CN116917266A - 可离子化脂质及其制造和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涵盖新颖的可离子化脂质化合物及其在脂质纳米颗粒递送系统中的用途，所述脂质纳米颗粒递送系统适用于将核酸递送至哺乳动物受试者，所述可离子化脂质化合物可经纳入以用作例如癌症疫苗、基因编辑疗法、递送编码抗体的核酸(例如，mRNA)、感染性疾病用疫苗和蛋白质替代治疗剂。此外，本发明涵盖在脂质纳米颗粒中包含可离子化脂质的组合物和治疗剂，以及所述组合物和治疗剂用于制备药物组合物、尤其是疫苗(例如，用于预防或治疗感染性疾病、肿瘤或癌症疾病、罕见疾病、过敏症或自身免疫疾病)的用途。本发明涵盖治疗或预防上述疾病的方法。

Description

可离子化脂质及其制造和使用方法

I.相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月14日提交的美国临时申请第63/091,616号；2021年4月26日提交的美国临时申请第63/179,885号；2020年10月14日提交的美国临时申请第63/091,603号；和2021年4月26日提交的美国临时申请第63/179,872号的权益，所述临时申请各自通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过电子方式提交并且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2021年12月21日，命名为AEXR-001-02US-343269-2014_SL.txt并且大小为1,460字节。

II.技术领域

本发明涵盖新颖的可离子化脂质化合物及其在脂质纳米颗粒递送系统中的用途，所述脂质纳米颗粒递送系统适用于将核酸递送至哺乳动物受试者，所述可离子化脂质化合物可经纳入以用作例如癌症疫苗、递送基因编辑疗法、递送编码抗体的核酸(例如，mRNA)、感染性疾病用疫苗和蛋白质替代治疗剂。此外，本发明涵盖在所述脂质纳米颗粒中包含可离子化脂质的组合物和治疗剂，以及所述组合物和治疗剂用于制备药物组合物、尤其是疫苗(例如，用于预防或治疗感染性疾病、肿瘤或癌症、罕见疾病、过敏症或自身免疫疾病)的用途。本发明还涵盖治疗或预防上述疾病的方法。

II.发明背景

基因疗法和基因疫苗接种属于现代医学中最有前景且发展最快的方法。它们可为多种疾病的疗法提供高度特异性和个性化的选择。作为基本的生物学概念，细胞机制利用mRNA作为信息的瞬时载体来合成基因编码的蛋白质。因此，从理论角度来看，mRNA应该能够代替DNA或重组蛋白质用于治疗目的。例如，RNA干扰(RNAi)剂如小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)作为治疗剂具有强大潜力，可用于治疗广泛多种疾病，例如恶性肿瘤、感染、自身免疫疾病以及与不良基因表达相关的神经性疾病。

对于这些渗透性差并且易降解的大分子的全身施用，非常需要安全有效的递送平台。由于高生物相容性、生物可降解性和临床使用的可靠记录，由脂质和/或磷脂制成的纳米载体已普遍用于促进RNA递送(例如，脂质体、脂质纳米颗粒和脂质纳米乳液)。

基因疫苗接种引起对选定抗原如细菌表面的特征组分、病毒颗粒、肿瘤抗原等的期望的免疫反应。基因疫苗(即用于基因疫苗接种的疫苗)通常由基因工程化核酸分子构成，所述核酸分子允许在体内表达病原体或肿瘤抗原所特有的肽或蛋白质(即抗原)片段。基因疫苗在由靶细胞摄取后向患者施用时表达。所施用的核酸的表达导致所编码蛋白质的产生。如果这些蛋白质被患者的免疫系统识别为外来物，则会触发免疫反应。

DNA以及RNA可用作核酸分子，用于在基因疫苗接种的背景下的施用。众所周知，DNA相对稳定并且易于处理。然而，使用DNA带来将所施用DNA片段不期望地插入患者基因组中的风险，这可能导致诱变事件，例如受损基因的功能丧失。作为另一种风险，可能会出现不需要的抗DNA抗体产生。另一个缺点是在DNA施用后可实现的编码肽或蛋白质的有限表达水平，因为DNA必须进入细胞核才能在所产生的mRNA可被翻译之前进行转录。除其他原因外，所施用DNA的表达水平将取决于调节DNA转录的特定转录因子的存在。在不存在此类因子的情况下，DNA转录不会产生令人满意的RNA量。作为结果，所获得的翻译肽或蛋白质的水平是有限的。

通过使用RNA代替DNA进行基因疗法和基因疫苗接种，可最大限度地降低或避免不希望的基因组整合和产生抗DNA抗体的风险。然而，RNA被视为一种相当不稳定的分子种类，很容易由普遍存在的RNA酶降解。本领域需要提供一种有效的mRNA施用方法(例如，用于疫苗接种)，所述方法允许引发适应性免疫反应，其中施用不会因抗原的早期降解或由于mRNA在细胞中的低效释放所致的mRNA的低效翻译而受到严重损害。此外，需要减少mRNA疫苗的剂量以减少潜在的安全问题并使得第三世界能够负担得起疫苗。

存在许多与核酸递送相关的挑战以影响在生物系统中的所需反应。基于核酸的治疗剂(例如疫苗)具有巨大的潜力，但仍需要更有效地将核酸递送至细胞、组织或生物内的适当位点以实现这种潜力。然而，目前在治疗环境中使用寡核苷酸面临三个问题。首先，游离RNA容易受到血浆中核酸酶的消化。其次，游离RNA进入相关翻译机制所在的细胞内区室的能力有限。第三，仅一小部分内化的寡核苷酸释放至细胞质中而变得具有生物活性。由本发明的可离子化脂质(如本文所定义)与其他脂质组分如中性脂质、类固醇、PEG、聚乙二醇化脂质和寡核苷酸组合形成的脂质纳米颗粒(LNP)已用于阻断血浆中RNA的降解并促进寡核苷酸的细胞摄取。如果适当设计，则它们可将治疗水平的寡核苷酸释放至细胞质中。

局部递送造成RNA的全身存在，从而导致不需要的副作用和功效降低。疫苗通常经由肌内(IM)注射施用，并且经由IM途径递送至树突状细胞的LNP要求与静脉内(IV)递送至肝细胞不同。肝细胞靶向是由于LNP与ApoE相关联，ApoE将LNP摄取靶向肝细胞LDL受体，而ApoE在IM施用中可能没有相同的作用。LNP的第二靶向机制是它们的净电荷。带负电的LNP在IV施用时以脾脏为目标，而带正电的LNP以肺脏为目标，并且接近中性的LNP以肝脏为目标。已发表的研究未评估LNP电荷在IM施用中的影响。

仍然需要用于递送寡核苷酸的经改进的可离子化脂质和脂质纳米颗粒。

包含在脂质纳米颗粒中的本发明的可离子化脂质(如本文所定义)提供最佳药物:脂质比，保护核酸免于降解，并在血清中清除，适用于全身或局部递送，并提供核酸的细胞内递送。此外，包含在脂质-核酸颗粒中的本发明的可离子化脂质具有良好的耐受性并提供足够的治疗指数，使得以有效剂量的核酸对患者进行的治疗不会导致不可接受的毒性和/或对患者的风险。本发明提供了这些和相关优势。

III.发明内容

本发明提供了用于脂质纳米颗粒(LNP)中的本发明的可离子化脂质(如下所定义)的令人惊讶和出乎意料的发现，所述可离子化脂质提供核酸递送(例如，mRNA)的效力增强，以用于例如疫苗候选物中，其极大地促进满足成功mRNA疫苗的三个标准的能力-(1)持久保护，(2)每年的大产量，以及(3)全球人口有机会并愿意接种疫苗。由本发明的可离子化脂质提供的增强效力减少了所需剂量和不良反应，同时通过降低成本和提高制造能力保持了功效并增强了全球接种的能力。在某些实施方案中，在这些相同剂量下提高的效力增强了保护。

本发明人已惊讶且意外地发现一类可用于LNP中的新型可离子化脂质，所述可离子化脂质通过使用两种方式设计脂质纳米颗粒来提高效力-意指mRNA表达、免疫原性和保护(例如，当用于递送疫苗时)：

1)经改进的可离子化脂质设计和性能，以及

2)经由控制LNP组装产生更有效的脂质纳米颗粒。

在某些实施方案中，效力增加的量度是本发明的LNP为获得与代表先前临床试验中使用的那些的标准LNP相同水平的针对病毒挑战的保护而实现的剂量减少。

在某些实施方案中，本发明涵盖一种设计可离子化脂质的新型方法，其特征在于已知控制递送效率的三个结构特征：(1)在胞内体pH范围内的离子化，(2)在生理pH下的净电荷，以及(3)与分支和饱和/不饱和相关的脂质尾构象。

本发明还涵盖用于合成的候选物的计算机模拟分析，所述分析能够基于不适当的预测特性消除不需要的候选物。本发明涵盖制备可离子化脂质的新颖合成方法。在其他实施方案中，所述新颖方法通过使用水溶性类似物的NMR表征本发明的可离子化脂质的分子离子化并通过在pH范围(3-10)内测量LNP的ζ电位来遵循设计策略。在某些实施方案中，候选物评估和阐明结构-功能关系(SFR)的方法是全面的，包括但不限于翻译和毒性的体外和体内评估、细胞摄取的体外评价、胞内体释放和先天性免疫传感器激活、分布和细胞运输的体内表征、免疫原性、以及在病毒挑战研究中使用当前和进化的啮齿动物和非啮齿动物模型。

在某些实施方案中，由于脂质与mRNA的混合浓度的增加，在组装期间实现mRNALNP的体内表达的增加(例如，>5X)。在某些实施方案中，克服与系统地检查这些参数相关的关键技术难点和高成本。通过将此发现推广到一系列可离子化脂质，本发明可改变更有效的LNP的工业生产。

在某些实施方案中，本发明涵盖设计和合成有效的可离子化脂质，以用于mRNA疫苗的肌内递送和向所需细胞、组织或器官的集中施用。

在另一个实施方案中，本发明涵盖可离子化脂质，其与先前递送方法相比效力增加并且剂量减少(例如，减少了至少2x、3x、4x、5x、10x、20x、50x或100x)，同时保持相似的表达、免疫原性和针对病毒挑战的保护。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质的多价头部基团的离子化特性的优化，其在中性pH值下产生带正电的LNP以限制全身性传播并增加胞内体离子化，从而增强疫苗效力，同时产生高度分支和可降解的脂质尾部，其可进一步经由胞内体释放增强效力，并且可离子化脂质的电荷和结构会影响LNP佐剂性。

在某些实施方案中，本发明的LNP增强限制不良事件的效力、降低制造成本、并提高全球接种疫苗的能力。

在其他实施方案中，本发明涵盖可离子化脂质和LNP的设计和合成，用于评估物理化学和生物学特性，以鉴定更有效的系统和潜在的结构-功能关系(SFR)。

在另一个实施方案中，本发明涵盖一种通过使用包括ACDLabs Percepta的软件预测本发明的可离子化脂质的pKa来显著加速所述可离子化脂质的设计的方法。

在其他实施方案中，脂质的经预测的水性pKa均显著高于由TNS所测量的值。在某些实施方案中，从水性环境至LNP环境的pKa下降(例如，1-3点下降)先前在LNP文献中并未得到认可，但已知的是脂质膜中的碱性氨基酸。不希望受理论束缚，由于与水相相比脂质相中质子的溶剂化能更高以及来自阳离子LNP的质子的静电排斥(它们可结合使水相至脂质相的pKa降低1-3个点)，因此可找到合理的解释。在某些实施方案中，通过检查潜在候选物的pKa表并仅选择具有适当pKa值的那些，利用这种能力来选择特定的头部基团和碳间隔基。以此方式可准确地消除大多数候选物，从而大大节省合成和测试时间与费用。

在某些实施方案中，本发明涵盖在脂质纳米颗粒(LNP)制剂中使用的经优化的本发明的可离子化脂质。示例性LNP包含本发明的可离子化脂质、第二脂质、类固醇、聚合物缀合脂质和治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于LNP内或与LNP结合。

在某些实施方案中，本发明人出乎意料地发现，本发明的可离子化脂质的优化制剂的特征为与治疗剂递送相关的LNP性质提供了重要改进(例如，提高的稳定性和增强的递送)。

在某些实施方案中，包含在脂质纳米颗粒中的本发明的可离子化脂质被用于递送核酸，例如小干扰RNA、反义RNA、微RNA和/或信使RNA。

因此，在一个实施方案中，提供了一种LNP，其包含：

i)本发明的可离子化脂质；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂(例如，DNA或RNA)或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

另一个实施方案提供了一种LNP，其包含：

i)0.1至75摩尔百分比的本发明的可离子化脂质，其具有大于5.5的有效LNP pKa；

ii)0至50摩尔百分比的中性或两性离子脂质；

iii)0至50摩尔百分比的阴离子脂质；

iv)10至55摩尔百分比的类固醇；

v)0.1至10摩尔百分比的聚合物缀合脂质；和

vi)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合，

其中所述摩尔百分比是基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔数确定的。

另一个实施方案提供了一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)具有有效pKa的本发明的可离子化脂质；

ii)中性脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖用于脂质纳米颗粒中的包含本发明的可离子化脂质的药物组合物及其用于治疗各种疾病或疾患(例如由传染性实体、癌症和/或蛋白质不足引起的那些疾病或疾患)的方法。

在其他实施方案中，本发明提供了一种将治疗剂靶向施用(例如，至特定组织或器官)至有需要的患者的方法，所述方法包括将本发明的可离子化脂质或包含其的药物组合物施用于受试者。

在某些特定实施方案中，本发明涵盖一种式V化合物：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环烷基环或杂芳基环，

其中每个R³、R⁴、R¹³和R¹⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹⁵和R¹⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中w、x、y和z各自独立地为0-10的整数；

其中每个Q独立地为选自O、NH、NR¹和S的原子；

其中每个m为0至8的整数，优选为0、1或2；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

一种式III化合物：

其中每个R¹'、R¹、R²、R¹¹和R¹²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C₆杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成环烷基环或杂环烷基环，其中如果Q为S或O，则与S或O连接的R¹为电子对；

其中每个R³和R⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中x、y和z各自独立地为0-10的整数；

其中G和Q各自独立地为选自CH、O、N和S的原子；

其中m和n各自为0-8的整数；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR¹R²R³)；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在某些优选实施方案中，所述化合物具有以下结构：

在其他实施方案中，本发明涵盖一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂(例如mRNA)或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种将核酸靶向递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂(例如mRNA或siRNA)或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种将核酸靶向递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的本发明的可离子化脂质；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种脂质纳米颗粒，其包含：

i)具有以下结构的化合物：

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种将核酸递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构所涵盖的本发明的可离子化脂质；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种将核酸递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构(例如，下式的化合物)所涵盖的本发明的可离子化脂质；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

在其他实施方案中，本发明涵盖一种将包含治疗性蛋白质、疫苗、基因编辑RNA的治疗剂递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)由式I、II、III、IV、V、VI或VII的结构(例如，具有以下结构的化合物)所涵盖的本发明的可离子化脂质：

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，它们被封装于脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒结合。

IV.附图说明

图1说明使用包含在脂质纳米颗粒中的本发明的可离子化脂质来增强和改善mRNA效力与递送的示例性方法。

图2A说明从pH 7滴定至ph 12的MC3的定制合成的水溶性头部基团的水相pKa以及二甲胺质子经测量以拟合亨德森-哈瑟尔巴赫(Henderson-Hasselbach)方程(HH)从而获得9.45的pKa(类似于由ACDLabs Percepta所预测的9.4)时的化学位移的图。图2B说明5个针对氮烷二基二酯(ADDE)的LNP和2个由MC3和KC2标准制得的LNP从pH 3至pH 10测量的ζ电位的图。图2C说明使用拟合至HH的传统TNS方法测量的LNP pKa。

图3A说明mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。图3B说明在BALB/c小鼠中注射后4小时mRNA Fluc的体内翻译。图3C说明空LNP的cryoTEM图像。

图4说明由本发明的示例性第一代ADDE可离子化脂质所呈现的稳健结合抗体反应。图4A说明通过ELISA评估的SARS-CoV-2 S-特异性IgG。图4B说明针对VSVDG-RFP SARS-CoV-2假病毒的中和抗体。

图5说明空LNP的cryoTEM图像。将不含mRNA的KC2 LNP混合并喷射至pH 4缓冲液中，在pH 7下显示小电子透明结构与电子致密结构。

图6A说明在微流体混合期间脂质和mRNA浓度增加时LNP效力的增加。图6B说明本发明的LNP的体内靶向。

图7说明如实施例1A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图8说明如实施例1B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图9说明如实施例1C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图10说明如实施例1D中示例的基于Presto Blue HS活力试剂的毒性测定的图。

图11说明如实施例2A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图12说明如实施例2B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图13说明如实施例2C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图14说明如实施例3A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图15说明如实施例3B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图16说明如实施例3C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图17说明如实施例3D中示例的基于Presto Blue HS活力试剂的毒性测定的图。

图18说明如实施例4A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图19说明如实施例4B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图20说明如实施例4C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图21说明如实施例5A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图22说明如实施例5B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图23说明如实施例5C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图24说明如实施例5D中示例的在BALB/c小鼠中注射后4小时mRNA Fluc的体内翻译图。

图25说明如实施例6A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图26说明如实施例6B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图27说明如实施例6C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图28说明如实施例7A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图29说明如实施例7B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图30说明如实施例7C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图31说明离子化和电荷的分子和LNP表征图。图31A说明从pH 7滴定至pH 12的MC3的定制合成的水溶性头部基团的水相pKa和经测量以拟合亨德森-哈瑟尔巴赫(HH)方程的DMA质子的化学位移。图31B说明5个ADDE LNP和2个用MC3和KC2标准制成的LNP从pH 3至pH10测量的ζ电位。图31C说明使用拟合至HH方程的TNS(由于与LNP的结合)的传统荧光增强测量的LNP pKa。

图32说明荧光素酶报告基因的体外和体内表达。图32A说明以每孔25-200ng的剂量在含有12k细胞的含血清培养基中以5个ADDE LNP以及MC3和KC2 LNP递送至HEK 293细胞的Fluc mRNA。图32B说明通过IM注射在BALB/c小鼠中递送的2.5μg Fluc mRNA(含有MC3和KC2的LNP在肝脏中呈现出脱靶系统表达，而DL-ADDE LNP则靶向表达至肌肉和引流淋巴结(参见离体)。图32C说明使用CryoTEM成像的包含KC2的LNP，显示球形LNP的直径对应于通过DLS所测量的65nm的数量尺寸的直径。

图33A说明ADDE可离子化脂质用0.3mg(绿色)和10mg(蓝色)S-2P mRNA编码的免疫原以4种不同LNP在第0周和第3周免疫的BALB/c小鼠(n＝5只/组)中引起稳健结合抗体反应，并通过ELISA评估SARS-CoV-2S特异性IgG。图33B说明针对VSVΔG-RFP SARS-CoV-2假病毒的中和抗体。

图34说明如实施例8A中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图35说明如实施例8B中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图36说明如实施例8C中示例的LNP电荷、pKa和Pi的ζ电位图。

图37说明如实施例8D中示例的LNP pKa的TNS测定的图。

图38说明如实施例9A中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图39说明如实施例9B中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图40说明在肌内(I.M.)注射的小鼠中IM施用5ug经封装的mRNA后的体内萤火虫荧光素酶表达。图40A从左到右(MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示4小时体内成像(左组1，右组2)。图40B说明在肌肉和肝脏中的存在，从左到右(MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示在肌内施用之后的全身分布和局部浓度。图40C从左到右(MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示24小时体内成像(左组1，右组2)。图40D说明在肌肉和肝脏中的存在，从左到右(MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ)展示在肌内施用之后的全身分布和局部浓度。图40E说明在肌内施用之后MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ的样品的分布。图40F说明在肌内施用之后MC3的样品的分布。图40G说明在肌内施用之后DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ的样品的分布。图40H说明在肌内施用之后BODD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ的样品的分布。

图41说明如实施例10A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图42说明如实施例10B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图43说明如实施例10C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图44说明如实施例11A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图45说明如实施例11B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图46说明如实施例11C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图47说明如实施例12B中所示例使用萤火虫荧光素酶测定的基于体外效力的稳定性测定的图。

图48说明如实施例12C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图49说明如实施例13A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图50说明如实施例13B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图51说明如实施例13C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图52说明如实施例14A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定的图。

图53说明如实施例14B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图54说明如实施例14C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图55说明如实施例15A中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图56说明如实施例15B中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图57A至图57I说明示例性可离子化脂质制剂BODD C2C4 PipZ在高1.5mg/ml mRNA混合浓度下用于快速微流体混合，与标准混合浓度为0.2mg/ml的参考脂质MC3相比，显示出高的体内递送效率和效力。

图58说明如实施例16A中示例的体内免疫原性终点ELISA抗RBD滴度–图58A(加强前)，图58B(加强后)。

图59说明如实施例16B中示例的假中和测定的体内免疫原性FRNT50滴度。

图60说明如实施例17A中所示例的针对病毒挑战的体内保护-在挑战模型中的存活比例、重量和温度；图60A(存活比例：MC3-SR)；图60B(存活比例：BODD C2C4 PipZ-HO)

图61A至图61D说明如实施例17B中所示例在挑战模型中的体内重量和温度。

图62说明如实施例18A中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图63说明如实施例18B中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图64A至图64H说明如实施例18C中所示例在IM施用中的体内萤火虫荧光素酶表达。图64I-J说明优于MC3标准的本发明的多种第二代可离子化脂质在IM(图64I)和IV(图64J)施用时的体内筛选。

图65和图66说明如实施例19A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。

图67说明如实施例19B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图68说明如实施例19C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图69说明如实施例20A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。

图70说明如实施例20B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图71说明如实施例20C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图72说明如实施例21A中示例的mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。

图73说明如实施例21B中示例的mRNA封装效率的Ribogreen测定的图。

图74说明如实施例21C中示例的LNP尺寸的动态光散射(白点为PDI右y轴)的图。

图75和图76说明如实施例22A中所示例在IM施用时注射部位的体内萤火虫荧光素酶表达的结果。

图77和图78说明如实施例22B中所示例在IM施用时注射部位的离体萤火虫荧光素酶表达的结果。

图79和图80说明如实施例23A中所示例在IM施用时注射部位的体内萤火虫荧光素酶表达的结果。

图81、图82和图83说明如实施例23B中所示例在IM施用时注射部位的离体萤火虫荧光素酶表达的结果。

图84A至图84F说明多质子C24可离子化脂质在LNP中产生多级质子化和在胞内体pH范围内产生比MC3 LNP更大的质子化的结果以及MC3 LNP与C24 LNP之间的比较数据。

图85A至图85C说明C24和MC3脂质纳米颗粒的结构特性的影响。图85A至图85C说明空LNP。

图86A至图86F说明在Balb/c小鼠中肌内(IM)施用后荧光素酶表达的结果，展示与MC3相比，C24 LNP显著更高的中靶mRNA表达和更低的脱靶mRNA表达。

图87A至图87E说明在Balb/c小鼠的免疫原性研究中C24 LNP产生比MC3 LNP高10倍的结合和假中和抗体滴度的结果。

图88A至图88I说明C24 LNP，它们在低剂量的S2P免疫原下对致命的SARS-CoV-2挑战具有保护作用，并完全消除肺部感染。图88B至图88I说明MC3和C24 LNP的比较数据。

图89A至图89I说明C24的局部注射部位炎症低于MC3 mRNA LNP。

图90A至图90F说明C24和MC3 LNP的生物活性和mRNA完整性，它们在4℃下稳定，但在2周内在较高温度下会下降。

图91说明在用含有mRNA编码的S2P免疫原的C24和MC3 LNP下以0.1至1.0μg范围内的剂量进行初免-加强疫苗接种后第0天接受致死挑战的K18-hACE2小鼠的重量和温度效应。

图92说明在微流体混合期间脂质和mRNA浓度增加时LNP效力和胞内体质子化增加。图92A)以更高浓度组装的KC2 LNP在体外以25-200ng/含有12k HEK293细胞的孔的相同剂量产生更高的Fluc表达。图92B)在更高混合浓度下产生并在50μL中稀释至恒定5μg剂量以供IM注射的LNP(混合时以mM为单位的总脂质浓度示于动物上方)是更有效的(彩色条是以107p/sec/cm2/sr计的辐射)。图92C)对于通过高浓度混合制备的LNP，当pH从7.4下降至5时，ζ电位测量揭示质子化增加更多，表明更多的胞内体释放。

图93说明LNP性能的决定因素，这些因素将在体外和动物模型中进行测量、建模并与递送效率、靶向性、毒性和反应原性相关。

图94说明示例性BODD PipZ类型的可离子化脂质。这个家族的12个成员用不同的碳间隔基合成，以产生具有跨越2点范围的分子大离子化常数(如上面的N上所示)的可离子化脂质，以表征所得LNP电荷和胞内体质子化，并将这些特征与递送效率和靶向性相关联。

图95说明带负电的LNP减少肝脏表达并增加脾脏中的表达。在mRNA LNP组装之前，阴离子脂质18-1PA以15％和30％的总脂质添加至脂质混合物中。以15％的总脂质添加18-1PA会减少FLuc的肝脏表达，并在IV施用后将脾脏表达增加2.5倍。

图96说明在标准浓度(A、B中0.2mg/ml mRNA)和高浓度(C、D中1.5mg/ml mRNA)下Fluc LNP的组装在以1:2v/v的乙醇/水中喷射(A,C)后或在PBS中透析至pH 7.4(B,D)后进行成像。在高混合浓度下产生的高效mRNA LNP在混合后立即显示出更高水平的融合结构(C对比A)，在透析后转化为更均匀的LNP。

V.具体实施方式

V.1.定义

除非另有定义，或者除非具体上下文另有要求，否则本文所用的所有技术术语都具有与相关技术领域的技术人员通常所理解的相同的含义。

在数字上下文中的百分比应理解为相对于各个项目的总数。在其他情况下，除非上下文另有说明，否则百分比应理解为重量百分比(wt.-％)或摩尔百分比(mol.-％)。

除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”应理解为包括复数个所指物。表述“一实施方案”、“一具体实施方案”、“一个实施方案”等意指一特定特征、性质或特性，或者特征、性质或特性的一特定组或组合(当与相应表述组合提及时)存在于本发明的至少一个实施方案中。在本说明书通篇的各个地方出现的这些表述不一定指代相同的实施方案。此外，特定特征、性质或特性可在一个或多个实施方案中以任何适合的方式组合。

如本文所用，“适应性免疫系统”由消除或阻止病原体生长和复制的高度特化的全身细胞和过程组成。适应性免疫反应为脊椎动物免疫系统提供识别和记忆特定病原体(例如，以产生免疫力)并在每次遇到病原体时发动更强大的攻击的能力。由于体细胞超突变(体细胞突变频率增加的过程)和V(D)J重组(抗原受体基因链段的不可逆基因重组)，所以所述系统具有高度的适应性。这种机制允许少数基因产生大量不同的抗原受体，然后在每个单独的淋巴细胞上独特地表达。由于基因重排造成每个细胞的DNA发生不可逆的变化，因此所述细胞的所有后代(progeny/offspring)将继承编码相同受体特异性的基因，包括记忆B细胞和记忆T细胞，它们为长效特异性免疫的关键。免疫网络理论是一种关于适应性免疫系统如何工作的理论，其是基于T细胞、B细胞受体的可变区与由具有可变区的T细胞和B细胞产生的分子的可变区之间的相互作用。如本文所用，术语“适应性免疫反应”通常应理解为抗原特异性的。抗原特异性允许产生专门针对特定抗原、病原体或病原体感染细胞的反应。通过“记忆细胞”在体内维持发动这些定制反应的能力。如果病原体不止一次感染身体，则这些特定的记忆细胞便用于快速消除它。在此上下文中，适应性免疫反应的第一步为活化幼稚抗原特异性T细胞或不同的免疫细胞，这些细胞能够通过抗原呈递细胞诱导抗原特异性免疫反应。这发生在幼稚T细胞不断通过的淋巴组织和器官中。可充当抗原呈递细胞的细胞类型尤其是树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每种在引发免疫反应方面均具有独特的功能。树突状细胞通过吞噬作用和巨胞饮作用摄取抗原，并通过与例如外来抗原接触而经刺激以迁移至局部淋巴组织，在此它们分化为成熟的树突状细胞。巨噬细胞摄取微粒抗原如细菌，并由传染原或其他适当的刺激物诱导以表达MHC分子。B细胞经由其受体结合和内化可溶性蛋白抗原的独特能力对于诱导T细胞也是重要的。在MHC分子上呈递抗原会导致T细胞活化，从而诱导它们增殖并分化为经武装的效应T细胞。效应T细胞最重要的功能是CD8+细胞毒性T细胞对感染细胞的杀灭和Th1细胞对巨噬细胞的活化，它们共同构成细胞介导的免疫，以及Th2和Th1细胞对B细胞的活化以产生不同种类的抗体，从而驱动体液免疫反应。T细胞经由它们的T细胞受体识别抗原，T细胞受体不直接识别和结合抗原，而是识别(例如病原体衍生的蛋白抗原的)短肽片段，这些抗原与其他细胞表面上的MHC分子结合。

如本文所用，最广泛意义上的术语“佐剂或佐剂组分”通常为(例如，药用或免疫)剂或组合物，其可修饰(例如增强)其他剂如药物或疫苗的功效。常规地，所述术语在本发明的上下文中是指用作免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。它应从广义上解释，并且是指能够增加掺入或与所讨论佐剂共施用的抗原的免疫原性的广谱物质。在本发明的上下文中，佐剂优选将增强本发明活性剂的特定的免疫原性作用。通常，“佐剂”或“佐剂组分”具有相同含义并且可相互使用。佐剂可分为例如免疫增强剂、抗原递送系统或甚至其组合。如本文所用，术语“佐剂”通常应理解为不包括自身赋予免疫力的剂。佐剂非特异性地辅助免疫系统增强抗原特异性免疫反应，这通过例如促进抗原向免疫系统呈递或诱导非特异性先天性免疫反应来实现。此外，佐剂优选可通过例如将占优势的基于Th2的抗原特异性反应转变为更基于Th1的抗原特异性反应来例如调节抗原特异性免疫反应，反之亦然。因此，佐剂可有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫反应类型等。

如本文所用，术语“烷基”意指饱和、单价无支链或支链(被取代或未被取代的)烃链。烷基的实例包括但不限于(C₁-C₂₂)烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基2-戊基、2,2-二甲基1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基，以及更长烷基，例如庚基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。

如本文所用，术语“烯基”意指其中具有一个或多个双键的单价无支链或支链烃链。烯基的双键可为非共轭的或与另一个不饱和基团共轭。适合的烯基包括但不限于(C₂-C₂₂)烯基，例如乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基。烯基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。

如本文所用，术语“烷氧基”意指-O-烷基，其中烷基如上文中所定义。烷氧基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，烷氧基的烷基链的长度为1至6个碳原子，在本文中称为“(C₁-C₂₂)烷氧基”。

如本文所用，术语“烷氧羰基”意指式-C(O)-烷氧基的单价基团。优选地，烷氧羰基的烃链的长度为1至22个碳原子。

如本文所用，术语“炔基”意指在其中具有一个或多个三键的单价无支链或支链烃链。炔基的三键可为非共轭的或与另一个不饱和基团共轭。适合的炔基包括但不限于(C₂-C₆)炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基和4-丁基-2-己炔基。炔基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。

如本文所用，在本发明的上下文中，“抗原”通常是指可由免疫系统(优选由适应性免疫系统)识别并且能够触发抗原特异性免疫反应(例如，通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫反应的一部分)的物质。通常，抗原可为或可包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。在本发明的意义上，抗原可为所提供的核酸分子(优选如本文所定义的mRNA)的翻译产物。在此上下文中，包含至少一个表位的肽和蛋白质的片段、变体和衍生物也应理解为抗原。

如本文所用，在本发明的上下文中的术语“提供抗原的mRNA”通常可为具有至少一个开放阅读框的mRNA，所述开放阅读框可由具有所述mRNA的细胞或生物翻译。此翻译的产物为一种肽或蛋白质，其可充当抗原，优选充当免疫原。产物也可为由超过一种免疫原构成的融合蛋白(例如，由两个或更多个源自相同或不同病毒蛋白的表位、肽或蛋白质组成的融合蛋白)，其中表位、肽或蛋白质可由接头序列连接。

如本文所用，术语“人工mRNA(序列)”通常可理解为非天然存在的mRNA分子。换言之，人工mRNA分子可理解为非天然mRNA分子。此类mRNA分子可为非天然的，由于其单独的序列(并非天然存在的)和/或由于其他修饰，例如并非天然存在的核苷酸的结构修饰。通常，人工mRNA分子可通过基因工程方法设计和/或产生以对应于期望的人工核苷酸序列(异源序列)。在此情况下，人工序列通常是可能并非天然存在的序列，即它与野生型序列有至少一个核苷酸不同。术语“野生型”可理解为自然界中存在的序列。此外，术语“人工核酸分子”不限于表示“一个单一分子”，而是通常应理解为包含相同分子的集合。因此，它可能涉及包含在等分试样中的多个相同分子。

如本文所用，术语“芳基”意指包含碳原子和氢原子的单环或多环芳族基团。适合的芳基的实例包括但不限于苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、甘菊环基(azulenyl)和萘基，以及苯并稠合碳环部分，例如5,6,7,8-四氢萘基。芳基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，芳基为单环，其中所述环包含6个碳原子，在本文中称为“(C₆)芳基”。

如本文所用，术语“芳氧基”意指-O-芳基，其中芳基如上所定义。芳氧基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，芳氧基的芳环为单环，其中所述环包含6个碳原子，在本文中称为“(C₆)芳氧基”。

如本文所用，术语“B细胞表位”通常是位于如本文所定义的(天然)蛋白质或肽抗原的外表面上的片段，优选具有5至15个氨基酸、更优选具有5至12个氨基酸、甚至更优选具有6至9个氨基酸，其可由抗体识别，即以其天然形式。蛋白质或肽的此类表位还可选自本文提及的此类蛋白质或肽的任何变体。在此上下文中，抗原决定基可为构象或不连续表位，其是由本文所定义的蛋白质或肽的链段构成，这些片段在本文所定义的蛋白质或肽的氨基酸序列上是不连续的，但在三维结构上聚集在一起；或为由单一多肽链构成的连续或线性表位。

如本文所用，术语“苄基”意指-CH₂-苯基。

如本文所用，术语“双/多顺反子mRNA”是通常可具有两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框(ORF)(编码区或编码序列)的mRNA。在此上下文中，开放阅读框是可经翻译成肽或蛋白质的若干核苷酸三联体(密码子)的序列。此类mRNA的翻译产生两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)不同翻译产物(如果ORF不相同)。为了在真核生物中表达，此类mRNA可例如包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。

如本文所用，术语“CAP类似物”是指具有CAP功能性的非可聚合二核苷酸，因为其促进翻译或定位和/或在掺入RNA分子的5'端时防止RNA分子降解。非可聚合意指CAP类似物将仅在5'末端处并入，因为它不具有5'三磷酸，并且因此不能通过模板依赖性RNA聚合酶在3'-方向上延伸。在某些实施方案中，5'-帽类似物利用Trilink BiotecchnologiesCleanCap Technology-https://www.trilinkbiotech.com/cleancap。如本文所用，术语“CAP类似物”包括但不限于选自由以下组成的组的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的CAP类似物(例如GpppG)；二甲基化的CAP类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化的CAP类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化的对称CAP类似物(例如m7Gpppm7G)或抗反向CAP类似物(例如ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸衍生物)(Stepinski等人,2001.RNA 7(10):1486-95)。其他CAP类似物先前已有描述(美国专利第7,074,596号、WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)，其通过引用整体并入本文。N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸CAP类似物的合成近期已有描述(Kore等人,(2013)Bioorg.Med.Chem.21(15):4570-4)，其通过引用整体并入本文。如本文所用，术语“5'-CAP结构”通常是添加至mRNA分子5'端的经修饰的核苷酸(CAP类似物)，特别是鸟嘌呤核苷酸。优选地，使用5′-5′-三磷酸键(也称为m7GpppN)添加5′-CAP。5′-CAP结构的其他实例包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4′,5′亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏-呋喃戊糖基核苷酸、非环3',4'-第二核苷酸、非环3,4-二羟基丁基核苷酸、非环3,5二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向无碱基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。这些经修饰的5′-CAP结构可在本发明的上下文中用于修饰本发明组合物的mRNA序列。可在本发明的上下文中使用的进一步修饰的5'-CAP结构是CAP1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化)、CAP2(m7GpppN下游第2个核苷酸的核糖的额外甲基化)、CAP3(m7GpppN下游第3个核苷酸的核糖的额外甲基化)、CAP4(m7GpppN下游第4个核苷酸的核糖的额外甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物)、经修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。在本发明的上下文中，还可使用cCAP类似物在化学RNA合成或RNA体外转录(共转录加帽)中形成5'-CAP结构，或者可使用加帽酶(例如市售加帽试剂盒)在体外形成CAP结构。

如本文所用，“氨甲酰基”意指基团-C(O)N(R′)₂，其中R′选自由氢、烷基和芳基组成的组。

如本文所用，“羰基”是式-C＝(O)-的二价基团。

如本文所用，本发明的上下文中的术语“载体”通常可为促进另一种化合物的运输和/或复合的化合物。所述载体可与所述其他化合物形成复合物。聚合载体是由聚合物形成的载体。

除非从特定上下文中清楚不同的含义，否则术语“阳离子的”意指相应结构带有正电荷，永久地或非永久地，但响应于某些条件如pH。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化”。如本文所用，“永久阳离子的”意指相应化合物或基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电。通常，正电荷是由季氮原子的存在引起的。当化合物带有多个此类正电荷时，它可称为永久多阳离子，其为永久阳离子的子类。

如本文所用，术语“细胞免疫/细胞免疫反应”通常涉及巨噬细胞、自然杀手细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化，以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。更一般来说，细胞免疫与抗体无关，而是与免疫系统细胞的活化有关。细胞免疫反应的特征在于例如活化抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，这些T淋巴细胞能够诱导在其表面上显示抗原表位的体细胞的凋亡，例如病毒感染的细胞、具有胞内细菌的细胞和显示肿瘤抗原的癌细胞；激活巨噬细胞和自然杀手细胞，使它们能够消灭病原体；和刺激细胞分泌多种细胞因子，这些细胞因子会影响其他参与适应性免疫反应和先天性免疫反应的细胞的功能。

在本发明的上下文中，“组合物”是指其中指定成分可任选地与任何其他成分(通常与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂)一起掺入的任何类型的组合物。因此，组合物可为干式组合物如粉末或颗粒，或固体单元如冻干形式或片剂。或者，组合物可呈液体形式，并且每种成分可以溶解或分散(例如悬浮或乳化)形式独立地掺入。在优选实施方案的一者中，组合物被配制成无菌固体组合物，例如粉末或冻干形式，以便用含水液体载体重构。对于包含如下文进一步详细描述的核酸货物的那些形式的组合物，此类制剂也是优选的。

如本文所用，“化合物”意指化学物质(例如，本发明的可离子化脂质)，其为由具有基本上相同的化学结构和性质的分子组成的材料。对于小分子化合物，分子在其原子组成和结构构型方面通常是相同的。对于大分子或聚合化合物，化合物的分子高度相似，但不一定全部相同。例如，称为由50个单体单元组成的聚合物链段还可含有单个分子，例如具有48或53个单体单元。

除非上下文另有指示或要求，否则“包含”和类似表述在本说明书和权利要求中应在开放和包容的意义上解释为“包括但不限于”。

如本文所用，术语“环烷基”意指包含碳和氢原子并且不具有碳-碳多重键的单环或多环饱和环。环烷基的实例包括但不限于(C₃-C₇)环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基，以及饱和环状和双环萜烯。环烷基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，环烷基为单环或双环。

如本文所用，术语“肽或蛋白质的衍生物”通常应理解为一种分子，所述分子衍生自另一分子例如所述肽或蛋白质。肽或蛋白质的“衍生物”还涵盖包含用于本发明中的肽或蛋白质的融合物。例如，融合物包含标记物，例如表位，例如FLAG表位或V5表位。例如，表位为FLAG表位。此类标签适用于例如纯化融合蛋白。

如本文所用，术语“表位(也称为“抗原决定基”)：是指T细胞表位或蛋白质的部分在本发明的上下文中可包含优选具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度的片段，例如由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸、例如8、9或10个(或甚至11或12个氨基酸)的长度；或由MHC II类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个或更多个氨基酸、例如13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个氨基酸的长度，其中这些片段可选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以由肽片段和MHC分子组成的复合物形式由T细胞识别。

如本文所用，术语蛋白质或肽的“片段”在本发明的上下文中通常可包含如本文所定义的蛋白质或肽的序列，即就其氨基酸序列(或其编码核酸分子)而言，与原始(天然)蛋白质(或其编码核酸分子)的氨基酸序列相比，N末端和/或C末端经截短。因此，此种截短可发生在氨基酸层面上或相应地发生在核酸层面上。因此，关于如本文所定义的此类片段的序列同一性优选可指如本文所定义的完整蛋白质或肽或此类蛋白质或肽的完整(编码)核酸分子。在此上下文下，蛋白质的片段通常可包含与相应的天然存在的全长蛋白质的氨基酸序列具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％和最优选至少95％或甚至97％的序列同一性的氨基酸序列。

如本文所用，在本发明的上下文中的术语“蛋白质或肽的片段”还可包含如本文所定义的蛋白质或肽的序列，其具有例如至少5个氨基酸的长度，优选长度为至少6个氨基酸，优选至少7个氨基酸，更优选至少8个氨基酸，甚至更优选至少9个氨基酸；甚至更优选至少10个氨基酸；甚至更优选至少11个氨基酸；甚至更优选至少12个氨基酸；甚至更优选至少13个氨基酸；甚至更优选至少14个氨基酸；甚至更优选至少15个氨基酸；甚至更优选至少16个氨基酸；甚至更优选至少17个氨基酸；甚至更优选至少18个氨基酸；甚至更优选至少19个氨基酸；甚至更优选至少20个氨基酸；甚至更优选至少25个氨基酸；甚至更优选至少30个氨基酸；甚至更优选至少35个氨基酸；甚至更优选至少50个氨基酸；或最优选至少100个氨基酸。例如，此类片段可具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸、例如8、9或10个(或甚至6、7、11或12个氨基酸)的长度；或由MHC II类分子加工和呈递的片段，优选具有约13个或更多个氨基酸、例如13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个氨基酸的长度，其中这些片段可选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以由肽片段和MHC分子组成的复合物形式由T细胞识别，即，所述片段通常不会以其天然形式被识别。蛋白质或肽的片段可包含那些蛋白质或肽的至少一个表位。此外，蛋白质的结构域，如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白质的缩短或截短形式还可理解为包含蛋白质的片段。

如本文所用，如本文所用的术语“全长蛋白质”通常是指基本上包含天然存在的蛋白质的完整氨基酸序列的蛋白质。然而，氨基酸的取代(例如由于蛋白质中的突变所致)也涵盖在术语全长蛋白质中。

如本文所用，“卤素”意指氟、氯、溴或碘。因此，术语“卤基”和“Hal”的含义涵盖氟、氯、溴和碘。

如本文所用，术语“杂芳基”意指包含碳原子、氢原子以及一个或多个杂原子、优选1至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的单环或多环芳族环。杂芳基的说明性实例包括但不限于吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡唑基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基和(1,2,4)-三唑基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、苯基、异噁唑基和噁唑基。杂芳基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，杂芳基为单环，其中环包含2至5个碳原子和1至3个杂原子，在本文中称为“(C₂-C₅)杂芳基”。

如本文所用，术语“杂环烷基”意指包含碳原子和氢原子以及至少一个杂原子，优选1至3个选自氮、氧和硫的杂原子并且不具有不饱和度的单环或多环。杂环烷基的实例包括吡咯烷基、N-吡咯烷基、哌啶基、N-哌啶基、哌嗪基、N-哌嗪基、吗啉基、N-吗啉基、硫代吗啉基、二氧戊环基、N-硫代吗啉基和吡喃基。杂环烷基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代。优选地，杂环烷基为单环或双环，更优选为单环，其中所述环包含3至6个碳原子和1至3个杂原子，在本文中称为(C₁-C₆)杂环烷基。

如本文所用，术语“杂环基团”或“杂环”是指杂环烷基或杂芳基。

如本文所用，术语“体液免疫”通常是指抗体产生和可伴随其的辅助过程。体液免疫反应的典型特征可为例如Th2活化和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成。体液免疫通常还可指抗体的效应功能，包括病原体和毒素中和、经典补体活化和调理素促进吞噬作用和病原体消除。

如本文所用，术语“水合物”意指本发明的化合物或其盐，其进一步包括化学计量或非化学计量的量的经由非共价分子间力结合的水。术语水合物包括溶剂化物，其为化学计量或非化学计量的量的经由非共价分子间力结合的溶剂。优选溶剂是挥发性的、无毒的和/或为以痕量向人类施用可接受的。

如本文所用，术语“烃基”意指选自(C₁-C₂₂)烷基、(C₂-C₂₂)烯基和(C₂-C₈)炔基的单价基团，任选地被一个或两个适合的取代基取代。优选地，烃基的烃链长度为1至22个碳原子，在某些情况下在本文中称为“(C₁-C₂₂)烃基”。

如本文所用，术语“序列同一性”意指两个序列(例如，如本文所定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由如本文所定义的聚合载体的核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身)相同的百分比，可比对序列以便随后进行相互比较。因此，例如可将第一序列的位置与第二序列的相应位置进行比较。如果第一序列中的某位置与第二序列中的某位置一样由相同组分(残基)占据，则两个序列在此位置上是相同的。如果并非这种情况，则此位置处的序列不同。如果与第一序列相比，在第二序列中发生插入，则可将空位插入第一序列中以允许进一步比对。如果与第一序列相比，在第二序列中出现缺失，则可将空位插入第二序列中以允许进一步比对。两个序列相同的百分比为相同位置的数量除以包括仅在一个序列中被占据的那些位置的位置总数的函数。可使用数学算法判定两个序列相同的百分比。可使用的数学算法的优选但非限制性实例为Karlin等人,(1993),PNAS USA,90:5873-5877或Altschul等人,(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。此类算法集成在BLAST程序中。通过此程序可鉴定与本发明的序列在一定程度上相同的序列。

如本文所用，术语“免疫系统”可保护生物免受感染。如果病原体突破生物的物理屏障并进入此生物，则先天性免疫系统会提供立即但非特异性反应。如果病原体逃避此先天反应，则脊椎动物会拥有第二层保护，即适应性免疫系统。在此，免疫系统在感染期间调整其反应以提高其对病原体的识别。这种改进的反应会在病原体被清除后以免疫记忆形式保留下来，并允许适应性免疫系统在每次遇到此病原体时发起更快且更强的攻击。据此，免疫系统包含先天性免疫系统和适应性免疫系统。所述两个部分各自含有所谓的体液和细胞组分。

如本文所用，术语“免疫反应”通常可为适应性免疫系统对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫反应)或先天性免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天性免疫反应)。本发明涉及适应性免疫系统的特异性反应(适应性免疫反应)的核心。特别是，它涉及对病毒(如例如流感病毒)感染的适应性免疫反应。然而，此特异性反应可得到额外的非特异性反应(先天性免疫反应)的支持。因此，本发明还涉及用于同时刺激先天性和适应性免疫系统以引起有效的适应性免疫反应的化合物。

如本文所用，在本发明的上下文中的术语“免疫刺激性RNA(isRNA)”通常可为能够自身诱导先天性免疫反应的RNA。它通常不具有开放阅读框，并且因此不提供肽抗原或免疫原，但会例如通过与特定种类的Toll样受体(TLR)或其他合适的受体结合而引发先天性免疫反应。然而，当然，具有开放阅读框并编码肽/蛋白质(例如抗原功能)的mRNA也可诱导先天性免疫反应。

如本文所用，术语“流感大流行或大流行性流感”可在非人类(新型)流感病毒获得有效和持续的人际传播能力并且然后在全球传播时出现。具有引起大流行潜力的流感病毒被称为“具有大流行潜力的流感病毒”或“大流行性流感病毒”。具有大流行潜力的流感病毒的实例包括甲型禽流感(H5N1)和甲型禽流感(H7N9)，它们是两种不同的“禽流感”病毒。它们是非人类病毒(即它们在人类中为新颖病毒，并且在世界部分地区的鸟类中传播)，因此人类对这些病毒几乎没有免疫力。人类感染这些病毒的情况很少发生，但如果这些病毒中的任一种发生变化，使其能够轻易感染人类并易于在人与人之间传播，则可能导致流感大流行。

如本文所用，术语“先天性免疫系统”也称为非特异性免疫系统，包含以非特异性方式保护宿主免受其他生物感染的细胞和机制。这意味着先天系统的细胞以通用方式识别病原体并对其做出反应，但与适应性免疫系统不同的是，它不会赋予宿主以持久或保护性免疫。先天性免疫系统可例如由病原体相关分子模式(PAMP)受体的配体活化，例如Toll样受体(TLR)或其他辅助物质，例如脂多糖、TNF-α、CD40配体或细胞因子、单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子和hGH；人类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配体；鼠类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配体；NOD样受体的配体、RIG-I样受体的配体、免疫刺激性核酸、免疫刺激性RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗细菌剂或抗病毒剂。典型地，先天性免疫系统的反应包括经由产生化学因子(包括称为细胞因子的专门的化学介质)将免疫细胞募集至感染部位；补体级联的活化；经由专门的白细胞鉴定并去除器官、组织、血液和淋巴中存在的外来物质；经由称为抗原呈递的过程激活适应性免疫系统；和/或充当传染原的物理和化学屏障。

如本文所用，术语“可离子化”(例如，如在术语“本发明的可离子化脂质”中所用)意指化合物或基团或原子在其环境的某个pH值下带电而在其环境的另一pH值下不带电。同样，在无法判定pH值的非水性环境中，可离子化的化合物、基团或原子在氢离子浓度高时带正电，而在氢离子浓度或活性低时带负电或不带电。其取决于可离子化或可多离子化化合物的个别特性，特别是相应可离子化基团或原子的pKa，在所述pH或氢离子浓度下它带电或不带电。在经稀释的水性环境中，可使用本领域技术人员熟知的所谓的亨德森-哈瑟尔巴赫方程估计带有电荷的可离子化化合物、基团或原子的分率。例如，在一些实施方案中，如果化合物或部分是可离子化的，则优选的是其在以下条件下带正电：约1至9、优选4至9、5至8或甚至6至8的pH值下，更优选等于或低于9、等于或低于8、等于或低于7的pH值下，最优选在生理pH值，例如约7.3至7.4下，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下。在其他实施方案中，可离子化化合物或部分在生理pH值(例如约7.0-7.4)下主要是中性的，但在较低pH值下带正电。在一些实施方案中，可阳离子化的化合物或部分的优选pKa范围为约5至约7。

如本文所用，短语“本发明的可离子化脂质”意指本文所公开的化合物，包括本文所公开的可离子化脂质纳米颗粒化合物。本发明的特定化合物是式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体的混合物。因此，“本发明的可离子化脂质”统称为式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体的混合物。本发明的可离子化脂质在本文中由它们的化学结构和/或化学名称鉴定。当化合物由化学结构和化学名称两者提及并且化学结构与化学名称冲突时，以化学结构为主。术语“本发明的可离子化脂质”通常是指能够带电的分子，其例如在通常约1至9的pH值下带正电(阳离子)。在一些实施方案中，阳离子组分/化合物优选在等于或低于9(例如5至9)、等于或低于8(例如5至8)、等于或低于7(例如5至7)的pH值下，最优选在生理pH值、例如约7.3至7.4下，以及体细胞pH值、例如约7至5下带电。因此，根据本发明的一个实施方案的阳离子肽、蛋白质、多糖、脂质或聚合物，在某些实施方案中，在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电。在另一个优选实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒、阳离子肽、蛋白质、多糖、脂质或聚合物在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下不带电、具有中性电荷或分别呈电中性的。阳离子肽或蛋白质优选含有更大量的阳离子氨基酸，例如，比其他氨基酸残基更多的Arg、His、Lys或Orn(特别是比阴离子氨基酸残基如Asp或Glu多的阳离子氨基酸)或包含主要由阳离子氨基酸残基形成的嵌段。表述“阳离子”还可指“多阳离子”组分/化合物。阳离子组分/化合物还可指能够带正电的阳离子脂质。示例性阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基团。优选的阳离子脂质是可离子化的，使得它们可取决于pH而以带正电或中性形式存在。在不同pH条件下，阳离子脂质的离子化会影响脂质纳米颗粒(LNP)的表面电荷。这种电荷状态会影响血浆蛋白质吸收、血液清除和组织分布(Semple,S.C.等人,Adv.Drug Deliv Rev 32:3-17(1998))以及形成非双层结构的能力(Hafez,I.M.等人,Gene Ther 8:1188-1196(2001))，这对核酸的胞内递送至关重要。如别处所述，经配制的阳离子脂质的pKa与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人,Angewandte Chemie,国际版(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,NatureBiotechnology 28,172-176(2010))。在本发明的一些实施方案中，pKa的优选范围为约5至约7。在优选实施方案中，本发明的可离子化脂质具有中性电荷，在pH 7附近带有轻微的正电荷或负电荷。本发明的可离子化脂质可含有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此以立体异构体形式存在，例如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映异构体。根据本发明，本文所描绘的化学结构和由此本发明的可离子化脂质涵盖所有相应化合物的对映异构体和立体异构体，即立体异构纯形式(例如几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构体与立体异构体的混合物。当化合物相对于特定手性中心为约90％ee(对映异构过量)或更高、优选等于或大于95％ee时，本发明的可离子化脂质被视为具有光学活性或相对于手性中心呈对映异构富集的(即，基本上呈R型或基本上呈S型)。当化合物相对于特定手性中心具有大于约1％ee、优选大于约5％ee、更优选大于约10％ee的对映异构过量时，本发明的可离子化脂质被视为呈对映异构富集形式。当化合物相对于特定手性中心为约90％de(非对映异构过量)或更高、优选等于或大于95％de时，本发明的可离子化脂质被视为相对于多个手性中心呈非对映异构纯的。当化合物相对于特定手性中心具有大于约1％de、优选大于约5％de、更优选大于约10％de的非对映异构过量时，本发明的可离子化脂质被视为呈非对映异构富集形式。如本文所用，外消旋混合物意指相对于分子中的所有手性中心，约50％的一种对映异构体与约50％的其相应对映异构体。因此，本发明涵盖式I至V化合物的所有对映异构纯、对映异构富集、非对映异构纯、非对映异构富集和外消旋混合物。对映异构体与非对映异构体混合物可通过以下熟知的方法拆分成它们的组分对映异构体或立体异构体：例如手性气相色谱法、手性高效液相色谱法、化合物结晶成手性盐复合物或化合物在手性溶剂中结晶。对映异构体和非对映异构体还可通过熟知的不对称合成方法，由非对映异构或对映异构纯的中间体、试剂和催化剂获得。本发明的可离子化脂质在本文中由它们的化学结构和/或化学名称定义。如果化合物同时由化学结构与化学名称提及并且化学结构与化学名称发生冲突，则化学结构决定化合物的身份。当向患者，例如向用于兽医用途或供改进家畜用的动物，或向用于临床用途的人类施用时，本发明的可离子化脂质以分离形式或作为药物组合物中的分离形式施用。如本文所用，“经分离的”意指本发明化合物与以下的其他组分分离：(a)天然来源，例如植物或细胞，优选细菌培养物，或(b)合成有机化学反应混合物。优选地，经由常规技术纯化本发明的可离子化脂质。如本文所用，“经纯化的”意指当分离时，分离物含有以分离物的重量计至少95％、优选至少98％的本发明的单一羟基化合物。

如本文所用，术语“喷射注射”如本文所用是指无针注射方法，其中迫使含有至少一种本发明的mRNA序列和任选地其他合适赋形剂的流体穿过孔口，从而产生能够穿透哺乳动物皮肤并且根据注射设置，能够穿透皮下组织或肌肉组织的超细高压液体流。原则上，液体流在皮肤上形成一个孔，液体流通过所述孔被推入靶组织。优选地，喷射注射被用于皮内、皮下或肌内注射根据本发明的mRNA序列。在一个优选实施方案中，喷射注射被用于肌内注射根据本发明的mRNA序列。在另一个优选实施方案中，喷射注射被用于皮内注射根据本发明的mRNA序列。

如本文所用，术语“类脂质化合物”，也简称为类脂质，是脂质样化合物，即具有脂质样物理特性的两亲化合物。在本发明的上下文中，术语脂质被视为涵盖类脂质。

如本文所用，术语“微针注射”是指用于跨越各种屏障递送疫苗或其他药物的显微施用器：虽然透皮施用是微针最流行的用途，但眼内和耳蜗内微针药物递送系统正在兴起。微针是通过各种方法构建的，通常涉及光刻工艺或微成型。这些方法包括将显微结构蚀刻于树脂或硅中以铸造微针。微针由多种材料制成，包括硅、钛、不锈钢和聚合物。一些微针由有待递送至身体的药物制成，但经成型成针状，因此它们可穿透皮肤。微针的尺寸、形状和功能各不相同，但均用作其他递送方法如常规皮下注射针或其他注射装置的替代。

如本文所用，术语“单顺反子mRNA”通常可为仅包含一个开放阅读框(编码序列或编码区)的mRNA。在此上下文中，开放阅读框是可经翻译成肽或蛋白质的若干核苷酸三联体(密码子)的序列。

如本文所用，术语“核酸”意指任何DNA或RNA分子。所述术语可用于多核苷酸和/或寡核苷酸。无论在本文中何处提及编码特定蛋白质和/或肽的核酸或核酸序列，所述核酸或核酸序列分别优选还包含调控序列，其允许编码特定蛋白质或肽的核酸序列在合适的宿主(例如人类)中表达，即转录和/或翻译。

如本文所用，术语“核苷修饰”在本发明的上下文中，术语核苷修饰是指包含核苷的mRNA分子或化合物，其通常并非mRNA的一部分，优选为非天然核苷。特别是，所述术语优选是指除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和在一些情况下胸腺嘧啶之外的mRNA核苷。

如本文所用，术语“肽”是至少两种氨基酸单体的寡聚物或聚合物。通常单体经由肽键连接。术语“肽”不限制氨基酸聚合物链的长度。在本发明的一些实施方案中，肽可例如含有少于50个单体单元。较长的肽也称为多肽，通常具有50至600个单体单元，更具体地具有50至300个单体单元。

如本文所述，“核苷”被定义为包含五碳糖分子(戊糖或核糖)或其衍生物和有机碱、嘌呤或嘧啶或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”被定义为由磷酸基团组成的核苷。在一些实施方案中，化学修饰可包括氨基、硫醇基、烷基或卤基。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫基-泽布拉林、2-硫基-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在其他实施方案中，经修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷(wyosine)、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫基-鸟苷、6-硫基-7-脱氮-鸟苷、6-硫基-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫基-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫基-鸟苷、N2-甲基-6-硫基-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫基-鸟苷。

如本文所用，短语“药学上可接受的盐”包括但不限于可存在于本发明化合物中的酸性或碱性基团的盐。本质上呈碱性的化合物能够与各种无机酸和有机酸形成广泛多种盐。可用于制备此类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的那些酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、顺丁烯二酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐、龙胆酸盐、反丁烯二酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、葡萄糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。除上述酸外，包含氨基部分的本发明化合物还可与各种氨基酸形成药学上可接受的盐。本质上呈酸性的本发明化合物能够与各种药理学上可接受的阳离子形成碱盐。此类盐的实例包括碱金属盐或碱土金属盐，并且特别是钙、镁、钠、锂、锌、钾和铁盐。

如本文所用，在本发明的上下文中的术语“药学有效量”通常应理解为足以诱导免疫反应的量。

如本文所用，术语“苯基”意指-C₆H₅。苯基可未被取代或被一个或两个适合的取代基取代，其中所述取代基置换苯基的H。如本文所用，“Ph”表示苯基或被取代的苯基。

如本文所用，前缀“聚-”是指化合物中具有相应特性的多个原子或基团。如果置于括号中，则复数的存在是任选的。例如，(多)阳离子意指阳离子和/或多阳离子。然而，前缀的缺失不应解释为排除多个。例如，多阳离子化合物也是阳离子化合物并且可如此提及。

如本文所用，术语“聚-A-尾”，也称为“3'-聚(A)尾或聚(A)序列”，通常是添加至RNA的3'端上的腺苷核苷酸的长序列，长达约400个腺苷核苷酸，例如约25至约400、优选约50至约400、更优选约50至约300、甚至更优选约50至约250、最优选约60至约250个腺苷核苷酸。此外，聚(A)序列或聚(A)尾可例如使用源自大肠杆菌或酵母的聚(A)聚合酶，通过RNA的酶促多腺苷酸化在体外生成。

如本文所用，术语“多腺苷酸化”通常应理解为将聚(A)序列添加至核酸分子，例如RNA分子，例如至早熟mRNA中。多腺苷酸化可由所谓的多腺苷酸化信号诱导。此信号优选位于有待多腺苷酸化的核酸分子(例如RNA分子)的3'端处的一段核苷酸内。多腺苷酸化信号通常包含由腺嘌呤和尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸组成的六聚物，优选为六聚物序列AAUAAA。还可想到其他序列，优选六聚物序列。多腺苷酸化通常发生在前体mRNA(也称为早熟mRNA)的加工期间。通常，RNA成熟(从前体mRNA至成熟mRNA)包括多腺苷酸化步骤。

如本文所用，术语“聚(C)序列”通常为胞嘧啶核苷酸的长序列，通常具有约10至约200个胞嘧啶核苷酸、优选约10至约100个胞嘧啶核苷酸、更优选约10至约70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选约20至约50或甚至约20至约30个胞嘧啶核苷酸。聚(C)序列优选可位于核酸所包含的编码区的3′处。

如本文所用，术语“蛋白质”通常由折叠成3维形式以促进生物学功能的一种或多种肽和/或多肽组成。

如本文所用，术语“Pyr”、“Pyrd”和“PyrD”可互换使用并且是指吡啶或吡啶基取代基。

如本文所用，RNA涵盖信使RNA与经修饰的信使RNA，以及编码(cRNA)与非编码RNA(ncRNA)，包括管家ncRNA(转移RNA(即tRNA)和核糖体RNA(即rRNA))和调节性ncRNA，其根据它们的大小进一步分类，包括具有至少200个核苷酸的长ncRNA(lncRNA)和具有少于200个核苷酸的小ncRNA，包括微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)。

如本文所用，术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及其中在无细胞系统(体外)中合成RNA的过程。DNA，特别是质粒DNA，被用作生成RNA转录物的模板。RNA可通过适当的DNA模板的DNA依赖性体外转录获得，根据本发明，其优选为线性化质粒DNA模板。用于控制体外转录的启动子可为任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的特定实例为T7、T3和SP6 RNA聚合酶。用于体外RNA转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是对应于有待体外转录的各个RNA的cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体例如质粒DNA中来获得。在本发明的一个优选实施方案中，DNA模板在体外转录前用适合的限制性酶线性化。cDNA可通过mRNA的反转录或化学合成获得。此外，体外合成RNA的DNA模板还可通过基因合成获得。如本文所用，用于体外转录的方法是本领域已知的(参见例如Geall等人,(2013)Semin.Immunol.25(2):152-159；Brunelle等人,(2013)Methods Enzymol.530:101-14)。用于所述方法中的试剂通常包括：

1)线性化DNA模板，其启动子序列对其各自的RNA聚合酶(例如噬菌体编码的RNA聚合酶)具有高结合亲和力；

2)四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTP)；

3)任选地如上定义的CAP类似物(例如，m7G(5′)ppp(5′)G(m7G)或10.1126/scitranslmed.aav5701)：使用带有2'-O-甲基转移酶(ScriptCap，CELLSCRIPT)的m7G加帽试剂盒对RNA进行加帽以获得cap1)；

4)能够与线性化DNA模板内的启动子序列结合的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶)；

5)任选地核糖核酸酶(RNase)抑制剂以灭活任何污染的RNase；

6)任选地焦磷酸酶以降解焦磷酸，焦磷酸会抑制转录；

7)MgCl₂，其提供Mg2+离子作为聚合酶的辅因子；

8)维持适合的pH值的缓冲液，其还可含有最佳浓度的抗氧化剂(例如DTT)和/或多胺如亚精胺。

如本文所用，术语“稳定的核酸，优选mRNA”通常呈现出增强对体内降解(例如通过外切或内切核酸酶的降解)和/或离体降解(例如通过疫苗施用之前的制造过程，例如在有待施用的疫苗溶液的制备过程中的降解)的抗性的修饰。例如，可通过提供5'-CAP-结构、聚-A-尾或任何其他UTR修饰来实现RNA的稳定化。其还可通过化学修饰或核酸的G/C含量的修饰来实现。各种其他方法是本领域中已知的并且在本发明的上下文中可想到。

如本文所用，“基本上”包含化合物的组合物意指所述组合物含有大于约80重量％、更优选大于约90重量％、甚至更优选大于约95重量％、并且最优选大于约97重量％的所述化合物。

如本文所用，“基本上完成”的反应意指所述反应含有大于约80重量％的所需产物、更优选大于约90重量％的所需产物、甚至更优选大于约95％重量％的所需产物、并且最优选大于约97重量％的所需产物。

如本文所用，“基本上不含”化合物的组合物意指所述组合物含有小于约20重量％、更优选小于约10重量％、甚至更优选小于约5重量％、并且最优选小于约3重量％的所述化合物。

如本文所用，“被取代的”或“取代基”各自意指不会使本发明化合物或适用于制备它们的中间体的合成或药学效用无效的基团。适合的取代基的实例包括但不限于：-NH₂；CN；卤基；杂环烷基；杂环芳基；(C₁-C₂₂)烷基；(C₂-C₂₂)烯基；(C₂-C₂₂)炔基；(C₆)芳基；(C₂-C₅)杂芳基；(C₃-C₇)环烷基；(C₁-C₈)烷氧基；(C₆)芳氧基；-CN；-OH；氧代基；卤基；-CO₂H；-NH₂；-NH((C₁-C₂₂)烷基)；-N((C₁-C₂₂)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-CHO；-CO((C₁-C₂₂)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)或可充当适合的取代基的本文所鉴定的任何基团。本领域技术人员可易于根据本发明化合物的稳定性以及药理和合成活性选择合适的取代基。

如本文所用，术语“5'末端寡嘧啶束(TOP)”通常是位于核酸分子的5'末端区，例如某些mRNA分子的5'末端区或功能实体的5'末端区(例如，某些基因的转录区)的一段嘧啶核苷酸。所述序列以通常对应于转录起始位点的胞苷开始，并且接着是一段通常约3至30个嘧啶核苷酸的序列。例如，TOP可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或甚至更多个核苷酸。嘧啶段和由此5'-TOP在位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸的5'处以一个核苷酸终止。含有5'末端寡嘧啶束的信使RNA通常称为TOP mRNA。因此，提供此类信使RNA的基因被称为TOP基因。TOP序列已例如见于编码肽延伸因子和核糖体蛋白的基因和mRNA中。

如本文所用，术语“TOP基序”是对应于如上所定义的5'-TOP的核酸序列。因此，在本发明的上下文中的TOP基序优选是一段长度为3-30个核苷酸的嘧啶核苷酸。优选地，TOP基序由至少3个嘧啶核苷酸、优选至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个核苷酸、更优选至少7个核苷酸、最优选至少8个嘧啶核苷酸组成，其中嘧啶核苷酸段优选在其5'端以胞嘧啶核苷酸开始。在TOP基因和TOP mRNA中，TOP基序优选在其5'端以转录起始位点开始，并在所述基因或mRNA中第一个嘌呤残基的5′处以一个核苷酸终止。在本发明的意义上的TOP基序优选位于代表5'-UTR的序列的5'端或编码5'-UTR的序列的5'端。因此，优选地，如果一段3个或更多个嘧啶核苷酸的序列位于相应序列(例如本发明mRNA、本发明mRNA的5′-UTR元件或源自如本文所述的TOP基因的5'-UTR的核酸序列)的5′端，则此段序列在本发明的意义上被称为“TOP基序”。换言之，如果一段3个或更多个嘧啶核苷酸不位于5'-UTR或5'-UTR元件的5'端，而是位于5'-UTR或5'-UTR元件内的任何位置，则其优选不被称为“TOP基序”。

