第56圖中說明。
C ：在 IM 投與時的活體內螢火蟲螢光素酶表現。將0.5-5 ug總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。在注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時及24小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。結果在第57A-57I圖中說明。
實例 16 ：在 1.5 mg/ml 高 mRNA 混合濃度下的示範性可離子化脂質調配物 BODD C2C4 PipZ 與標準混合濃度 0.2 mg/ml 下的參考脂質 MC3 相比當遞送 SARS-CoV-2 免疫原時顯示出較高的活體內遞送效率及免疫原性效力 (InVivo-8)
概述：使用10-75 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得75 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到10 mM。將密碼子優化之2019-nCoV Wuhan S-2P (Covid)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15-25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNP稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ：活體內免疫原性終點 ELISA 抗 RBD 效價。將0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。加強前及加強後(3週後)顯示如下。結果在第58A-58B圖中說明。
B ：用於假中和檢定之活體內免疫原性 FRNT50 效價。將0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。加強前及加強後(3週後)顯示如下。結果在第59圖中說明。
實例 17 ：使用示範性可離子化脂質調配物 BODD C2C4 PipZ 以 1.5 mg/ml 高 mRNA 混合濃度進行快速微流體混合之小鼠挑戰當遞送 SARS-CoV-2 免疫原 ( 在 0.25 ug 劑量下提供 100% 保護 ) 時顯示出比在標準混合濃度 0.2 mg/ml 下之標準脂質 MC3( 在 0.5 ug 下提供 100% 保護 ) 高的活體內遞送效率及免疫原性效力 (InVivo-9)
概述：使用10-75 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得75 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到10 mM。將密碼子優化之2019-nCoV Wuhan S-2P (Covid)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15-25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ：針對病毒挑戰之活體內保護 - 挑戰模型中之存活比例、體重及溫度。將0.1、0.25、0.5、1 ug之總 mRNA在加強前及加強後（5週後）以肌內(I.M.) 注射之方式注射至小鼠中。該挑戰係與意大利毒株(Italian strain)一起在5 x 10 4PFU下使用。結果在第60A-60B圖中說明。
B ：挑戰模型中之活體內體重及溫度。將0.1、0.25、0.5、1 ug之總 mRNA在加強前及加強後（5週後）以肌內(I.M.) 注射之方式注射至小鼠中。該挑戰係與意大利毒株(Italian strain)一起在5 x 10 4PFU下使用。結果在第61A-61D圖中說明。
實例 18 ：用於快速微流體混合的在 1.5 mg/ml 高 mRNA 混合濃度下之示範性可離子化脂質調配物顯示出比標準脂質 MC3 高的活體內遞送效率及效力 (InVivo-10)
概述：使用77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第62圖中說明。
B ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第63圖中說明。
C ： IM 及 IV 投與時的活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌內(I.M.)及靜脈內(I.V.)注射之方式注射至小鼠中。在注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時及24小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。結果在第64A-64J圖中說明。
實例 19 ：脂質濃度自 10.2 增至 77 mM 且 mRNA 自 0.2 增至 1.5 mg/ml( 以供快速微流體混合 ) 提高活體外 LNP 遞送效率。 (TRANS-49)
概述：使用10.2-77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM總脂質濃度，隨後進行系列稀釋以達到10.2 mM。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2-1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析持續4x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持10 7RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第65圖及第66圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第67圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第68圖中說明。
實例 20 ：脂質濃度增至 77 mM 且 mRNA 增至 1.5 mg/ml( 以供快速微流體混合 ) 顯示出活體外 LNP 遞送效率。 (TRANS-52)
概述：使用77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，以達到濃度5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析持續4x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10-5 mg/ml 至4.88 x10-3 mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持107 RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第69圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第70圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在1X PBS中量測尺寸，其中黏度為1.02 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第71圖中說明。
實例 21 ：在約 25 mM 總脂質濃度下與 0.5 mg/ml mRNA 組裝之示範性脂質 ( 以供快速微流體混合 ) 顯示出活體外 LNP 遞送效率。 (TRANS-59)
概述：使用約25 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將每一種脂質溶解於乙醇中直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得約25 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，以達到濃度5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在25 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到0.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析持續4x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A. 用於 mRNA 遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。轉染24小時後，將經轉染之細胞調節至室溫並持續30分鐘，之後進行螢火蟲螢光素酶檢定。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍系列稀釋製備。將50 ul自3.9 x10-5 mg/ml 至4.88 x10-3 mg/ml的各標準點包括在微孔板中作為陽性酶活性對照（數據未顯示），以保持107 RLU/mg/ml之線性。將ONE-Glo受質以1:1之比率添加至未經轉染、經轉染及Quantilum之各孔中，該受質先前已調節至室溫持續至少4小時。將檢定板在黑暗中培育3分鐘，隨後立即引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取發光。結果在第72圖中說明。
B ：用於 mRNA 封裝效率之 Ribogreen 檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液（1X TE緩衝液中之2% v/v）一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul，並以1:1之比率添加至各TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及1X TE緩衝液，且另一條含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之每條均用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，該種使用兩條標準曲線之方法在計算封裝效率及mRNA濃度時更準確。在將經稀釋之LNP添加至微孔板中之後，標準品包含在微孔板中。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之比率添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。結果在第73圖中說明。
C ： LNP 尺寸之動態光散射（紅點為 PDI 右 y 軸）。將經透析之LNP在蔗糖緩衝液pH 7.5中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在蔗糖中量測尺寸，其中黏度為1.1 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。結果在第74圖中說明。
實例 22 ：在總脂質濃度 77 mM 及 mRNA 濃度 1.5 mg/ml 下 ( 以供快速微流體混合 ) 的 LNP 之組裝顯示出活體內 LNP 遞送效率。 (InVivo-11)
概述：使用77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將雙脂質儲備液（可離子化/膽固醇，DSPC/PEG-DMG）溶解於乙醇中，直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在20 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。隨後將LNP針對1X DPBS pH 7.4透析6x1小時。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ： IM 投與時注射部位之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug之總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時藉由活的動物成像監測注射部位之螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。結果在第75圖及第76圖中說明。
B ： IM 投與時的離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug之總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。對於離體而言，在活體內成像後立即提取器官並成像。結果在第77圖及第78圖中說明。
實例 23 ：在總脂質濃度 77 mM 及 mRNA 濃度 1.5 mg/ml 下 ( 以供快速微流體混合 ) 的 LNP 之組裝顯示出活體內 LNP 遞送效率。 (InVivo-13)
概述：使用77 mM之總脂質濃度調配LNP，該等脂質包含若干種可離子化脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)。將雙脂質儲備液（可離子化/膽固醇，DSPC/PEG-DMG）溶解於乙醇中，直至觀察到澄清溶液。將該四種脂質合併以獲得77 mM之總脂質濃度。將密碼子優化之螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中用於共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄並經纖維素純化以移除dsRNA。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌並重懸於無核酸酶之水中，使其濃度達到5.5 mg/ml。將FLuc mRNA儲備液以系列稀釋自較高濃度之溶液稀釋至較低濃度，以在15 mM醋酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，同時將NP比率保持在4，之後在Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)中混合，由此允許使用微流體混合技術在調配物中實現高再現性。在設置3中混合16 μl脂質混合物與32 μl mRNA溶液，並注入48 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將所形成之LNPS稀釋至另外的96 µl 1X DPBS pH 7.4中。接著將LNP針對蔗糖緩衝液pH 7.5透析6x1小時。將冷凍的LNP保持在-80C下以供活體內注射。接著稀釋LNP，以使32 ul含有25-200 ng，並將12K HEK293細胞用相同劑量轉染，但在微流體混合器中以不同濃度製造。
A ： IM 投與時注射部位之離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug之總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。結果在第79圖及第80圖中說明。
B ： IM 投與時的離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug之總mRNA以肌內(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射後4小時腹膜內投與螢光素，並在4小時藉由活的動物成像監測螢光素酶表現。使用IVIS系統計算ROI。對於離體而言，在活體內成像後立即提取器官並成像。結果在第81圖、第82圖及第83圖中說明。
實例 24 ： C24 可離子化脂質之三價頭部基團呈現出可在胞內體 pH 範圍內增強質子化的分子及 LNP 離子化特性
可離子化脂質設計空間之初步篩選包括多於100個頭部基團、10個連接子及50個烷基尾部，它們為了50,000餘種潛在的可離子化脂質候選物而組合。計算約500種候選物之水相pKa，此等候選物對此設計空間進行採樣，並選擇若干個頭部基團，以便使用僅涉及2個反應及一種催化劑之合成程序用帶有烷基尾部之丙烯酸酯來合成，而對於當前的COVID-19 mRNA疫苗中之可離子化脂質，則需要多於5個反應及7種催化劑。反應方案之簡單性導致純化步驟少得多、合成時間短得多且產率超過80%，估計成本降低了10倍，這可促進全球疫苗接種活動。最初合成了多於30種候選的可離子化脂質，並對其進行物理化學及某些生物學性能指標之表徵，從而為當前研究選擇C24（第84a圖）以供進一步之研究。C24帶有三價4-甲基-1-哌嗪丁胺頭部基團，其中理論水相pKa範圍在4至8內，兩個皆接近預測值（7.7及7.8）。合成水溶性類似物（C24-WSA）並使用已建立的1H NMR方法量測每個氮之pKa，證實理論pKa值在0.4個單位內（第84b圖）。對於末端氮（pKa 8.1，在第84b圖中呈紅色），觀察到與理想的亨德森-哈瑟爾巴赫行為之略微拉伸偏差，這與具有略低pKa（第84b圖中之7.5）之氮原子相互作用一致，它們幾乎同時質子化。此觀察結果亦指示這兩個位點之間的質子配位及在初始質子化階段形成配位鍵的潛力。水溶性MC3類似物之NMR分析揭示pKa為9.5（第84c圖），這與預測值9.4（第84a圖）極其相似。正如吾等最近所描述，使用量測表面電荷之TNS染料結合檢定評估用C24及MC3製成的LNP之質子化並藉由量測LNP淨電荷之電泳移動率評估ζ電位。TNS染料結合檢定揭示C24 (6.77)之pKa高於MC3 (6.55)並且當pH值自7.4下降至6時表面質子化的增加更大（第84f圖中之4517與2559 RFU），表明在胞內體pH範圍內C24比MC3大的表面質子化。對於TNS染料結合檢定而言，將計算胞內體質子化中的下限pH值取為6，因為低於此pH值時表面電荷沒有變化。與TNS染料結合檢定相反，電泳移動率量測對LNP之淨電荷進行量測並顯示出降至3之ζ電位增加所反映的LNP淨電荷之更廣泛變化（第84e圖）。MC3非常密切地遵循最初為聚電解質34提出的擴展亨德森-哈瑟爾巴赫模型之行為，因為它解釋了密切相互作用的可離子化位點之離子化狀態依賴性pKa，該等位點係諸如在LNP內緊密靠近的數千個二甲胺MC3頭部基團。擴展的亨德森-哈瑟爾巴赫分析揭示MC3 LNP之ζ電位pKa為5.33且pI為5.57（第84f圖）。C24 LNP之離子化行為更複雜，其中ζ電位在自pH 7.4變至pH 6時快速上升，對應於頭部基團中3個氮中之2個的同時質子化，水相pKa為8.1及7.5（第84b圖），低於此值時，ζ電位在pKa 3.7下因中心氮之作用而繼續上升（第84b圖）。C24之此多質子離子化行為未得到擴展的亨德森-哈瑟爾巴赫模型（第84e圖中呈紅色虛線與實線）很好地表示，導致ζ電位pKa為 5.21且pI為6.12（第84f圖）。C24 LNP之ζ電位自pH 7.4增至pH 4.5 (此時胞內體被視為與溶酶體融合)的計算結果高於MC3 LNP（第84f圖中之25.1 mV與14.3 mV），再次表明C24之質子化水準在胞內體pH範圍內時高於MC3。綜上所述，上述分析將單質子與多質子頭部基團上的分子質子化事件與它們在凝聚的LNP環境中之質子化聯繫起來，並且表明在胞內體pH範圍內時，C24 LNP與MC3相比質子化增加了約2倍。
尺寸表徵顯示C24 LNP略大於MC3（第85a圖中之直徑80 nm與64 nm），並且ribogreen染料結合不可及之mRNA分率略低（第85b圖中之68%與79%）ribogreen不可及的mRNA之分率通常稱為封裝效率，然而，現在已知不可及之部分不為mRNA之游離部分，因為它可能不會在基於凝膠之檢定中遷移。使用吾等最近公佈的LNP分子體積模型來估計每種LNP中螢火蟲螢光素酶(FLuc)編碼mRNA之拷貝數量，發現MC3 LNP中平均有4.5個拷貝，而C24 LNP中平均有6個拷貝（第2c圖），此係由於其較大之尺寸。CyroTEM分析揭示C24 LNP之尺寸更大，與DLS量測結果一致，並且兩個LNP皆具有相似的結構，顯示出外圍雙層及內部電子緻密非晶核（第85d、e圖）。
實例 25 ：肌內注射後， C24 LNP 之螢光素酶表現比 MC3 LNP 高 4 倍，並且在肝臟中之脫靶表現比 MC3 低 6 倍
以相對較高劑量之5μg mRNA在小鼠中肌內(IM)投與LNP後，mRNA FLuc編碼報告基因之活體內表現在4小時及24小時的C24注射部位顯示出高2倍之表現（第86a圖及第86b圖）對於MC3，肝臟中之全身生物分佈及脫靶表現係高的（第86圖）。相比之下，與MC3相比，此高劑量之C24實際上消除了全身生物分佈，其中肝臟中之脫靶表現降低了6倍（第86C圖），這為一個重要發現，因為與mRNA-LNP疫苗相關之全身反應原性及不良事件可與除注射部位及引流淋巴結以外部位的全身生物分佈及脫靶表現有關聯。在此針對MC3所見之高脫靶表現與先前對MC3之發現一致，並且監管文件表明它亦發生在當前緊急授權之COVID-19 mRNA疫苗的齧齒動物模型中。顯著限制C24 LNP全身生物分佈之機制可能與其在接近中性pH值時表面電荷及淨電荷之快速增加有關（第86d圖及第86e圖），因為先前發現在IM投與時更局部地含有帶負電較少之LNP。在更低的0.5 μg劑量下IM投與Fluc 編碼之mRNA-LNP，這更能代表小鼠之疫苗接種劑量，顯示C24在注射部位處之表現比MC3高4倍（第86d圖及第86e圖）。由於肝臟部位之低訊噪比，IVIS在此10倍低劑量下無法偵測到脫靶表現。小鼠之每日成像顯示持續48小時之初始表現爆發，並在5天內逐漸下降至基線（第86f圖）。
實例 26 ：對 mRNA 編碼之 SARS-CoV-2 刺突蛋白的免疫原性顯示， C24 LNP 與 MC3 LNP 相比，針對原始武漢毒株及兩種突出變異體的結合效價更高且假中和效價高 10 倍
LNP與核苷修飾之mRNA組裝在一起，該mRNA編碼雙脯胺酸穩定之膜結合刺突蛋白免疫原(S2P)，該免疫原在當前緊急授權之COVID-19 mRNA疫苗中。在Balb/c小鼠中進行免疫原性研究，藉由IM投與兩次免疫接種，劑量範圍為0.1 µg至1 µg，在初接觸與加強免疫之間間隔3週，並且分析血清中針對刺突蛋白受體結合域之結合抗體，以及對SARS-CoV-2假病毒之中和檢定。在過渡稀釋度下的ELISA結合檢定之光密度顯示，與MC3相比，在所有劑量下C24 LNP之結合抗體均顯著更高（第87a圖及第87b圖）。對SARS-CoV-2假病毒之中和檢定顯示，在加強後之所有劑量下，C24 LNP之中和效價比MC3顯著增加了約10倍（第87C圖）。在Moderna之SM-102 LNP中用相同mRNA編碼之免疫原（其他mRNA結構不同）在Balb/c小鼠中進行的一項非常相似之檢定揭示效價與MC3（1,000，在1 µg下）相似，提示C24 LNP可能亦比SM-102 LNP更有效。在C24 LNP中遞送之1 µg劑量亦能夠在單次劑量後誘導中和，其中MC3不產生中和作用（第87c圖中之初接觸）。最終，發現以最高1 µg劑量接種之動物的血清能夠中和SARS-CoV-2之兩種變異體，並且對於所測試之變異體，C24之效價高於MC3之效價（第87d圖）。
實例 27 ：在 K18-hACE2 小鼠中之致死挑戰揭示，在 0.25 µg 之低初接觸 / 加強劑量的核苷修飾之 S2P mRNA 下 C24 LNP 可實現完全保護，並且在 0.5 µg 劑量下完全消除肺部感染
在載有人類ACE2受體之K18-hACE2基因轉殖小鼠中研究接種含有S2P免疫原之mRNA-LNP後針對SARS-CoV-2致死感染之保護作用。將含有S2P免疫原之C24及MC3 LNP以0.1至1 µg範圍內之mRNA劑量水準投與兩次，每組5只動物，且隨後用致命鼻內劑量之意大利毒株（意大利分離株-INMI1）SARS-CoV-2進行挑戰。將每組五隻動物中之兩隻在第5天處死以評估肺中之病毒效價，並且對其餘3只進行追蹤直至滿足安樂死標準。發現C24 mRNA LNP在0.25 µg下完全保護小鼠，其中在0.1 µg劑量下3只動物中之一只亦存活，而MC3則在0.5 µg劑量下出現保護（第88a圖）。斑塊檢定中之中和效價顯示C24 LNP在0.25 µg下達到的效價相當於在初接觸及加強後1 µg劑量下MC3之效價（第88b圖及第88c圖）。感染後5天檢查肺病毒效價，發現C24 mRNA LNP在0.5 μg劑量下完全阻斷肺部感染，且即使在最高1 μg劑量下，MC3亦不能完全阻斷感染。綜上所述，此等結果表明C24 LNP以比MC3低約4倍之劑量實現對感染之保護。在吾等之研究中施用兩次的0.25 µg保護劑量比在含有刺突蛋白之自我複製mRNA的LNP38中所見的單一有效劑量(15 µg)低60倍，並且比在亦含有自我複製之mRNA的不同LNP下所見的另一單一劑量低10倍。雖然後面此等關於自我複製mRNA之研究為單劑量的，但所需劑量要大得多，而且其水準預計會在人類中產生不可接受之反應原性。與吾等最相似之研究為在Moderna之SM-102 LNP中使用S2P免疫原進行初接觸/加強核苷修飾之方法，其中SM-102 LNP中高達1 µg之S2P免疫原的劑量無法阻斷肺部感染，儘管與PBS對照相比，它們確實減少了肺部感染。因此，在吾等之研究中，SM-102 LNP阻斷小鼠肺部感染之效力與MC3相似，支持SM-102及MC3中和效價對SARS-CoV-2假病毒（皆在約1,000下，第87c圖)之類似效力。綜上所述，此等結果提示C24 LNP系統在小鼠模型中超過MC3及SM-102 LNP之效力。通常，無法由小鼠模型預測向非人類靈長類動物及人類之轉譯，因此需要更大的動物模型及臨床研究結果來進一步評估C24 mRNA LNP疫苗。
實例 28 ： C24 LNP 之注射部位炎症比 MC3 LNP 溫和
MC3 mRNA LNP之注射部位炎症在IM投與後24小時由肉眼可見之腫脹及注射腿之高度僵硬在視覺上顯而易見。以5 µg劑量注射之C24 mRNA LNP的注射部位炎症在肉眼上程度低於MC3 LNP注射部位之腫脹。因此，固定及處理注射腿以進行標準組織學分析（石蠟及H&E染色）。發現所注射之50 µL mRNA LNP儲庫不在肌肉組織內，而是主要沉積在內側與外側腓腸肌之間的面平面中（第89a、89d及89g圖中之IS）並且難以區分此等部位之脂肪組織。LNP儲庫之此非肌內部位係由於標準的3 mm注射深度穿過約2 mm厚之內側腓腸肌。內側腓腸肌之體積僅為約150 µL41，因此即使注射深度減小，標準的50 µL LNP體積亦不太可能包含在肌肉內。在將C24組織學與MC3進行比較時，觀察到MC3之炎症程度更高，例如在多細胞之滑膜中，並且MC3與C24之正常外觀相比係增厚的（第89e、89f圖與第89b、89c圖）。除了注射部位處有白血球及脈管系統浸潤外，亦觀察到C24及MC3 LNP在投與後24小時存在混合細胞型淋巴樣結構（第89 a、g、i圖），而對照未注射之腿中則不存在。此等快速形成（在24小時內）之淋巴樣結構可在小鼠之免疫反應中發揮重要作用，並且正在進行進一步表徵。
實例 29 ： LNP 在 4 ℃ 下之儲存揭示 C24 LNP 可穩定至少 19 天，而在較高溫度下之儲存會誘導生物活性喪失及 mRNA 切割，這與 mRNA 切割之磷酸二酯轉酯反應機制一致
mRNA LNP通常需要冷凍儲存，並且根據緊急授權LNP之使用說明書，可在冷藏溫度下儲存長達30天。近期的審查強調幾乎完全缺乏有關導致mRNA LNP儲存過程中之不穩定機制的資訊，儘管歐洲監管文件指出不穩定係溫度依賴性的，並且涉及mRNA完整性之喪失以及LNP尺寸之變化及雜質的產生。因此，將C24及MC3 FLuc mRNA LNP在PBS中在2個溫度，亦即4℃或室溫（RT≈22℃）之一個下儲存2週，並藉由螢光素酶之活體外表現測試生物活性。發現C24及MC3 LNP在4℃下儲存2週時的生物活性係穩定的（對在不同日期接種之細胞進行的此生物活性檢定之高度可變性範圍內），但在室溫下儲存時下降了20-40%（第90a圖）。沒有發現LNP尺寸或對Ribogreen之可及性在在2週內在任一儲存溫度下發生任何變化（第90b圖及第90c圖）。使用自表徵鹼催化之磷酸二酯轉酯反應及mRNA骨架切割的溫度及pH值依賴性之數據中導出的模型計算2,061個核苷酸長之FLuc的mRNA完整性隨時間之喪失。該模型預測的半衰期為4℃下2,300天、22℃ (RT)下125天及37℃下11天，均在pH 7.4下（第90d圖）。因此，預計mRNA骨架切割對溫度極其敏感，並且此等趨勢與先前對游離mRNA之發現在性質上一致。隨後，在4℃及22℃ (RT)以及37℃下將另外的mRNA LNP儲存在PBS中以加速降解，並在氯仿/甲醇中提取mRNA，以在微流體電泳裝置上分析mRNA之完整性。發現mRNA之完整性在4℃下儲存時可保持至少19天，而較高溫度會產生mRNA切割（第90e圖）。藉由對應於FLuc mRNA峰之曲線下面積(AUC)估計mRNA完整性，該峰經歸一化為C24與MC3 LNP合在一起之第0天值。在較高溫度下，C24 LNP似乎比MC3 LNP保持更高程度之mRNA完整性，但樣品數量太少而無法進行統計分析（第90f圖）。在較高溫度下增加的mRNA切割與基於介導之mRNA切割的磷酸二酯轉酯反應機制模型一致（第90d圖），但可能呈現出對LNP環境及LNP中可離子化脂質之特定結構的依賴性。LNP環境可例如藉由質子分配現象加速mRNA降解，發現該現象為水介質中可離子化脂質與LNP中可離子化脂質pKa差異的原因。亦即，與外部水相相比，脂質環境中較高的質子溶劑合能將排除質子並提高LNP中之pH值，從而可加速鹼介導之mRNA切割，正如鹼催化之磷酸二酯轉酯及mRNA骨架之切割模型的pH值依賴性所預測的。
實例 30
材料與方法
材料
DMG-PEG (MW 2000 Da) (DMG-PEG2000)係購自NOF America。膽固醇係購自Combi Blocks。1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:0 PC, DSPC)係購自Avanti Polar Lipids。4-甲基-1-哌嗪丁胺係購自Enamine。丙烯醯氯、三甲基甲矽烷基丙磺酸鈉(DSS)係購自Sigma Aldrich。2-辛基-1-十二醇係購自BOC sciences。三級丁醇及新戊醇係購自combi-blocks。除非另有說明，否則所有反應均在周圍空氣氣氛下進行。除非另有說明，否則所有市售試劑均不經進一步純化而使用。將雙(2-辛基十二烷基) 3,3'-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)氮烷二基)二丙酸酯(C24)及C24與MC3之水溶性類似物如下所述合成並純化。與Spark NanoAssmblr™兼容之微流體盒係購自Precision Nanosystems。3M醋酸鈉pH=5.5係購自Thermofisher Scientific。ONE-Glo螢光素酶檢定系統係購自Promega Corporation。Slide-A-Lyzer™ MINI透析裝置0.5 ml (MWCO, 10 KDa)、20X TE緩衝液、無RNA酶及Quanti-iT Ribogreen RNA試劑係購自Thermo Fisher Scientific。Triton X-100及6-(對甲苯胺)-2-萘磺酸鈉鹽(TNS)係購自Sigma。將螢火蟲螢光素酶(FLuc)序列選殖至mRNA生產質體（優化之3'及5' UTR並含有101聚A尾）中，使用N1-甲基假尿苷修飾之核苷進行活體外轉錄，使用CleanCap技術（TriLink）進行共轉錄加帽並經纖維素純化45以移除dsRNA。預融合雙脯胺酸穩定之SARS-CoV-2刺突蛋白(S2P)序列經密碼子優化，並如上所述產生。將經純化之mRNA經乙醇沉澱，洗滌，重懸於無核酸酶之水中，並進行品質控制（電泳、點狀墨點及轉染至人類DC中）。D-螢光素(鈉鹽)係購自REGIS technologies, INC。HEK293細胞係購自ATCC。
可離子化脂質及可離子化脂質類似物之合成
溶劑係購自Sigma Aldrich、Combi blocks、Oakwood chemicals、Alfa Aesar、VWR及Thermofisher。無水二氯甲烷(DCM)、無水四氫呋喃(THF)及無水DMF係購自Sigma Aldrich。使用Opt監測反應。KMnO4玻璃基矽膠板、F254薄層層析板(TLC)及管柱純化係使用購自Siliccycle之矽膠層析(TLG-R10014BK-323)進行。使用CDCl3、D2O(Sigma Aldrich)作為d-溶劑及內標(1H NMR δ 7.26及13C NMR δ 77.00)在Bruker 400 MHz光譜儀上記錄NMR譜。1 M NaOH及1 M HCl溶液係購自Sigma Aldrich。四種內部NMR標準品（哌嗪、咪唑、氯乙酸及乙酸）係購自Sigma Aldrich，並且選擇性地用於原位NMR pH量測。