如本文所用，术语“TOP基因”通常以存在5'末端寡嘧啶束为特征。此外，大多数TOP基因的特征为与生长相关的翻译调控。然而，具有组织特异性翻译调控的TOP基因也是已知的。如上所定义，TOP基因的5'-UTR对应于源自TOP基因的成熟mRNA的5'-UTR的序列，其优选从位于5'-CAP的3'的核苷酸延伸至位于起始密码子的5'的核苷酸。TOP基因的5'-UTR通常不包含任何起始密码子，优选不包含上游AUG(uAUG)或上游开放阅读框(uORF)。其中，上游AUG和上游开放阅读框通常应理解为出现在应被翻译的开放阅读框的起始密码子(AUG)的5'处的AUG和开放阅读框。TOP基因的5'-UTR通常相当短。TOP基因的5'-UTR的长度可在20个核苷酸至500个核苷酸之间变化，并且通常小于约200个核苷酸、优选小于约150个核苷酸、更优选小于约100个核苷酸。在本发明的意义上，TOP基因的示例性5'-UTR是从根据以下的序列中的位置5处的核苷酸延伸至位于紧邻起始密码子(例如ATG)的5'处的核苷酸的核酸序列：国际专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:1-1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421和SEQ ID NO:1422或其同源物或变体，所述申请的公开内容通过引用并入于此。在此上下文中，TOP基因的5'-UTR的特别优选片段为缺少5'-TOP基序的TOP基因的5'-UTR。术语“TOP基因的5'-UTR”优选是指天然存在的TOP基因的5'-UTR。

如本文所用，“3'-非翻译区(3'-UTR)”通常为位于蛋白质编码区(即开放阅读框)与mRNA的聚(A)序列之间的mRNA部分。mRNA的3'-UTR不翻译成氨基酸序列。3'-UTR序列通常由基因编码，所述基因在基因表达过程中转录为相应的mRNA。基因组序列首先转录成早熟mRNA，其包含任选的内含子。接着在成熟过程中将早熟mRNA进一步加工成成熟mRNA。此成熟过程包括以下步骤：5'-加帽、剪接早熟mRNA以切除任选的内含子和3'端的修饰，例如对早熟mRNA的3'端的多腺苷酸化以及任选的内切或外切核酸酶切割等。在本发明的上下文中，3'-UTR对应于成熟mRNA的序列，其位于蛋白质编码区的终止密码子的3'端，优选紧邻蛋白质编码区的终止密码子的3'端，并且其延伸至聚(A)序列的5'侧，优选延伸至紧邻聚(A)序列的5'的核苷酸。术语“对应于”意指3'-UTR序列可为RNA序列，例如在用于定义3'-UTR序列的mRNA序列中，或对应于此类RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中，术语“基因的3'-UTR”，例如“白蛋白基因的3'-UTR”，为对应于源自此基因的成熟mRNA的3'-UTR的序列，即通过基因转录和早熟mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3'-UTR”涵盖3'-UTR的DNA序列和RNA序列。

如本文所用，术语“5'-非翻译区(5'-UTR)”通常应理解为信使RNA(mRNA)的特定部分。它位于mRNA的开放阅读框的5′处。通常，5'-UTR以转录起始位点开始，并在开放阅读框的起始密码子前的一个核苷酸处结束。5'-UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调控元件。此类调控元件可为例如核糖体结合位点或5'末端寡嘧啶束。5'-UTR可经转录后修饰，例如通过添加5'-CAP。在本发明的上下文中，5'-UTR对应于位于5'-CAP与起始密码子之间的成熟mRNA的序列。优选地，5'-UTR对应于从位于5'-CAP的3'的核苷酸、优选从位于紧邻5'-CAP的3'的核苷酸延伸至位于蛋白质编码区的起始密码子的5'的核苷酸、优选至位于紧邻蛋白质编码区的起始密码子的5'的核苷酸。位于紧邻成熟mRNA的5'-CAP的3'的核苷酸通常对应于转录起始位点。术语“对应于”意指5'-UTR序列可为RNA序列，例如在用于定义5'-UTR序列的mRNA序列中，或对应于此类RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中，术语“基因的5'-UTR”，例如“TOP基因的5'-UTR”，是对应于源自此基因的成熟mRNA的5'-UTR的序列，即通过基因转录和早熟mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5'-UTR”涵盖5'-UTR的DNA序列和RNA序列。

如本文所用，术语“疫苗”通常应理解为提供至少一种抗原或抗原功能的预防或治疗材料。抗原或抗原功能可刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫反应。如本文所用，术语“大流行性流感/流感用疫苗或大流行性流感/流感疫苗”是指针对大流行性流感病毒的疫苗，在本文中称为大流行性流感/流感用疫苗或大流行性流感/流感疫苗。如本文所用，术语“季节性流感/流感用疫苗或季节性流感/流感疫苗”是指针对流感季节中季节性出现的流感病毒的疫苗，在本文中称为“季节性流感/流感用疫苗或季节性流感/流感疫苗”。

如本文所用，可生成如本发明的上下文中定义的蛋白质或肽的术语“变体”，其在一个或多个突变中具有不同于原始序列的氨基酸序列，例如一个或多个被取代、插入和/或缺失的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白质相比，这些片段和/或变体具有相同的生物学功能或比活性，例如其特异性抗原特性。如本发明的上下文中定义的蛋白质或肽的“变体”与其天然(即非突变的)生理序列相比，可包含保守氨基酸取代。那些氨基酸序列以及它们的编码核苷酸序列特别属于如本文所定义的术语变体。源自相同类别的氨基酸相互交换的取代被称为保守取代。特别是，它们是具有脂肪族侧链、带正电或带负电侧链、侧链中有芳族基团的氨基酸或如下氨基酸，所述氨基酸的侧链可进入氢桥，例如具有羟基官能团的侧链。这意味着例如具有极性侧链的氨基酸被具有同样极性侧链的另一个氨基酸置换，或例如以疏水性侧链为特征的氨基酸被具有同样疏水性侧链的另一个氨基酸取代(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。插入和取代是可能的，特别是在不引起三维结构改变或不影响结合区的那些序列位置处。通过插入或缺失对三维结构的修改可例如使用CD光谱(圆二色光谱)(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides，于：Modern Physical Methods inBiochemistry，Neuberger等人(编)，Elsevier，Amsterdam中)容易地确定。

如本文所用，术语蛋白质或肽的“变体”在此种蛋白质或肽的一段10、20、30、50、75或100个氨基酸内可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸同一性。此外，可由核酸分子编码的如本文所定义的蛋白质或肽的变体还可包含那些序列，其中编码核酸序列的核苷酸根据遗传密码的简并性进行交换，而不导致蛋白质或肽的相应氨基酸序列的改变，即，氨基酸序列或其至少部分在上述含义内的一个或多个突变中可与原始序列没有区别。

如本文所用，术语“媒介物”意指试剂，例如载体，其通常可用于药物组合物或疫苗中以促进向个体施用药物组合物或疫苗的组分。

V.2.本发明的示例性可离子化脂质

本发明人已发现一类新型可离子化脂质，即本发明的可离子化脂质，其经合成以包括两个或更多个可离子化的胺头部基团、两个或更多个可降解的接头基团和两个或更多个饱和或不饱和或支链烷基尾部。

在其最广泛的实施方案中，本发明的可离子化脂质具有式I的结构：

头部——间隔基——接头——间隔基——尾部

式I

其中pKa可经调节以实现对身体的特定组织或器官的靶向递送。

在某些实施方案中，示例性尾部基团、头部基团和接头基团各自独立地选自下表1中各个类别中鉴定的取代基。下表中描述的取代基R基团包括本文中允许和定义的任何取代基R基团。

表1

表1a-示例性头部基团

表1c-示例性尾部基团

表1c(续)

在某些实施方案中，间隔基是任选的并且为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。在优选实施方案中，每个间隔基独立地为被取代或未被取代的C₁碳、被取代或未被取代的C₂碳、被取代或未被取代的C₃碳、被取代或未被取代的C₄碳、被取代或未被取代的C₅碳、被取代或未被取代的C₆碳、被取代或未被取代的C₇碳、被取代或未被取代的C₈碳、被取代或未被取代的C₉碳、被取代或未被取代的C₁₀碳、被取代或未被取代的C₁₁碳、被取代或未被取代的C₁₂碳、被取代或未被取代的C₁₃碳、被取代或未被取代的C₁₄碳、被取代或未被取代的C₁₅碳、被取代或未被取代的C₁₆碳、被取代或未被取代的C₁₇碳、被取代或未被取代的C₁₈碳、被取代或未被取代的C₁₉碳、被取代或未被取代的C₂₀碳、被取代或未被取代的C₂₁碳或被取代或未被取代的C₂₂碳。

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质包括关于以下的候选头部基团结构：DL＝二亚油酸，ADDE＝氮烷二基二乙基，Cx/Cy＝碳间隔基，DMA＝二甲胺，Pyr＝吡啶，PipZ＝哌嗪，PipD＝哌啶，DIPA＝二异丙胺，DM＝二甲基，BOD＝双辛基癸基头部基团和pKa的Percepta预测值。

在某些实施方案中，二甲胺(表2)、哌啶(表3)、吡咯烷(表4)和哌嗪(表5)各自的示例性非限制性头部基团在下文中说明。在某些实施方案中，可调整两种胺的pKa以获得特定值，从而促进向特定组织或器官的递送。对于经典算法，pKa的Percepta预测显示为黑色，而对于Galas算法则显示为红色。由于带电位点之间的静电排斥减少，使胺彼此远离会使两个pKa更接近。使内部胺远离酯键会提高其pKa，因为胺的质子结合自由电子对进一步从吸电子酯中去除。选择具有适当pKa的头部基团结构有望实现用于IM定位的轻微正电荷或中性LNP，以及在低于pH 7下强力增加正电荷以实现内溶酶体释放能力。

表2：在头部基团与接头之间具有C₁-C₇间隔基的二甲胺头部基团(来自ACD软件的pKa示于氮原子上)

表3：在头部基团与接头之间具有C₁-C₇间隔基的哌啶头部基团(来自ACD软件的pKa示于氮原子上)

表4：在头部基团与接头之间具有C₁-C₇间隔基的吡咯烷头部基团(来自ACD软件的pKa示于氮原子上)

表5：在头部基团与接头之间具有C₁-C₇间隔基的哌嗪头部基团(来自ACD软件的pKa示于氮原子上)

在某些实施方案中，可选择额外的二价头部基团以及表2、表4和表5中所示的二甲胺、吡咯烷和哌嗪，其中可改变碳间隔基以产生特定的分子pKa。除了特定的离子化特性外，一些头部基团还可具有增加的免疫佐剂性。

表6

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质包含一个或多个接头基团，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个接头基团。

示例性接头在下表7A-7E中说明。

表7A

表7B

表7C

表7D

表7E

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质的烷基尾部的形状优选为锥形和发散的，以通过生成非双层倒六边形或其他结构来促进内溶酶体释放。示例性烷基尾部在表8A、表8B和表8C中说明。在某些实施方案中，这可通过添加饱和键或分支来实现。在其他实施方案中，添加酯键可经由更快速的降解提高耐受性。

表8A

表8B

表8C

具有二甲胺、吡咯烷和哌嗪头部基团、酯接头、C₄间隔基和烷基/亚烷基尾部的本发明的可离子化脂质的示例性非限制性实例在表9中说明并且可具有允许在pH 7.4下带正电的LNP的pKa以供IM定位和具有接近6.5的pKa的第二内部胺，其可在胞内体酸化期间进一步离子化并提供释放。

表9

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式II：

其中每个R¹和R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C₆杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基或任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基，或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环或杂芳基环；

其中每个R³和R⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，或者其中R¹与R²一起包含3-7元杂环或杂芳族环；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中x、y和z各自独立地为0-10的整数；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₂₂)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

本发明的可离子化脂质可任选地在第一氮与第二氮之间(即在以上式II中的CR⁵R⁶)并且在第二氮与酯接头之间(即在以上式II中的CR⁷R⁸和CR⁹R¹⁰)包含碳间隔基。在某些实施方案中，尾部是对称的，包括例如二亚油酸(DL)和支链双辛基癸基(BOD)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些优选实施方案中，R³和/或R⁴上的取代基包括末端二氧戊环基团。

在某些实施方案中，R⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，x为0。

在某些实施方案中，x为1。

在某些实施方案中，x为2。

在某些实施方案中，x为3。

在某些实施方案中，x为4。

在某些实施方案中，x为5。

在某些实施方案中，x为6。

在某些实施方案中，x为7。

在某些实施方案中，x为8。

在某些实施方案中，x为9。

在某些实施方案中，x为10。

在某些实施方案中，x为11。在某些实施方案中，x为12。

在某些实施方案中，x为13。

在某些实施方案中，x为14。

在某些实施方案中，x为15。

在某些实施方案中，x为16。

在某些实施方案中，x为17。

在某些实施方案中，x为18。

在某些实施方案中，x为19。

在某些实施方案中，x为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O(CR¹R²R³)。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式III：

其中每个R¹'、R¹、R²、R¹¹和R¹²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成环烷基环或杂环烷基环，其中如果Q为S或O，则与S或O连接的R¹为电子对；

其中每个R³和R⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中x、y和z各自独立地为0-20的整数；

其中G和Q各自独立地为选自CH、O、N和S的原子；

其中m和n各自为0-4的整数；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；-SO₂((C₆)芳基)；和二硫键。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，x为0。

在某些实施方案中，x为1。

在某些实施方案中，x为2。

在某些实施方案中，x为3。

在某些实施方案中，x为4。

在某些实施方案中，x为5。

在某些实施方案中，x为6。

在某些实施方案中，x为7。

在某些实施方案中，x为8。

在某些实施方案中，x为9。

在某些实施方案中，x为10。

在某些实施方案中，x为11。

在某些实施方案中，x为12。

在某些实施方案中，x为13。

在某些实施方案中，x为14。

在某些实施方案中，x为15。

在某些实施方案中，x为16。

在某些实施方案中，x为17。

在某些实施方案中，x为18。

在某些实施方案中，x为19。

在某些实施方案中，x为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O(R¹R²R³)

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，Q为CH。

在某些实施方案中，Q为O。

在某些实施方案中，Q为S。

在某些实施方案中，Q为N。

在某些实施方案中，G为CH。

在某些实施方案中，G为O。

在某些实施方案中，G为S。

在某些实施方案中，G为N。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式IV：

其中R¹选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基和任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基；

其中每个R³和R⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中x、y和z各自独立地为0-10的整数；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，x为0。

在某些实施方案中，x为1。

在某些实施方案中，x为2。

在某些实施方案中，x为3。

在某些实施方案中，x为4。

在某些实施方案中，x为5。

在某些实施方案中，x为6。

在某些实施方案中，x为7。

在某些实施方案中，x为8。

在某些实施方案中，x为9。

在某些实施方案中，x为10。

在某些实施方案中，x为11。

在某些实施方案中，x为12。

在某些实施方案中，x为13。

在某些实施方案中，x为14。

在某些实施方案中，x为15。

在某些实施方案中，x为16。

在某些实施方案中，x为17。

在某些实施方案中，x为18。

在某些实施方案中，x为19。

在某些实施方案中，x为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O(CR¹R²R³)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式V：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环或杂芳基环；

其中每个R³、R⁴、R¹³和R¹⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹⁵和R¹⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中w、x、y和z各自独立地为0-10的整数；

其中每个Q独立地为选自O、NH、S的原子或二硫键；

其中每个m为0-4的整数，优选为0、1或2；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁵独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁶独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，w为0。

在某些实施方案中，w为1。

在某些实施方案中，w为2。

在某些实施方案中，w为3。

在某些实施方案中，w为4。

在某些实施方案中，w为5。

在某些实施方案中，w为6。

在某些实施方案中，w为7。

在某些实施方案中，w为8。

在某些实施方案中，w为9。

在某些实施方案中，w为10。

在某些实施方案中，w为11。

在某些实施方案中，w为12。

在某些实施方案中，w为13。

在某些实施方案中，w为14。

在某些实施方案中，w为15。

在某些实施方案中，w为16。

在某些实施方案中，w为17。

在某些实施方案中，w为18。

在某些实施方案中，w为19。

在某些实施方案中，w为20。

在某些实施方案中，x为0。

在某些实施方案中，x为1。

在某些实施方案中，x为2。

在某些实施方案中，x为3。

在某些实施方案中，x为4。

在某些实施方案中，x为5。

在某些实施方案中，x为6。

在某些实施方案中，x为7。

在某些实施方案中，x为8。

在某些实施方案中，x为9。

在某些实施方案中，x为10。

在某些实施方案中，x为11。

在某些实施方案中，x为12。

在某些实施方案中，x为13。

在某些实施方案中，x为14。

在某些实施方案中，x为15。

在某些实施方案中，x为16。

在某些实施方案中，x为17。

在某些实施方案中，x为18。

在某些实施方案中，x为19。

在某些实施方案中，x为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O(CR¹R²R³)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，Q为CH。

在某些实施方案中，Q为O。

在某些实施方案中，Q为S。

在某些实施方案中，Q为NH。

在某些实施方案中，Q为二硫键。

在某些实施方案中，m为0。

在某些实施方案中，m为1。

在某些实施方案中，m为2。

在某些实施方案中，m为3。

在某些实施方案中，m为4。

在某些实施方案中，m为5。

在某些实施方案中，m为6。

在某些实施方案中，m为7。

在某些实施方案中，m为8。

在某些实施方案中，m为9。

在某些实施方案中，m为10。

在某些实施方案中，m为11。

在某些实施方案中，m为12。

在某些实施方案中，m为13。

在某些实施方案中，m为14。

在某些实施方案中，m为15。

在某些实施方案中，m为16。

在某些实施方案中，m为17。

在某些实施方案中，m为18。

在某些实施方案中，m为19。

在某些实施方案中，m为20。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式VI：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环或杂芳基环；

其中每个R³、R⁴、R²³和R²⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁷、R¹⁸、R³⁴、R³⁵、R³⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中u、v、w、x、y和z各自独立地为0-20的整数；

其中每个Q独立地为选自O、NH、S的原子或二硫键；

其中每个m为0-4的整数，优选为0、1或2；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R³为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烷基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂烯基。

在一个优选实施方案中，R⁴为被取代或未被取代的-C(＝O)O-C₁-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁵独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁶独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H。

在某些实施方案中，R¹¹为OH。

在某些实施方案中，R¹¹为卤基。

在某些实施方案中，R¹¹为苯基。

在某些实施方案中，R¹¹为苄基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹²为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹²为H。

在某些实施方案中，R¹²为OH。

在某些实施方案中，R¹²为卤基。

在某些实施方案中，R¹²为苯基。

在某些实施方案中，R¹²为苄基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H。

在某些实施方案中，R¹³为OH。

在某些实施方案中，R¹³为卤基。

在某些实施方案中，R¹³为苯基。

在某些实施方案中，R¹³为苄基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H。

在某些实施方案中，R¹⁴为OH。

在某些实施方案中，R¹⁴为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H。

在某些实施方案中，R¹⁵为OH。

在某些实施方案中，R¹⁵为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H。

在某些实施方案中，R¹⁶为OH。

在某些实施方案中，R¹⁶为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，u为0。

在某些实施方案中，u为1。

在某些实施方案中，u为2。

在某些实施方案中，u为3。

在某些实施方案中，u为4。

在某些实施方案中，u为5。

在某些实施方案中，u为6。

在某些实施方案中，u为7。

在某些实施方案中，u为8。

在某些实施方案中，u为9。

在某些实施方案中，u为10。

在某些实施方案中，u为11。

在某些实施方案中，u为12。

在某些实施方案中，u为13。

在某些实施方案中，u为14。

在某些实施方案中，u为15。

在某些实施方案中，u为16。

在某些实施方案中，u为17。

在某些实施方案中，u为18。

在某些实施方案中，u为19。

在某些实施方案中，u为20。

在某些实施方案中，v为0。

在某些实施方案中，v为1。

在某些实施方案中，v为2。

在某些实施方案中，v为3。

在某些实施方案中，v为4。

在某些实施方案中，v为5。

在某些实施方案中，v为6。

在某些实施方案中，v为7。

在某些实施方案中，v为8。

在某些实施方案中，v为9。

在某些实施方案中，v为10。

在某些实施方案中，v为11。

在某些实施方案中，v为12。

在某些实施方案中，v为13。

在某些实施方案中，v为14。

在某些实施方案中，v为15。

在某些实施方案中，v为16。

在某些实施方案中，v为17。

在某些实施方案中，v为18。

在某些实施方案中，v为19。

在某些实施方案中，v为20。

在某些实施方案中，w为0。

在某些实施方案中，w为1。

在某些实施方案中，w为2。

在某些实施方案中，w为3。

在某些实施方案中，w为4。

在某些实施方案中，w为5。

在某些实施方案中，w为6。

在某些实施方案中，w为7。

在某些实施方案中，w为8。

在某些实施方案中，w为9。

在某些实施方案中，w为10。

在某些实施方案中，w为11。

在某些实施方案中，w为12。

在某些实施方案中，w为13。

在某些实施方案中，w为14。

在某些实施方案中，w为15。

在某些实施方案中，w为16。

在某些实施方案中，w为17。

在某些实施方案中，w为18。

在某些实施方案中，w为19。

在某些实施方案中，w为20。

在某些实施方案中，x为0。

在某些实施方案中，x为1。

在某些实施方案中，x为2。

在某些实施方案中，x为3。

在某些实施方案中，x为4。

在某些实施方案中，x为5。

在某些实施方案中，x为6。

在某些实施方案中，x为7。

在某些实施方案中，x为8。

在某些实施方案中，x为9。

在某些实施方案中，x为10。

在某些实施方案中，x为11。

在某些实施方案中，x为12。

在某些实施方案中，x为13。

在某些实施方案中，x为14。

在某些实施方案中，x为15。

在某些实施方案中，x为16。

在某些实施方案中，x为17。

在某些实施方案中，x为18。

在某些实施方案中，x为19。

在某些实施方案中，x为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O(CR¹R²R³)

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，Q为CH。

在某些实施方案中，Q为O。

在某些实施方案中，Q为S。

在某些实施方案中，Q为NH。

在某些实施方案中，Q为二硫键。

在某些实施方案中，m为0。

在某些实施方案中，m为1。

在某些实施方案中，m为2。

在某些实施方案中，m为3。

在某些实施方案中，m为4。

在某些实施方案中，m为5。

在某些实施方案中，m为6。

在某些实施方案中，m为7。

在某些实施方案中，m为8。

在某些实施方案中，m为9。

在某些实施方案中，m为10。

在某些实施方案中，m为11。

在某些实施方案中，m为12。

在某些实施方案中，m为13。

在某些实施方案中，m为14。

在某些实施方案中，m为15。

在某些实施方案中，m为16。

在某些实施方案中，m为17。

在某些实施方案中，m为18。

在某些实施方案中，m为19。

在某些实施方案中，m为20。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式VII：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环烷基环或杂芳基环；

其中每个R⁵、R⁶、R⁵'、R⁶'、R⁵”和R⁶”独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中u、v、w、y和z各自独立地为0-20的整数；

其中每个Q独立地为选自O、NH、S的原子或二硫键；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，每个R⁵独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁶独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H。

在某些实施方案中，R¹¹为OH。

在某些实施方案中，R¹¹为卤基。

在某些实施方案中，R¹¹为苯基。

在某些实施方案中，R¹¹为苄基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹²为H。

在某些实施方案中，R¹²为OH。

在某些实施方案中，R¹²为卤基。

在某些实施方案中，R¹²为苯基。

在某些实施方案中，R¹²为苄基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H。

在某些实施方案中，R¹³为OH。

在某些实施方案中，R¹³为卤基。

在某些实施方案中，R¹³为苯基。

在某些实施方案中，R¹³为苄基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H。

在某些实施方案中，R¹⁴为OH。

在某些实施方案中，R¹⁴为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H。

在某些实施方案中，R¹⁵为OH。

在某些实施方案中，R¹⁵为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H。

在某些实施方案中，R¹⁶为OH。

在某些实施方案中，R¹⁶为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，u为0。

在某些实施方案中，u为1。

在某些实施方案中，u为2。

在某些实施方案中，u为3。

在某些实施方案中，u为4。

在某些实施方案中，u为5。

在某些实施方案中，u为6。

在某些实施方案中，u为7。

在某些实施方案中，u为8。

在某些实施方案中，u为9。

在某些实施方案中，u为10。

在某些实施方案中，u为11。

在某些实施方案中，u为12。

在某些实施方案中，u为13。

在某些实施方案中，u为14。

在某些实施方案中，u为15。

在某些实施方案中，u为16。

在某些实施方案中，u为17。

在某些实施方案中，u为18。

在某些实施方案中，u为19。

在某些实施方案中，u为20。

在某些实施方案中，v为0。

在某些实施方案中，v为1。

在某些实施方案中，v为2。

在某些实施方案中，v为3。

在某些实施方案中，v为4。

在某些实施方案中，v为5。

在某些实施方案中，v为6。

在某些实施方案中，v为7。

在某些实施方案中，v为8。

在某些实施方案中，v为9。

在某些实施方案中，v为10。

在某些实施方案中，v为11。

在某些实施方案中，v为12。

在某些实施方案中，v为13。

在某些实施方案中，v为14。

在某些实施方案中，v为15。

在某些实施方案中，v为16。

在某些实施方案中，v为17。

在某些实施方案中，v为18。

在某些实施方案中，v为19。

在某些实施方案中，v为20。

在某些实施方案中，w为0。

在某些实施方案中，w为1。

在某些实施方案中，w为2。

在某些实施方案中，w为3。

在某些实施方案中，w为4。

在某些实施方案中，w为5。

在某些实施方案中，w为6。

在某些实施方案中，w为7。

在某些实施方案中，w为8。

在某些实施方案中，w为9。

在某些实施方案中，w为10。

在某些实施方案中，w为11。

在某些实施方案中，w为12。

在某些实施方案中，w为13。

在某些实施方案中，w为14。

在某些实施方案中，w为15。

在某些实施方案中，w为16。

在某些实施方案中，w为17。

在某些实施方案中，w为18。

在某些实施方案中，w为19。

在某些实施方案中，w为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂(CR¹R²R³)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，Q为CH。

在某些实施方案中，Q为O。

在某些实施方案中，Q为S。

在某些实施方案中，Q为NH。

在某些实施方案中，Q为二硫键。

在某些实施方案中，m为0。

在某些实施方案中，m为1。

在某些实施方案中，m为2。

在某些实施方案中，m为3。

在某些实施方案中，m为4。

在某些实施方案中，m为5。

在某些实施方案中，m为6。

在某些实施方案中，m为7。

在某些实施方案中，m为8。

在某些实施方案中，m为9。

在某些实施方案中，m为10。

在某些实施方案中，m为11。

在某些实施方案中，m为12。

在某些实施方案中，m为13。

在某些实施方案中，m为14。

在某些实施方案中，m为15。

在某些实施方案中，m为16。

在某些实施方案中，m为17。

在某些实施方案中，m为18。

在某些实施方案中，m为19。

在某些实施方案中，m为20。

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式VIII：

其中

R₁和R₂各自独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C₆杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基或任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基；

R₃和R₄各自独立地为任选地被取代的C₁₀-C₂₂烷基、任选地被取代的C₁₀-C₂₂烯基、任选地被取代的C₁₀-C₂₂炔基，或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环或杂芳基环

X为OH或NR₁R₂；并且

Z为0至5的整数。

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式VIII的可离子化脂质选自由以下组成的组：

在另一个实施方案中，本发明涵盖本发明的可离子化脂质，其具有式IX：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、电子对、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成3-7元杂环或杂芳基环；

其中每个R⁵、R⁶、R⁵'、R⁶'、R⁵”和R⁶”独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中u、v、w、y和z各自独立地为0-20的整数；

其中X为O、S或N；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁵R⁶R⁷)_m；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，R¹为H。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R1为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R1为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。在某些实施方案中，R¹为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，R²为H。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆杂环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆烷基环烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₆芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₃-C₆杂芳基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₄-C₈芳氧基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₇-C₁₀芳烷基。

在某些实施方案中，R²为被取代或未被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基。

在某些实施方案中，每个R⁵独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁵为H。

在某些实施方案中，R⁵为OH。

在某些实施方案中，R⁵为卤基。

在某些实施方案中，R⁵为苯基。

在某些实施方案中，R⁵为苄基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，每个R⁶独立地为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁶为H。

在某些实施方案中，R⁶为OH。

在某些实施方案中，R⁶为卤基。

在某些实施方案中，R⁶为苯基。

在某些实施方案中，R⁶为苄基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁷为H。

在某些实施方案中，R⁷为OH。

在某些实施方案中，R⁷为卤基。

在某些实施方案中，R⁷为苯基。

在某些实施方案中，R⁷为苄基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁷为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁸为H。

在某些实施方案中，R⁸为OH。

在某些实施方案中，R⁸为卤基。

在某些实施方案中，R⁸为苯基。

在某些实施方案中，R⁸为苄基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁸为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R⁹为H。

在某些实施方案中，R⁹为OH。

在某些实施方案中，R⁹为卤基。

在某些实施方案中，R⁹为苯基。

在某些实施方案中，R⁹为苄基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R⁹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁰为H。

在某些实施方案中，R¹⁰为OH。

在某些实施方案中，R¹⁰为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁰为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H。

在某些实施方案中，R¹¹为OH。

在某些实施方案中，R¹¹为卤基。

在某些实施方案中，R¹¹为苯基。

在某些实施方案中，R¹¹为苄基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹¹为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹¹为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹²为H。

在某些实施方案中，R¹²为OH。

在某些实施方案中，R¹²为卤基。

在某些实施方案中，R¹²为苯基。

在某些实施方案中，R¹²为苄基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹²为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹³为H。

在某些实施方案中，R¹³为OH。

在某些实施方案中，R¹³为卤基。

在某些实施方案中，R¹³为苯基。

在某些实施方案中，R¹³为苄基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹³为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁴为H。

在某些实施方案中，R¹⁴为OH。

在某些实施方案中，R¹⁴为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁴为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁵为H。

在某些实施方案中，R¹⁵为OH。

在某些实施方案中，R¹⁵为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁵为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H、OH、卤基、苯基、苄基、被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基、被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基、或被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，R¹⁶为H。

在某些实施方案中，R¹⁶为OH。

在某些实施方案中，R¹⁶为卤基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为苄基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₁-C₂₂烷基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂烯基。

在某些实施方案中，R¹⁶为被取代或未被取代的C₂-C₂₂炔基。

在某些实施方案中，u为0。

在某些实施方案中，u为1。

在某些实施方案中，u为2。

在某些实施方案中，u为3。

在某些实施方案中，u为4。

在某些实施方案中，u为5。

在某些实施方案中，u为6。

在某些实施方案中，u为7。

在某些实施方案中，u为8。

在某些实施方案中，u为9。

在某些实施方案中，u为10。

在某些实施方案中，u为11。

在某些实施方案中，u为12。

在某些实施方案中，u为13。

在某些实施方案中，u为14。

在某些实施方案中，u为15。

在某些实施方案中，u为16。

在某些实施方案中，u为17。

在某些实施方案中，u为18。

在某些实施方案中，u为19。

在某些实施方案中，u为20。

在某些实施方案中，v为0。

在某些实施方案中，v为1。

在某些实施方案中，v为2。

在某些实施方案中，v为3。

在某些实施方案中，v为4。

在某些实施方案中，v为5。

在某些实施方案中，v为6。

在某些实施方案中，v为7。

在某些实施方案中，v为8。

在某些实施方案中，v为9。

在某些实施方案中，v为10。

在某些实施方案中，v为11。

在某些实施方案中，v为12。

在某些实施方案中，v为13。

在某些实施方案中，v为14。

在某些实施方案中，v为15。

在某些实施方案中，v为16。

在某些实施方案中，v为17。

在某些实施方案中，v为18。

在某些实施方案中，v为19。

在某些实施方案中，v为20。

在某些实施方案中，w为0。

在某些实施方案中，w为1。

在某些实施方案中，w为2。

在某些实施方案中，w为3。

在某些实施方案中，w为4。

在某些实施方案中，w为5。

在某些实施方案中，w为6。

在某些实施方案中，w为7。

在某些实施方案中，w为8。

在某些实施方案中，w为9。

在某些实施方案中，w为10。

在某些实施方案中，w为11。

在某些实施方案中，w为12。

在某些实施方案中，w为13。

在某些实施方案中，w为14。

在某些实施方案中，w为15。

在某些实施方案中，w为16。

在某些实施方案中，w为17。

在某些实施方案中，w为18。

在某些实施方案中，w为19。

在某些实施方案中，w为20。

在某些实施方案中，y为0。

在某些实施方案中，y为1。

在某些实施方案中，y为2。

在某些实施方案中，y为3。

在某些实施方案中，y为4。

在某些实施方案中，y为5。

在某些实施方案中，y为6。

在某些实施方案中，y为7。

在某些实施方案中，y为8。

在某些实施方案中，y为9。

在某些实施方案中，y为10。

在某些实施方案中，y为11。

在某些实施方案中，y为12。

在某些实施方案中，y为13。

在某些实施方案中，y为14。

在某些实施方案中，y为15。

在某些实施方案中，y为16。

在某些实施方案中，y为17。

在某些实施方案中，y为18。

在某些实施方案中，y为19。

在某些实施方案中，y为20。

在某些实施方案中，z为0。

在某些实施方案中，z为1。

在某些实施方案中，z为2。

在某些实施方案中，z为3。

在某些实施方案中，z为4。

在某些实施方案中，z为5。

在某些实施方案中，z为6。

在某些实施方案中，z为7。

在某些实施方案中，z为8。

在某些实施方案中，z为9。

在某些实施方案中，z为10。

在某些实施方案中，z为11。

在某些实施方案中，z为12。

在某些实施方案中，z为13。

在某些实施方案中，z为14。

在某些实施方案中，z为15。

在某些实施方案中，z为16。

在某些实施方案中，z为17。

在某些实施方案中，z为18。

在某些实施方案中，z为19。

在某些实施方案中，z为20。

在某些实施方案中，L¹为键。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L¹为-SO-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂-。

在某些实施方案中，L¹为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₃-。

在某些实施方案中，L¹为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂N。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L¹为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L¹为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L¹为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L¹为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为键。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-OC(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-NH-C(＝O)-。

在某些实施方案中，L²为-SO-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂-。

在某些实施方案中，L²为OC(＝O)。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)O-。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)NH-。

在某些实施方案中，L²为-SO₃-。

在某些实施方案中，L²为-NSO₂-。

在某些实施方案中，L²为-SO₂N。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₁-C₈)烷基)₂。

在某些实施方案中，L²为-NH((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-N((C₆)芳基)₂。

在某些实施方案中，L²为二氧杂环戊烯并吡咯烷-二酮。

在某些实施方案中，L²为-C(＝O)R¹-。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，L²为-CO₂(CR¹R²R³)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₁-C₂₂)烷基)。

在某些实施方案中，L²为-SO₂((C₆)芳基)。

在某些实施方案中，Q为CH。

在某些实施方案中，X为O。

在某些实施方案中，X为S。

在某些实施方案中，X为N。

在某些实施方案中，m为0。

在某些实施方案中，m为1。

在某些实施方案中，m为2。

在某些实施方案中，m为3。

在某些实施方案中，m为4。

在某些实施方案中，m为5。

在某些实施方案中，m为6。

在某些实施方案中，m为7。

在某些实施方案中，m为8。

在某些实施方案中，m为9。

在某些实施方案中，m为10。

在某些实施方案中，m为11。

在某些实施方案中，m为12。

在某些实施方案中，m为13。

在某些实施方案中，m为14。

在某些实施方案中，m为15。

在某些实施方案中，m为16。

在某些实施方案中，m为17。

在某些实施方案中，m为18。

在某些实施方案中，m为19。

在某些实施方案中，m为20。

V.3.本发明的说明性可离子化脂质

本发明的可离子化脂质的说明性非限制性实例在表10中说明(具有标题“方法”的列是指合成特定化合物的方法，如下文部分V.4.制备本发明的可离子化脂质的方法中所述)。

表10

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

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表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

表10(续)

在本发明的另一个实施方案中，调节本发明的可离子化脂质的pKa可指导脂质纳米颗粒-核酸复合物(LNP-NA)向特定组织或器官的施用。本发明人惊奇地发现，使用软件例如ACDLabs Percepta预测可离子化脂质的pKa可显著加速本发明的可离子化脂质的设计。本发明人发现可离子化脂质的经预测的水性pKa均显著高于通过TNS所测量的值。在某些实施方案中，从水性环境至LNP环境的pKa下降先前在文献中未得到承认。不希望受理论束缚，由于与水相相比，脂质相中质子的溶剂化能更高，以及来自LNP中的本发明的可离子化脂质的质子的静电排斥，可找到合理的解释，以上两个理由可结合以使从水相至脂质相的pKa降低1-3点。在某些实施方案中，这种预测能力可用于通过检查潜在候选物的pKa表并仅选择具有适当pKa值的那些来选择特定的头部基团和碳间隔基。以此方式可准确地消除候选物，从而大大节省合成和测试时间与费用。

在某些实施方案中，LNP中包含的本发明的可离子化脂质的pKa是通过阴离子亲脂染料TNS与含有可离子化脂质的LNP结合的荧光增强来测量的。先前研究显示，TNS pKa需要接近6.5，才能在IV施用后有效递送至肝脏。水相中的pKa可通过例如ACDLabs Percepta的软件来预测，导致pKa高于TNS pKa。鉴于LNP pKa在确定其效率方面的重要性，开发了新方法(ζ电位、¹H NMR、建模)将可离子化脂质的内在pKa与LNP离子化特性联系起来，以便合理地设计用于mRNA递送的有效系统。

表11a：已知的可离子化脂质的pKa

表11b：具有内部pKa的可离子化脂质(包括本发明的示例性可离子化脂质和已知脂质)

在某些实施方案中，本发明涵盖一类新型可离子化脂质(本发明的可离子化脂质)，其经合成以带有两个可离子化的胺和两个可降解的酯接头，所述接头连接至亚油酸尾或分支尾。DL＝二亚油酸，ADDE＝氮烷二基二乙基，Cx/Cy＝碳间隔基，DMA＝二甲胺，Pyr＝吡啶，PipZ＝哌嗪，PipD＝哌啶，DIPA＝二异丙胺，DM＝二甲基，BOD＝双辛基癸基。大多数ADDE可离子化脂质在体外成功转染HEK 293细胞，但下面列出的4种例外，它们无活性，可能是由于它们的头部基团庞大并且构象受限。

表12：本发明的说明性可离子化脂质的pKa

表12(续)

表12(续)

表12(续)

在某些实施方案中，合成额外的可离子化脂质，其带有一个可离子化胺和两个亚油酸尾部，它们经由可降解的酯连接至头部基团如异戊胺(IP)、乙醇(EA)、丙醇(PA)，如表13A所示。

表13A

在某些实施方案中，第二类的脂质含有一个可离子化基团(DMA)和两个不同接头：可降解的酯和不可降解的八磺酰氨基(OSA)。另外，这些脂质含有线性(亚麻油酰基)或分支尾(十八烷基)，如表13B所示。

表13B

在某些实施方案中，第三类可离子化脂质具有一个可离子化胺和一个亚油酸(L)尾部，两者都经由不可降解的酰胺连接至头部基团如(氨基乙烷(AE)、二甲胺和氨乙基二磺酰基(AEDS))，如表13C所示。

表13C

在某些实施方案中，包括烷基脂质的示例性本发明可离子化脂质用来自ACDClassic和ACD Galas的经预测的pKa来说明，包括合成方法，如表13D所示。

表13D

表13D(续)

表13D(续)

表13D(续)

表13D(续)

表13D(续)

表13D(续)

表13D(续)

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V.4.制备本发明的可离子化脂质的说明性方法

本发明的可离子化脂质可使用市售试剂，通过各种途径合成。以下方法提供制备本发明的可离子化脂质的说明性技术。

一般反应方案1

具有两种可降解酯的本发明的可离子化脂质(例如化合物A-7)的说明性实施方案可根据一般反应方案1(“方法A”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或饱和/不饱和链和双层尾(对称和不对称)，n为1至6的整数。参考一般反应方案1，结构A-1的化合物可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。将A-1在溶剂乙醇中的混合物用催化量的硫酸处理以得到酯A-2，接着将A-2用LAH(例如氢化铝锂)在无水THF中处理9-10小时以得到醇衍生物A-3。经纯化的A-3与丙烯酰氯衍生物(其中Ra＝CH₃、C₂H₅和/或异丙基)A-4、碱(例如三乙胺)在二氯甲烷中反应4-5小时，得到被取代的酰化产物A-5。在任何必要的后处理和或纯化步骤后，将酰化产物与头部基团(R1)N,N-二甲基二胺A-6的混合物在足以产生A-7的温度和时间下加热。

一般反应方案2

在接头与内部胺之间具有增加的碳间隔基的本发明的可离子化脂质(例如化合物B-3)的说明性实施方案可根据一般反应方案2(“方法B”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数。参考一般反应方案2，根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备结构A-2的化合物。将B-1与A-2以二氯甲烷为溶剂的混合物用催化量的N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、羟基苯并三唑(HOBt)和碱如三乙胺处理，得到酯衍生物B-2，接着将B-2与A-6的混合物用碱(例如N,N-二异丙基乙胺或1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)在无水THF中处理，在任何必要的后处理和或纯化步骤后，在足以产生B-3的温度和时间下加热2-5天。

一般反应方案3

本发明的可离子化脂质(与4个酯基对称)(例如化合物C-4)的说明性实施方案可根据一般反应方案3(“方法C”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，其中m为-1至2的整数，n为1至6的整数。参考一般反应方案3，根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备结构A-2的化合物。将C-1与A-2的混合物在用氮气吹扫(保持在无水条件下)的施伦克管(Schlenk tube)中用无溶剂条件和催化量的有机催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)处理，在一定温度下加热，得到酯衍生物C-2。在三乙胺的存在下，使用二氯甲烷作为溶剂将经纯化的C-2与丙烯酰氯A-4混合。然后将反应在室温下搅拌直至起始材料消耗，得到C-3。在任何必要的后处理和或纯化步骤之后，将酰化产物与头部基团C-3和N,N-二甲基二胺A-6的混合物在足以产生C-4的温度和时间下加热。

一般反应方案4

本发明的可离子化脂质(与4个酯基不对称)(例如化合物C-7)的说明性实施方案可根据一般反应方案4(“方法-C1”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，其中m为-1至2的整数，n为1至6的整数。参考一般反应方案4，根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备结构A-2的化合物。将C-1与A-2的混合物在用氮气吹扫(保持在无水条件下)的施伦克管中用无溶剂条件和催化量的有机催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)处理，在一定温度下加热，得到酯衍生物C-2。在三乙胺的存在下，使用二氯甲烷作为溶剂将经纯化的C-2与丙烯酰氯A-4混合。将反应在室温下搅拌直至起始材料消耗以获得C-3。等量的酰化C-3产物与头部基团N,N-二甲基二胺A-6的混合物在足以产生C-5的温度和时间的加热下反应。将进一步经纯化的C-5用相同当量的C-6(双层尾)处理，并在任何必要的后处理和或纯化步骤后在足以产生C-7的温度和时间下加热。

一般反应方案5

具有六种可降解酯的本发明的可离子化脂质(例如化合物D-8)的说明性实施方案可根据一般反应方案5(“方法D”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数，R²为烷基、环状、杂环取代基，并且R⁴为具有烷基链的酯衍生物。参考一般反应方案5，结构B-1、A-1、A-2、A-5和A-6的化合物可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。将B-1在乙醇存在下使用催化量的硫酸进行酯化，得到D-1。此外，通过经典芬克尔斯坦(Finkelstein)反应，用碘化钠的丙酮溶液将烷基溴转化为相应的烷基碘D-2。将D-2与D-3的混合物与乙醇钠(NaOEt)在乙醇中在回流下反应，接着酸化至低pH以获得D-4。在步骤4中，在N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和催化量的4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)存在下在二氯甲烷中酯化过夜，得到D-5。在硼氢化钠(NaBH₄)存在下，进一步将D-5还原为相应的醇，得到D-6。经纯化的D-6与丙烯酰氯衍生物(其中Ra＝CH₃、C₂H₅和/或异丙基)A-5在碱(例如三乙胺)存在下在四氢呋喃溶剂中反应4-5小时，获得被取代的酰化产物D-7。在任何必要的后处理和或纯化步骤之后，将酰化产物D-7与头部基团(R1)N,N-二甲基二胺A-6的混合物在足以产生D-8的温度和时间下加热。

一般反应方案6

具有可降解和不可降解酯的本发明的可离子化脂质(例如化合物E、F和G)的说明性实施方案可根据一般反应方案6(“方法E”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数，R²为烷基、环状、杂环取代基。参考一般反应方案6，结构E-1、A-4、E-2、A-5和A-6的化合物可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在试剂三乙胺的存在下，E-1与丙烯酰氯A-4在二氯甲烷中反应，得到E-2。在步骤2中，A-6与A-5反应以原位获得单烷基化产物。在无溶剂条件下进一步滴加A-5，接着在任何必要的后处理和或纯化步骤之后加热足以产生E-3的时间。在步骤3中，A-6在氮气气氛下在无溶剂条件下与2当量的丙烯酰胺反应，接着在任何必要的后处理和或纯化步骤之后在足以产生化合物F的温度和时间下加热。在步骤4中，A-6与1当量的E-2反应以获得单烷基化产物，并在任何必要的后处理和或纯化步骤之后进一步与烷基磺酰氯反应以获得不可降解的接头衍生物G。

一般反应方案7

具有螺二氧戊环衍生物的本发明的可离子化脂质(例如化合物H)的说明性实施方案是根据一般反应方案7(“方法H”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数，R²为烷基、环状、杂环取代基。参考一般反应方案5，结构A-6、H-1、H-5的化合物和必要的催化剂可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。顺丁烯二酸酐与3-(二甲氨基)-1-丙胺(DMAPA)反应，生成3-(N,N-二甲氨基)丙基顺丁烯酰氨酸H-2。所述反应在氯仿中通过在室温下将胺添加至顺丁烯二酸酐中并且随后加热至60℃来进行。纯化后，H-2在乙酸酐中与醋酸钠反应并在任何必要的后处理和或纯化步骤后在足以产生G-3的温度和时间下加热。在步骤3中，使用四氧化锇在无水THF中进行羟基化反应过夜，得到H-4。将H-4与H-5的混合物溶解于甲苯溶剂中，并且圆底烧瓶装有迪安-斯达克(Dean-Stark)装置，随后将反应加热至回流并持续8小时，随着反应继续进行，在单独的烧瓶中收集迪安-斯达克装置中得到的水，直至在任何必要的后处理和或纯化步骤后消耗起始材料以获得H-6。

一般反应方案8

具有螺二氧戊环衍生物的本发明的可离子化脂质(例如化合物I)的说明性实施方案是根据一般反应方案8(“方法I”)制备，其中R¹为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数，R²为烷基、环状、杂环取代基。参考一般反应方案8，结构I-1、I-5的化合物和必要的催化剂可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。I-1、1,2,5-戊三醇和对甲苯磺酸吡啶鎓在甲苯中的混合物在氮气下用迪安-斯达克装置回流过夜以除去水并使反应回流直至反应物完全消耗以获得I-2。在步骤2中进行酯化，I-2与不同的烷基饱和/不饱和直链或双层酸以及试剂如EDC·HCl和4-DMAP在二氯甲烷中反应过夜，获得I-3。胺的脱保护得到I-4衍生物。在步骤3中，I-4与I-5在EDC·HCl、HOBt和DMAP或三乙胺的存在下反应。将所有这些混合物溶解于二甲基甲酰胺中并允许在室温下搅拌直至在任何必要的后处理和或纯化步骤之后消耗起始材料以获得I-6。

一般反应方案9

具有两种可降解酯的脂质(例如化合物A-5)的说明性实施方案可根据一般反应方案9制备，其中R₁为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数。参考一般反应方案9，结构A-1的化合物可从商业来源购得和/或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。A-1与A-2丙烯酰氯衍生物(其中Ra＝CH₃、C₂H₅和/或异丙基)和催化量的碱(例如三乙胺)在二氯甲烷溶剂中反应4-5小时，得到被取代的酰化产物A-3。酰化产物与头部基团(R1)N,N-二甲基二胺和或伯胺取代基(例如N-烷基、无环、环状、杂环、芳族胺)A-4的混合物在任何必要的后处理和或纯化步骤之后在足以产生A-5的温度和时间下加热。

一般反应方案10

在接头与内部胺之间具有增加的碳间隔基的脂质(例如化合物B-2)的说明性实施方案可根据一般反应方案10制备，其中R₁和R₂为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至6的整数。参考一般反应方案10，结构B-2的化合物是根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。将B-1与B-2在作为溶剂的二氯甲烷中的混合物用化学计量的量的N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或DCC二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑(HOBt)和碱如三乙胺处理，得到酯衍生物B-3，接着将B-3与A-4的混合物在无水乙腈溶剂中用碱(例如N,N-二异丙基乙胺)处理，在任何必要的后处理和或纯化后在67℃的温度下加热16小时，产生B-4。

一般反应方案11

具有可降解/不可降解的脂质(例如化合物C-2)的说明性实施方案可根据一般反应方案11制备，其中R尾部为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至8的整数。参考一般反应方案11，结构A-4的化合物可从商业来源购得和或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在任何必要的后处理和或纯化步骤后，A-4与C-1在催化量的碱(例如，碳酸钾、N,N-二异丙基乙胺、碘化钾)存在下在乙腈溶剂中在67℃的温度下反应16小时，产生C-2。

一般反应方案12

具有可降解/不可降解的脂质(例如化合物D-4)的说明性实施方案可根据一般反应方案12制备，其中R尾部为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至12的整数。参考一般反应方案12，结构A-4的化合物可从商业来源购得和或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在任何必要的后处理和或纯化步骤后，过量当量的A-4与1当量的C-1在催化量的碱(例如碳酸钾、N,N-二异丙基乙胺、碘化钾)存在下在乙腈溶剂中在67℃温度下反应16小时，产生D-1。然后D-1与D-2以与步骤1相同的方式反应，产生D-3。A-3与D-3在无溶剂条件下反应，产生D-4，以用于按照方案1的程序。此外，N,N-烷基化是通过与B-3和D-3以与一般反应方案10相同的程序进行反应来完成。

一般反应方案13

具有可降解/不可降解的脂质(例如化合物E-2)的说明性实施方案可根据一般反应方案13制备，其中R尾部为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至12的整数。参考一般反应方案13，结构A-4和E-1的化合物可从商业来源购得和或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在任何必要的后处理和或纯化步骤之后，过量当量的E-1与1当量的A-4在化学计量的量的三乙酰氧基硼氢化钠存在下在二氯甲烷溶剂中反应4-5小时，产生E-2。

一般反应方案14

具有可降解/不可降解的脂质(例如化合物F-2)的说明性实施方案可根据一般反应方案14制备，其中R尾部为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至14的整数。参考一般反应方案14，结构A-4和F-1的化合物可从商业来源购得和或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在任何必要的后处理和或纯化步骤之后，过量当量的F-1与1当量的A-4在催化量的四丁基氟化铵存在下在四氢呋喃溶剂中于80℃下反应3天，产生F-2。

一般反应方案15

具有六种可降解酯的脂质(例如化合物D-8)的说明性实施方案可根据一般反应方案15制备，其中R尾部为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n为1至8的整数，R头部为烷基、环状、杂环取代基。参考一般反应方案7，结构B-1和A-4的化合物可从商业来源购得或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。B-1在乙醇存在下使用催化量的硫酸进行酯化，获得G-1。此外，通过经典芬克尔斯坦反应，用碘化钠的丙酮溶液将烷基溴转化为相应的烷基碘G-2。将G-2与G-3的混合物与乙醇钠(NaOEt)在乙醇中在回流下反应，接着酸化至低pH，得到G-4。在步骤4中，在N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和催化量的4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)存在下在二氯甲烷中进行费雪(Fischer)酯化反应过夜，得到G-5。在硼氢化钠(NaBH4)存在下，进一步将G-5还原为相应的还原胺化，得到G-6。在任何必要的后处理和或纯化步骤之后，在足以产生D-8的温度和时间下，经纯化的G-6在碱(例如三乙胺)存在下，在四氢呋喃溶剂中与酰基或磺酰氯衍生物G-8反应4-5小时，得到被取代的酰化产物G-9。

一般反应方案16

在接头与内部胺之间具有增加的碳间隔基的脂质(例如化合物H-4)的说明性实施方案可根据一般反应方案16制备，其中R1和R2为具有直链的饱和或不饱和C₁-C₁₈烷基，或具有双层尾(对称和不对称)的饱和/不饱和基团，n和n1为1至6的整数。参考一般反应方案16，结构H-4的化合物是根据本领域普通技术人员熟悉的方法来制备。将B-1与B-2在作为溶剂的二氯甲烷中的混合物用化学计量的量的N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)或DCC二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑(HOBt)和碱如三乙胺处理，得到酯衍生物B-3。另一方面，胺H-1的保护是根据前述方法完成，产生H-1，然后将B-3与H-1的混合物用碱(例如N,N-二异丙基乙胺)在无水乙腈溶剂中处理，在67℃下加热16小时，产生H-3，接着在酸介质存在下进行脱保护，然后在任何必要的后处理和或纯化后进行N-烷基化以产生H-4。

V.5.包含本发明的可离子化脂质的LNP的靶向递送

在某些实施方案中，令人惊讶地发现，当本发明的可离子化脂质用于肌内(IM)注射用疫苗中时，经由IM途径递送至树突状细胞的LNP需要不同于向肝细胞的静脉内(IV)递送。在某些实施方案中，肝细胞靶向是由于LNP与ApoE相关联，ApoE将LNP摄取靶向肝细胞LDL受体，而ApoE在IM施用中可能没有相同的作用。在某些实施方案中，LNP的第二靶向机制是它们的净电荷。在某些实施方案中，带负电的LNP在IV施用时靶向脾脏，而带正电的LNP靶向肺脏并且接近中性的LNP靶向肝脏。然而，本发明人基于以下结果惊奇地发现显著的电荷效应：先前已知的LNP在IM施用后迅速播散并全身表达，而在LNP中使用的本发明的可离子化脂质可经调整为在生理pH下具有轻微的正电荷或接近中性，并且不会播散，并在肌肉和引流淋巴结中局部表达，以通过靶向递送产生稳健免疫反应。在某些实施方案中，表达的定位可通过避免脱靶表达来提高效力并减少全身不良事件。

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质和分支脂质尾部的质子化促进胞内体释放，并且LNP电荷影响靶向。在其他实施方案中，本发明的可离子化脂质影响LNP结构对其佐剂性的作用。在某些实施方案中，当与蛋白质亚单位抗原一起递送时，不对称可离子化脂质LNP充当强的Th2偏向佐剂。

在某些实施方案中，这些LNP驱动的佐剂效应的多样性激发控制这些特性的结构功能关系(SFR)的鉴定，所述特性可能涉及头部基团的环状对比直链性质。

不希望受理论束缚，本发明涵盖本发明的可离子化脂质和有效LNP，例如用于mRNA疫苗中，其基于对将LNP离子化、电荷和结构与在向其他递送部位的潜在应用下肌内施用的递送效率、靶向性和佐剂性联系起来的SFR的理解。

在某些实施方案中，对于可离子化脂质，pKa是由ACDLabs Percepta获得，而对于含有可离子化脂质的LNP，是通过ζ电位和TNS获得。在其他实施方案中，LNP等电pI是由ζ电位获得，并且LNP直径是来自DLS的数均值。每个LNP的平均mRNA拷贝是使用分子体积模型和DLS直径来计算，并且与LNP体积成比例。

在某些实施方案中，本发明涵盖由式I的结构所涵盖的本发明的可离子化脂质：

头部——间隔基——接头——间隔基——尾部式I

其中pKa可经调节以实现对身体的特定组织或器官的靶向递送。本领域普通技术人员将认识到，式I-IX的本发明的可离子化脂质及其特定实施方案可用于LNP的靶向递送。

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质可经调整以在生理pH下具有轻微的正电荷或接近中性，由此它们不会全身性播散并在局部例如在肌肉和引流淋巴结中表达，以通过靶向递送产生稳健免疫反应。在某些实施方案中，表达的定位可通过避免脱靶表达来提高效力并减少全身不良事件。

在某些实施方案中，用于LNP中的本发明的可离子化脂质中的分支脂质尾部的质子化和利用促进胞内体释放，并且LNP电荷影响靶向——第三SFR是LNP结构对其佐剂性的影响。在某些实施方案中，当与蛋白质亚单位抗原一起递送时，LNP中的本发明的不对称可离子化脂质充当强的Th2偏向佐剂，并且LNP mRNA疫苗驱动Tfh偏向反应，从而刺激Tfh和生发中心B细胞的增殖和有效的持久中和抗体反应。

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质经设计成具有三个已知控制递送效率的结构特征-在胞内体pH范围内的离子化、在生理pH下的净电荷以及与分支和饱和/不饱和相关的脂质尾构象。在某些实施方案中，候选物评估和阐明结构-功能关系(SFR)的方法包括翻译和毒性的体外和体内评估；细胞摄取、胞内体释放和先天性免疫传感器激活的体外评估；分布和细胞运输的体内表征；免疫原性；以及在病毒挑战研究中使用当前和进化的啮齿动物和非啮齿动物模型。

在某些实施方案中，由于组装期间脂质与mRNA的混合浓度增加，本发明的可离子化脂质具有增加的mRNA LNP体内表达(>5X)。

在某些实施方案中，包含本发明的可离子化脂质的LNP的靶向递送包括：1)优化多价头部基团的离子化特性，所述头部基团在生理pH下可产生轻微带正电或接近中性的LNP，以限制全身播散并增加胞内体离子化，从而提高疫苗效力。在其他实施方案中，包含本发明的可离子化脂质的LNP的靶向递送涉及高度分支和可降解的脂质尾部，其可经由胞内体释放进一步提高效力。在其他实施方案中，包含本发明的可离子化脂质的LNP的靶向递送涉及可影响LNP佐剂性的本发明的可离子化脂质的电荷和结构。

在某些实施方案中，LNP效力提高以限制不良事件、降低制造成本并提高为大量人群接种疫苗的能力。

在某些实施方案中，本发明涵盖一种优于当前LNP的LNP递送系统，与疫苗中的当前LNP相比，其具有在更低剂量下的保护、更低的反应原性、更低的全身分布和更大的储存稳定性。在某些实施方案中，就所有这些特性而言，第一代C24 LNP优于MC3，即本领域中的标准参考LNP，并且在其临床前研究中超过了所公布的疫苗中和滴度。在某些实施方案中，使用最新的第二代LNP与所公开的疫苗制剂进行头对头比较，所述LNP比C24有所改进。在某些实施方案中，本发明涵盖鉴定参与疫苗反应的细胞类型和细胞反应的作用机制。在某些实施方案中，通过将电荷介导的靶向(以消除脱靶肝脏表达并增加脾脏靶向)与配体介导的靶向(针对T细胞中的特定细胞摄取)相结合，将精确靶向递送至脾脏T细胞。在某些实施方案中，对多样化和独特的高效可离子化脂质文库的系统筛选将允许鉴定其他几种可实现的细胞特异性靶标，所述靶标将经由电荷和配体介导的靶向以及配制和制造过程参数进行优化。

在某些实施方案中，本发明涵盖使用3种mRNA编码的报告基因、荧光素酶、mCherry和Cre重组酶以及一种mRNA编码的免疫原，即S2P SARS-Cov-2免疫原。在某些实施方案中，这些构建体足以开发mRNA脂质纳米颗粒的表达、靶向和毒性的一般原理和模型。在某些实施方案中，其他RNA序列的取代，无论是小(siRNA)或大(自扩增RNA、多价疫苗、基因编辑设计)，都需要对LNP制剂和制造进行相对较小或适度的修改。

在某些实施方案中，本发明涵盖鉴定预测靶向性能属性的LNP特征的方法并提供测量它们的方法。在某些实施方案中，经改进的制造过程允许鉴定适当的过程控制(IPC)，以确保一致地制造高效LNP。在某些实施方案中，所述方法可在需要靶向递送治疗剂或预防剂的各种系统上实施。

在某些实施方案中，本发明涵盖一种在结构和理论离子化特性方面具有系统变化的可离子化脂质的新颖文库。在某些实施方案中，本文所述的一系列计划模块允许获取数据集，这些数据集将允许预测模型将LNP的性能决定特性与分子、制剂和制造参数相关联(下面三个最左侧框中的每个箭头都有多个模型)。

在某些实施方案中，有些模型是涉及机器学习方法的统计模型，而有些则是机械模型。在某些实施方案中，LNP的性能已经表征为当前理解的影响性能的特征(在上面的中间框中并且如上所述进行预测)。在某些实施方案中，所测量的体外和体内性能包括表达效率、器官和细胞靶向、毒性、可降解性和免疫原性(上面最右侧框)。

在某些实施方案中，基于体外细胞培养的表征和动物模型中的体内性能表征由LNP特征(从中央框至上方最右侧框的箭头)预测LNP性能。

在某些实施方案中，体内mRNA-LNP表达和靶向的决定因素包括但不限于LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)、胞内体质子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可离子化脂质膜破坏能力(MDIL)、可离子化脂质RNA释放能力(RRIL)、靶向配体密度(ρL)和结合亲和力(KL)。在某些实施方案中，这些参数依次由可离子化脂质离子化和结构特性以及配制参数(例如脂质类型和摩尔比)、制造工艺(例如浓度、缓冲液、pH值、溶剂比、流动速率)和配体缀合决定。在某些实施方案中，所述模型根据可离子化脂质特性、配制参数和制造工艺参数以及预测LNP中的mRNA稳定性的模型来预测NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL和KL。

在一个实施方案中，LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)和胞内体质子化(EPLNP)预测是源自可离子化脂质结构和离子化特性。在一个实施方案中，本发明涵盖一种由单质子可离子化脂质的分子离子化常数在理论上预测LNP离子化特性的方法，并扩展至多质子可离子化脂质，其具有更大的控制LNP的胞内体质子化和净电荷的潜力。

在一个实施方案中，脂质尾部的结构对于mRNA LNP的递送、释放和表达效率很重要，并且被认为是由于它们的胞内体膜破坏和RNA释放能力。

在某些实施方案中，本发明涵盖评估在LNP中储存期间的mRNA切割的方法。在一个实施方案中，可离子化脂质经由此反应的动力学的pH依赖性影响切割速率。

在一个实施方案中，LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)、胞内体质子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可离子化脂质膜破坏能力(MDIL)和RNA释放能力(RRIL)预测是由LNP制剂获得。在一个实施方案中，LNP电荷可通过改变制剂比率、添加第5种脂质以及将特定的离子化特性设计至可离子化脂质中来修改。在一个实施方案中，不同的PEG脂质结构还会影响表达和靶向。

在一个实施方案中，在混合和自组装之前制备脂质溶液和mRNA溶液的方法形成LNP，根据体外和体内报告基因表达，它们是更有效的递送媒介物。在一个实施方案中，这些新颖溶液在自组装期间具有更高浓度的脂质和mRNA，以及用于质子化可离子化脂质的特定方法。在一个实施方案中，统计机器学习模型将制造参数与LNP特性相关联。

在一个实施方案中，靶向配体直接与完整LNP的缀合显示出细胞特异性靶向的大量增加。

在其他实施方案中，对于某些LNP，ApoE吸附是细胞摄取LNP所必需的。在某些实施方案中，肝细胞中具有较高PEG-脂质含量的LNP活性降低导致ApoE与LNP的结合减少。在某些实施方案中，与含1.5％ PEG-脂质的LNP相比，含5％ PEG-脂质的LNP与ApoE的结合亲和力较低。在某些实施方案中，通过将独特的靶向配体引入高度聚乙二醇化LNP中，可阻断ApoE介导的细胞摄取并且可实现LNP的选择性递送。

在某些实施方案中，甘露糖缀合的纳米颗粒已在各种靶向递送研究中进行研究，并且这些纳米颗粒已经证明是安全的。为了在LNP表面上引入甘露糖部分，使用甘露糖-PEG脂质。

V.6.含有本发明的可离子化脂质的脂质纳米颗粒

在某些实施方案中，本发明涵盖脂质纳米颗粒，其包含一种或多种本发明的可离子化脂质。在某些实施方案中，LNP包含第二脂质。在某些实施方案中，LNP包含类固醇。在其他实施方案中，LNP包含聚乙二醇化脂质。在其他实施方案中，LNP包含核酸，优选mRNA。

如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”，也称为LNP，是指具有纳米量级(例如，1-1,000nm)的至少一个尺度的颗粒，其包含本发明的可离子化脂质，例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵盖的本发明的可离子化脂质或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，此类脂质纳米颗粒包含例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵盖的本发明的可离子化脂质以及一种或多种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合脂质(例如聚乙二醇化脂质)的赋形剂。在一些实施方案中，核酸(优选mRNA)或其一部分被封装在脂质纳米颗粒的脂质部分或由脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包覆的水性空间中，从而保护其免受酶促降解或由宿主生物或细胞的机制诱导的其他不希望有的效应，例如不良免疫反应。在一些实施方案中，mRNA或其一部分与脂质纳米颗粒结合。

在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒不限于任何特定形态，并且应解释为包括当由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵盖的本发明的可离子化脂质与任选地一种或多种其他脂质在例如水性环境中和/或在核酸化合物存在下组合时产生的任何形态。例如，脂质体、脂质复合物、脂质复合体等都在脂质纳米颗粒的范围内。

在各个实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上无毒。在某些实施方案中，当存在于脂质纳米颗粒中时，mRNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。如本文所用，平均直径可由通过动态光散射测定的数量加权平均值表示。

LNP可包含由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)和(IX)所涵盖的本发明的任何可离子化脂质，其能够形成颗粒，一个或多个核酸分子附着于所述颗粒上，或者一个或多个核酸分子封装于其中。术语“脂质”是指一组有机化合物，其为脂肪酸的衍生物(例如，酯)，并且特征通常为不溶于水但可溶于许多有机溶剂。脂质通常可分为至少三种类别：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，例如类固醇。

在一个实施方案中，含mRNA的LNP包含由如本文定义的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵盖的一种或多种本发明的可离子化脂质，以及一种或多种稳定化脂质。稳定化脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。

如所提及，LNP包含例如由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)所涵盖的本发明的可离子化脂质。在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质优选为可阳离子化的(即，当pH低于脂质的可离子化基团的pKa时，它变得质子化)，但在较高pH值下逐渐变得更中性。在某些实施方案中，当带正电时，脂质能够与带负电的核酸结合。在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质包含在pH值降低时呈现正电荷的两性离子脂质。LNP可包含任何能够形成颗粒的脂质，一个或多个核酸分子附着于所述颗粒上或一个或多个核酸分子封装于所述颗粒中。

在某些实施方案中，LNP可包含另一种阳离子或可阳离子化脂质，(即，在选择性pH如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任一种)。此类脂质的实例包括但不限于N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N',N'二甲氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰羧精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。

另外，可在本发明中使用许多市售的脂质制剂。它们包括例如(市售阳离子脂质体，包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL,Grand Island,N.Y.)；(市售阳离子脂质体，包含N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；以及(市售阳离子脂质，包含乙醇中的双十八烷基酰氨基甘氨酰羧精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子脂质，并且在低于生理pH时具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)。

在其他实施方案中，其他脂质是氨基脂质。适用于本发明中的适合的氨基脂质包括WO2012/016184中描述的那些，所述文献通过引用整体并入本文。代表性氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油酰氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰氧基-3吗啉并丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油酰基硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油酰基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油酰基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油酰基氧代-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。

在某些实施方案中，LNP包含一种或多种在颗粒形成期间稳定颗粒的形成的额外脂质。

适合的稳定化脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任一种。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。

示例性中性脂质包括例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚胺甲基)-环己烷-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(transDOPE)。在一个实施方案中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱(DSPC)。

在一些实施方案中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各个实施方案中，本发明的可离子化脂质(例如，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的结构所涵盖的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1范围内。在某些实施方案中，摩尔比为2:1、2.5:1、3:1.、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、15:1、20:1、30:1、50:1和这些范围内包括的所有摩尔比。

在各个实施方案中，LNP还包含类固醇或类固醇类似物。

在某些实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方案的一些中，本发明的可离子化脂质(例如，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的结构所涵盖的脂质)与类固醇的摩尔比在约5:1至1:1范围内。在某些实施方案中，摩尔比为2:1、2.5:1、3:1.、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、15:1、20:1、30:1、50:1和这些范围内包括的所有摩尔比。