C24可離子化脂質及水溶性類似物
Figure 02_image255
將丙烯酸2-辛基十二烷酯2 (2) (3.4 mmol, 1.2 g, 1.48 ml)添加至烘箱乾燥之5 ml biotage微波小瓶中，並逐滴添加4-甲基-1-哌嗪丁胺(1) (1.31 mmol; 0.224 g)46。保持無溶劑條件並將密封的微波小瓶在90℃下攪拌2-3天。藉由TLC（氯仿/甲醇9:1 v/v，可用碘染色及磷鉬酸染色來觀察）監測反應進程直至1完全消耗。將粗產物在矽膠管柱上純化，用含0-5%甲醇之氯仿溶離。藉由薄層層析(TLC)分析管柱級分並將含有純產物之級分（Rf = 0.3）濃縮，以獲得呈黃色油狀之產物(雙(2-辛基十二烷基) 3,3'-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)氮烷二基)二丙酸酯(3)。(0.77 g，產率72%)。1H-NMR : (400 MHz, CDCl3, δ = 7.26 ppm作為標準): δ 3.95 (d, 6.0 Hz, 4H), 2.76 (t, 7.4 Hz, 4H), 2.49-2.40 (m, 12H), 2.34 (t, 7.2 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.60 (s, br, 2H), 1.44-1.435 (m, 4H), 1.25 (m, 64H), 0.87(t, 6.8 Hz, 12H)。13C NMR: (100 MHz, CDCl3, δ = 77.0 ppm作為標準): δ 172.8(C), 67.2(CH2), 58.5(CH2), 55.1(CH2), 53.6(CH2), 53.2(CH2), 49.2(CH2), 46.0(CH3), 37.3(CH), 32.6(CH2), 31.94(CH2), 31.92(CH2), 31.2(CH2), 30.0(CH2), 29.7(CH2), 29.67(CH2), 29.60(CH2), 29.38(CH2), 29.35(CH2), 26.7(CH2), 25.2(CH2), 24.7(CH2), 22.7(CH3)。
C24-水溶性類似物
Figure 02_image257
將4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-胺(1) (1.16 mmol, 0.2 g)與丙烯酸第三丁酯46 (4) (3.13 mmol, 0.40 g) 之混合物添加至烘箱乾燥之5 ml biotage微波小瓶中並保持無溶劑條件46。將密封的微波小瓶在90℃下攪拌2-3天。藉由TLC（氯仿/甲醇 9:1 v/v，可用碘染色及磷鉬酸染色觀察）監測反應進程，直至1完全消耗。將粗產物在矽膠管柱上純化，用含0-5%甲醇之氯仿溶離。藉由薄層層析(TLC)分析管柱級分並將含有純產物之級分(Rf = 0.34)濃縮，以獲得呈黃色油狀之產物(5)。(0.30 g，產率53%)。1H-NMR : (400 MHz, CDCl3, δ = 7.26 ppm作為標準): δ 2.67 (t, 7.2 Hz, 4H), 2.44-2.42 (m, 9H), 2.37-2.27 (m, 7H), 2.25 (s, 3H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.44-1.39 (m, 22H)。13C NMR: (100 MHz, CDCl3, δ = 77.0 ppm作為標準): δ 172.0 (C), 80.1 (C), 58.3 (CH2), 54.9 (2 × CH2), 53.5 (CH2), 52.9 (2 × CH2), 49.2 (2 × CH2), 45.8 (CH3), 33.6 (2 × CH3), 28.0 (9 × CH3), 25.2 (CH2), 24.5 (CH2)。
DLin-MC3-DMA水溶性類似物
Figure 02_image259
DLin-MC3-DMA水溶性類似物係按照先前文獻報導合成的。將4-(二甲胺基)丁酸鹽酸鹽(6) (59.7 mmol, 1.0 g)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC•HCl) (7.16 mmol, 0.63 g)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP) (1.49 mmol, 0.18 g)、三乙胺(42.0 mmol, 4.25 g, 5.83 mL)及CH2Cl2 (100 mL)置於250-mL雙頸圓底燒瓶中。將反應在室溫下攪拌20分鐘並逐滴添加新戊醇(7) (7.16 mmol, 0.78 mL)並將反應攪拌隔夜。藉由TLC（氯仿/甲醇9:1 v/v，可用碘染色觀察）監測反應進程，直至6完全消耗並藉由旋轉蒸發移除溶劑CH2Cl2。將混合物溶解於100 mL CH2Cl2中並用150 mL水及150 mL飽和NaHCO3溶液洗滌。將有機相經硫酸鎂乾燥並蒸發。將粗產物在矽膠管柱上純化，用含0-1%甲醇之氯仿溶離。藉由薄層層析(TLC)分析管柱級分並將含有純產物之級分(Rf = 0.4)濃縮，以獲得呈黃色油狀之產物(8)。(0.58 g，產率48%)。1H-NMR : (400 MHz, CDCl3, δ = 7.26 ppm作為標準): δ 2.36 (t, 7.4 Hz, 2H), 2.31 (t, 7.2 Hz, 2H), 2.22 (s, 6H, 2×NCH3), 1.84-1.78 (m, 2H), 0.86 (s, 9H, 2×CH3)。13C NMR: (100 MHz, CDCl3, δ = 77.0 ppm作為標準): δ 173.6 (C), 73.6 (CH2), 58.8 (CH2), 45.3 (2 × CH3), 32.1 (CH2), 31.2 (C), 26.4 (9 × CH3), 22.9 (2 × CH2)。
水溶性可離子化脂質類似物之pKa的NMR量測。
質子NMR化學位移之pH值依賴性用於按照已公開之方法5,6量測可離子化脂質水溶性類似物(WSA)之pKa值。哌嗪、咪唑、2-氯乙酸及乙酸之化學位移用作內部pH指示劑。MC3-WSA之溶液係用100 mM KCl、2 mM哌嗪、2 mM咪唑及5 mM水溶性可離子化脂質類似物於95% H2O-5% D2O中製備。C24-WSA羧酸酯之β位的末端（N1）及氮雜胺（N2）之溶液係用100 mM KCl、2 mM哌嗪、2 mM咪唑、0.2 mM DSS及5 mM水溶性可離子化脂質類似物於95% H2O-5% D2O中製備。C24-WSA之內部胺(N3)溶液係用100 mM KCl、2 mM氯乙酸、2 mM乙酸、0.2 mM DSS及5 mM水溶性可離子化脂質類似物在95% H2O-5% D2O中製備。將溶液分成兩個等體積，且一個使用0.1 M HCl滴定至較低pH值，而另一個使用0.1 M NaOH滴定至較高pH值，其中較低及較高pH值涵蓋所需的pH範圍。藉由混合不同比例之該兩種溶液獲得中間pH值。NMR量測係在Bruker 400 MHz光譜儀上進行的，其中在自低至高pH範圍內的約24個pH值之每個下均獲得1H光譜。MC3之峰經校準至D2O（400 MHz，D2O，δ = 4.79 ppm作為標準），而C24之峰經校準至DSS（400 MHz，DSS，δ = 0.00 ppm作為標準）。接著使用哌嗪、咪唑、2-氯乙酸及乙酸之化學位移，根據已公開之方法5,6計算每種溶液之pH值，並且與可離子化脂質水溶性類似物頭部基團中的每個氮相鄰的質子之化學位移經擬合至亨德森-哈瑟爾巴赫方程以提供每個氮之pKa。光譜在第2補充圖中。
pKa之理論計算
使用Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)軟體將來自NMR、ζ電位及TNS檢定之實驗測定的pKa值與理論計算值進行比較。ACD/pKa資料庫使用兩種方法基於其組成片段在水性環境中藉由算法估計整個分子之pKa值。經典算法採用參數化之哈米特(Hammett)型方程資料庫，以涵蓋大多數可離子化官能基，各自之特徵為若干個涉及σ常數變化之方程。Galas算法基於反應中心及鄰近離子化中心之周圍環境來估計處於假設不帶電狀態下的所有可能離子化中心之pKa微常數，以產生自其獲得pKa宏觀常數之微常數。本研究使用經典算法計算。
mRNA脂質奈米顆粒之製備
藉由使用50/10/38.5/1.5之MC3及C24之48/13/37/2的可離子化脂質/DSPC/膽固醇/DMG-PEG2000之莫耳比百分比在乙醇中製備脂質並在水性緩衝液中製備mRNA來調配載有mRNA之LNP。該兩種溶液在Spark NanoAssmblr™ (Precision NanoSystems)中以一定體積及濃度混合，以實現mRNA骨架上可離子化脂質與磷酸酯之莫耳比為4，並噴射至pH 7.4之PBS中。MC3 LNP係使用先前描述之標準程序製備的，而C24 LNP組件針對此特定調配優化了一些參數。將所得混合物以1:1稀釋至PBS pH 7.4中，並使用Slide-A-Lyzer MINI透析裝置（MWCO，10 kDa）針對PBS進行透析，以在6小時內6次緩衝液更換後達到pH 7.3-7.4。
mRNA對Ribogreen之不可及性的檢定
將Tris(10 mM，pH=7.5)/EDTA(1 mM) (TE)及Triton/TE（TE緩衝液中的2% v/v Triton）一式兩份添加至黑色微孔板中。將LNP中之總mRNA在TE中稀釋至約4 ng/µL，並以1:1之體積比添加至各TE及TE/Triton孔中。Ribogreen檢定中包括兩條標準曲線，一條含有mRNA及TE，另一條含有mRNA及Triton/TE。每條標準曲線用於計算每個相應緩衝液中mRNA對ribogreen之可及性。與Triton/TE中之單一標準曲線相比，使用兩條標準曲線之此方法為必需的，其可能將不可及性高估了5-10%，因為Ribogreen在Triton/TE中比在TE中具有更高的背景螢光。將微孔板在37℃下培育10分鐘，以使用Triton提取LNP。將DMSO中之Ribogreen試劑在TE緩衝液中按1:100稀釋，並以1:1之體積比添加至各孔中。立即將微孔板引入Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)中以讀取螢光(Ex485/Em528)。
TNS檢定
使用TNS檢定測定LNP pKa。將TNS製備成於DMSO中之300 μM儲備溶液。將LNP在總體積約103 µL之緩衝溶液中稀釋至24 μM可離子化脂質，TNS至6.3 µM，該緩衝溶液含有20 mM硼酸、10 mM咪唑、10 mM醋酸鈉、10 mM甘胺醯甘胺酸、25 mM NaCl，其中pH範圍為3至10。使用Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek)來讀取螢光(Ex321/Em445)。在添加TNS後量測各孔之pH值。Mathematica (Wolfram Research)用於將螢光數據擬合至亨德森-哈瑟爾巴赫方程 RFU=RFU_max-((RFU_max-RFU_min ))⁄((1+10^(pKa-pH) ) )，以提供 pKa。
使用動態光散射及電泳移動率測定之mRNA LNP尺寸、ζ電位(ZP)、ZP pKa及pI、mRNA拷貝數。
將LNP在PBS pH=7.4中稀釋至6.25 ng/ul並轉移至石英光析管(ZEN2112)中，以藉由動態光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中使用1.45之顆粒RI及0.001之吸光度在25℃下在PBS中量測尺寸，其中黏度為0.888 cP且RI為1.335。使用173°反向散射偵測角進行量測，先前在25℃下平衡30秒，一式兩份，各運行5輪次，且持續時間為10秒，量測之間沒有延遲。每次量測在石英光析管中均有4.65之固定位置，並帶有自動衰減選擇。使用具有正常解析度之General-Purpose模型分析數據。直徑係報告為與ζ平均值相比，更接近於電子顯微鏡中所見之物理尺寸的數均值。之前描述的分子體積模型係用於估計LNP中之mRNA拷貝數，使用數均直徑來計算LNP體積。將LNP稀釋至上述TNS緩衝液中，pH範圍為3-10，以用於在Zetasizer Nano ZP (Malvern Panalytical)中藉由電泳光散射(ELS)，使用與上述相同之材料及分散劑參數以及斯莫魯霍夫斯基(Smoluchowski)模型進行ζ電位量測。每次量測均將電壓手動設置為80伏，以避免在自動設置電壓時發生歐姆加熱。在具有光子計數自動衰減選擇之一次性折疊毛細光析管中一式三份進行量測，各運行20輪次，且每個複製之間有30秒延遲。Mathematica用於將ζ電位數據擬合至擴展的亨德森-哈瑟爾巴赫方程之數據 Ψ=Ψ_max-((Ψ_max-Ψ_min ))⁄((1+10^(((pKa-pH))⁄n) ) ) 以分別提供pKa、n及低pH值和高pH值ζ電位限值Ψ_max和Ψ_min。此處使用擴展模型，因為LNP pKa以類似於聚電解質之方式呈離子化狀態依賴性的。TNS數據不需要擴展模型，因為TNS染料結合僅偵測LNP表面電荷。等電pI為藉由將ζ電位內插為零而得出的pH值。
冷凍電子顯微鏡
使用Vitrobot Mark IV系統快速冷凍電子顯微鏡網格。將腔室設置為25℃及100%之濕度。將LNP (3 µL)施加於網格（蕾絲碳支撐體上的超薄碳膜，Ted Pella #01824G）上，培育1分鐘，接著在浸入液體乙烷之前以25之墨點力轉漬兩次，每次3秒。在Talos Arctica系統（Thermo Fisher Scientific）上使用Falcon 3EC偵測器在200 kV下對網格成像，使用EPU進行數據收集。標稱放大倍數為45,000倍，校準像素尺寸為0.223 nm。使用5秒曝光以積分模式收集圖像，總劑量為60 e/Å2，並使用Motioncor252對66個部分進行運動校正。
肌內投與含有FLuc mRNA之C24及MC3 LNP後螢光素酶表現之活體內活的動物成像。
研究人員遵循國家研究委員會生命科學實驗室動物資源委員會之護理委員會的「實驗室動物護理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」。小鼠研究係根據賓夕法尼亞大學(UPenn)機構動物護理和使用委員會(IACUC)批準之協議進行的。所有動物均根據當地、州和聯邦政策在國際實驗室動物護理評估和認證協會(AAALAC)認可的設施中飼養及照護。8週齡雌性Balb/c小鼠係購自Charles Rivers並在實驗之前在賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)適應7天。使用3/10 cm3 29G胰島素注射器（BD Biosciences）向小鼠注射5 µg或0.5 µg FLuc mRNA-LNP。將mRNA-LNP在PBS中稀釋並注射至腓腸肌(50 µL注射體積)中。注射後4小時，將小鼠用氧氣中之2%異氟烷麻醉，並在腹腔內注射250 µL D-螢光素(15 mg/ml)後10分鐘成像。使用IVIS Spectrum成像系統（Caliper Life Sciences）進行生物發光成像。在24小時，重複成像並對動物實施安樂死。在壽命實驗中每天對動物成像持續5天。在投藥後24小時亦將腿部固定，並將注射部位固定在中性緩衝福爾馬林中，在石蠟中處理，並用蘇木精和伊紅染色。
含有核苷修飾之S2P SARS-CoV-2免疫原的C24及MC3 LNP在Balb/c小鼠中之免疫原性。
向Balb/c小鼠（Charles Rivers）投與含有0.1、0.25、0.5、1.0 µg核苷修飾之mRNA編碼的S2P免疫原的C24及MC3 LNP（N=5只動物/劑量/LNP），以50 µl注射至腓腸肌內側中。兩次注射間隔3週，並在第一次注射前一天(放血前)、第二次注射前(除接觸)及第二次注射後2週(加強)經由眶後途徑收集血液。在室溫下培育30分鐘後將血清自血液中分離，並將樣品在非冷藏之Eppendorf 54離心機（Eppendorf, Enfield, CT, USA）中以10,000 g離心5分鐘。將經分離之血清在使用前儲存在-20℃下。使用終點酶聯免疫吸附檢定(ELISA)測定總抗體效價。簡言之，將High Bind Stripwell™ Corning 96孔透明聚苯乙烯微孔板用1 μg/ml經純化之SARS-CoV-2 RBD（目錄號Z03501）包被隔夜，用洗滌緩衝液（PBS中之0.05% Tween-20）洗滌一次，隨後在室溫下使用PBS中之2% w/v BSA阻斷兩小時。接著將板洗滌3次，並將小鼠血清按1:27,000（初接觸血清）及1:54,000（加強血清）加入阻斷溶液中，並在室溫下培育2小時，洗滌3次之後用（HRP)-結合之抗小鼠二抗在阻斷緩衝液(1:10 000)中培育1.5小時。培育後，將板洗滌3次，之後每孔添加100 µl KPL TMB受質，持續8分鐘。使用2N硫酸終止反應，並使用SpectraMax™ 190酶標儀在450 nm下量測吸光度。為了確定中和潛力，將VSVΔG-RFP假型病毒（50-200個病灶形成單位/孔）與2倍連續稀釋之血清樣品一起培育，並在37℃下培育1小時，之後將病毒-抗體混合物添加至VeroE6 TMPRSS2細胞中。感染後20小時，將細胞用4%多聚甲醛洗滌並固定，之後在S6 FluoroSpot分析儀（CTL，Shaker Heights OH）上觀察。對單個感染病灶進行枚舉，並將數值與沒有抗體之對照孔進行比較。病灶減少中和效價50% (FRNT50)經量測為最大血清稀釋度，在該稀釋度下病灶計數相對於不存在小鼠血清之情況下感染假型病毒的對照細胞減少了至少50%。各樣品之FRNT50效價在不同之日進行兩次技術重複量測。
藉由使用含有核苷修飾之S2P SARS-CoV-2免疫原的C24及MC3 LNP進行免疫接種，保護K18-hACE2小鼠免受SARS-CoV-2之致死挑戰
向購自Jackson Laboratory K18-hACE2小鼠之雌性B6;SJL-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J (hACE2)小鼠投與含有0.1、0.25、0.5、1.0 µg核苷修飾之mRNA編碼的S2P免疫原的C24及MC3 LNP（N =5只動物/劑量/LNP），以50μl注射至腓腸肌內側中。小鼠接受mRNA LNP之初接觸注射及加強注射，且兩次注射間隔6週。在第一次注射之前(放血前)、第二次注射之前(初接觸)及第二次注射後2週(加強)，經由下頜放血收集血液。中和抗體係藉由斑塊減少中和效價檢定(PRNT)(如下所述)來評估。SARS-CoV-2繁殖係在接種Vero細胞之細胞培養瓶中以60-75%之匯合度進行的。該等細胞感染了SARS-CoV-2意大利分離株-INMI1（來自BEI Resources）。感染進行48-72小時，之後回收上清液，並藉由斑塊檢定評估病毒效價。在用SARS-CoV-2進行第二次免疫後2週，藉由鼻內投與以5X105 pfu之劑量對小鼠進行挑戰，並跟蹤直至滿足死亡或安樂死標準。每天記錄體重及溫度。在挑戰後第5天處死每組5只小鼠中的兩隻以藉由斑塊檢定評估肺病毒效價。將肺組織均質化並離心。回收上清液以藉由斑塊檢定評估病毒負荷量。每天監測其餘三隻小鼠之發病及死亡跡象。每天亦記錄存活小鼠之體重及溫度讀數，直至研究結束。
對於PRNT50檢定，將小鼠血清在DMEM（補充有5% FBE、1% L-麩胺酸及20 U/mL青黴素及20 μg/mL鏈黴素）中按1:10稀釋。隨後自1:10稀釋液中製備連續的兩倍稀釋液，並與100 pfu之SARS-CoV-2病毒混合，並在37℃下培育1小時。接著將血清/病毒混合物以12孔板形式覆蓋在匯合的Vero細胞層上，並在37℃及5% CO2之培育箱中培育1小時。接著用伊戈氏(Eagle』s)最低必需培養基（不含酚紅，補充有5% FBE、非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉(VWR, 45000-710, Dixon, CA, USA)、2 mM L-麩胺醯胺、20 U/mL青黴素及20 μg/mL鏈黴素）與0.6%瓊脂糖（ThermoFisher，16500100）之1:1混合物覆蓋接種孔，並在37℃及5% CO2下培育48小時。接著將細胞用10%甲醛(FisherSci, F79p-4)固定1小時。移除培養基，將細胞用diH2O洗滌並用1%結晶紫(FisherSci, C581-25)及20%乙醇溶液(FisherSci, BP2818-4)染色。對斑塊進行計數並繪製成pfu/稀釋度。
對於斑塊測定，將Vero細胞（WT Veros，ATCC）以每孔2X105個細胞之密度鋪於12孔板中並培育隔夜。將來自組織勻漿之上清液連續稀釋至10-6，並覆蓋在細胞上1小時（37℃，5% CO2O）。隨後用伊戈氏最低必需培養基（不含酚紅，補充有5% FBE、非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉(VWR, 45000-710, Dixon, CA, USA)、2 mM L-麩胺醯胺、20 U/mL青黴素及20 μg/mL鏈黴素）以及0.6%瓊脂糖（ThermoFisher，16500100）覆蓋細胞並培育48小時。接著將細胞用10%甲醛(FisherSci, F79p-4)固定1小時。移除培養基，將細胞用diH2O洗滌並用1%結晶紫(FisherSci, C581-25)及20%乙醇溶液(FisherSci, BP2818-4)染色。手動計數斑塊，並且資料集表示每毫升之斑塊形成單位(PFU/mL)。
mRNA LNP之儲存/穩定性研究
將含有FLuc mRNA之C24及MC3 LNP在4℃或室溫（RT≈22℃）下儲存在PBS中。將它們在儲存之第0、2、4、7、14天藉由如上所述之DLS測定尺寸、如上所述之mRNA封裝以及經由轉染至HEK293細胞中並評估螢光素酶表現來測定生物活性。對於生物活性，在轉染前一天，將HEK293細胞以每孔12x10 3個細胞之密度接種於100 µL EMEM培養基（10% FBS）中的白色96孔板中，並在37℃ 5% CO2下培育。將載有FLuc mRNA之LNP稀釋，使得8 µL含有25 ng mRNA FLuc，並在接種之後24小時使用一式三份在此劑量下轉染HEK293細胞。進一步轉染24小時後，將100 µL One-Glo受質直接添加至孔中，以便根據Cytation 5光度計讀板儀中的發光偵測螢光素酶表現。將含有FLuc mRNA之額外C24及MC3 LNP在PBS中於4℃、RT及37℃下儲存19天。使用氯仿/甲醇自LNP中提取FLuc mRNA，並按照製造商說明書，在2100 Bioanalyser (Agilent)上藉由微流體電泳分析mRNA之完整性。藉由Nanodrop量化mRNA濃度，隨後稀釋至1 ng/ul以在Bioanalyser中加載各樣品之1 ng mRNA。藉由對主要mRNA FLuc峰之曲線下面積(AUC)積分並歸一化至C24及MC3 LNP合在一起之第0天平均值來計算mRNA之完整性百分比%。
統計及再現性
將在JMP Pro 15.1.0軟體中之線性最小平方多變量模型用於執行第84圖與第86圖中的組之間的比較。對於活體內IVIS成像資料，4及20/24小時之時間點被視為重複量測。將Log10轉換應用於FRNT50及病毒效價。使用線性迴歸模型依照LNP比較OD與轉換的FRNT50及病毒效價，對劑量進行調整，如第87a-87c、88d及8h圖中。將使用LNP作為預測因子的未調整線性迴歸用於比較第87d圖中之假病毒中和。使用Fishers Exact Test，依照LNP比較SARS-CoV-2致死挑戰後死亡的小鼠比例，不包括PBS（第88a圖）。以劑量、稀釋度及LNP作為固定效應且對小鼠隨機截距之線性混合效應模型評估了LNP對所偵測病毒之百分比的影響（第88b、c、f、g圖）。線性迴歸及混合效應模型在R版本3.6.3中運行。
實例 31 – 第 84 圖
多質子C24可離子化脂質在LNP中產生多級質子化，並在胞內體pH範圍內產生比MC3 LNP更大的質子化。a) 展示理論pKa的C24及MC3及其水溶性類似物之結構。C24可離子化脂質(MW 876.49)有兩個可快速降解之酯鍵，各鍵皆連接至不對稱支鏈C8-C10（雙2-辛基十二烷基）烷基尾部。C24之頭部基團為三價的，使用ACDLabs Percepta Classic算法計算的理論pKa為7.8、4.1及7.7。MC3 (MW 642.11) 有一個可緩慢降解之酯(該酯連接至二亞麻油酸尾部)及單價頭部基團，理論pKa為9.4。b) 使用插圖中的水溶性類似物，使用與每個氮相鄰之質子的1H NMR化學位移之pH依賴性量測C24可離子化脂質中每個氮之pKa。化學位移相對於pH值之曲線與亨德森-哈瑟爾巴赫方程之擬合提供了每個氮之pKa，並且與84(a)中所示之ACDLabs Percepta Classic算法預測的pKa相差0.4個單位以內。末端氮（紅色）滴定之拉伸外觀表明其質子化形式與最靠近連接子（藍色）之氮相互作用，同時質子化可能會協調這兩個氮原子。c) 使用二甲胺質子之1 H NMR化學位移的pH依賴性並擬合至亨德森-哈瑟爾巴赫方程，量測MC3之二甲胺氮之pKa。所量測之pKa為9.5，與(a)中顯示的由ACDLabs Percepta Classic算法所預測之值9.4一致。d) 使用TNS染料結合檢定量測C24及MC3之LNP pKa。TNS pKa量度表面電荷並且不能反映低於pH≈6之質子化。在針對C24及MC3之檢定中使用等量之可離子化脂質，由此對於低於7之pH值，C24之較高RFU表明在胞內體pH範圍內C24 LNP之表面質子化水準較高，其中t檢驗比較在pH 6及6.5下C24與MC3之RFU ，顯示出顯著差異p＜0.05 (*)（N=3之平均值+/-SD）。e) 使用電泳移動率量測LNP淨電荷及離子化，以提供在pH範圍3-10內的ζ電位。電泳移動率視LNP之淨電荷而定，並且可在整個pH範圍內偵測質子化，包括當胞內體與溶酶體融合時，胞內體pH值低至4.5。對於單質子MC3可離子化脂質，ζ電位擬合最初為聚電解質開發的擴展的亨德森-哈瑟爾巴赫方程（實線），因為它捕獲多價LNP之pKa的離子化狀態依賴性，其中LNP內含有數千個緊密靠近的強相互作用之MC3分子。對於C24，ζ電位不能準確地擬合擴展的亨德森-哈瑟爾巴赫模型（虛線與紅色實線），因為每個C24含有3個具有不同pKa之氮，如b所示。兩個外圍氮將在較高pH值下質子化，而內部之中心氮在pH值低於4.5時產生急劇增加之ζ電位。C24 LNP在中性pH值下產生更負的ζ電位，其隨著在胞內體pH範圍內pH值之下降而迅速上升，表明C24之胞內體質子化比MC3更大，並且在pH 7.4下比較C24與MC3之ZP (mV)的t檢驗顯示顯著差異p＜0.001 (*)（N=3之平均值+/-SD）。f) 由ACD Percepta Classic算法所預測之pKa與藉由NMR對水溶性類似物所量測的以及TNS pKa、ζ電位(ZP)pKa、ZP等電pI相比較，TNS RFU在自pH 7.4至6下增加且ζ電位在自pH 7.4至4.5下之增加。NMR pKa與理論預測之pKa一致，並且明顯高於由TNS及ζ電位所量測之LNP pKa。最近解釋了分子與膠態pKa之間的此種差異，主要是由於LNP之脂質相與水性介質之間的質子分配。C24之TNS RFU在自pH 7.4至6下之增加及ζ電位在自pH 7.4至4.5下之增加幾乎為MC3之兩倍，表明C24之表面LNP質子化(TNS)及LNP淨電荷(ZP)在胞內體pH範圍內比MC3增加更多。
實例 32 – 第 85 圖
C24 及 MC3 脂質奈米顆粒之結構特性。a) DLS數均尺寸顯示C24 LNP比MC3 LNP稍大且多分散性指數較低。b) ribogreen檢定顯示，與MC3相比，C24之ribogreen不可及的mRNA之水準略低。使用2條標準曲線，在有及沒有Triton下進行此檢定。當僅使用一條帶有triton之標準曲線時（諸如，在迄今為止的大多數出版物中），ribogreen不可及之mRNA增加了約8%，如黃色陰影部分所示。此檢定通常被解釋為封裝效率%與在此顯示的ribogreen不可及之mRNA%。後者更準確，因為已顯示mRNA之染料可及性並不表明mRNA為游離的且未經封裝的。然而，它可能反映了LNP之不同包裝及內部結構。c) 使用先前公佈之分子體積模型及每個LNP之數字加權平均直徑計算mRNA拷貝數。估計C24可離子化脂質之分子體積與其在1.76 nm3下之MW成正比，對於MC3則在1.29 nm3下。d) MC3及C24 (E)之CryoTEM揭示尺寸與DLS數均尺寸一致。如前所述，兩個LNP皆有外圍雙層，與此區間中之DSPC定位一致。
實例 33 – 第 86 圖
在 Balb/c 小鼠中肌內 (IM) 投藥後的螢光素酶表現顯示與 MC3 相比， C24 LNP 有顯著更高的中靶及更低的脫靶 mRNA 表現。a) IM投與LNP中5μg劑量之FLuc後4小時及24小時的活體內成像顯示，與MC3相比，使用C24遞送的Fluc之肌內表現（綠色ROI）更高，並且亦揭示MC3之顯著全身分佈，導致肝臟中之脫靶表現(紅色ROI)。b) 在此5 μg高劑量下，C24之肌內表現明顯高於MC3，其中p=0.0074，在光子通量之多變量分析中LNP之作用作為LNP (MC3/C24)及時間(4hr/24h)之函數。c) IM投藥後肝臟中之脫靶Fluc表現對於C24比MC3低6倍，其中在比較LNP之t檢驗中p=0.051。d)當投與低劑量(0.5µg)的更具代表性之疫苗接種時，C24與MC3相比，4小時肌肉中之FLuc高約4倍，其中p=0.0034（在e中），在Flux之多變量分析中LNP之作用作為LNP (MC3/C24)及時間(4hr/24h)之函數。f) 在5天內跟蹤IM投與5 µg劑量的螢光素酶表現之持續時間，顯示在前2天快速下降，繼之表現緩慢下降。
實例 34 – 第 87 圖
在 Balb/c 小鼠之免疫原性研究中， C24 LNP 產生之結合及假中和抗體效價比 MC3 LNP 高 10 倍。向Balb/c小鼠以範圍在0.1至1 μg內之4個劑量投與含有編碼SARS-CoV-2的雙脯胺酸穩定之膜結合刺突蛋白(S2P)的核苷修飾之mRNA的C24及MC3 LNP。a) 在27,000之過渡稀釋度下之ELISA光密度，用於S2P結合抗體檢定，對於低劑量0.1 µg及0.25 µg mRNA編碼之S2P免疫原，在加強後2週收集血清。包括LNP及劑量作為預測因子之線性迴歸模型分析顯示，C24結合抗體OD顯著高於MC3 (p=0.0005)。平均值+/- SEM。b) 在54,000之過渡稀釋度下ELISA光密度，用於 S2P結合抗體檢定，對於更高劑量的0.5 µg及1.0 µg mRNA編碼之S2P免疫原，在加強後2週收集血清。包括LNP及劑量作為預測因子之線性迴歸模型分析顯示，C24結合抗體OD顯著高於MC3 (p=0.01)。平均值+/- SEM。c) 在單次注射1 μg初接觸劑量後3週，C24 LNP產生可偵測的針對VSV∆G-RFP SARS-CoV-2假病毒之FRNT50效價，而MC3 LNP則沒有（左側初接觸圖）。加強後兩週（右側加強圖），0.25至1 μg劑量之C24 LNP揭示FRNT50效價比相同劑量之MC3 LNP高約10倍。對數轉換之FRNT50效價的線性迴歸模型分析（包括劑量及LNP作為預測因子）顯示，C24 FRNT50效價對於初接觸（p=0.00002）及加強（p=0.011）顯著高於MC3。平均值+/- SEM。d) 代表變異體D614G及ZA之假病毒變異體中和表明C24之FRNT50效價高於MC3 LNP，儘管統計分析沒有發現顯著差異。平均值+/- SEM。
實例 35 – 第 88 圖
C24 LNP 在低劑量之 S2P 免疫原下對致命的 SARS-CoV-2 挑戰具有保護作用，並且完全消除肺部感染。在K18-hACE2小鼠（N=3只/組，自第0天N=5只起，因為在第5天每組取2只動物以評估肺病毒效價）中，含有0.25 μg mRNA編碼之S2P免疫原的C24 LNP具有完全保護性(a)以抵禦SARS-CoV-2之致命挑戰，而MC3 LNP在0.5 μg之更高劑量下具有保護性(e)。C24組中3只動物中有一隻在0.1 μg之極低劑量下亦存活下來。統計分析未顯示出每劑量少量動物(n=3只)之顯著差異。藉由PRNT（N=5只/組）在斑塊檢定中對SARS-CoV-2之中和表明C24 LNP在0.25 μg劑量(b)下具有中和活性，而MC3在初接觸後僅在1 μg劑量(f)下具有中和活性。包括LNP、劑量及稀釋度作為預測因子的線性混合效應模型分析顯示，C24比MC3顯著更多地降低所偵測之病毒%（b對f，p=0.021）。針對所測試之稀釋度，在加強後C24在0.25 µg劑量下具有100%中和活性(c)，而MC3僅在1 µg下有(g)。包括LNP、劑量及稀釋度作為預測因子之線性混合效應模型分析顯示，C24比MC3顯著更多地降低所檢測之病毒%（c對g)，p＜0.00001）。在斑塊檢定(N=2)中對感染後第5天肺病毒效價之評估發現，C24 LNP在0.5 μg劑量下完全消除了肺部感染(d)，而MC3 LNP即使在所測試之1 µg最高劑量下亦不能完全消除肺部感染(h)。包括LNP及劑量作為預測因子的對數轉換病毒效價之線性迴歸模型分析顯示，C24比MC3顯著更多地降低肺病毒效價(p=0.00008)。為清楚起見，僅在b、c、f、g中顯示一個劑量之SEM。挑戰後之體重及溫度記錄在第3補充圖中。平均值+/- SEM。