术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、正十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈油醇磷脂酰甘油(POPG)和连接至中性脂质的其他阴离子修饰基团。

在某些实施方案中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。

在一些实施方案中，LNP包含聚合物缀合脂质。术语“聚合物缀合脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的一个实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域中已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-s-DMG)等。

在某些实施方案中，LNP包含额外的稳定化脂质，其为聚乙二醇-脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方案中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其他实施方案中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，例如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨甲酸酯，例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨甲酸酯。在各个实施方案中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比在约400:1至约10:1范围内。

如所提及，包含脂质纳米颗粒的mRNA可包含具有以下结构的聚乙二醇化脂质：

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：

R⁸和R⁹各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地由一个或多个酯键中断；并且w具有在30至60范围内的平均值。

在聚乙二醇化脂质的先前实施方案的一些中，当w为42时，R⁸和R⁹不都为正十八烷基。在一些其他实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有10至18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有12至16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在其他实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在更多实施方案中，R⁸和R⁹各自独立地为含有18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。在其他实施方案中，R⁸为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链，并且R⁹为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链。

在各个实施方案中，w跨越选定的范围，使得PEG部分具有约400至约6000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，w平均为约50。

在某些实施方案中，相对于纳米颗粒的总脂质含量，PEG脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方案中，PEG脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方案中，PEG脂质以约1摩尔百分比或约1.5摩尔百分比存在于LNP中。

在某些实施方案中，LNP包含一个或多个能够将LNP靶向细胞或细胞群的靶向部分。例如，在一个实施方案中，靶向部分是将LNP引导至见于细胞表面上的受体的配体。

在某些实施方案中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方案中，LNP包含一个或多个与细胞结合以诱导LNP的内化的结构域。例如，在一个实施方案中，一个或多个内化结构域与见于细胞表面上的受体结合以诱导受体介导的LNP摄取。在某些实施方案中，LNP能够在体内结合生物分子，接着结合LNP的生物分子可由细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方案中，LNP结合全身ApoE，其导致LNP和相关货物的摄取。

其他示例性LNP及其制造在本领域中有所描述，例如在美国专利申请公开第US20120276209号；Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74中，所述文献各自通过引用整体并入。

在优选实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上无毒。如所提及，平均直径可对应于通过动态光散射测定的数量加权平均值。

在本发明的另一个优选实施方案中，脂质纳米颗粒分别具有在约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm、或约60nm至约120nm范围内的流体动力学直径。

在某些实施方案中，当存在于脂质纳米颗粒中时，mRNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。

脂质纳米颗粒中mRNA的总量会有所不同，并且可根据mRNA与总脂质的w/w比率来定义。在某些实施方案中，纳米颗粒比率为2至10。在本发明的一个实施方案中，mRNA与总脂质的比率小于0.06w/w，优选介于0.03与0.04w/w之间。

在一些实施方案中，LNP包含由式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)结构中的任一者所涵盖的本发明的可离子化脂质；如上定义的mRNA化合物、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。

在某些实施方案中，LNP包含一个或多个能够将LNP靶向细胞或细胞群的靶向部分。例如，在一个实施方案中，靶向部分是将LNP引导至见于细胞表面上的受体的配体。

在某些实施方案中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方案中，LNP包含一个或多个与细胞结合以诱导LNP的内化的结构域。例如，在一个实施方案中，一个或多个内化结构域与见于细胞表面上的受体结合以诱导受体介导的LNP摄取。在某些实施方案中，LNP能够在体内结合生物分子，接着结合LNP的生物分子可由细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方案中，LNP结合全身ApoE，其导致LNP和相关货物的摄取。

特别是，本发明涉及以下非限制性具体实施方案。

在一个优选实施方案中，本发明涉及一种包含脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含根据如上定义的式(I)、(II)、(II)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的本发明的可离子化脂质和包含编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列的mRNA化合物、以及DSPC、胆固醇和PEG脂质，其比率为约50:10:38.5:1。

在一个具体的优选实施方案中，本发明涉及一种包含脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含本发明的可离子化脂质、PEG-脂质、包含编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列的mRNA化合物、类固醇和中性脂质，其中优选在约50:10:38.5:1.5的比率下，封装未经修饰的、1-甲基假尿苷修饰的或密码子优化的mRNA。优选地，抗原肽或蛋白质来源于致病性抗原、肿瘤抗原、过敏性抗原或自身免疫性自身抗原或其片段或变体。

在某些实施方案中，本发明涵盖一种包括本发明的可离子化脂质的50-100nm直径的LNP，所述LNP由核酸和以下4种脂质构成：具有氨基的本发明的可离子化脂质(50％)、第二脂质(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC))(10％)、类固醇(例如胆固醇)(38.5％)和聚乙二醇化脂质(例如，1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000))(1.5％)(括号中为摩尔比)。

在某些实施方案中，包含在LNP中的本发明的可离子化脂质的量为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9、40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9、50、55、60、65、70或75摩尔百分比。

在某些实施方案中，包含在LNP中的第二脂质的量为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9或40摩尔百分比。

在某些实施方案中，包含在LNP中的类固醇的量为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20、21.1、21.2、21.3、21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、30、31、31.1、31.2、31.3、31.4、31.5、31.6、31.7、31.8、31.9、32、32.1、32.2、32.3、32.4、32.5、32.6、32.7、32.8、32.9、33、33.1、33.2、33.3、33.4、33.5、33.6、33.7、33.8、33.9、34、34.1、34.2、34.3、34.4、34.5、34.6、34.7、34.8、34.9、35、35.1、35.2、35.3、35.4、35.5、35.6、35.7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36.4、36.5、36.6、36.7、36.8、36.9、37、37.1、37.2、37.3、37.4、37.5、37.6、37.7、37.8、37.9、38、38.1、38.2、38.3、38.4、38.5、38.6、38.7、38.8、38.9、39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9、40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9、50、55、60、65、70或75摩尔百分比。

在某些实施方案中，包含在LNP中的聚乙二醇化脂质的量为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20摩尔百分比。

在某些实施方案中，亲水性DMG-PEG形成LNP的壳。核酸的量由可离子化脂质上的胺与核酸骨架上的磷酸基团的NP摩尔比表示，并且通常为3-6。在某些实施方案中，LNP的pKa在6-7范围内，对应于早期胞内体中的pH。LNP中可离子化脂质的pKa与基因沉默效率之间的联系表明，6-7范围内的LNP pKa对可离子化脂质DLinDMA产生更多沉默并与促进脂质结构有关，这可能会破坏胞内体的膜。使用阴离子染料TNS荧光增强的pH依赖性测量LNP的pKa。在某些实施方案中，pKa依赖性胞内体释放机制被描述为阳离子质子化可离子化脂质与阴离子胞内体磷脂之间的离子配对事件，其中可离子化脂质的发散锥形脂质尾部促进膜破裂。

在特别优选实施方案中，脂质纳米颗粒包括包含在脂质纳米颗粒中的mRNA，其中优选地，抗原肽或蛋白质源自流感病毒的血球凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核输出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶碱性蛋白2(PB2)或其片段或变体。更优选地，抗原肽或蛋白质源自流感病毒的血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体。甚至更优选地，抗原肽或蛋白质是流感病毒的血球凝集素(HA)的至少一种全长蛋白质和/或神经氨糖酸苷酶(NA)的至少一种全长蛋白质或其变体。在另一个优选实施方案中，流感病毒选自甲型、乙型或丙型流感病毒。在一个特别优选实施方案中，甲型流感病毒选自以血球凝集素(HA)为特征的流感病毒，所述血球凝集素选自由以下组成的组：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18，并且/或甲型流感病毒选自以神经氨糖酸苷酶(NA)为特征的流感病毒，所述神经氨糖酸苷酶选自由以下组成的组：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11。优选地，甲型流感病毒选自由以下组成的组：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2和H10N7，优选选自H1N1、H3N2、H5N1。最优选地，mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)或其片段或变体的抗原肽或蛋白质和至少一种源自流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。在一个特别优选实施方案中，mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质和/或至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，所述甲型流感病毒选自由以下组成的组：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2和H10N7，优选选自H1N1、H3N2、H5N1或其片段或变体。

V.7.制备本发明的LNP的方法

本发明还涉及一种制备脂质纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将以下各物组合：

(a)如上定义的本发明的可离子化脂质或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，

(b)PEG脂质；

(c)至少一种mRNA化合物，其包含编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列；和

(d)任选地类固醇；以及

(e)任选地中性脂质；

(ii)将可离子化脂质和/或PEG脂质和任选地中性脂质和/或类固醇或类固醇衍生物溶解于乙醇中；

(iii)将乙醇脂质溶液与包含mRNA多核苷酸的水溶液混合

(iv)去除乙醇以形成封装或结合mRNA多核苷酸的脂质纳米颗粒；和任选地

(v)经由稀释、透析或过滤调节pH；

(vi)分离或纯化脂质纳米颗粒。

乙醇可通过不会对脂质或所形成的脂质纳米颗粒产生负面影响的任何适合的方法去除。在本发明的一个实施方案中，乙醇是通过透析去除。在一个替代实施方案中，乙醇是通过透析过滤去除。

脂质纳米颗粒的分离和最佳纯化也可能通过任何适合的方法进行。优选地，对脂质纳米颗粒进行过滤，更优选地，经由无菌过滤器，通过过滤分离或纯化脂质纳米颗粒。

V.8.本发明的药物组合物

本发明还涵盖包含本发明的可离子化脂质和核酸的药物组合物和/或疫苗。

在一个优选实施方案中，包含mRNA的根据本发明的药物组合物或疫苗包含脂质纳米颗粒，其摩尔比为约50:10:38.5:1.5、优选47.5:10:40.8:1.7或更优选47.4:10:40.9:1.7(即，本发明的可离子化脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质的比例(摩尔％)；溶解于乙醇中)。在另一个实施方案中，摩尔比为48:12:38:2。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种根据本发明的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含mRNA化合物，所述mRNA化合物包含编码至少一种如本文所定义的抗原肽或蛋白质的序列。

在本发明的一个实施方案中，mRNA序列编码一种抗原肽或蛋白质。在本发明的一个替代实施方案中，mRNA序列编码超过一种抗原肽或蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含根据本发明的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含超过一种mRNA化合物，其各自包含编码抗原肽或蛋白质的不同mRNA序列。

在本发明的一个替代实施方案中，药物组合物包含第二脂质纳米颗粒，其中所述第二脂质纳米颗粒所包含的mRNA化合物不同于第一脂质纳米颗粒所包含的mRNA化合物。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含含有至少一个如本文所定义的编码区的mRNA序列；和药学上可接受的载体。根据本发明的组合物优选作为药物组合物或疫苗提供。

根据一个优选实施方案，根据本发明的药物组合物或疫苗包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种含有至少一个如上定义的mRNA序列的mRNA，其中所述至少一个mRNA序列的至少一个编码区编码至少一种抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质优选源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质，优选为血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)蛋白或糖蛋白中的任一者，或这些蛋白质中任一者的片段或变体。

优选地，根据本发明的药物组合物或疫苗包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种含有至少一个如上定义的mRNA序列的mRNA，其中所述至少一个mRNA序列的至少一个编码序列包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列编码至少一种抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质优选源自流感病毒的蛋白质，优选为血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)蛋白中的任一者或其片段或变体，其中源自流感病毒的蛋白质的蛋白质优选包含以下或由以下组成：氨基酸序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。或者，抗原肽或蛋白质源自狂犬病病毒，优选源自狂犬病病毒的糖蛋白或这些序列中的任一者的片段或变体。

优选地，根据本发明的药物组合物或疫苗包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种含有至少一个如上定义的mRNA序列的mRNA，其中所述mRNA序列的至少一个编码序列包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列编码至少一种源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体的抗原肽或蛋白质，其中所述抗原肽或蛋白质源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质。

因此，根据本发明的药物组合物或疫苗可包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种mRNA，所述mRNA包含至少一个含有至少一个编码区的mRNA序列，所述编码区编码至少一种抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，其中所述至少一个mRNA序列的至少一个编码区编码一种特定的抗原肽或蛋白质，例如源自本文所定义的流感病毒的蛋白质或其片段或变体。

或者，本发明的药物组合物或疫苗可包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种含有至少一个根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物，其中所述至少一个mRNA序列编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种不同的抗原肽或蛋白质，例如源自如本文所定义的流感病毒的蛋白质或其片段或变体。

在此上下文中，特别优选的是，包含在药物组合物或疫苗中的至少一种mRNA化合物是双顺反子或多顺反子mRNA，其编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种不同的抗原肽或蛋白质，例如源自流感病毒的蛋白质。还设想这些实施方案之间的混合物，例如包含超过一个mRNA序列的组合物，其中至少一个mRNA序列可为单顺反子的，而至少一个其他mRNA序列可为双顺反子的或多顺反子的。

根据本发明的药物组合物或疫苗，优选地其中包含的mRNA序列的至少一个编码序列，因此可包含如本文所定义的核酸序列的任何组合。

优选地，药物组合物或疫苗包含含有脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含多个或超过一个根据本发明的mRNA序列，其中每个mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种抗原肽或蛋白质，其源自流感病毒的蛋白质或其片段或变体。

在一个特别优选实施方案中，所述组合物包含至少2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100个不同的mRNA序列，每个序列编码至少一种抗原肽或蛋白质，例如源自如上所定义的流感病毒的蛋白质或其片段或变体，例如源自流感病毒的血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体。

在另一个实施方案中，所述组合物包含4个不同的mRNA序列，每个序列编码至少一种抗原肽或蛋白质，优选源自如上所定义的流感病毒的蛋白质或其片段或变体，例如，源自流感病毒的血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体。

在此上下文中，特别优选的是，每个mRNA序列编码至少一种不同的抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质源自相同病原体(例如流感病毒)的蛋白质，其中特别优选的是，所述抗原肽或蛋白质源自相同病原体(例如流感病毒)的不同蛋白质。优选地，所述组合物包含至少两个mRNA序列，其中至少一个mRNA序列编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，并且至少一个mRNA序列编码至少一种源自相同流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质。

在另一个优选实施方案中，每个mRNA序列编码至少一种不同的抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质源自不同病原体(例如流感病毒)的蛋白质。优选地，每个mRNA序列编码至少一种源自不同流感病毒的血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质。

优选地，根据本发明的药物组合物或疫苗包含多个mRNA序列，每个mRNA序列编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中源自2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或100种不同流感病毒的血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)的至少一种抗原肽或蛋白质是由多个mRNA序列编码。

在此上下文中，特别优选的是，药物组合物或疫苗包含至少一种mRNA，所述mRNA包含含有mRNA化合物的脂质纳米颗粒，所述mRNA化合物包含：编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒H1的蛋白质，优选源自血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)；至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒H3的蛋白质，优选源自血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)；至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒H5的蛋白质，优选源自血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)；和任选地至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒H7的蛋白质，优选源自血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)；和/或任选地至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒H9的蛋白质，优选源自血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)。

优选地，药物组合物或疫苗包含至少一种mRNA，所述mRNA包含含有mRNA化合物的脂质纳米颗粒，所述mRNA化合物包含：编码至少一种源自甲型流感病毒H1的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H1的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H3的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H3的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H5的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H5的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；和任选地至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H7的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H7的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；和/或任选地至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H9的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H9的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列。

在一个具体实施方案中，药物组合物或疫苗包含至少一种mRNA，所述mRNA包含含有mRNA化合物的脂质纳米颗粒，所述mRNA化合物包含：编码至少一种源自甲型流感病毒H1N1的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H1N1的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H3N2的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H3N2的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列；至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H5N1的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自甲型流感病毒H5N1的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列。

另外，药物组合物或疫苗优选还包含至少一种mRNA，所述mRNA包含含有mRNA化合物的脂质纳米颗粒，所述mRNA化合物包含编码至少一种源自至少一种乙型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列和/或至少一个编码至少一种源自至少一种乙型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质的mRNA序列，所述mRNA序列封装或与包含根据本发明的脂质纳米颗粒的mRNA结合。

V.9.用于本发明的LNP中的核酸

本发明是基于以下令人惊讶的发现，即编码包含在脂质纳米颗粒(LNP)中的至少一种抗原肽或蛋白质的核酸(例如，m-RNA)在低剂量和给药方案下非常有效地诱导针对所编码的抗原肽或蛋白质的抗原特异性免疫反应，其不需要频繁施用。

编码包含在脂质纳米颗粒(LNP)中的至少一种抗原肽或蛋白质的本发明mRNA的另一个优点是：诱导强烈的体液免疫反应；诱导b细胞记忆；免疫保护的更快启动；所诱导免疫反应的耐久性；诱导广泛的细胞性t细胞反应；诱导(局部和瞬时)促炎环境；不诱导全身细胞因子或趋化因子反应；耐受性好、无副作用、无毒；有利的稳定性特征；与许多不同抗原相容的制剂；基于相同(生产)技术可行的更大抗原混合液；无载体免疫，即技术可用于针对多种(不同)抗原对同一受试者多次接种疫苗；生产的速度、适应性、简便性和可扩展性。

特别是，本发明涉及脂质纳米颗粒及其用途。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒至少包含：

(i)本发明的可离子化脂质和/或PEG-脂质；和

(ii)mRNA化合物，其包含编码抗原肽或蛋白质的mRNA序列。

在某些实施方案中，包含mRNA的脂质纳米颗粒可包含其他化合物，例如一种或多种中性脂质、类固醇和所述化合物的组合。适合的化合物将在下文中详细描述。

在某些实施方案中，包含编码抗原肽或蛋白质的mRNA序列的mRNA化合物可为mRNA分子。在本发明的一个实施方案中，mRNA化合物为天然和未经修饰的mRNA。在本发明的上下文中，天然和未经修饰的mRNA涵盖体外产生的mRNA，没有化学修饰或序列变化。

在本发明的一个替代实施方案中，mRNA化合物包含人工mRNA。在本发明的上下文中，人工mRNA涵盖具有化学修饰、序列修饰或非天然序列的mRNA。

在本发明的一个优选实施方案中，mRNA化合物不包含核苷修饰，特别是无碱基修饰。在另一个实施方案中，mRNA化合物不包含1-甲基假尿苷修饰。在一个优选实施方案中，mRNA仅包含天然存在的核苷。在另一个优选实施方案中，mRNA化合物不包含任何化学修饰并且任选地包含序列修饰。在本发明的另一个优选实施方案中，mRNA化合物仅包含天然存在的核苷腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。

根据本发明的某些实施方案，mRNA序列为单顺反子、双顺反子或多顺反子的，优选如本文所定义。双顺反子或多顺反子mRNA中的编码序列优选编码如本文所定义的不同肽或蛋白质或其片段或变体。优选地，编码两种或更多种肽或蛋白质的编码序列可在双顺反子或多顺反子mRNA中由至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列分隔开，如下所定义。因此，术语“编码两种或更多种肽或蛋白质”可意指但不限于双顺反子或甚至多顺反子mRNA可编码例如至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(优选不同的)在本文所提供的定义内的肽或蛋白质或其片段或变体。更优选地但不限于此，双顺反子或甚至多顺反子mRNA可编码例如至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(优选不同的)如本文所定义的肽或蛋白质或如本文所定义的其片段或变体。

在此上下文中，如上所定义的所谓的IRES(内部核糖体进入位点)序列可用作唯一的核糖体结合位点，但其还可用于提供如上所定义的双顺反子或甚至多顺反子mRNA，它编码几种肽或蛋白质，它们是由相互独立的核糖体翻译。可根据本发明使用的IRES序列的实例是来自以下病毒的那些序列：小核糖核酸病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、典型猪瘟病毒(CSFV)、小鼠白血病病毒(MLV)、猴类免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。我们使用的TEV、烟草蚀刻病毒5'UTR为IRES。

根据另一个实施方案，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区可编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种和更多种如本文所定义的肽或蛋白质(或其片段和衍生物)，它们在有或无氨基酸接头序列下连接，其中所述接头序列可包括刚性接头、柔性接头、可切割接头(例如，自切割肽)或其组合。其中，肽或蛋白质可为相同或不同或其组合。特定的肽或蛋白质组合可由编码至少两种如本文所说明的肽或蛋白质的所述mRNA(在本文中也称为“多抗原构建体/mRNA”)编码。

在本发明的一个特定方面，脂质纳米颗粒包含mRNA化合物，所述mRNA化合物包含编码抗原肽或蛋白质或其片段、变体或衍生物的mRNA序列。

这些抗原肽或蛋白质可源自致病性抗原、肿瘤抗原、过敏性抗原或自身免疫性自身抗原，优选如本文所定义。在本发明的上下文中，抗原肽或蛋白质优选排除荧光素酶。

V.9.1.致病性抗原

此类致病性抗原源自致病性生物，特别是细菌、病毒或原生动物(多细胞)致病性生物，其引起受试者、特别是哺乳动物受试者、更特别是人类的免疫反应。更具体地，致病性抗原优选是表面抗原，例如位于病毒或细菌或原生动物生物的表面上的蛋白质(或蛋白质片段，例如表面抗原的外部部分)。

致病性抗原是优选源自与感染性疾病相关的病原体的肽或蛋白质抗原，其优选选自源自以下病原体的抗原：鲍曼氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、边虫属(Anaplasma genus)、嗜吞噬细胞边虫(Anaplasma phagocytophilum)、巴西钩虫(Ancylostoma braziliense)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、曲霉菌属(Aspergillus genus)、星状病毒科(Astroviridae)、焦虫属(Babesia genus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巴尔通氏体(Bartonellahenselae)、BK病毒、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、百日咳嗜血杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、疏螺旋体属(Borrelia genus)、疏螺旋体某种(Borrelia spp)、布氏杆菌属(Brucella genus)、马来血丝虫(Brugia malayi)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae family)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)和其他伯克氏菌菌种、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、杯状病毒科(Caliciviridae family)、弯曲杆菌属(Campylobacter genus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、念珠菌属某种(Candida spp)、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、CD朊病毒、中华肝吸虫(Clonorchis sinensis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)、产气荚膜梭状芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌某种(Clostridium spp)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、球孢子菌某种(Coccidioides spp)、冠状病毒(coronaviruses)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、伯纳特氏柯克斯氏体(Coxiella burnetii)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fevervirus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、隐孢子虫属(Cryptosporidium genus)、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(Dengue viruse)(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、埃博拉病毒(Ebolavirus)(EBOV)、绦虫属(Echinococcusgenus)、查菲艾利希体(Ehrlichia chaffeensis)、伊氏艾利希体(Ehrlichia ewingii)、艾利希体属(Ehrlichia genus)、溶组织阿米巴(Entamoeba histolytica)、肠球菌属(Enterococcus genus)、肠病毒属(Enterovirus genus)、肠病毒(主要是甲型柯萨奇(Coxsackie)病毒和肠病毒71(EV71))、表皮癣菌某种(Epidermophyton spp)、EB病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)、大肠杆菌O157:H7、O111和O104:H4、肝片吸虫(Fasciolahepatica)和巨片吸虫(Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、丝虫目超科(Filarioideasuperfamily)、黄病毒(Flaviviruses)、土拉文氏杆菌(Francisella tularensis)、细梭菌属(Fusobacterium genus)、白地丝霉菌(Geotrichum candidum)、肠鞭毛虫(Giardiaintestinalis)、颚口虫某种(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜纳瑞托病毒(Guanaritovirus)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、亨德拉·尼帕病毒(Henipavirus)(亨德拉病毒尼帕病毒)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、荚膜组织浆菌(Histoplasmacapsulatum)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、威尼克何德霉(Hortaea werneckii)、人类波卡病毒(bocavirus)(HBoV)、人类疱疹病毒6(HHV-6)和人类疱疹病毒7(HHV-7)、人类间质肺炎病毒(hMPV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、日本脑炎病毒、JC病毒、Junin病毒、金格金氏杆菌(Kingella kingae)、肉芽肿克雷伯菌(Klebsiella granulomatis)、Kuru朊病毒、赖萨病毒(Lassa virus)、退伍军人嗜肺病菌(Legionella pneumophila)、利什曼原虫属(Leishmania genus)、钩端螺旋体属(Leptospira genus)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、马丘波病毒(Machupovirus)、马拉色菌某种(Malassezia spp)、马堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、横川后殖吸虫(Metagonimus yokagawai)、微孢子目门(Microsporidia phylum)、传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和肉瘤分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎霉浆菌(Mycoplasma pneumoniae)、变形纤毛虫(Naegleria fowleri)、美洲钩虫(Necator americanus)、淋病双球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、星形土壤丝菌(Nocardiaasteroides)、土壤丝菌某种(Nocardia spp)、盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)(流感)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、肺吸虫某种(Paragonimus spp)、卫氏肺吸虫(Paragonimus westermani)、微小病毒B19、巴氏杆菌属(Pasteurella genus)、疟原虫属(Plasmodium genus)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰白质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次体(Rickettsia akari)、立克次体属(Rickettsia genus)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、Rift谷热病毒、轮状病毒、德国麻疹病毒(Rubella virus)、萨比亚病毒(Sabia virus)、沙门杆菌属(Salmonellagenus)、疥螨(Sarcoptes scabiei)、SARS冠状病毒、血吸虫属(Schistosoma genus)、志贺杆菌属(Shigella genus)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌属、葡萄球菌属、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪拟圆虫(Strongyloides stercoralis)、绦虫属(Taeniagenus)、有钩绦虫(Taenia solium)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、犬蛔虫(Toxocara canis)或猫蛔虫(Toxocara cati)、弓虫(Toxoplasma gondii)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)、发癣菌某种(Trichophyton spp)、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、尿素霉浆菌(Ureaplasma urealyticum)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、西尼罗病毒(West Nile virus)、西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)、潘氏丝状虫(Wuchereria bancrofti)、黄热病毒、小肠结肠炎耶氏杆菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶氏杆菌(Yersinia pestis)和假性结核病耶氏杆菌(Yersiniapseudotuberculosis)。

在此上下文中，特别优选为来自选自以下的病原体的抗原：流感病毒、SARS-COV-2、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、疟原虫、困难梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、登革热病毒、砂眼披衣菌、布氏杆菌、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核分枝杆菌、狂犬病病毒、克里米亚-刚果出血热病毒和黄热病病毒。

此外，致病性抗原(源自与感染性疾病相关的病原体的抗原)可优选选自以下抗原：外膜蛋白AOmpA、生物膜相关蛋白Bap、转运蛋白MucK(鲍曼氏不动杆菌，不动杆菌感染))；可变表面糖蛋白VSG、微管相关蛋白MAPP15、转唾液酸酶TSA(布氏锥虫，非洲昏睡病(非洲锥虫病))；HIV p24抗原、HIV包膜蛋白(Gp120、Gp41、Gp160)、多蛋白GAG、负因子蛋白Nef、转录反式活化因子Tat(HIV(人类免疫缺陷病毒)，AIDS(获得性免疫缺陷综合征))；半乳糖可抑制粘着蛋白GIAP、29kDa抗原Eh29、Gal/GalNAc凝集素、蛋白CRT、125kDa免疫显性抗原、蛋白M17、粘附素ADH112、蛋白STIRP(溶组织阿米巴，阿米巴病)；主要表面蛋白1-5(MSP1a、MSP1b、MSP2、MSP3、MSP4、MSP5)、IV型分泌系统蛋白(VirB2、VirB7、VirB11、VirD4)(边虫属，边虫病)；保护性抗原PA、水肿因子EF、致死因子LF、S-层同源蛋白SLH(炭疽芽孢杆菌，炭疽)；溶血素、磷脂酶D、胶原结合蛋白CbpA(溶血隐秘杆菌，溶血隐秘杆菌感染)；核衣壳蛋白NP、糖蛋白前体GPC、糖蛋白GP1、糖蛋白GP2(Junin病毒，阿根廷出血热)；几丁质蛋白层蛋白、14kDa表面抗原A14、主要精子蛋白MSP、MSP聚合组织蛋白MPOP、MSP纤维蛋白2MFP2、MSP聚合活化激酶MPAK、ABA-1样蛋白ALB、蛋白ABA-1、壳脂蛋白CUT-1(人蛔虫，蛔虫病)；41kDa过敏原Asp v13、过敏原Asp f3、主要分生孢子表面蛋白小杆A、蛋白酶Pep1p、GPI-锚定蛋白Gel1p、GPI-锚定蛋白Crf1p(曲霉菌属，曲霉菌病)；家族VP26蛋白、VP29蛋白(星状病毒科，星状病毒感染)；棒状体相关蛋白1RAP-1、裂殖子表面抗原MSA-1、MSA-2(a1、a2、b、c)、12D3、11C5、21B4、P29、变异红细胞表面抗原VESA1、顶端膜抗原1AMA-1(焦虫属，焦虫病)；溶血素、肠毒素C、PXO1-51、乙醇酸氧化酶、ABC-转运蛋白、青霉素结合蛋白、锌转运蛋白家族蛋白、假尿苷合酶Rsu、质粒复制蛋白RepX、寡内肽酶F、原噬菌体膜蛋白、蛋白HemK、鞭毛抗原H、28.5-kDa细胞表面抗原(蜡样芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌感染)；大T抗原LT、小T抗原、衣壳蛋白VP1、衣壳蛋白VP2(BK病毒，BK病毒感染)；29kDa-蛋白、凋亡蛋白酶-3-样抗原、糖蛋白(人芽囊原虫，人芽囊原虫感染)；酵母表面粘附素WI-1(皮炎芽生菌，芽生菌病)；核蛋白N、聚合酶L、基质蛋白Z、糖蛋白GP(马丘波病毒，玻利维亚出血热)；外表面蛋白A OspA、外表面蛋白OspB、外表面蛋白OspC、饰胶蛋白聚糖结合蛋白A DbpA、饰胶蛋白聚糖结合蛋白BDbpB、鞭毛丝41kDa核心蛋白Fla、碱性膜蛋白A前体BmpA(免疫显性抗原P39)、外表面22kDa脂蛋白前体(抗原IPLA7)、可变表面脂蛋白vlsE(疏螺旋体属，疏螺旋体感染)；肉毒杆菌神经毒素BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、重组肉毒杆菌毒素F He域FHc(肉毒梭状芽孢杆菌，肉毒杆菌中毒(和婴儿型肉毒杆菌中毒))；核衣壳、糖蛋白前体(萨比亚病毒，巴西出血热)；铜/锌超氧化物歧化酶SodC、细菌铁蛋白Bfr、50S核糖体蛋白RplL、含OmpA样跨膜域的蛋白Omp31、免疫原性39-kDa蛋白M5 P39、锌ABC转运蛋白周质锌结合蛋白znuA、周质免疫原性蛋白Bp26、30S核糖体蛋白S12 RpsL、甘油醛-3-磷酸脱氢酶Gap、25kDa外膜免疫原性蛋白前体Omp25、入侵蛋白B lalB、触发因子Tig、分子伴侣蛋白DnaK、推定的肽基-脯氨酰基顺反异构酶SurA、脂蛋白Omp19、外膜蛋白MotYOmp16、保守外膜蛋白D15、苹果酸脱氢酶Mdh、IV型分泌系统(T4SS)VirJ的组分、未知功能的脂蛋白BAB1_0187(布氏杆菌属，布氏杆菌病)；ABC转运蛋白家族的成员(LolC、OppA和PotF)、推定的脂蛋白释放系统跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞内运动性ABimA、细菌延长因子-Tu EF-Tu、17kDa OmpA样蛋白、boaA编码蛋白、boaB编码蛋白(洋葱伯克氏菌和其他伯克氏菌菌种，伯克氏菌感染)；分枝酰基-转移酶Ag85A、热休克蛋白Hsp65、蛋白TB10.4、19kDa抗原、蛋白PstS3、热休克蛋白Hsp70(溃疡分枝杆菌，Buruli氏溃疡)；诺罗病毒主要和次要病毒衣壳蛋白VP1和VP2、基因组多蛋白、札幌病毒衣壳蛋白VP1、蛋白Vp3、geome多蛋白(杯状病毒科，杯状病毒感染(诺罗病毒和札幌病毒))；主要外膜蛋白PorA、鞭毛蛋白FlaA、表面抗原CjaA、纤连蛋白结合蛋白CadF、天冬氨酸/谷氨酸结合ABC转运蛋白Peb1A、蛋白FspA1、蛋白FspA2(弯曲杆菌属，弯曲杆菌病)；糖解酶烯醇酶、分泌型天冬氨酰基蛋白酶SAP1-10、糖磷脂酸肌醇(GPI)连接的细胞壁蛋白、蛋白Hyr1、补体受体3-相关蛋白CR3-RP、粘附素Als3p、热休克蛋白90kDa hsp90、细胞表面疏水性蛋白CSH(通常为白色念珠菌和其他念珠菌物种，念珠菌病)；17-kDa抗原、蛋白P26、三聚自转运蛋白粘附素TAA、巴尔通氏体粘附素A BadA、可变表达的外膜蛋白Vomp、蛋白Pap3、蛋白HbpA、外膜相关蛋白酶HtrA、蛋白OMP89、蛋白GroEL、蛋白LalB、蛋白OMP43、二氢硫辛酰胺琥珀酰基转移酶SucB(巴尔通氏体，猫抓病)；无鞭毛体表面蛋白-2、无鞭毛体特异性表面蛋白SSP4、cruzipain、转唾液酸酶TS、锥鞭毛体表面糖蛋白TSA-1、补体调节蛋白CRP-10、蛋白G4、蛋白G2、副轴杆蛋白PAR2、副鞭毛杆组分Par1、粘液素相关表面蛋白MPSP(克氏锥虫，却格司氏病(Chagas Disease)(美洲锥虫病))；包膜糖蛋白(gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL)(水痘-带状疱疹病毒(VZV)，水痘)；主要外膜蛋白MOMP、可能外膜蛋白PMPC、外膜复合蛋白B OmcB、热休克蛋白Hsp60 HSP10、蛋白IncA、来自III型分泌系统的蛋白、核糖核苷酸还原酶小链蛋白NrdB、质体蛋白Pgp3、披衣菌外蛋白N CopN、抗原CT521、抗原CT425、抗原CT043、抗原TC0052、抗原TC0189、抗原TC0582、抗原TC0660、抗原TC0726、抗原TC0816、抗原TC0828(砂眼披衣菌，衣原体)；低钙反应蛋白E LCrE、披衣菌外蛋白N CopN、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PknD、酰基载体蛋白S-丙二酰转移酶FabD、单链DNA结合蛋白Ssb、主要外膜蛋白MOMP、外膜蛋白2Omp2、多形态膜蛋白家族(Pmp1、Pmp2、Pmp3、Pmp4、Pmp5、Pmp6、Pmp7、Pmp8、Pmp9、Pmp10、Pmp11、Pmp12、Pmp13、Pmp14、Pmp15、Pmp16、Pmp17、Pmp18、Pmp19、Pmp20、Pmp21)(肺炎嗜衣原体，肺炎嗜衣原体感染)；霍乱毒素B CTB、毒素共调节菌毛蛋白ATcpA、毒素共调节菌毛蛋白TcpF、毒素共调节菌毛生物合成蛋白F TcpF、霍乱肠毒素亚单位A、霍乱肠毒素亚单位B、耐热性肠毒素ST、甘露糖敏感性血球凝集素MSHA、外膜蛋白U孔蛋白ompU、Poring B蛋白、多形态膜蛋白-D(霍乱弧菌，霍乱)；丙酰基-CoA羧化酶PCC、14-3-3蛋白、抑制素、半胱氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、凝溶胶蛋白、组织蛋白酶L蛋白酶CatL、被膜蛋白20.8kDa TP20.8、被膜蛋白31.8kDa TP31.8、溶血磷脂酸磷酸酶LPAP、(中华肝吸虫，肝吸虫病)；表面层蛋白SLP、谷氨酸脱氢酶抗原GDH、毒素A、毒素B、半胱氨酸蛋白酶Cwp84、半胱氨酸蛋白酶Cwp13、半胱氨酸蛋白酶Cwp19、细胞壁蛋白CwpV、鞭毛蛋白FliC、鞭毛蛋白FIiD、Zmp-1、CdeM、CdeC(困难梭状芽孢杆菌，困难梭状芽孢杆菌感染)；鼻病毒：衣壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4；冠状病毒：穗蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、核衣壳蛋白N(通常为鼻病毒和冠状病毒，普通感冒(急性病毒性鼻咽炎；急性鼻炎))；朊病毒蛋白Prp(CJD朊病毒，库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD))；包膜蛋白Gc、包膜蛋白Gn、核衣壳蛋白(克里米亚-刚果出血热病毒，克里米亚-刚果出血热(CCHF))；毒力相关DEAD-盒RNA解旋酶VAD1、半乳木甘露聚糖-蛋白GalXM、葡糖醛酸木甘露聚糖GXM、甘露糖蛋白MP(新型隐球菌，隐球菌病)；酸性核糖体蛋白P2 CpP2、粘液蛋白抗原Muc1、Muc2、Muc3 Muc4、Muc5、Muc6、Muc7、表面粘着蛋白CP20、表面粘着蛋白CP23、表面蛋白CP12、表面蛋白CP21、表面蛋白CP40、表面蛋白CP60、表面蛋白CP15、表面相关糖肽gp40、表面相关糖肽gp15、卵囊壁蛋白AB、抑制蛋白(profilin)PRF、腺三磷双磷酸酶(隐孢子虫属，隐孢子虫病)；脂肪酸和视黄醇结合蛋白-1FAR-1、金属蛋白酶TIMP的组织抑制剂(TMP)、半胱氨酸蛋白酶ACEY-1、半胱氨酸蛋白酶ACCP-1、表面抗原Ac-16、分泌性蛋白2ASP-2、金属蛋白酶1MTP-1、天冬氨酰基蛋白酶抑制剂API-1、表面相关抗原SAA-1、成人特异性分泌因子Xa丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝剂AP、组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶ARR-1(通常为巴西钩虫；多种其他寄生虫，皮肤幼虫移行症(CLM))；组织蛋白酶L样蛋白酶、53/25-kDa抗原、8kDa家族成员、具有边缘胰蛋白酶样活性的囊虫蛋白TsAg5、六钩蚴蛋白TSOL18、六钩蚴蛋白TSOL45-1A、乳酸脱氢酶ALDHA、乳酸脱氢酶B LDHB(有钩绦虫，囊虫症)；pp65抗原、膜蛋白pp15、壳-近端被膜蛋白pp150、蛋白M45、DNA聚合酶UL54、解旋酶UL105、糖蛋白gM、糖蛋白gN、糖蛋白H、糖蛋白B gB、蛋白UL83、蛋白UL94、蛋白UL99(巨细胞病毒(CMV)，巨细胞病毒感染)；衣壳蛋白C、膜前蛋白prM、膜蛋白M、包膜蛋白E(域I、域II、域II)、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白NS2B、蛋白NS3、蛋白NS4A、蛋白2K、蛋白NS4B、蛋白NS5(登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)-黄病毒，登革热)；39kDa蛋白(脆弱双核阿米巴，双核阿米巴病)；白喉毒素前体Tox、白喉毒素DT、菌毛蛋白-特异性分选酶SrtA、轴菌毛蛋白SpaA、顶端菌毛蛋白SpaC、次要菌毛蛋白SpaB、表面相关蛋白DIP1281(白喉杆菌，白喉)；糖蛋白GP、核蛋白NP、次要基质蛋白VP24、主要基质蛋白VP40、转录活化因子VP30、聚合酶辅因子VP35、RNA聚合酶L(埃博拉病毒(EBOV)，埃博拉出血热)；朊病毒蛋白(vCOD朊病毒，变异库贾氏病(vCOD、nvCOD))；UvrABC系统蛋白B、蛋白Flp1、蛋白Flp2、蛋白Flp3、蛋白TadA、血红蛋白受体HgbA、外膜蛋白TdhA、蛋白CpsRA、调节因子CpxR、蛋白SapA、18kDa抗原、外膜蛋白NcaA、蛋白LspA、蛋白LspA1、蛋白LspA2、蛋白LspB、外膜组分DsrA、凝集素DltA、脂蛋白Hip、主要外膜蛋白OMP、外膜蛋白OmpA2(杜克雷嗜血杆菌，软下疳)；天冬氨酰基蛋白酶1Pep1、磷脂酶B PLB、α-甘露糖苷酶1AMN1、葡聚糖基转移酶GEL1、尿素酶URE、过氧化酶体基质蛋白Pmp1、富含脯氨酸的抗原Pra、人类T细胞反应性蛋白TcrP(粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)，球孢子菌病)；过敏原Tri r 2、热休克蛋白60Hsp60、真菌肌动蛋白Act、抗原Tri r2、抗原Tri r4、抗原Tri t1、蛋白IV、甘油-3-磷酸脱氢酶Gpd1、渗透传感因子HwSho1A、渗透传感因子HwSho1B、组氨酸激酶HwHhk7B、过敏原Mala s 1、过敏原Mala s 11、硫氧还蛋白Trx Mala s 13、过敏原Mala f、过敏原Mala s(通常为发癣菌某种、表皮癣菌某种、马拉色菌某种、威尼克何德霉，皮癣菌病)；蛋白EG95、蛋白EG10、蛋白EG18、蛋白EgA31、蛋白EM18、抗原EPC1、抗原B、抗原5、蛋白P29、蛋白14-3-3、8-kDa蛋白、亲肌肉抗原、热休克蛋白20HSP20、糖蛋白GP-89、脂肪酸结合蛋白FAPB(绦虫属，绦虫病)；主要表面蛋白2MSP2、主要表面蛋白4MSP4、MSP变体SGV1、MSP变体SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510编码蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(艾利希体属，艾利希体症)；分泌型抗原SagA、sagA样蛋白SalA和SalB、胶原粘附素Scm、表面蛋白Fms1(EbpA(fm)、Fms5(EbpB(fm)、Fms9(EpbC(fm)和Fms10、蛋白EbpC(fm)、96kDa免疫保护糖蛋白G1(肠球菌属，肠球菌感染)；基因组多蛋白、聚合酶3D、病毒衣壳蛋白VP1、病毒衣壳蛋白VP2、病毒衣壳蛋白VP3、病毒衣壳蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C(肠病毒属，肠病毒感染)；外膜蛋白OM、60kDa外膜蛋白、细胞表面抗原OmpA、细胞表面抗原OmpB(sca5)、134kDa外膜蛋白、31kDa外膜蛋白、29.5kDa外膜蛋白、细胞表面蛋白SCA4、细胞表面蛋白Adr1(RP827)、细胞表面蛋白Adr2(RP828)、细胞表面蛋白SCA1、入侵蛋白invA、细胞分裂蛋白fts、分泌蛋白sec 0家族、毒力蛋白virB、tlyA、tlyC、细小蛋白样蛋白Pip、前蛋白转位酶SecA、120-kDa表面蛋白抗原SPA、138kD复合抗原、主要100-kD蛋白(蛋白I)、细胞浆内蛋白D、保护性表面蛋白抗原SPA(普氏立克次体，流行性斑疹伤寒)；EB核抗原(EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP))、潜伏膜蛋白(LMP-1、LMP-2A、LMP-2B)、早期抗原EBV-EA、膜抗原EBV-MA、病毒衣壳抗原EBV-VCA、碱性核酸酶EBV-AN、糖蛋白H、糖蛋白gp350、糖蛋白gp110、糖蛋白gp42、糖蛋白gHgL、糖蛋白gB(EB病毒(EBV)，EB病毒感染性单核细胞增多症)；衣壳蛋白VP2、衣壳蛋白VP1、主要蛋白NS1(微小病毒B19，传染性红斑(第五疾病))；pp65抗原、糖蛋白105、主要衣壳蛋白、包膜糖蛋白H、蛋白U51(人类疱疹病毒6(HHV-6)和人类疱疹病毒7(HHV-7)，幼儿急疹)；硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶TGR、组织蛋白酶L1和L2、孔尼兹型(Kunitz-type)蛋白KTM、亮氨酸氨基肽酶LAP、半胱氨酸蛋白酶Fas2、皂素样蛋白-2SAP-2、硫氧还蛋白过氧化物酶TPx、Prx-1、Prx-2、组织蛋白酶I半胱氨酸蛋白酶CL3、蛋白酶组织蛋白酶L CL1、磷酸甘油酸激酶PGK、27-kDa分泌蛋白、60kDa蛋白HSP35α、谷胱甘肽转移酶GST、28.5kDa被膜抗原28.5kDa TA、组织蛋白酶B3蛋白酶CatB3、I型胱抑素stefin-1、组织蛋白酶L5、组织蛋白酶Llg和组织蛋白酶B、脂肪酸结合蛋白FABP、亮氨酸氨基肽酶LAP(肝片吸虫和巨片吸虫，片吸虫病)；朊病毒蛋白(FFI朊病毒，致命家族性失眠(FFI))；毒液过敏原同源物样蛋白VAL-1、丰幼虫转录物ALT-1、丰幼虫转录物ALT-2、硫氧还蛋白过氧化物酶TPX、胡蜂过敏原同源物VAH、硫氧还蛋白过氧化物酶2TPX-2、抗原蛋白SXP(肽N、N1、N2和N3)、活化相关蛋白-1ASP-1、硫氧还蛋白TRX、转谷酰氨酸酶BmTGA、谷胱甘肽-S-转移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂过敏原同源物VAH、175kDa胶原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、角质层胶原Col-4、分泌型幼虫酸性蛋白SLAP、几丁质酶CHI-1、麦芽糖结合蛋白MBP、糖解酶果糖-1,6-双磷酸醛缩酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、线虫特异性基因产物OvB20、盘尾半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白(onchocystatin)CPI-2、Cox-2(丝虫目超科，丝虫病)；磷脂酶C PLC、不耐热肠毒素B、Iota毒素组分Ib、蛋白CPE1281、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、延长因子G EF-G、穿孔素O Pfo、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC、果糖-双磷酸醛缩酶Alf2、产气荚膜梭状芽孢杆菌肠毒素CPE、α毒素AT、α类毒素ATd、ε-类毒素ETd、蛋白HP、大细胞毒素TpeL、内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Naglu、磷甘油酸变位酶Pgm(产气荚膜梭状芽孢杆菌，由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的食物中毒)；白细胞毒素IktA、粘附FadA、外膜蛋白RadD、高分子量精氨酸结合蛋白(细梭菌属、细梭菌感染)；磷脂酶C PLC、不耐热肠毒素B、Iota毒素组分Ib、蛋白CPE1281、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、延长因子G EF-G、穿孔素O Pfo、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC、果糖-双磷酸醛缩酶Alf2、产气荚膜梭状芽孢杆菌肠毒素CPE、α毒素AT、α类毒素ATd、ε-类毒素ETd、蛋白HP、大细胞毒素TpeL、内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Naglu、磷甘油酸变位酶Pgm(通常为产气荚膜梭状芽孢杆菌；其他梭状芽孢杆菌物种、气性坏疽(Clostridial myonecrosis))；脂肪酶A、脂肪酶B、过氧化物酶Dec1(白地丝霉菌，地丝霉菌病)；朊病毒蛋白(GSS朊病毒，Gerstmann--Scheinker综合征(GSS))；囊壁蛋白CWP1、CWP2、CWP3、变异表面蛋白VSP、VSP1、VSP2、VSP3、VSP4、VSP5、VSP6、56kDa抗原、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶PFOR、醇脱氢酶E ADHE、α-贾第素(giardin)、α8-贾第素、α1-贾第素、β-贾第素、半胱氨酸蛋白酶、谷胱甘肽-S-转移酶GST、精氨酸脱亚氨酶ADI、果糖-1,6-双磷酸醛缩酶FBA、贾第鞭毛虫滋养体抗原GTA(GTA1、GTA2)、鸟氨酸羧基转移酶OCT、横纹纤维组装蛋白样蛋白SALP、尿苷磷酰基样蛋白UPL、α-微管蛋白、β-微管蛋白(肠鞭毛虫，梨形鞭毛虫病)；ABC转运蛋白家族的成员(LolC、OppA和PotF)、推定的脂蛋白释放系统跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞内运动性ABimA、细菌延长因子-Tu EF-Tu、17kDa OmpA样蛋白、boaA编码蛋白(鼻疽伯克氏菌，鼻疽)；亲环素CyP、24kDa第三阶段幼虫蛋白GS24、排泄-分泌产物ESP(40、80、120和208kDa)(棘颚口虫(Gnathostomaspinigerum)和刚棘颚口线虫(Gnathostoma hispidum)，颌口虫病)；菌毛蛋白、次要菌毛蛋白相关亚单位pilC、主要菌毛蛋白亚单位和变体pilE、pilS、相变异蛋白porA、孔蛋白BPorB、蛋白TraD、奈瑟菌外膜抗原H.8、70kDa抗原、主要外膜蛋白PI、外膜蛋白PIA和PIB、W抗原、表面蛋白A NspA、转铁蛋白结合蛋白TbpA、转铁蛋白结合蛋白TbpB、PBP2、mtrR编码蛋白、ponA编码蛋白、膜通透酶FbpBC、FbpABC蛋白系统、LbpAB蛋白、外膜蛋白Opa、外膜转运蛋白FetA、铁抑制调节剂MpeR(淋病双球菌，淋病)；外膜蛋白AOmpA、外膜蛋白C OmpC、外膜蛋白K17OmpK17(肉芽肿克雷伯菌，腹股沟肉芽肿(Donovanosis))；纤连蛋白结合蛋白Sfb、纤连蛋白/纤维蛋白原结合蛋白FBP54、纤连蛋白结合蛋白FbaA、M蛋白1型Emm1、M蛋白6型Emm6、免疫球蛋白结合蛋白35Sib35、表面蛋白R28 Spr28、超氧化物歧化酶SOD、C5a肽酶ScpA、抗原I/II AgI/II、粘附素AspA、G相关α2-巨球蛋白结合蛋白GRAB、表面原纤蛋白M5(酿脓链球菌，A组链球菌感染)；C蛋白P3抗原、精氨酸脱亚氨酶蛋白、粘附素BibA、105kDA蛋白BPS、表面抗原c、表面抗原R、表面抗原X、胰蛋白酶抗性蛋白R1、胰蛋白酶抗性蛋白R3、胰蛋白酶抗性蛋白R4、表面免疫原性蛋白Sip、表面蛋白Rib、富含亮氨酸的重复蛋白LrrG、富含丝氨酸的重复蛋白Srr-2、C蛋白α-抗原Bca、β抗原Bag、表面抗原ε、α样蛋白ALP1、α样蛋白ALP5表面抗原δ、α样蛋白ALP2、α样蛋白ALP3、α样蛋白ALP4、Cβ蛋白Bac(无乳链球菌，B组链球菌感染)；转铁蛋白结合蛋白2Tbp2、磷酸酶P4、外膜蛋白P6、肽聚糖相关脂蛋白Pal、蛋白D、蛋白E、粘着和渗透蛋白Hap、外膜蛋白26Omp26、外膜蛋白P5(Fimbrin)、外膜蛋白D15、外膜蛋白OmpP2、5′-核苷酸酶NucA、外膜蛋白P1、外膜蛋白P2、外膜脂蛋白Pcp、脂蛋白E、外膜蛋白P4、岩藻糖激酶FucK、[Cu,Zn]-超氧化物歧化酶SodC、蛋白酶HtrA、蛋白0145、α-半乳糖苷基神经酰胺(流感嗜血杆菌，流感嗜血杆菌感染)；聚合酶3D、病毒衣壳蛋白VP1、病毒衣壳蛋白VP2、病毒衣壳蛋白VP3、病毒衣壳蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C(肠病毒，主要是甲型柯萨奇和肠病毒71(EV71)，手足口病(HFMD))；RNA聚合酶L、蛋白L、糖蛋白Gn、糖蛋白Gc、核衣壳蛋白S、包膜糖蛋白G1、核蛋白NP、蛋白N、多蛋白M(辛诺柏病毒、汉坦病毒，汉坦病毒肺综合征(HPS))；热休克蛋白HspA、热休克蛋白HspB、柠檬酸合酶GltA、蛋白UreB、热休克蛋白Hsp60、嗜中性粒细胞活化蛋白NAP、过氧化氢酶KatA、空泡细胞毒素VacA、尿素酶αUreA、尿素酶βUreb、蛋白Cpn10、蛋白groES、热休克蛋白Hsp10、蛋白MopB、细胞毒性相关10kDa蛋白CAG、36kDa抗原、β-内酰胺酶HcpA、β-内酰胺酶HcpB(幽门螺旋杆菌，幽门螺旋杆菌感染)；整合膜蛋白、易聚集蛋白、O-抗原、毒素-抗原Stx2B、毒素-抗原Stx1B、粘附-抗原片段Int28、蛋白EspA、蛋白EspB、Intimin、蛋白Tir、蛋白IntC300、蛋白Eae(大肠杆菌O157:H7、O111和O104:H4、溶血性尿毒综合征(HUS))；RNA聚合酶L、蛋白L、糖蛋白Gn、糖蛋白Gc、核衣壳蛋白S、包膜糖蛋白G1、核蛋白NP、蛋白N、多蛋白M(布尼亚病毒科，肾综合征出血热(HFRS))；糖蛋白G、基质蛋白M、核蛋白N、融合蛋白F、聚合酶L、蛋白W、蛋白C、磷蛋白p、非结构蛋白V(亨德拉·尼帕病毒(亨德拉病毒尼帕病毒)，亨德拉·尼帕病毒感染)；多蛋白、糖蛋白Gp2、甲型肝炎表面抗原HBAg、蛋白2A、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、蛋白P1B、蛋白P2A、蛋白P3AB、蛋白P3D(甲型肝炎病毒，甲型肝炎)；乙型肝炎表面抗原HBsAg、乙型肝炎核心抗原HbcAg、聚合酶、蛋白Hbx、preS2中间表面蛋白、表面蛋白L、大S蛋白、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4(乙型肝炎病毒(HBV)，乙型肝炎)；包膜糖蛋白E1 gp32 gp35、包膜糖蛋白E2 NS1 gp68 gp70、衣壳蛋白C、核心蛋白Core、多蛋白、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、抗原G、蛋白NS3、蛋白NS5A、(丙型肝炎病毒，丙型肝炎)；病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、大肝炎δ抗原、小肝炎δ抗原(丁型肝炎病毒，丁型肝炎)；病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4、衣壳蛋白E2(戊型肝炎病毒，戊型肝炎)；糖蛋白L UL1、尿嘧啶-DNA糖苷酶UL2、蛋白UL3、蛋白UL4、DNA复制蛋白UL5、门脉蛋白UL6、病毒体成熟蛋白UL7、DNA解旋酶UL8、复制起点结合蛋白UL9、糖蛋白M UL10、蛋白UL11、碱性核酸外切酶UL12、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶UL13、被膜蛋白UL14、末端酶UL15、被膜蛋白UL16、蛋白UL17、衣壳蛋白VP23 UL18、主要衣壳蛋白VP5UL19、膜蛋白UL20、被膜蛋白UL21、糖蛋白H(UL22)、胸苷激酶UL23、蛋白UL24、蛋白UL25、衣壳蛋白P40(UL26、VP24、VP22A)、糖蛋白B(UL27)、ICP18.5蛋白(UL28)、主要DNA结合蛋白ICP8(UL29)、DNA聚合酶UL30、核基质蛋白UL31、包膜糖蛋白UL32、蛋白UL33、内核膜蛋白UL34、衣壳蛋白VP26(UL35)、大被膜蛋白UL36、衣壳组装蛋白UL37、VP19C蛋白(UL38)、核糖核苷酸还原酶(大亚单位)UL39、核糖核苷酸还原酶(小亚单位)UL40、被膜蛋白/病毒体宿主关闭VHS蛋白(UL41)、DNA聚合酶进行性因子UL42、膜蛋白UL43、糖蛋白C(UL44)、膜蛋白UL45、被膜蛋白VP11/12(UL46)、被膜蛋白VP13/14(UL47)、病毒体成熟蛋白VP16(UL48、α-TIF)、包膜蛋白UL49、dUTP二磷酸酶UL50、被膜蛋白UL51、DNA解旋酶/引物酶复合蛋白UL52、糖蛋白K(UL53)、转录调控蛋白IE63(ICP27、UL54)、蛋白UL55、蛋白UL56、病毒复制蛋白ICP22(IE68、US1)、蛋白US2、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶US3、糖蛋白G(US4)、糖蛋白J(US5)、糖蛋白D(US6)、糖蛋白I(US7)、糖蛋白E(US8)、被膜蛋白US9、衣壳/被膜蛋白US10、Vmw21蛋白(US11)、ICP47蛋白(IE12、US12)、主要转录活化子ICP4(IE175、RS1)、E3泛素连接酶ICPO(IE110)、潜伏期相关蛋白1LRP1、潜伏期相关蛋白2LRP2、神经毒力因子RL1(ICP34.5)、潜伏期相关转录物LAT(单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)，单纯疱疹)；热休克蛋白Hsp60、细胞表面蛋白H1C、二肽基肽酶IV型DppIV、M抗原、70kDa蛋白、17kDa组蛋白样蛋白(荚膜组织浆菌，组织浆菌症)；脂肪酸和视黄醇结合蛋白-1FAR-1、金属蛋白酶的组织抑制剂TIMP(TMP)、半胱氨酸蛋白酶ACEY-1、半胱氨酸蛋白酶ACCP-1、表面抗原Ac-16、分泌性蛋白2ASP-2、金属蛋白酶1MTP-1、天冬氨酰基蛋白酶抑制剂API-1、表面相关抗原SAA-1、表面相关抗原SAA-2、成人特异性分泌因子Xa、丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝剂AP、组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶ARR-1、谷胱甘肽S-转移酶GST、天冬氨酸蛋白酶APR-1、乙酰基胆碱酯酶AChE(十二指肠钩虫和美洲钩虫，钩虫感染)；蛋白NS1、蛋白NP1、蛋白VP1、蛋白VP2、蛋白VP3(人类波卡病毒(HBoV)，人类波卡病毒感染)；主要表面蛋白2MSP2、主要表面蛋白4MSP4、MSP变体SGV1、MSP变体SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510编码蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE 130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(伊氏艾利希体，人类伊氏艾利希体病)；主要表面蛋白1-5(MSP1a、MSP1b、MSP2、MSP3、MSP4、MSP5)、IV型分泌系统蛋白VirB2、VirB7、VirB11、VirD4(嗜吞噬细胞边虫，人类颗粒球性边虫病(HGA))；蛋白NS1、小疏水性蛋白NS2、SH蛋白、融合蛋白F、糖蛋白G、基质蛋白M、基质蛋白M2-1、基质蛋白M2-2、磷蛋白P、核蛋白N、聚合酶L(人类间质肺炎病毒(hMPV)，人类间质肺炎感染)；主要表面蛋白2MSP2、主要表面蛋白4MSP4、MSP变体SGV1、MSP变体SGV2、外膜蛋白OMP、外膜蛋白19OMP-19、主要抗原蛋白MAP1、主要抗原蛋白MAP1-2、主要抗原蛋白MAP1B、主要抗原蛋白MAP1-3、Erum2510编码蛋白、蛋白GroEL、蛋白GroES、30-kDA主要外膜蛋白、GE 100-kDa蛋白、GE 130-kDa蛋白、GE 160-kDa蛋白(查菲艾利希体，人类单核细胞艾利希体病)；复制蛋白E1、调节蛋白E2、蛋白E3、蛋白E4、蛋白E5、蛋白E6、蛋白E7、蛋白E8、主要衣壳蛋白L1、次要衣壳蛋白L2(人类乳头状瘤病毒(HPV)，人类乳头状瘤病毒(HPV)感染)；融合蛋白F、血球凝集素-神经氨糖酸苷酶HN、糖蛋白G、基质蛋白M、磷蛋白P、核蛋白N、聚合酶L(人类副流感病毒(HPIV)，人类副流感病毒感染)；血球凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白(NEP蛋白：核输出蛋白)、PA蛋白、PB1蛋白(聚合酶碱性1蛋白)、PB1-F2蛋白和PB2蛋白(正粘病毒科，流感病毒(flu))；基因组多蛋白、蛋白E、蛋白M、衣壳蛋白C(日本脑炎病毒，日本脑炎)；RTX毒素、IV型pili、主要pilus亚单位PilA、调节转录因子PilS和PilR、蛋白σ54、外膜蛋白(金格金氏杆菌，金格金氏杆菌感染)；朊病毒蛋白(Kuru朊病毒，Kuru)；核蛋白N、聚合酶L、基质蛋白Z、糖蛋白GP(赖萨病毒，赖萨热)；肽聚糖相关脂蛋白PAL、60kDa陪伴蛋白Cpn60(groEL、HspB)、IV型菌毛蛋白PilE、外膜蛋白MIP、主要外膜蛋白MompS、锌金属蛋白酶MSP(退伍军人嗜肺病菌，退伍军人杆菌病(退伍军人病，庞蒂亚克热))；P4核酸酶、蛋白WD、核糖核苷酸还原酶M2、表面膜糖蛋白Pg46、半胱氨酸蛋白酶CP、葡萄糖调节蛋白78GRP-78、阶段特异性S抗原样蛋白A2、ATPase F1、β-微管蛋白、热休克蛋白70Hsp70、KMP-11、糖蛋白GP63、蛋白BT1、核苷水解酶NH、细胞表面蛋白B1、核糖体蛋白P1样蛋白P1、固醇24-c-甲基转移酶SMT、LACK蛋白、组织蛋白H1、SPB1蛋白、硫醇特异性抗氧化剂TSA、蛋白抗原STI1、信号肽酶SP、组织蛋白H2B、表面抗原PSA-2、半胱氨酸蛋白酶b Cpb(利什曼原虫属，利什曼原虫病)；主要膜蛋白I、富含丝氨酸的抗原-45kDa、10kDa陪伴蛋白GroES、HSP kDa抗原、氨基-氧代壬酸酯合酶AONS、蛋白重组酶ARecA、乙酰基-/丙酰基-辅酶A羧化酶α、丙氨酸消旋酶、60kDa陪伴蛋白2、ESAT-6样蛋白EcxB(L-ESAT-6)、蛋白Lsr2、蛋白ML0276、肝素结合血球凝集素HBHA、热休克蛋白65Hsp65、mycP1或ML0041编码蛋白、htrA2或ML0176编码蛋白、htrA4或ML2659编码蛋白、gcp或ML0379编码蛋白、clpC或ML0235编码蛋白(麻风分枝杆菌和肉瘤分枝杆菌，麻风)；外膜蛋白LipL32、膜蛋白LIC10258、膜蛋白LP30、膜蛋白LIC12238、Ompa样蛋白Lsa66、表面蛋白LigA、表面蛋白LigB、主要外膜蛋白OmpL1、外膜蛋白LipL41、蛋白LigAni、表面蛋白LcpA、粘附蛋白LipL53、外膜蛋白UpL32、表面蛋白Lsa63、鞭毛蛋白FlaB1、膜脂蛋白LipL21、膜蛋白pL40、螺旋体性表面粘附素Lsa27、外膜蛋白OmpL36、外膜蛋白OmpL37、外膜蛋白OmpL47、外膜蛋白OmpL54、酰基转移酶LpxA(钩端螺旋体属，钩端螺旋体病)；李斯特菌溶胞素O前体Hly(LLO)、入侵相关蛋白Iap(P60)、李斯特菌溶胞素调节蛋白PrfA、锌金属蛋白酶Mpl、磷脂酸肌醇特异性磷脂酶C PLC(PlcA、PlcB)、O-乙酰基转移酶Oat、ABC-转运蛋白通透酶Im.G_1771、粘附蛋白LAP、LAP受体Hsp60、粘附素LapB、溶血素李斯特菌溶胞素O LLO、蛋白ActA、内化素A InlA、蛋白InlB(李斯特单胞菌，李氏菌病)；外表面蛋白A OspA、外表面蛋白OspB、外表面蛋白OspC、饰胶蛋白聚糖结合蛋白ADbpA、饰胶蛋白聚糖结合蛋白B DbpB、鞭毛丝41kDa核心蛋白Fla、碱性膜蛋白A BmpA(免疫显性抗原P39)、外表面22kDa脂蛋白前体(抗原IPLA7)、可变表面脂蛋白vlsE(通常为伯氏疏螺旋体和其他疏螺旋体物种，莱姆病(莱姆疏螺旋体病))；毒液过敏原同源物样蛋白VAL-1、丰幼虫转录物ALT-1、丰幼虫转录物ALT-2、硫氧还蛋白过氧化物酶TPX、胡蜂过敏原同源物VAH、硫氧还蛋白过氧化物酶2TPX-2、抗原蛋白SXP(肽N、N1、N2和N3)、活化相关蛋白-1ASP-1、硫氧还蛋白TRX、转谷酰氨酸酶BmTGA、谷胱甘肽-S-转移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂过敏原同源物VAH、175kDa胶原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、角质层胶原Col-4、分泌型幼虫酸性蛋白SLAP、几丁质酶CHI-1、麦芽糖结合蛋白MBP、糖解酶果糖-1,6-双磷酸醛缩酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、线虫特异性基因产物OvB20、盘尾半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白CPI-2、蛋白Cox-2(潘氏丝状虫和马来血丝虫，淋巴丝虫病(象皮病))；糖蛋白GP、基质蛋白Z、聚合酶L、核蛋白N(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎)；血小板反应蛋白相关匿名蛋白TRAP、SSP2孢子体表面蛋白2、顶端膜抗原1AMA1、棒状体膜抗原RMA1、酸性碱性重复抗原ABRA、细胞穿越蛋白PF、蛋白Pvs25、裂殖子表面蛋白1MSP-1、裂殖子表面蛋白2MSP-2、环感染红细胞表面抗原RESALiver阶段抗原3LSA-3、蛋白Eba-175、丝氨酸重复抗原5SERA-5、环子孢子蛋白CS、裂殖子表面蛋白3MSP3、裂殖子表面蛋白8MSP8、烯醇酶PF10、肝细胞红细胞蛋白17kDa HEP17、红细胞膜蛋白1EMP1、蛋白Kβ裂殖子表面蛋白4/5MSP 4/5、热休克蛋白Hsp90、富含谷氨酸的蛋白GLURP、裂殖子表面蛋白4MSP-4、蛋白STARP、环孢子体蛋白相关抗原前体CRA(疟原虫属，疟疾)；核蛋白N、膜相关蛋白VP24、次要核蛋白VP30、聚合酶辅因子VP35、聚合酶L、基质蛋白VP40、包膜糖蛋白GP(马堡病毒、马堡出血热(MHF))；蛋白C、基质蛋白M、磷蛋白P、非结构蛋白V、血球凝集素糖蛋白H、聚合酶L、核蛋白N、融合蛋白F(麻疹病毒，麻疹)；ABC转运蛋白家族的成员(LolC、OppA和PotF)、推定的脂蛋白释放系统跨膜蛋白LolC/E、鞭毛蛋白FliC、伯克氏菌胞内运动性A BimA、细菌延长因子-Tu EF-Tu、17kDaOmpA样蛋白、boaA编码蛋白、boaB编码蛋白(假鼻疽伯克氏菌，类鼻疽(惠特穆尔氏病))；菌毛蛋白、次要菌毛蛋白相关亚单位pilC、主要菌毛蛋白亚单位和变体pilE、pilS、相变异蛋白porA、孔蛋白B PorB、蛋白TraD、奈瑟菌外膜抗原H.8、70kDa抗原、主要外膜蛋白PI、外膜蛋白PIA和PIB、W抗原、表面蛋白ANspA、转铁蛋白结合蛋白TbpA、转铁蛋白结合蛋白TbpB、PBP2、mtrR编码蛋白、ponA编码蛋白、膜通透酶FbpBC、FbpABC蛋白系统、LbpAB蛋白、外膜蛋白Opa、外膜转运蛋白FetA、铁抑制调节剂MpeR、因子H结合蛋白fHbp、粘附素NadA、蛋白NhbA、抑制因子FarR(脑膜炎奈瑟菌，脑膜炎球菌病)；66kDa蛋白、22kDa蛋白(通常为横川后殖吸虫，偏殖器吸虫病)；极管蛋白(微胞子虫中34、75和170kDa，胞内原虫中35、55和150kDa)、致动蛋白相关蛋白、RNA聚合酶II最大亚单位、类似的ot整合膜蛋白YIPA、抗沉默蛋白1、热休克转录因子HSF、蛋白激酶、胸苷激酶、NOP-2样核仁蛋白(微孢子目门，微孢子虫病)；CASP8和FADD样凋亡调节因子、谷胱甘肽过氧化物酶GPX1、RNA解旋酶NPH-II NPH2、Poly(A)聚合酶催化亚单位PAPL、主要包膜蛋白P43K、早期转录因子70kDa亚单位VETFS、早期转录因子82kDa亚单位VETFL、金属内肽酶G1型、核苷三磷酸酶I NPH1、复制蛋白A28样MC134L、RNA聚合酶7kDa亚单位RPO7(传染性软疣病毒(MCV)，传染性软疣(MC))；基质蛋白M、磷蛋白P/V、小疏水蛋白SH、核蛋白N、蛋白V、融合糖蛋白F、血球凝集素-神经氨糖酸苷酶HN、RNA聚合酶L(腮腺炎病毒，腮腺炎)；外膜蛋白OM、细胞表面抗原OmpA、细胞表面抗原OmpB(sca5)、细胞表面蛋白SCA4、细胞表面蛋白SCA1、细胞浆内蛋白D、结晶表面层蛋白SLP、保护性表面蛋白抗原SPA(伤寒立克次体，鼠斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒))；粘附素P1、粘附P30、蛋白p116、蛋白P40、细胞骨架蛋白HMW1、细胞骨架蛋白HMW2、细胞骨架蛋白HMW3、MPN152编码蛋白、MPN426编码蛋白、MPN456编码蛋白、MPN-500编码蛋白(肺炎霉浆菌，霉浆菌肺炎)；NocA、铁依赖性调节蛋白、VapA、VapD、VapF、VapG、溶酪蛋白蛋白酶、丝尖端相关43-kDa蛋白、蛋白P24、蛋白P61、15-kDa蛋白、56-kDa蛋白(通常为星形土壤丝菌和其他土壤丝菌物种，奴卡菌病)；毒液过敏原同源物样蛋白VAL-1、丰幼虫转录物ALT-1、丰幼虫转录物ALT-2、硫氧还蛋白过氧化物酶TPX、胡蜂过敏原同源物VAH、硫氧还蛋白过氧化物酶2TPX-2、抗原蛋白SXP(肽N、N1、N2和N3)、活化相关蛋白-1ASP-1、硫氧还蛋白TRX、转谷酰氨酸酶BmTGA、谷胱甘肽-S-转移酶GST、肌凝蛋白、胡蜂过敏原同源物VAH、175kDa胶原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、角质层胶原Col-4、分泌型幼虫酸性蛋白SLAP、几丁质酶CHI-1、麦芽糖结合蛋白MBP、糖解酶果糖-1,6-双磷酸醛缩酶Fba、原肌凝蛋白TMY-1、线虫特异性基因产物OvB20、盘尾半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白CPI-2、Cox-2(盘尾丝虫，蟠尾丝虫病(河盲症))；43kDa分泌型糖蛋白、糖蛋白gp0、糖蛋白gp75、抗原Pb27、抗原Pb40、热休克蛋白Hsp65、热休克蛋白Hsp70、热休克蛋白Hsp90、蛋白P10、磷酸丙糖异构酶TPI、N-乙酰基-葡萄胺糖结合凝集素副球菌素、28kDa蛋白Pb28(巴西副球孢子菌，巴西副球孢子菌病(南美芽生菌病))；28-kDacruzipain样半胱氨酸蛋白酶Pw28CCP(通常为卫氏肺吸虫和其他肺吸虫种，肺吸虫病)；外膜蛋白OmpH、外膜蛋白Omp28、蛋白PM1539、蛋白PM0355、蛋白PM1417、修复蛋白MutL、蛋白BcbC、蛋白PM0305、甲酸脱氢酶-N、蛋白PM0698、蛋白PM1422、DNA旋转酶、脂蛋白PlpE、粘附蛋白Cp39、血红蛋白采集系统受体HasR、39kDa荚膜蛋白、铁调节的OMP IROMP、外膜蛋白OmpA87、菌毛蛋白Ptf、菌毛亚单位蛋白PtfA、转铁蛋白结合蛋白Tbpl、酯酶MesA、败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)毒素PMT、粘附蛋白Cp39(巴氏杆菌属，巴氏杆菌症)；“丝状血球凝集素FhaB、腺苷酸环化酶CyaA、百日咳毒素亚单位4前体PtxD、百日咳杆菌粘附素前体Prn、毒素亚单位1PtxA、蛋白Cpn60、蛋白brkA、百日咳毒素亚单位2前体PtxB、百日咳毒素亚单位3前体PtxC、百日咳毒素亚单位5前体PtxE、百日咳杆菌粘附素Prn、蛋白Fim2、蛋白Fim3；“(百日咳嗜血杆菌，百日咳(Whooping cough))；“F1荚膜抗原、毒力相关V抗原、分泌型效应蛋白LcrV、V抗原、外膜蛋白酶Pla、分泌型效应蛋白YopD、推定的分泌型蛋白-酪氨酸磷酸酶YopH、针复合物主要亚单位YscF、蛋白激酶YopO、推定的自转运蛋白YapF、内膜ABC-转运蛋白YbtQ(Irp7)、推定的糖结合蛋白YP00612、热休克蛋白90HtpG、推定的硫酸酯酶蛋白YdeN、外膜脂蛋白载体蛋白LolA、分泌伴侣蛋白YerA、推定的脂蛋白YP00420、溶血素活化因子蛋白HpmB、鼠疫菌素/耶尔森杆菌素外膜受体Psn、分泌型效应蛋白YopE、分泌型效应蛋白YopF、分泌型效应蛋白YopK、外膜蛋白YopN、外膜蛋白YopM、凝固酶/血纤维蛋白溶酶前体Pla；“(鼠疫耶氏杆菌，鼠疫)；蛋白PhpA、表面粘附素PsaA、肺炎球菌溶血素Ply、ATP依赖性蛋白酶Clp、硫辛酸蛋白连接酶LplA、细胞壁表面锚定蛋白psrP、分选酶SrtA、谷氨酰基-tRNA合成酶GltX、胆碱结合蛋白A CbpA、肺炎球菌表面蛋白A PspA、肺炎球菌表面蛋白CPspC、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Gnd、铁结合蛋白PiaA、胞壁质水解酶LytB、proteon LytC、蛋白酶A1(肺炎链球菌，肺炎球菌感染)；主要表面蛋白B、kexin样蛋白酶KEX1、蛋白A12、55kDa抗原P55、主要表面糖蛋白Msg(耶氏肺孢子菌，肺囊虫肺炎(PCP))；基因组多蛋白、聚合酶3D、病毒衣壳蛋白VP1、病毒衣壳蛋白VP2、病毒衣壳蛋白VP3、病毒衣壳蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C(脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎)；蛋白质Nfa1、exendin-3、分泌脂肪酶、组织蛋白酶B样蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、过氧环蛋白、蛋白Cry1Ac(通常为变形纤毛虫，原发性阿米巴脑膜炎(PAM))；agnoprotein、大T抗原、小T抗原、主要衣壳蛋白VP1、次要衣壳蛋白Vp2(JC病毒，进行性多灶性白质脑病)；低钙反应蛋白E LCrE、披衣菌外蛋白N CopN、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PknD、酰基载体蛋白S-丙二酰转移酶FabD、单链DNA结合蛋白Ssb、主要外膜蛋白MOMP、外膜蛋白2Omp2、多形态膜蛋白家族(Pmp1、Pmp2、Pmp3、Pmp4、Pmp5、Pmp6、Pmp7、Pmp8、Pmp9、Pmp10、Pmp11、Pmp12、Pmp13、Pmp14、Pmp15、Pmp16、Pmp17、Pmp18、Pmp19、Pmp20、Pmp21)(鹦鹉热嗜衣原体，鹦鹉热)；外膜蛋白P1、热休克蛋白B HspB、肽ABC转运蛋白、GTP结合蛋白、蛋白IcmB、核糖核酸酶R、磷酸酶SixA、蛋白DsbD、外膜蛋白TolC、DNA结合蛋白PhoB、ATPase DotB、热休克蛋白B HspB、膜蛋白Com1、28kDa蛋白、DNA-3-甲基腺嘌呤糖苷酶I、p外膜蛋白OmpH、外膜蛋白AdaA、甘氨酸切割系统T蛋白(伯纳特氏柯克斯氏体，Q热病)；核蛋白N、大结构蛋白L、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G(狂犬病病毒，狂犬病)；融合蛋白F、核蛋白N、基质蛋白M、基质蛋白M2-1、基质蛋白M2-2、磷蛋白P、小疏水性蛋白SH、主要表面糖蛋白G、聚合酶L、非结构蛋白1NS1、非结构蛋白2NS2(呼吸道合胞病毒(RSV)，呼吸道合胞病毒感染)；基因组多蛋白、聚合酶3D、病毒衣壳蛋白VP1、病毒衣壳蛋白VP2、病毒衣壳蛋白VP3、病毒衣壳蛋白VP4、蛋白酶2A、蛋白酶3C(鼻病毒、鼻病毒感染)；外膜蛋白OM、细胞表面抗原OmpA、细胞表面抗原OmpB(sca5)、细胞表面蛋白SCA4、细胞表面蛋白SCA1、蛋白PS120、细胞浆内蛋白D、保护性表面蛋白抗原SPA(痘立克次体，立克次体感染)；外膜蛋白OM、细胞表面抗原OmpA、细胞表面抗原OmpB(sca5)、细胞表面蛋白SCA4、细胞表面蛋白SCA1、细胞浆内蛋白D(痘立克次体，立克次体痘)；包膜糖蛋白GP、聚合酶L、核蛋白N、非结构蛋白NSS(Rift谷热病毒，Rift谷热(RVF))；外膜蛋白OM、细胞表面抗原OmpA、细胞表面抗原OmpB(sca5)、细胞表面蛋白SCA4、细胞表面蛋白SCA1、细胞浆内蛋白D(立氏立克次体，落矶山斑点热(RMSF))；非结构蛋白6NS6、非结构蛋白2NS2、中间衣壳蛋白VP6、内衣壳蛋白VP2、非结构蛋白3NS3、RNA导向的RNA聚合酶L、蛋白VP3、非结构蛋白1NS1、非结构蛋白5NS5、外衣壳糖蛋白VP7、非结构糖蛋白4NS4、外衣壳蛋白VP4；(轮状病毒，轮状病毒感染)；多蛋白P200、糖蛋白E1、糖蛋白E2、蛋白NS2、衣壳蛋白C(德国麻疹病毒，德国麻疹)；陪伴蛋白GroEL(MopA)、肌醇磷酸磷酸酶SopB、热休克蛋白HslU、伴侣蛋白DnaJ、蛋白TviB、蛋白IroN、鞭毛蛋白FliC、入侵蛋白SipC、糖蛋白gp43、外膜蛋白LamB、外膜蛋白PagC、外膜蛋白TolC、外膜蛋白NmpC、外膜蛋白FadL、转运蛋白SadA、转移酶WgaP、效应蛋白SifA、SteC、SseL、SseJ和SseF(沙门杆菌属，沙门杆菌病)；“蛋白14、非结构蛋白NS7b、非结构蛋白NS8a、蛋白9b、蛋白3a、核蛋白N、非结构蛋白NS3b、非结构蛋白NS6、蛋白7a、非结构蛋白NS8b、膜蛋白M、包膜小膜蛋白EsM、复制酶多蛋白1a、刺突糖蛋白S、复制酶多蛋白lab；SARS冠状病毒，SARS(严重急性呼吸道综合征))；丝氨酸蛋白酶、非典型疥癣虫抗原1ASA1、谷胱甘肽S-转移酶GST、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、载脂蛋白(疥螨，疥癣)；谷胱甘肽S-转移酶GST、副肌凝蛋白、血红蛋白酶(hemoglbinase)SM32、主要虫卵抗原、14kDa脂肪酸结合蛋白Sm14、主要幼虫表面抗原P37、22.6kDa被膜抗原、钙蛋白酶CANP、三磷酸异构酶Tim、表面蛋白9B、外衣壳蛋白VP2、23kDa整合膜蛋白Sm23、Cu/Zn-超氧化物歧化酶、糖蛋白Gp、肌凝蛋白(血吸虫属，血吸虫病(血吸虫症))；60kDa陪伴蛋白、56kDa型特异性抗原、丙酮酸磷酸二激酶、4-羟基苯甲酸八异戊二烯基转移酶(恙虫病东方体，丛林性斑疹伤寒)；脱氢酶GuaB、入侵蛋白Spa32、侵袭素IpaA、侵袭素IpaB、侵袭素IpaC、侵袭素IpaD、侵袭素IpaH、侵袭素IpaJ(志贺杆菌属，志贺杆菌病(杆菌性痢疾))；蛋白P53、病毒体蛋白US10同源物、转录调节因子IE63、转录反式活化因子IE62、蛋白酶P33、α转导因子74kDa蛋白、脱氧尿苷5′-三磷酸核苷酸水解酶、转录反式活化因子IE4、膜蛋白UL43同源物、核磷蛋白UL3同源物、核蛋白UL4同源物、复制起点结合蛋白、膜蛋白2、磷蛋白32、蛋白57、DNA聚合酶进行性因子、门脉蛋白54、DNA引物酶、被膜蛋白UL14同源物、被膜蛋白UL21同源物、被膜蛋白UL55同源物、三重末端酶亚单位UL33同源物、三重末端酶亚单位UL15同源物、壳结合蛋白44、病毒体包装蛋白43(水痘-带状疱疹病毒(VZV)，带状疱疹(Shingles))；截短的3-β羟基-5-烯类固醇脱氢酶同源物、病毒体膜蛋白A13、蛋白A19、蛋白A31、截短蛋白A35同源物、蛋白A37.5同源物、蛋白A47、蛋白A49、蛋白A51、脑信号蛋白样蛋白A43、丝氨酸蛋白酶抑制剂1、丝氨酸蛋白酶抑制剂2、丝氨酸蛋白酶抑制剂3、蛋白A6、蛋白B15、蛋白C1、蛋白C5、蛋白C6、蛋白F7、蛋白F8、蛋白F9、蛋白F11、蛋白F14、蛋白F15、蛋白F16(大天花或小天花，天花(痘))；粘附素/糖蛋白gp70、蛋白酶(申克氏孢子丝菌，孢子丝菌病)；血质铁结合蛋白IsdB、胶原粘附素Cna、凝集因子A ClfA、蛋白MecA、纤连蛋白结合蛋白A FnbA、A型肠毒素EntA、B型肠毒素EntB、C型肠毒素EntC1、C型肠毒素EntC2、D型肠毒素EntD、E型肠毒素EntE、毒性休克综合征毒素-1TSST-1、葡萄球菌激酶、青霉素结合蛋白2a PBP2a(MecA)、分泌抗原SssA(葡萄球菌属，葡萄球菌食物中毒)；血质铁结合蛋白IsdB、胶原粘附素Cna、凝集因子A ClfA、蛋白MecA、纤连蛋白结合蛋白AFnbA、A型肠毒素EntA、B型肠毒素EntB、C型肠毒素EntC1、C型肠毒素EntC2、D型肠毒素EntD、E型肠毒素EntE、毒性休克综合征毒素-1TSST-1、葡萄球菌激酶、青霉素结合蛋白2a PBP2a(MecA)、分泌抗原SssA(葡萄球菌属，例如金黄色葡萄球菌，葡萄球菌感染)；抗原Ss-IR、抗原NIE、强力霉素、Na+-K+ATPase Sseat-6、原肌球蛋白SsTmy-1、蛋白LEC-5、41kDa a抗原P5、41-kDa幼虫蛋白、31-kDa幼虫蛋白、28-kDa幼虫蛋白(粪拟圆虫，拟圆虫病)；甘油磷酸二酯磷酸二酯酶GlpQ(Gpd)、外膜蛋白TmpB、蛋白Tp92、抗原TpF1、重复蛋白Tpr、重复蛋白FTprF、重复蛋白G TprG、重复蛋白I TprI、重复蛋白J TprJ、重复蛋白K TprK、密螺旋体膜蛋白A TmpA、脂蛋白、15kDa Tpp15、47kDa膜抗原、微铁蛋白TpF1、粘附素Tp0751、脂蛋白TP0136、蛋白TpN17、蛋白TpN47、外膜蛋白TP0136、外膜蛋白TP0155、外膜蛋白TP0326、外膜蛋白TP0483、外膜蛋白TP0956(梅毒螺旋体，梅毒)；组织蛋白酶L样蛋白酶、53/25-kDa抗原、8kDa家族成员、具有边缘胰蛋白酶样活性的囊尾幼虫蛋白TsAg5、六钩蚴蛋白TSOL18、六钩蚴蛋白TSOL45-1A、乳酸脱氢酶A LDHA、乳酸脱氢酶B LDHB(绦虫属，绦虫病)；破伤风毒素TetX、破伤风毒素C TTC、140kDa S层蛋白、黄素蛋白β-亚单位CT3、磷脂酶(卵磷脂酶)、磷酸载体蛋白HPr(破伤风梭状芽孢杆菌、破伤风(Lockjaw))；基因组多蛋白、蛋白E、蛋白M、衣壳蛋白C(蜱传脑炎病毒(TBEV)，蜱传脑炎)；58-kDa抗原、68-kDa抗原、弓蛔虫幼虫排泄-分泌抗原TES、32-kDa糖蛋白、糖蛋白TES-70、糖蛋白GP31、排泄-分泌抗原TcES-57、肠周液抗原Pe、可溶性提取物抗原Ex、排泄/分泌幼虫抗原ES、抗原TES-120、多蛋白过敏原TBA-1、组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶c-cpl-1、26-kDa蛋白(犬蛔虫或猫蛔虫，蛔虫症(眼幼虫移行症(OLM)和内脏性幼虫移行症(VLM)))；微线体蛋白(MIC1、MIC2、MIC3、MIC4、MIC5、MIC6、MIC7、MIC8)、棒状体蛋白Rop2、棒状体蛋白(Rop1、Rop2、Rop3、Rop4、Rop5、Rop6、Rop7、Rop16、Rjop17)、蛋白SRi、表面抗原P22、主要抗原p24、主要表面抗原p30、致密颗粒蛋白(GRA1、GRA2、GRA3、GRA4、GRA5、GRA6、GRA7、GRA8、GRA9、GRA10)、28kDa抗原、表面抗原SAG1、SAG2相关抗原、核苷-三磷酸酶1、核苷-三磷酸酶2、蛋白Stt3、含HesB样域的蛋白、菱形样蛋白酶5、毒胰蛋白酶1(弓虫，弓虫症)；43kDa分泌型糖蛋白、53kDa分泌型糖蛋白、副肌凝蛋白、抗原Ts21、抗原Ts87、抗原p46000、TSL-1抗原、小凹蛋白-1CAV-1、49kDa新生幼虫抗原、鞘脂激活蛋白原(prosaposin)同源物、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、45-kDa糖蛋白Gp45(旋毛虫，旋毛虫症)；Myb样转录因子(Myb1、Myb2、Myb3)、粘附蛋白AP23、粘附蛋白AP33、粘附素蛋白AP33-3、粘附素AP51、粘附素AP65、粘附蛋白AP65-1、α-辅肌动蛋白、致动蛋白相关蛋白、teneurin、62kDa蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶SUB1、半胱氨酸蛋白酶基因3CP3、α-烯醇酶烯醇、半胱氨酸蛋白酶CP30、热休克蛋白(Hsp70、Hsp60)、免疫原性蛋白P270、(阴道滴虫，滴虫病)；β-微管蛋白、47-kDa蛋白、分泌白细胞样蛋白酶-1SLP-1、50-kDa蛋白TT50、17kDa抗原、43/47kDa蛋白(毛首鞭虫，鞭虫病(鞭虫感染))；蛋白ESAT-6(EsxA)、10kDa滤液抗原EsxB、分泌型抗原85-B FBPB、纤连蛋白结合蛋白AFbpA(Ag85A)、丝氨酸蛋白酶PepA、PPE家族蛋白PPE18、纤连蛋白结合蛋白D FbpD、免疫原性蛋白MPT64、分泌性蛋白MPT51、过氧化氢酶-过氧化物酶-过氧化亚硝酸酶T KATG、周质磷酸结合脂蛋白PSTS3(PBP-3、Phos-1)、铁调节肝素结合血球凝集素Hbha、PPE家族蛋白PPE14、PPE家族蛋白PPE68、蛋白Mtb72F、蛋白Apa、免疫原性蛋白MPT63、周质磷酸结合脂蛋白PSTS1(PBP-1)、分子伴侣蛋白DnaK、细胞表面脂蛋白Mpt83、脂蛋白P23、磷酸转运系统通透酶蛋白pstA、14kDa抗原、纤连蛋白结合蛋白C FbpC1、丙氨酸脱氢酶TB43、谷酰氨酸合成酶1、ESX-1蛋白、蛋白CFP10、TB10.4蛋白、蛋白MPT83、蛋白MTB12、蛋白MTB8、Rpf样蛋白、蛋白MTB32、蛋白MTB39、晶体蛋白、热休克蛋白HSP65、蛋白PST-S(通常为结核分枝杆菌，结核病)；外膜蛋白FobA、外膜蛋白FobB、细胞内生长基因座IgIC1、细胞内生长基因座IgIC2、氨基转移酶Wbt1、陪伴蛋白GroEL、17kDa主要膜蛋白TUL4、脂蛋白LpnA、几丁质酶家族18蛋白、异柠檬酸脱氢酶、Nif3家族蛋白、IV型pili糖化蛋白、外膜蛋白tolC、FAD结合家族蛋白、IV型菌毛蛋白多聚体外膜蛋白、双组分传感蛋白KdpD、伴侣蛋白蛋白DnaK、蛋白ToIQ(土拉文氏杆菌，土拉文氏杆菌病)；“MB抗原、尿素酶、蛋白GyrA、蛋白GyrB、蛋白ParC、蛋白ParE、脂质相关膜蛋白LAMP、胸苷激酶TK、磷脂酶PL-A1、磷脂酶PL-A2、磷脂酶PL-C、表面表达的96-kDa抗原；“(尿素霉浆菌，尿素霉浆菌感染)；非结构多蛋白、结构多蛋白、衣壳蛋白CP、蛋白E1、蛋白E2、蛋白E3、蛋白酶P1、蛋白酶P2、蛋白酶P3(委内瑞拉马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎)；糖蛋白GP、基质蛋白Z、聚合酶L、核蛋白N(瓜纳瑞托病毒，瓜纳瑞托出血热)；多蛋白、蛋白E、蛋白M、衣壳蛋白C、蛋白酶NS3、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白AS2B、蛋白NS4A、蛋白NS4B、蛋白NS5(西尼罗病毒，西尼罗热)；衣壳蛋白CP、蛋白E1、蛋白E2、蛋白E3、蛋白酶P2(西部马脑炎病毒，西部马脑炎)；基因组多蛋白、蛋白E、蛋白M、衣壳蛋白C、蛋白酶NS3、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白AS2B、蛋白NS4A、蛋白NS4B、蛋白NS5(黄热病病毒，黄热病)；推定的Yop靶向蛋白YobB、效应蛋白YopD、效应蛋白YopE、蛋白YopH、效应蛋白YopJ、蛋白转位蛋白YopK、效应蛋白YopT、蛋白YpkA、鞭毛生物合成蛋白FlhA、肽酶M48、钾外排系统KefA、转录调节因子RovA、粘附素Ifp、转位蛋白LcrV、蛋白PcrV、侵袭素Inv、外膜蛋白OmpF样孔蛋白、粘附素YadA、蛋白激酶C、磷脂酶C1、蛋白PsaA、甘露糖基转移酶样蛋白WbyK、蛋白YscU、抗原YPMa(假性结核病耶氏杆菌，假性结核病耶氏杆菌感染)；效应蛋白YopB、60kDa陪伴蛋白、蛋白WbcP、酪氨酸-蛋白磷酸酶YopH、蛋白YopQ、肠毒素、半乳糖苷通透酶、还原酶NrdE、蛋白YasN、侵袭素Inv、粘附素YadA、外膜孔蛋白F OmpF、蛋白UspA1、蛋白EibA、蛋白Hia、细胞表面蛋白Ail、伴侣蛋白SycD、蛋白LcrD、蛋白LcrG、蛋白LcrV、蛋白SycE、蛋白YopE、调节蛋白TyeA、蛋白YopM、蛋白YopN、蛋白YopO、蛋白YopT、蛋白YopD、蛋白酶ClpP、蛋白MyfA、蛋白FilA和蛋白PsaA(小肠结肠炎耶氏杆菌，肠道耶氏症)。