實例 36– 第 89 圖
C24 之局部注射部位炎症低於 MC3 mRNA LNP 。注射後24小時，C24 LNP (a-c)在注射部位引起之炎症比MC3 LNP (d-i)要輕，這與肉眼觀察到的C24之腫脹水準低於MC3一致，藉由目視及手動觸診來評估。注射至內側腓腸肌(MG)中的含有5 µg mRNA及約65 µg總脂質之50 µl在a、d及g中主要見於內側腓腸肌與外側腓腸肌(LG)之間的注射部位(IS)處。脂質很難與局部脂肪組織區分開。MC3在整個腿部引發強烈的發炎反應，導致肉眼可見的腫脹及組織學上觀察到的滑膜組織炎症（e、f），而在注射C24之腿（b、c）中則不存在。注射部位之發炎反應涉及嗜中性白血球及血管之浸潤(h)，並在注射部位產生混合細胞型淋巴樣結構(i)，這在非注射對照中未觀察到。對於MC3及C24中之各者，此等反應代表一組3只動物。染色為蘇木精和伊紅。
實例 37– 第 90 圖
C24 及 MC3 LNP 之生物活性及 mRNA 完整性在 4 ℃ 下穩定，但在 2週 內在較高溫度下下降。a)在第0、2、4、7及14天藉由螢光素酶表現量測HEK 293細胞中之生物活性，每孔25 ng，含有12,000個細胞。在4℃下儲存在PBS中的C24及MC3 LNP之生物活性為穩定的，但在室溫(RT)下儲存2週後，其生物活性下降了約20-40%。b) DLS未偵測到LNP尺寸之變化，Ribogreen不可及之mRNA%亦沒有變化(c)。d) 使用Li及Breaker 1999之方程「e」中的模型對mRNA完整性（未切割%）進行理論計算表明，游離FLuc mRNA在pH 7.4下的半衰期為 4℃下2,300天、RT下125天及37℃下11天。e) 在第0天產生之後以及在PBS中在4℃、RT及37℃下儲存19天後，使用氯仿/甲醇自LNP中提取mRNA，並藉由微流體電泳進行分析。在4℃下19天後（與第0天相比）未發現可偵測之降解，而在較高溫度（RT及37℃）下儲存會產生越來越多的mRNA切割，這與(d)中之模型所預測的較高溫度下之更高降解在性質上係一致的。在(e)中顯示針對每種條件量測的3個LNP之降解最少之實例。低於20s之峰為標準的，而高於主要mRNA Fluc峰之40s附近的峰為非模板延伸之產物，使用用於純化mRNA45之纖維素方法無法消除。藉由對應於FLuc mRNA峰之曲線下面積(AUC)估計mRNA完整性，並歸一化為C24及MC3 LNP合在一起之第0天平均值。f) mRNA完整性在4℃下穩定至少19天，並在更高溫度下下降，但C24之下降程度小於MC3。N=3或對於一些N=2，由於一些樣品之蹤跡中的技術不規範導致無法定量。
實例 38
藉由開發使用可離子化脂質結構來預測 LNP 離子化及可離子化脂質破壞胞內體膜及釋放 mRNA 之能力的模型來制定合理的設計方法。
mRNA-LNP係使用微流體或更大規模之T型混合器藉由自組裝過程製造的，其中乙醇中之4種脂質與低pH值緩衝液中的mRNA快速混合。mRNA LNP之形成係經由質子化陽離子可離子化脂質與陰離子mRNA磷酸骨架之靜電結合發生的，繼之脂質自水相中分離以形成由親水性PEG界面穩定的奈米顆粒。許多因素在製造過程中可能會發生變化，包括脂質及mRNA之絕對和相對濃度、緩衝液類型、其濃度和pH值、有機相與水相之比率以及流速。已發現，在不改變相對濃度之情況下，共同增加脂質及mRNA之絕對濃度，通常可將所得mRNA LNP之遞送效率提高4倍（第92圖）。所有專利及科學文獻均使用接近12.5 mM之總脂質混合濃度，這對應於接近0.25 mg/ml之mRNA濃度。發現增加此等混合濃度之方法(例如，增加了6倍至75 mM總脂質及1.5 mg/ml mRNA)導致在相同劑量下活體外及活體內遞送效率提高4倍（第92圖）。藉由量測自pH 7.4至5之ζ電位增加，發現此等更有效的LNP與在標準條件下組裝之彼等相比，ζ電位增加了2倍（第92C圖）。此結果表明，提高的效力一部分係由於LNP中更高水準之未質子化的可離子化脂質，其增加了胞內體質子化。在最近的一項創新中，在無緩衝液之環境中進行mRNA LNP組裝。沒有在mRNA溶液中使用低pH值緩衝液在混合時使可離子化脂質質子化，而是在與無緩衝液之水中的mRNA混合之前藉由將HCl添加至脂質混合物中使可離子化脂質預質子化，藉由TLC-MS及1H NMR進行驗證表明沒有發生脂質降解。使用吾等具有3個氮之C24可離子化脂質，並為每個可離子化脂質添加0.25個質子，平均每4個脂質有1個氮質子化，使得質子化氮與mRNA之磷酸酯的比率為1:1（NP比率為4）。與使用緩衝液相比，吾等無緩衝液之組裝方法（均使用高脂質及mRNA混合濃度）在活體內產生更高的效力，藉由IVIS針對IM及IV投藥而言提高了3倍。因此，無緩衝液、高絕對脂質/mRNA濃度組裝方法可產生比目前使用低濃度及低pH值緩衝液的製造方法強10倍之LNP，但不會改變最終調配物之組成。與需要對流及擴散以接觸並質子化脂質(此係一個固有的快速及非均質過程)的緩衝液相比，預質子化方法更準確地靶向特定水準之可離子化脂質的質子化。此等達成高效LNP之專有製造創新有望在所有製造規模以及微流體及T型混合幾何結構中輕鬆實施。吾等之目標為對LNP效力對製造過程參數之依賴性進行預測建模，以進一步提高遞送效率，從而顯著減少劑量及毒性，並增加mRNA LNP之供應。
mRNA LNP之分佈、靶向性及表現視LNP電荷及配體結合而定
mRNA-LNP呈現出與其離子化特性相關的生物分佈及表現模式。LNP表面上之細胞靶向配體亦可增加細胞特異性攝取。在IV投藥中，已證明帶正電之LNP靶向肺，近中性之LNP靶向肝臟，而帶負電之LNP靶向脾臟。在此等研究中，LNP之電荷係藉由以下手段來控制：改變帶正電之可離子化/陽離子脂質與帶負電之mRNA的比率，或者保持此比率恆定並添加第5個陰離子或陽離子脂質來調節LNP電荷。電荷介導的靶向之一種機制為血清蛋白(諸如由肝細胞中之LDL受體識別的ApoE)之電荷依賴性結合。MC3 LNP及其他肝臟導向之LNP具有促進ApoE結合之輕微負電荷。相反，LNP上的強負電荷或正電荷將阻止ApoE結合，從而阻止肝臟靶向。在負LNP靶向脾臟之情況下，另一種機制可能起作用，因為脾臟巨噬細胞及樹突狀細胞識別磷脂醯絲胺酸以吞噬凋亡細胞及老化的紅血球。因此，用磷脂醯絲胺酸類似物或其他負脂質包被LNP可增強脾臟之遞送。生成具有5.7之低pKa值的LNP之可離子化脂質亦會使LNP呈負性，並顯示出靶向脾臟並在脾臟B淋巴細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球中表現mRNA。尺寸亦被認為在脾臟靶向中具有作用，其中較大的尺寸可分佈至脾臟，這大概係由於脾血竇中之大尺寸孔(200-500 nm)將動脈血輸送至實質細胞。
器官內的細胞特異性靶向亦可藉由調整LNP電荷來實現。pKa接近6.4之MC3及Acuitas LNP呈現出ApoE介導之靶向，導致主要在肝細胞中表現，其中在肝竇內皮細胞(LSEC)、造血細胞及庫弗細胞(Kupffer cell)中亦有少量表現。然而，藉由添加具有更高pKa之第二可離子化脂質以生成LNP，可將細胞靶向自肝細胞轉移至LSEC，其中對於LSEC靶向，pKa為7.15，而對於肝細胞靶向，pKa則為6.4。當肌內注射mRNA-LNP用於疫苗時，許多細胞類型表現mRNA，包括單核細胞及樹突狀細胞、肌細胞及脂肪細胞。吾等小組係首個展示IM投藥中之LNP電荷影響生物分佈者，其中MC3 LNP分佈至脈管系統並在肝臟中表現，而具有較高pKa之負性較小的LNP則保留在注射部位及引流淋巴結中。亦已藉由將配體與LNP結合實現細胞特異性靶向之目標。例如，針對血管細胞黏附分子PECAM-121之抗體靶向肺內皮細胞，而針對CD4受體之抗體靶向脾CD4+ T淋巴細胞。短肽亦已用於LNP靶向，例如，流感衍生之GALA肽靶向肺內皮，且神經細胞黏附分子(NCAM)之14胺基酸肽允許靶向骨骼肌。此提案之第三目標為基於設計及製造具有特定離子化/電荷特性以及特定密度及LNP表面上之配體親和力/親合力的LNP來開發預測器官及細胞特異性靶向之模型。
預測模型旨在製造具有所需表現效率、器官及細胞靶向、低毒性/反應原性以及在疫苗情況下之適當佐劑性及免疫原性的mRNA LNP。使用在下文A中描述的當前可離子化脂質文庫，部分B旨在開發使用LNP調配及製造參數來預測LNP特徵（諸如電荷、胞內體質子化、配體密度/親和力）的模型，該等特徵已知可確定效率、靶向性、毒性及免疫原性。在部分C中，活體外研究表徵向特定細胞類型之遞送及反應原性/毒性反應。在部分D中，進行的動物研究旨在將此等LNP特徵與實驗確定之效率、靶向性、毒性及免疫原性相關聯。在部分E中，描述使用機器學習及多級功能模擬模組來關聯使用統計模型在多級收集的參數數據。然後，此等結果將提供反饋，以提出可離子化脂質設計及製造過程，以提高性能。與之前的工作相比，吾等方法之一關鍵差別係對已知確定LNP性能之特徵進行精確量測及建模，而非試圖將性能直接與化學結構、調配及製造聯繫起來。一個例外為可降解性，已知其主要視可離子化脂質之結構而定。
A) 可離子化脂質之合成。使用上述方法設計可離子化脂質文庫，以創建具有高遞送效率之mRNA LNP。考慮了可離子化脂質之可降解性、合成途徑之複雜性及成本，並且避免了立體異構混合物之形成。目前的可離子化脂質需要更少的合成步驟，並且獲得的成本比目前授權疫苗中之可離子化脂質低10倍。當前文庫擁有超過100種合成的可離子化脂質，對其進行如下所述之分析及模型開發。使用NMR光譜、FTIR、LC/MS/MS及燃燒分析對合成產物之身份及純度進行全面表徵。
B) 開發模型以自脂質結構、調配及製造過程參數預測 LNP 電荷、胞內體質子化、尺寸、膜破壞和 RNA 釋放能力、結合脂質密度及結合親和力。將在本提案中表徵及建模的mRNA-LNP活體內表現及靶向之決定因素為LNP淨電荷(NCLNP)、表面電荷(SCLNP)、胞內體質子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可離子化脂質膜破壞能力(MDIL)、可離子化脂質RNA釋放能力(RRIL)、靶向配體密度(ρL)及結合親和力(KL)（第93圖）。此等參數反之由可離子化脂質之離子化及結構特性以及調配參數（脂質類型和莫耳比）、製造過程（濃度、緩衝液、pH值、溶劑比、流速）及配體結合決定。將開發若干個模型，以根據可離子化脂質特性、調配參數及製造過程參數預測 NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL及KL。此等性能主要決定因素（NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KL）以及可離子化脂質離子化/結構參數（pKa、結構描述符）、調配參數（第5脂質結構/添加方法/莫耳分數、PEG脂質結構/添加方法/莫耳分數、結合脂質結構/添加方法/莫耳分數）及製造過程參數（脂質/mRNA濃度、緩衝液類型/濃度）則將用於關聯及預測特定器官及細胞類型中之活體內mRNA分佈及表現水準，以及預測毒性及疫苗之反應原性和免疫原性。
B1) 自可離子化脂質結構及離子化特性對 LNP 淨電荷 (NCLNP) 、表面電荷 (SCLNP) 及胞內體質子化 (EPLNP) 之預測。最初，此模型將針對固定的調配及製造過程，其中僅改變可離子化脂質，初始使用BODD PipZ家族之成員（第94圖）以及DSPC、膽固醇、PEG-DMG-2000及2,069鹼基FLuc mRNA。使用不同的碳間隔基合成BODD PipZ家族之12個成員，以提供一系列分子pKa宏觀常數。由於此等可預見的改變的宏觀常數之結果，活體外轉染顯示出劑量反應中之全身模式。BODD PipZ家族成員之分子離子化常數的系統變化預計會在約2個單位範圍內改變所得的LNP pKa及 pI，這將顯著影響活體內效率及靶向。將所計算之可離子化脂質分子離子化常數以及NMR量測之分子離子化常數4及結構描述符（極性原子之#及類型，頭部基團之2D拓撲描述符）與所量測之pH依賴性LNP淨電荷（ζ電位之NCLNP）及表面電荷（TNS之SCLNP及其他表面指示因子）相關聯並推導出EPLNP=NCLNP(pH5)-NCLNP (pH 7.4)。吾等量測pH依賴性之方法(NCLNP、SCLNP、EPLNP)已公佈。該模型之一般形式為：
(NCLNP、SCLNP、EPLNP) = f(可離子化脂質離子化/結構參數、pH值)
其中pH依賴性將遵循亨德森-哈瑟爾巴赫(HH)及其擴展版本，並且離子化參數將包含脂質/水質子溶劑和能量差異及離子化狀態依賴性。此模型將基於可離子化脂質分子離子化及結構來預測及設計已知會影響表現效率及靶向的LNP電荷及質子化特性。
B2) 熱穩定性表徵及建模。吾等近期的mRNA LNP穩定性研究證實了歐洲藥品管理局(European Medicines Agency)對Pfizer 和Moderna疫苗的公開評估文件中之發現，將mRNA完整性之喪失描述為儲存過程中不穩定性的主要機制。儲存了MC3及吾等第一代C24 mRNA LNP，且發現它們在4℃下穩定超過3週。在較高溫度下之加速降解顯示，與MC3 LNP中之完整性完全喪失相比，吾等C24 LNP中mRNA完整性之喪失最小。此差異可能係由於LNP內每種脂質之pKa差異所致，其中MC3為9.4，而C24為8.1。與MC3相比，較低的C24 pKa可在C24 LNP中產生較低的pH值，並減慢鹼基介導之mRNA切割的動力學。在此部分中，將自當前的mRNA穩定性模型開始，該模型包括pH值及溫度依賴性，並將預測結果與LNP中的游離mRNA及mRNA在一系列溫度及pH值條件下的穩定性分析進行比較。將使用氯仿/甲醇提取LNP中之mRNA以進行片段分析。亦將量測脂質穩定性。一系列具有不同pKa宏觀常數之可離子化脂質將經調配成LNP，以評估此參數以及溫度及pH值對mRNA降解動力學之作用。將建立以下形式之模型：
(mRNA降解) = f(溫度、pH值、可離子化脂質離子化/結構參數)
此模型能夠預測性設計mRNA穩定性，這是製造及分銷中之關鍵特徵。
B3) 自 LNP 調配參數對 LNP 淨電荷 (NC LNP) 、表面電荷 (SC LNP) 、胞內體質子化 (EP LNP) 、尺寸 (D LNP) 、可離子化脂質膜破壞能力 (MD IL) 及 RNA 釋放能力 (RR IL) 之預測。此模型最初將針對固定的NP比率(4)及可離子化脂質，諸如C24，並將脂質組分/比率與pH依賴性NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL及RRIL相關聯。對於脂質組分，最初將使用C24、DSPC、膽固醇、PEG-DMG-2000並將根據Cheng添加帶負電或帶正電之第5脂質。已發現，藉由在與mRNA混合之前向脂質中添加負性18-1PA，在IV投與螢光素酶報告基因後，肝臟表現大幅降低，脾臟表現增加了2-3倍（第96圖）儘管此等效應被認為係由於18-1PA產生了帶負電之LNP，但迄今為止尚未對此等LNP之表面或淨電荷進行量測。建議進行此等量測來開發此模擬模組。將使用若干種負性脂質，諸如18-0PA、18-1PA、18-2PA，其中雙鍵自2減至0之操作預計會使脂質更多地移動到LNP之表面並遠離LNP內部。亦將藉由在混合後的稀釋孔中在混合的水性/有機/電解質溶劑中培育LNP，將18PA直接置於LNP表面上，從而促進18PA插入LNP表面，而非在混合之前將18PA添加至乙醇中的其他4種脂質中。將使用帶正電之脂質，諸如DOTMA及DOTAP作為第5脂質來驅動分佈至肺部。亦將使用帶正電或帶負電之PEG脂質。將改變PEG烷基尾部之長度，因為這會強烈影響脫落及細胞攝取，如同PEG鏈本身之長度一樣。最終，類似物亦將取代PEG-DMG-2000，以便更有效地轉染T細胞。NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL將如上所述進行量測並且經由以下一般形式與第5脂質及PEG脂質結構/添加方法/莫耳分數相關：
(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL) = f
(第5脂質結構/添加方法/莫耳分數、PEG脂質結構/添加方法/莫耳分數、pH值)
此模型將藉由使電荷、尺寸、膜去穩定及RNA釋放參數與LNP中之第5脂質和PEG脂質之類型及其比例及添加方法相關聯，實現預測性LNP靶向及表現。在第二階段，將設計可離子化脂質來改變LNP電荷。
B4) 自 LNP 製造過程參數對 LNP 淨電荷 (NCLNP) 、表面電荷 (SCLNP) 、胞內體質子化 (EPLNP) 、尺寸 (DLNP) 、可離子化脂質膜破壞能力 (MDIL) 及 RNA 釋放能力 (RRIL) 之預測。此模型將基於使用有限數量(~5)之固定調配物及可離子化脂質之實驗，自標準莫耳比的C24/DSPC/膽固醇/PEG-DMG-2000及NP比率4開始，使用2,069核苷酸之FLuc mRNA。已發現兩種新穎的LNP組裝方法，其可提高mRNA LNP之效力。如上文引言中所述，兩種方法皆需要在混合前提高脂質及mRNA之濃度。更近來發現的第二種方法自mRNA溶液中移除緩衝液，並藉由控制向乙醇中之可離子化脂質中添加HCl直接質子化可離子化脂質，並且如上所示，已經可將效力提高近10倍。量測含有緩衝液之方法的ζ電位，並發現更負性之高pH值平台，且因此在代表胞內體質子化之pH值下降 (7 -＞ 5) 期間，ζ電位之增加更大。該種含有緩衝液之方法使DLNP增加了約20 nm，而具有更高效力之無緩衝液方法則不會改變DLNP。沒有關於此等過程變化之MDIL及RRIL的數據，並且僅有有限的來自CryoTEM之超微結構資訊。在此，建議使用C24 LNP並在沒有緩衝液之情況下使用一系列脂質/mRNA濃度、緩衝液濃度及可離子化脂質之質子化水準對其進行組裝來完成對此等新穎LNP組裝及製造過程之表徵。將量測NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL，並由使用SAXS（小角X射線散射）及SANS（小角中子散射）之CryoTEM成像及散射方法獲取超微結構資訊。已建立此等超微結構方法，包括使用氘代脂質之對比度變化SANS，以獲得有關脂質組分分佈之特定資訊，並將自此等超微結構數據來定義參數/描述符以與組裝過程參數相關。一旦針對此等不同組裝條件對C24 LNP進行表徵，將進一步表徵感興趣之LNP。對於特定的LNP，將獲得以下一般形式之模型：
(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、超微結構參數) = f(脂質/mRNA濃度、緩衝液類型/濃度、無緩衝液之質子化水準、pH值)
此模型將能夠根據組裝及製造條件預測電荷、尺寸、膜去穩定、RNA釋放及超微結構參數，該等條件會改變脂質/mRNA/緩衝液濃度以及無緩衝液環境中可離子化脂質之質子化水準。
B5) mRNA LNP 之連續體及分子動力學模型。此模組之目的係深入瞭解產生與LNP效力相關之mRNA LNP結構及特性的混合及組裝過程。將使用連續流體力學結合擴散和化學反應方程對微流體及T型混合幾何形狀進行建模。乙醇與水性牛頓流體之混合方式視混合之幾何形狀以及兩種溶劑之流速和比率而定。混合溶劑乙醇/水之黏度由於非理想性而比單獨的溶劑高約3倍，並將考慮在內。mRNA、脂質組分及緩衝液將被視為具有自文獻中提取的具有濃度依賴性之擴散常數的連續溶質。可根據pH值而帶電的溶質（緩衝液、可離子化脂質）及永久帶電之mRNA將遵循局部淨電中性以及具有適當pKa值的緩衝液及可離子化脂質之HH方程。初始模擬將確定兩種流體之流動及混合模式，並且慮及擴散及電中性以及HH方程，將計算mRNA、4種脂質之空間濃度、可離子化脂質質子化及pH值。預計混合過程中的LNP組裝會因脂質和mRNA濃度閾值及可離子化脂質質子化以及局部含水量增加而成核，導致脂質不溶性，亦即當所有4個特徵均出現在同一位置時。將對已知會影響最終LNP效力的脂質、mRNA及緩衝液濃度之不同值進行模擬。將在高效及低效組裝條件下對脂質、mRNA之空間濃度、可離子化脂質質子化、局部含水量及pH值進行比較。對於低濃度混合，在微流體通道中觀察到空脂質體與含有RNA之結構的混合群體，而在高濃度下，此等結構出現融合（第97C圖）。假設此等特徵可藉由混合過程中脂質、mRNA之空間重疊程度、質子化可離子化脂質及局部含水量來解釋。將移除緩衝液並使用預定的可離子化脂質質子化運行模擬，以模擬第二種高效組裝方法。將在產生一系列mRNA LNP效力之條件下檢查微流體及T形接頭混合幾何形狀。將計算的重要參數為：
FNML，亦即mRNA-LNP成核事件之頻率，其特徵在於高脂質與mRNA濃度之重疊以及高於臨界閾值的可離子化脂質質子化及水含量（初始分 別＞25%和＞50%）。
PNIL，亦即與FNML事件相關之成核時的質子化水準（範圍為25-100%）。
FNL，亦即空LNP成核事件之頻率，其特徵為不存在高mRNA濃度或可離子化脂質質子化保持在低於臨界閾值(＜25%)。
咸信高FNML會產生更有效的 LNP，而高FNL會產生效力較低的LNP。亦假設PNIL需要高於質子化可離子化脂質與mRNA離子複合之臨界閾值（亦即25%），但低於上限閾值（亦即75%），使得未質子化的可離子化脂質在該複合物內以如吾等ζ電位量測所示在胞內體中質子化。在此需要注意的是，即使LNP藉由透析或TFF被中和至pH 7.4，與未結合的質子化可離子化脂質相比，結合至陰離子mRNA磷酸酯骨架上的質子化可離子化脂質之pKa可由於靜電作用而向上移動多達2個點。這將強烈有利於在結合時保持質子化，從而使LNP內存在額外的未質子化未結合的可離子化脂質成為胞內體釋放之必要條件。將為層流微流體及湍流T型混合幾何形狀以及不同流速及溶劑比率推導出以下形式之一般關係：
(FNML、PNIL FNL) = f (mRNA/脂質濃度、緩衝液濃度、無緩衝液之預質子化水準)
作為本模組之第二補充態樣，將使用分子動力學模擬來為局部分子可離子化脂質/mRNA結合及在一定條件下之LNP組裝建模，該等條件已知會在高濃度與低濃度脂質/mRNA以及不同水準之可離子化脂質質子化及由上述連續模擬產生的緩衝液濃度下影響LNP效力。在此，咸信在高水準之可離子化脂質質子化下的低脂質/mRNA濃度將產生均一的組裝，其中高度質子化之可離子化脂質覆蓋mRNA骨架並且過量的質子化可離子化脂質聚集在此等結構周圍。在較高濃度下，可觀察到更粗糙的結構，其中mRNA骨架之內部部分未與質子化可離子化脂質結合，而外部mRNA結構域與質子化可離子化脂質結合，並且過量的未質子化可離子化脂質圍繞此等結構。將對與雙層及細胞溶質條件相互作用的後一結構進行建模，以確定它們是否更容易在細胞內釋放。將對結合後之pKa偏移進行顯式建模，以評估此潛在關鍵特徵之大小。為了對第二種高效組裝方法進行建模，將移除緩衝液並將可離子化脂質預質子化至不同水準，以觀察在高濃度及低濃度範圍內可離子化脂質的質子化及未質子化部分之結構及分佈。
咸信1) 高濃度混合可產生更粗糙之離子聚集體，其中mRNA更容易釋放；及2) 由於存在確定的非緩衝液依賴性水準之非質子化物質能夠參與胞內體釋放，因此可離子化脂質之較低水準的預質子化更有效。此部分中之模型將提供對生產高效mRNA LNP之製造過程參數的理解。
B6) 配體靶向 LNP 之 cGMP 相容性生產及配體密度 ρ L 和結合親和力之量測。當前配體結合之LNP將細胞特異性靶向增加了至少10倍，但生產方法（直接化學結合或後插入至LNP）難以控制並致使與cGMP製造相容。肝臟等器官中之高水準非特異性表現仍然存在並且亦成問題。在此，建議開發一種cGMP相容性自組裝方法來產生載有配體之LNP，並量化配體密度(ρL)及對靶標之結合親和力(KDL)，並藉由控制LNP電荷來減少脫靶表現。將自已成功與LNP結合之CD4 T細胞靶向抗體開始，並使用可與PEG部分進行位點特異性連接之scFv抗CD4蛋白。不採用膠束後插入法，而是將抗小鼠CD4 scFv直接與單體DSPE-PEG2000-順丁烯二醯亞胺化學結合，並鑑定維持單體狀態以放置於稀釋孔中之有機/水性/電解質溶劑條件，用於LNP之後微流體混合並摻入LNP表面中。已改變有機/水性/電解質溶劑條件，以維持微流體通道中產生的LNP之結構或誘導LNP融合，如通常發生的那樣。因此，將能夠在能夠控制LNP穩定性並控制結合脂質向LNP表面中之摻入的稀釋孔中對多種有機/水性/電解質溶劑條件進行篩選研究。所得的LNP將藉由離心過濾或粒徑排阻層析法(Sepharose CL-4B)與未結合之scFv分離，並在含LNP之濃縮物及濾液中量測蛋白質含量，以評估與LNP相關的配體之量。此結合配體量將歸一化為藉由奈米顆粒追蹤獲得的顆粒數量及藉由ribogreen檢定獲得的mRNA含量，以提供配體密度ρL含量作為每個LNP之scFv數量，或者scFv與mRNA之質量或莫耳比。使用先前在實驗室中開發之方法，使用表面電漿子共振(SPR)及等溫滴定量熱法(ITC44)量測抗CD4結合之LNP與CD4配體KDL之結合親和力。除了配體密度及結合親和力之此等定量評估外，亦將藉由CryoTEM (DTEML)對配體分佈進行成像，以便使用具有對比度增強之負染色，藉由CD4與配體之培育及結合以及金標記之抗體免疫染色來可視化scFv分佈。一旦選擇了生產方法，將藉由修改稀釋孔中的溶劑條件及結合脂質濃度來產生一系列配體密度及親和力/親合力。用於細胞及動物測試之最終LNP將經表徵為淨電荷及表面電荷。在稍後的階段，將使用上述B1及B4中之方法修改配體結合之LNP的電荷，以便結合及協調電荷介導之靶向與配體介導之靶向。例如，電荷調整有望消除肝臟中靶向脾臟T細胞的LNP之脫靶表現（第96圖）。使用具有cGMP產生及消除的肝臟表現的此公開之CD4靶向LNP將為此方法之初步概念驗證。第二概念驗證將應用此等方法來展示神經細胞黏附分子(NCAM)之肽配體以靶向骨骼肌。此處較小的蛋白質組分將顯著改變其在LNP表面中摻入所需的有機/水性/電解質溶劑條件。在本模組之初始階段為原型C24 LNP及抗CD4 PEG脂質推導出之特定模型結果由一般形式表示：
(ρL、KDL、DTEML) = f(有機/水性/電解質溶劑條件、配體類型/濃度)
此部分中推導出之方法及模型將允許受控製造呈現出一系列配體類型（抗體、肽）之LNP，該等配體類型具有特徵性配體密度及親和力。
C) 遞送效率、毒性及反應原性之活體外評估。
C1) 遞送效率之活體外評估。使用螢光素酶報告基因之mRNA LNP轉染的方法將對代表輕易可轉染之細胞(HEK293)、懸浮細胞(CHO)、內皮細胞(HUVEC)、肌肉細胞(C212)、巨噬細胞(RAW)、肝細胞(Hep G2)及T細胞(Jurkat)以及原代人類CD4+ T細胞之細胞類型進行。代謝毒性將由Alamar Blue評估。在此建立之關係係如下：
在細胞(j)中(效率、毒性) = f(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、劑量)
C2) 毒性及反應原性之活體外預測因子。為了使先天免疫反應原性與LNP結構及mRNA LNP調配物相關聯，將藉由先天免疫活化之無細胞及基於細胞之檢定進行高通量篩選。血漿中之補體及FXIIa活化被視為LNP誘導之急性類過敏反應的潛在驅動因素。補體活化將藉由使人類檸檬酸鹽化血漿暴露於LNP，繼之進行C3酶原轉化為C3b之西方墨點分析來量測。若在LNP與血漿接觸後陰離子RNA表面暴露出來，則可能會導致因子XII (FXII)活化，從而產生舒緩肽，一種與過敏反應相關之血管擴張劑。作為接觸途徑之起始步驟，FXII活化之後會產生凝血酶，這會增加凝血病之風險。將使用吾等實驗室開發的血栓彈力圖(TEG)檢定量測RNA LNP對 FXII之活化，其中陰離子表面可誘導微粒耗乏血漿之突然凝固，否則在添加鈣後無法凝結。基於細胞之反應將包括紅血球之溶血及滲透脆性，在肺(~pH 7.4)及血管外空間(~pH 6.7)中所見的pH值水平下LNP劑量逐漸增加。已藉由將編碼eGFP之LNP與肝素化人血在37℃下培育4小時，接著量測反應原性細胞介素（IL-6、IL-8）之產生來評估LNP在外周白細胞中誘導先天免疫活化之潛力。LNP亦在一種新穎的培養凝結檢定中測試，採用未經修飾之人類全血，其中C24 LNP之反應原性低於MC3 LNP。經培養之凝結細胞在24小時後表現eGFP，但在肝素化血液中未觀察到eGFP表現，提示新穎的培養凝結檢定在篩選毒性及LNP調配物之表現方面具有優越性。LNP加料培養凝結之RNAseq將使得能夠測試LNP mRNA表現與特定先天免疫反應相關之假設，該等先天免疫反應先於成功的適應性免疫反應。將在此建立的關係之一般形式係如下：
（FXII活化、補體活化、炎症/抗原呈遞細胞介素）= f（NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、可離子化脂質描述符、劑量、pH值）
此模型將根據LNP特徵預測毒性及反應原性反應。
D) 在齧齒動物及非人類靈長類動物 (NHP) 模型中評估遞送效率、靶向性及毒性 / 反應原性。使用上述預測模型設計的mRNA LNP將在小鼠、大鼠及NHP模型中表徵器官及細胞特異性遞送效率以及毒性。
D1) 表現及靶向之小鼠模型評估。在對小鼠進行IV投藥時，將使用3 種mRNA編碼之報告基因：螢光素酶、mCherry及Cre重組酶報告基因在Ai6 RCL-ZsGreen1基因轉殖小鼠中評估mRNA表現及生物分佈，它們不依賴於肝臟、肺、脾、淋巴結、心臟、骨髓、骨骼肌、眼睛、大腦、睾丸及卵巢之表現。離體IVIS成像將用於螢光素酶報告基因，而組織學及流式細胞術將用於mCherry及Cre活化的ZsGreen。在投藥後的前72小時期間，將對來自接受mCherry及Cre報告基因之動物的器官進行勻漿化，並將細胞酶促釋放以供如前所述之流式細胞術。這兩個報告基因為互補的，因為一旦Cre-R在Ai6模型中表現，細胞便會永久保持綠色，但水準可為細胞類型依賴性的，並具有一定的異質性。mCherry表現為瞬時的，但可指示mRNA轉譯之強度。
將推導出器官特異性靶向之5個量度：
器官(i) IVIS_表現= 4小時時集成的器官IVIS訊號（光子/s）
器官(i) mCherryF_表現= 每個器官的總細胞mCherry螢光強度(Fluo/器官)
器官(i) ZsGreenF_表現= 個器官的總細胞ZsGreen螢光強度(Fluo/器官)
器官(i) mCherryC_表現= 每個器官的總mCherry陽性細胞(Fluo/器官)
器官(i) ZsGreenC_表現= 每個器官的總ZsGreen陽性細胞(Fluo/器官)
在流式細胞術中，基質細胞、血液細胞、抗原呈遞細胞及器官特異性細胞類型之特定標記將指示每種細胞類型之mCherry及ZsGreen表現，提供以下指標：
器官中(i)之細胞(j) mCherryF_表現= 總mCh螢光強度(j)細胞/總強度
器官中(i)之細胞(j) ZsGreenF_表現= 總ZsG螢光強度(j)細胞/總強度
器官中(i)之細胞(j) mCherryC_表現= 總mCh陽性(j)細胞/總陽性細胞
器官中(i)之細胞(j) ZsGreenC_表現= 總ZsG陽性(j)細胞/總陽性細胞
對於IV投藥，將獲得所有解剖器官之IVIS指標，而細胞特異性表現最初僅限於脾臟及肝臟。在肝臟單細胞懸浮液中，細胞表面標記將使用以下標記指示肝細胞、肝竇內皮細胞、庫弗細胞、嗜中性白血球及樹突狀細胞：(ASGR1、CD16/CD32、CD31、CD11c、CD11b、CD209、CD64、CD45、ESAM、Ly-6g、CD49b、CD19、CD3e、I-A/I-E、Tim-4、CD206、F4/80、CD24、CD86、OX40L)。在脾臟單細胞懸浮液中，細胞表面標記將使用以下標記指示T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞：(B220、CCR2、CD3、CD14、CD19、CD49b、CD68、CD71、CD103、CD117、CD169、CD206、Mac2、Mac3、MerTK、Siglec F、CD24、CD86、OX40L)。在組織學中，將使用定量組織形態測定法圖像分析來評估細胞類型特異性表現，作為每個具有陽性表現之細胞類型的面積%。為了評估與表現無關之生物分佈，將對器官勻漿使用分支DNA (bDNA)檢定。另外的器官亦將在處理之前灌注以移除間質LNP，接著藉由bDNA對器官之單細胞懸浮液進行分析，並量測懸浮液中之bDNA及表現。上述器官及細胞特異性表現及分佈資料將藉由以下類型之綜合模型與前一部分中表徵之LNP參數相關聯：
器官(i)表現/分佈 = f（NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、劑量）
細胞(j)器官(i)表現/分佈 = f（NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、劑量）