前一部分中的括号指示特定病原体或抗原来源的病原体家族以及与病原体相关的感染性疾病。

在本发明的第一方面的一个特别优选实施方案中，mRNA化合物包含含有编码区的mRNA序列，所述编码区编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核输出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶碱性蛋白2(PB2)或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。

在此上下文中，至少一种抗原肽或蛋白质的氨基酸序列可选自源自流感病毒的血球凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核输出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶碱性蛋白2(PB2)或其片段或变体或源自任何合成工程化流感病毒肽或蛋白质的任何肽或蛋白质。

在本发明的一个优选实施方案中，编码区编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。在此上下文中，血球凝集素(HA)和神经氨糖酸苷酶(NA)可选自相同流感病毒或不同流感病毒。

在此上下文中，特别优选的是，至少一个编码区编码流感病毒的血球凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核输出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白(PA)、聚合酶碱性蛋白PB1、PB1-F2或聚合酶碱性蛋白2(PB2)的至少一种全长蛋白或其变体。

在特别优选实施方案中，至少一个编码区编码流感病毒的血球凝集素(HA)的至少一种全长蛋白和/或神经氨糖酸苷酶(NA)的至少一种全长蛋白或其变体。

如本文所用，术语“全长蛋白”通常是指基本上包含天然存在的蛋白质的完整氨基酸序列的蛋白质。

在特定实施方案中，流感病毒肽或蛋白质源自甲型、乙型或丙型流感病毒(毒株)。

在特定实施方案中，病毒肽或蛋白质源自冠状病毒，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS等(毒株)。

甲型流感病毒可选自以血球凝集素(HA)为特征的甲型流感病毒，所述血球凝集素选自由以下组成的组：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。优选地，甲型流感病毒选自以血球凝集素(HA)为特征的流感病毒，所述血球凝集素选自由H1、H3、H5或H9组成的组。

此外，特别优选为以神经氨糖酸苷酶(NA)为特征的甲型流感病毒，所述神经氨糖酸苷酶选自由以下组成的组：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10和N11。最优选地，甲型流感病毒以神经氨糖酸苷酶(NA)为特征，所述神经氨糖酸苷酶选自由N1、N2和N8组成的组。

在特别优选实施方案中，甲型流感病毒选自由以下组成的组：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8和H10N7，优选选自H1N1、H3N2、H5N1和H5N8。

在此上下文中，特别优选的是，本发明mRNA序列的至少一个编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质和/或至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，所述甲型流感病毒选自由以下组成的组：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8和H10N7，优选选自H1N1、H3N2、H5N1、H5N8或其片段或变体。

在本发明的上下文中，由根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区编码的蛋白质的片段或其变体通常可包含与相应的天然存在的全长蛋白质或其变体的氨基酸序列具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％序列同一性的氨基酸序列。

在特定实施方案中，抗原肽或蛋白质源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)蛋白。

此外，在此上下文中，编码至少一种源自流感病毒的血球凝集素(HA)和/或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段、变体或衍生物的抗原肽或蛋白质的编码区可选自包含编码区的任何核酸序列，所述编码区编码源自任何流感病毒分离株的血球凝集素(HA)或神经氨糖酸苷酶(NA)或其片段或变体。

在本发明的第一方面的一个特别优选实施方案中，包含mRNA序列的mRNA化合物包含编码区，所述编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白G或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。

在此上下文中，至少一种抗原肽或蛋白质的氨基酸序列可选自源自狂犬病病毒的糖蛋白或其片段或变体的任何肽或蛋白质，或选自任何合成工程化狂犬病病毒肽或蛋白质。

在本发明的一个优选实施方案中，编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。

在此上下文中，特别优选的是，至少一个编码区编码狂犬病病毒的糖蛋白的至少一种全长蛋白质或其变体。

如本文所用，术语“全长蛋白质”优选是指本发明的序列表中指示的全长蛋白质序列。

在此上下文中，进一步优选地，本发明的mRNA序列的至少一个编码序列编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白质。狂犬病病毒的每种糖蛋白是由相应蛋白质的数据库登录号来标识(参见序列表数字标识符<223>，其指示蛋白质或核酸登录号(GenBank))。如果在序列表中进一步搜索相应的蛋白质或核酸登录号(GenBank)，则在数字标识符<223>下显示所述蛋白质或核酸登录号(GenBank)的下一个SEQID NO:对应于编码所述蛋白质的野生型mRNA的核酸序列。

此外，在此上下文中，编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白或其片段、变体或衍生物的抗原肽或蛋白质的编码区可选自包含编码区的任何核酸序列，所述编码区编码源自任何狂犬病病毒分离株或其片段或变体的糖蛋白。

埃博拉病毒和遗传相关的马堡病毒是导致严重疾病的人类病原体。埃博拉病毒和马堡病毒是丝状病毒，它们是具有负链RNA基因组的包膜病毒。丝状病毒科包括三个属：埃博拉病毒、马堡病毒和奎瓦病毒(Cuevavirus)。奎瓦病毒属以及马堡病毒属仅包括一个物种，分别即洛维奎瓦病毒(Lloviu cuevavirus)(洛维病毒-LLOV)和马堡马堡病毒(Marburgmarburgvirus)，细分为马堡病毒(MARV)与拉文病毒(RAVV)。埃博拉病毒属包括五个已知物种，即本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo virus-BDBV)、雷斯顿埃博拉病毒(Reston virus-RESTV)、苏丹埃博拉病毒(Sudan virus-SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒(Tai Forest virus-TAFV)(＝d'Ivoire ebolavirus)和扎伊尔埃博拉病毒(埃博拉病毒-EBOV)。虽然已从蝙蝠中分离出奎瓦病毒并且它们作为人类病原体的潜力仍然未知，但埃博拉病毒和马堡病毒都是人类病原体，分别引起埃博拉病毒病(EVD)和马堡病毒病，其特征为出血热与极高的死亡率。在本发明的上下文中，属于上文列出的科和属的病毒或与上文列出的科和属的病毒相关或源自上文列出的科和属的病毒的任何病毒、病毒成员、病毒株、病毒类型、病毒亚型、病毒分离株、病毒变种、或病毒血清型或病毒的基因重配体都被视为“埃博拉病毒”。

在本发明的第一方面的一个特别优选实施方案中，包含mRNA序列的mRNA化合物包含编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质源自埃博拉病毒属或马堡病毒属的病毒的糖蛋白(GP)和/或基质蛋白40(VP40)和/或核蛋白(NP)或其片段、变体或衍生物。

在此上下文中，至少一种抗原肽或蛋白质的氨基酸序列可选自源自以下的任何肽或蛋白质：糖蛋白(GP)和/或基质蛋白40(VP40)和/或核蛋白(NP)、埃博拉病毒的糖蛋白或其片段或变体，或选自任何合成工程化埃博拉病毒肽或蛋白质。

在本发明的一个优选实施方案中，编码区编码至少一种抗原肽或蛋白质，所述抗原肽或蛋白质源自埃博拉病毒的糖蛋白或其片段或变体。在此上下文中，特别优选的是，至少一个编码区编码埃博拉病毒的糖蛋白的至少一种全长蛋白或其变体。

在特别优选实施方案中，mRNA序列包含至少一个编码埃博拉病毒的糖蛋白的编码区。在特别优选实施方案中，mRNA序列包含至少一个编码埃博拉病毒的VP40的编码区。在特别优选实施方案中，mRNA序列包含至少一个编码埃博拉病毒的NP的编码区。

在特别优选实施方案中，mRNA序列包含至少一个编码埃博拉病毒的抗原肽或蛋白质的编码区，所述编码区包含选自以下RNA序列的RNA序列：

编码埃博拉病毒的GP蛋白的mRNA：专利申请WO2016097065的SEQ ID NO:37-39，或这些序列的片段或变体。在此上下文中，WO2016097065的SEQ ID NO:37-39和有关WO2016097065的SEQ ID NO:37-39的公开内容通过引用并入本文。

编码埃博拉病毒的VP40的mRNA：专利申请WO2016097065的SEQ ID NO:40-42，或这些序列的片段或变体。在此上下文中，WO2016097065的SEQ ID NO:40-42和有关WO2016097065的SEQ ID NO:40-42的公开内容通过引用并入本文。

编码埃博拉病毒的NP的mRNA：专利申请WO2016097065的SEQ ID NO:43-44，或这些序列的片段或变体。在此上下文中，WO2016097065的SEQ ID NO:43-44和有关WO2016097065的SEQ ID NO:43-44的公开内容通过引用并入本文。

V.9.3.肿瘤抗原

优选地，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物的至少一个编码序列编码肿瘤抗原(优选如本文所定义)或其片段或变体，其中所述肿瘤抗原优选选自由以下组成的组：1A01_HLA-A/m；1A02；5T4；ACRBP；AFP；AKAP4；α-辅肌动蛋白-_4/m；α-甲基酰基-辅酶_A_消旋酶；ANDR；ART-4；ARTC1/m；AURKB；B2MG；B3GN5；B4GN1；B7H4；BAGE-1；BASI；BCL-2；bcr/abl；β-连环蛋白/m；BING-4；BIRC7；BRCA1/m；BY55；钙网蛋白；CAMEL；CASP-8/m；CASPA；组织蛋白酶_B；组织蛋白酶_L；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D；CD1E；CD20；CD22；CD276；CD33；CD3E；CD3Z；CD44_同功型_1；CD44_同功型_6；CD4；CD52；CD55；CD56；CD80；CD86；CD8A；CDC27/m；CDE30；CDK4/m；CDKN2A/m；CEA；CEAM6；CH3L2；CLCA2；CML28；CML66；COA-1/m；毛状蛋白样_蛋白；胶原蛋白_XXIII；COX-2；CP1B1；CSAG2；CT45A1；CT55；CT-_9/BRD6；CTAG2_同功型_LAGE-1A；CTAG2_同功型_LAGE-1B；CTCFL；Cten；周期蛋白_B1；周期蛋白_D1；cyp-B；DAM-10；DEP1A；E7；EF1A2；EFTUD2/m；EGFR；EGLN3；ELF2/m；EMMPRIN；EpCam；EphA2；EphA3；ErbB3；ERBB4；ERG；ETV6；EWS；EZH2；FABP7；FCGR3A_型式_1；FCGR3A_型式_2；FGF5；FGFR2；纤连蛋白；FOS；FOXP3；FUT1；G250；GAGE-1；GAGE-2；GAGE-3；GAGE-4；GAGE-5；GAGE-6；GAGE7b；GAGE-8_(GAGE-2D)；GASR；GnT-V；GPC3；GPNMB/m；GRM3；HAGE；丝氨酸蛋白酶；Her2/neu；HLA-A2/m；同源盒_NKX3.1；HOM-TES-85；HPG1；HS71A；HS71B；HST-2；hTERT；iCE；IF2B3；IL10；IL-13Ra2；IL2-RA；IL2-RB；IL2-RG；IL-5；IMP3；ITA5；ITB1；ITB6；血管舒缓素-2；血管舒缓素-4；KI20A；KIAA0205；KIF2C；KK-LC-1；LDLR；LGMN；LIRB2；LY6K；MAGA5；MAGA8；MAGAB；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-A1；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-B10；MAGE-B16；MAGE-B17；MAGE-_B1；MAGE-B2；MAGE-B3；MAGE-B4；MAGE-B5；MAGE-B6；MAGE-C1；MAGE-C2；MAGE-C3；MAGE-D1；MAGE-D2；MAGE-D4；MAGE-_E1；MAGE-E1_(MAGE1)；MAGE-E2；MAGE-F1；MAGE-H1；MAGEL2；乳腺珠蛋白_A；MART-1/melan-A；MART-2；MC1_R；M-CSF；间皮素；MITF；MMP1_1；MMP7；MUC-1；MUM-1/m；MUM-2/m；MYCN；MYO1A；MYO1B；MYO1C；MYO1D；MYO1E；MYO1F；MYO1G；MYO1H；NA17；NA88-A；Neo-PAP；NFYC/m；NGEP；NPM；NRCAM；NSE；NUF2；NY-ESO-1；OA1；OGT；OS-9；骨钙素；骨桥蛋白；p53；PAGE-4；PAI-1；PAI-2；PAP；PATE；PAX3；PAX5；PD1L1；PDCD1；PDEF；PECA1；PGCB；PGFRB；Pim-1_-激酶；Pin-1；PLAC1；PMEL；PML；POTEF；POTE；PRAME；PRDX5/m；PRM2；prostein；蛋白酶-3；PSA；PSB9；PSCA；PSGR；PSM；PTPRC；RAB8A；RAGE-1；RARA；RASH；RASK；RASN；RGS5；RHAMM/CD168；RHOC；RSSA；RU1；RU2；RUNX1；S-100；SAGE；SART-_1；SART-2；SART-3；SEPR；SERPINB5；SIA7F；SIA8A；SIAT9；SIRT2/m；SOX10；SP17；SPNXA；SPXN3；SSX-1；SSX-2；SSX3；SSX-4；ST1A1；STAG2；STAMP-1；STEAP-1；存活素-2B；存活素；SYCP1；SYT-SSX-1；SYT-SSX-2；TARP；TCRg；TF2AA；TGFB1；TGFR2；TGM-4；TIE2；TKTL1；TPI/m；TRGV11；TRGV9；TRPC1；TRP-p8；TSG10；TSPY1；TVC_(TRGV3)；TX101；酪氨酸酶；TYRP1；TYRP2；UPA；VEGFR1；WT1；和XAGE1。

适用于本发明的其他抗原如下所示(基因名称之后的括号内为蛋白质登录号)：

1A01_HLA-A/m(UniProtKB:P30443)；1A02(UniProtKB:P01892)；5T4(UniProtKB:Q13641)；ACRBP(UniProtKB:Q8NEB7)；AFP(UniProtKB:P02771)；AKAP4(UniProtKB:Q5JQC9)；α-辅肌动蛋白-_4/m(UniProtKB:B4DSX0)；α-辅肌动蛋白-_4/m(UniProtKB:B4E337)；α-辅肌动蛋白-_4/m(UniProtKB:043707)；α-甲基酰基-辅酶A_消旋酶(UniProtKB:AOA024RE16)；α-甲基酰基-辅酶A_消旋酶(UniProtKB:A8KAC3)；ANDR(UniProtKB:P10275)；ART-4(UniProtKB:Q9ULX3)；ARTCi/m(UniProtKB:P52961)；AURKB(UniProtKB:Q96GD4)；B2MG(UniProtKB:P61769)；B3GN5(UniProtKB:Q9BYG0)；B4GN1(UniProtKB:Q00973)；B7H4(UniProtKB:Q7Z7D3)；BAGE-1(UniProtKB:Q13072)；BASI(UniProtKB:P35613)；BCL-2(UniProtKB:A9QXG9)；bcr/abl(UniProtKB:A9UEZ4)；bcr/abl(UniProtKB:A9UEZ7)；bcr/abl(UniProtKB:A9UEZ8)；bcr/abl(UniProtKB:A9UEZ9)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF00)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF01)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF03)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF04)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF05)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF06)；bcr/abl(UniProtKB:A9UF08)；β-连环蛋白/m(UniProtKB:P35222)；β-连环蛋白/m(UniProtKB:Q8WYA6)；BING-4(UniProtKB:015213)；BIRC7(UniProtKB:Q96CA5)；BRCA1/m(UniProtKB:AOA024R1V0)；BRCA1/m(UniProtKB:AOA024R1V7)；BRCA1/m(UniProtKB:AOA024RIZ8)；BRCA1/m(UniProtKB:AOA068BFX7)；BRCA1/m(UniProtKB:C6YB45)；BRCA1/m(UniProtKB:C6YB47)；BRCA1/m(UniProtKB:G3XAC3)；BY55(UniProtKB:095971)；钙网蛋白(UniProtKB:B4DHR1)；钙网蛋白(UniProtKB:B4E2Y9)；钙网蛋白(UniProtKB:P27797)；钙网蛋白(UniProtKB:Q96L12)；CAMEL(UniProtKB:095987)；CASP-8/m(UniProtKB:Q14790)；CASPA(UniProtKB:Q92851-4)；组织蛋白酶_B(UniProtKB:AOA024R374)；组织蛋白酶_B(UniProtKB:P07858)；组织蛋白酶_L(UniProtKB:AOA024R276)；组织蛋白酶_L(UniProtKB:P07711)；组织蛋白酶_L(UniProtKB:Q9HBQ7)；CD1A(UniProtKB:P06126)；CD1B(UniProtKB:P29016)；CD1C(UniProtKB:P29017)；CD1D(UniProtKB:P15813)；CD1E(UniProtKB:P15812)；CD20(UniProtKB:P11836)；CD22(UniProtKB:060926)；CD22(UniProtKB:P20273)；CD22(UniProtKB:Q0EAF5)；CD276(UniProtKB:Q5ZPR3)；CD33(UniProtKB:B4DF51)；CD33(UniProtKB:P20138)；CD33(UniProtKB:Q546G0)；CD3E(UniProtKB:P07766)；CD3Z(UniProtKB:P20963)；CD44_同功型_1(UniProtKB:P16070)；CD44_同功型_6(UniProtKB:P16070-6)；CD4(UniProtKB:P01730)；CD52(UniProtKB:P31358)；CD52(UniProtKB:Q6IBD0)；CD52(UniProtKB:V9HWN9)；CD55(UniProtKB:B1AP15)；CD55(UniProtKB:D3DT85)；CD55(UniProtKB:D3DT86)；CD55(UniProtKB:P08174)；CD56(UniProtKB:P13591)；CD80(UniProtKB:A0N0P2)；CD80(UniProtKB:P33681)；CD86(UniProtKB:P42081)；CD8A(UniProtKB:P01732)；CDC27/m(UniProtKB:G5EA36)；CDC27/m(UniProtKB:P30260)；CDE30(UniProtKB:P28908)；CDK4/m(UniProtKB:AOA024RBB6)；CDK4/m(UniProtKB:P11802)；CDK4/m(UniProtKB:Q6LC83)；CDK4/m(UniProtKB:Q96BE9)；CDKN2A/m(UniProtKB:D1LYX3)；CDKN2A/m(UniProtKB:G3XAG3)；CDKN2A/m(UniProtKB:K7PML8)；CDKN2A/m(UniProtKB:L8E941)；CDKN2A/m(UniProtKB:Q8N726)；CEA(RefSeq:NP_004354)；CEAM6(UniProtKB:P40199)；CH3L2(UniProtKB:Q15782)；CLCA2(UniProtKB:Q9UQC9)；CML28(UniProtKB:Q9NQT4)；CML66(UniProtKB:Q96RS6)；COA-1/m(UniProtKB:Q5T124)；毛状蛋白样_蛋白(UniProtKB:Q14019)；胶原蛋白_XXIII(UniProtKB:L8EAS4)；胶原蛋白_XXIII(UniProtKB:Q86Y22)；COX-2(UniProtKB:Q6ZYK7)；CP1B1(UniProtKB:Q16678)；CSAG2(UniProtKB:Q9Y5P2-2)；CSAG2(UniProtKB:Q9Y5P2)；CT45A1(UniProtKB:Q5HYN5)；CT55(UniProtKB:Q8WUE5)；CT-_9/BRD6(UniProtKB:Q58F21)；CTAG2_同功型_LAGE-1A(UniProtKB:075638-2)；CTAG2_同功型_LAGE-1B(UniProtKB:075638)；CTCFL(UniProtKB:Q8NI51)；Cten(UniProtKB:Q8IZW8)；周期蛋白_B1(UniProtKB:P14635)；周期蛋白_D1(UniProtKB:P24385)；cyp-B(UniProtKB:P23284)；DAM-10(UniProtKB:P43366)；DEP1A(UniProtKB:Q5TB30)；E7(UniProtKB:P03129)；E7(UniProtKB:P06788)；E7(UniProtKB:P17387)；E7(UniProtKB:P06429)；E7(UniProtKB:P27230)；E7(UniProtKB:P24837)；E7(UniProtKB:P21736)；E7(UniProtKB:P26558)；E7(UniProtKB:P36831)；E7(UniProtKB:P36833)；E7(UniProtKB:Q9QCZ1)；E7(UniProtKB:Q81965)；E7(UniProtKB:Q80956)；EF1A2(UniProtKB:Q05639)；EFTUD2/m(UniProtKB:Q15029)；EGFR(UniProtKB:A0A0B4J1Y5)；EGFR(UniProtKB:E7BSV0)；EGFR(UniProtKB:L0R6G1)；EGFR(UniProtKB:P00533-2)；EGFR(UniProtKB:P00533)；EGFR(UniProtKB:Q147T7)；EGFR(UniProtKB:Q504U8)；EGFR(UniProtKB:Q8NDU8)；EGLN3(UniProtKB:Q9H6Z9)；ELF2/m(UniProtKB:B7Z720)；EMMPRIN(UniProtKB:Q54A51)；EpCam(UniProtKB:P16422)；EphA2(UniProtKB:P29317)；EphA3(UniProtKB:P29320)；EphA3(UniProtKB:Q6P4R6)；ErbB3(UniProtKB:B3KWG5)；ErbB3(UniProtKB:B4DGQ7)；ERBB4(UniProtKB:Q15303)；ERG(UniProtKB:P11308)；ETV6(UniProtKB:P41212)；EWS(UniProtKB:Q01844)；EZH2(UniProtKB:F2YMM1)；EZH2(UniProtKB:G3XAL2)；EZH2(UniProtKB:L0R855)；EZH2(UniProtKB:Q15910)；EZH2(UniProtKB:S4S3R8)；FABP7(UniProtKB:015540)；FCGR3A_型式_1(UniProtKB:P08637)；FCGR3A_型式_2(CCDS:CCDS1232.1)；FGF5(UniProtKB:P12034)；FGF5(UniProtKB:Q60518)；FGFR2(UniProtKB:P21802)；纤连蛋白(UniProtKB:AOA024R5I6)；纤连蛋白(UniProtKB:AOA024RB01)；纤连蛋白(UniProtKB:AOA024RDT9)；纤连蛋白(UniProtKB:AOA024RDV5)；纤连蛋白(UniProtKB:A6NH44)；纤连蛋白(UniProtKB:A8K6A5)；纤连蛋白(UniProtKB:B2R627)；纤连蛋白(UniProtKB:B3KXM5)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DIC5)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DN21)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DS98)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DTH2)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DTK1)；纤连蛋白(UniProtKB:B4DU16)；纤连蛋白(UniProtKB:B7Z3W5)；纤连蛋白(UniProtKB:B7Z939)；纤连蛋白(UniProtKB:G5E9X3)；纤连蛋白(UniProtKB:Q9H382)；FOS(UniProtKB:P01100)；FOXP3(UniProtKB:Q9BZS1)；FUT1(UniProtKB:P19526)；G250(UniProtKB:Q16790)；GAGE-1(Genbank:AAA82744)；GAGE-2(UniProtKB:Q6NT46)；GAGE-3(UniProtKB:Q13067)；GAGE-4(UniProtKB:Q13068)；GAGE-5(UniProtKB:Q13069)；GAGE-6(UniProtKB:Q13070)；GAGE7b(UniProtKB:076087)；GAGE-8_(GAGE-2D)(UniProtKB:Q9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V.9.4.检查点抑制剂

发现了负调节性T细胞表面分子，它们在经活化的T细胞中上调以抑制其活性，从而降低所述经活化的T细胞杀死肿瘤细胞的有效性。由于这些抑制分子与T细胞共刺激分子CD28具有同源性，因此它们是称为负共刺激分子。这些蛋白质(也称为免疫检查点蛋白)在多种途径中发挥作用，包括减弱早期激活信号、竞争正共刺激和直接抑制抗原呈递细胞(Bour-Jordan等人,2011.Immunol Rev.241(1):180-205)。

在本发明的上下文中，检查点调节剂通常为分子，例如蛋白质(例如抗体)、显性负性受体、诱饵受体、或配体或其片段或变体，其调节免疫检查点蛋白的功能，例如，它抑制或降低检查点抑制剂(或抑制性检查点分子)的活性，或者它刺激或提高检查点刺激剂(或刺激性检查点分子)的活性。因此，如本文所定义的检查点调节剂影响检查点分子的活性。

在此上下文中，抑制性检查点分子被定义为检查点抑制剂并且可同义使用。另外，刺激性检查点分子被定义为检查点刺激剂并且可同义使用。

优选地，检查点调节剂选自激动性抗体、拮抗性抗体、配体、显性负性受体和诱饵受体或其组合。

生成和使用mRNA编码抗体的方法是本领域中已知的(例如WO2008/083949或PCT/EP2017/060226)。

在本发明的上下文中，可受检查点调节剂抑制的优选抑制性检查点分子为PD-1、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3/HAVCR2、2B4、A2aR、B7H3、B7H4、BTLA、CD30、CD160、CD155、GAL9、HVEM、IDO1、IDO2、KIR、LAIR1和VISTA。

在本发明的上下文中，可受检查点调节剂刺激的优选刺激性检查点分子为CD2、CD27、CD28、CD40、CD137、CD226、CD276、GITR、ICOS、OX40和CD70。

根据一个优选实施方案，包含本发明的RNA的药物组合物或疫苗被用于如本文所述的用途，其中所述用途包括——作为额外的药物活性成分——选自由检查点调节剂组成的组的检查点调节剂选自由以下组成的组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂、TIGIT抑制剂、OX40刺激剂、4-1BB刺激剂、CD40L刺激剂、CD28刺激剂和GITR刺激剂。

根据一个优选实施方案，如本文所用的检查点调节剂靶向PD-1通路的成员。PD-1通路的成员通常是与PD-1信号传导相关的蛋白质。在一个方面，这个组包括在PD-1上游诱导PD-1信号传导的蛋白质，例如PD-1、PD-L1和PD-L2的配体，以及信号转导受体PD-1。另一方面，这个组包括PD-1受体下游的信号转导蛋白。在本发明的上下文中，特别优选作为PD-1通路成员的是PD-1、PD-L1和PD-L2。

在本发明的上下文中，PD-1通路拮抗剂(或PD-1抑制剂)在本文中优选定义为能够削弱PD-1通路信号传导、优选由PD-1受体介导的信号传导的化合物。因此，PD-1通路拮抗剂可为针对能够拮抗PD-1通路信号传导的PD-1通路的任何成员的任何拮抗剂。

在一个优选实施方案中，本文所用的检查点调节剂为PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中PD-1抑制剂优选是针对PD-1的拮抗性抗体，而PD-L1抑制剂优选是针对PD-L1的拮抗性抗体。

在此上下文中，拮抗剂可为本文所定义的拮抗性抗体，靶向PD-1通路的任何成员，优选是针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2的拮抗性抗体。此种拮抗性抗体也可由核酸编码。此外，PD-1通路拮抗剂可为阻断PD1配体活性的PD-1受体的片段。B7-1或其片段也可充当PD1拮抗配体。另外，PD-1通路拮抗剂可为包含能够结合PD-1但例如通过抑制PD-1和B7-H1或B7-DL相互作用阻止PD-1信号传导的氨基酸序列的蛋白质(或编码能够结合PD-1但例如通过抑制PD-1和B7-H1或B7-DL相互作用阻止PD-1信号传导的氨基酸序列的核酸)(WO 2014/127917；WO2012062218)。

特别优选的是抗PD1抗体纳武单抗(MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538),(Brahmer等人,2010.J Clin Oncol.28(19):3167-75；PMID:20516446)；匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011),(Berger等人,2008.Clin Cancer Res.14(10):3044-51；PMID:18483370)；派姆单抗(MK-3475,SCH 900475)；AMP-224和MEDI0680(AMP-514)。

特别优选的还有抗PD-L1抗体MDX-1105/BMS-936559(Brahmer等人,2012.N EnglJ Med.366(26):2455-65；PMID:22658128)；阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A/RG7446)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)；和阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718)。

根据另一个实施方案，本文所用的检查点调节剂是OX40刺激剂。OX40是TNFR受体超家族的成员，并且在抗原活化的哺乳动物CD4+和CD8+T淋巴细胞表面上表达。OX40配体(OX40L，也称为gp34、ACT-4-L和CD252)是与OX40受体特异性相互作用的蛋白质。术语OX40L包括整个OX40配体、可溶性OX40配体和融合蛋白，其包含与第二部分例如蛋白质结构域共价连接的OX40配体的功能活性部分。OX40L的定义中还包括氨基酸序列与天然存在的OX40L不同但保留与OX40受体特异性结合的能力的变体。OX40L的定义中还包括其变体，所述变体提高OX40的生物活性。OX40激动剂是诱导或提高OX40的生物活性(例如，OX40介导的信号转导)的分子。Ox40激动剂在本文中优选定义为能够与OX40特异性结合的结合分子。因此，OX40激动剂可为与OX40结合并能够刺激OX40信号传导的任何激动剂。在此上下文中，OX40激动剂可为与OX40结合的激动性抗体。

OX40激动剂和抗0X40单克隆抗体描述于WO1995/021251、WO1995/012673和WO1995/21915中。特别优选的是抗0X40抗体9B12，即一种针对人类OX40胞外域的鼠抗0X40单克隆抗体(Weinberg等人,2006.J.Immunother.29(6):575-585)。

在另一个实施方案中，如本文所用的检查点调节剂是选自由以下组成的组的拮抗性抗体：抗CTLA4、抗PD1、抗PD-L1、抗Vista、抗Tim-3、抗TIGIT、抗LAG-3和抗BTLA。

优选地，可用作检查点调节剂的抗CTLA4抗体是针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)。CTLA-4主要在T细胞的细胞内区室中表达。在经由T细胞受体(TCR)对幼稚T细胞进行有效或持久刺激后，CTLA-4被转运至细胞表面并集中在免疫突触处。CTLA-4随后与CD28竞争CD80/CD86并经由对Akt信号传导的效应下调TCR信号传导。因此，CTLA-4在生理上起到信号阻尼器的作用(Weber,J.2010.Semin.Oncol.37(5):430-9)。

在优选实施方案中，包含本发明的RNA的药物组合物或疫苗被用于如本文所述的用途，其中所述用途包括——作为额外的药物活性成分——CTLA4拮抗剂，其优选为针对CTLA4的拮抗性抗体(抗CTLA4抗体)。如本文所用，术语“CTLA4拮抗剂”包括拮抗CTLA4的生理功能的任何化合物，例如抗体。在本发明的上下文中，术语“抗CTLA4抗体”可指代针对CTLA4的拮抗性抗体(或所述抗体的功能片段或变体)或编码所述拮抗性抗体(或其功能片段)的核酸，优选RNA。抗CTLA4抗体的功能片段或变体优选充当CTLA4拮抗剂。更优选地，术语“抗CTLA4抗体”是指针对CTLA4的单克隆抗体(或此类抗体的功能片段或变体)或编码针对CTLA4的单克隆抗体(或此类抗体的功能片段或变体)的核酸。如本文所用，术语“抗CTLA4抗体”可分别指代抗体重链或轻链，或还指代抗体链(重链和轻链)，或这些链中任一者的片段或变体。优选地，如本文所用的抗CTLA4抗体的片段或变体是功能片段或变体，优选如本文所述。

特别优选的是抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)曲美木单抗(tremelimumab)和AGEN-1884。如本文所用，进一步优选的抗CTLA4抗体包括BMS 734016；BMS-734016；BMS734016；MDX 010；MDX 101；MDX-010；MDX-101；MDX-CTLA-4；MDX-CTLA4；MDX010；Winglore；和Yervoy；或这些抗体中任一者的功能片段或变体。

根据另一个实施方案，如本文所用的检查点调节剂是表1中描述的至少一种抗体或其片段或变体。

V.5.组合癌症疗法

更优选地，接受包含本发明的RNA的药物组合物或疫苗、其组合或包含所述RNA的药物组合物或疫苗的受试者是患有如本文所述的肿瘤或癌症疾病并且接受过或接受化疗(例如一线或二线化疗)、放疗、放化疗(化疗与放疗的组合)、激酶抑制剂、抗体疗法和/或检查点调节剂(例如CTLA4抑制剂、PD1通路抑制剂)的患者，或在接受上述一种或多种治疗后已实现部分反应或疾病稳定的患者。更优选地，受试者是患有如本文所述的肿瘤或癌症疾病并且接受过或接受常规用于本文所述的任何这些疾病的化合物的患者，更优选为接受或接受过检查点调节剂的患者。

以下化合物是优选化合物，其优选用于标准疗法中并且可与包含本发明的RNA的药物组合物或疫苗组合应用：西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、(吉美嘧啶(gimeracil)+奥替拉西(oteracil)+替加氟(tegafur))(TS-1)、多西紫杉醇(Docetaxel、Doxel、Taxotere、多西紫杉醇An、Docel、Nanoxel M、Tautax、多西紫杉醇-AS、多西紫杉醇-M、Qvidadotax、Relidoce、Taxelo、Oncodocel、Doxotel、Pacancer、Docetrust、Dodetax、Dodabur、Soulaxcin、Taxedol、Docefim、Docetaxel、Ribodocel、Critidoc、Asodoc、Chemodoc、Docelibbs、Docenat、Dincilezan、Dostradixinol、Docefrez、Camitotic、Oncotaxel、Somatixel、Belotaxel、Qvidadotax、Taxceus、Cetadocure、多西紫杉醇CT、Tevaxter、Docirena、Eurotere、Axtere、Celotax、Taxanit、Drobanos、Cetado、Doxocad、Taxceus、Egidox、Tedocad、Docecad、Docelex、Docetax、Docetaxel、Docetere、Dotax、Taxuba、Monotaxel、Taceedo、Detaxl、Docet、Docetaxel、Ferdotax、Wintaxel)、(替加氟+尿嘧啶)(Uft、Uft E、Tefudex、Unitoral、Luporal、Tagracil)、氟尿嘧啶(5-FU)、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)ODT(TS-1组合OD)、硫酸博莱霉素(Tecnomicina、Cinaleo、Bleomycin、Bloicin-S、Bonar、Bleocin、Bleomycin Sulfate、Bleo、Bleocel、Bleotex、Oncobleo、Bleonco、Bleosol、Lyoble、Bleomycin Sulfate、Blenamax、Bleomycin、Blenoxane、Bleomicina、Bleomycine Bellon、Bleoprim)、卡铂(Carboplatin、PlatamineCS、Carbaccord、Carboplatina、Carboplatino、Paraplatin、Carbosin、Tecnocarb、Carbomerck、Paract、Carboplatine CTRS、Carboplatine Intsel Chimos、Carboplatin、Carbokem、Carbotinol、Fauldcarbo、Evocarb、Citoplatina、Platin)、赛普沙辛(Hypoflox、Ufexil)、盐酸赛普沙辛(Ciprofloxacin Pharma、Prodin、Ciproxin)、顺铂(Cisplatin、Stritin、Ifapla、Accocit、Unistin、Cancertin、Cisplan、Citoplax、Nuoxin、Placis、Cisplatino、Displanor、Randa、Cispla、Fauldcispla、Briplatin、Platinex、Platinol、Platinex、Riboplatin、Cisplatine、Platistine CS、Platosin、Accocit、Cisplatino)、环磷酰胺(Endoxan、Cyclophosphamide)、脱氧氟尿苷(Doxifluridine、May Vladimir)、多柔比星(盐酸多柔比星、Adriamycin RDF、Doxorubicin、Doxorubicin PFS)、盐酸表柔比星(Brecila、Cloridrato De Epirrubicina、Epirubicin、Farmorubicina、Nuovodox、Adnexa、4-Eppedo、Favicin)、氟尿嘧啶(Agicil、Fluorouracil、Fauldfluor、Oncourcil、Flocil、5Flucel)、叶酸+甲氨蝶呤(Truxofol)、人类腺病毒5型(重组)(Oncorine)、羟基脲(Oxyrea、Durea、Myelostat、Riborea、Unidrea、Ondrea、Hydran、Leukocel、Hydroxyurea、Hydrea)、异环磷酰胺(Holoxan、Ifosfamide EG)、左旋咪唑(Zirsol)、甲氨蝶呤(Tratoben、Methotrexate、Fresexate、Neometho、Fauldmetro、Methotrexate Sodium、Methocel、Hytas、Methaccord、Methofill、Metotrexato、Traxacord、Plastomet、Tevatrex、Metrex、Caditrex、Carditrex、Vibzi、Imutrex、Biotrexate、Methorex、Mexate、Neotrexate、Oncotrex、Remtrex、Trixilem、Hi-Trex、Metorex、Trex、Unitrexate、Ebetrexac、Fauldexato、Lantarel、Maxtrex、Miantrex CS、Rheumatrex、Folex、Folex PFS、Abitrexate、Tevametho、Trexall、Emthexate、Abitrexate、Meadow)、丝裂霉素(丝裂霉素C、Mitomycin、Mitonco、Lyomit)、奈达铂(Jiebaishu、Aoxianda、Aqupla)、尼美舒利(Nimulid)、尼妥珠单抗(Biomab EGFR,Laedemab)、硝基呋喃妥因(Furatsilin)、氧氟沙星(Entof)、紫杉醇(Paclitaxel、Taxol)、硫酸匹莱霉素(Pepleo)、沙培林(Picibanil)、吡柔比星(盐酸吡柔比星、Therarubicin、Pinorubin)、甘氨双唑钠(CMNa)、替加氟(Utefos、Icarus、Futraful、Tegafur Gimeracil Oteracil Potassium)、替莫卟吩(Foscan)、盐酸拓扑替康(Topotecan)、乌苯美司(Ubenimex)、硫酸长春花碱(Vinblastine、Vblastin)、硫酸长春新碱(Vincristine、Vincristine Sulfate、Vincristin、Sutivin、vindesine sulfate(Eldisine)、卡铂(Carboplatine Qualimed、Carboplatine、Carboplatino、Carboplatin)、顺铂(Cisplatin)、多西紫杉醇(Kamdocon、Naltoxater、Docetaxel)、氟尿嘧啶(Fluorouracil、Fluorouracile、Fluorouracil)、甲氨蝶呤(甲氨蝶呤钠、Mexate、MexateAq、Biometrox、Medsatrexate、Otaxem)、硫酸长春新碱(Oncovin)、氟尿嘧啶、苹果酸舒尼替尼、阿维A酸、纤维蛋白密封剂、西妥昔单抗、西妥昔单抗、埃罗替尼、顺铂；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、未经公开的抗癌药物、吉非替尼(gefitinib)、普伐他汀钠(pravastatin sodium)、西罗莫司(sirolimus)、未经公开的化疗、顺铂；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、西罗莫司、氟尿嘧啶；未经公开的紫杉烷、盐酸氨基戊酮酸甲酯、顺铂；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、盐酸埃罗替尼、西妥昔单抗、咪喹莫特、未经公开的中草药、阿司匹林；马来酸伊那拉普利(enalaprilmaleate)、未经公开的化疗、西妥昔单抗、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)；卡铂；顺铂、顺铂；氟尿嘧啶；尼妥珠单抗、卡铂；白蛋白结合型紫杉醇、顺铂；奈达铂、博莱霉素、奈达铂、顺铂；紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)、博莱霉素；未经公开的化疗、阿帕替尼；多西紫杉醇、未经公开的免疫调节补充剂、BCM-95、盐酸氨酮戊酸、奈达铂、顺铂；帕利夫明(palifermin)、西妥昔单抗、吉非替尼、贝伐单抗、belagenpumatucel-L、顺铂；替拉扎明(tirapazamine)、顺铂；替拉扎明、顺铂；吉西他滨(gemcitabine)；紫杉醇；拓扑替康；长春瑞滨、顺铂；氟尿嘧啶、帕尼单抗、卡铂；多西紫杉醇；盐酸吉西他滨；酒石酸长春瑞滨、氨磷汀；氟尿嘧啶、顺铂；氟尿嘧啶、卡铂；紫杉醇、替拉扎明、顺铂；阿法依伯汀、菲妥珠单抗(figitumumab)、美法仑(melphalan)；肿瘤坏死因子alf、顺铂、顺铂；氟尿嘧啶、顺铂；未经公开的化疗、多西紫杉醇、拉康舒集(contusugene ladenovec)、顺铂；氟尿嘧啶；紫杉醇、多西紫杉醇、人类乳头状瘤病毒[血清型16、18](二价)疫苗、异维甲酸、顺铂；氟尿嘧啶、米索硝唑(misonidazole)、紫杉醇、帕利夫明(palifermin)、内皮抑素(endostatin)、匹鲁卡品(pilocarpine)、顺铂；多西紫杉醇；非格司亭(filgrastim)；氟尿嘧啶；紫杉醇、顺铂；多西紫杉醇；非格司亭；氟尿嘧啶；紫杉醇、顺铂；盐酸伊立替康、顺铂；吉西他滨、顺铂；表柔比星；氟尿嘧啶；未经公开的化疗、盐酸氨基戊酮酸甲酯、卡铂；紫杉醇、卡波金(carbogen)；二氧化碳；烟碱酰胺、顺铂；氟尿嘧啶、talimogene laherparepvec、阿法依泊汀、顺铂；氟尿嘧啶；帕尼单抗、顺铂；氟尿嘧啶、顺铂；氟尿嘧啶、阿地白介素(aldesleukin)、顺铂；氟尿嘧啶、顺铂；紫杉醇、顺铂；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶；甲酰四氢叶酸；乐巴铂(lobaplatin)、顺铂、顺铂；乙硫醇；异环磷酰胺；美司钠(mesna)；二溴卫矛醇(mitolactol)、多柔比星；左旋咪唑、(替加氟+尿嘧啶)、顺铂；氟尿嘧啶、顺铂；长春瑞滨、卡铂；顺铂；盐酸吉西他滨、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)；多柔比星、卡培他滨(capecitabine)；顺铂；氟尿嘧啶；紫杉醇、氟尿嘧啶；甲酰四氢叶酸；甲氨蝶呤、rAd-p53、西妥昔单抗；顺铂；多西紫杉醇、PV-10、盐酸氨基戊酮酸甲酯、顺铂；氟尿嘧啶、紫杉醇；盐酸拓扑替康、卡铂；顺铂；紫杉醇、顺铂；盐酸拓扑替康、顺铂；依托泊苷、多西紫杉醇；氟尿嘧啶、阿司匹林、顺铂；吉西他滨、短乳酸杆菌CD2、顺铂；多西紫杉醇、三木甲胺康布瑞汀(fosbretabulin tromethamine)、帕尼单抗、氟尿嘧啶、紫杉醇、卡铂；顺铂；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、盐酸埃罗替尼、顺铂；未经公开的化疗；长春瑞滨、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)；卡铂、西妥昔单抗、拉康舒集、西妥昔单抗、盐酸氨基戊酮酸甲酯、环磷酰胺、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)；顺铂、白蛋白结合型紫杉醇、卡铂；紫杉醇、顺铂；吉西他滨、卡培他滨；顺铂、多西紫杉醇、Z-100、顺铂；异环磷酰胺；紫杉醇、尼妥珠单抗、盐酸伊立替康、塞来昔布；甲氨蝶呤、Nutrison、卡铂；顺铂；氟尿嘧啶；紫杉醇、顺铂；紫杉醇、顺铂；多西紫杉醇；长春瑞滨、紫杉醇、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)；顺铂、卡铂；紫杉醇、盐酸氨基戊酮酸甲酯、Aibin、顺铂；氟尿嘧啶、卟吩姆钠(porfimersodium)、卡铂；顺铂；生育三烯酚(tocotrienol)；长春瑞滨、(吉美嘧啶+奥替拉西+替加氟)；顺铂；紫杉醇、多西紫杉醇、伊匹单抗、顺铂、VB-4847、塞来昔布；沙利度胺(thalidomide)、顺铂；表柔比星；氟尿嘧啶、顺铂；氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡铂；紫杉醇、西妥昔单抗；顺铂；多西紫杉醇、自体细胞因子诱导的杀手细胞、顺铂；多西紫杉醇；氟尿嘧啶、顺铂；表柔比星；氟尿嘧啶、tergenpumatucel-L、西妥昔单抗；顺铂；多西紫杉醇、爱伦多(Elental)、顺铂；尼妥珠单抗；紫杉醇、二十碳五烯酸；未经公开的营养补充剂、帕博西林(palbociclib)、派姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、尼妥珠单抗、阿帕托森(apatorsen)和达可替尼(dacomitinib)。