希望上述關係為可普遍化的，並且在LNP設計中為吾等提供指導，因為已知驅動表現及靶向之LNP特徵位於上述表達式之右側。亦將在多級模型之第二階段中探索與可離子化脂質結構描述符、調配及製造參數之潛在關係，以充分利用該資料集。極其多樣化的可離子化脂質文庫與調配及製造之大修改空間相結合，可能會提供顯著改變靶向之能力。將使用第94圖中可離子化脂質家族之初步發現來設置基線，接著對其他文庫家族及候選物進行採樣，以繪製出針對吾等設計空間之圖。此等結果則將指導吾等進一步進行可離子化脂質設計及調配/製造改變。
在對小鼠進行IM投藥時，將使用上述相同的評估，但此外，將添加注射部位及引流淋巴結之離體IVIS成像。將在流式細胞術中分析注射部位及引流淋巴結之mCherry及ZsGreen表現，以便使用上面列出之脾細胞標記來鑑定嗜中性白血球、單核細胞、嗜酸性白血球、嗜鹼性白血球、肥大細胞及樹突狀細胞。注射部位之組織學分析將與上述IV投藥的相同，並且具體包括肌細胞及脂肪細胞。此部分之結果將預測針對LNP特徵之器官及細胞特異性靶向及表現，該等特徵預計會強烈影響此等性能參數，但以前從未與靶向及表現相關。結果應闡明此等依賴性，並為設計新型可離子化脂質、調配及製造過程提供指導，以進一步改善mRNA LNP之靶向表現。
D2) 毒性及反應原性之小鼠模型評估。LNP之毒性已藉由將可降解酯摻入可離子化脂質中來降低，該等脂質由活體內水解酶切割並產生足夠小且親水性足以自尿液及糞便中排泄的片段。MC3中單一緩慢降解之二級酯產生二亞麻油酸，其消除時間非常緩慢，並且在組織中累積之趨勢很強。將額外的可降解酯併入烷基尾部會加速降解。將快速降解之一級酯併入Moderna之可離子化脂質的支鏈中亦比MC3產生快得多的降解，並且降低了IV投藥後齧齒動物之全身毒性61且減輕IM投藥後注射部位之炎症。另一組報告了類似的發現，將另一種可離子化脂質與產生比MC3毒性更低的多種一級酯進行比較。因此，活體內降解速率為決定毒性及反應原性之重要因素。目前的可離子化脂質文庫含有100多種合成的專有化合物，其結構包含0至6個可降解酯，產生具有一系列可預測尺寸之片段。描述此等可降解特性之化學描述符將與活體內毒性及可降解性量測相關。將使用已公開的應用於提取組織勻漿之LC-MS方法量測活體內可降解性。將使用已建立的方法評估毒性，該等方法量測血清中之全身細胞介素以及血液及肝/脾組織病理學中之ALT及AST水準。對於IM投藥，亦將評估注射部位及引流淋巴結之組織勻漿中的促炎細胞介素，以便與毒性及APC活化相關聯。組織學分析將包括免疫染色，以鑑定參與注射部位及引流淋巴結中之發炎反應的細胞類型。此等結果將允許建立以下關係：
（可降解性、炎症/APC活化）= f（可離子化脂質描述符、LNP描述符、劑量）
D3) 免疫原性及佐劑性之小鼠模型評估。除了提供高遞送效率外，用於mRNA疫苗之LNP亦需要充當佐劑，以增加引流淋巴結中抗原特異性T濾泡輔助(Tfh)細胞及生髮中心B (GC B)細胞之數量。此LNP特異性佐劑活性有助於驅動免疫球蛋白類別轉換、親和力成熟以及長期B細胞記憶及漿細胞之發育64。由於已知此等效應視可離子化脂質而定，所以將量測引流淋巴結及脾臟中的抗原特異性Tfh及GC B細胞反應，並將它們與可離子化脂質之結構特徵相關聯。亦將使用當前用於SARS-CoV-2之mRNA編碼的核苷修飾之免疫原，亦即雙脯胺酸穩定之刺突蛋白(S2P)來評估免疫原性。在Balb/c小鼠中以0.1至1 µg之低劑量進行初接觸及加強後，量測針對SARS-CoV-2假病毒之結合效價及中和效價，如最近所公佈的5。在此確定之關係為：
(效價、Tfh、GC B) = f(可離子化脂質描述符、NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、劑量)
將用空間轉錄組學補充上述注射部位及引流淋巴結中的細胞反應及細胞介素反應之分析。轉錄組圖譜將指示免疫活化、脂質代謝及毒性，並描繪由特定可離子化脂質特徵誘導的分子事件之動態。
D4) 表現、靶向性、毒性、反應原性、免疫原性之大鼠及非人類靈長類動物模型評估。以上相對高通量之小鼠模型之後將在大鼠及非人類靈長類動物中進行選定研究，因為此等為人類研究之必要先決條件，並且可揭示物種依賴性。非人類靈長類動物通常顯示出與齧齒動物模型之明顯差異，並且關於大鼠中之LNP靶向的傳聞報導表明，與小鼠相比，大鼠可能更接近於代表非人類靈長類動物。因此，將在此項目之第二年以與上述類似之方式針對靶向性進行選定的大鼠研究。根據迄今為止獲得之全部資料，將在第3年進行數量有限的非人類靈長類動物研究。
E) 預測模型開發。上述研究中生成的資料集將用於開發預測模型，該模型將部分C及D中量測之mRNA LNP性能與目前預計會強烈影響以上部分B中所述之性能的LNP特徵相關聯。此等LNP特徵反之亦視化學結構、調配參數及製造過程而定，從而創建了一組多層相互依賴之模型及用於開發彼等模型之基礎資料。因此，將開發與在多個級別收集之參數資料相關的機器學習、知識網絡及多級功能模擬模組，此等資料將被統計及機械建模（使用上面開發的電腦工具）以瞭解潛在的關係。分子、調配及製造參數將用於預測已知影響性能之LNP特徵，而此等LNP特徵將用於預測動物模型中諸如表現、靶向性及毒性之性能。電腦模型將使用由活體外及活體內實驗生成之資料進行指導和調整。此等預測模型將使用當前最新的機器學習算法進行訓練，此等算法將有助於鑑定來自不同領域（分子、調配、製造、LNP、性能）之相關變量。將根據交叉驗證策略嚴格評估預測性能及各個變量之重要性。
前述詳細說明及所附實例僅為說明性的，並且不應解釋為對本發明範疇之限制，本發明範疇僅由所附申請專利範圍及其等效方案確定。
對所揭示之實施例的各種改變及修改為熟習此項技術者顯而易見的。此類更改及修改，包括但不限於本發明之化學結構、取代基、衍生物、中間物、合成、組合物、調配物及使用方法，旨在落入本發明之精神及範疇內。
對於本文引用之所有專利、申請案、或其他參考，諸如非專利文獻及參考序列資訊，應瞭解，其針對所有目的及針對所述及之主題以整體引用之方式併入。當以參照方式併入之文獻與本申請案之間存在任何矛盾時，將以本申請案為準。與本申請案中揭示之參考基因序列相關之所有資訊，諸如GeneID或登錄號(通常參考NCBI登錄號)，包括例如基因組位點(genomic loci)、基因組序列、功能注解、對偶基因變異體、及參考mRNA (包括例如，外顯子邊界或反應元件)及蛋白質序列(諸如保守域結構)、以及化學參考(例如，PubChem化合物、PubChem物質、或PubChem Bioassay實體，包括其中之注解，諸如結構及檢定，等等)，係特此以整體引用之方式併入。
本申請案中使用之標題係僅為了方便之目的且不影響本申請案之解釋。
由本發明提供之每一態樣之較佳特徵原則上適用於本發明之所有其他態樣，且(非限制性地)藉由從屬權利要求例證且亦涵蓋本發明之特定實施例及態樣(包括工作實例)之個別特徵(例如元件，包括數值範圍及示範性實施例)之組合及排列。舉例而言，工作實例中例證之特定實驗參數可適合於逐個地在所要求保護之發明中使用而不背離本發明。舉例而言，對於所披露之材料，雖然此等化合物之各種個別及共同組合及排列中之每一者之具體參考可能未明確地披露，但每一者被具體地涵蓋且於本文描述。因此，若一類元件A、B、及C與一類元件D、E、及F被披露且披露了元件A-D之組合之實例，則，即使未個別地述及每一者，每一者亦個別地且共同地被涵蓋。因此，在此實例中，組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、及C-F中之每一者被具體地涵蓋且應視為自A、B及C；D、E及F；及實例組合A-D之披露而得以披露。同樣，此等之組合之任何子集亦被具體地涵蓋並披露。因此，例如，A-E、B-F、及C-E之子群組係具體地涵蓋且應視為自A、B及C；D、E及F；及實例組合A-D之披露而得以披露。此概念適用於本申請案之所有態樣，包括物質組合物之元素及製備或使用該等組合物之方法之步驟。
如本技術領域中具有通常知識者根據本說明書之教義將認識到的，本發明之前述態樣可以任何組合或排列要求保護，只要其相對於先前技術為新穎的且非顯而易見的—因此，當元件在由本技術領域中具有通常知識者所知之一或多個參考中被描述時，可藉由該特徵或特徵之組合之負麵條件或放棄聲明將其自所要求保護之發明排除在外。
無
第 1 圖說明使用包含在脂質奈米顆粒中的本發明之可離子化脂質來增強及改善mRNA效力與遞送的示範性方法。
第 2A 圖說明自pH 7滴定至ph 12的MC3之定製合成的水溶性頭部基團之水相pKa以及二甲胺質子經量測以擬合亨德森-哈瑟爾巴赫(Henderson-Hasselbach)方程(HH)從而獲得9.45之pKa(類似於由ACDLabs Percepta所預測之9.4)時的化學位移之圖。 第 2B 圖說明5個針對氮烷二基二酯(ADDE)之LNP及2個由MC3及KC2標準製得之LNP自pH 3至pH 10量測的ζ電位之圖。 第 2C 圖說明使用擬合至HH之傳統TNS方法量測的LNP pKa。
第 3 圖說明示範性螢光素酶報告基因在活體外及活體內之表現。
第 4 圖說明由本發明之示範性第一代ADDE可離子化脂質所呈現的穩健結合抗體反應。 第4A 圖說明藉由ELISA評估之SARS-CoV-2 S-特異性IgG。 第 4B 圖說明針對VSVDG-RFP SARS-CoV-2假病毒之中和抗體。
第 5 圖說明空LNP之CryoTEM圖像。將不含mRNA之KC2 LNP混合並噴射至pH 4緩衝液中，在pH 7下展示小電子透明結構與電子緻密結構。
第 6 圖說明在微流體混合過程中脂質及mRNA濃度增加時LNP效力的增加。
第 7 圖說明如實例1A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 8 圖說明如實例1B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 9 圖說明如實例1C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 10 圖說明如實例1D中例示之基於Presto Blue HS活力試劑的毒性檢定之圖。
第 11 圖說明如實例2A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 12 圖說明如實例2B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 13 圖說明如實例2C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 14 圖說明如實例3A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 15圖說明如實例3B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 16 圖說明如實例3C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 17 圖說明如實例3D中例示之基於Presto Blue HS活力試劑的毒性檢定之圖。
第 18 圖說明如實例4A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 19 圖說明如實例4B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 20 圖說明如實例4C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 21 圖說明如實例5A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 22 圖說明如實例5B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 23 圖說明如實例5C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 24 圖說明如實例5D中例示之在BALB/c小鼠中注射後4小時mRNA Fluc之活體內轉譯圖。
第 25 圖說明如實例6A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 26 圖說明如實例6B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 27 圖說明如實例6C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 28圖說明如實例7A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 29 圖說明如實例7B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 30 圖說明如實例7C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 31 圖說明離子化及電荷之分子及LNP表徵圖。 第 31A 圖說明自pH 7滴定至pH 12的MC3之定製合成之水溶性頭部基團的水相pKa及經量測以擬合亨德森-哈瑟爾巴赫(HH)方程的DMA質子之化學位移。 第 31B 圖說明5個ADDE LNP及2個用MC3及KC2標準製成之LNP自pH 3至pH 10量測的ζ電位。 第 31C 圖說明使用擬合至HH方程的TNS(由於與LNP之結合)之傳統螢光增強量測的LNP pKa。
第 32 圖說明螢光素酶報告基因之活體外及活體內表現。 第 32A 圖說明以每孔25-200 ng之劑量在含有12k細胞之含血清培養基中以5個ADDE LNP以及MC3及KC2 LNP遞送至HEK 293細胞的Fluc mRNA。 第 32B 圖說明藉由IM注射在BALB/c小鼠中遞送的2.5μg Fluc mRNA（含有MC3及KC2之LNP在肝臟中呈現出脫靶系統表現，而DL-ADDE LNP則靶向表現至肌肉及引流淋巴結（參見離體）。 第 32C 圖說明使用CryoTEM成像的包含KC2之LNP，展示球形LNP之直徑對應於藉由DLS所量測的65 nm之數量尺寸的直徑。
第 33 圖說明ADDE可離子化脂質用0.3 mg（綠色）及10 mg（藍色）S-2P mRNA編碼之免疫原以4種不同LNP在第0週及第3週免疫之BALB/c小鼠（n = 5只/組）中引起強烈的結合抗體反應，並藉由ELISA評估SARS-CoV-2 S特異性IgG( 第 33A 圖)以及針對VSVΔG-RFP SARS-CoV-2假病毒之中和抗體( 第 33B 圖)。
第 34 圖說明如實例8A中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 35 圖說明如實例8B中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 36 圖說明如實例8C中例示之LNP電荷、pKa及Pi的ζ電位圖。
第 37 圖說明如實例8D中例示之LNP pKa的TNS檢定之圖。
第 38 圖說明如實例9A中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 39 圖說明如實例9B中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 40 圖說明在肌內(I.M.)注射之小鼠中IM投與5 ug經封裝之mRNA 後的活體內螢火蟲螢光素酶表現。 第 40A 圖自左至右(MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示4小時活體內成像（左組1，右組2）。 第 40B 圖說明在肌肉及肝臟中之存在，自左至右(MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示在肌內投與之後的全身分佈及局部濃度。 第 40C 圖自左至右(MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示24小時活體內成像（左組1，右組2）。 第 40D 圖說明在肌肉及肝臟中之存在，自左至右(MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示在肌內投與之後的全身分佈及局部濃度。 第 40E 圖說明在肌內投與之後MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ之樣品的分佈。 第 40F 圖說明在肌內投與之後MC3之樣品的分佈。 第 40G 圖說明在肌內投與之後DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ之樣品的分佈。 第 40H 圖說明在肌內投與之後BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ之樣品的分佈。 第 40I 圖說明用0.1 μg及1 μg劑量之S-2P mRNA編碼之免疫原以3種不同LNP MC3 / DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ / BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ在第0週及第3週免疫之BALB/c小鼠(n=5只/組)中產生的結合抗體效價。在Prime後3週及Boost後5週，藉由ELISA評估血清之SARS-CoV-2 S特異性IgG。