如本文所用，术语“肿瘤”、“癌症”或“癌症疾病”是指恶性疾病，其优选选自由以下组成的组：腺囊癌(腺样囊性癌)、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、小脑幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、儿童类癌瘤、胃肠道类癌瘤、不明原发癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤(包括蕈状肉芽肿和赛扎里综合征(SezarySyndrome))、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文家族肿瘤中的尤文氏肉瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、颅外、性腺外或卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干神经胶质瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、胃癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、人乳头状瘤病毒(HPV)相关癌症、下咽癌、儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、儿童髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、头颈癌、口腔癌、儿童多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、多发性骨髓瘤(骨髓癌)、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、儿童松果体母细胞瘤和小脑幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文氏肿瘤家族的肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发灶、软组织肉瘤(STS)、儿童小脑幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌(精原细胞瘤和非精原细胞瘤)、喉癌、儿童胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、儿童甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌和儿童维尔姆斯瘤(肾癌)。

V.9.过敏性抗原

与过敏或过敏性疾病相关的抗原(过敏原或过敏性抗原)优选来源于选自由以下组成的列表的来源：

毛囊虫属某种(Aca s 1、Aca s 10、Aca s 10.0101、Aca s 13、Aca s 13.0101、Aca s 2、Aca s 3、Aca s 7、Aca s 8)、刺鲅属某种(Aca so 1)、棘唇线虫某种(Aca v 3、Aca v 3.0101)、毛虾属某种(Ace ja 1)、猕猴桃属某种(Act a 1、Act c 1、Act c 10、Actc 10.0101、Act c 2、Act c 4、Act c 5、Act c 5.0101、Act c 8、Act c 8.0101、Act c几丁质酶、Act d 1、Act d 1.0101、Act d 10、Act d 10.0101、Act d 10.0201、Act d 11、Act d11.0101、Act d 2、Act d 2.0101、Act d 3、Act d 3.0101、Act d 3.02、Act d 4、Act d4.0101、Act d 5、Act d 5.0101、Act d 6、Act d 6.0101、Act d 7、Act d 7.0101、Act d8、Act d 8.0101、Act d 9、Act d 9.0101、Act d几丁质酶、Act e 1、Act e 5)、管蚜属某种(Acy pi 7、Acy pi 7.0101、Acy pi 7.0102)、西番莲属(Adenia)某种(Ade v RIP)、斑蚊属某种(Aed a 1、Aed a 1.0101、Aed a 2、Aed a 2.0101、Aed a 3、Aed a 3.0101、Aed a 4、Aed a 7、Aed a 7.0101、Aed a 7.0102、Aed a 7.0103、Aed a 7.0104、Aed a 7.0105、Aeda 7.0106、Aed a 7.0107、Aed a 7.0108、Aed a 7.0109、Aed a 7.0110、Aed a 7.0111、Aedal 1、Aed al 3、Aed al 37kD、Aed v 37kD、Aed v 63kD)、山羊草属某种(Aeg ta 28、Aegtaα_麦胶蛋白、Aeg um 28、Aeg un 28)、烟鲈属某种(Aet ro 1)、冰草属某种(Agr c 7)、小糠草属某种(Agr ca 1、Agr ca 5、Agr g 1、Agr g 4、Agr s 5)、农杆菌属某种(Agr sp CP4EPSPS)、猫熊属某种(Ail me卵黄高磷蛋白、Ail me TCTP)、鸳鸯某种(Aix ga 1、Aix sp1)、食粉螨属某种(Ale o 1、Ale o 10、Ale o 10.0101、Ale o 10.0102、Ale o 13、Ale o14、Ale o 2、Ale o 20、Ale o 3、Ale o 5、Ale o 7、Ale o 8、Ale o 9)、蒜属某种(All a3、All a蒜氨酸解离酶、All c 3、All c 30kD、All c 4、All c蒜氨酸解离酶、All p蒜氨酸解离酶、All s蒜氨酸解离酶)、赤杨属某种(Aln g 1、Aln g 1.0101、Aln g 1/Bet v 1/Cora 1TPC7、Aln g 1/Bet v 1/Cor a 1 TPC9、Aln g 2、Aln g 4、Aln g 4.0101)、埃和雁属某种(Alo ae 1)、看麦娘属某种(Alo p 1、Alo p 5)、链格孢菌属某种(Alt a 1、Alt a1.0101、Alt a 1.0102、Alt a 10、Alt a 10.0101、Alt a 12、Alt a 12.0101、Alt a 13、Alt a 13.0101、Alt a 2、Alt a 3、Alt a 3.0101、Alt a 4、Alt a 4.0101、Alt a 5、Alt a5.0101、Alt a 6、Alt a 6.0101、Alt a 7、Alt a 7.0101、Alt a 70kD、Alt a 8、Alt a8.0101、Alt a 9、Alt a MnSOD、Alt a NTF2、Alt a TCTP、Alt ar 1、Alt arg 1、Alt b 1、Alt bl 1、Alt br 1、Alt c 1、Alt ca 1、Alt ce 1、Alt ch 1、Alt ci 1、Alt co 1、Alt cr1、Alt ct 1、Alt cu 1、Alt cy 1、Alt d 1、Alt du 1、Alt e 1、Alt et 1、Alt eu 1、Altga 1、Alt gr 1、Alt j 1、Alt I 1、Alt lo 1、Alt m 1、Alt me 1、Alt mi 1、Alt mo 1、Alto 1、Alt p 1、Alt ph 1、Alt po 1、Alt ps 1、Alt r 1、Alt s 1、Alt se 1、Alt sm 1、Altso 1、Alt su 1、Alt t 1、Alt te 1、Alt to 1)、苋属某种(Ama r 2、Ama r 2.0101、Ama v2、Ama v 2.0101、Ama v 2.0201)、猪草属某种(Amb a 1、Amb a 1.0101、Amb a 1.0201、Amba 1.0202、Amb a 1.0301、Amb a 1.0302、Amb a 1.0303、Amb a 1.0304、Amb a 1.0305、Amba 1.0401、Amb a 1.0402、Amb a 1.0501、Amb a 1.0502、Amb a 10、Amb a 10.0101、Amb a3、Amb a 3.0101、Amb a 4、Amb a 4.0101、Amb a 5、Amb a 5.0101、Amb a 6、Amb a6.0101、Amb a 7、Amb a 7.0101、Amb a 8、Amb a 8.0101、Amb a 8.0102、Amb a 9、Amb a9.0101、Amb a 9.0102、Amb a CPI、Amb p 1、Amb p 5、Amb p 5.0101、Amb p 5.0201、Amb t5、Amb t 5.0101、Amb t 8)、菊苣属某种(Ammothea spp)(Amm h 7、Amm h 7.0101)、粗饰蚶属某种(Ana br 1)、菠萝属某种(Ana c 1、Ana c 1.0101、Ana c 2、Ana c 2.0101、Ana c2.0101(MUXF3))、鸭属某种(Ana ca 1)、狼鱼属某种(Ana I 1)、腰果属某种(Ana o 1、Anao 1.0101、Ana o 1.0102、Ana o 2、Ana o 2.0101、Ana o 3、Ana o 3.0101)、鸭属某种(Anap 1、Ana p 2、Ana p 3)、鳗鲡属某种(Ang a 1、Ang j 1)、胃线虫属某种(Ani s 1、Ani s1.0101、Ani s 10、Ani s 10.0101、Ani s 11、Ani s 11.0101、Ani s 12、Ani s 12.0101、Ani s 2、Ani s 2.0101、Ani s 24kD、Ani s 3、Ani s 3.0101、Ani s 4、Ani s 4.0101、Anis 5、Ani s 5.0101、Ani s 6、Ani s 6.0101、Ani s 7、Ani s 7.0101、Ani s 8、Ani s8.0101、Ani s 9、Ani s 9.0101、Ani s CCOS3、Ani s细胞色素B、Ani s FBPP、Ani sNADHDS4L、Ani s NARaS、Ani s PEPB、Ani s肌钙蛋白)、番荔枝属某种(Ann c几丁质酶)、疟蚊属某种(Ano da 17、Ano da 17.0101、Ano da 27、Ano da 27.0101、Ano da 7、Ano da7.0101、Ano g 7、Ano g 7.0101)、雁属某种(Ans a 1、Ans a 2、Ans a 3、Ans in 1)、春茅属某种(Ant o 1、Ant o 1.0101、Ant o 12、Ant o 13、Ant o 2、Ant o 4、Ant o 5、Ant o6、Ant o 7)、蜜蜂某种(Api c 1、Api c 1.0101、Api c 10、Api c 2、Api c 4、Api d 1、Apid 1.0101、Api d 4、Api fl 4)、芹菜某种(Api g 1、Api g 1.0101、Api g 1.0201、Api g2、Api g 2.0101、Api g 3、Api g 3.0101、Api g 4、Api g 4.0101、Api g 5、Api g5.0101、Api g 6、Api g 6.0101)、蜜蜂某种(Api m 1、Api m 1.0101、Api m 10、Api m10.0101、Api m 11、Api m 11.0101、Api m 11.0201、Api m 13kD、Api m 2、Api m 2.0101、Api m 3、Api m 3.0101、Api m 4、Api m 4.0101、Api m 5、Api m 5.0101、Api m 6、Api m6.0101、Api m 7、Api m 7.0101、Api m 8、Api m 8.0101、Api m 9、Api m 9.0101、Api mA1-A2、Api m A1-A2-A3、Api m蜂王浆白蛋白1、Api m蜂王浆白蛋白2、Api me 1、Api me4)、落花生属某种(Ara d 2、Ara d 6、Ara f 3、Ara f 4、Ara h 1、Ara h 1.0101、Ara h10、Ara h 10.0101、Ara h 10.0102、Ara h 11、Ara h 11.0101、Ara h 2、Ara h 2.0101、Ara h 2.0102、Ara h 2.0201、Ara h 2.0202、Ara h 3、Ara h 3.0101、Ara h 4、Ara h4.0101、Ara h 5、Ara h 5.0101、Ara h 6、Ara h 6.0101、Ara h 7、Ara h 7.0101、Ara h7.0201、Ara h 7.0202、Ara h 8、Ara h 8.0101、Ara h 8.0201、Ara h 9、Ara h 9.0101、Ara h 9.0201、Ara h凝集素、Ara h油质蛋白18kD、Ara i 2、Ara i 6)、拟南芥属某种(Arat 3、Ara t 8、Ara t GLP)、羊鲷属某种(Arc pr 1)、古河豚属(Archaeopotamobius)某种(Arc s 8、Arc s 8.0101)、差海扇属(Aequipecten)某种(Arg i 1)、锐缘壁虱属某种(Argr 1、Arg r 1.0101)、拟海鲶属某种(Ari fe 1)、辣根某种(Arm r HRP)、燕麦草属某种(Arre 1、Arr e 5)、蒿属某种(Art a 1、Art ap 1)、丰年虾属某种(Art fr 1、Art fr 1.0101、Art fr 5、Art fr 5.0101)、关节杆菌属某种(Art gl CO)、头癣菌属某种(Art gy 7)、波罗蜜属某种(Art h 17kD、Art h 4)、节旋藻属某种(Art p1β_藻蓝素)、艾属某种(Art v 1、Art v 1.0101、Art v 1.0102、Art v 1.0103、Art v 1.0104、Art v 1.0105、Art v1.0106、Art v 1.0107、Art v 2、Art v 2.0101、Art v 3、Art v 3.0101、Art v 3.0201、Art v 3.0202、Art v 3.0301、Art v 4、Art v 4.0101、Art v 4.0201、Art v 47kD、Art v5、Art v 5.0101、Art v 6、Art v 6.0101、Art v 60kD)、节皮菌属某种(Art va 4)、蛔虫属某种(Asc 1 3、Asc 1 3.0101、Asc 1 3.0102、Asc I 34kD、Asc s 1、Asc s 1.0101、Asc s3、Asc s 3.0101、Asc s GST)、曲菌属某种(Asp aw葡萄糖淀粉酶、Asp c 22、Asp f 1、Aspf 1.0101、Asp f 10、Asp f 10.0101、Asp f 11、Asp f 11.0101、Asp f 12、Asp f12.0101、Asp f 13、Asp f 13.0101、Asp f 15、Asp f 15.0101、Asp f 16、Asp f 16.0101、Asp f 17、Asp f 17.0101、Asp f 18、Asp f 18.0101、Asp f 2、Asp f 2.0101、Asp f 22、Asp f 22.0101、Asp f 23、Asp f 23.0101、Asp f 27、Asp f 27.0101、Asp f 28、Asp f28.0101、Asp f 29、Asp f 29.0101、Asp f 3、Asp f 3.0101、Asp f 34、Asp f 34.0101、Asp f 4、Asp f 4.0101、Asp f 5、Asp f 5.0101、Asp f 56kD、Asp f 6、Asp f 6.0101、Aspf 7、Asp f 7.0101、Asp f 8、Asp f 8.0101、Asp f 99、Asp f 9.0101、Asp f AfCalAp、Aspf AT_V、Asp f过氧化氢酶、Asp f几丁聚糖酶、Asp f CP、Asp f DPPV、Asp f FDH、Asp fγ_肌动蛋白、Asp f葡萄糖苷酶、Asp f GPI、Asp f GST、Asp f GT、Asp f IAO、Asp f IPMI、Asp f LPL1、Asp f LPL3、Asp f甘露糖苷酶、Asp f MDH、Asp f PL、Asp f PUP、Asp fRPS3、Asp f SXR、Asp fl 13、Asp fl 13.0101、Asp fl 18、Asp fl 2、Asp fl 21、Asp fl3、Asp fl 4、Asp fl 7、Asp fl 8、Asp fl 9、Asp me蜂蜜曲霉蛋白酶、Asp n 14、Asp n14.0101、Asp n 18、Asp n 18.0101、Asp n 25、Asp n 25.0101、Asp n 30、Asp n葡萄糖淀粉酶、Asp n半纤维素酶、Asp n Pectinase、Asp o 13、Asp o 13.0101、Asp o 21、Asp o21.0101、Asp o 3、Asp o 4、Asp o 7、Asp o 8、Asp o乳糖酶、Asp o脂肪酶、Asp oc 13、Aspr 1、Asp sa AP、Asp sp葡萄糖淀粉酶、Asp sp葡萄糖氧化酶、Asp sp PL、Asp sp PME、Aspsy 13、Asp v 13、Asp v 13.0101、Asp v过氧化氢酶A、Asp v烯醇酶、Asp v GAPDH、Asp vMDH、Asp v SXR)、芦荀属某种(Aspa o 1、Aspa o 1.01、Aspa o 1.02、Aspa o 17kD、Aspa o4)、曲菌属某种(Aspe ni 2、Aspe ni 3、Aspe ni 4、Aspe ni 7、Aspe ni 8、Aspe ni 9)、燕麦属某种(Ave s 1、Ave s 12、Ave s 13、Ave s 2、Ave s 4、Ave s 5、Ave s 7)、东风螺属某种(Bab ja 1)、杆菌属某种(Bac al枯草杆菌蛋白酶、Bac cl枯草杆菌蛋白酶、Bac I枯草杆菌蛋白酶、Bac li aA、Bac li枯草杆菌蛋白酶)、杆角属石某种(Bac ol 27、Bac ol27.0101)、杆菌属某种(Bac sp aA1、Bac sp aA3、Bac sp脱羧酶、Bac st amyM、Bac su枯草杆菌蛋白酶、Bac t Cry1Ab、Bac t Cry1Fa、Bac t Cry3Bb1、Bac t Cry9c)、海鲿属某种(Bag ma 1)、鳞鲀属某种(Bal ca 1)、藤壶属某种(Bal r 1、Bal r 1.0101)、白僵菌属某种(Bea b Aid、Bea b Enol、Bea b f2、Bea b Hex)、巴西栗某种(Ber e 1、Ber e 1.0101、Bere 2、Ber e 2.0101)、金眼鲷属某种(Ber sp 1)、桦木属某种(Bet ab 1、Bet al 1、Bet ch1、Bet co 1、Bet da 1、Bet gr 1、Bet hu 1、Bet le 1、Bet me 1、Bet n 1、Bet p 1、Betpa 1、Bet po 1、Bet pu 1、Bet pu 2、Bet pu 4、Bet pu 6、Bet pu 7、Bet sc 1、Bet ut 1、Bet v 1、Bet v 1B1-B1-B1、Bet v 1fv Mal 4x、Bet v 1.0101、Bet v 1.0102、Bet v1.0103、Bet v 1.0201、Bet v 1.0301、Bet v 1.0401、Bet v 1.0402、Bet v 1.0501、Bet v1.0601、Bet v 1.0602、Bet v 1.0701、Bet v 1.0801、Bet v 1.0901、Bet v 1.1001、Bet v1.1101、Bet v 1.1201、Bet v 1.1301、Bet v 1.1401、Bet v 1.1402、Bet v 1.1501、Bet v1.1502、Bet v 1.1601、Bet v 1.1701、Bet v 1.1801、Bet v 1.1901、Bet v 1.2001、Bet v1.2101、Bet v 1.2201、Bet v 1.2301、Bet v 1.2401、Bet v 1.2501、Bet v 1.2601、Bet v1.2701、Bet v 1.2801、Bet v 1.2901、Bet v 1.3001、Bet v 1.3101、Bet v 2、Bet v2.0101、Bet v 3、Bet v 3.0101、Bet v 4、Bet v 4.0101、Bet v 6、Bet v 6.0101、Bet v6.0102、Bet v 7、Bet v 7.0101、Bet v 8、Bet v聚葡萄糖酶)、甜菜属某种(Beta v 1、Betav 1.0101、Beta v 2、Beta v 2.0101)、小蠊属某种(Bla g 1、Bla g 1.0101、Bla g1.0102、Bla g 1.0103、Bla g 1.0201、Bla g 1.0202、Bla g 2、Bla g 2.0101、Bla g2.0201、Bla g 36kD、Bla g 4、Bla g 4.0101、Bla g 4.0201、Bla g 5、Bla g 5.0101、Blag 5.0201、Bla g 6、Bla g 6.0101、Bla g 6.0201、Bla g 6.0301、Bla g 7、Bla g 7.0101、Bla g 8、Bla g 8.0101、Bla g 9、Bla g烯醇酶、Bla g GSTD1、Bla g RACK1、Bla g TPI、Bla g胰蛋白酶、Bla g卵黄生成素)、蜚蠊属某种(Bla o 1、Bla o 7)、无爪螨属某种(Blo t1、Blo t 1.0101、Blo t 1.0201、Blo t 10、Blo t 10.0101、Blo t 10.0102、Blo t 11、Blot 11.0101、Blo t 12、Blo t 12.0101、Blo t 12.0102、Blo t 13、Blo t 13.0101、Blo t14、Blo t 15、Blo t 18、Blo t 19、Blo t 19.0101、Blo t 2、Blo t 2.0101、Blo t2.0102、Blo t 2.0103、Blo t 20、Blo t 21、Blo t 21.0101、Blo t 3、Blo t 3.0101、Blot 4、Blo t 4.0101、Blo t 5、Blo t 5.0101、Blo t 6、Blo t 6.0101、Blo t 7、Blo t 8、Blo t 9、Blo t HSP70)、熊蜂属某种(Bom ar 4、Bom hy 4、Bom p 1、Bom p 1.0101、Bom p2、Bom p 3、Bom p 4、Bom p 4.0101、Bom t 1、Bom t 1.0101、Bom t 4、Bom t 4.0101)、家蚕属某种(Bomb m 1、Bomb m 1.0101、Bomb m 7、Bomb m 7.0101、Bomb m 7.0102、Bomb m7.0103、Bomb m 7.0104、Bomb m 7.0105、Bomb m 7.0106)、牛尾壁虱属某种(Boo m 1、Boom 7、Boo m 7.0101)、牛属某种(Bos d 2、Bos d 2.0101、Bos d 2.0102、Bos d 2.0103、Bosd 3、Bos d 3.0101、Bos d 4、Bos d 4.0101、Bos d 5、Bos d 5.0101、Bos d 5.0102、Bos d6、Bos d 6(MDA)、Bos d 6.0101、Bos d 7、Bos d 7.0101、Bos d 8、Bos d 8αS1、Bos d 8αS2、Bos d 8β、Bos d 8κ、Bos dα2I、Bos dα2I.0101、Bos d凝乳酶、Bos d血纤维蛋白、Bos d明胶、Bos d HG、Bos d胰岛素、Bos d乳铁蛋白、Bos d乳过氧化物酶、Bos d肌红蛋白、Bos dOBP、Bos d OSCP、Bos d卵黄高磷蛋白、Bos d PLA2、Bos d PRVB、Bos d凝血酶、Bos d TI、Bos gr ALA、Bos gr肌红蛋白)、矛头蝮蛇属(Bothrops)某种(Bot as 1、Bot at 1)、格兰马草属(Bouteloua)某种(Bou g 1)、咬虱属(Biting)某种(Bov ov 1)、乌鲂属某种(Bra du1)、芸苔属某种(Bra j 1、Bra j 1.0101、Bra n 1、Bra n 1.0101、Bra n 4、Bra n 7、Bra n8、Bra n PG、Bra ni 8、Bra o 3、Bra o 3.0101、Bra r 1、Bra r 1.0101、Bra r 2、Bra r2.0101、Bra r 3、Bra r 4、Bra r 7)、雀麦属某种(Bro a 1、Bro a 4)、单鳍鳕属某种(Brobr 1)、雀麦属某种(Bro i 1、Bro i 5、Bro i 7)、血丝虫属某种(Bru m 3、Bru m 3.0101、Bru m Bm33)、水牛属某种(Bub b ALA、Bub b BLG、Bub b酪蛋白、Bub b酪蛋白αS1、Bub b酪蛋白αS2、Bub b酪蛋白β、Bub b酪蛋白κ)、隐杆线虫属某种(Cae b 3、Cae b 3.0101、Cae br3、Cae br 3.0101、Cae e 3、Cae e 3.0101、Cae e 3.0102、Cae re 13、Cae re 13.0101)、木豆属某种(Caj c 1)、鱼虱属某种(Cal cl 1、Cal cl 1.0101、Cal cl 1.0102)、菖蒲属某种(Cal le 1)、美青蟹属某种(Cal s 2)、骆驼属某种(Cam d ALA、Cam d酪蛋白、Cam d酪蛋白αS1、Cam d酪蛋白αS2、Cam d酪蛋白β、Cam d酪蛋白κ)、弓背蚁属某种(Cam fl 7、Cam fl7.0101)、犬属某种(Can f 1、Can f 1.0101、Can f 2、Can f 2.0101、Can f 3、Can f3.0101、Can f 4、Can f 4.0101、Can f 5、Can f 5.0101、Can f 6、Can f 6.0101、Can fFeld1样、Can f Homs2样、Can f卵黄高磷蛋白、Can f TCTP)、疣鳞鲀属某种(Can ma 1)、黄道蟹属某种(Can mg 2、Can p 1)、大麻属某种(Can s 3)、念珠菌属某种(Cand a 1、Cand a1.0101、Cand a 3、Cand a 3.0101、Cand a CAAP、Cand a CyP、Cand a烯醇酶、Cand a FPA、Cand a MnSOD、Cand a PGK、Cand b 2、Cand b 2.0101、Cand b FDH、Cand r脂肪酶)、辣椒某种(Cap a 1、Cap a 1.0101、Cap a 17kD、Cap a 2、Cap a 2.0101、Cap a 30kD、Cap a聚葡萄糖酶、Cap ch 17kD)、麦秆虫某种(Cap e 1)、山羊属某种(Cap h ALA、Cap h BLG、Caph酪蛋白、Cap h酪蛋白αS1、Cap h酪蛋白αS2、Cap h酪蛋白β、Cap h酪蛋白κ、Cap h GSA)、头状花某种(Cap m 1)、鲫属某种(Car au 1)、鹅耳枥属某种(Car b 1、Car b 1.0101、Car b1.0102、Car b 1.0103、Car b 1.0104、Car b 1.0105、Car b 1.0106、Car b 1.0107、Car b1.0108、Car b 1.0109、Car b 1.0110、Car b 1.0111、Car b 1.0112、Car b 1.0113、Car b1.0201、Car b 1.0301、Car b 1.0302、Car b 2、Car b 4)、鲹属某种(Car cr 1)、山核桃属某种(Car i 1、Car i 1.0101、Car i 2、Car i 4、Car i 4.0101)、真蟹属某种(Car ma 2)、鱼尾葵属某种(Car mi 2)、番瓜树属某种(Car p 1、Car p几丁质酶、Car p木瓜凝乳酶、Carp蛋白内切酶)、栗属某种(Cas c 24kD、Cas s 1、Cas s 1.0101、Cas s 1.0102、Cas s1.0103、Cas s 2、Cas s 5、Cas s 5.0101、Cas s 8、Cas s 8.0101、Cas s 9、Cas s9.0101)、长春花属某种(Cat r 1、Cat r 1.0101、Cat r 17kD、Cat r 2)、茎方头鱼属某种(Cau ch 1)、豚鼠属某种(Cav p 1、Cav p 1.0101、Cav p 2、Cav p 2.0101、Cav p 3、Cav p3.0101、Cav p明胶、Cav p GSA)、锯鮨属某种(Cen s 1)、九棘鲈属某种(Cep so 1)、蟳属某种(Cha f 1、Cha f 1.0101)、棘白鲳属某种(Cha fa 1)、扁柏属某种(Cha o 1、Cha o1.0101、Cha o 2、Cha o 2.0101)、藜属某种(Che a 1、Che a 1.0101、Che a 2、Che a2.0101、Che a 3、Che a 3.0101)、摇蚊属某种(Chi k 1、Chi k 10、Chi k 10.0101)、绒鼠属某种(Chi I 21kD_a、Chi I 21kD_b)、雪蟹属某种(Chi o 1、Chi o 1.0101、Chi o 2、Chio 4、Chi o 6、Chi oα_肌动蛋白、Chi o SERCA)、摇蚊属某种(Chi t 1、Chi t 1.0101、Chit 1.0201、Chi t 2、Chi t 2.0101、Chi t 2.0102、Chi t 3、Chi t 3.0101、Chi t 4、Chi t4.0101、Chi t 5、Chi t 5.0101、Chi t 6、Chi t 6.0101、Chi t 6.0201、Chi t 7、Chi t7.0101、Chi t 8、Chi t 8.0101、Chi t 9、Chi t 9.0101)、锦海扇蛤属某种(Chl n 1)、草雁属某种(Chl pi 1)、嗜渣螨属某种(Cho a 10)、叶甲属某种(Chr tr 7、Chr tr 7.0101)、鹰嘴豆属某种(Cic a 2S白蛋白、Cic a白蛋白)、菊苣属某种(Cic i 1)、臭虫属某种(Cim I载氮蛋白)、柑橘属某种(Cit I 1、Cit I 3、Cit I 3.0101)、西瓜属某种(Cit la 2、Cit laMDH、Cit la TPI)、柑橘属某种(Cit r 3、Cit r 3.0101、Cit s 1、Cit s 1.0101、Cit s 2、Cit s 2.0101、Cit s 3、Cit s 3.0101、Cit s 3.0102、Cit s IFR)、分枝孢子菌属某种(Cla c 14、Cla c 14.0101、Cla c 9、Cla c 9.0101、Cla h 1、Cla h 10、Cla h 10.0101、Cla h 12、Cla h 12.0101、Cla h 2、Cla h 2.0101、Cla h 42kD、Cla h 5、Cla h 5.0101、Cla h 6、Cla h 6.0101、Cla h 7、Cla h 7.0101、Cla h 8、Cla h 8CSP、Cla h 8.0101、Clah 9、Cla h 9.0101、Cla h abH、Cla h GST、Cla h HCh1、Cla h HSP70、Cla h NTF2、Cla hTCTP)、梭状芽孢杆菌属某种(Clo hi胶原酶、Clo t类毒素)、鲱属某种(Clu h 1、Clu h1.0101、Clu h 1.0201、Clu h 1.0301)、椰子属某种(Coc n 2、Coc n 4、Coc n 5)、球孢子菌属某种(Coc po 8)、咖啡树属某种(Cof a 1、Cof a 1.0101)、鸽属某种(Col IPSA)、一夜蕈属某种(Cop c 1、Cop c 1.0101、Cop c 2、Cop c 2.0101、Cop c 3、Cop c 3.0101、Cop c4、Cop c 5、Cop c 5.0101、Cop c 6、Cop c 7、Cop c 7.0101)、榛属某种(Cor a 1、Cor a1.0101、Cor a 1.0102、Cor a 1.0103、Cor a 1.0104、Cor a 1.0201、Cor a 1.0301、Cor a1.0401、Cor a 1.0402、Cor a 1.0403、Cor a 1.0404、Cor a 10、Cor a 10.0101、Cor a11、Cor a 11.0101、Cor a 12、Cor a 12.0101、Cor a 13、Cor a 13.0101、Cor a 14、Cor a14.0101、Cor a 2、Cor a 2.0101、Cor a 2.0102、Cor a 8、Cor a 8.0101、Cor a 9、Cor a9.0101)、棒状杆菌属某种(Cor d Toxoid)、榛属某种(Cor he 1)、鲯鳅属某种(Cor hi 1)、胡荽属某种(Cor s 1、Cor s 11kD、Cor s 2)、铺地蜈蚣属某种(Cot I 3)、褐虾属某种(Crac 1、Cra c 1.0101、Cra c 2、Cra c 2.0101、Cra c 4、Cra c 4.0101、Cra c 5、Cra c5.0101、Cra c 6、Cra c 6.0101、Cra c 8、Cra c 8.0101)、巨蛎属某种(Cra g 1)、仓鼠属某种(Cri c HSA)、Crivellia某种(Cri pa 1)、番红花属某种(Cro s 1、Cro s 1.0101、Cros 2、Cro s 2.0101、Cro s 3、Cro s 3.01、Cro s 3.02)、柳杉属某种(Cry j 1、Cry j1.0101、Cry j 1.0102、Cry j 1.0103、Cry j 2、Cry j 2.0101、Cry j 2.0102、Cryj 3、Cryj 3.1、Cryj 3.2、Cryj 3.3、Cryj 3.4、Cryj 3.5、Cryj 3.6、Cryj 3.7、Cryj 3.8、Cryj4、Cryj AP、Cry j几丁质酶、Cry j CPA9、Cry j IFR、Cry j LTP、Cry j P1-P2)、丛赤壳属某种(Cry p AP)、栉头蚤属某种(Cte f 1、Cte f 1.0101、Cte f 2、Cte f 2.0101、Cte f3、Cte f 3.0101)、草鱼属某种(Cte id 1)、甜瓜属某种(Cuc m 1、Cuc m 1.0101、Cuc m 2、Cuc m 2.0101、Cuc m 3、Cuc m 3.0101、Cuc m Lec17、Cuc m MDH)、南瓜属某种(Cuc ma18kD、Cuc ma 2、Cuc p 2、Cuc p AscO)、甜瓜属某种(Cuc s 2)、糠蚊属某种(Cul n 1、Culn 10、Cul n 11、Cul n 2、Cul n 3、Cul n 4、Cul n 5、Cul n 6、Cul n 7、Cul n 8、Cul n9、Cul n HSP70)、家蚊属某种(Cul q 28kD、Cul q 35kD、Cul q 7、Cul q 7.0101、Cul q7.0102)、糠蚊属某种(Cul so 1)、小茴香属某种(Cum c 1、Cum c 2)、柏木属某种(Cup a1、Cup a 1.0101、Cup a 1.02、Cup a 2、Cup a 3、Cup a 4、Cup a 4.0101、Cup s 1、Cup s1.0101、Cup s 1.0102、Cup s 1.0103、Cup s 1.0104、Cup s 1.0105、Cup s 3、Cup s3.0101、Cup s 3.0102、Cup s 3.0103、Cup s 8)、旋孢腔菌属某种(Cur I 1、Cur I1.0101、Cur I 2、Cur I 2.0101、Cur I 3、Cur I 3.0101、Cur I 4、Cur I 4.0101、Cur IADH、Cur I GST、Cur I MnSOD、Cur IOryzin、Cur I Trx、Cur I ZPS1)、蓝翅雁(Cyanochen)某种(Cya cy 1)、犬牙石首鱼属某种(Cyn ar 1)、洋狗尾草属某种(Cyn cr 1、Cyn cr 5)、狗牙根属某种(Cyn d 1、Cyn d 1.0101、Cyn d 1.0102、Cyn d 1.0103、Cyn d 1.0104、Cynd 1.0105、Cyn d 1.0106、Cyn d 1.0107、Cyn d 1.0201、Cyn d 1.0202、Cyn d 1.0203、Cynd 1.0204、Cyn d 10、Cyn d 11、Cyn d 12、Cyn d 12.0101、Cyn d 13、Cyn d 15、Cyn d15.0101、Cyn d 2、Cyn d 22、Cyn d 22.0101、Cyn d 23、Cyn d 23.0101、Cyn d 24、Cyn d24.0101、Cyn d 4、Cyn d 5、Cyn d 6、Cyn d 7、Cyn d 7.0101)、犬牙石首鱼属某种(Cyn ne1)、草原犬鼠属某种(Cyn sp脂质运载蛋白)、鲤属某种(Cyp c 1、Cyp c 1.01、Cyp c1.02)、山蝰属某种(Dab ru 1)、鸭茅属某种(Dac g 1、Dac g 1.01、Dac g 1.0101、Dac g1.02、Dac g 12、Dac g 13、Dac g 2、Dac g 2.0101、Dac g 3、Dac g 3.0101、Dac g 4、Dacg 4.0101、Dac g 5、Dac g 5.0101、Dac g 7)、黇鹿属某种(Dam d CSA)、丹尼鱼某种(Danre 1、Dan re 2、Dan reα2I、Dan re CK)、土魟属某种(Das ak 1、Das am 1、Das sa 1)、胡萝卜属某种(Dau c 1、Dau c 1.0101、Dau c 1.0102、Dau c 1.0103、Dau c 1.0104、Dau c1.0105、Dau c 1.0201、Dau c 1.0301、Dau c 3、Dau c 4、Dau c 4.0101、Dau c CyP)、单离鳍鲹属某种(Dec ru 1)、棘穗软珊瑚某种(Den n 1、Den n 1.0101)、表皮螨属某种(Der f1、Der f 1.0101、Der f 1.0102、Der f 1.0103、Der f 1.0104、Der f 1.0105、Der f1.0106、Der f 1.0107、Der f 1.0108、Der f 1.0109、Der f 1.0110、Der f 10、Der f10.0101、Der f 10.0102、Der f 11、Der f 11.0101、Der f 13、Der f 13.0101、Der f 14、Der f 14.0101、Der f 15、Der f 15.0101、Der f 16、Der f 16.0101、Der f 17、Der f17.0101、Der f 18、Der f 18.0101、Der f 2、Der f 2.0101、Der f 2.0102、Der f2.0103、Der f 2.0104、Der f 2.0105、Der f 2.0106、Der f 2.0107、Der f 2.0108、Der f2.0109、Der f 2.0110、Der f 2.0111、Der f 2.0112、Der f 2.0113、Der f 2.0114、Der f2.0115、Der f 2.0116、Der f 2.0117、Der f 20、Der f 21、Der f 22、Der f 22.0101、Derf 3、Der f 3.0101、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 6.0101、Der f 7、Der f7.0101、Derf 8、Der f 9、Der f HSP70)、刺皮螨属某种(Der g 10、Der g 10.0101)、表皮螨属某种(Der m 1、Der m 1.0101、Der p 1、Der p 1.0101、Der p 1.0102、Der p 1.0103、Der p1.0104、Der p 1.0105、Der p 1.0106、Der p 1.0107、Der p 1.0108、Der p 1.0109、Der p1.0110、Der p 1.0111、Der p 1.0112、Der p 1.0113、Der p 1.0114、Der p 1.0115、Der p1.0116、Der p 1.0117、Der p 1.0118、Der p 1.0119、Der p 1.0120、Der p 1.0121、Der p1.0122、Der p 1.0123、Der p 1.0124、Der p 10、Der p 10.0101、Der p 10.0102、Der p10.0103、Der p 11、Der p 11.0101、Der p 13、Der p 14、Der p 14.0101、Der p 15、Der p18、Der p 2、Der p 2.0101、Der p 2.0102、Der p 2.0103、Der p 2.0104、Der p 2.0105、Der p 2.0106、Der p 2.0107、Der p 2.0108、Der p 2.0109、Der p 2.0110、Der p2.0111、Der p 2.0112、Der p 2.0113、Der p 2.0114、Der p 2.0115、Der p 20、Der p20.0101、Der p 21、Der p 21.0101、Der p 23、Der p 23.0101、Der p 3、Der p 3.0101、Der p 4、Der p 4.0101、Der p 5、Der p 5.0101、Der p 5.0102、Der p 6、Der p 6.0101、Der p 7、Der p 7.0101、Der p 8、Der p 8.0101、Der p 9、Der p 9.0101、Der p 9.0102、Der p P1-P2、Der p P2-P1、Der s 1、Der s 2、Der s 3)、石竹属某种(Dia c RIP)、芒萁属某种(Dic I 2S白蛋白)、柿树属某种(Dio k 17kD、Dio k 4、Dio k IFR)、山药属某种(Diop TSP)、重牙鲷属某种(Dip ho 1)、盐草属某种(Dis s 1、Dis s 7)、海鲋属某种(Dit te1)、长黄胡蜂属某种(Dol a 1、Dol a 2、Dol a 5、Dol a 5.0101)、扁豆属某种(Dol b凝集素)、长黄胡蜂属某种(Dol m 1、Dol m 1.0101、Dol m 1.02、Dol m 2、Dol m 2.0101、Dol m5、Dol m 5.0101、Dol m 5.02)、果蝇属某种(Dro an 7、Dro an 7.0101、Dro er 7、Dro er7.0101、Dro er 7.0102、Dro gr 7、Dro gr 7.0101、Dro gr 7.0102、Dro m 7、Dro m7.0101、Dro m 7.0102、Dro m 7.0103、Dro m 7.0104、Dro m 7.0105、Dro m 7.0106、Dro m7.0107、Dro m 7.0108、Dro m 7.0109、Dro m 7.0110、Dro m 7.0111、Dro m 7.0112、Dro m7.0113、Dro m 9、Dro m MnSOD、Dro mo 7、Dro mo 7.0101、Dro pp 7、Dro pp 7.0101、Drose 7、Dro se 7.0101、Dro si 7、Dro si 7.0101、Dro si 7.0102、Dro vi 7、Dro vi7.0101、Dro wi 7、Dro wi 7.0101、Dro y 7、Dro y 7.0101、Dro y 7.0102、Dro y7.0103)、蓝蓟属某种(Ech p细胞色素C)、油棕属某种(Ela g 2、Ela g Bd31 kD)、海鲢属某种(Elo sa 1)、埃里格孢属某种(Emb a 1、Emb i 1、Emb nz 1、Emb t 1)、鳀属某种(Eng e1)、章鱼属某种(Ent d 1)、石斑属某种(Epi bl 1、Epi co 1、Epi fl 1、Epi mc 1、Epi mo1)、附球菌属某种(Epi p 1、Epi p 1.0101、Epi p 12kD、Epi p GST)、石斑鱼属某种(Epipo 1、Epi un 1)、木贼属某种(Equ a 17kD)、马属某种(Equ as 4、Equ as DSA、Equ bu 4、Equ c 1、Equ c 1.0101、Equ c 2、Equ c 2.0101、Equ c 2.0102、Equ c 3、Equ c 3.0101、Equ c 4、Equ c 4.0101、Equ c 5、Equ c 5.0101、Equ c ALA、Equ c BLG、Equ c酪蛋白、Equc酪蛋白β、Equ c酪蛋白κ、Equ c PRVB、Equ he 4、Equ z ZSA)、毛甲蟹属某种(Erii 1、Erii1.0101、Erii 1.0102)、绒螯蟹属某种(Eri s 1、Eri s 1.0101、Eri s 2)、欧文氏菌属某种(Erw ch天冬酰氨酸酶)、埃希氏杆菌属某种(Esc c天冬酰氨酸酶、Esc cβGAL)、狗鱼属某种(Eso I 1)、磷虾属某种(Eup p 1、Eup p 1.0101)、磷虾属某种(Eup s 1、Eup s 1.0101)、嗜霉螨属某种(Eur m 1、Eur m 1.0101、Eur m 1.0102、Eur m 1.0103、Eur m 10、Eur m14、Eur m 14.0101、Eur m 2、Eur m 2.0101、Eur m 2.0102、Eur m 3、Eur m 3.0101、Eur m4、Eur m 4.0101)、犁齿鲷属某种(Evy j 1)、荞麦属某种(Fag e 1、Fag e 1.0101、Fag e10kD、Fag e 19kD、Fag e 2、Fag e 2.0101、Fag e TI)、山毛榉属某种(Fag s 1、Fag s1.0101、Fag s 2、Fag s 4)、荞麦属某种(Fag t 1、Fag t 10kD、Fag t 2、Fag t 2.0101)、猫属某种(Fel d 1、Fel d 1.0101、Fel d 2、Fel d 2.0101、Fel d 3、Fel d 3.0101、Fel d4、Fel d 4.0101、Fel d 5、Fel d 5.0101、Fel d 6、Fel d 6.0101、Fel d 7、Fel d7.0101、Fel d 8、Fel d 8.0101、Fel d IgG)、明对虾属某种(Fen c 1、Fen c 2、Fen me 1、Fen me 1.0101)、牛毛草属某种(Fes e 1、Fes e 13、Fes e 4、Fes e 5、Fes e 7、Fes p 1、Fes p 13、Fes p 4、Fes p 4.0101、Fes p 5、Fes r 1、Fes r 5)、无花果属某种(Fic c17kD、Fic c 4、Fic c无花果蛋白酶)、茴香属某种(Foe v 1、Foe v 2)、连翘属某种(For s1)、铗蠓属某种(For t 1、For t 1.0101、For t 2、For t 2.0101、For t 7、For t FPA、Fort肌凝蛋白、For t TPI)、草莓属某种(Fra a 1、Fra a 1.0101、Fra a 3、Fra a 3.0101、Fraa 3.0102、Fra a 3.0201、Fra a 3.0202、Fra a 3.0203、Fra a 3.0204、Fra a 3.0301、Fraa 4、Fra a 4.0101、Fra c 1)、白蜡树属某种(Fra e 1、Fra e 1.0101、Fra e 1.0102、Frae 1.0201、Fra e 12、Fra e 2、Fra e 3、Fra e 9)、草莓属某种(Fra v 1)、镰菌属某种(Fusc 1、Fus c 1.0101、Fus c 2、Fus c 2.0101、Fus c 3、Fus s 1、Fus s 45kD、Fus sp脂肪酶)、鳕属某种(Gad c 1、Gad c 1.0101、Gad c APDH、Gad m 1、Gad m 1.0101、Gad m1.0102、Gad m 1.0201、Gad m 1.0202、Gad m 45kD、Gad m明胶、Gad ma 1)、原鸡属某种(Gal d 1、Gal d 1.0101、Gal d 2、Gal d 2.0101、Gal d 3、Gal d 3.0101、Gal d 4、Gal d4.0101、Gal d 5、Gal d 5.0101、Gal d 6、Gal d 6.0101、Gal d Apo I、Gal d Apo VI、Gald GPI、Gal d HG、Gal d IgY、Gal d L-PGDS、Gal d Ovo粘液素、Gal d卵黄高磷蛋白、Gal dPRVB、Gal la 4)、蜡蛾属某种(Gal m 18kD、Gal m 24kD)、原鸡属某种(Gal so 4)、钩虾属某种(Gam s TM)、白树属某种(Gel m RIP)、泽蟹属某种(Geo de 1)、舌蝇属某种(Glo m 5、Glo m 5.0101、Glo m 7、Glo m 7.0101、Glo m 7.0102、Glo m 7.0103)、大豆属某种(Gly aBd30K、Gly ar Bd30K、Gly ca Bd30K、Gly cl Bd30K、Gly cu Bd30K、Gly cy Bd30K)、食甜螨属某种(Gly d 10、Gly d 10.0101、Gly d 13、Gly d 2、Gly d 2.0101、Gly d 2.0201、Gly d 2.03、Gly d 2/Lep d 2L1、Gly d 2/Lep d 2L2、Gly d 2/Lep d 2L3、Gly d 2/Lepd 2L4、Gly d 2/Lep d 2R1、Gly d 2/Lep d 2R2、Gly d 2/Lep d 2R3、Gly d 2/Lep d2R4、Gly d 2/Lep d 2R5、Gly d 20、Gly d 3、Gly d 5、Gly d 5.01、Gly d 5.02、Gly d 7、Gly d 8)、大豆属某种(Gly f Bd30K、Gly I Bd30K、Gly m 1、Gly m 1.0101、Gly m1.0102、Gly m 2、Gly m 2.0101、Gly m 2S白蛋白、Gly m 3、Gly m 3.0101、Gly m 3.0102、Gly m 39kD、Gly m 4、Gly m 4.0101、Gly m 5、Gly m 5.0101、Gly m 5.0201、Gly m5.0301、Gly m 5.0302、Gly m 50kD、Gly m 6、Gly m 6.0101、Gly m 6.0201、Gly m6.0301、Gly m 6.0401、Gly m 6.0501、Gly m 68kD、Gly m凝集素、Gly m Bd28K、Gly mBd30K、Gly m Bd60K、Gly m CPI、Gly m EAP、Gly m TI、Gly mi Bd30K、Gly s Bd30K、Gly tBd30K、Gly to Bd30K)、棉属某种(Gos h蚕豆球蛋白)、嗜血杆菌属某种(Hae in P6)、血蜱属某种(Hae I 7、Hae I 7.0101、Hae q 7、Hae q 7.0101)、鲍鱼属某种(Hal a 1、Hal d 1、Hal di 1、Hal di PM、Hal m 1、Hal m 1.0101、Hal r 1、Hal r 49kD、Hal ru 1)、瓢虫属某种(Har a 1、Har a 1.0101、Har a 2、Har a 2.0101)、掠猛蚁属某种(Har sa 7、Har sa7.0101、Har sa 7.0102)、向日葵属某种(Hel a 1、Hel a 1.0101、Hel a 2、Hel a 2.0101、Hel a 2S白蛋白、Hel a 3、Hel a 3.0101、Hel a 4)、蜗牛属某种(Hel ap 1、Hel as 1、Helas 1.0101)、螺旋线虫某种(Hel p 3、Hel p 3.0101)、向日葵属某种(Hel tu 1)、银花鮨属某种(Hem le 1)、角螺属某种(Hem t 1)、异皮线虫属某种(Het g 3、Het g 3.0101)、橡胶树属某种(Hev b 1、Hev b 1.0101、Hev b 10、Hev b 10.0101、Hev b 10.0102、Hev b10.0103、Hev b 11、Hev b 11.0101、Hev b 11.0102、Hev b 12、Hev b 12.0101、Hev b 13、Hev b 13.0101、Hev b 14、Hev b 14.0101、Hev b 2、Hev b 2.0101、Hev b 3、Hev b3.0101、Hev b 4、Hev b 4.0101、Hev b 5、Hev b 5.0101、Hev b 6、Hev b 6.01、Hev b6.02、Hev b 6.0202、Hev b 6.03、Hev b 7、Hev b 7.01、Hev b 7.02、Hev b 7.D2、Hev b7.S2、Hev b 8、Hev b 8.0101、Hev b 8.0102、Hev b 8.0201、Hev b 8.0202、Hev b8.0203、Hev b 8.0204、Hev b 9、Hev b 9.0101、Hev b柠檬酸结合蛋白、Hev b GAPDH、Hevb HSP80、Hev b IFR、Hev b蛋白酶体亚单位、Hev b旋转异构酶、Hev b SPI、Hev b Trx、Hevb UDPGP)、六线鱼属某种(Hex ot 1)、庸鲽属某种(Hip h 1)、拟庸鲽属某种(Hip pl 1)、庸鲽属某种(Hip st 1)、水蛭属某种(Hir me Hirudin)、绒毛草属某种(Hol I 1、Hol I1.0101、Hol I 1.0102、Hol I 2、Hol I 4、Hol I 5、Hol I 5.0101、Hol I 5.0201)、Holocnemus某种(Hol p1 9、Hol p1血蓝蛋白)、螯龙虾属某种(Hom a 1、Hom a 1.0101、Homa 1.0102、Hom a 1.0103、Hom a 3、Hom a 3.0101、Hom a 4、Hom a 6、Hom a 6.0101、Hom g1、Hom g 2)、人类某种(Hom s 1、Hom s 1.0101、Hom s 2、Hom s 2.0101、Hom s 3、Hom s3.0101、Hom s 4、Hom s 4.0101、Hom s 5、Hom s 5.0101、Hom s AAT、Hom s ACTH、Hom s阿达木单抗、Hom s ALA、Hom sα_肌动蛋白、Hom sα-半乳糖苷酶、Hom s APDH、Hom s芳基硫酸酯酶B、Hom s酪蛋白、Hom s CyP A、Hom s CyP B、Hom s CyP C、Hom s DSF70、Hom s DSG3、Hom s eIF6、Hom s依那西普(Etanercept)、Hom s因子IX、Hom s因子VII、Hom s因子VIII、Hom s G-CSF、Hom s葡萄糖脑苷脂酶、Hom s葡萄糖苷酶、Hom s HLA-DR-α、Hom s HSA、Homs艾杜糖醛酸酶、Hom s艾度硫酸酯酶、Hom s IgA、Hom s胰岛素、Hom s乳铁蛋白、Hom s层连结蛋白γ_2、Hom s MnSOD、Hom s催产素、Hom s P2、Hom s卵黄高磷蛋白、Hom s抑制蛋白、Hom s PSA、Hom s RP1、Hom s TCTP、Hom s TL、Hom s TPA、Hom s TPO、Hom s转醛醇酶、Homs Trx、Hom s微管蛋白-α、Hom s/Mus m巴利昔单抗、Hom s/Mus m西妥昔单抗、Hom s/Mus m西妥昔单抗(Gal-Gal)、Hom s/Mus m英夫利昔、Hom s/Mus m那他珠单抗、Hom s/Mus m奥马珠单抗、Hom s/Mus m帕利珠单抗、Hom s/Mus m利妥昔单抗、Hom s/Mus m托珠单抗、Hom s/Mus m曲妥珠单抗)、棘胸鲷属某种(Hop a 1)、大麦属某种(Hor v 1、Hor v 12、Hor v12.0101、Hor v 13、Hor v 14、Hor v 15、Hor v 15.0101、Hor v 16、Hor v 16.0101、Hor v17、Hor v 17.0101、Hor v 18kD、Hor v 2、Hor v 21、Hor v 21.0101、Hor v 28、Hor v 33、Hor v 4、Hor v 5、Hor v 5.0101、Hor v BDAI、Hor v BTI)、腐殖霉属某种(Humin纤维素酶)、蛇麻属某种(Hum j 1、Hum j 1.0101、Hum j 10kD、Hum j 2)、鳇属某种(Hus h 1)、量天尺属某种(Hyl un LTP)、膜首鳕属某种(Hym st 1)、栉鲳属某种(Hyp by 1)、鲢属某种(Hyp mo 1)、鲢属某种(Hyp no 1)、真鮰属某种(Ict fu 1、Ict p 1)、白茅属某种(Imp c4、Imp c 5、Imp c VIIIel)、真壁虱属某种(Ixo r 2、Ixo sc 7、Ixo sc 7.0101)、岩龙虾属某种(Jas la 1、Jas la 1.0101、Jas la 1.0102)、胡桃属某种(Jug ca 1、Jug ca 2、Jugci 1、Jug ci 2、Jug n 1、Jug n 1.0101、Jug n 2、Jug n 2.0101、Jug r 1、Jug r 1.0101、Jug r 2、Jug r 2.0101、Jug r 3、Jug r 3.0101、Jug r 4、Jug r 4.0101、Jug r 5)、刺柏属某种(Jun a 1、Jun a 1.0101、Jun a 1.0102、Jun a 2、Jun a 2.0101、Jun a 3、Jun a3.0101、Jun c 1、Jun o 1、Jun o 4、Jun o 4.0101、Jun r 3、Jun r 3.1、Jun r 3.2、Jun v1、Jun v 1.0101、Jun v 1.0102、Jun v 3、Jun v 3.0101、Jun v 3.0102、Jun v 4)、鲣属某种(Kat p 1)、舵鱼属某种(Kyp se 1)、毛唇隆头鱼属某种(Lac ma 1)、巨蝮属某种(Lac mu1)、莴苣属某种(Lac s 1、Lac s 1.0101)、河鲀属某种(Lag la 1)、鸥属某种(Lar a 1、Lara 2、Lar a 3)、黄鱼属某种(Lar po 1)、尖吻鲈属某种(Lat c 1)、花鲈属某种(Lat ja 1)、香豌豆某种(Lat oc凝集素)、平口石首鱼属某种(Lei xa 1)、扁豆某种(Len c 1、Len c1.0101、Len c 1.0102、Len c 1.0103、Len c 2、Len c 2.0101、Len c 3、Len c 3.0101、Len c凝集素)、美洲豹猫某种(Leo p 1)、螨属某种(Lep d 10、Lep d 10.0101、Lep d 12、Lep d 13、Lep d 13.0101、Lep d 2、Lep d 2.0101、Lep d 2.0102、Lep d 2.0201、Lep d2.0202、Lep d 3、Lep d 39kD、Lep d 5、Lep d 5.0101、Lep d 5.0102、Lep d 5.0103、Lepd 7、Lep d 7.0101、Lep d 8、Lep dα微管蛋白)、太阳鱼属某种(Lep gi 1)、马鲅属某种(Lep i 1)、太阳鱼属某种(Lep ma 1)、衣鱼属某种(Lep s 1、Lep s 1.0101、Lep s1.0102)、疮痂鱼虱属某种(Lep sa 1、Lep sa 1.0101、Lep sa 1.0102、Lep sa 1.0103)、薮猫属某种(Lep se 1)、鳞鲆属某种(Lep w 1、Lep w 1.0101)、田鳖属某种(Let in 7、Letin 7.0101、Let in 7.0102)、雅罗鱼属某种(Leu ce 1)、利瓦伊菌属某种(Lew in 1)、女贞属某种(Lig v 1、Lig v 1.0101、Lig v 1.0102、Lig v 2)、百合属某种(Lil I 2、LilIPG)、黄盖鲽属某种(Lim fe 1)、大头蛙属某种(Lim m 1)、鲎属某种(Lim p 1、Lim p1.0101、Lim p 2、Lim p LPA)、书虱属某种(Lip b 1、Lip b 1.0101)、荔枝属某种(Lit c1、Lit c 1.0101、Lit c IFR、Lit c TPI)、牛蛙属某种(Lit ca 1)、滨对虾属某种(Lit se1、Lit v 1、Lit v 1.0101、Lit v 2、Lit v 2.0101、Lit v 3、Lit v 3.0101、Lit v 4、Litv 4.0101)、丝虫某种(Loa lo 3、Loa lo 3.0101)、松鲷属某种(Lob su 1)、蝗虫属某种(Loc m 7、Loc m 7.0101)、鱿鱼属某种(Lol b 1、Lol e 1)、黑麦草属某种(Lol m 2、Lol m5、Lol p 1、Lol p 1.0101、Lol p 1.0102、Lol p 1.0103、Lol p 10、Lol p 11、Lol p11.0101、Lol p 12、Lol p 13、Lol p 2、Lol p 2.0101、Lol p 3、Lol p 3.0101、Lol p 4、Lol p 4.0101、Lol p 5、Lol p 5.0101、Lol p 5.0102、Lol p 7、Lol p CyP、Lol p FT、Lolp豆球蛋白)、蚕蛾属某种(Lon o 7、Lon o 7.0101)、秋沙鸭属某种(Lop cu 1)、凤头鸭属某种(Lop sp 1)、羽扇豆属某种(Lup a 1、Lup aα_羽扇豆蛋白、Lup aδ_羽扇豆蛋白、Lup aγ_羽扇豆蛋白、Lup an 1、Lup an 1.0101、Lup anα_羽扇豆蛋白、Lup anδ_羽扇豆蛋白、Lup anγ_羽扇豆蛋白、Lup I 17kD)、笛鲷属某种(Lut a 1、Lut c 1、Lut cy 1、Lut gr 1、Lut gu 1、Lut jo 1)、獭蛤属某种(Lut p 1)、笛鲷属某种(Lut pu 1、Lut sy 1)、西红柿某种(Lyc e 1、Lyc e 1.0101、Lyc e 11S球蛋白、Lyc e 2、Lyc e 2.0101、Lyc e 2.0102、Lyce 3、Lyc e 3.0101、Lyc e 4、Lyc e 4.0101、Lyc e ARP60S、Lyc e几丁质酶、Lyc e聚葡萄糖酶、Lyc e过氧化物酶、Lyc e PG、Lyc e PME、Lyc e PR23、Lyc e Vicilin)、曼粉蚧属某种(Mac h 7、Mac h 7.0101)、尖尾无须鳕属某种(Mac ma 1、Mac n 1)、美国刺桑属某种(Mac po 17kD)、沼虾属某种(Mac ro 1、Mac ro 1.0101、Mac ro血蓝蛋白)、大袋鼠属某种(Macr s明胶)、苹果属某种(Mal d 1、Mal d 1.0101、Mal d 1.0102、Mal d 1.0103、Mal d1.0104、Mal d 1.0105、Mal d 1.0106、Mal d 1.0107、Mal d 1.0108、Mal d 1.0109、Mal d1.0201、Mal d 1.0202、Mal d 1.0203、Mal d 1.0204、Mal d 1.0205、Mal d 1.0206、Mal d1.0207、Mal d 1.0208、Mal d 1.0301、Mal d 1.0302、Mal d 1.0303、Mal d 1.0304、Mal d1.0401、Mal d 1.0402、Mal d 1.0403、Mal d 2、Mal d 2.0101、Mal d 3、Mal d 3.0101、Mal d 3.0102、Mal d 3.0201、Mal d 3.0202、Mal d 3.0203、Mal d 4、Mal d 4.0101、Mald 4.0102、Mal d 4.0201、Mal d 4.0202、Mal d 4.0301、Mal d 4.0302)、金虎尾属某种(Mal g 4、Mal g Hevein)、苹果属某种(Mal p 1)、马拉色菌属某种(Mala f 2、Mala f2.0101、Mala f 3、Mala f 3.0101、Mala f 4、Mala f 4.0101、Mala g 10、Mala s 1、Malas 1.0101、Mala s 10、Mala s 10.0101、Mala s 11、Mala s 11.0101、Mala s 12、Mala s12.0101、Mala s 13、Mala s 13.0101、Mala s 5、Mala s 5.0101、Mala s 6、Mala s6.0101、Mala s 7、Mala s 7.0101、Mala s 8、Mala s 8.0101、Mala s 9、Mala s 9.0101)、木薯属某种(Man e 5、Man e 5.0101、Man e FPA、Man e GAPDH)、芒果属某种(Man i 1、Mani 14kD、Man i 2、Man i 3、Man i 3.01、Man i 3.02、Man i几丁质酶)、囊对虾属某种(Marj 1、Mar j 1.0101、Mar j 2、Mar j 4)、香菊属某种(Mat c 17kD)、纺织娘属某种(Mec e7)、鲂属某种(Meg am 2、Meg am CK)、巨也匙虫戚(Megathura)某种(Meg c血蓝蛋白)、大眼幼虫某种(Meg sp 1)、黑线鳕属某种(Mel a 1)、白点鲀(Meleagris)某种(Mel g 1、Mel g2、Mel g 3、Mel g PRVB、Mel g TSA)、沟对虾属某种(Mel I 1)、无鳔石首鱼属某种(Men am1)、山靛属某种(Mer a 1、Mer a 1.0101)、无须鳕属某种(Mer ap 1、Mer au 1、Mer bi 1、Mer ca 1、Mer ga 1、Mer hu 1)、牙鳕属某种(Mer me 1)、无须鳕属某种(Mer mr 1、Mer pa1、Mer po 1、Mer pr 1、Mer se 1)、沙漠鼠属某种(Mer un 23kD)、绿僵菌属某种(Met a30)、赤虾属某种(Met ba 1)、对虾属某种(Met e 1、Met e 1.0101、Met e 2)、水杉属某种(Met gl 2)、对虾属某种(Met j 1、Met j 2)、后海螯虾属某种(Met ja 1)、赤虾属某种(Met la 1)、后海螯虾属某种(Met t 2)、蓝鳕属某种(Mic po 1)、绒须石首鱼属某种(Micun 1)、类栉孔扇贝属某种(Mim n 1)、苦瓜属某种(Mom c RIP)、桑属某种(Mor a 17kD、Mora 4)、狼鲈属某种(Mor am 1)、桑属某种(Mor n 3、Mor n 3.0101)、狼鲈属某种(Mor sa 1、Mor sc 1)、鲻属某种(Mug c 1)、鳗鳞鳕属某种(Mur mi 1)、巴蕉属某种(Mus a 1、Mus a1.0101、Mus a 2、Mus a 2.0101、Mus a 3、Mus a 3.0101、Mus a 4、Mus a 4.0101、Mus a5、Mus a 5.0101、Mus a 5.0102)、小鼠属某种(Mus m 1、Mus m 1.0101、Mus m 1.0102、Musm 2、Mus m明胶、Mus m IgG、Mus m MSA、Mus m莫罗单抗、Mus m卵黄高磷蛋白)、鼬属某种(Mus p 17kD)、巴蕉属某种(Mus xp 1、Mus xp 2、Mus xp 5)、喙鲈属某种(Myc bo 1、Mycmi 1、Myc ph 1)、毁丝霉属某种(Myc sp Laccase)、公牛蚁属某种(Myr p 1、Myr p1.0101、Myr p 2、Myr p 2.0101、Myr p 2.0102、Myr p 3、Myr p 3.0101)、贻贝属某种(Myte 1、Myt g 1、Myt g PM)、瘤蚜属某种(Myz p 7、Myz p 7.0101)、Nemorhedus某种(Nae goHya)、钩虫属某种(Nec a钙网蛋白)、金线鱼属某种(Nem vi 1)、新萨托菌属某种(Neo fi1、Neo fi 22)、Neochen某种(Neo ju 1)、新园蛛属某种(Neo n 7、Neo n 7.0101)、韶子属某种(Nep I GAPDH)、海螯虾属某种(Nep n 1、Nep n DF9)、香螺属某种(Nep po 1、Nep po1.0101)、烟草属某种(Nic t 8、Nic t渗调蛋白、Nic t绒毛蛋白)、假格链格孢属某种(Nimc 1、Nim s 1)、日圆线虫属某种(Nip b Agl)、懒猴属某种(Nyc c 1)、章鱼某种(Oct f 1、Oct I 1、Oct v 1、Oct v 1.0101、Oct v PM)、敏尾笛鲷属某种(Ocy ch 1)、洋橄榄属某种(Ole e 1、Ole e 1.0101、Ole e 1.0102、Ole e 1.0103、Ole e 1.0104、Ole e 1.0105、Olee 1.0106、Ole e 1.0107、Ole e 10、Ole e 10.0101、Ole e 11、Ole e 11.0101、Ole e11.0102、Ole e 12、Ole e 13、Ole e 2、Ole e 2.0101、Ole e 3、Ole e 3.0101、Ole e36kD、Ole e 4、Ole e 4.0101、Ole e 5、Ole e 5.0101、Ole e 6、Ole e 6.0101、Ole e 7、Ole e 7.0101、Ole e 8、Ole e 8.0101、Ole e 9、Ole e 9.0101)、柔鱼属某种(Omm b 1、Omm b 1.0101)、大麻哈鱼属某种(Onc ke 1、Onc ke 18kD、Onc keα2I、Onc ke卵黄生成素、Onc m 1、Onc m 1.0101、Onc m 1.0201、Onc mα2I、Onc m鱼精蛋白、Onc m卵黄生成素、Oncma 1、Onc ma FPA、Onc ma FSA、Onc ma TPI、Onc n 1)、蟠尾丝虫属某种(Onc o 3、Onc o3.0101)、鲑鱼属某种(Onc ts 1)、蟠尾丝虫属某种(Onc v 3、Onc v 3.0101)、口虾蛄属某种(Ora o 1、Ora o 1.0101)、口孵丽鲷某种(Ore a 1、Ore mo 1、Ore mo 2、Ore mo FPA、Ore mo SCAF7145、Ore ni 1、Ore ni 18kD、Ore ni 45kD)、禽刺螨属某种(Orn sy 10、Ornsy 10.0101、Orn sy 10.0102)、穴兔属某种(Ory c 1、Ory c 1.0101、Ory c 2、Ory c酪蛋白、Ory c卵黄高磷蛋白、Ory c RSA)、稻属某种(Ory s 1、Ory s 1.0101、Ory s 11、Ory s12、Ory s 12.0101、Ory s 13、Ory s 14、Ory s 17kD、Ory s 19kD、Ory s 2、Ory s 23、Orys 3、Ory s 7、Ory s aA_TI、Ory s GLP52、Ory s GLP63、Ory s乙二醛酶I、Ory s NRA)、铁木属某种(Ost c 1、Ost c 1.0101)、羊属某种(Ovi a ALA、Ovi a BLG、Ovi a酪蛋白、Ovi a酪蛋白αS1、Ovi a酪蛋白αS2、Ovi a酪蛋白β、Ovi a酪蛋白κ、Ovi a卵黄高磷蛋白、Ovi aSSA)、粗针蚁属某种(Pac c 3)、赤鲷属某种(Pag m 1、Pag pa 1)、鲳属某种(Pam ar 1、Pamc 1)、长额虾属某种(Pan b 1、Pan b 1.0101)、巨鲶属某种(Pan bo 1)、长额虾属某种(Pane 1、Pan e 1.0101、Pan e 4)、龙虾属某种(Pan h 1、Pan hy 1)、巨鲶属某种(Pan hy18kD、Pan hy 45kD)、龙虾属某种(Pan j 1)、豹属某种(Pan I 1、Pan o 1、Pan p 1)、龙虾属某种(Pan s 1、Pan s 1.0101)、豹属某种(Pan t 1)、黑猩猩属某种(Pan tr TCTP)、罂粟属某种(Pap s 17kD、Pap s 2、Pap s 34kD)、凤蝶属某种(Pap xu 7、Pap xu 7.0101、Papxu 7.0102)、牙鲆属某种(Par a 1)、鲶属某种(Par as 1、Par c 1)、拟石蟹属某种(Par c1.0101、Par c 1.0102、Par f 1)、银胶菊属某种(Par h 1)、墙草属某种(Par j 1、Par j1.0101、Par j 1.0102、Par j 1.0103、Par j 1.0201、Par j 2、Par j 2.0101、Par j2.0102、Par j 3、Par j 3.0101、Par j 3.0102、Par j 4、Par j 4.0101、Par j J1-J2)、牙鲆属某种(Par le 1)、墙草属某种(Par m 1、Par o 1、Par o 1.0101)、牙鲆属某种(Par ol1、Par olα2I)、Parahucho某种(Par pe卵黄生成素)、西番莲属某种(Pas e几丁质酶、Pas eHevein)、雀稗属某种(Pas n 1、Pas n 1.0101、Pas n 13)、盘海扇属某种(Pat y 1)、虱属某种(Ped h 7、Ped h 7.0101)、对虾属某种(Pen a 1、Pen a 1.0101、Pen a 1.0102、Pen a1.0102(103-117)、Pen a 1.0102(109-123)、Pen a 1.0102(1-15)、Pen a 1.0102(115-129)、Pen a 1.0102(121-135)、Pen a 1.0102(127-141)、Pen a 1.0102(13-27)、Pen a1.0102(133-147)、Pen a 1.0102(139-153)、Pen a 1.0102(145-159))、美对虾属某种(Pena 1.0102(151-165))、对虾属某种(Pen a 1.0102(157-171)、Pen a 1.0102(163-177)、Pena 1.0102(169-183)、Pen a 1.0102(175-189)、Pen a 1.0102(181-195)、Pen a 1.0102(187-201)、Pen a 1.0102(193-207)、Pen a 1.0102(19-33)、Pen a 1.0102(199-213)、Pena 1.0102(205-219)、Pen a 1.0102(211-225)、Pen a 1.0102(217-231)、Pen a 1.0102(223-237)、Pen a 1.0102(229-243))、美对虾属某种(Pen a 1.0102(235-249))、对虾属某种(Pen a 1.0102(241-255)、Pen a 1.0102(247-261)、Pen a 1.0102(253-267)、Pen a1.0102(25-39)、Pen a 1.0102(259-273)、Pen a 1.0102(265-279)、Pen a 1.0102(270-284)、Pen a 1.0102(31-45)、Pen a 1.0102(37-51)、Pen a 1.0102(43-57)、Pen a 1.0102(49-63))、美对虾属某种(Pen a 1.0102(55-69))、对虾属某种(Pen a 1.0102(61-75)、Pena 1.0102(67-81)、Pen a 1.0102(7-21)、Pen a 1.0102(73-87)、Pen a 1.0102(79-93)、Pen a 1.0102(85-99)、Pen a 1.0102(91-105)、Pen a 1.0102(97-111)、Pen a 1.0103)、青霉菌属某种(Pen b 13、Pen b 13.0101、Pen b 26、Pen b 26.0101、Pen c 1、Pen c 13、Pen c 13.0101、Pen c 18、Pen c 19、Pen c 19.0101、Pen c 2、Pen c 22、Pen c 22.0101、Pen c 24、Pen c 24.0101、Pen c 3、Pen c 3.0101、Pen c 30、Pen c 30.0101、Pen c 32、Pen c 32.0101、Pen c MnSOD、Pen ch 13、Pen ch 13.0101、Pen ch 18、Pen ch 18.0101、Pen ch 20、Pen ch 20.0101、Pen ch 31、Pen ch 31.0101、Pen ch 33、Pen ch 33.0101、Pen ch 35、Pen ch 35.0101、Pen ch MnSOD)、对虾属某种(Pen i 1、Pen i 1.0101、Pen m1、Pen m 1.0101、Pen m 1.0102、Pen m 2、Pen m 2.0101、Pen m 3、Pen m 3.0101、Pen m4、Pen m 4.0101、Pen m 6、Pen m 6.0101)、青霉菌属某种(Pen o 18、Pen o 18.0101)、对虾属某种(Pena o 1、Pena o 1.0101)、大蠊属某种(Per a 1、Per a 1.0101、Per a1.0102、Per a 1.0103、Per a 1.0104、Per a 1.0105、Per a 1.0201、Per a 10、Per a10.0101、Per a 2、Per a 3、Per a 3.0101、Per a 3.0201、Per a 3.0202、Per a 3.0203、Per a 4、Per a 5、Per a 6、Per a 6.0101、Per a 7、Per a 7.0101、Per a 7.0102、Per a7.0103、Per a 9、Per a 9.0101、Per a组织蛋白酶、Per a FABP、Per a胰蛋白酶、Per f 1、Per f 7、Per f 7.0101)、股蛤属某种(Per v 1)、鳄梨属某种(Pers a 1、Pers a 1.0101、Pers a 4)、欧芹属某种(Pet c 1、Pet c 2、Pet c 3)、虉草属某种(Pha a 1、Pha a1.0101、Pha a 5、Pha a 5.0101、Pha a 5.02、Pha a 5.03、Pha a 5.04)、菜豆属某种(Phav 3、Pha v 3.0101、Pha v 3.0201、Pha v aAI、Pha v aAI.0101、Pha v几丁质酶、Pha vPHA、Pha v菜豆素)、梯牧草属某种(Phl p 1、Phl p 1.0101、Phi p 1.0102、Phi p 11、Phip 11.0101、Phi p 12、Phi p 12.0101、Phi p 12.0102、Phi p 12.0103、Phi p 13、Phl p13.0101、PhI p 2、Phi p 2.0101、Phi p 3、Phi p 3.0101、PhI p 3.0102、Phi p 4、Phi p4.0101、Phi p 4.0102、Phl p 4.0201、Phl p 4.0202、Phl p 4.0203、Phl p 4.0204、Phl p5、Phl p 5.0101、Phl p 5.0102、Phl p 5.0103、Phl p 5.0104、Phl p 5.0105、Phl p5.0106、Phl p 5.0107、Phl p 5.0108、Phl p 5.0109、Phl p 5.0201、Phl p 5.0202、Phl p5.0203、Phl p 5.0204、Phl p 5.0205、Phl p 5.0206、Phl p 5.0207、Phl p 6、Phl p6.0101、Phl p 6.0102、Phl p 7、Phl p 7.0101、Phl p P1-P2-P5-P6、Phl p P2-P6、Phl pP5-P1、Phl p P6-P2)、Phoenix某种(Pho d 2、Pho d 2.0101、Pho d 40kD、Pho d 90kD)、毛足鼠属某种(Pho s 21kD)、茎点霉属某种(Pho t 1)、芦苇属某种(Phr a 1、Phr a 12、Phra 13、Phr a 4、Phr a 5)、商陆属某种(Phy a RIP)、茴芹属某种(Pim a 1、Pim a 2)、珧蛤属某种(Pin a 1)、胡椒属某种(Pip n 14kD、Pip n 28kD)、豌豆属某种(Pis s 1、Pis s1.0101、Pis s 1.0102、Pis s 2、Pis s 2.0101、Pis s 5、Pis s凝集素、Pis s白蛋白)、黄连木属某种(Pis v 1、Pis v 1.0101、Pis v 2、Pis v 2.0101、Pis v 2.0201、Pis v 3、Pisv 3.0101、Pis v 4、Pis v 4.0101、Pis v 5、Pis v 5.0101)、悬铃木属某种(Pla a 1、Plaa 1.0101、Pla a 2、Pla a 2.0101、Pla a 3、Pla a 3.0101、Pla a 8)、江鲽属某种(Pla f1)、车前属某种(Pla I 1、Pla I 1.0101、Pla I 1.0102、Pla I 1.0103、Pla I细胞色素C)、悬铃木属某种(Pla oc 1、Pla or 1、Pla or 1.0101、Pla or 2、Pla or 2.0101、Pla or 3、Pla or 3.0101、Pla or 4、Pla or CyP、Pla r 1)、鳃棘鲈属某种(Pie ar 1)、格孢腔菌属某种(Pie h 1)、鳃棘鲈属某种(Pie le 1)、谷斑螟属某种(Plo i 1、Plo i 1.0101、Plo i2、Plo i 2.0101)、早熟禾属某种(Poa p 1、Poa p 1.0101、Poa p 10、Poa p 12、Poa p 13、Poa p 2、Poa p 4、Poa p 5、Poa p 5.0101、Poa p 6、Poa p 7)、马蜂属某种(Pol a 1、Pola 1.0101、Pol a 2、Pol a 2.0101、Pol a 5、Pol a 5.0101、Pol d 1、Pol d 1.0101、Pol d1.0102、Pol d 1.0103、Pol d 1.0104、Pol d 4、Pol d 4.0101、Pol d 5、Pol d 5.0101、Pol e 1、Pol e 1.0101、Pol e 2、Pol e 4、Pol e 4.0101、Pol e 5、Pol e 5.0101、Pol f5、Pol f 5.0101、Pol g 1、Pol g 1.0101、Pol g 2、Pol g 4、Pol g 5、Pol g 5.0101、Polhe MLT、Pol m 5、Pol m 5.0101)、多足摇蚊属某种(Pol n 1)、龟足属某种(Pol po 1)、青鳕属某种(Pol vi 1)、黄蜂(Polybia)某种(Poly p 1、Poly p 1.0101、Poly p 2、Poly p5、Poly s 5、Poly s 5.0101)、扁鲹属某种(Pom sa 1)、猩猩属某种(Pon ab HSA)、Pontastacus某种(Pon I 4、Pon I 4.0101、Pon I 7、Pon I 7.0101)、梭子蟹属某种(Por s1、Por s 1.0101、Por s 1.0102、Por tr 1、Por tr 1.0101)、Protortonia某种(Pro ca38kD)、原蝲蛄属某种(Pro cl 1、Pro cl 1.0101、Pro cl 21kD)、牧豆树属某种(Pro j20kD)、李属某种(Pru ar 1、Pru ar 1.0101、Pru ar 3、Pru ar 3.0101、Pru av 1、Pru av1.0101、Pru av 1.0201、Pru av 1.0202、Pru av 1.0203、Pru av 2、Pru av 2.0101、Pruav 3、Pru av 3.0101、Pru av 4、Pru av 4.0101、Pru c 1、Pru d 1、Pru d 2、Pru d 3、Prud 3.0101、Pru d 4、Pru du 1、Pru du 2、Pru du 2S白蛋白、Pru du 3、Pru du 3.0101、Prudu 4、Pru du 4.0101、Pru du 4.0102、Pru du 5、Pru du 5.0101、Pru du 6、Pru du6.0101、Pru du 6.0201、Pru du羽扇豆蛋白、Pru p 1、Pru p 1.0101、Pru p 2、Pru p2.0101、Pru p 2.0201、Pru p 2.0301、Pru p 3、Pru p 3.0101、Pru p 3.0102、Pru p 4、Pru p 4.0101、Pru p 4.0201、Pru sa 3)、光盖伞属某种(Psi c 1、Psi c 1.0101、Psi c2、Psi c 2.0101)、痒螨属某种(Pso o 1、Pso o 10、Pso o 10.0101、Pso o 11、Pso o 13、Pso o 14、Pso o 2、Pso o 21、Pso o 3、Pso o 5、Pso o 7)、美洲豹某种(Pum c 1)、石榴属某种(Pun g 3)、梨属某种(Pyr c 1、Pyr c 1.0101、Pyr c 3、Pyr c 3.0101、Pyr c 4、Pyrc 4.0101、Pyr c 5、Pyr c 5.0101、Pyr py 2)、栎属某种(Que a 1、Que a 1.0101、Que a1.0201、Que a 1.0301、Que a 1.0401、Que a 2、Que a 4)、军曹鱼属某种(Rac ca 1)、蛙属某种(Ran e 1、Ran e 1.0101、Ran e 2、Ran e 2.0101)、蛙蟹属某种(Ran ra 1)、驯鹿属某种(Ran t BLG)、鼠属某种(Rat n 1、Rat n 1.0101、Rat n酪蛋白、Rat n明胶、Rat n IgG、Rat n卵黄高磷蛋白、Rat n RSA、Rat n转铁蛋白)、根毛霉属某种(Rhi m AP)、根霉某种(Rhi nv脂肪酶、Rhi o脂肪酶)、翼齿鲷属某种(Rho au 1)、红酵母属某种(Rho m 1、Rho m1.0101、Rho m 2、Rho m 2.0101)、蓖麻某种(Ric c 1、Ric c 1.0101、Ric c 2、Ric c 3、Ric c 8、Ric c RIP)、溪鳉属某种(Riv ma 1)、刺槐属某种(Rob p 2、Rob p 4、Rob p聚葡萄糖酶)、蔷薇属某种(Ros r 3)、大王椰子属某种(Roy e 2)、悬钩子属某种(Rub i 1、Rubi 1.0101、Rub i 3、Rub i 3.0101、Rub i几丁质酶、Rub i CyP)、酵母属某种(Sac c羧肽酶Y、Sac c CyP、Sac c烯醇酶、Sac c葡萄糖苷酶、Sac c转化酶、Sac c MnSOD、Sac c P2、Sacc抑制蛋白)、红点鲑属某种(Sal f 1)、猪毛菜某种(Sal k 1、Sal k 1.0101、Sal k1.0201、Sal k 1.0301、Sal k 1.0302、Sal k 2、Sal k 2.0101、Sal k 3、Sal k 3.0101、Sal k 4、Sal k 4.0101、Sal k 4.0201、Sal k 5、Sal k 5.0101)、红点鲑属某种(Sal le卵黄生成素)、大西洋鲑鱼某种(Sal s 1、Sal s 1.0101、Sal s 1.0201、Sal s 2、Sal s2.0101、Sal s明胶)、接骨木属某种(Sam n 1)、檀香某种(San lu 1)、肥皂草属某种(Sap oRIP)、拟沙丁鱼属某种(Sar m 1)、瘤鸭属某种(Sar ml 1)、沙丁鱼属某种(Sar p 1)、疥螨属某种(Sar s 1、Sar s 14、Sar s 3、Sar s GST、Sar s PM)、拟沙丁鱼属某种(Sar sa 1、Sar sa 1.0101)、住血吸虫属某种(Sch j GST、Sch j PM、Sch j Sj22、Sch j Sj67、Sch maSm20、Sch ma Sm21、Sch ma Sm22、Sch ma Sm31)、石首鱼属某种(Sci oc 1)、鲭鱼属某种(Sco a 1)、马鲛属某种(Sco ca 1)、鰆属某种(Sco g 1)、鲭鱼属某种(Sco j 1、Sco ma 1、Sco s 1)、蜈蚣某种(Sco y 7、Sco y 7.0101)、青蟹属某种(Scy o 1、Scy o 1.0101、Scy o2、Scy pa 1、Scy pa 2、Scy s 1、Scy s 1.0101、Scy s 2)、平鲉属某种(Seb fa 1、Seb in1、Seb m 1、Seb m 1.0101、Seb m 1.0201)、黑麦属某种(Sec c 1、Sec c 12、Sec c 13、Secc 2、Sec c 20、Sec c 20.0101、Sec c 20.0201、Sec c 28、Sec c 3、Sec c 4、Sec c4.0101、Sec c 4.0201、Sec c 5、Sec c 5.0101、Sec c aA_TI、Sec c aA_TI.0101)、千里光属某种(Sen j MDH、Sen j PL)、乌贼属某种(Sep e 1、Sep e 1.0101)、拟乌贼属某种(SepI 1、Sep 1 1.0101)、乌贼属某种(Sep m 1)、甘鲹属某种(Ser d 1、Ser la 1)、樱虾属某种(Ser lu 1)、甘鲹属某种(Ser q 1、Ser ri 1)、胡麻属某种(Ses i 1、Ses i 1.0101、Ses i2、Ses i 2.0101、Ses i 3、Ses i 3.0101、Ses i 4、Ses i 4.0101、Ses i 5、Ses i5.0101、Ses i 6、Ses i 6.0101、Ses i 7、Ses i 7.0101、Ses i 8)、志贺杆菌属某种(Shibo GST、Shi dy GST)、蚋属某种(Sim vi 1、Sim vi 2、Sim vi 3、Sim vi 4、Sim vi 70kD)、白芥属某种(Sin a 1、Sin a 1.0101、Sin a 1.0104、Sin a 1.0105、Sin a 1.0106、Sin a1.0107、Sin a 1.0108、Sin a 2、Sin a 2.0101、Sin a 3、Sin a 3.0101、Sin a 4、Sin a4.0101)、缢蛏属某种(Sin c 1、Sin c 1.0101)、火蚁属某种(Sol g 2、Sol g 2.0101、Solg 3、Sol g3.0101、Sol g 4、Sol g 4.0101、Sol g 4.0201、Sol i 1、Sol i 1.0101、Sol i2、Sol i 2.0101、Sol i 3、Sol i 3.0101、Sol i 4、Sol i 4.0101)、管鞭虾属某种(Sol me1)、火蚁属某种(Sol r 1、Sol r 2、Sol r 2.0101、Sol r 3、Sol r 3.0101、Sol s 2、Sol s2.0101、Sol s 3、Sol s 3.0101、Sol s 4)、鳎属某种(Sol so 1、Sol so TPI)、茄属某种(Sola t 1、Sola t 1.0101、Sola t 2、Sola t 2.0101、Sola t 3、Sola t 3.0101、Sola t3.0102、Sola t 4、Sola t 4.0101、Sola t 8、Sola t聚葡萄糖酶)、高粱属某种(Sor b 1、Sor h 1、Sor h 1.0101、Sor h 12、Sor h 7)、鲷属某种(Spa a 1)、双髻鲨属某种(Sph ti1)、螺旋藻属某种(Spi mxβ_藻蓝素)、菠菜属某种(Spi o 2、Spi o RuBisCO)、虾蛄属某种(Squ ac 1、Squ ac 1.0101、Squ o 1、Squ o 1.0101)、葡萄球菌属某种(Sta a FBP、Sta aSEA、Sta a SEB、Sta a SEC、Sta a SED、Sta a SEE、Sta a TSST)、葡萄穗霉属某种(Sta c3、Sta c 3.0101、Sta c纤维素酶、Sta c溶血素、Sta c SchS34、Sta c Stachyrase A)、匍柄霉属某种(Ste b 1、Ste c 1、Ste v 1)、小公鱼属某种(Sto i 1)、鸵鸟某种(Str c 1、Str c 2、Str c 3)、链球菌属某种(Str dy链球菌激酶)、链霉菌属某种(Str g Pronase)、链球菌属某种(Str pn PspC)、紫海胆属某种(Str pu 18kD、Str pu卵黄生成素)、链球菌属某种(Str py SPEA、Str py SPEC、Str py链球菌激酶)、拟圆虫属某种(Str st 45kD)、链霉菌属某种(Str v PAT)、柄海鞘属某种(Sty p 1)、皱皮螨属某种(Sui m 1、Sui m 13、Sui m2、Sui m 3、Sui m 5、Sui m 5.01、Sui m 5.02、Sui m 5.03、Sui m 6、Sui m 7、Sui m 8、Sui m 9)、野猪属某种(Sus s ACTH、Sus s ALA、Sus s淀粉酶、Sus s BLG、Sus s酪蛋白、Sus s酪蛋白αS1、Sus s酪蛋白αS2、Sus s酪蛋白β、Sus s酪蛋白κ、Sus s明胶、Sus s HG、Sus s胰岛素、Sus s脂肪酶、Sus s胃蛋白酶、Sus s卵黄高磷蛋白、Sus s PRVB、Sus s PSA、Sus s TCTP)、Syntelopodeuma某种(Syn y 7、Syn y 7.0101)、丁香属某种(Syr v 1、Syr v1.0101、Syr v 1.0102、Syr v 1.0103、Syr v 2、Syr v 3、Syr v 3.0101)、牛虻属某种(Taby 1、Tab y 1.0101、Tab y 2、Tab y 2.0101、Tab y 5、Tab y 5.0101)、麻鸭属某种(Tad ra1)、篮状菌属某种(Tal st 22、Tal st 3、Tal st 8)、蒲公英属某种(Tar o 18kD)、水松属某种(Tax d 2)、隅蛛属某种(Teg d血蓝蛋白)、背带线虫属某种(Tel ci 3)、异舟蛾属某种(Tha p 1、Tha p 1.0101、Tha p 2、Tha p 2.0101)、狭鳕属某种(The c 1)、嗜热真菌属某种(The I脂肪酶、The sp脂肪酶、The sp木胶多糖酶)、鲔属某种(Thu a 1、Thu a 1.0101、Thu a胶原、Thu al 1、Thu at 1、Thu o 1、Thu o胶原)、侧柏属某种(Thu oc 3、Thu p 1)、鲔属某种(Thu t 1、Thu to 1)、杖鱼属某种(Thy at 1)、Thyrophygus某种(Thy y 7、Thy y7.0101)、褶柔鱼属某种(Tod p 1、Tod p 1.0101、Tod p 1.0102)、桔蚜属某种(Tox c 7、Tox c 7.0101)、蛔虫属某种(Tox ca TES120、Tox ca TES26、Tox ca TES30)、弓虫属某种(Tox g HSP70)、鹰爪虾属某种(Tra c 1)、鲳鲹属某种(Tra ca 1)、真鲹属某种(Tra j 1、Tra j明胶、Tra tr明胶)、小麦属某种(Tri a 1、Tri a 10kD、Tri a 12、Tri a 12.0101、Tri a 12.0102、Tri a 12.0103、Tri a 12.0104、Tri a 13、Tri a 14、Tri a 14.0101、Tria 14.0201、Tri a 15、Tri a 15.0101、Tri a 18、Tri a 18.0101、Tri a 19、Tri a19.0101、Tri a 2、Tri a 21、Tri a 21.0101、Tri a 23kd、Tri a 25、Tri a 25.0101、Tria 26、Tri a 26.0101、Tri a 27、Tri a 27.0101、Tri a 28、Tri a 28.0101、Tri a 29、Tria 29.0101、Tri a 29.0201、Tri a 3、Tri a 30、Tri a 30.0101、Tri a 31、Tri a31.0101、Tri a 32、Tri a 32.0101、Tri a 33、Tri a 33.0101、Tri a 34、Tri a 34.0101、Tri a 35、Tri a 35.0101、Tri a 36、Tri a 36.0101、Tri a 37、Tri a 37.0101、Tri a 4、Tri a 4.0101、Tri a 4.0201、Tri a 5、Tri a 7、Tri a aA_SI、Tri aα_麦胶蛋白、Tri abA、Tri a Bd36K、Tri aβ_麦胶蛋白、Tri a几丁质酶、Tri a CM16、Tri a DH、Tri a Endo几丁质酶、Tri aγ_麦胶蛋白、Tri a Germin、Tri a麦胶蛋白、Tri a GST、Tri a LMW Glu、Tri a LMW-GS B16、Tri a LMW-GS P42、Tri a LMW-GS P73、Tri a LTP2、Tri a omega2_麦胶蛋白、Tri a过氧化物酶、Tri a过氧化物酶1、Tri a SPI、Tri a TLP、Tri a麦芽凝集素、Tri a XI)、麦轴梗霉属某种(Tri al蛋白酶K)、拟谷盗属某种(Tri ca 17、Tri ca17.0101、Tri ca 7、Tri ca7.0101)、毛样线虫属某种(Tri co 3、Tri co 3.0101)、发癣菌某种(Tri eq 4)、毛样线虫属某种(Tri fg 1、Tri fg 2、Tri fg 3、Tri fg 4)、栝楼属某种(Tri k RIP)、带鱼属某种(Tri le 1)、小麦属某种(Tri m过氧化物酶)、发癣菌属某种(Trime 2、Tri me 4)、三毛草属某种(Tri p 1、Tri p 5)、旋毛虫属某种(Tri ps 3、Tri ps3.0101)、发癣菌属某种(Tri r 2、Tri r 2.0101、Tri r 4、Tri r 4.0101)、木霉属某种(Tri rs纤维素酶)、小麦属某种(Tri s 14)、发癣菌属某种(Tri sc 2、Tri sc 4、Tri so2)、旋毛虫属某种(Tri sp 3、Tri sp 3.0101、Tri sp 3.0102、Tri sp 3.0103、Tri sp3.0104、Tri sp 3.0105、Tri sp 3.0106)、发癣菌属某种(Tri t 1、Tri t 1.0101、Tri t4、Tri t 4.0101)、小麦属某种(Tri td 14、Tri td aA_TI)、木霉属某种(Tri v纤维素酶)、发癣菌某种(Tri ve 4)、锥鼻虫属某种(Tria p 1、Tria p 1.0101)、白梧桐属某种(Trip s1)、蝾螺属某种(Tur c 1、Tur c PM)、酪食螨属某种(Tyr p 1、Tyr p 10、Tyr p 10.0101、Tyr p 10.0102、Tyr p 13、Tyr p 13.0101、Tyr p 2、Tyr p 2.0101、Tyr p 24、Tyr p24.0101、Tyr p 3、Tyr p 3.0101、Tyr p 4、Tyr p 5、Tyr p 5.01、Tyr p 5.02、Tyr p5.03、Tyr p 7、Tyr pα微管蛋白)、细基格孢属某种(Ulo a 1、Ulo at 1、Ulo b 1、Ulo c 1、Ulo co 1、Ulo cu 1、Ulo mu 1、Ulo ob 1、Ulo se 1、Ulo su 1、Ulo tu 1)、雪豹属某种(Unc u 1)、长鳍鳕属某种(Uro te 1)、苔莓属某种(Vac m 3)、瓦螨属某种(Var j 13kD)、蛤仔属某种(Ven ph 1、Ven ph 1.0101)、黄胡蜂属某种(Ves f 1、Ves f 2、Ves f 5、Ves f5.0101、Ves g 1、Ves g 2、Ves g 5、Ves g 5.0101、Ves m 1、Ves m 1.0101、Ves m 2、Vesm 2.0101、Ves m 5、Ves m 5.0101、Ves m MLT、Ves p 1、Ves p 2、Ves p 5、Ves p 5.0101、Ves s 1、Ves s 1.0101、Ves s 2、Ves s 5、Ves s 5.0101、Ves v 1、Ves v 1.0101、Ves v2、Ves v 2.0101、Ves v 2.0201、Ves v 3、Ves v 3.0101、Ves v 5、Ves v 5.0101、Ves v5-Pol a 5、Ves vi 5、Ves vi 5.0101)、胡蜂属某种(Vesp c 1、Vesp c 1.0101、Vesp c 2、Vesp c 5、Vesp c 5.0101、Vesp c 5.0102、Vesp m 1、Vesp m 1.0101、Vesp m 5、Vesp m5.0101、Vesp ma 1、Vesp ma 2、Vesp ma 5、Vesp ma MLT、Vesp v MLT)、缸豆属某种(Vig r1、Vig r 1.0101、Vig r 17kD、Vig r 5、Vig r 8S球蛋白、Vig r白蛋白、Vig rβ-伴大豆球蛋白)、葡萄属某种(Vit v 1、Vit v 1.0101、Vit v 4、Vit v 5、Vit v聚葡萄糖酶、Vit vTLP)、旗鱼属某种(Xip g 1、Xip g 1.0101、Xip g 25kD)、玉蜀黍属某种(Zea m 1、Zea m1.0101、Zea m 11、Zea m 12、Zea m 12.0101、Zea m 12.0102、Zea m 12.0103、Zea m12.0104、Zea m 12.0105、Zea m 13、Zea m 14、Zea m 14.0101、Zea m 14.0102、Zea m 2、Zea m 20S、Zea m 22、Zea m 25、Zea m 25.0101、Zea m 27kD Zein、Zea m 3、Zea m 4、Zeam 5、Zea m 50kD Zein、Zea m 7、Zea m几丁质酶、Zea m G1、Zea m G2、Zea m PAO、Zea mZm13)、海鲂属某种(Zeu fa 1)、枣属某种(Ziz m 1、Ziz m 1.0101)、绵鳚属某种(Zoa aISPIII)、肉蒺藜属某种(Zyg f 2)。

在此上下文中，括号中的术语指示来自特定来源的特别优选的过敏性抗原(过敏原)。

最优选地，过敏性抗原优选源自来源(例如植物(例如草或树)、天然产物(例如牛奶、坚果等)、真菌来源(例如曲霉属)或细菌来源或来自动物来源或动物毒素(例如猫、狗、蜜蜂毒液等)，优选选自由以下组成的列表：草花粉(例如黑麦花粉)、树木花粉(例如榛子树、桦树、桤木、梣树的花粉)、花朵花粉、草本花粉(例如艾蒿的花粉)、尘螨(例如Der f 1、Der p 1、Eur m 1、Der m 1Der f 2、Der p 2、Eur m 2、Tyr p 2、Lep d 2)、霉菌(例如顶头孢属、曲霉属、枝孢属、镰刀菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、葡萄孢属、木霉属或链格孢属的过敏原)、动物(例如猫的Fel d1、Fel d 2、Fel d3或Fel d4)、食物(例如鱼(例如鲈鱼、鳕鱼、比目鱼)、海鲜(例如螃蟹、龙虾、虾)、鸡蛋、小麦、坚果(例如花生、杏仁、腰果、核桃)、大豆、牛奶等)或昆虫毒液的过敏原(例如来自黄蜂、蜜蜂、大黄蜂、蚂蚁、蚊子或蜱的毒液的过敏原)。

自身免疫性自身抗原

自身免疫性自身抗原，即与自身免疫疾病相关的抗原或自身抗原，可能与影响以下器官系统中的至少一者或多者的自身免疫疾病有关：循环系统、消化系统、内分泌系统、排泄系统、免疫系统、外皮系统、肌肉系统、神经系统、生殖系统、呼吸系统、骨骼系统，优选心血管系统、神经内分泌系统、肌肉骨骼系统或胃肠系统。其中，循环系统为器官系统，它能够经由心脏、血液和血管将血液泵送和输送至身体和肺部。消化系统能够经由唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠和肛门消化并加工食物。内分泌系统使用由例如下丘脑、垂体或垂体腺、松果体或松果体腺、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺的内分泌腺产生的激素实现体内交流。排泄系统包括肾脏、输尿管、膀胱和尿道，并参与体液平衡、电解质平衡和尿液排泄。免疫系统包括参与组织与血流、淋巴和淋巴结与血管之间的淋巴转移的结构，这些结构可负责免疫系统的细胞和体液组分的运输。它负责防御致病因子，并且尤其包括白细胞、扁桃体、腺样体、胸腺和脾脏。外皮系统包括皮肤、毛发和指甲。肌肉系统使肌肉与骨骼系统一起运动，骨骼系统包括骨骼、软骨、韧带和肌腱，并提供结构支撑。神经系统负责收集、传递和处理信息，并且包括大脑、脊髓和神经。生殖系统包括性器官，例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎。呼吸系统包括用于呼吸的器官、咽、喉、气管、支气管、肺和横膈膜，并且与循环系统共同发挥作用。

自身免疫性自身抗原(与自身免疫疾病相关的抗原或自身抗原)选自与自身免疫疾病相关的自身抗原，所述自身免疫疾病选自阿狄森氏病(自身免疫性肾上腺炎，MorbusAddison)、斑秃、阿狄森氏贫血(Morbus Biermer)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、冷型自身免疫性溶血性贫血(AIHA)(冷血球凝集素病、冷性自身免疫性溶血性贫血(AIHA)(冷凝集素病)、(CHAD))、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、温型(暖型AIHA、暖型自身免疫性溶血贫血(AIHA))、自身免疫性溶血性Donath-Landsteiner贫血(阵发性冷血红蛋白尿)、抗磷脂综合征(APS)、动脉粥样硬化、自身免疫性关节炎、颞动脉炎、Takayasu动脉炎(高安氏病、主动脉弓病)、颞动脉炎/巨细胞自身免疫性慢性胃炎、自身免疫性不孕症、自身免疫性内耳病(AIED)、巴塞多氏病(Morbus Basedow)、贝希德莱氏病(Morbus Bechterew、僵直性脊柱炎、强直性脊柱炎)、白塞氏综合征(Morbus Behcet)、肠病包括自身免疫性炎性肠病(包括溃疡性结肠炎(Morbus Crohn、克罗恩氏病)、心肌病特别是自身免疫性心肌病、特发性扩张性心肌病(DCM)、乳糜泻口炎性皮炎(谷蛋白介导的肠病)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性多发性关节炎、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、CREST综合征(皮肤钙沉着、雷诺现象(Raynaudphenomenon)、食道运动障碍、sklerodaktylia和毛细血管扩张的综合征)、克罗恩氏病(Morbus Crohn、溃疡性结肠炎)、疱疹样皮炎、皮肤自身免疫疾病、皮肌炎、糖尿病、1型糖尿病(I型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病)、2型糖尿病(II型糖尿病)、原发性混合性冷凝球蛋白血症、原发性混合性冷凝球蛋白血症、纤维肌痛、纤维肌炎、古巴士德氏(Goodpasture)综合征(抗GBM介导的肾小球性肾炎)、移植物抗宿主疾病、格林-巴利综合征(GBM、多发性神经炎)、血液自身免疫疾病、桥本(Hashimoto)甲状腺炎、血友病、获得性血友病、肝炎、自身免疫性肝炎特别是自身免疫性慢性肝炎、特发性肺纤维化(IPF)、特发性血小板减少性紫癜、免疫血小板减少性紫癜(Morbus Werlhof；ITP)、IgA肾病、不孕症、自身免疫性不孕症、幼年型类风湿性关节炎(Morbus Still、Still综合征)、Lambert-Eaton综合征、扁平苔藓、硬化性苔藓、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、红斑狼疮(盘状)、莱姆关节炎(莱姆疾病、疏螺旋体关节炎)、梅尼埃病(Morbus Meniere)；混合性结缔组织病(MCTD)、多发性硬化症(MS、播散性脑脊髓炎、Charcot氏病)、重症肌无力(肌无力、MG)、肌炎、多发性肌炎、神经自身免疫疾病、神经性皮炎、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、瘢痕形成类天疱疮；结节性多动脉炎(periarteiitis nodosa)、多软骨炎(panchondritis)、多腺(自身免疫性)综合征(PGA综合征、施密特综合征)、风湿性多发性肌痛、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化PBC、原发性自身免疫性胆管炎)、进行性全身性硬化症(PSS)、牛皮癣、寻常型牛皮癣、雷诺氏现象、赖特综合征(Morbus Reiter、尿道结膜滑膜综合征)、类风湿性关节炎(RA、慢性多发性关节炎、关节风湿病、风湿热)、类肉瘤病(Morbus Boeck、Besnier-Boeck-Schaumann病)、僵人综合征、硬皮病、硬皮症、氏综合征、交感神经性眼炎；瞬时谷蛋白不耐受、移植器官排斥、葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜炎、血管炎、白斑病(白癜风、花斑皮肤)和韦格纳病(Morbus Wegner、韦格纳肉芽肿病)。

充当自身免疫性自身抗原的这些和其他蛋白质应理解为治疗性的，因为它们意在通过用由哺乳动物(例如人类)自身表达并触发不希望有的免疫反应(而所述反应不会在健康受试者中产生)的自身抗原接种疫苗来治疗受试者，特别是哺乳动物，更特别是人类。因此，充当自身抗原的此类蛋白质通常是哺乳动物来源的，特别是人类来源的。

在此上下文中，特别优选的是选自以下的自身免疫性自身抗原(自身抗原)：

髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘寡树突状细胞糖蛋白(MOG)，在每种情况下与多发性硬化症(MS)相关；

CD44、前胰岛素原、胰岛素原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD65)、酪氨酸磷酸酶样胰岛素瘤抗原2(IA2)、锌转运蛋白((ZnT8)和热休克蛋白60(HSP60)，在每种情况下与I型糖尿病相关；

与自身免疫性葡萄膜炎相关的光感受器间类视色素结合蛋白(IRBP)；

乙酰胆碱受体AchR和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)，在每种情况下与重症肌无力相关；

与风湿热相关的来自β-溶血性链球菌(假自身抗原)的M蛋白；

与关节炎相关的巨噬细胞迁移抑制因子；

Ro/La RNP复合物、α-和β-胞影蛋白、胰岛细胞自身抗原、聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)、NuMA、NOR-90、Ro60自身抗原和p27抗原，在每种情况下与氏综合征相关；

Ro60自身抗原、低密度脂蛋白、U-1小核核糖核蛋白复合物的Sm抗原(B/B'、D1、D2、D3、E、F、G)和RNP核糖核蛋白，在每种情况下与红斑狼疮相关；

oxLDL、β(2)GPI、HSP60/65和oxLDL/β(2)GPI，在每种情况下与动脉粥样硬化相关；

与特发性扩张性心肌病(DCM)相关的心脏β(1)-肾上腺素性受体；

与肌炎相关的组氨酰基-tRNA合成酶(HisRS)；

与硬皮病相关的拓扑异构酶I。

此外，在其他实施方案中，所述自身免疫性自身抗原与相应的自身免疫疾病相关，例如像IL-17、热休克蛋白和/或任何独特型致病性T细胞或趋化因子受体，其由参与所述自身免疫疾病(例如本文所述的任何自身免疫疾病)中的自身免疫反应的免疫细胞表达。

优选地，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物的至少一个编码区包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个核酸序列，所述核酸序列与在序列表中(或分别在PCT/EP2016/075843的表1-5或图20-24中)公开的任一核酸序列或所述核酸序列中的任一者的片段或变体至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％同一或具有此序列同一性。

优选地，包含至少一个如本文所定义的编码区的mRNA序列通常包含约50至约20000、或100至约20000个核苷酸、优选约250至约20000个核苷酸、更优选约500至约10000、甚至更优选约500至约5000的长度。

根据另一个实施方案，根据本发明的mRNA序列是如本文所定义的人工mRNA序列。

根据另一个实施方案，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物是经修饰的mRNA序列，优选如本文所述的经修饰的mRNA序列。在此上下文中，如本文所定义的修饰优选导致根据本发明的mRNA序列的稳定化。更优选地，本发明因此提供包含至少一个如本文所定义的编码区的稳定化的mRNA序列。

根据一个实施方案，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物因此可作为“稳定化的mRNA序列”提供，即作为基本上抵抗体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)的mRNA。此种稳定化可受到例如本发明的mRNA的经修饰的磷酸骨架的影响。与本发明有关的骨架修饰是其中包含在mRNA中的核苷酸骨架的磷酸酯经化学修饰的修饰。就此而言可优选使用的核苷酸包含例如硫代磷酸酯修饰的磷酸骨架，优选地，磷酸骨架中包含的磷酸氧中的至少一者被硫原子代替。稳定化的mRNA还可包括例如：非离子磷酸酯类似物，例如膦酸烷酯和膦酸芳酯，其中带电膦酸酯的氧被烷基或芳基代替；或磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电氧残基以烷基化形式存在。此类骨架修饰通常包括但不限于来自由以下组成的组的修饰：甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(例如胞苷-5′-O-(1-硫代磷酸))。

在下文中，描述了具体的修饰，其优选能够“稳定化”如本文所定义的mRNA。

V.9.化学修饰

如本文所用，术语“mRNA修饰”可指代化学修饰，包括骨架修饰以及糖修饰或碱基修饰。

在此上下文中，如本文所定义的经修饰的mRNA(序列)可包含核苷酸类似物/修饰，例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明有关的骨架修饰是一种修饰，其中包含在含有本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物中的核苷酸骨架的磷酸酯经化学修饰。与本发明有关的糖修饰是包含如本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明有关的碱基修饰是包含mRNA序列的mRNA化合物的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在此上下文中，核苷酸类似物或修饰优选选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。

可并入包含如本文所述的mRNA序列的经修饰的mRNA化合物中的经修饰的核苷和核苷酸可在糖部分中经修饰。例如，2'羟基(OH)可用许多不同的“氧基”或“脱氧”取代基修饰或代替。“氧基”-2'羟基修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，—O(CH₂CH₂)_nCH₂CH₂OR；“经锁定的”核酸(LNA)，其中2'羟基通过例如亚甲基桥连接至同一核糖的4'碳；以及氨基(—O-氨基，其中氨基，例如NRR，可为烷氨基、二烷氨基、杂环基、芳氨基、二芳氨基、杂芳氨基或二杂芳氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。

“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如，NH2；烷氨基、二烷氨基、杂环基、芳氨基、二芳氨基、杂芳氨基、二杂芳氨基或氨基酸)；或者氨基可经由接头连接至糖上，其中接头包含原子C、N和O中的一者或多者。

糖基团还可含有一个或多个碳，所述一个或多个碳的立体化学构型与核糖中相应碳的立体化学构型相反。因此，经修饰的mRNA可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。

磷酸骨架可在经修饰的核苷和核苷酸中进一步经修饰，它们可并入包含如本文所述的mRNA序列的经修饰的mRNA化合物中。可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来修饰骨架的磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可包括用本文所述的经修饰的磷酸酯完全置换未经修饰的磷酸酯部分。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、膦酸烷酯或膦酸芳酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都由硫置换。磷酸酯接头也可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基-膦酸酯)置换连接氧来修饰。

可并入包含如本文所述的mRNA序列的经修饰的mRNA化合物中的经修饰的核苷和核苷酸可在核碱基部分中进一步经修饰。见于mRNA中的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。

例如，本文所述的核苷和核苷酸可在大沟面上进行化学修饰。在一些实施方案中，大沟化学修饰可包括氨基、硫醇基、烷基或卤基。

在本发明的特别优选实施方案中，核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰，其优选选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-氨基嘌呤-核苷-5'-三磷酸、2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸、4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-脱氮腺苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、或嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄苷-5'-三磷酸。特别优选的是用于碱基修饰的核苷酸，其选自由以下碱基修饰的核苷酸组成的组：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸和假尿苷-5'-三磷酸。

在一些实施方案中，经修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。

在一些实施方案中，经修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-假异胞苷、4-硫基-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫基-泽布拉林、2-硫基-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。

在其他实施方案中，经修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。

在其他实施方案中，经修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫基-鸟苷、6-硫基-7-脱氮-鸟苷、6-硫基-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫基-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫鸟苷、N2-甲基-6-硫鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫鸟苷。

在一些实施方案中，核苷酸可在大沟面上经修饰并且可包括用甲基或卤基置换尿嘧啶的C-5上的氢。在具体实施方案中，经修饰的核苷为5′-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5′-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷。

在其他具体实施方案中，经修饰的mRNA可包含选自以下的核苷修饰：6-氮杂-胞苷、2-硫基-胞苷、α-硫基-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫基-尿苷、4-硫基-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫基-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫基-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。

在本发明的一个非常具体的实施方案中，mRNA化合物不包含如上所述的碱基修饰。

根据另一个实施方案，包含如本文所定义的mRNA序列的经修饰的mRNA化合物可含有脂质修饰。此类脂质修饰的mRNA通常包含如本文所定义的mRNA。如本文所定义的此类脂质修饰的mRNA通常还包含至少一个与所述mRNA共价连接的接头，和至少一种与相应接头共价连接的脂质。或者，脂质修饰的mRNA包含至少一种如本文所定义的mRNA和至少一种与所述mRNA共价连接(无接头)的(双功能)脂质。根据第三替代方案，脂质修饰的mRNA包含如本文所定义的mRNA分子、至少一个与所述mRNA共价连接的接头和至少一种与相应接头共价连接的脂质，以及至少一种与所述mRNA共价连接(无接头)的(双功能)脂质。在此上下文中，特别优选地，脂质修饰存在于线性mRNA序列的末端处。

根据另一个实施方案，包含脂质纳米颗粒的mRNA包含含有mRNA序列的mRNA化合物，所述mRNA序列可通过修饰包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物的mRNA序列(优选至少一个编码区)的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量来修饰并由此稳定化。

在本发明的一个特别优选实施方案中，与相应野生型mRNA(即未经修饰的mRNA)的编码区的G/C含量相比，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物的编码区的G/C含量经修饰，特别是增加的。与由相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，由mRNA编码的氨基酸序列优选未经修饰。本发明的mRNA序列的此修饰是基于以下事实：待翻译的任何mRNA区域的序列对于所述mRNA的有效翻译而言很重要。因此，mRNA的组成和各种核苷酸的序列是重要的。特别是，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。根据本发明，与相应的野生型mRNA相比，mRNA的密码子因此改变，同时保留所翻译的氨基酸序列，使得它们包括增加量的G/C核苷酸。关于若干密码子编码同一个氨基酸的事实(所谓的遗传密码简并)，可确定最有利于稳定性的密码子(所谓的替代密码子使用)。与野生型序列相比，取决于待由mRNA编码的氨基酸，mRNA序列有多种修饰可能性。对于由排他地含有G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸，不需要密码子修饰。因此，Pro(CCC或CCG)、Arg(CGC或CGG)、Ala(GCC或GCG)和Gly(GGC或GGG)的密码子不需要修饰，因为不存在A或U。相反，含有A和/或U核苷酸的密码子可通过其他密码子的取代来修饰，所述其他密码子编码相同的氨基酸但不含A和/或U。这些的实例为：Pro的密码子可从CCU或CCA修饰为CCC或CCG；Arg的密码子可从CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG；Ala的密码子可从GCU或GCA修饰为GCC或GCG；Gly的密码子可从GGU或GGA修饰为GGC或GGG。在其他情况下，虽然不能从密码子中消除A或U核苷酸，但可通过使用含有较低A和/或U核苷酸含量的密码子来减少A和U的含量。这些的实例为：Phe的密码子可从UUU修饰为UUC；Leu的密码子可从UUA、UUG、CUU或CUA修饰为CUC或CUG；Ser的密码子可从UCU或UCA或AGU修饰为UCC、UCG或AGC；Tyr的密码子可从UAU修饰为UAC；Cys的密码子可从UGU修饰为UGC；His的密码子可从CAU修饰为CAC；Gin的密码子可从CAA修饰为CAG；Ile的密码子可从AUU或AUA修饰为AUC；Thr的密码子可从ACU或ACA修饰为ACC或ACG；Asn的密码子可从AAU修饰为AAC；Lys的密码子可从AAA修饰为AAG；Val的密码子可从GUU或GUA修饰为GUC或GUG；Asp的密码子可从GAU修饰为GAC；Glu的密码子可从GAA修饰为GAG；终止密码子UAA可修饰为UAG或UGA。另一方面，对于Met(AUG)和Trp(UGG)的密码子，则没有序列修饰的可能性。上面列出的取代可单独使用或以所有可能的组合使用，以增加本发明的mRNA序列与其特定野生型mRNA (即原始序列)相比的G/C含量。因此，例如，可将野生型序列中出现的Thr的所有密码子修饰为ACC(或ACG)。然而，优选地，例如，使用上述取代可能性的组合：

原始序列(野生型mRNA)中编码Thr的所有密码子取代为ACC(或ACG)，并且原始编码Ser的所有密码子取代为UCC(或UCG或AGC)；

原始序列中编码Ile的所有密码子取代为AUC并且

原始编码Lys的所有密码子取代为AAG并且

原始编码Tyr的所有密码子取代为UAC；

原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)并且原始编码Glu的所有密码子取代为GAG并且

原始编码Ala的所有密码子取代为GCC(或GCG)并且

原始编码Arg的所有密码子取代为CGC(或CGG)；

原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)并且原始编码Glu的所有密码子取代为GAG并且

原始编码Ala的所有密码子取代为GCC(或GCG)并且

原始编码Gly的所有密码子取代为GGC(或GGG)并且

原始编码Asn的所有密码子取代为AAC；

原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)并且原始编码Phe的所有密码子取代为UUC并且

原始编码Cys的所有密码子取代为UGC并且

原始编码Leu的所有密码子取代为CUG(或CUC)并且

原始编码Gin的所有密码子取代为CAG并且

原始编码Pro的所有密码子取代为CCC(或CCG)；等

优选地，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物的编码区的G/C含量增加了至少7％、更优选至少15％、特别优选至少20％，其编码如本文所定义的抗原或其片段或变体。根据一个具体实施方案，在编码如本文所定义的肽或蛋白质或其片段或变体或野生型mRNA序列的整个序列的区域中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％、95％或甚至100％的可取代密码子被取代，从而增加所述序列的GC/含量。在此上下文中，特别优选的是，将本发明的mRNA序列的G/C含量，优选根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区的G/C含量与野生型序列相比增加至最大(即，100％的可取代密码子)。根据本发明，本发明的mRNA序列的另一个优选修饰是基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，如果本发明的mRNA序列中存在所谓的“稀有密码子”的程度增加，则相应经修饰的mRNA序列的翻译程度明显低于密码子编码相对“频繁”的tRNA的情况。根据本发明，在本发明的经修饰的mRNA序列中，与野生型mRNA序列的相应区域相比，编码本文所定义的肽或蛋白质或其片段或变体的区域经修饰，以使得野生型序列的至少一个密码子(其编码在细胞中相对罕见的tRNA)交换为一个密码子，所述密码子编码在细胞中相对频繁的tRNA，并携带与相对罕见的tRNA相同的氨基酸。通过此修饰，本发明的mRNA的序列经修饰，以使得插入频繁出现的tRNA可用的密码子。换言之，根据本发明，通过此修饰，编码细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的所有密码子在每种情况下均可交换为编码tRNA的密码子，所述tRNA在细胞中相对常见并在每种情况下均携带与相对罕见的tRNA相同的氨基酸。本领域技术人员已知哪些tRNA在细胞中相对频繁地出现，而哪些相对罕见地出现；参看例如Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660-666。特别优选的是用于特定氨基酸的密码子(最频繁出现的tRNA)，例如使用在(人类)细胞中最频繁出现的tRNA的Gly密码子。根据本发明，特别优选的是，将在本发明的经修饰的mRNA序列中增加、特别是最大化的连续G/C含量与“频繁”密码子相关联，而不修饰由mRNA序列的编码区编码的蛋白质的氨基酸序列。这种优选实施方案允许提供本发明的特别有效翻译和稳定化(修饰)的mRNA序列。可使用WO02/098443中说明的计算机程序进行如上所述的本发明的经修饰的mRNA序列的测定(增加的G/C含量；tRNA的交换)——其公开内容以其全部范围包括在本发明中。使用此计算机程序，可借助于遗传密码或其简并性修饰任何所需mRNA序列的核苷酸序列，以使得结合使用编码细胞中尽可能频繁出现的tRNA的密码子，得到最大的G/C含量，与未经修饰的序列相比，由经修饰的mRNA序列编码的氨基酸序列优选不经修饰。或者，与原始序列相比，也可能仅修改G/C含量或仅修改密码子使用。Visual Basic 6.0中的原始码(所使用的开发环境：MicrosoftVisual Studio Enterprise 6.0with Servicepack 3)在WO02/098443中也有描述。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的mRNA序列的核糖体结合位点环境中的A/U含量与其相应野生型mRNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量相比是增加的。此修饰(核糖体结合位点周围增加的A/U含量)提高了核糖体与mRNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合(Kozak序列：SEQ ID NO:224307或SEQ ID NO:224308，AUG形成起始密码子)进而具有mRNA有效翻译的作用。根据本发明的另一个实施方案，本发明的mRNA序列可关于潜在失稳序列元件经修饰。特别是，与相应野生型mRNA相比，此mRNA序列的编码区和/或5'和/或3'非翻译区可经修饰，以使得它不含失稳序列元件，经修饰的mRNA序列的编码氨基酸序列与其相应的野生型mRNA相比优选不经修饰。众所周知，例如在真核mRNA序列中，会出现失稳序列元件(DSE)，信号蛋白与所述元件结合并在体内调节mRNA的酶促降解。为了进一步稳定化经修饰的mRNA序列，任选地在编码至少一种如本文所定义的肽或蛋白质或其片段或变体的区域中，与野生型mRNA的相应区域相比，可因此进行一种或多种此类修饰，使得在该处不含或基本上不含失稳序列元件。根据本发明，也可通过此类修饰从本发明的mRNA序列中消除存在于非翻译区(3'-和/或5'-UTR)中的DSE。此类失稳序列是例如富含AU的序列(AURES)，其出现在许多不稳定的mRNA的3'-UTR部分中(Caput等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986,83:1670至1674)。因此，与相应野生型mRNA相比，本发明的mRNA序列优选经修饰，以使得本发明的mRNA序列不包含此类失稳序列。这也适用于那些由可能的核酸内切酶识别的序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在编码转铁蛋白受体的基因的3'-UTR链段中(Binder等人,EMBO J.1994,13:1969至1980)。优选在本发明的mRNA序列中也去除这些序列基序。

根据一个优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，其中所述编码区包含以下或由以下组成：如在具有数字标识符<223>的序列表或分别在PCT/EP2016/075843(其通过引用并入本文)的表1-5或图20-24的“C列”中所公开的(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体，所述数字标识符<223>是如下开头：“衍生和/或修饰的CDS序列(opt1)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt2)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt3)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt4)”或“衍生和/或修饰的CDS序列(opt5)”。

根据一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

在另一个优选实施方案中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含RNA序列或由RNA序列组成，所述RNA序列与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％同一或具有此序列同一性。

根据一个特别优选实施方案，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含以下或由以下组成：与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体具有至少80％的序列同一性的RNA序列。

根据本发明，含有包含在包含本发明的脂质纳米颗粒的mRNA的mRNA中的mRNA序列的mRNA化合物的另一个优选修饰是基于以下发现：编码相同氨基酸的密码子通常以不同频率出现。根据本发明，在包含本发明的mRNA序列的经修饰的mRNA化合物中，与相应野生型mRNA的相应编码区相比，如本文所定义的编码区优选经修饰，以使得编码相同氨基酸的密码子的频率根据人类密码子使用，对应于所述密码子的天然出现频率。

例如，在由包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物的至少一个编码区编码的氨基酸序列中存在的氨基酸丙氨酸(Ala)的情况下，野生型编码区优选适于以下方式：密码子“GCC”以0.40的频率使用，密码子“GCT”以0.28的频率使用，密码子“GCA”以0.22的频率使用，并且密码子“GCG”以0.10的频率使用等。

根据一个优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自埃博拉病毒的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列的片段或变体。

在另一个优选实施方案中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含RNA序列或由RNA序列组成，所述RNA序列与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％同一或具有此序列同一性。

根据一个特别优选实施方案，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含以下或由以下组成：与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体具有至少80％的序列同一性的RNA序列。

如上所述，根据本发明，优选的是，编码细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的所有密码子交换成编码细胞中相对频繁并且在每种情况下均携带与相对罕见的tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。此种优化程序增加了密码子适应指数(CAI)并最终使CAI最大化。在本发明的上下文中，CAI增加或最大化的序列通常称为“密码子优化的”序列和/或CAI增加和/或最大化的序列。根据一个优选实施方案，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物包含至少一个编码区，其中所述编码区/序列是如本文所述经密码子优化的。更优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为1。

例如，在由根据本发明的RNA的至少一个编码序列编码的氨基酸序列中存在的氨基酸丙氨酸(Ala)的情况下，野生型编码序列以最频繁的人类密码子“GCC”总用于所述氨基酸的方式进行适应，或者对于氨基酸半胱氨酸(Cys)而言，野生型序列以最频繁的人类密码子“TGC”总用于所述氨基酸的方式进行适应，等等。

根据一个优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

在另一个优选实施方案中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含RNA序列或由RNA序列组成，所述RNA序列与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％同一或具有此序列同一性。

根据一个特别优选实施方案，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含以下或由以下组成：与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体具有至少80％的序列同一性的RNA序列。

根据另一个实施方案，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物可通过修改、优选增加mRNA序列(优选mRNA序列的编码区)的胞嘧啶(C)含量来修饰。

在本发明的一个特别优选实施方案中，与相应野生型mRNA，即未经修饰的mRNA的编码区的C含量相比，本发明的mRNA序列的编码区的C含量经修改，优选是增加的。与由相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，由本发明的mRNA序列的至少一个编码区编码的氨基酸序列优选不经修饰。

在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的mRNA序列经修饰以使得实现至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％、或至少90％理论上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量。

在其他优选实施方案中，靶mRNA野生型序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％密码子(它们是“胞嘧啶含量可优化的”)由比野生型序列中存在的密码子具有更高胞嘧啶含量的密码子置换。

在另一个优选实施方案中，野生型编码序列的一些密码子可另外经修饰，以使得细胞中相对罕见的tRNA的密码子由细胞中相对频繁的tRNA的密码子交换，条件是相对频繁tRNA的被取代的密码子携带与原始野生型密码子的相对罕见tRNA相同的氨基酸。优选地，相对罕见tRNA的所有密码子均由细胞中相对频繁tRNA的密码子置换，编码排他地由不含任何胞嘧啶的密码子编码的氨基酸的密码子除外，或由两个密码子编码的谷氨酰胺(Gln)除外，这两个密码子各自含有相同数量的胞嘧啶。

在本发明的另一个优选实施方案中，经修饰的靶mRNA经修饰以使得借助于密码子实现至少80％或至少90％理论上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量，所述密码子编码细胞中相对频繁的tRNA，其中氨基酸序列保持不变。

由于遗传密码的天然存在的简并性，超过一个密码子可编码特定的氨基酸。因此，20个天然存在的氨基酸中有18个由超过一个密码子，例如由2个密码子(例如Cys、Asp、Glu)、由3个密码子(例如Ile)、由4个密码子(例如A1、Gly、Pro)或由6个密码子(例如Leu、Arg、Ser)编码(其中Tryp和Met是例外)。然而，并非所有编码相同氨基酸的密码子在体内条件下都以相同频率使用。取决于每个单一生物，建立典型的密码子使用谱。

在本发明的上下文中使用的术语“胞嘧啶含量可优化的密码子”是指与编码相同氨基酸的其他密码子相比呈现出更低的胞嘧啶含量的密码子。因此，任何野生型密码子当可由编码相同氨基酸并在所述密码子内呈现出更高数量的胞嘧啶的另一密码子置换时，被视为胞嘧啶可优化的(C可优化的)。由野生型编码区内特定的C优化密码子对C可优化野生型密码子的任何此类取代增加了其总体C含量并反映了富含C的经修饰的mRNA序列。根据一个优选实施方案，本发明的mRNA序列，优选地，本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含以下或由以下组成：C最大化的mRNA序列，所述C最大化的mRNA序列含有所有潜在C优化密码子的C优化的密码子。因此，100％或所有理论上可置换的C可优化密码子优选在编码区的整个长度上由C优化密码子置换。

在此上下文中，胞嘧啶含量可优化的密码子是含有比编码相同氨基酸的其他密码子更少数量的胞嘧啶的密码子。

密码子GCG、GCA、GCU中的任一者编码氨基酸Ala，其可由编码相同氨基酸的密码子GCC交换，和/或

编码Cys的密码子UGU可由编码相同氨基酸的密码子UGC交换，和/或

编码Asp的密码子GAU可由编码相同氨基酸的密码子GAC交换，和/或

编码Phe的密码子UUU可由编码相同氨基酸的密码子UUC交换，和/或

编码Gly的密码子GGG、GGA、GGU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子GGC交换，和/或

编码His的密码子CAU可由编码相同氨基酸的密码子CAC交换，和/或

编码Ile的密码子AUA、AUU中的任一者可由密码子AUC交换，和/或

编码Leu的密码子UUG、UUA、CUG、CUA、CUU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子CUC交换，和/或

编码Asn的密码子AAU可由编码相同氨基酸的密码子AAC交换，和/或

编码Pro的密码子CCG、CCA、CCU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子CCC交换，和/或

编码Arg的密码子AGG、AGA、CGG、CGA、CGU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子CGC交换，和/或

编码Ser的密码子AGU、AGC、UCG、UCA、UCU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子UCC交换，和/或

编码Thr的密码子ACG、ACA、ACU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子ACC交换，和/或

编码Val的密码子GUG、GUA、GUU中的任一者可由编码相同氨基酸的密码子GUC交换，和/或

编码Tyr的密码子UAU可由编码相同氨基酸的密码子UAC交换。

在任何上述情况下，每个交换密码子的胞嘧啶数量增加1。编码区的所有非C优化密码子(对应于C可优化密码子)的交换产生C最大化的编码序列。在本发明的上下文中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区内的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的非C优化密码子由C优化密码子置换。

可能优选的是，对于一些氨基酸，由C优化密码子置换的C可优化密码子的百分比小于70％，而对于其他氨基酸，所置换密码子的百分比高于70％以满足C优化的总体百分比达编码区的所有C可优化野生型密码子的至少70％。

优选地，在本发明的C优化mRNA序列中，任何给定氨基酸的C可优化野生型密码子的至少50％由C优化密码子置换，例如，任何经修饰的富含C的mRNA序列优选在C可优化野生型密码子位置处含有至少50％、优选至少60％的C优化密码子，其编码上述氨基酸Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val和Tyr中的任一者。

在此上下文中，编码氨基酸的密码子无需任何进一步的选择过程即可使用，所述氨基酸不是胞嘧啶含量可优化的，但由至少两个密码子编码。然而，编码细胞(例如人类细胞)中相对罕见tRNA的野生型序列的密码子可交换为编码细胞中相对频繁tRNA的密码子，其中两者编码相同的氨基酸。因此，编码Glu的相对罕见密码子GAA可由编码相同氨基酸的相对频繁密码子GAG交换，和/或

编码Lys的相对罕见密码子AAA可由编码相同氨基酸的相对频繁密码子AAG交换，和/或

编码Gin的相对罕见密码子CAA可由编码相同氨基酸的相对频繁密码子CAG交换。

在此上下文中，仅由一个密码子编码的氨基酸Met(AUG)和Trp(UGG)保持不变。终止密码子不是胞嘧啶含量优化的，然而，相对罕见的终止密码子amber、ochre(UAA,UAG)可由相对频繁的终止密码子opal(UGA)交换。

上面列出的单个取代可单独使用，也可以所有可能的组合使用，以便与野生型mRNA序列相比，优化经修饰的mRNA序列的胞嘧啶含量。

因此，与相应野生型mRNA的编码区相比，至少一个本文所定义的编码序列可如此改变，使得氨基酸由至少两个或更多个密码子编码，其中一个密码子包含一个额外的胞嘧啶，此种密码子可由包含一个额外胞嘧啶的C优化密码子交换，其中与野生型序列相比，所述氨基酸优选未经改变。

根据一个优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的血球凝集素(HA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自甲型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自乙型流感病毒的神经氨糖酸苷酶(NA)的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

根据另一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含如本文所定义的mRNA序列，所述mRNA序列包含至少一个编码区，所述编码区编码至少一种源自狂犬病病毒的糖蛋白的抗原肽或蛋白质，其中所述编码区包含以下或由以下组成：(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体。

在另一个优选实施方案中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含RNA序列或由RNA序列组成，所述RNA序列与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％或甚至97％同一或具有此序列同一性。

根据一个特别优选实施方案，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物的至少一个编码区包含以下或由以下组成：与(经修饰的)RNA序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体具有至少80％的序列同一性的RNA序列。

根据一个特别优选实施方案，本发明提供了包含脂质纳米颗粒的mRNA，其中所述mRNA包含含有至少一个如本文所定义的编码区的mRNA序列，其中所述mRNA序列的至少一个编码区的G/C含量与相应野生型mRNA的相应编码区的G/C含量相比是增加的，和/或

其中所述mRNA序列的至少一个编码区的C含量与相应野生型mRNA的相应编码区的C含量相比是增加的，和/或

其中所述mRNA序列的至少一个编码区中的密码子适于人类密码子使用，其中密码子适应指数(CAI)在所述mRNA序列的至少一个编码区中优选是增加的或最大化的，

并且其中与由相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，由mRNA序列编码的氨基酸序列优选未经修饰。

根据本发明的另一个优选实施方案，如本文所定义的经修饰的mRNA序列可通过添加所谓的“5′-CAP结构”来修饰，所述结构优选稳定如本文所述的mRNA。5'-CAP是实体，通常是经修饰的核苷酸实体，它通常为成熟mRNA的5'端“加帽”。5'-CAP通常可由经修饰的核苷酸、特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5'-CAP经由5'-5'-三磷酸键连接至5'末端。5'-CAP可经甲基化，例如m7GpppN，其中N为携带5'-CAP的核酸的末端5'核苷酸，通常为mRNA的5'端。m7GpppN是5'-CAP结构，其天然存在于由聚合酶II转录的mRNA中，并且因此优选不被视为包含于在此上下文中经修饰的mRNA中的修饰。因此，本发明的经修饰的mRNA序列可包含m7GpppN作为5'-帽，但另外，经修饰的mRNA序列通常包含至少一个如本文所定义的其他修饰。

5′-CAP结构的其他实例包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4′,5′亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏-呋喃戊糖基核苷酸、非环3',4'-第二核苷酸、非环3,4-二羟基丁基核苷酸、非环3,5二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向无碱基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。这些经修饰的5'-CAP结构在此上下文中被视为至少一种修饰。

特别优选的经修饰的5′-CAP结构是cap1(m7G的相邻核苷酸的核糖的甲基化)、cap2(m7G下游第2核苷酸的核糖的额外甲基化)、cap3(m7G下游第3核苷酸的核糖的额外甲基化)、cap4(m7G下游第4核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物、经修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。因此，根据本发明的RNA优选包含5'-CAP结构。

根据另一个优选实施方案，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物可在3'末端含有聚A尾，其通常具有约10至200个腺苷核苷酸、优选约10至100个腺苷核苷酸、更优选约40至80个腺苷核苷酸或甚至更优选约50至70个腺苷核苷酸。

优选地，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物中的聚(A)序列通过RNA体外转录衍生自DNA模板。或者，聚(A)序列还可通过化学合成的常用方法在体外获得，而不必由DNA-祖细胞转录。此外，可使用可市售的多腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案，通过根据本发明的RNA的酶促多腺苷酸化生成聚(A)序列或聚(A)尾。

或者，如本文所述的mRNA任选地包含多腺苷酸化信号，其在本文中定义为通过特定蛋白质因子(例如切割和多腺苷酸化特异性因子(CPSF)、切割刺激因子(CstF)、切割因子I和II(CF I和CF II)、聚(A)聚合酶(PAP))将多腺苷酸化传递至(所转录的)RNA的信号。在此上下文中，优选为包含NN(U/T)ANA共有序列的共有多腺苷酸化信号。在一个特别优选方面，多腺苷酸化信号包含以下序列之一：AA(U/T)AAA 或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中，而胸苷通常存在于DNA中)。

根据另一个优选实施方案，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物可在3'末端含有聚(C)尾，其通常具有约10至200个胞嘧啶核苷酸、优选约10至100个胞嘧啶核苷酸、更优选约20至70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选约20至60或甚至10至40个胞嘧啶核苷酸。

在一个优选实施方案中，包含mRNA序列的mRNA化合物优选在5'-至3'-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码区，其编码至少一种抗原肽或蛋白质，

c)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约125个腺苷、并且最优选约85至约95个腺苷，并且在某些实施方案中95个腺苷；

d)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个更优选实施方案中，mRNA序列优选在5'-至3'-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质源自流感或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，

c)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约95个腺苷，并且在某些实施方案中95个腺苷；

d)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个特别优选实施方案中，mRNA序列优选在5′-至3′-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，所述编码区优选包含以下或由以下组成：如具有数字标识符<223>的序列表中所公开的核酸序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体组成，所述序列是如下开头：“衍生和/或修饰的CDS序列(wt)”或“衍生和/或修饰的CDS序列(opt1)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt2)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt3)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt4)”或“衍生和/或修饰的CDS序列(opt5)”，

c)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约105个腺苷，并且在某些实施方案中97至101个腺苷；

d)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个优选实施方案中，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物包含至少一个5'-或3'-UTR元件。在此上下文中，UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自任何天然存在基因的5'-或3'-UTR，或源自基因的5'-或3'-UTR的片段、同源物或变体。优选地，根据本发明使用的5'-或3'-UTR元件与本发明的mRNA序列的至少一个编码区为异源的。即使源自天然存在的基因的5'-或3'-UTR元件是优选的，在本发明的上下文中也可使用合成工程化UTR元件。

术语“3'-UTR元件”通常是指核酸序列，其包含源自3'-UTR或源自3'-UTR的变体的核酸序列或由源自3'-UTR或源自3'-UTR的变体的核酸序列组成。在本发明的意义上的3'-UTR元件可代表RNA(优选mRNA)的3'-UTR。因此，在本发明的意义上，优选地，3'-UTR元件可为RNA(优选mRNA)的3'-UTR，或者其可为RNA的3'-UTR的转录模板。因此，3'-UTR元件优选是对应于RNA的3'-UTR，优选对应于mRNA例如通过经基因工程化载体构建体的转录获得的mRNA的3'-UTR的核酸序列。优选地，3'-UTR元件实现3'-UTR的功能或编码实现3'-UTR的功能的序列。

优选地，至少一个3'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因的3'-UTR，或源自脊索动物基因、优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因的3'-UTR的变体。

优选地，包含本发明的mRNA序列的mRNA化合物包含3'-UTR元件，其可源自与具有延长半衰期(由此提供稳定的mRNA)的mRNA相关的基因，例如，如下文定义和描述的3'-UTR元件。优选地，3'-UTR元件是源自基因的3'-UTR或所述基因的同源物、片段或变体的核酸序列，所述基因优选编码稳定的mRNA。

在一个特别优选实施方案中，3'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自选自由以下组成的组的基因的3′-UTR：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因，例如胶原蛋白α1(I)基因；或源自选自由以下组成的组的基因的3′-UTR的变体：白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因，例如根据专利申请WO2013/143700(其公开内容通过引用并入本文)的SEQ ID NO:1369-1390的胶原蛋白α1(I)基因；或源自所述基因的同源物、片段或变体。在一个特别优选实施方案中，3'-UTR元件包含以下或由以下组成：源自白蛋白基因、优选脊椎动物白蛋白基因、更优选哺乳动物白蛋白基因的3'-UTR的核酸序列。

术语“核酸序列，其衍生自[...]基因的3′-UTR”优选是指核酸序列，所述核酸序列是基于[...]基因的3′-UTR序列或其部分，例如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因例如胶原蛋白α1(I)基因、优选白蛋白基因的3′-UTR或其部分。此术语包括对应于基因的整个3'-UTR序列(即全长3'-UTR序列)的序列，以及对应于基因的3'-UTR序列的片段的序列，所述基因是例如白蛋白基因，α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因，例如胶原蛋白α1(I)基因，优选为白蛋白基因。

术语“核酸序列，其衍生自[...]基因的3′-UTR的变体”优选是指核酸序列，所述核酸序列是基于基因的3′-UTR序列的变体，例如白蛋白基因、α-球蛋白基因、β-球蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因例如胶原蛋白α1(I)基因的3′-UTR的变体，或基于如上所述的其部分。此术语包括对应于基因的3'-UTR的变体的整个序列(即基因的全长变异3'-UTR序列)的序列，以及对应于基因的变异3'-UTR序列的片段的序列。在此上下文中，片段优选由对应于全长变异3'-UTR中的连续核苷酸段的连续核苷酸段组成，所述连续核苷酸段代表至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％的全长变异3'-UTR。在本发明的意义上，变体的此类片段优选为如本文所述的变体的功能片段。