第 41圖說明如實例10A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 42圖說明如實例10B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 43 圖說明如實例10C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 44圖說明如實例11A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 45圖說明如實例11B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 46 圖說明如實例11C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 47 圖說明如實例12B中所例示使用螢火蟲螢光素酶檢定的基於活體外效力之穩定性檢定的圖。
第 48 圖說明如實例12C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 49 圖說明如實例13A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 50 圖說明如實例13B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 51 圖說明如實例13C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 52圖說明如實例14A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定之圖。
第 53圖說明如實例14B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 54 圖說明如實例14C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 55 圖說明如實例15A中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 56圖說明如實例15B中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 57A-57I 圖說明如實例15C中所例示在IM投與中的活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第 58 圖說明如實例16A中例示之活體內免疫原性終點ELISA抗RBD效價– 第 58A 圖(BOOST前)， 第 58B 圖(BOOST後)。
第 59 圖說明如實例16B中例示之假中和檢定的活體內免疫原性FRNT50效價。
第 60 圖說明如實例17A中所例示的針對病毒挑戰之活體內保護 - 在挑戰模型中之存活比例、重量及溫度； 第 60A 圖(存活比例：MC3-SR)； 第 60B 圖(存活比例： BODD C2C4 PipZ-HO)
第 61A-61D 圖說明如實例17B中所例示在挑戰模型中之活體內重量及溫度。
第 62 圖說明如實例18A中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 63 圖說明如實例18B中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 64A-64H 圖說明如實例18C中所例示在IM投與中的活體內螢火蟲螢光素酶表現。 第 64I-J 圖說明優於MC3標準的本發明之多種第二代可離子化脂質在IM ( 第 64I 圖)及IV ( 第 64J圖)投與時的活體內篩選。
第 65 圖及 第 66 圖說明如實例19A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定。
第 67 圖說明如實例19B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 68 圖說明如實例19C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 69 圖說明如實例20A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定。
第 70 圖說明如實例20B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 71 圖說明如實例20C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 72 圖說明如實例21A中例示之mRNA遞送效率的螢火蟲螢光素酶檢定。
第 73 圖說明如實例21B中例示之mRNA封裝效率的Ribogreen檢定之圖。
第 74 圖說明如實例21C中例示之LNP尺寸的動態光散射（紅點為PDI右y軸）之圖。
第 75 圖及 第 76 圖說明如實例22A中所例示在IM投與時注射部位之活體內螢火蟲螢光素酶表現的結果。
第 77 圖及 第 78 圖說明如實例22B中所例示在IM投與時注射部位之離體螢火蟲螢光素酶表現的結果。
第 79 圖及 第 80 圖說明如實例23A中所例示在IM投與時注射部位之活體內螢火蟲螢光素酶表現的結果。
第 81 圖、第 82 圖及 第 83 圖說明如實例23B中所例示在IM投與時注射部位之離體螢火蟲螢光素酶表現的結果。
第 84 圖說明多質子C24可離子化脂質在LNP中產生多級質子化及在胞內體pH範圍內產生比MC3LNP更大之質子化的結果。
第 85 圖說明C24及MC3脂質奈米顆粒之結構特性的影響。
第 86 圖說明在Balb/c小鼠中肌內(IM)投與後螢光素酶表現之結果，展示與MC3相比，C24 LNP顯著更高的中靶mRNA表現及更低的脫靶mRNA表現。
第 87 圖說明在Balb/c小鼠之免疫原性研究中C24 LNP產生比MC3 LNP高10倍的結合及假中和抗體效價之結果。
第 88 圖說明C24 LNP，它們在低劑量之S2P免疫原下對致命的SARS-CoV-2挑戰具有保護作用，並完全消除肺部感染。
第 89 圖說明C24之局部注射部位炎症低於MC3 mRNA LNP。
第 90 圖說明C24及MC3 LNP之生物活性及mRNA完整性，它們在4℃下穩定，但在2週內在較高溫度下會下降。
第 91 圖說明在用含有mRNA編碼之S2P免疫原的C24及MC3 LNP下以0.1至1.0 µg之劑量進行 Prime-Boost疫苗接種後第0天接受致死挑戰的K18-hACE2小鼠之重量及溫度效應。
第 92 圖說明在微流體混合期間脂質及mRNA濃度增加時LNP效力及胞內體質子化增加。A)以更高濃度組裝的KC2 LNP在活體外以25-200 ng/含有12k HEK293細胞之孔的相同劑量產生更高的Fluc表現。B)在更高混合濃度下產生並在50 µL中稀釋至恆定5 µg劑量以供IM注射的LNP（混合時以mM為單位之總脂質濃度示於動物上方）係更有效的（彩色條為以107 p/sec/cm2/sr計之輻射）。C)對於藉由高濃度混合製備之LNP，當pH自7.4下降至5時，ζ電位量測揭示質子化增加更多，表明更多的胞內體釋放。
第 93 圖說明LNP性能之決定因素，此等因素將在活體外及動物模型中進行量測、建模並與遞送效率、靶向性、毒性及反應原性相關。
第 94 圖說明示範性BODD PipZ類型之可離子化脂質。此家族之12個成員用不同的碳間隔基合成，以產生具有跨越2點範圍之分子大離子化常數（如上面的N上所示）的可離子化脂質，以表徵所得LNP電荷及胞內體質子化，並將此等特徵與遞送效率及靶向性相關聯。
第 95 圖說明帶負電之LNP減少肝臟表現並增加脾臟中之表現。在mRNA LNP組裝之前，陰離子脂質18-1PA以15%及30%之總脂質添加至脂質混合物中。以15%之總脂質添加18-1PA會減少FLuc之肝臟表現，並在IV投與後將脾臟表現增加2.5倍。
第 96 圖說明在標準濃度（A、B中0.2 mg/ml mRNA）及高濃度（C、D中1.5 mg/ml mRNA）下Fluc LNP之組裝在以1:2 v/v之乙醇/水中噴射(A, C)後或在PBS中透析至pH 7.4 (B, D)後進行成像。在高混合濃度下產生的高效mRNA LNP在混合後立即顯示出更高水準之融合結構（C對比A），在透析後轉化為更均勻的LNP。
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Claims (19)

  1. 一種式V化合物：
    Figure 03_image072
    式 V其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成環烷基環或雜環烷基環； 其中R 3、R 4、R 13及R 14各自獨立地選自由以下組成之群：-H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基； 其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 15及R 16各自獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基， 其中w、y及z中之各者獨立地為0-10之整數； 其中各Q獨立地為選自O、NH、NR 1、S之原子或二硫鍵； 其中各m為0-20之整數，並且 其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m-；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
  2. 一種式III化合物：
    Figure 03_image261
    式 III其中各R 1’、R 1、R 2、R 11及R 12獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳烷基、視情況經取代之C 5-C 10雜芳烷基、視情況經取代之胺；或R 1與R 2可一起形成環烷基環或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則與S或O連接之R 1為電子對； 其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基； 其中R 5、R 6、R 7、R 8、R 9及R 10各自獨立地選自由以下組成之群： H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基， 其中x、y及z各自獨立地為0-10之整數； 其中G及Q各自獨立地為選自CH、O、N及S之原子； 其中m及n各自為0-20之整數；並且 其中L 1及L 2各自獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m-；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
  3. 如請求項1所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image263
    。
  4. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image265
    。
  5. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image267
    。
  6. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image269
    。
  7. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image271
    。
  8. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image273
    。
  9. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image275
    。
  10. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image277
    。
  11. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image279
    。
  12. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image281
    。
  13. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：
    Figure 03_image283
    。
  14. 一種脂質奈米顆粒，其包含： i) 如請求項1所述之化合物； ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合脂質；及 v) 治療劑或預防劑或其醫藥學上可接受之鹽，封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
  15. 一種脂質奈米顆粒，其包含： i) 如請求項2所述之化合物； ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合脂質；及 v) 治療劑或預防劑或其醫藥學上可接受之鹽，封裝於該脂質奈米顆粒內或與該脂質奈米顆粒結合。
  16. 一種將核酸遞送至受試者之方法，該方法包含以下步驟：向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒： i) 如請求項1所述之化合物； ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合脂質；及 v) 核酸或其醫藥學上可接受之鹽，封裝於該脂質奈米顆粒內或與該脂質奈米顆粒結合。
  17. 一種將核酸遞送至受試者之方法，該方法包含以下步驟：向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒： i) 如請求項2所述之化合物； ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合脂質；及 v) 核酸或其醫藥學上可接受之鹽，封裝於該脂質奈米顆粒內或與該脂質奈米顆粒結合。
  18. 一種將包含治療性蛋白質、疫苗、基因編輯RNA之治療劑遞送至受試者之方法，該方法包含以下步驟：向該受試者投與包含以下各物之脂質奈米顆粒： i) 如請求項1所述之化合物； ii) 第二脂質，例如，中性或兩性離子脂質； iii) 類固醇； iv) 聚合物結合脂質；及 v) 治療劑或其醫藥學上可接受之鹽，它們經封裝於脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒結合。
  19. 一種將包含治療劑或預防劑之脂質奈米顆粒(LNP)活體內靶向遞送至細胞或組織的方法，該方法包含以下步驟： 1.) 預測可離子化脂質之分子pKa，合成該可離子化脂質，用諸如NMR之分析方法量測pKa； 2.) 使用包括TNS及ζ電位之分析方法量測LNP pKa； 3.) 使用選自由螢光素酶、mCherry、Cre報告基因組成之群的報告基因評估活體內細胞及器官靶向性； 4.) 調整可離子化脂質結構以找出用於細胞或組織靶向之最佳分子pKa； 5.) 選擇具有與靶向所需細胞或組織相關的所需pKa之頭部基團、間隔基團及尾部基團；以及 6.) 重複步驟1-4，直至實現最佳細胞及組織靶向。
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