根据一个优选实施方案，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物包含5'-CAP结构和/或至少一个3'-非翻译区元件(3'-UTR元件)，优选如本文所定义。更优选地，RNA还包含如本文所定义的5'-UTR元件。

在一个优选实施方案中，包含mRNA序列的mRNA化合物优选在5'-至3'-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码区，其编码至少一种抗原肽或蛋白质，

c)任选地3'-UTR元件，优选包含源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列组成；

d)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约105个腺苷，并且在某些实施方案中，97至101个腺苷；

e)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个优选实施方案中，mRNA序列优选在5'-至3'-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质优选源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，

c)任选地3'-UTR元件，优选包含源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列组成；

d)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约105个腺苷，并且在某些实施方案中97至101个腺苷；

e)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个特别优选实施方案中，mRNA序列优选在5′-至3′-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppAm(Cap1)和m7GpppA(Cap0)；

b)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质优选源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，或这些序列中的任一者的片段或变体，

c)任选地3'-UTR元件，优选包含源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列或由源自α球蛋白基因、其同源物、片段或变体的核酸序列组成；

d)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约105个腺苷，并且在某些实施方案中97至101个腺苷；

e)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

在一个特别优选实施方案中，包含mRNA序列的至少一种mRNA化合物包含至少一个5′-非翻译区元件(5′-UTR元件)。优选地，至少一个5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自TOP基因的5'-UTR或源自TOP基因的5'-UTR的片段、同源物或变体。

特别优选的是，5'-UTR元件不包含如上所定义的TOP基序或5'-TOP。

在一些实施方案中，源自TOP基因的5'-UTR的5'-UTR元件的核酸序列在其3'端处以位于其所来源的基因或mRNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸终止。因此，5'-UTR元件不包含蛋白质编码区的任何部分。因此，优选地，至少一个mRNA序列的唯一蛋白质编码部分由编码区提供。

源自TOP基因的5'-UTR的核酸序列优选源自真核TOP基因、优选植物或动物TOP基因、更优选脊索动物TOP基因、甚至更优选脊椎动物TOP基因、最优选哺乳动物TOP基因，例如人类TOP基因。

例如，5'-UTR元件优选选自包含核酸序列或由核酸序列组成的5'-UTR元件。

在一个优选实施方案中，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物的5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列来源于从核苷酸位置5(即位于序列中的位置5处的核苷酸)延伸至紧邻起始密码子5'的核苷酸位置(位于序列的3'端)的核酸序列。

在一个特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自编码核糖体蛋白的TOP基因的5'-UTR或源自编码核糖体蛋白的TOP基因的5'-UTR的变体。例如，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138和1284-1360中的任一者的核酸序列的5′-UTR、如本文所述的相应RNA序列、其同源物或其变体，优选缺乏5′-TOP基序。如上所述，从位置5延伸至紧邻ATG 5'的核苷酸(位于序列的3'端)的序列对应于所述序列的5'-UTR。

优选地，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5'-UTR或源自编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5'-UTR的同源物或变体。例如，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自根据PCT专利申请公开WO2013/143700(其通过引用并入本文)的SEQ ID NO:67、259、1284-1318、1344、1346、1348-1354、1357、1358、1421和1422中的任一者的核酸序列的5′-UTR、如本文所述的相应RNA序列、其同源物或其变体，优选缺乏5′-TOP基序。

在一个特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自核糖体大蛋白32基因、优选源自脊椎动物核糖体大蛋白32(L32)基因、更优选源自哺乳动物核糖体大蛋白32(L32)基因、最优选源自人类核糖体大蛋白32(L32)基因的5'-UTR，或源自核糖体大蛋白32基因、优选源自脊椎动物核糖体大蛋白32(L32)基因、更优选源自哺乳动物核糖体大蛋白32(L32)基因、最优选源自人类核糖体大蛋白32(L32)基因的5'UTR的变体，其中优选地，5'-UTR元件不包含所述基因的5'-TOP。

因此，在一个特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与专利申请WO2013/143700)的相应SEQ ID NO:1368或优选与相应RNA序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5′-UTR元件包含核酸序列的片段或由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％的同一性，其中优选地，所述片段如上所述，即为代表全长5'-UTR的至少20％等的连续核苷酸段。优选地，所述片段的长度为至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多。优选地，所述片段是如本文所述的功能片段。

在一些实施方案中，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物包含5'-UTR元件，所述5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自脊椎动物TOP基因，例如哺乳动物，例如人类TOP基因的5'-UTR，所述基因选自RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB或其同源物或变体，其中优选地，5'-UTR元件不包含TOP基序或所述基因的5'-TOP，并且其中任选地5'-UTR元件在其5'端以位于5'末端寡嘧啶束(TOP)下游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸开始，并且其中进一步任选地，源自TOP基因的5′-UTR的5′-UTR元件在其3′端以位于其所源自的基因的起始密码子(A(U/T)G)上游的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处的核苷酸终止。

在其他特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列源自以下基因的5'-UTR：核糖体大蛋白32基因(RPL32)、核糖体大蛋白35基因(RPL35)、核糖体大蛋白21基因(RPL21)、ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单位1、心肌(ATP5A1)基因、羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、雄激素诱导的1基因(AIG1)、细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或N-酰基神经鞘胺醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体，优选来自脊椎动物核糖体大蛋白32基因(RPL32)、脊椎动物核糖体大蛋白35基因(RPL35)、脊椎动物核糖体大蛋白21基因(RPL21)、脊椎动物ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单位1、心肌(ATP5A1)基因、脊椎动物羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、脊椎动物雄激素诱导的1基因(AIG1)、脊椎动物细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或脊椎动物N-酰基神经鞘胺醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体，更优选来自哺乳动物核糖体大蛋白32基因(RPL32)、核糖体大蛋白35基因(RPL35)、核糖体大蛋白21基因(RPL21)、哺乳动物ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单位1、心肌(ATP5A1)基因、哺乳动物羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、哺乳动物雄激素诱导的1基因(AIG1)、哺乳动物细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或哺乳动物N-酰基神经鞘胺醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体，最优选来自人类核糖体大蛋白32基因(RPL32)、人类核糖体大蛋白35基因(RPL35)、人类核糖体大蛋白21基因(RPL21)、人类ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单位1、心肌(ATP5A1)基因、人类羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、人类雄激素诱导的1基因(AIG1)、人类细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或人类N-酰基神经鞘胺醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)或其变体，其中优选地，5′-UTR元件不包含所述基因的5′-TOP。

因此，在一个特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:1368或SEQ ID NO:1412-1420的核酸序列或相应RNA序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5′-UTR元件包含核酸序列的片段或由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:1368或SEQ ID NO:1412-1420的核酸序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上所述，即为代表全长5'-UTR的至少20％等的连续核苷酸段。优选地，所述片段的长度为至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多。优选地，所述片段是如本文所述的功能片段。

因此，在一个特别优选实施方案中，5'-UTR元件包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与根据SEQ ID NO:1(缺乏5′末端寡嘧啶束的ATP5A1的5′-UTR：GCGGCTCGGCCATGTCCCAGTACAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCGGAGTAACTGCAAAG；对应于专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:224289)的核酸序列或优选地与相应的RNA序列(SEQ ID NO:224290)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5′-UTR元件包含核酸序列的片段或由核酸序列的片段组成，所述核酸序列的片段与根据SEQ ID NO:224289的核酸序列或更优选与相应的RNA序列(SEQ ID NO:224290)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中优选地，所述片段如上所述，即为代表全长5'-UTR的至少20％等的连续核苷酸段。优选地，所述片段的长度为至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多。优选地，所述片段是如本文所述的功能片段。

优选地，至少一个5'-UTR元件与至少一个3'-UTR元件协同作用以增加如上所述的至少一个mRNA序列的蛋白质产量。

根据一个优选实施方案，包含根据本发明的mRNA序列的mRNA化合物优选在5'-至3'-方向上包含：

a)5′-CAP结构，优选m7GpppN；

b)任选地5′-UTR元件，其优选包含源自TOP基因的5′-UTR的核酸序列或由源自TOP基因的5′-UTR的核酸序列组成，更优选包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO:224287的核酸序列的RNA序列(如SEQ ID NO:224288所示)或其同源物、片段或变体；

c)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，所述抗原肽或蛋白质优选源自流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质或其片段或变体，优选包含以下或由以下组成：如具有数字标识符<223>的序列表或分别在PCT/EP2016/075843(其通过引用并入本文)的表1-5或图20-24的“B列”或“C列”、SEQ ID NO:32013-64024或SEQ ID NO:64025-224084中所公开的核酸序列中的任一者或这些序列中的任一者的片段或变体，所述数字标识符<223>是如下开头：“衍生和/或修饰的CDS序列(wt)”或“衍生和/或修饰的CDS序列(opt1)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt2)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt3)”、“衍生和/或修饰的CDS序列(opt4)”或“衍生和/或修饰的CDS序列(opt5)”，

d)任选地3'-UTR元件，其优选包含源自提供稳定mRNA的基因的核酸序列或由源自提供稳定mRNA的基因的核酸序列组成，所述核酸序列优选包含以下或由以下组成：核酸序列的相应RNA序列或其同源物、片段或变体；

e)任选地聚(A)序列，优选包含约50至约250个腺苷、更优选约75至约100个腺苷、并且最优选约85至约105个腺苷，并且在某些实施方案中97至101个腺苷；以及

f)任选地聚(C)序列，优选包含约10至约100个胞嘧啶、更优选约20至约50个胞嘧啶、并且最优选约25至约35个腺苷胞嘧啶，并且在某些实施方案中30个胞嘧啶。

信号肽

根据另一个特别优选实施方案，根据本发明的mRNA序列可另外或替代地编码分泌信号肽。此类信号肽是通常呈现出约15至30个氨基酸的长度并且优选位于所编码肽的N末端的序列，但不限于此。如本文所定义的信号肽优选允许由至少一个mRNA序列编码的抗原、抗原性蛋白质或抗原性肽转运至确定的细胞区室中，优选转运至细胞表面、内质网(ER)或胞内体-溶酶体区室中。如本文所定义的分泌信号肽序列的实例包括但不限于经典或非经典MHC分子的信号序列(例如，MHC I和II分子的信号序列，例如，MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列)、如本文所定义的细胞因子或免疫球蛋白的信号序列、如本文所定义的免疫球蛋白或抗体的恒定链的信号序列、Lamp1、Tapasin、Erp57、Calretikulin、Calnexin以及其他膜相关蛋白或与内质网(ER)或胞内体-溶酶体区室相关的蛋白质的信号序列。最优选地，根据本发明可使用MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列。例如，优选使用源自HLA-A的信号肽以促进如本文所定义的编码抗原或其片段或变体的分泌。更优选地，HLA-A信号肽与如本文所定义的编码抗原或其片段或变体融合。

mRNA的产生

可使用本领域已知的任何方法制备根据本发明的mRNA，包括合成方法，例如固相RNA合成；以及体外方法，例如RNA体外转录反应，特别是如实施例中所述。

如所述，根据本发明的mRNA化合物被封装于脂质纳米颗粒中或与脂质纳米颗粒结合。

本发明的佐剂

适合的佐剂此外可选自具有式GIXmGn的核酸，其中：G为鸟苷、尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物；X为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；I为1至40的整数，其中当I＝1时，G为鸟苷或其类似物，当I>1时，至少50％的核苷酸为鸟苷或其类似物；m为整数并且为至少3；其中当m＝3时，X为尿嘧啶或其类似物，当m>3时，出现至少3个连续尿嘧啶或尿嘧啶的类似物；n为1至40的整数，其中当n＝1时，G为鸟苷或其类似物，当n>1时，至少50％的核苷酸为鸟苷或其类似物，或下式的核酸：(NuGIXmGnNv)a，其中：G为鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，优选为鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；X为鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物，优选为尿苷(尿嘧啶)或其类似物；N为具有约4至50、优选约4至40、更优选约4至30或4至20个核酸的长度的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；a为1至20、优选1至15、最优选1至10的整数；I为1至40的整数，其中当I＝1时，G为鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当I>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)为鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；m为整数并且为至少3；其中当m＝3时，X为尿苷(尿嘧啶)或其类似物，并且当m>3时，出现至少3个连续尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物；n为1至40的整数，其中当n＝1时，G为鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当n>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)为鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；u、v可彼此独立地为0至50的整数，优选地其中当u＝0时，v>1，或当v＝0时，u>1；其中式(NuGIXmGnNv)a的核酸分子具有至少50个核苷酸、优选至少100个核苷酸、更优选至少150个核苷酸、甚至更优选至少200个核苷酸并且最优选至少250个核苷酸的长度。

在某些实施方案中，本发明的可离子化脂质具有佐剂效果。在特定实施方案中，本发明的可离子化脂质也可充当佐剂。

在一些实施方案中，佐剂为例如：montanide ISA-51(Seppic Inc.,Fairfield,N.J.,United States of America)；QS-21(Aquila Biopharmaceuticals.Inc.,Framingham,Mass.,United States of America)；Arlacel A；油酸(oeleic acid)；破伤风辅助肽(例如但不限于QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:2)和/或AQYIKANSKFIGITEL(SEQ IDNO:3)；GM-CSF；环磷酰胺；卡介苗(BCG)；短小棒状杆菌(Corynbacterium parvum)；左旋咪唑、阿齐美宗(azimezone)；异丙肌苷；二硝基氯苯(DNCB)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；弗氏佐剂(Freunds adjuvant)(完全和不完全)；矿物凝胶；氢氧化铝(Alum)；溶血卵磷脂；普朗尼克多元醇；多聚阴离子；肽；油乳液；核酸(例如但不限于可溶性链RNA；dsRNA)二硝基酚；白喉毒素(DT)；toll样受体(TLR；例如但不限于TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9)激动剂(包括但不限于内毒素，例如脂多糖(LPS)；单磷酰基脂质A(MPL)；和/或聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC/HILTONOL.RTM.；Oncovir,Inc.,Washington,D.C.,United States of America)；IMO-2055；葡萄吡喃糖苷脂质A(GLA)；QS-21(从皂树树皮中提取的皂苷，也称为皂树皮树或Soapbark)；瑞喹莫德(resiquimod)(TLR7/8激动剂)；CDX-1401(一种融合蛋白，由全人类单克隆抗体组成，对与NY-ESO-1肿瘤抗原连接的树突状细胞受体DEC-205具有特异性)；Juvaris的阳离子脂质-DNA复合物；伐克沙星(Vaxfectin)；及其组合。在一个实施方案中，使用源自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595的异质单磷酰脂质A(MPL)的佐剂被用于诱导针对动物和人类疫苗中的异源蛋白质的Th-1型免疫反应。示例性单磷酰基脂质A型佐剂如下所示：

其他适合的佐剂还可选自具有下式的核酸：CIXmCn，其中：C为胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；X为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；I为1至40的整数，其中当I＝1时，C为胞嘧啶或其类似物，当I>1时，至少50％的核苷酸为胞嘧啶或其类似物；m为整数并且为至少3；其中当m＝3时，X为尿嘧啶或其类似物，当m>3时，出现至少3个连续尿嘧啶或尿嘧啶的类似物；n为1至40的整数，其中当n＝1时，C为胞嘧啶或其类似物，当n>1时，至少50％的核苷酸为胞嘧啶或其类似物。

在此上下文中，WO2008/014979和WO2009/095226的公开内容也通过引用并入本文。

在另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其是基于包含根据本发明的脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一种mRNA化合物，所述mRNA化合物包含含有如本文所定义的编码区的mRNA序列。根据本发明的疫苗优选为如本文所定义的(药物)组合物。

因此，根据本发明的疫苗是基于与本文所述的(药物)组合物相同的组分。就此而言，可参考如本文所提供的(药物)组合物的描述。优选地，根据本发明的疫苗包含至少一种包含脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒包含至少一个如本文所定义的mRNA序列，和药学上可接受的载体。在其中疫苗包含封装于包含脂质纳米颗粒的mRNA中的超过一个mRNA序列(例如多个根据本发明的RNA序列，其中各自优选编码不同的抗原肽或蛋白质)的实施方案中，疫苗可以物理上分开的形式提供并且可通过单独施用步骤施用。根据本发明的疫苗可对应于如本文所述的(药物)组合物，尤其是当mRNA序列由一种单一组合物提供时。然而，本发明疫苗也可在物理上分开提供。例如，在其中疫苗包含超过一个封装于包含如本文所定义的脂质纳米颗粒的mRNA中的mRNA序列/种类的实施方案中，可提供这些RNA种类以使得提供例如两种、三种、四种、五种或六种单独的组合物，所述组合物各自可含有至少一个mRNA种类/序列(例如，三个不同的mRNA种类/序列)，各自编码不同的抗原肽或蛋白质，它们可经组合或可不经组合。本发明疫苗也可为至少两种不同组合物的组合，每种组合物包含至少一种编码如本文所定义的抗原肽或蛋白质中的至少一者的mRNA。或者，疫苗可作为至少一种mRNA，优选至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种mRNA的组合提供，每种mRNA编码本文所定义的抗原肽或蛋白质中的一者。疫苗可经组合以在其使用之前提供一种单一组合物，或者可使用它以使得需要超过一次施用来施用编码封装于包含如本文所定义的脂质纳米颗粒的mRNA中的任何抗原肽或蛋白质的不同mRNA序列/种类。如果疫苗含有至少一种包含脂质纳米颗粒的mRNA，所述脂质纳米颗粒通常包含至少两个mRNA序列，所述mRNA序列编码本文所定义的抗原组合，则所述疫苗可例如通过单次施用(组合所有mRNA种类/序列)、通过至少两次单独施用进行施用。因此，编码至少一种抗原肽或蛋白质或如本文所定义的抗原(和任选地其他抗原)的任何组合的单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA的任何组合是作为单独的实体(含有一种mRNA种类)或经组合的实体(含有超过一种mRNA种类)提供，其应理解为根据本发明的疫苗。根据本发明疫苗的一个特别优选实施方案，至少一种抗原，优选由本发明组合物整体编码的至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种抗原的如本文所定义的组合是作为单独的(单顺反子)mRNA提供，将其单独施用。

对于根据本发明的(药物)组合物，疫苗实体可以液体和或干燥(例如冻干)形式提供。它们可含有其他组分，特别是允许其医药用途的其他组分。疫苗或(药物)组合物可例如另外含有药学上可接受的载体和/或其他辅助物质和添加剂和/或佐剂。

疫苗或(药物)组合物通常包含安全且有效量的如本文所定义的根据本发明的mRNA化合物，其编码如本文所定义的抗原肽或蛋白质或其片段或变体或抗原的组合，它们封装于脂质纳米颗粒中和/或与脂质纳米颗粒结合。如本文所用，“安全且有效量”意指足以显著诱导癌症或与癌症相关的疾病或病症的积极缓解的mRNA的量。然而，与此同时，“安全且有效量”足够小以避免严重的副作用，也就是说，允许优势与风险之间存在合理的关系。这些限制的判定通常在合理的医学判断范围内。关于本发明的疫苗或(药物)组合物，表述“安全且有效量”优选意指适于以一定方式刺激适应性免疫系统的mRNA(和由此所编码抗原)的量，所述方式不实现过度或破坏性免疫反应，但优选地还没有低于可测量水平的此类免疫反应。此外，可依赖于mRNA例如单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子mRNA的类型来选择本文所定义的(药物)组合物或疫苗的mRNA的此类“安全且有效量”，因为双顺反子mRNA或甚至多顺反子mRNA可能导致所编码抗原的表达明显高于使用等量单顺反子mRNA。如上所定义的(药物)组合物或疫苗的mRNA的“安全且有效量”将进一步根据待治疗的特定疾患以及待治疗患者的年龄和身体状况、疾患的严重程度、治疗持续时间、伴随疗法的性质、所用的特定药学上可接受的载体的性质以及类似因素在随行医生的知识和经验范围内变化。根据本发明的疫苗或组合物可根据本发明用于人类以及兽医医学目的，作为药物组合物或作为疫苗。

在一个优选实施方案中，包含根据本发明的(药物)组合物、疫苗或分装试剂盒的脂质纳米颗粒的mRNA是以冻干形式提供。优选地，包含脂质纳米颗粒的冻干mRNA在施用之前在合适的缓冲液中重构，所述缓冲液有利地基于水性载体，例如林格氏-乳酸盐溶液、林格氏溶液、磷酸盐缓冲溶液。在一个优选实施方案中，根据本发明的(药物)组合物、疫苗或分装试剂盒包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种mRNA化合物，其可作为单一种类的脂质纳米颗粒提供，或针对每个LNP种类单独提供，任选地以冻干形式(任选地与至少一种其他添加剂一起)并且优选在它们使用之前在合适的缓冲液(例如林格氏-乳酸盐溶液)中单独重构，以允许单独施用每一种(单顺反子)mRNA。

根据本发明的疫苗或(药物)组合物通常可包含药学上可接受的载体。如本文所用，表述“药学上可接受的载体”优选包括本发明疫苗的液体或非液体基质。如果本发明疫苗以液体形式提供，则载体将为水，通常为无热原水；等渗盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。特别是对于本发明疫苗的注射，可使用水或优选缓冲液，更优选水性缓冲液，其含有钠盐，优选至少50mM的钠盐；钙盐，优选至少0.01mM的钙盐；和任选地钾盐，优选至少3mM的钾盐。根据一个优选实施方案，钠盐、钙盐和任选地钾盐可以如下形式存在：其卤化物形式，例如氯化物、碘化物或溴化物；其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式。不限于此，钠盐的实例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na₂CO₃、NaHCO₃、Na₂SO₄，任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K₂CO₃、KHCO₃、K₂SO₄，并且钙盐的实例包括例如CaCl₂)、CaI₂、CaBr₂、CaCO₃、CaSO₄、Ca(OH)₂。此外，上述阳离子的有机阴离子可包含在缓冲液中。根据一个更优选实施方案，适合于如上所定义的注射目的的缓冲液可含有选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂))和任选地氯化钾(KCl)的盐，其中除了氯化物之外还可存在其他阴离子。CaCl₂)也可用另一种盐如KCl来代替。通常，注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)、至少3mM氯化钾(KCl)和至少0.01mM氯化钙(CaCl₂))的浓度存在。注射缓冲液相对于特定参考介质可为高渗的、等渗的或低渗的，即相对于特定的参考介质，缓冲液可具有更高、相同或更低的盐含量，其中优选地，可使用此种浓度的上述盐，其不会因渗透或其他浓度效应导致细胞损伤。参考介质为例如在“体内”方法中出现的液体，例如血液、淋巴液、胞质液或其他体液；或例如液体，其可在“体外”方法中用作参考介质，例如常见的缓冲液或液体。此种常见缓冲液或液体是本领域技术人员已知的。

然而，还可使用一种或多种相容固体或液体填充剂或稀释剂或封装化合物，它们适于向人施用。如本文所用，术语“相容的”意指本发明疫苗的成分能够以不发生相互作用的方式与如本文所定义的根据本发明的mRNA混合，这会基本上降低在典型使用条件下本发明疫苗的药学效用。药学上可接受的载体、填充剂和稀释剂当然必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适合向待治疗的人施用。可用作药学上可接受的载体、填充剂或其成分的化合物的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋葡萄糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；牛脂；固体助滑剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可豆油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；藻酸。

药学上可接受的载体的选择原则上由根据本发明的药物组合物或疫苗的施用方式决定。组合物或疫苗可例如全身或局部施用。全身施用途径通常包括例如透皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部施用途径通常包括例如局部施用途径以及皮内、透皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内和舌下注射。更优选地，本发明的组合物或疫苗可通过皮内、皮下或肌内途径施用，优选通过注射施用，所述注射可为无针注射和/或针注射。因此，组合物/疫苗优选以液体或固体形式配制。待施用的本发明疫苗或组合物的合适量可通过常规实验，例如通过使用动物模型确定。此类模型包括但不限于兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人类灵长类动物模型。优选的注射用单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。此类溶液的pH值应调节至生理上可耐受的pH，例如约7.4。合适的注射用载体包括水凝胶、用于控制或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原蛋白基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括适用于洗剂、乳膏、凝胶等的那些载体。如果本发明的组合物或疫苗将要口服施用，则片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体是现有技术中熟知的。其选择将取决于例如味道、成本和可储存性的次要考虑因素，它们对于本发明的目的并不关键，并且本领域技术人员可以毫无困难地进行。

本发明的疫苗或组合物可另外含有一种或多种辅助物质以进一步增强免疫原性。由此优选地实现本发明组合物中所含的mRNA与辅助物质的协同作用，所述辅助物质可任选地与如上所述的本发明疫苗或组合物共同配制(或单独配制)。取决于各种类型的辅助物质，不同机制可在此方面中发挥作用。例如，允许树突状细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。通常，可能使用以“危险信号”(LPS、GP96等)或细胞因子(例如GM-CFS)的方式影响免疫系统的任何剂作为辅助物质，它们允许由根据本发明的免疫刺激性佐剂产生的免疫反应以靶向方式得到增强和/或受到影响。特别优选的辅助物质是细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，除了由所编码的至少一种抗原诱导适应性免疫反应之外，它们还促进先天性免疫反应，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子如hGH。优选地，此类免疫原性增强剂或化合物是单独提供(不与本发明的疫苗或组合物共配制)并单独施用的。

可包含在本发明疫苗或组合物中的其他添加剂是乳化剂，例如Tween；润湿剂，例如月桂基硫酸钠；着色剂；呈味剂、药物载体；制片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。

本发明疫苗或组合物还可另外含有任何其他化合物，已知其由于对人类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和力，或由于对鼠类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激性。

在此上下文中，可添加至本发明疫苗或组合物中的另一类化合物可为CpG核酸，特别是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可为单链CpG-DNA(ss CpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选呈CpG-RNA形式，更优选呈单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)形式。CpG核酸优选含有至少一个或多个(促有丝分裂)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。根据第一个优选替代方案，这些序列中包含的至少一个CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)是未甲基化的。任选地包含在这些序列中的所有其他胞嘧啶或鸟嘌呤可为甲基化或未甲基化的。然而，根据另一个优选替代方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以甲基化形式存在。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，特别是分装试剂盒，其包含含有如本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物和至少一种如上所定义的根据式(I)、(II)、(III)或(IV)的脂质。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含如上所定义的脂质纳米颗粒或含有如上所定义的脂质纳米颗粒的(药物)组合物，和/或根据本发明的疫苗，任选地用于溶解的液体媒介物和任选地具有包含脂质纳米颗粒的mRNA、组合物和/或疫苗的施用和剂量信息的技术说明书。技术说明书可含有关于包含脂质纳米颗粒的mRNA、组合物和/或疫苗的施用和剂量的信息。此类试剂盒(优选分装试剂盒)可应用于例如任何上述应用或用途，优选用于根据本发明的脂质纳米颗粒(用于制备本发明的药剂，优选疫苗)在治疗或预防流感病毒感染或与其相关的疾病或病症中的用途。所述试剂盒还可应用于本文所定义的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗(用于制备本发明的疫苗)在治疗或预防流感病毒感染或与其相关的疾病或病症中的用途，其中脂质纳米颗粒、组合物和/或疫苗可能能够在如上所定义的哺乳动物中诱导或增强免疫反应。此类试剂盒可进一步应用于如本文所定义的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗(用于制备本发明的疫苗)在用于调节、优选用于引发、例如诱导或增强如上所定义的哺乳动物中的免疫反应中的用途，并且优选用于支持流感病毒感染或与其相关的疾病或病症的治疗或预防。分装试剂盒作为试剂盒的特殊形式可在试剂盒的不同部分中包含一种或多种相同或不同的如本文所述的组合物和/或一种或多种相同或不同的如本文所述的疫苗。分装试剂盒还可在试剂盒的不同部分中含有(例如一种)组合物、(例如一种)疫苗和/或包含根据本发明的脂质纳米颗粒的mRNA，例如，试剂盒的每个部分包含含有如本文所定义的脂质纳米颗粒的mRNA，优选编码不同抗原。优选地，试剂盒或分装试剂盒含有用于溶解根据本发明的mRNA的媒介物作为一部分，所述媒介物任选地为林格氏-乳酸盐溶液。任何上述试剂盒均可用于如上所定义的治疗或预防中。

在这个方面的另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒可另外含有至少一种佐剂。在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒可另外含有至少一种其他药物活性组分，优选含有适用于治疗和/或预防癌症或相关病症的治疗化合物。此外，在另一个实施方案中，试剂盒可另外含有对于施用根据本发明的组合物或疫苗而言必需或适合的部分和/或装置，包括针、施药器、贴剂、注射装置。

在另一个方面，本发明涉及包含脂质纳米颗粒的mRNA或药物组合物作为药剂的用途。在一个替代实施方案中，本发明涉及药物组合物或包含脂质的mRNA在制造药剂中的用途。特别是，所述药剂是用于治疗性或预防性地提高有需要的受试者的免疫反应。

在一个优选实施方案中，所述药剂是用于预防或治疗癌症或肿瘤疾病、感染性疾病、过敏症或自身免疫疾病或与其相关的病症。

特别是，所述药剂是用于治疗受试者，优选脊椎动物。在一个优选实施方案中，受试者为哺乳动物，优选选自包含以下的组：山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物如小鼠、仓鼠、兔，并且特别是人类。

在一个特别优选实施方案中，所述药剂为疫苗，优选肿瘤、流感或狂犬病疫苗。在一个具体实施方案中，所述药剂是用于治疗狂犬病的狂犬病疫苗。

所述药剂可能以任何合适的方式施用。优选地，所述药剂是用于肠胃外施用，特别是注射。

本发明进一步涉及一种在有需要的受试者中引发或增强免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用如上所定义的脂质纳米颗粒或如上定义的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中预防或治疗癌症或肿瘤疾病、感染性疾病、过敏症或自身免疫疾病或与其相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用如上所定义的脂质纳米颗粒或如上所定义的药物组合物。

根据本发明的一个方面，包含脂质纳米颗粒的mRNA、(药物)组合物或疫苗可根据本发明(用于制备药剂)用于治疗或预防癌症或肿瘤疾病、感染性疾病、过敏症或自身免疫疾病或与其相关的病症。在此上下文中，特别优选的是流感病毒或狂犬病病毒感染的治疗或预防。

此外，本发明还包括治疗或预防癌症或肿瘤疾病、感染性疾病、过敏症或自身免疫疾病或与其相关的病症(优选如本文所定义)的方法，其通过向有需要的受试者施用药学上有效量的包含脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的(药物)组合物或疫苗。此种方法通常包括制备包含脂质纳米颗粒的mRNA、本发明的组合物或疫苗的任选的第一步骤，以及包括向有需要的患者/受试者施用(药学上有效量的)所述组合物或疫苗的第二步骤。有需要的受试者通常为哺乳动物。在本发明的上下文中，哺乳动物优选选自包括但不限于以下的组：例如山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物如小鼠、仓鼠、兔子，并且特别是人类。在本发明的一些实施方案中，受试者为鸟，优选为鸡。

在此上下文中，本发明优选包括治疗或预防流感病毒或狂犬病病毒感染或与其相关的病症的方法。

本发明还涉及包含脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的组合物或疫苗的用途，优选用于在哺乳动物中引发免疫反应，优选用于治疗或预防癌症或肿瘤疾病、感染性疾病、过敏症或自身免疫疾病或与其相关的病症，优选流感病毒或狂犬病病毒感染或如本文所定义的相关疾患。

本发明此外包括如本文所定义的包含脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的(药物)组合物或疫苗用于调节、优选用于诱导或增强如本文所定义的哺乳动物中的免疫反应的用途，更优选用于预防和/或治疗流感病毒感染或与其相关的疾病或病症。在此上下文中，治疗或预防流感病毒感染的支持可为常规流感治疗方法的任何组合，例如使用抗病毒药物例如神经氨糖酸苷酶抑制剂(例如奥司他韦和扎那米韦)和M2蛋白抑制剂(例如金刚烷衍生物)的疗法，以及使用如本文所定义的RNA或药物组合物的疗法。在本文所定义的任何其他实施方案中还可设想治疗或预防流感病毒感染的支持。因此，包含脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的(药物)组合物或疫苗与任何其他方法、优选地一种或多种上述治疗方法的共同疗法，特别是与抗病毒药物组合的任何用途均在本发明的范围内。

对于施用，优选可使用如本文所定义的任何施用途径。特别是，使用一种施用途径，其适用于治疗或预防如本文所定义的流感病毒感染或与其相关的疾病或病症，通过基于包含根据本发明的脂质纳米颗粒的mRNA编码的抗原诱导或增强适应性免疫反应来实现。根据本发明的组合物和/或疫苗的施用则可在施用如本文所定义的另一种组合物和/或疫苗之前、同时和/或之后进行，其可另外含有另一种包含脂质纳米颗粒的mRNA或包含编码不同抗原或抗原组合的脂质纳米颗粒的mRNA的组合，其中由根据本发明的mRNA序列编码的每种抗原优选适用于治疗或预防流感病毒感染和与其相关的疾病或病症。在此上下文中，如本文所定义的治疗还可包括调节与流感病毒感染相关的疾病和与其相关的疾病或病症。

根据本发明的此方面的一个优选实施方案，本发明的(药物)组合物或疫苗是通过注射施用。可使用本领域已知的任何适合的注射技术。优选地，本发明组合物是通过注射施用，优选通过无针注射，例如通过喷射注射施用。

在一个实施方案中，本发明组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种如本文所定义的mRNA，其各自优选单独注射，优选通过无针注射。或者，本发明组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种mRNA，其中至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种mRNA作为混合物优选通过如本文所定义的注射施用。

在另一个方面，本发明涉及一种针对抗原或抗原组合对受试者进行免疫的方法。

用于针对如本文所定义的抗原或至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种抗原的组合对受试者进行免疫的免疫方案通常包含一系列单剂量或多剂量的根据本发明的(药物)组合物或疫苗。如本文所用，单一剂量分别是指初始/第一剂量、第二剂量或任何其他剂量，它们优选被施用以“加强”免疫反应。在此上下文中，每个单一剂量优选包含施用如本文所定义的相同抗原或所述抗原的相同组合，其中两次单一剂量施用之间的间隔可在以下范围内变化：至少一天、优选2、3、4、5、6或7天至至少1周、优选2、3、4、5、6、7或8周。单一剂量之间的间隔可为恒定的或在免疫方案过程中变化，例如，间隔在方案开始时可能会更短，而在方案结束时可能会更长。取决于单一给药总数和单一给药之间的间隔，免疫方案可延长一段时间，优选持续至少一周，更优选若干周(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周)，甚至更优选若干个月(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月)。每个单一剂量优选涵盖施用抗原，优选至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种如本文所定义的抗原的组合，并且因此可包括至少一次，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次注射。在一些情况下，根据本发明的组合物或疫苗作为单一剂量通常在一次注射中施用。在其中根据本发明的疫苗包含编码如本文所定义的不同抗原的单独mRNA制剂的情况下，在施用单一剂量期间进行的最小注射次数对应于疫苗的单独组分的数量。在某些实施方案中，单一剂量的施用可涵盖针对疫苗的每个组分进行多于一次注射(例如，包含编码例如本文所定义的一种抗原肽或蛋白质的mRNA的具体mRNA制剂)。例如，疫苗的单个组分的总体积的一部分可注射至不同的身体部位，因此涉及超过一次注射。在一个更具体的实施例中，包含四种单独的mRNA制剂的单剂量疫苗包括八次注射，其中每种制剂在两个不同的身体部位施用。通常，单一剂量包含施用疫苗的所有组分所需的所有注射，其中单一组分可能涉及超过一次的如上所述的注射。在其中单剂量的根据本发明的疫苗的施用包括超过一次注射的情况下，注射基本上同时或并行，即通常在专业人员所需的时间框内以时间交错的方式进行，以便一个接一个地进行单个注射步骤。因此，单剂量的施用优选持续几分钟的时间段，例如2、3、4、5、10、15、30或60分钟。

包含如本文所定义的脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的(药物)组合物或疫苗的施用可在时间交错的治疗中进行。时间交错的治疗可为例如在流感病毒感染或与其相关的疾病或病症的常规疗法之前、同时和/或之后施用包含脂质纳米颗粒的mRNA、组合物或疫苗，例如，通过在适用于治疗或预防流感病毒感染或与其相关的疾病或病症的疗法或治疗剂施用之前、同时和/或之后施用包含脂质纳米颗粒的mRNA、组合物或疫苗来实现。此种时间交错的治疗可使用例如试剂盒，优选如本文所定义的分装试剂盒进行。

时间交错的治疗可另外或替代地还包括以一种形式施用包含如本文所定义的脂质纳米颗粒的mRNA、根据本发明的(药物)组合物或疫苗，其中编码如本文所定义的抗原肽或蛋白质或其片段或变体的所述mRNA(优选形成组合物或疫苗的一部分)在包含如上所定义的脂质纳米颗粒的另一mRNA的同时、之前或之后施用，所述另一mRNA优选形成相同的本发明组合物或疫苗的一部分。优选地，(所有包含脂质纳米颗粒的mRNA的)施用在一小时内、更优选在30分钟内、甚至更优选在15、10、5、4、3或2分钟内或甚至在1分钟内进行。此种时间交错的治疗可使用例如试剂盒，优选如本文所定义的分装试剂盒进行。

在一个优选实施方案中，重复施用本发明的药物组合物或疫苗，其中每次施用优选包括单独施用本发明组合物或疫苗的至少一种包含脂质纳米颗粒的mRNA。在每个施用时间点，至少一种mRNA可施用超过一次(例如2次或3次)。在本发明的一个特别优选实施方案中，至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个mRNA序列(各自编码一种不同的如本文所定义的抗原)用包含如上所定义的脂质纳米颗粒的mRNA封装或与其结合，其中mRNA序列是具有相同或不同脂质纳米颗粒的mRNA化合物的一部分，所述经封装或结合的mRNA序列在每个时间点施用，其中每种mRNA通过注射施用两次，分布在四肢上。

本发明的可离子化脂质的额外应用

基因编辑

本发明还涵盖用于递送核酸、优选RNA、更优选单向导RNA(sgRNA)和用于基因表达改变、基因组操纵和基因参与遗传病症的基于工程化CRISPR/CRISPR相关(Cas)9的组合物的组合物和方法。已发现它可用于修正或减小突变的效应。在某些实施方案中，基于CRISPR/Cas9的系统包含Cas9蛋白和至少一种向导RNA(所述向导RNA提供系统的DNA靶向特异性)并使用包含一种或多种本发明的可离子化脂质的LNP来递送。

特别是，本公开描述了Cas9融合蛋白，其将基于CRISPR/Cas9的DNA序列靶向功能与另外的活性相整合，从而允许改变的基因表达和/或表观遗传背景。此系统还可用于修正或减轻基因组操纵和基因突变的影响。

本公开还提供了用于递送靶向基于CRISPR/CRISPR相关(Cas)9的系统的多种gRNA和一种或多种包含LNP的内源基因的某些组合物和方法，所述LNP包含一种或多种本发明的可离子化脂质。靶向单个启动子的多种sgRNA的共转染允许协同活化，但是，由于拷贝数量差异导致表达水平，多种质粒的共转染在每个细胞中可能会有所不同。此外，转染后的基因活化是瞬时的，因为质粒DNA会随着时间的推移而稀释。此外，许多细胞类型不容易转染，并且瞬时基因表达可能不足以引起治疗效果。

包含一种或多种本发明的可离子化脂质的这种LNP组合物能够控制CRISPR/Cas9依赖性基因调控的幅度和时间。此外，包含一种或多种本发明的可离子化脂质的LNP组合物提供促进CRISPR/Cas9系统在原代细胞中的治疗用途的强烈且持久的基因表达水平。最终，包含一种或多种本发明的可离子化脂质的LNP组合物可用于同时编辑多种基因(例如，用于同时敲除若干个致癌基因)。

本发明进一步涉及一种修正细胞中的突变基因的方法。所述方法包括向含有DNA靶向系统的细胞施用经分离的多核苷酸和包含本发明的可离子化脂质的LNP的步骤。突变基因的修正可包括同源定向修复。所述方法还可包括向细胞施用供体DNA的步骤。突变基因可包括提前终止密码子和导致截短基因产物的移码突变。突变基因的修饰可包括核酸酶介导的异源末端连接。突变基因的修饰可包括提前终止密码子的删除、剪接受体位点的破坏、一个或多个外显子的删除或剪接供体序列的破坏。一个或多个外显子的删除可导致阅读框的修正。

在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的携带突变型抗肌萎缩蛋白基因的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用DNA靶向系统、经分离的多核苷酸或载体的步骤。在某些实施方案中，受试动物可患有杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne musculardystrophy)。

本发明涉及一种修正细胞中的突变型抗肌萎缩蛋白基因的方法。所述方法包括向含有突变型抗肌萎缩蛋白基因的细胞施用DNA靶向系统、经分离的多核苷酸、载体或细胞的步骤。突变型抗肌萎缩蛋白基因可包括未成熟终止密码子、由遗传缺陷破坏的阅读框、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点，其中靶区域是未成熟终止密码子，破坏。位于所定义阅读框、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的上游或下游。突变型抗肌萎缩蛋白基因的修饰可包括同源定向修复。所述方法还可包括向细胞施用供体DNA的步骤。突变型抗肌萎缩蛋白基因可包括提前终止密码子和导致截短基因产物的移码突变。突变型抗肌萎缩蛋白基因的修饰可包括核酸酶介导的异源末端连接。突变型抗肌萎缩蛋白基因的修饰可包括提前终止密码子的删除、破坏的阅读框的修饰或通过剪接受体位点的破坏或剪接供体序列的破坏对剪接的调节。突变型抗肌萎缩蛋白基因的修饰可包括外显子45-55或外显子51的删除。

本发明涉及一种试剂盒，其包含融合蛋白、DNA靶向系统、经分离的多核苷酸、载体或细胞。

本发明涉及一种调节细胞中哺乳动物基因表达的方法。所述方法包括使细胞与编码DNA靶向系统的多核苷酸接触。DNA靶向系统包含融合蛋白和至少一种包括在包含本发明的可离子化脂质的LNP中的向导RNA(gRNA)。

DNA靶向系统可包括1至10个不同的gRNA。不同的gRNA可与靶基因内的不同区域结合。靶区域可由至少一个核苷酸隔开。靶区域可由约15至约700个碱基对隔开。不同的gRNA各自可结合至少一种不同的靶基因。不同靶基因可位于同一条染色体上。不同靶基因可位于不同染色体上。至少一个靶区域可位于非开放染色质区域、开放染色质区域、靶基因启动子区域、靶基因增强子区域、靶基因转录区域或靶基因转录起始位点上游的区域中。至少一个靶区域可位于靶基因转录起始位点上游约1至约1000个碱基对处。至少一个靶区域可位于靶基因转录起始位点上游约1至约600个碱基对处。可诱导基因表达。DNA靶向系统由2种不同的gRNA、3种不同的gRNA、4种不同的gRNA、5种不同的gRNA、6种不同的gRNA、7种不同的gRNA、8种不同的gRNA、9种不同的gRNA或10种不同的gRNA组成。可包括在内。至少一种向导RNA可靶向选自由以下组成的组的基因的启动子区域：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1。至少一个靶区域可在靶基因的内含子或外显子内。

本发明涉及在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物。所述组合物包含融合蛋白和至少一种包括在包含本发明的可离子化脂质的LNP中的向导RNA(gRNA)。

本发明涉及在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物。所述组合物包含编码融合蛋白的经分离的多核苷酸序列和至少一种向导RNA(gRNA)。至少一种向导RNA可靶向选自由以下组成的组的基因的启动子区域：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1。

本发明涉及含有上述组合物的细胞，所述组合物在细胞中诱导哺乳动物基因表达。

本发明涉及用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物，或包含含有用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物的细胞的试剂盒。

本发明涉及一种用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的试剂盒。所述试剂盒包含用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物或含有用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的组合物的细胞。

蛋白质替代疗法

在一些实施方案中，如本文所公开的方法、组合物和试剂盒可经定制以用于体内蛋白质替代疗法的方法中。在一些实施例中，在治疗需要蛋白质表达的多种不同疾病的方法中，可将编码目标蛋白质的合成修饰的RNA递送至组织和/或器官以用于体内蛋白质表达。在一些实施例中，疾病可为如本文所公开的功能丧失疾病，例如但不限于肌肉萎缩症、囊性纤维化和其他疾病，其中特定蛋白质的蛋白质表达水平不足和/或基因表达产生非功能性蛋白质。

另外，使用包含本发明的可离子化脂质的LNP来体内递送合成修饰的RNA以供如本文所公开的体内蛋白质表达的方法可用于创建动物模型平台，所述平台可用于研究整个器官和全身病理生理学。在一些实施例中，如本文所公开的方法提供了一种体内系统，其使用小型和大型动物模型，例如灵长类动物和猪模型，用于测试和/或开发用于人类患者的临床用途的治疗剂。

在一些实施例中，使用包括在包含本发明的可离子化脂质的LNP中的合成修饰的RNA进行体内蛋白质表达的如本文所公开的方法和组合物和试剂盒可用于疾病或病症的发展和治疗。在一些实施例中，疾病或病症是遗传性和/或获得性病症，其为特定蛋白质的表达不足或失效版本的蛋白质表达的结果。在一些实施例中，疾病或病症是获得性病症，例如本文所公开的心血管疾病或病症。

在另一个实施例中，使用包括在包含本发明的可离子化脂质的LNP中的合成修饰的RNA进行体内蛋白质表达的如本文所公开的方法和组合物和试剂盒也可用于再生医学策略中。例如，在一些实施例中，包含至少一种编码目标蛋白质的合成修饰的RNA的组合物还可包含目标细胞群。换言之，在一些实施方案中，本公开提供了用于再生细胞疗法的方法，其包括向受试者施用至少一种合成修饰的RNA与目标细胞群的组合。在一些实施例中，细胞群为干细胞群，并且在一些实施例中，干细胞群为心脏前体细胞或心脏祖细胞群。在一些实施例中，干细胞为Isl1+干细胞群，或为血管祖细胞群。此类细胞群是本领域中熟知的，并且包括但不限于国际专利申请WO/2008/054819、WO2010/144678、WO2010/042856和美国专利申请2010/0166714、US2011/0033430、US2010/021713和US2011/0003327中公开的细胞群，所述文献各自通过引用并入本文。

细胞程序设计和细胞疗法

在另一个实施方案中，本发明涵盖，本文所公开的发明涉及一种用于刺激人类宿主免疫系统而无GVH毒性的同种异体细胞疗法，并且由此所述同种异体细胞随后由宿主免疫系统排斥。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中选择同种异体细胞而不考虑与受体的HLA匹配，或允许HLA单倍型与预期患者群体的最大错配，从而确保最大的同种异体潜能和随后宿主对所述产物的免疫反应。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞在输注至未接受过先前同种异体BMT的患者中时，能够刺激针对肿瘤的有效宿主免疫反应。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞在输注至未接受过免疫抑制调理方案的患者中时，能够刺激针对肿瘤的有效宿主免疫反应。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞疗法通过刺激宿主中炎性“1型”单核因子和淋巴因子的产生来刺激患者的免疫反应。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞疗法通过激活宿主先天性和/或Th1适应性免疫的组分来刺激患者的免疫反应。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞疗法刺激细胞因子的产生，所述细胞因子增强肿瘤的免疫原性。

本文所公开的发明还涉及一种上述产物，其中同种异体细胞直接杀死肿瘤，从而使肿瘤相关抗原可用于刺激宿主1型适应性免疫。

本文所公开的发明还涉及一种产生上述产物的方法，其中产物中包含的同种异体T细胞处于增强活化的状态。

本文所公开的发明还涉及一种用于刺激宿主免疫系统的方法，所述方法通过以下步骤来实现：从无关供体收集单核细胞、激活单核细胞群内的T细胞以及将活化的T细胞施用于具有宿主免疫系统的宿主，从而活化的T细胞由宿主免疫系统排斥，同时刺激宿主免疫系统以介导针对常驻疾病的有效免疫反应。宿主可能患有常驻疾病，例如血液系统恶性肿瘤、实体肿瘤、已转移的实体肿瘤或病毒感染。选择供体时不考虑与宿主的组织相容性，并且最大组织相容性不匹配是优选的。宿主还优选不应具有先前的骨髓移植并且优选不应接受任何旨在允许同种异体供体细胞输注的植入的免疫抑制化学疗法和/或放射调理方案。

所述方法还包括，T细胞优选为CD4+T细胞并且大多数CD4+T细胞在离体活化后从CD45RA+、CD62Lhi幼稚细胞分化为CD45RO+、CD62Llo记忆细胞，并且其中此类细胞产生1型细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α，而不产生2型细胞因子如IL-4、IL-10和TGF-β。

本文所公开的发明还包括此类CD4+T细胞，其在离体活化后在细胞表面上表达CD40L和/或TRAIL。优选地，T细胞通过施加于T细胞的细胞表面上的抗CD3与抗CD28 mAb的交联而活化。优选地，施加于所述T细胞的表面上的抗CD3和抗CD28 mAb通过与包被有对所述mAb有反应性的试剂的生物可降解微球体结合而交联。

本文所公开的发明还包括其中大于90％的T细胞在接触宿主免疫系统之前和接触宿主免疫系统之时处于活化状态，并且在优选实施方案中，大于95％的T细胞在向宿主施用之时并且在即将接触宿主之前经活化。

所述方法还包括其中T细胞在输注于宿主中之前至少六天连续暴露于活化刺激。T细胞优选经活化，同时维持在至少107个细胞/ml的细胞密度下以最大化细胞与细胞的接触。此种细胞与细胞的接触用于增强同种异体T细胞的活化状态。

在另一个实施方案中，所述方法包括其中T细胞与施加于同种异体T细胞表面上的抗CD3和抗CD28 mAb一起施用，并且其中mAb通过与包被有对mAb有反应性的剂的生物可降解微球体结合和包涵而交联。

所述方法还包括其中T细胞施用刺激1型细胞因子的产生，并且此类细胞因子包括以下至少一种：IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-β。此类细胞因子刺激免疫，包括宿主先天免疫功能。所述方法还包括其中经活化的T细胞的施用活化宿主树突状细胞和/或巨噬细胞。

本发明还包括其中经活化的同种异体T细胞的施用和经活化T细胞的后续排斥刺激针对宿主驻留疾病的免疫反应。

本发明还包括一种方法，其中在配制和向宿主施用之前将离体活化的同种异体T细胞冷冻保存。

本发明还包括一种用抗CD3和抗CD28 mAb标记的同种异体T细胞的组合物，所述mAb与包被有对所述mAb有反应性的剂的生物可降解微球体交联。经标记的同种异体T细胞和相关生物可降解微球体悬浮在适用于静脉内输注的介质中。此类T细胞和相关生物可降解微球体以107个细胞/ml或更高的细胞密度悬浮，并且优选在柔性容器或注射器中。用抗CD3和抗CD28标记的T细胞也可在配制和施用之前冷冻保存。

本发明还包括一种同种异体细胞材料，当与载有肿瘤的宿主免疫系统接触时，引发宿主抗肿瘤(HVT)和宿主抗移植物(HVG)反应，而不会引发毒性移植物抗宿主(GVH)反应。同种异体细胞材料含有离体活化的T细胞并且其中所述经活化的T细胞优选为CD4+T细胞。

本发明还包括一种同种异体细胞材料，所述材料在向载有肿瘤的宿主施用时引起肿瘤细胞凋亡。同种异体细胞材料含有活化的同种异体T细胞，并且此类T细胞优选为CD4+细胞。此类CD4+细胞应在细胞表面上表达FasL和/或TRAIL，优选以高密度表达。此类活化的T细胞优选在离体活化后分化成表达CD45RO和CD63Llo的记忆细胞。此类同种异体T细胞应表达以下细胞因子中的一者或多者：IL-2、IL-15、IFN-γ和TNF-α，并在向宿主施用后，表达表面FasL和/或TRAIL。

本发明还包括一种包含治疗有效量的同种异体细胞群的组合物，其中至少一部分为T细胞并且由此所述T细胞用活化有效量的一种或多种单克隆抗体或其部分标记；以及交联有效量的对单克隆抗体有反应性的剂。此种组合物的T细胞优选用抗CD3和抗CD28 mAb标记。对mAb有反应性的剂优选在可降解的微球体上包被。同种异体T细胞和相关生物可降解微球体悬浮于适用于静脉内输注的介质中。此类经标记的T细胞和相关交联生物可降解微球体以107个细胞/ml或更高的细胞密度悬浮于柔性容器或注射器中。组合物可在输注前冷冻保存。

在优选实施方案中，本发明中使用的同种异体细胞为已经离体活化的纯化的T细胞，优选为CD4+T细胞，更优选为已分化成效应细胞或记忆细胞的CD4+T细胞，它们产生高水平的1型细胞因子，例如IL-2、IL-15、IFN-γ、TNF-α，并且还在细胞表面上表达，优选以高密度表达效应分子如CD40L、TRAIL和FasL。

在另一个优选实施方案中，用于输注的同种异体T细胞通过使细胞保持高细胞密度(107个细胞/ml或更高)与T细胞活化剂连续接触的方法进行离体处理。

在另一个优选实施方案中，用于输注的同种异体T细胞在适于输注的培养基中配制，其中含有活化剂作为从收获至输注保持T细胞活化状态的手段。

在另一个优选实施方案中，大于90％或优选大于95％所输注的同种异体T细胞在输注至患者体内时继续处于活化增强的状态。

VI.本发明的实施例

实施例1：新颖的可离子化脂质在200ng/孔的体外剂量下具有高递送效率(研究TRANS-14)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)并连续稀释以获得27.74mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到1mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.56mg/ml，同时将NP比率保持恒定在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNP稀释至额外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBSpH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的50-200ng剂量转染12KHEK293细胞。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，在萤火虫荧光素酶测定之前，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的每个孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图7中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔中。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条都用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图8中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图9中说明。

D：基于Presto Blue HS活力试剂的毒性测定。转染24小时后，将经转染的细胞与预热的Presto Blue HS试剂(10％v/v)在37℃下温育15分钟。立即将微孔板引入Cytation5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex540/Em590)。结果在图10中说明。

实施例2：示例性可离子化脂质在体外剂量为200ng/孔下具有高递送效率(研究TRANS-16)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)并连续稀释以获得27.74mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到1mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.56mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的50-200ng剂量转染12K HEK293细胞。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，在萤火虫荧光素酶测定之前，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图11中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔中。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图12中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图13中说明。

实施例3：示例性可离子化脂质在体外剂量为200ng/孔下具有高递送效率(研究TRANS-18)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到3.6mg/ml。将FLucmRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并将12K HEK293细胞用相同的200ng剂量转染。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，在萤火虫荧光素酶测定之前，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图14中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图15中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图16中说明。

D：基于Presto Blue HS活力试剂的毒性测定。转染24小时后，将经转染的细胞与预热的Presto Blue HS试剂(10％v/v)在37℃下温育15分钟。立即将微孔板引入Cytation5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex540/Em590)。结果在图17中说明。

实施例4：示例性可离子化脂质在体外剂量为100-200ng/孔时具有高递送效率(研究TRANS-22)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到3.6mg/ml。将FLucmRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在50mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的50-200ng剂量转染12K HEK293细胞。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图18中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图19中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图20中说明。

实施例5：示例性可离子化脂质在体外剂量为100-200ng/孔和体内剂量为2.5μg时具有高递送效率(研究InVivo-1)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到3.6mg/ml。将mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在50mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置5上混合24μl脂质混合物与48μl mRNA溶液，并注入72μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的144μl1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的50-200ng剂量转染12K HEK293细胞。第一代DL-ADDE LNP在体外和体内具有与MC3相似的效率，MC3是现有技术LNP中使用的标准参考脂质。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图21中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图22中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图23中说明。

D：在BALB/c小鼠中注射后4小时的mRNA Fluc的体内翻译。经透析的DL-ADDE LNP和MC3 LNP经由3种施用途径注射-血管内(IV)、肌内(IM)、皮内(ID)。注射总体积为50μL，含有2.5μg具有Fluc mRNA的LNP(2X 25μLl，对于MC3 ID)。注射后4小时腹膜内施用荧光素，并通过活动物成像监测荧光素酶表达。DL-ADDE-C2/C2-PipZ LNP将在注射后4小时的表达定位至IM注射部位，并根据辐射的感兴趣区域(ROI)分析以约50％的MC3水平表达荧光素酶。与定位于肌肉的DL-ADDE表达相反，MC3和其他公开的脂质在IM注射后4小时造成在肝脏中快速播散的表达。DL-ADDE LNP的IM局部表达可能是由于它们在生理pH下带有轻微的正电荷，而MC3和其他公开的LNP则带负电，并且可能产生更大的免疫原性，同时有降低的反应原性和减少的全身不良事件。显然，即使IV注射时，DL-ADDE LNP也不会在肝脏中表达。以下两种LNP(DL-ADDE-C2/C2-PYR、DL-ADDE-C2/C2-PIPZ)符合通过/不通过标准，以便使用表达SARS-CoV-2的mRNA进行免疫原性测试，如下实施例9中进一步展示。结果在图24中说明。

实施例6：示例性DL-ADDE可离子化脂质在100-200ng/孔的剂量下具有高递送效率，而BOD-ADDE可离子化脂质在25-200ng下是体外有效的(研究TRANS-30)

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)并连续稀释以获得27.74mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到3.6mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.56mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的25-200ng剂量转染12K HEK293细胞。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图25中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图26中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图27中说明。

实施例7：示例性DL-ADDE可离子化脂质在100-200ng/孔的剂量下具有高递送效率，而BOD-ADDE可离子化脂质在25-200ng下是体外有效的(研究TRANS-31)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)并连续稀释以获得27.74mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到3.6mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.56mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有200ng，并用相同的25-200ng剂量转染12K HEK293细胞。第一代DL-ADDE LNP具有与MC3和KC2相似的效率，MC3和KC2是在mRNALNP文献中使用的标准参考脂质。

A：用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图28中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图29中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图30中说明。

实施例8：用于快速微流体混合的50mM新颖可离子化脂质与1mg/ml mRNA显示出独特的胶态离子化特性(研究LNP-19)、高体外递送效率(研究Trans 31)和递送SARS-CoV-2免疫原时的高免疫原性(研究In Vivo 2)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)和2019-nCoV S-2P(Covid)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到≥3mg/ml。将mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在50mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。将ADDE脂质与标准脂质如KC2和MC3进行比较。图31-33

示例性ADDE可离子化脂质。pKa对于可离子化脂质是由ACDLabs Percepta获得，并且对于含有可离子化脂质的LNP是通过ζ电位和TNS获得。LNP等电pI是由ζ电位获得。LNP直径是来自DLS的数均值。每个LNP的平均mRNA拷贝是使用分子体积模型和DLS直径来计算，并且与LNP体积成比例。

表14

1.从上述结构中最左边的N原子开始的N原子的pKa。

A：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图34中说明。

B：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图35中说明。

C：LNP电荷的ζ电位、pKa和pI。将LNP在75mM TNS缓冲液(甘氨酰甘氨酸、乙酸盐、咪唑各10mM、20mM硼酸盐、25mM NaCl)中稀释，使其在800ul TNS缓冲液中含有0.8mg总mRNA，并转移至Folded Capillary Zeta Cell(DTS1070)中以通过动态光散射(DLS)测量尺寸并通过电泳光散射(ELS)在Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)中测量电泳迁移率。ζ电位是在控制电压的条件下测量的，以限制溶液中的欧姆加热，所述溶液具有4种缓冲液，其中pKa分布在pH范围3-10内，间隔为0.5。LNP pKa是通过将亨德森-哈瑟尔巴赫方程拟合至ζ电位数据来计算的。LNP pI是通过将ζ电位内插为零来找出。使用电动力学模型来计算LNP的亨利函数和电荷。结果在图36中说明。

D：LNP pKa的TNS测定。将LNP稀释以在75mM TNS缓冲液(甘氨酰甘氨酸、乙酸盐、咪唑各10mM、20mM硼酸盐、25mM NaCl)中保持75uM可离子化脂质和6uM TNS的最终浓度，以保持TNS/可离子化比率为0.08。荧光TNS在具有4种缓冲液的溶液中测量，pKa分布在pH范围3-10内，间隔为0.5。LNP的pKa是使用阴离子染料TNS荧光增强的pH值依赖性测量的，在较低pH值下强度较高，而在高pH值下强度较低。LNP pKa是通过将亨德森-哈瑟尔巴赫方程拟合至来自TNS测定的荧光数据来计算的。结果在图37中说明。

实施例9：示例性可离子化脂质在体内具有高递送效率(研究InVivo-4)。

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50:10:38.5:1.5mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为25/5/19.25/0.75mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到4mg/ml。将mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在50mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置5上混合24μl脂质混合物与48μl mRNA溶液，并注入72μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的144μl1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。将LNP浓缩以注射5ug经封装的mRNA 50ul以供肌内施用。

A：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图38中说明。

B：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图39中说明。

C：在IM施用时的体内萤火虫荧光素酶表达。将5ug经封装的mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。在注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时和24小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。结果在图40A-40H中说明。

D：SARS-CoV-2S特异性结合抗体滴度。将BALB/c小鼠(n＝5/组)在第0周和第3周用0.1μg和1μg剂量的S-2P mRNA编码的免疫原在3种不同的LNP MC3/DL-ADDE-C2C2-4Me-PipZ/BOD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ中进行免疫。在初免后3周和加强后5周，通过ELISA评估血清的SARS-CoV-2S特异性IgG。在MC3和BOD-ADDE-C2C4-4Me-PipZ初免后发现剂量依赖性和高结合抗体滴度。在这些年幼动物中加强后发现所有LNP的滴度都很高。

实施例10：经由摩尔比调整进一步优化LNP体外递送效率。

(TRANS-36)

概述：使用50-52mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含可离子化BODD-C2C4-PipZ/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47-70:8-14:29-49:1-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以达到50-52mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到4.6mg/ml。将FLucmRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在20mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图41中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图42中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图43中说明。

实施例11：对用于快速微流体混合的在50mM总脂质浓度下与1mg/ml的mRNA混合的可离子化脂质的筛选提高体外LNP递送效率(TRANS-40)

概述：使用50mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将四种脂质合并以获得50mM总脂质浓度(分别为24/6.5/18.5/1mM)。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的96μl1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图44中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图45中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图46中说明。

实施例12：液体形式的示例性可离子化脂质制剂在4℃和室温下的稳定性(TRANS-42)

概述：使用约75mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47-50:10-13:37-38.5:1.5-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得75mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15-25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(PrecisionNanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：使用萤火虫荧光素酶测定，基于体外效力的稳定性测定。在第0、2、4、7、14和28天转染细胞。每天进行萤火虫测定并记录。结果在图47中说明。

B：针对LNP尺寸的动态光散射(DLS)和针对LNP封装效率的Ribogreen测定。在第0、2、4、7、14和28天测定LNP，并记录。结果在图48中说明。

实施例13：用于快速微流体混合的低0.25mg/ml和高1.5mg/ml混合浓度的示例性可离子化脂质制剂在体外显示出高递送效率和效力(TRANS-43)

概述：使用12.5-75mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得75mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到12.5mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾(SEQ ID NO:4))中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.25-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图49中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图50中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图51中说明。

实施例14：Moderna缓冲液有助于比PBS更好地冷冻可离子化脂质制剂，并在体外显示出相同的递送效率和效力(TRANS-45)

概述：使用12.33-77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(50-47:10-13:37-38.5:1.5-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到12.33mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到6.3mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.25-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1XDPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。将LNP在Moderna冷冻缓冲液20mM Tris缓冲液中分成一半进行透析持续6小时，所述缓冲液含有87mg/mL(254mM)蔗糖和10.7mM醋酸钠，pH 7.5(Moderna Protocol第47页)。接着将每组LNP(新鲜PBS、新鲜Moderna、冷冻PBS、冷冻Moderna)稀释，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图52中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图53中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图54中说明。

实施例15：用于快速微流体混合的1.5mg/ml高mRNA混合浓度下的示例性可离子化脂质制剂BODD C2C4 PipZ与标准混合浓度0.2mg/ml下的参考脂质MC3相比显示出高的体内递送效率和效力(InVivo-7)

概述：使用10-75mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47-50:10-13:37-38.5:1.5-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得75mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到10mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15-25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.2-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图55中说明。

B：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图56中说明。

C：在IM施用时的体内萤火虫荧光素酶表达。将0.5-5ug总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。在注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时和24小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。结果在图57A至图57I中说明。

实施例16：在1.5mg/ml高mRNA混合浓度下的示例性可离子化脂质制剂BODD C2C4PipZ与标准混合浓度0.2mg/ml下的参考脂质MC3相比当递送SARS-CoV-2免疫原时显示出高的体内递送效率和免疫原性效力(InVivo-8)

概述：使用10-75mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47-50:10-13:37-38.5:1.5-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得75mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到10mM。将密码子优化的2019-nCoV S-2P(Covid)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15-25mM醋酸钠缓冲液pH4中达到0.2-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNP稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBSpH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：体内免疫原性终点ELISA抗RBD滴度。将0.1、0.25、0.5、1ug总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。加强前和加强后(3周后)显示如下。结果在图58A至图58B中说明。

B：用于假中和测定的体内免疫原性FRNT50滴度。将0.1、0.25、0.5、1ug总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。加强前和加强后(3周后)显示如下。结果在图59中说明。

实施例17：使用示例性可离子化脂质制剂BODD C2C4 PipZ以1.5mg/ml高mRNA混合浓度进行快速微流体混合的小鼠挑战当递送SARS-CoV-2免疫原(在0.25ug剂量下提供100％保护)时显示出比在标准混合浓度0.2mg/ml下的标准脂质MC3(在0.5ug下提供100％保护)高的体内递送效率和免疫原性效力(InVivo-9)

概述：使用10-75mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47-50:10-13:37-38.5:1.5-2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得75mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到10mM。将密码子优化的2019-nCoV S-2P(Covid)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15-25mM醋酸钠缓冲液pH4中达到0.2-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在SparkNanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1XDPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：针对病毒挑战的体内保护-挑战模型中的存活比例、体重和温度。将0.1、0.25、0.5、1ug的总mRNA在加强前和加强后(5周后)以肌内(I.M.)注射的方式注射至小鼠中。所述挑战是与意大利毒株(Italian strain)一起在5x10⁴PFU下使用。结果在图60A至图60B中说明。

B：挑战模型中的体内体重和温度。将0.1、0.25、0.5、1ug的总mRNA在加强前和加强后(5周后)以肌内(I.M.)注射的方式注射至小鼠中。所述挑战是与意大利毒株一起在5x10⁴PFU下使用。结果在图61A至图61D中说明。

实施例18：用于快速微流体混合的在1.5mg/ml高mRNA混合浓度下的示例性可离子化脂质制剂显示出比标准脂质MC3高的体内递送效率和效力(InVivo-10)

概述：使用77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图62中说明。

B：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图63中说明。

C：IM和IV施用时的体内萤火虫荧光素酶表达。将1ug总mRNA以肌内(I.M.)和静脉内(I.V.)注射的方式注射至小鼠中。在注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时和24小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。结果在图64A至图64J中说明。

实施例19：脂质浓度从10.2增至77mM并且mRNA从0.2增至1.5mg/ml(以供快速微流体混合)提高了体外LNP递送效率。

(TRANS-49)

概述：使用10.2-77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质和DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM总脂质浓度，接着进行系列稀释以达到10.2mM。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.2-1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析持续4x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10^-5mg/ml至4.88x10^-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持10⁷RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图65和图66中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图67中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图68中说明。

实施例20：脂质浓度增至77mM并且mRNA增至1.5mg/ml(以供快速微流体混合)显示出体外LNP递送效率。(TRANS-52)

概述：使用77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质和DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，以达到浓度5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBSpH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析持续4x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10-5mg/ml至4.88x10-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持107RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图69中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图70中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在ZetasizerNano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在1X PBS中测量尺寸，其中粘度为1.02cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图71中说明

实施例21：在约25mM总脂质浓度下与0.5mg/ml mRNA组装的示例性脂质(以供快速微流体混合)显示出体外LNP递送效率。

(TRANS-59)

概述：使用约25mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质和DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将每一种脂质溶解于乙醇中直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得约25mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，以达到浓度5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在25mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到0.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析持续4x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A.用于mRNA递送效率的萤火虫荧光素酶测定。转染24小时后，将经转染的细胞调节至室温并持续30分钟，之后进行萤火虫荧光素酶测定。Quantilum重组荧光素酶标准曲线在10％ EMEM中以5倍系列稀释制备。将50ul从3.9x10-5mg/ml至4.88x10-3mg/ml的每个标准点包括在微孔板中作为阳性酶活性对照(数据未示出)，以保持107RLU/mg/ml的线性。将ONE-Glo底物以1:1的比率添加至未经转染、经转染和Quantilum的各孔中，所述底物先前已调节至室温持续至少4小时。将测定板在黑暗中温育3分钟并且立即引入Cytation5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取发光。结果在图72中说明。

B：用于mRNA封装效率的Ribogreen测定。将1X TE缓冲液和Triton缓冲液(1X TE缓冲液中的2％v/v)一式两份添加至每个LNP的黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀释至4ng/ul，并以1:1的比率添加至每个TE/Triton孔。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和1X TE缓冲液，并且另一条含有mRNA和Triton缓冲液。这些标准曲线中的每条均用于计算每个TE缓冲液或Triton缓冲液中的mRNA浓度。与单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法在计算封装效率和mRNA浓度时更准确。在将经稀释的LNP添加至微孔板中之后，标准品包含在微孔板中。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。Ribogreen试剂在1X TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的比率添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。结果在图73中说明。

C：LNP尺寸的动态光散射(红点为PDI右y轴)。将经透析的LNP在蔗糖缓冲液pH 7.5中稀释至6.25ng/ul并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在蔗糖中测量尺寸，其中粘度为1.1cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。结果在图74中说明。

实施例22：在总脂质浓度77mM和mRNA浓度1.5mg/ml下(以供快速微流体混合)的LNP的组装显示出体内LNP递送效率。

(InVivo-11)

概述：使用77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质和DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将双脂质储备液(可离子化/胆固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解于乙醇中，直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在20mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对1X DPBS pH 7.4透析6x1小时。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：IM施用时注射部位的体内萤火虫荧光素酶表达。将1ug的总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时通过活动物成像监测注射部位的荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。结果在图75和图76中说明。

B：IM施用时的离体萤火虫荧光素酶表达。将1ug的总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。对于离体而言，在体内成像后立即提取器官并成像。结果在图77和图78中说明。

实施例23：在总脂质浓度77mM和mRNA浓度1.5mg/ml下(以供快速微流体混合)的LNP的组装显示出体内LNP递送效率。

(InVivo-13)

概述：使用77mM的总脂质浓度配制LNP，所述脂质包含若干种可离子化脂质和DSPC/胆固醇/PEG-DMG(47:13:37:2mol％)。将双脂质储备液(可离子化/胆固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解于乙醇中，直至观察到澄清溶液。将所述四种脂质合并以获得77mM的总脂质浓度。将密码子优化的萤火虫荧光素酶(Fluc)序列克隆至mRNA质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中用于共转录加帽，使用N1甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录并经纤维素纯化以去除dsRNA。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤并重悬于无核酸酶的水中，使其浓度达到5.5mg/ml。将FLuc mRNA储备液以系列稀释从较高浓度的溶液稀释至较低浓度，以在15mM醋酸钠缓冲液pH 4中达到1.5mg/ml，同时将NP比率保持在4，之后在Spark NanoAssmblr(Precision NanoSystems)中混合，由此允许使用微流体混合技术在制剂中实现高重现性。在设置3上混合16μl脂质混合物与32μl mRNA溶液，并注入48μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将所形成的LNPS稀释至另外的96μl 1X DPBS pH 7.4中。接着将LNP针对蔗糖缓冲液pH 7.5透析6x1小时。将冷冻的LNP保持在-80C下以供体内注射。接着稀释LNP，以使32ul含有25-200ng，并将12K HEK293细胞用相同剂量转染，但在微流体混合器中以不同浓度制造。

A：IM施用时注射部位的离体萤火虫荧光素酶表达。将1ug的总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。结果在图79和图80中说明。

B：IM施用时的离体萤火虫荧光素酶表达。将1ug的总mRNA以肌内(I.M.)注射方式注射至小鼠中。注射后4小时腹膜内施用荧光素，并在4小时通过活动物成像监测荧光素酶表达。使用IVIS系统计算ROI。对于离体而言，在体内成像后立即提取器官并成像。结果在图81、图82和图83中说明。

实施例24：C24可离子化脂质的三价头部基团呈现出可在胞内体pH范围内增强质子化的分子和LNP离子化特性

可离子化脂质设计空间的初步筛选包括多于100个头部基团、10个接头和50个烷基尾部，它们为了超过50,000种潜在的可离子化脂质候选物而组合。我们计算约500种候选物的水相pKa，这些候选物对此设计空间进行采样，并选择若干个头部基团，以便使用仅涉及2个反应和一种催化剂的合成程序用带有烷基尾部的丙烯酸酯来合成，而对于当前的COVID-19mRNA疫苗中的可离子化脂质，则需要多于5个反应和7种催化剂。反应方案的简单性导致纯化步骤少得多、合成时间短得多并且产率超过80％，估计成本降低了10倍，这可促进全球疫苗接种活动。最初合成了超过30种候选的可离子化脂质，并对其进行物理化学和某些生物学性能指标的表征，从而为当前研究选择C24(图84a)以供进一步的研究。C24带有三价4-甲基-1-哌嗪丁胺头部基团，其中理论水相pKa范围在4至8内，两个都接近预测值(7.7和7.8)。我们合成了水溶性类似物(C24-WSA)并使用已建立的1H NMR方法20测量每个氮的pKa，证实理论pKa值在0.4个单位内(图84b)。对于末端氮(pKa 8.1，在图84b中呈红色)，观察到与理想的亨德森-哈瑟尔巴赫行为的略微拉伸偏差，这与具有略低pKa(图84b中的7.5)的氮原子相互作用一致，它们几乎同时质子化。此观察结果还指示这两个位点之间的质子配位和在初始质子化阶段形成配位键的潜力。水溶性MC3类似物的NMR分析揭示pKa为9.5(图84c)，这与预测值9.4(图84a)极其相似。正如我们最近所描述，使用测量表面电荷的TNS染料结合测定评估用C24和MC3制成的LNP的质子化并通过测量LNP净电荷的电泳迁移率评估ζ电位。TNS染料结合测定揭示了C24(6.77)的pKa高于MC3(6.55)并且当pH值从7.4下降至6时表面质子化的增加更大(图84f中的4517与2559RFU)，表明在胞内体pH范围内C24比MC3大的表面质子化。对于TNS染料结合测定而言，将计算胞内体质子化中的下限pH取为6，因为低于此pH值时表面电荷没有变化。与TNS染料结合测定相反，电泳迁移率测量对LNP的净电荷进行测量并显示出降至pH 3的ζ电位增加所反映的LNP净电荷的更广泛变化(图84e)。MC3非常密切地遵循最初为聚电解质34提出的扩展亨德森-哈瑟尔巴赫模型的行为，因为它解释了密切相互作用的可离子化位点的离子化状态依赖性pKa，所述位点是例如在LNP内紧密靠近的数千个二甲胺MC3头部基团。扩展的亨德森-哈瑟尔巴赫分析揭示了MC3LNP的ζ电位pKa为5.33并且pI为5.57(图84f)。C24 LNP的离子化行为更复杂，其中ζ电位在从pH 7.4变至pH 6时快速上升，对应于头部基团中3个氮中的2个的同时质子化，水相pKa为8.1和7.5(图84b)，低于此值时，ζ电位在pKa 3.7下因中心氮的贡献而继续上升(图84b)。C24的这种多质子离子化行为未得到扩展的亨德森-哈瑟尔巴赫模型(图84e中呈红色虚线与实线)很好地表示，导致ζ电位pKa为5.21并且pI为6.12(图84f)。C24 LNP的ζ电位从pH7.4增至pH 4.5(此时胞内体被视为与溶酶体融合)的计算结果高于MC3 LNP(图84f中的25.1mV与14.3mV)，再次表明C24的质子化水平在胞内体pH范围内时高于MC3。综上所述，上述分析将单质子与多质子头部基团上的分子质子化事件与它们在凝聚的LNP环境中的质子化联系起来，并且表明在胞内体pH范围内时，C24 LNP与MC3相比质子化增加了大约2倍。

尺寸表征显示C24 LNP略大于MC3(图85a中的直径80nm与64nm)，并且ribogreen染料结合不可及的mRNA分率略低(图85b中的68％与79％)。ribogreen不可及的mRNA的分率通常称为封装效率，然而，现在已知不可及的部分不是mRNA的游离部分，因为它可能不会在基于凝胶的测定中迁移。使用我们最近公布的LNP分子体积模型来估计每种LNP中萤火虫荧光素酶(FLuc)编码mRNA的拷贝数量，发现MC3 LNP中平均有4.5个拷贝，而C24 LNP中平均有6个拷贝(图2c)，这是由于其较大的尺寸。CyroTEM分析揭示C24 LNP的尺寸更大，与DLS测量结果一致，并且两个LNP都具有相似的结构，显示出外围双层和内部电子致密非晶核(图85d、图85e)。

实施例25：肌内注射后，C24 LNP的荧光素酶表达比MC3 LNP高4倍，并且在肝脏中的脱靶表达比MC3低6倍

以相对较高剂量的5μg mRNA在小鼠中肌内(IM)施用LNP后，mRNA FLuc编码报告基因的体内表达在4小时和24小时的C24注射部位显示出高2倍的表达(图86a和图86b)。对于MC3，肝脏中的全身生物分布和脱靶表达是高的(图86)。相比之下，与MC3相比，这种高剂量的C24实际上消除了全身生物分布，其中肝脏中的脱靶表达降低了6倍(图86C)，这是一个重要发现，因为与mRNA-LNP疫苗相关的全身反应原性和不良事件可与除注射部位和引流淋巴结以外部位的全身生物分布和脱靶表达有关联。在此针对MC3所见的高脱靶表达与先前对MC3的发现一致，并且监管文件表明它也发生在当前紧急授权的COVID-19mRNA疫苗的啮齿动物模型中。显著限制C24 LNP全身生物分布的机制可能与其在接近中性pH值时表面电荷和净电荷的快速增加有关(图86d和图86e)，因为我们先前发现在IM施用时更局部地含有带负电较少的LNP。在更低的0.5μg剂量下IM施用Fluc编码的mRNA-LNP，这更能代表小鼠的疫苗接种剂量，显示C24在注射部位处的表达比MC3高4倍(图86d和图86e)。由于肝脏部位的低信噪比，IVIS在此10倍低剂量下无法检测到脱靶表达。小鼠的每日成像显示持续48小时的初始表达爆发，并在5天内逐渐下降至基线(图86f)。

实施例26：对mRNA编码的SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫原性显示，C24 LNP与MC3LNP相比，针对原始毒株和两种显著变体的结合滴度更高并且假中和滴度高10倍

LNP与核苷修饰的mRNA组装在一起，所述mRNA编码双脯氨酸稳定的膜结合刺突蛋白免疫原(S2P)，所述免疫原在当前紧急授权的COVID-19mRNA疫苗中。在Balb/c小鼠中进行免疫原性研究，通过IM施用两次免疫接种，剂量范围为0.1μg至1μg，在初免与加强免疫之间间隔3周，并且分析血清中针对刺突蛋白受体结合域的结合抗体，以及对SARS-CoV-2假病毒的中和测定。在过渡稀释度下的ELISA结合测定的光密度显示，与MC3相比，在所有剂量下C24 LNP的结合抗体均显著更高(图87a和图87b)。对SARS-CoV-2假病毒的中和测定显示，在加强后的所有剂量下，C24 LNP的中和滴度比MC3显著增加了约10倍(图87C)。在Moderna的SM-102LNP中用相同mRNA编码的免疫原(其他mRNA结构不同)在Balb/c小鼠中进行的一项非常相似的测定揭示了滴度与MC3(1,000，在1μg下)相似，表明C24 LNP可能也比SM-102LNP更有效。在C24 LNP中递送的1μg剂量也能够在单次剂量后诱导中和，其中MC3不产生中和作用(图87c中的初免)。最终，发现以最高1μg剂量接种的动物的血清能够中和SARS-CoV-2的两种变体，并且对于所测试的变体，C24的滴度高于MC3的滴度(图87d)。

实施例27：在K18-hACE2小鼠中的致死挑战揭示，在0.25μg的低初免/加强剂量的核苷修饰的S2P mRNA下C24 LNP可实现完全保护，并且在0.5μg剂量下完全消除肺部感染

在载有人类ACE2受体的K18-hACE2转基因小鼠中研究接种含有S2P免疫原的mRNA-LNP后针对SARS-CoV-2致死感染的保护作用。将含有S2P免疫原的C24和MC3 LNP以0.1至1μg范围内的mRNA剂量水平施用两次，每组5只动物，并且接着用致命鼻内剂量的意大利毒株(意大利分离株-INMI1)SARS-CoV-2进行挑战。将每组五只动物中的两只在第5天处死以评估肺中的病毒滴度，并且对其余3只进行追踪直至满足安乐死标准。我们发现C24 mRNA LNP在0.25μg下完全保护小鼠，其中在0.1μg剂量下3只动物中的一只也存活，而MC3则在0.5μg剂量下出现保护(图88a)。斑块测定中的中和滴度显示C24 LNP在0.25μg下达到的滴度相当于在初免和加强后1μg剂量下MC3的滴度(图88b和图88c)。感染后5天检查肺病毒滴度，发现C24 mRNA LNP在0.5μg剂量下完全阻断肺部感染，并且即使在最高1μg剂量下，MC3也不能完全阻断感染。综上所述，这些结果表明C24 LNP以比MC3低约4倍的剂量实现对感染的保护。在我们的研究中施用两次的0.25μg保护剂量比在含有刺突蛋白的自我复制mRNA的LNP38中所见的单一有效剂量(15μg)低60倍，并且比在还含有自我复制的mRNA的不同LNP下所见的另一单一剂量低10倍。虽然后面这些关于自我复制mRNA的研究是单剂量的，但所需剂量要大得多，并且其水平预计会在人类中产生不可接受的反应原性。与我们最相似的研究是在Moderna的SM-102LNP中使用S2P免疫原进行初免/加强核苷修饰的方法，其中SM-102LNP中高达1μg的S2P免疫原的剂量无法阻断肺部感染，尽管与PBS对照相比，它们确实减少了肺部感染。因此，在我们的研究中，SM-102LNP阻断小鼠肺部感染的效力与MC3相似，支持SM-102和MC3中和滴度对SARS-CoV-2假病毒(都在约1,000下，图87c)的类似效力。综上所述，这些结果表明C24 LNP系统在小鼠模型中超过MC3和SM-102LNP的效力。通常，无法由小鼠模型预测向非人类灵长类动物和人类的翻译，因此需要更大的动物模型和临床研究结果来进一步评估C24mRNA LNP疫苗。

实施例28：C24 LNP的注射部位炎症比MC3 LNP温和

MC3 mRNA LNP的注射部位炎症在IM施用后24小时由肉眼可见的肿胀和注射腿的高度僵硬在视觉上显而易见。以5μg剂量注射的C24 mRNA LNP的注射部位炎症在肉眼上程度低于MC3 LNP注射部位的肿胀。因此，我们固定并处理注射腿以进行标准组织学分析(石蜡和H&E染色)。我们发现所注射的50μL mRNA LNP储库不在肌肉组织内，而是主要沉积在内侧与外侧腓肠肌之间的面平面中(图89a、图89d和图89g中的IS)并且难以区分这些部位的脂肪组织。LNP储库的此非肌内部位是由于标准的3mm注射深度穿过约2mm厚的内侧腓肠肌。内侧腓肠肌的体积仅为约150μL41，因此即使注射深度减小，标准的50μL LNP体积也不太可能包含在肌肉内。在将C24组织学与MC3进行比较时，我们观察到MC3的炎症水平更高，例如在多细胞的滑膜中，并且MC3与C24的正常外观相比是增厚的(图89e、图89f与图89b、图89c)。除了注射部位处有白细胞和脉管系统浸润外，还观察到C24和MC3 LNP在施用后24小时存在混合细胞型淋巴样结构(图89a、图89g、图89i)，而对照未注射的腿中则不存在。这些快速形成(在24小时内)的淋巴样结构可在小鼠的免疫反应中发挥重要作用，并且正在进行进一步表征。

实施例29：LNP在4℃下的储存揭示C24 LNP可稳定至少19天，而在较高温度下的储存会诱导生物活性丧失和mRNA切割，这与mRNA切割的磷酸二酯酯基转移反应机制一致

mRNA LNP通常需要冷冻储存，并且根据紧急授权LNP的使用说明书，可在冷藏温度下储存长达30天。近期的审查强调几乎完全缺乏有关导致mRNA LNP储存期间的不稳定性机制的信息，尽管欧洲监管文件指出不稳定性是温度依赖性的，并且涉及mRNA完整性的丧失以及LNP尺寸的变化和杂质的产生。因此，我们将C24和MC3 FLuc mRNALNP在PBS中在2个温度，即4℃或室温(RT≈22℃)的一个下储存2周，并通过荧光素酶的体外表达测试生物活性。我们发现C24和MC3 LNP在4℃下储存2周时的生物活性是稳定的(对在不同日期接种的细胞进行的此生物活性测定的高度可变性范围内)，但在室温下储存时下降了20-40％(图90a)。没有发现LNP尺寸或对Ribogreen的可及性在2周内在任一储存温度下发生任何变化(图90b和图90c)。使用从表征碱催化的磷酸二酯酯基转移和mRNA骨架切割的温度和pH值依赖性的数据中导出的模型计算2,061个核苷酸长的FLuc的mRNA完整性随时间的丧失。所述模型预测的半衰期为4℃下2,300天、22℃(RT)下125天和37℃下11天，均在pH 7.4下(图90d)。因此，预计mRNA骨架切割对温度极其敏感，并且这些趋势与先前对游离mRNA的发现在性质上一致。接着，在4℃和22℃(RT)以及37℃下将另外的mRNA LNP储存在PBS中以加速降解，并在氯仿/甲醇中提取mRNA，以在微流体电泳装置上分析mRNA的完整性。我们发现mRNA的完整性在4℃下储存时可保持至少19天，而较高温度会产生mRNA切割(图90e)。通过对应于FLucmRNA峰的曲线下面积(AUC)估计mRNA完整性，所述峰相对于C24与MC3 LNP合在一起的第0天值归一化。在较高温度下，C24 LNP似乎比MC3 LNP保持更高水平的mRNA完整性，但样品数量太少而无法进行统计分析(图90f)。在较高温度下增加的mRNA切割与基于介导的mRNA切割的磷酸二酯酯基转移反应机制模型一致(图90d)，但可能呈现出对LNP环境和LNP中可离子化脂质的特定结构的依赖性。LNP环境可例如通过质子分配现象加速mRNA降解，我们发现所述现象是水介质中可离子化脂质与LNP中可离子化脂质pKa差异的原因。即，与外部水相相比，脂质环境中较高的质子溶剂化能将排除质子并提高LNP中的pH，从而可加速碱介导的mRNA切割，正如碱催化的磷酸二酯酯基转移和mRNA骨架的切割模型的pH依赖性所预测的。

实施例30

材料与方法

材料

DMG-PEG(MW 2000Da)(DMG-PEG2000)是购自NOF America。胆固醇购自CombiBlocks。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0PC,DSPC)购自Avanti Polar Lipids。4-甲基-1-哌嗪丁胺购自Enamine。丙烯酰氯、三甲基甲硅烷基丙磺酸钠(DSS)购自SigmaAldrich。2-辛基-1-十二醇购自BOC sciences。叔丁醇和新戊醇购自combi-blocks。除非另有说明，否则所有反应都在周围空气气氛下进行。除非另有说明，否则所有市售试剂都不经进一步纯化而使用。将3,3'-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)氮烷二基)二丙酸双(2-辛基十二烷基)酯(C24)和C24与MC3的水溶性类似物如下所述合成并纯化。与Spark NanoAssmblr^TM相容的微流体盒购自Precision Nanosystems。3M醋酸钠pH＝5.5购自ThermofisherScientific。ONE-Glo荧光素酶测定系统购自Promega Corporation。Slide-A-Lyzer^TMMINI透析装置0.5ml(MWCO,10KDa)、20X TE缓冲液、无RNA酶和Quanti-iT Ribogreen RNA试剂购自Thermo Fisher Scientific。Triton X-100和6-(对甲苯胺)-2-萘磺酸钠盐(TNS)购自Sigma。将萤火虫荧光素酶(FLuc)序列克隆至mRNA生产质粒(优化的3'和5'UTR并含有101聚A尾)中，使用N1-甲基假尿苷修饰的核苷进行体外转录，使用CleanCap技术(TriLink)进行共转录加帽并经纤维素纯化45以去除dsRNA。预融合双脯氨酸稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白(S2P)序列经密码子优化，并如上所述产生。将经纯化的mRNA进行乙醇沉淀，洗涤，重悬于无核酸酶的水中，并进行质量控制(电泳、点状印迹和转染至人类DC中)。D-荧光素(钠盐)购自REGIS technologies,INC。HEK293细胞购自ATCC。

可离子化脂质和可离子化脂质类似物的合成

溶剂购自Sigma Aldrich、Combi blocks、Oakwood chemicals、Alfa Aesar、VWR和Thermofisher。无水二氯甲烷(DCM)、无水四氢呋喃(THF)和无水DMF购自Sigma Aldrich。使用Opt监测反应。KMnO4玻璃基硅胶板、F254薄层色谱板(TLC)和柱纯化是使用购自Siliccycle的硅胶色谱法(TLG-R10014BK-323)进行。使用CDCl3、D2O(Sigma Aldrich)作为d-溶剂和内标(1H NMRδ7.26和13C NMRδ77.00)在Bruker 400MHz光谱仪上记录NMR谱。1MNaOH和1M HCl溶液购自Sigma Aldrich。四种内部NMR标准品(哌嗪、咪唑、氯乙酸和乙酸)购自Sigma Aldrich，并且选择性地用于原位NMR pH测量。

C24可离子化脂质和水溶性类似物

将丙烯酸2-辛基十二烷酯2(2)(3.4mmol,1.2g,1.48ml)添加至烘干的5mlbiotage微波小瓶中，并滴加4-甲基-1-哌嗪丁胺(1)(1.31mmol；0.224g)46。保持无溶剂条件并将密封的微波小瓶在90℃下搅拌2-3天。通过TLC(氯仿/甲醇9:1v/v，可用碘染色和磷钼酸染色来观察)监测反应进程直至1完全消耗。将粗产物在硅胶柱上纯化，用含0-5％甲醇的氯仿洗脱。通过薄层色谱法(TLC)分析柱级分并将含有纯产物的级分(Rf＝0.3)浓缩，以获得呈黄色油状的产物3,3'-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)氮烷二基)二丙酸(双(2-辛基十二烷基)酯(3)。(0.77g，产率72％)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3,δ＝7.26ppm作为标准):δ3.95(d,6.0Hz,4H),2.76(t,7.4Hz,4H),2.49-2.40(m,12H),2.34(t,7.2Hz,2H),2.30(s,3H),1.60(s,br,2H),1.44-1.435(m,4H),1.25(m,64H),0.87(t,6.8Hz,12H)。13C NMR:(100MHz,CDCl3,δ＝77.0ppm作为标准):δ172.8(C),67.2(CH2),58.5(CH2),55.1(CH2),53.6(CH2),53.2(CH2),49.2(CH2),46.0(CH3),37.3(CH),32.6(CH2),31.94(CH2),31.92(CH2),31.2(CH2),30.0(CH2),29.7(CH2),29.67(CH2),29.60(CH2),29.38(CH2),29.35(CH2),26.7(CH2),25.2(CH2),24.7(CH2),22.7(CH3)。

C24-水溶性类似物

将4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-胺(1)(1.16mmol,0.2g)与丙烯酸叔丁酯46(4)(3.13mmol,0.40g)的混合物添加至烘干的5ml biotage微波小瓶中并保持无溶剂条件46。将密封的微波小瓶在90℃下搅拌2-3天。通过TLC(氯仿/甲醇9:1v/v，可用碘染色和磷钼酸染色观察)监测反应进程，直至1完全消耗。将粗产物在硅胶柱上纯化，用含0-5％甲醇的氯仿洗脱。通过薄层色谱法(TLC)分析柱级分并将含有纯产物的级分(Rf＝0.34)浓缩，以获得呈黄色油状的产物(5)。(0.30g，产率53％)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3,δ＝7.26ppm作为标准):δ2.67(t,7.2Hz,4H),2.44-2.42(m,9H),2.37-2.27(m,7H),2.25(s,3H),1.84-1.78(m,2H),1.44-1.39(m,22H)。13C NMR:(100MHz,CDCl3,δ＝77.0ppm作为标准):δ172.0(C),80.1(C),58.3(CH2),54.9(2×CH2),53.5(CH2),52.9(2×CH2),49.2(2×CH2),45.8(CH3),33.6(2×CH3),28.0(9×CH3),25.2(CH2),24.5(CH2)。

DLin-MC3-DMA水溶性类似物

DLin-MC3-DMA水溶性类似物是按照先前文献报道合成的。将4-(二甲氨基)丁酸盐酸盐(6)(59.7mmol,1.0g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(7.16mmol,0.63g)、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(1.49mmol,0.18g)、三乙胺(42.0mmol,4.25g,5.83mL)和CH2Cl2(100mL)置于250-mL双颈圆底烧瓶中。将反应在室温下搅拌20分钟并滴加新戊醇(7)(7.16mmol,0.78mL)并将反应搅拌过夜。通过TLC(氯仿/甲醇9:1v/v，可用碘染色观察)监测反应进程，直至6完全消耗并通过旋转蒸发去除溶剂CH2Cl2。将混合物溶解于100mL CH2Cl2中并用150mL水和150mL饱和NaHCO3溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并蒸发。将粗产物在硅胶柱上纯化，用含0-1％甲醇的氯仿洗脱。通过薄层色谱法(TLC)分析柱级分并将含有纯产物的级分(Rf＝0.4)浓缩，以获得呈黄色油状的产物(8)。(0.58g，产率48％)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3,δ＝7.26ppm作为标准):δ2.36(t,7.4Hz,2H),2.31(t,7.2Hz,2H),2.22(s,6H,2×NCH3),1.84-1.78(m,2H),0.86(s,9H,2×CH3)。13C NMR:(100MHz,CDCl3,δ＝77.0ppm作为标准):δ173.6(C),73.6(CH2),58.8(CH2),45.3(2×CH3),32.1(CH2),31.2(C),26.4(9×CH3),22.9(2×CH2)。

水溶性可离子化脂质类似物的pKa的NMR测量。

质子NMR化学位移的pH依赖性用于按照已公开的方法5,6测量可离子化脂质水溶性类似物(WSA)的pKa值。哌嗪、咪唑、2-氯乙酸和乙酸的化学位移用作内部pH指示剂。MC3-WSA的溶液是用100mM KCl、2mM哌嗪、2mM咪唑和5mM水溶性可离子化脂质类似物于95％H2O-5％ D2O中制备。C24-WSA羧酸酯的β位的末端(N1)和氮杂胺(N2)的溶液是用100mMKCl、2mM哌嗪、2mM咪唑、0.2mM DSS和5mM水溶性可离子化脂质类似物于95％ H2O-5％ D2O中制备。C24-WSA的内部胺(N3)溶液是用100mM KCl、2mM氯乙酸、2mM乙酸、0.2mM DSS和5mM水溶性可离子化脂质类似物在95％ H2O-5％ D2O中制备。将溶液分成两个等体积，并且一个使用0.1M HCl滴定至较低pH，而另一个使用0.1M NaOH滴定至较高pH，其中较低和较高pH涵盖所需的pH范围。通过混合不同比例的这两种溶液获得中间pH值。NMR测量是在Bruker400MHz光谱仪上进行的，其中在从低至高pH范围内的约24个pH值的每一者下均获得1H光谱。MC3的峰经校准至D2O(400MHz，D2O，δ＝4.79ppm作为标准)，而C24的峰经校准至DSS(400MHz，DSS，δ＝0.00ppm作为标准)。接着使用哌嗪、咪唑、2-氯乙酸和乙酸的化学位移，根据已公开的方法5,6计算每种溶液的pH，并且与可离子化脂质水溶性类似物头部基团中的每个氮相邻的质子的化学位移经拟合至亨德森-哈瑟尔巴赫方程以提供每个氮的pKa。光谱在补充图2中。

pKa的理论计算

使用Advanced Chemistry Development,Inc.(ACD/Labs)软件将来自NMR、ζ电位和TNS测定的实验确定的pKa值与理论计算值进行比较。ACD/pKa数据库使用两种方法基于其组成片段在水性环境中通过算法估计整个分子的pKa值。经典算法采用参数化的哈米特(Hammett)型方程数据库，以涵盖大多数可离子化官能团，各自的特征为若干个涉及σ常数变化的方程。Galas算法基于反应中心和邻近离子化中心的周围环境来估计处于假设不带电状态下的所有可能离子化中心的pKa微常数，以产生从其获得pKa宏观常数的微常数。本研究使用经典算法计算。

mRNA脂质纳米颗粒的制备

通过使用50/10/38.5/1.5(对于MC3)和48/13/37/2(对于C24)的可离子化脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000的摩尔比百分比在乙醇中制备脂质并在水性缓冲液中制备mRNA来配制载有mRNA的LNP。这两种溶液在Spark NanoAssmblr^TM(Precision NanoSystems)中以一定体积和浓度混合，以实现mRNA骨架上可离子化脂质与磷酸酯的摩尔比为4，并喷射至pH7.4的PBS中。MC3 LNP是使用先前描述的标准程序制备的，而C24 LNP组件针对此特定配制优化了一些参数。将所得混合物以1:1稀释至PBS pH 7.4中，并使用Slide-A-Lyzer MINI透析装置(MWCO，10kDa)针对PBS进行透析，以在6小时内6次缓冲液交换后达到pH 7.3-7.4。

mRNA的Ribogreen不可及性的测定

将Tris(10mM，pH＝7.5)/EDTA(1mM)(TE)和Triton/TE(TE缓冲液中的2％v/vTriton)一式两份添加至黑色微孔板中。将LNP中的总mRNA在TE中稀释至约4ng/μL，并以1:1的体积比添加至每个TE和TE/Triton孔中。Ribogreen测定中包括两条标准曲线，一条含有mRNA和TE，另一条含有mRNA和Triton/TE。每条标准曲线用于计算每个相应缓冲液中mRNA的ribogreen可及性。与Triton/TE中的单一标准曲线相比，这种使用两条标准曲线的方法是必需的，其可能将不可及性高估了5-10％，因为Ribogreen在Triton/TE中比在TE中具有更高的背景荧光。将微孔板在37℃下温育10分钟，以使用Triton提取LNP。将DMSO中的Ribogreen试剂在TE缓冲液中按1:100稀释，并以1:1的体积比添加至每个孔。立即将微孔板引入Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)中以读取荧光(Ex485/Em528)。

TNS测定

使用TNS测定测定LNP pKa。将TNS制备成于DMSO中的300μM储备溶液。将LNP在总体积约103μL的缓冲溶液中稀释至24μM可离子化脂质，TNS至6.3μM，所述缓冲溶液含有20mM硼酸、10mM咪唑、10mM醋酸钠、10mM甘氨酰甘氨酸、25mM NaCl，其中pH范围为3至10。使用Cytation 5细胞成像多模式读取器(Biotek)来读取荧光(Ex321/Em445)。在添加TNS后测量每个孔的pH。Mathematica(Wolfram Research)用于将荧光数据拟合至亨德森-哈瑟尔巴赫方程RFU＝RFU_max-((RFU_max-RFU_min))/((1+10^(pKa-pH)))，以提供pKa。

使用动态光散射和电泳迁移率测定的mRNA LNP尺寸、ζ电位(ZP)、ZP pKa和pI、mRNA拷贝数。

将LNP在PBS pH＝7.4中稀释至6.25ng/μL并转移至石英比色皿(ZEN2112)中，以通过动态光散射(DLS)在Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)中使用1.45的颗粒RI和0.001的吸光度在25℃下在PBS中测量尺寸，其中粘度为0.888cP并且RI为1.335。使用173°反向散射检测角进行测量，先前在25℃下平衡30秒，一式两份，各操作5次并且操作持续时间为10秒，测量之间没有延迟。每次测量在石英比色皿中均有4.65的固定位置并带有自动衰减选择。使用具有正常分辨率的General-Purpose模型分析数据。直径被报告为与ζ平均值相比，更接近于电子显微镜中所见的物理尺寸的数均值。之前描述的分子体积模型被用于使用数均直径来估计LNP中的mRNA拷贝数，以计算LNP体积。将LNP稀释至上述TNS缓冲液中，pH范围为3-10，以用于在Zetasizer Nano ZP(Malvern Panalytical)中通过电泳光散射(ELS)，使用与上述相同的材料和分散剂参数以及斯莫鲁霍夫斯基(Smoluchowski)模型进行ζ电位测量。每次测量均将电压手动设置为80伏，以避免在自动设置电压时发生欧姆加热。在具有光子计数自动衰减选择的一次性折叠毛细比色皿中一式三份进行测量，各操作20次，并且每个复制之间有30秒延迟。Mathematica用于将ζ电位数据拟合至扩展的亨德森-哈瑟尔巴赫方程的数据

Ψ＝Ψ_max-((Ψ_max-Ψ_min))/((1+10^(((pKa-pH))/n)))

以分别提供pKa、n和低pH和高pHζ电位限值Ψ_max和Ψ_min。此处使用扩展模型，因为LNP pKa以类似于聚电解质的方式呈离子化状态依赖性的。TNS数据不需要扩展模型，因为TNS染料结合仅检测LNP表面电荷。等电pI是通过将ζ电位内插为零而得出的pH。

冷冻电子显微镜

使用Vitrobot Mark IV系统快速冷冻电子显微镜网格。将腔室设置为25℃和100％的湿度。将LNP(3μL)施加于网格(蕾丝碳支撑体上的超薄碳膜，Ted Pella#01824G)上，温育1分钟，接着在浸入液体乙烷之前以25的印迹力印迹两次，每次3秒。在TalosArctica系统(Thermo Fisher Scientific)上使用Falcon 3EC检测器在200kV下对网格成像，使用EPU进行数据收集。标称放大倍数为45,000倍，校准像素尺寸为0.223nm。使用5秒曝光以积分模式收集图像，总剂量为并使用Motioncor252对66个部分进行运动校正。

肌内施用含有FLuc mRNA的C24和MC3 LNP后荧光素酶表达的体内活动物成像。

研究人员遵循国家研究委员会生命科学实验室动物资源委员会的护理委员会的“实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”。小鼠研究是根据宾夕法尼亚大学(UPenn)机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行的。所有动物都根据当地、州和联邦政策在国际实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)认可的设施中饲养和照护。8周龄雌性Balb/c小鼠购自Charles Rivers并在实验之前在宾夕法尼亚大学适应7天。使用3/10cm3 29G胰岛素注射器(BD Biosciences)向小鼠注射5μg或0.5μg FLuc mRNA-LNP。将mRNA-LNP在PBS中稀释并注射至腓肠肌(50μL注射体积)中。注射后4小时，将小鼠用氧气中的2％异氟烷麻醉，并在腹膜内注射250μL D-荧光素(15mg/ml)后10分钟成像。使用IVIS Spectrum成像系统(Caliper Life Sciences)进行生物发光成像。在24小时，重复成像并对动物实施安乐死。在寿命实验中每天对动物成像持续5天。在施用后24小时也将腿部固定，并将注射部位固定在中性缓冲福尔马林中，在石蜡中处理，并用苏木精和曙红染色。

含有核苷修饰的S2P SARS-CoV-2免疫原的C24和MC3 LNP在Balb/c小鼠中的免疫原性。

向Balb/c小鼠(Charles Rivers)施用含有0.1、0.25、0.5、1.0μg核苷修饰的mRNA编码的S2P免疫原的C24和MC3 LNP(N＝5只动物/剂量/LNP)，以50μl注射至腓肠肌内侧中。两次注射间隔3周，并在第一次注射前一天(放血前)、第二次注射前(初免)和第二次注射后2周(加强)经由眶后途径收集血液。在室温下30分钟温育期后将血清从血液中分离，并将样品在非冷藏的Eppendorf 54离心机(Eppendorf,Enfield,CT,USA)中以10,000g离心5分钟。将经分离的血清在使用前储存在-20℃下。使用终点酶联免疫吸附测定(ELISA)测定总抗体滴度。简言之，将High Bind Stripwell^TMCorning 96孔透明聚苯乙烯微孔板用1μg/ml经纯化的SARS-CoV-2RBD(目录号Z03501)包被过夜，用洗涤缓冲液(PBS中的0.05％ Tween-20)洗涤一次，并且在室温下使用PBS中的2％w/v BSA阻断两小时。接着将板洗涤三次，并将小鼠血清按1:27,000(初免血清)和1:54,000(加强血清)加入阻断溶液中，并在室温下温育2小时，洗涤三次之后用(HRP)缀合的抗小鼠二抗在阻断缓冲液(1:10 000)中温育1.5小时。温育后，将板洗涤三次，之后每孔添加100μl KPL TMB底物，持续8分钟。使用2N硫酸终止反应，并使用SpectraMax^TM190酶标仪在450nm下测量吸光度。为了确定中和潜力，将VSVΔG-RFP假型病毒(50-200个病灶形成单位/孔)与2倍连续稀释的血清样品一起温育，并在37℃下温育1小时，之后将病毒-抗体混合物添加至VeroE6 TMPRSS2细胞中。感染后20小时，将细胞用4％多聚甲醛洗涤并固定，之后在S6 FluoroSpot分析仪(CTL，Shaker Heights OH)上观察。对单个感染病灶进行枚举，并将数值与没有抗体的对照孔进行比较。病灶减少中和滴度50％(FRNT50)经测量为最大血清稀释度，在所述稀释度下病灶计数相对于不存在小鼠血清的情况下感染假型病毒的对照细胞减少了至少50％。每个样品的FRNT50滴度在不同日期进行两次技术重复测量。

通过使用含有核苷修饰的S2P SARS-CoV-2免疫原的C24和MC3 LNP进行免疫接种，保护K18-hACE2小鼠免受SARS-CoV-2的致死挑战

向购自Jackson Laboratory K18-hACE2小鼠的雌性B6；SJL-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J(hACE2)小鼠施用含有0.1、0.25、0.5、1.0μg核苷修饰的mRNA编码的S2P免疫原的C24和MC3 LNP(N＝5只动物/剂量/LNP)，以50μl注射至腓肠肌内侧中。小鼠接受mRNA LNP的初免注射和加强注射，并且两次注射间隔6周。在第一次注射之前(放血前)、第二次注射之前(初免)和第二次注射后2周(加强)，通过下颌放血收集血液。中和抗体通过斑块减少中和滴度测定(PRNT)(如下所述)来评估。SARS-CoV-2繁殖是在接种Vero细胞的细胞培养瓶中以60-75％的汇合度进行的。所述细胞感染了SARS-CoV-2意大利分离株-INMI1(来自BEIResources)。感染进行48-72小时，之后回收上清液，并通过斑块测定评估病毒滴度。在用SARS-CoV-2进行第二次免疫后2周，通过鼻内施用以5X105 pfu的剂量对小鼠进行挑战，并跟踪直至满足死亡或安乐死标准。每天记录体重和温度。在挑战后第5天处死每组5只小鼠中的两只以通过斑块测定评估肺病毒滴度。将肺组织均质化并离心。回收上清液以通过斑块测定评估病毒负荷量。每天监测其余三只小鼠的发病和死亡迹象。每天还记录存活小鼠的体重和温度读数，直至研究结束。

对于PRNT50测定，将小鼠血清在DMEM(补充有5％ FBE、1％L-谷氨酸和20U/mL青霉素和20μg/mL链霉素)中按1:10稀释。接着从1:10稀释液中制备连续的两倍稀释液，并与100pfu的SARS-CoV-2病毒混合，并在37℃下温育1小时。接着将血清/病毒混合物以12孔板形式覆盖在汇合的Vero细胞层上，并在37℃和5％ CO2的温育箱中温育1小时。接着用伊格尔最低必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(不含酚红，补充有5％ FBE、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠(VWR,45000-710,Dixon,CA,USA)、2mM L-谷氨酰胺、20U/mL青霉素和20μg/mL链霉素)与0.6％琼脂糖(ThermoFisher，16500100)的1:1混合物覆盖接种孔，并在37℃和5％ CO2下温育48小时。接着将细胞用10％甲醛(FisherSci,F79p-4)固定1小时。去除培养基，将细胞用diH2O洗涤并用1％结晶紫(FisherSci,C581-25)和20％乙醇溶液(FisherSci,BP2818-4)染色。对斑块进行计数并绘制成pfu/稀释度。

对于斑块测定，将Vero细胞(WT Veros，ATCC)以每孔2X105个细胞的密度铺于12孔板中并温育过夜。将来自组织匀浆的上清液连续稀释至10-6，并覆盖在细胞上1小时(37℃，5％ CO2O)。接着用伊格尔最低必需培养基(不含酚红，补充有5％ FBE、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠(VWR,45000-710,Dixon,CA,USA)、2mM L-谷氨酰胺、20U/mL青霉素和20μg/mL链霉素)以及0.6％琼脂糖(ThermoFisher，16500100)覆盖细胞并温育48小时。接着将细胞用10％甲醛(FisherSci,F79p-4)固定1小时。去除培养基，将细胞用diH2O洗涤并用1％结晶紫(FisherSci,C581-25)和20％乙醇溶液(FisherSci,BP2818-4)染色。手动计数斑块，并且数据集表示每毫升的斑块形成单位(PFU/mL)。

mRNA LNP的储存/稳定性研究

将含有FLuc mRNA的C24和MC3 LNP在4℃或室温(RT≈22℃)下储存在PBS中。将它们在储存的第0、2、4、7、14天通过如上所述的DLS测定尺寸、如上所述的mRNA封装以及经由转染至HEK293细胞中并评估荧光素酶表达来测定生物活性。对于生物活性，在转染前一天，将HEK293细胞以每孔12x10³个细胞的密度接种于100μL EMEM培养基(10％ FBS)中的白色96孔板中，并在37℃5％ CO2下温育。将载有FLuc mRNA的LNP稀释，使得8μL含有25ng mRNAFLuc，并在接种之后24小时使用一式三份在此剂量下转染HEK293细胞。进一步转染24小时后，将100μL One-Glo底物直接添加至孔中，以便根据Cytation 5亮度计读板仪中的发光检测荧光素酶表达。将含有FLuc mRNA的额外C24和MC3 LNP在PBS中于4℃、RT和37℃下储存19天。使用氯仿/甲醇从LNP中提取FLuc mRNA，并按照制造商说明书，在2100Bioanalyser(Agilent)上通过微流体电泳分析mRNA的完整性。通过Nanodrop量化mRNA浓度，接着稀释至1ng/ul以在Bioanalyser中加载每个样品的1ng mRNA。通过对主要mRNA FLuc峰的曲线下面积(AUC)积分并归一化至C24和MC3LNP合在一起的第0天平均值来计算mRNA的完整性％。

统计学和重现性

将在JMP Pro 15.1.0软件中的线性最小平方多变量模型用于执行图84与图86中的组之间的比较。对于体内IVIS成像数据，4和20/24小时的时间点被视为重复测量。将Log10转换应用于FRNT50和病毒滴度。使用线性回归模型依照LNP比较OD与转换的FRNT50和病毒滴度，对剂量进行调整，如图87a至图87c、图88d和图8h中。将使用LNP作为预测因子的未调整线性回归用于比较图87d中的假病毒中和。使用Fishers Exact Test，依照LNP比较SARS-CoV-2致死挑战后死亡的小鼠比例，不包括PBS(图88a)。以剂量、稀释度和LNP作为固定效应并且对小鼠随机截距的线性混合效应模型评估了LNP对所检测病毒的百分比的影响(图88b、图88c、图88f、图88g)。线性回归和混合效应模型在R版本3.6.3中运行。

实施例31-图84

多质子C24可离子化脂质在LNP中产生多级质子化，并在胞内体pH范围内产生比MC3 LNP更大的质子化。a)展示理论pKa的C24和MC3及其水溶性类似物的结构。C24可离子化脂质(MW 876.49)有两个可快速降解的酯键，每个键都连接至不对称支链C8-C10(双2-辛基十二烷基)烷基尾部。C24的头部基团为三价的，使用ACDLabs Percepta Classic算法计算的理论pKa为7.8、4.1和7.7。MC3(MW 642.11)有一个可缓慢降解的酯(所述酯连接至二亚油酸尾部)和单价头部基团，理论pKa为9.4。b)使用插图中的水溶性类似物，使用与每个氮相邻的质子的1H NMR化学位移的pH依赖性测量C24可离子化脂质中每个氮的pKa。化学位移相对于pH值的曲线与亨德森-哈瑟尔巴赫方程的拟合提供了每个氮的pKa，并且与84(a)中所示的ACDLabs Percepta Classic算法预测的pKa相差0.4个单位以内。末端氮(红色)滴定的拉伸外观表明其质子化形式与最靠近接头的氮(蓝色)相互作用，同时质子化可能会协调这两个氮原子。c)使用二甲胺质子的1H NMR化学位移的pH依赖性并拟合至亨德森-哈瑟尔巴赫方程，测量MC3的二甲胺氮的pKa。所测量的pKa为9.5，与(a)中显示的由ACDLabsPercepta Classic算法所预测的值9.4一致。d)使用TNS染料结合测定测量C24和MC3的LNPpKa。TNS pKa量度表面电荷并且不能反映低于pH≈6的质子化。在针对C24和MC3的测定中使用等量的可离子化脂质，由此对于低于7的pH，C24的较高RFU表明在胞内体pH范围内C24LNP的表面质子化水平较高，其中t检验比较在pH 6和6.5下C24与MC3的RFU，显示出显著差异p<0.05(*)(N＝3的平均值+/-SD)。e)使用电泳迁移率测量LNP净电荷和离子化，以提供在pH范围3-10内的ζ电位。电泳迁移率取决于LNP的净电荷，并且可在整个pH范围内检测质子化，包括当胞内体与溶酶体融合时，胞内体pH值低至4.5。对于单质子MC3可离子化脂质，ζ电位拟合最初为聚电解质开发的扩展的亨德森-哈瑟尔巴赫方程(实线)，因为它捕获多价LNP的pKa的离子化状态依赖性，其中LNP内含有数千个紧密靠近的强相互作用的MC3分子。对于C24，ζ电位不能准确地拟合扩展的亨德森-哈瑟尔巴赫模型(虚线与红色实线)，因为每个C24含有3个具有不同pKa的氮，如b所示。两个外围氮将在较高pH值下质子化，而内部的中心氮在pH值低于4.5时产生急剧增加的ζ电位。C24 LNP在中性pH值下产生更负的ζ电位，其随着在胞内体pH范围内pH的下降而迅速上升，表明C24的胞内体质子化比MC3更大，并且在pH7.4下比较C24与MC3的ZP(mV)的t检验显示显著差异p<0.001(*)(N＝3的平均值+/-SD)。f)由ACD Percepta Classic算法所预测的pKa与通过NMR对水溶性类似物所测量的以及TNSpKa、ζ电位(ZP)pKa、ZP等电pI相比较，TNS RFU在从pH 7.4至6下增加并且ζ电位在从pH 7.4至4.5下的增加。NMR pKa与理论预测的pKa一致，并且明显高于由TNS和ζ电位所测量的LNPpKa。最近解释了分子与胶态pKa之间的这种差异，主要是由于LNP的脂质相与水性介质20之间的质子分配。C24的TNS RFU在从pH 7.4至6下的增加和ζ电位在从pH 7.4至4.5下的增加几乎是MC3的两倍，表明C24的表面LNP质子化(TNS)和LNP净电荷(ZP)在胞内体pH范围内比MC3增加更多。

实施例32-图85

C24和MC3脂质纳米颗粒的结构特性。a)DLS数均尺寸显示C24 LNP比MC3 LNP稍大并且多分散性指数较低。b)ribogreen测定显示，与MC3相比，C24的ribogreen不可及的mRNA的水平略低。使用2条标准曲线，在有和没有Triton下进行此测定。当仅使用一条带有triton的标准曲线时(例如，在迄今为止的大多数出版物中)，ribogreen不可及的mRNA增加了约8％，如黄色阴影部分所示。此测定通常被解释为封装效率％与在此显示的ribogreen不可及的mRNA％。后者更准确，因为已显示mRNA的染料可及性并不表明mRNA是游离的并且未经封装的。然而，它可能反映了LNP的不同包装和内部结构。c)使用先前公布的分子体积模型和每个LNP的数字加权平均直径计算mRNA拷贝数。我们估计C24可离子化脂质的分子体积与其在1.76nm3下的MW成正比，对于MC3则在1.29nm3下。d)MC3和C24(E)的CryoTEM揭示尺寸与DLS数均尺寸一致。如前所述，两个LNP都有外围双层，与此区间中的DSPC定位一致。

实施例33-图86

在Balb/c小鼠中肌内(IM)施用后的荧光素酶表达显示与MC3相比，C24 LNP有显著更高的中靶和更低的脱靶mRNA表达。a)IM施用LNP中5μg剂量的FLuc后4小时和24小时的体内成像显示，与MC3相比，使用C24递送的Fluc的肌内表达(绿色ROI)更高，并且还揭示了MC3的显著全身分布，导致肝脏中的脱靶表达(红色ROI)。b)在此5μg高剂量下，C24的肌内表达明显高于MC3，其中p＝0.0074，在光子通量的多变量分析中LNP的作用作为LNP(MC3/C24)和时间(4小时/24小时)的函数。c)IM施用后肝脏中的脱靶Fluc表达对于C24比MC3低6倍，其中在比较LNP的t检验中p＝0.051。d)当施用低剂量(0.5μg)的更具代表性的疫苗接种时，C24与MC3相比，4小时肌肉中的FLuc高约4倍，其中p＝0.0034(在e中)，在Flux的多变量分析中LNP的作用作为LNP(MC3/C24)和时间(4小时/24小时)的函数。f)在5天内跟踪IM施用5μg剂量的荧光素酶表达的持续时间，显示在前2天快速下降，然后表达缓慢下降。

实施例34-图87

在Balb/c小鼠的免疫原性研究中，C24 LNP产生的结合和假中和抗体滴度比MC3LNP高10倍。向Balb/c小鼠以范围在0.1至1μg内的4个剂量施用含有编码SARS-CoV-2的双脯氨酸稳定的膜结合刺突蛋白(S2P)的核苷修饰的mRNA的C24和MC3 LNP。a)在27,000的过渡稀释度下的ELISA光密度，用于S2P结合抗体测定，对于低剂量0.1μg和0.25μg mRNA编码的S2P免疫原，在加强后2周收集血清。包括LNP和剂量作为预测因子的线性回归模型分析显示，C24结合抗体OD显著高于MC3(p＝0.0005)。平均值+/-SEM。b)在54,000的过渡稀释度下的ELISA光密度，用于S2P结合抗体测定，对于更高剂量的0.5μg和1.0μg mRNA编码的S2P免疫原，在加强后2周收集血清。包括LNP和剂量作为预测因子的线性回归模型分析显示，C24结合抗体OD显著高于MC3(p＝0.01)。平均值+/-SEM。c)在单次注射1μg初免剂量后3周，C24LNP产生可检测的针对VSVΔG-RFP SARS-CoV-2假病毒的FRNT50滴度，而MC3 LNP则没有(左侧初免图)。加强后两周(右侧加强图)，0.25至1μg剂量的C24 LNP揭示FRNT50滴度比相同剂量的MC3 LNP高约10倍。对数转换的FRNT50滴度的线性回归模型分析(包括剂量和LNP作为预测因子)显示，C24FRNT50滴度对于初免(p＝0.00002)和加强(p＝0.011)显著高于MC3。平均值+/-SEM。d)代表变体D614G和ZA的假病毒变体中和表明C24的FRNT50滴度高于MC3 LNP，尽管统计分析没有发现显著差异。平均值+/-SEM。

实施例35-图88

C24 LNP在低剂量的S2P免疫原下对致命的SARS-CoV-2挑战具有保护作用，并且完全消除肺部感染。在K18-hACE2小鼠(N＝3只/组，从第0天N＝5只起，因为在第5天每组取2只动物以评估肺病毒滴度)中，含有0.25μg mRNA编码的S2P免疫原的C24 LNP具有完全保护性(a)以抵御SARS-CoV-2的致命挑战，而MC3 LNP在0.5μg的更高剂量下具有保护性(e)。C24组中3只动物中有一只在0.1μg的极低剂量下也存活下来。统计分析未显示出每剂量少量动物(n＝3只)的显著差异。通过PRNT(N＝5只/组)在斑块测定中对SARS-CoV-2的中和表明C24LNP在0.25μg剂量(b)下具有中和活性，而MC3在初免后仅在1μg剂量(f)下具有中和活性。包括LNP、剂量和稀释度作为预测因子的线性混合效应模型分析显示，C24比MC3显著更多地降低所检测病毒％(b对f，p＝0.021)。针对所测试的稀释度，在加强后C24在0.25μg剂量下具有100％中和活性(c)，而MC3仅在1μg下有(g)。包括LNP、剂量和稀释度作为预测因子的线性混合效应模型分析显示，C24比MC3显著更多地降低所检测病毒％(c对g，p<0.00001)。在斑块测定(N＝2)中对感染后第5天肺病毒滴度的评估发现，C24 LNP在0.5μg剂量下完全消除肺部感染(d)，而MC3 LNP即使在所测试的1μg最高剂量下也不能完全消除肺部感染(h)。包括LNP和剂量作为预测因子的对数转换病毒滴度的线性回归模型分析显示，C24比MC3显著更多地降低肺病毒滴度(p＝0.00008)。为清楚起见，仅在b、c、f、g中显示一个剂量的SEM。挑战后的体重和温度记录在补充图3中。平均值+/-SEM。

实施例36-图89

C24的局部注射部位炎症低于MC3 mRNA LNP。注射后24小时，C24 LNP(a-c)在注射部位引起的炎症比MC3 LNP(d-i)要轻，这与肉眼观察到的C24的肿胀水平低于MC3一致，通过目视和手动触诊来评估。注射至内侧腓肠肌(MG)中的含有5μg mRNA和约65μg总脂质的50μl在a、d和g中主要见于内侧腓肠肌与外侧腓肠肌(LG)之间的注射部位(IS)处。脂质很难与局部脂肪组织区分开。MC3在整个腿部引发强烈的炎症反应，引起肉眼可见的肿胀和组织学上观察到的滑膜组织炎症(e、f)，而在C24注射腿中则不存在(b、c)。注射部位的炎症反应涉及嗜中性粒细胞和血管的浸润(h)，并在注射部位产生混合细胞型淋巴样结构(i)，这在非注射对照中未观察到。对于MC3和C24中的每一者，这些反应代表一组3只动物。染色为苏木精和曙红。

实施例37-图90

C24和MC3 LNP的生物活性和mRNA完整性在4℃下稳定，但在2周内在较高温度下下降。a)在第0、2、4、7和14天通过荧光素酶表达测量HEK 293细胞中的生物活性，每孔25ng，含有12,000个细胞。在4℃下储存在PBS中的C24和MC3 LNP的生物活性是稳定的，但在室温(RT)下储存2周时期时，其生物活性下降了约20-40％。b)DLS未检测到LNP尺寸的变化，Ribogreen不可及的mRNA％也没有变化(c)。d)使用Li和Breaker 1999的方程“e”中的模型对mRNA完整性(未切割％)进行理论计算表明，游离FLuc mRNA在pH 7.4下的半衰期为4℃下2,300天、RT下125天和37℃下11天。e)在第0天产生后立即以及在PBS中在4℃、RT和37℃下储存19天后，使用氯仿/甲醇从LNP中提取mRNA，并通过微流体电泳进行分析。在4℃下19天后(与第0天相比)未发现可检测的降解，而在较高温度(RT和37℃)下储存会产生越来越多的mRNA切割，这与(d)中的模型所预测的较高温度下的更高降解在性质上是一致的。在(e)中显示针对每种条件测量的3个LNP的降解最少的实施例。低于20s的峰是标准的，而高于主要mRNA Fluc峰的40s附近的峰是非模板延伸的产物，使用用于纯化mRNA45的纤维素方法无法消除。通过对应于FLuc mRNA峰的曲线下面积(AUC)估计mRNA完整性，并相对于C24和MC3LNP合在一起的第0天平均值归一化。f)mRNA完整性在4℃下稳定至少19天，并在更高温度下下降，但C24的下降程度小于MC3。N＝3或对于一些N＝2，由于一些样品的踪迹中的技术不规范导致无法定量。

实施例38

通过开发使用可离子化脂质结构来预测LNP离子化和可离子化脂质破坏胞内体膜和释放mRNA的能力的模型来制定合理的设计方法。

mRNA-LNP是使用微流体或更大规模的T型混合器通过自组装过程制造的，其中乙醇中的4种脂质与低pH值缓冲液中的mRNA快速混合。mRNA LNP的形成是经由质子化阳离子可离子化脂质与阴离子mRNA磷酸骨架的静电结合发生的，接着脂质从水相中分离以形成由亲水性PEG界面稳定化的纳米颗粒。许多因素在制造过程中可能会发生变化，包括脂质和mRNA的绝对和相对浓度、缓冲液类型、其浓度和pH、有机相与水相的比率以及流速。已发现，在不改变相对浓度的情况下，共同增加脂质和mRNA的绝对浓度，通常可将所得mRNA LNP的递送效率提高4倍(图92)。所有专利和科学文献均使用接近12.5mM的总脂质混合浓度，这对应于接近0.25mg/ml的mRNA浓度。我们发现增加这些混合浓度的方法(例如，增加了6倍至75mM总脂质和1.5mg/ml mRNA)导致在相同剂量下体外和体内递送效率提高4倍(图92)。通过测量从pH 7.4至5的ζ电位增加，发现这些更有效的LNP与在标准条件下组装的那些相比，ζ电位增加了2倍(图92C)。此结果表明，提高的效力一部分是由于LNP中更高水平的未质子化的可离子化脂质，其增加了胞内体质子化。在最近的一项创新中，在无缓冲液的环境中进行mRNA LNP组装。并非在mRNA溶液中使用低pH缓冲液在混合时使可离子化脂质质子化，而是在与无缓冲液的水中的mRNA混合之前通过将HCl添加至脂质混合物中使可离子化脂质预质子化，通过TLC-MS和1H NMR进行验证表明没有发生脂质降解。使用具有3个氮的C24可离子化脂质，并为每个可离子化脂质添加0.25个质子，平均每4个脂质有1个氮质子化，使得质子化氮与mRNA的磷酸酯的比率为1:1(NP比率为4)。与使用缓冲液相比，无缓冲液的组装方法(均使用高脂质和mRNA混合浓度)在体内产生更高的效力，通过IVIS针对IM和IV施用而言提高了3倍。因此，无缓冲液、高绝对脂质/mRNA浓度组装方法可产生比目前使用低浓度和低pH缓冲液的制造方法强10倍的LNP，但不会改变最终制剂的组成。与需要对流和扩散以接触并质子化脂质(这是一个固有的快速和非均质过程)的缓冲液相比，预质子化方法更准确地靶向特定水平的可离子化脂质的质子化。这些实现高效LNP的专有制造创新有望在所有制造规模以及微流体和T型混合几何结构中轻松实施。我们的目标是对LNP效力对制造过程参数的依赖性进行预测建模，以进一步提高递送效率，从而显著减少剂量和毒性，并增加mRNALNP的供应。

mRNA LNP的分布、靶向性和表达取决于LNP电荷和配体缀合

mRNA-LNP呈现出与其离子化特性相关的生物分布和表达模式。LNP表面上的细胞靶向配体也可增加细胞特异性摄取。在IV施用中，已证明带正电的LNP靶向肺，近中性的LNP靶向肝脏并且带负电的LNP靶向脾脏。在这些研究中，LNP的电荷是通过以下手段来控制：改变带正电的可离子化/阳离子脂质与带负电的mRNA的比率，或者保持此比率恒定并添加第5种阴离子或阳离子脂质来调节LNP电荷。电荷介导的靶向的一种机制是血清蛋白(例如由肝细胞中的LDL受体识别的ApoE)的电荷依赖性结合。MC3 LNP和其他肝脏导向的LNP具有促进ApoE结合的轻微负电荷。相反，LNP上的强负电荷或正电荷将阻止ApoE结合，从而阻止肝脏靶向。在负LNP靶向脾脏的情况下，另一种机制可能起作用，因为脾脏巨噬细胞和树突状细胞识别磷脂酰丝氨酸以吞噬凋亡细胞和老化的红细胞。因此，用磷脂酰丝氨酸类似物或其他负脂质包被LNP可增强脾脏的递送。生成具有5.7的低pKa的LNP的可离子化脂质也会使LNP呈负性，并显示出靶向脾脏并在脾脏B淋巴细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达mRNA。尺寸也被认为在脾脏靶向中具有作用，其中较大的尺寸可分布至脾脏，这大概是由于脾血窦中的大尺寸孔(200-500nm)将动脉血输送至实质细胞。

器官内的细胞特异性靶向也可通过调整LNP电荷来实现。pKa接近6.4的MC3和Acuitas LNP呈现出ApoE介导的靶向，导致主要在肝细胞中表达，其中在肝窦内皮细胞(LSEC)、造血细胞和库弗细胞(Kupffer cell)中也有少量表达。然而，通过添加具有更高pKa的第二可离子化脂质以生成LNP，可将细胞靶向从肝细胞转移至LSEC，其中对于LSEC靶向，pKa为7.15，而对于肝细胞靶向，pKa则为6.4。当肌内注射mRNA-LNP用于疫苗时，许多细胞类型表达mRNA，包括单核细胞和树突状细胞、肌细胞和脂肪细胞。我们小组是首个展示IM施用中的LNP电荷影响生物分布者，其中MC3 LNP分布至脉管系统并在肝脏中表达，而具有较高pKa的负性较小的LNP则保留在注射部位和引流淋巴结中。还已通过将配体与LNP缀合实现细胞特异性靶向的目标。例如，针对血管细胞粘附分子PECAM-121的抗体靶向肺内皮细胞，而针对CD4受体的抗体靶向脾CD4+T淋巴细胞。短肽也已用于LNP靶向，例如，流感衍生的GALA肽靶向肺内皮，并且神经细胞粘附分子(NCAM)的14氨基酸肽允许靶向骨骼肌。此提案的第三目标是基于设计和制造具有特定离子化/电荷特性以及特定密度和LNP表面上的配体亲和力/亲合力的LNP来开发预测器官和细胞特异性靶向的模型。

预测模型旨在制造具有所需表达效率、器官和细胞靶向、低毒性/反应原性以及在疫苗情况下的适当佐剂性和免疫原性的mRNA LNP。使用在下文A中描述的当前可离子化脂质文库，部分B旨在开发使用LNP配制和制造参数来预测LNP特征(例如电荷、胞内体质子化、配体密度/亲和力)的模型，所述特征已知可确定效率、靶向性、毒性和免疫原性。在部分C中，体外研究表征向特定细胞类型的递送和反应原性/毒性反应。在部分D中，进行的动物研究旨在将这些LNP特征与实验确定的效率、靶向性、毒性和免疫原性相关联。在部分E中，描述使用机器学习和多级功能模拟模块来关联使用统计模型在多级收集的参数数据。然后，这些结果将提供反馈，以提出可离子化脂质设计和制造过程，以提高性能。与之前的工作相比，我们方法的一个关键差别是对已知确定LNP性能的特征进行精确测量和建模，而非试图将性能直接与化学结构、配制和制造联系起来。一个例外是可降解性，已知其主要取决于可离子化脂质的结构。

A)可离子化脂质的合成。使用上述方法设计可离子化脂质文库，以创建具有高递送效率的mRNA LNP。考虑了可离子化脂质的可降解性、合成途径的复杂性和成本，并且避免了立体异构混合物的形成。目前的可离子化脂质需要更少的合成步骤，并且获得的成本比目前授权疫苗中的可离子化脂质低10倍。当前文库拥有超过100种合成的可离子化脂质，对其进行如下所述的分析和模型开发。使用NMR光谱、FTIR、LC/MS/MS和燃烧分析对合成产物的身份和纯度进行全面表征。

B)开发模型以从脂质结构、配制和制造过程参数预测LNP电荷、胞内体质子化、尺寸、膜破坏和RNA释放能力、缀合脂质密度和结合亲和力。将在本提案中表征和建模的mRNA-LNP体内表达和靶向的决定因素是LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)、胞内体质子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可离子化脂质膜破坏能力(MDIL)、可离子化脂质RNA释放能力(RRIL)、靶向配体密度(ρL)和结合亲和力(KL)(图93)。这些参数反之由可离子化脂质的离子化和结构特性以及配制参数(脂质类型和摩尔比)、制造过程(浓度、缓冲液、pH、溶剂比、流速)和配体缀合决定。我们将开发若干个模型，以根据可离子化脂质特性、配制参数和制造过程参数预测NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL和KL。这些性能主要决定因素(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KL)以及可离子化脂质离子化/结构参数(pKa、结构描述信息)、配制参数(第5种脂质结构/添加方法/摩尔分数、PEG脂质结构/添加方法/摩尔分数、缀合脂质结构/添加方法/摩尔分数)和制造过程参数(脂质/mRNA浓度、缓冲液类型/浓度)则将用于关联和预测特定器官和细胞类型中的体内mRNA分布和表达水平，以及预测毒性和疫苗的反应原性和免疫原性。

B1)根据可离子化脂质结构和离子化特性对LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)和胞内体质子化(EPLNP)的预测。最初，此模型将针对固定的配制和制造过程，其中仅改变可离子化脂质，初始使用BODD PipZ家族的成员(图94)以及DSPC、胆固醇、PEG-DMG-2000和2,069碱基FLuc mRNA。使用不同的碳间隔基合成BODD PipZ家族的12个成员，以提供一系列分子pKa宏观常数。由于这些可预见的改变的宏观常数的结果，体外转染显示出剂量反应中的全身模式。BODD PipZ家族成员的分子离子化常数的系统变化预计会在约2个单位范围内改变所得的LNP pKa和pI，这将显著影响体内效率和靶向。将所计算的可离子化脂质分子离子化常数以及NMR测量的分子离子化常数4和结构描述信息(极性原子的数目和类型，头部基团的2D拓扑描述信息)与所测量的pH依赖性LNP净电荷(ζ电位的NCLNP)和表面电荷(TNS的SCLNP和其他表面指示因子)相关联并推导出EPLNP＝NCLNP(pH5)-NCLNP(pH 7.4)。我们测量pH依赖性的方法(NCLNP、SCLNP、EPLNP)已公布。所述模型的一般形式为：

(NCLNP、SCLNP、EPLNP)＝f(可离子化脂质离子化/结构参数、pH)

其中pH依赖性将遵循亨德森-哈瑟尔巴赫(HH)及其扩展版本，并且离子化参数将包含脂质/水质子溶剂化能差异和离子化状态依赖性。此模型将基于可离子化脂质分子离子化和结构来预测和设计已知会影响表达效率和靶向的LNP电荷和质子化特性。

B2)热稳定性表征和建模。我们近期的mRNA LNP稳定性研究证实了欧洲药品管理局(European Medicines Agency)对Pfizer和Moderna疫苗的公开评估文件中的发现，将mRNA完整性的丧失描述为储存期间不稳定性的主要机制。储存了MC3和我们的第一代C24mRNA LNP，并且发现它们在4℃下稳定超过3周。在较高温度下的加速降解显示，与MC3LNP中的完整性完全丧失相比，C24 LNP中mRNA完整性的丧失最小。这种差异可能是由于LNP内每种脂质的pKa差异所致，其中MC3为9.4，而C24为8.1。与MC3相比，较低的C24 pKa可在C24 LNP中产生较低的pH，并减慢碱基介导的mRNA切割的动力学。在此部分中，将从当前的mRNA稳定性模型开始，所述模型包括pH和温度依赖性，并将预测结果与LNP中的游离mRNA和mRNA在一系列温度和pH条件下的稳定性分析进行比较。将使用氯仿/甲醇提取LNP中的mRNA以进行片段分析。还将测量脂质稳定性。一系列具有不同pKa宏观常数的可离子化脂质将经配制成LNP，以评估此参数以及温度和pH对mRNA降解动力学的作用。将建立以下形式的模型：

(mRNA降解)＝f(温度、pH、可离子化脂质离子化/结构参数)

此模型能够预测性设计mRNA稳定性，这是制造和分销中的关键特征。

B3)根据LNP配制参数对LNP净电荷(NC_LNP)、表面电荷(SC_LNP)、胞内体质子化(EP_LNP)、尺寸(D_LNP)、可离子化脂质膜破坏能力(MD_IL)和RNA释放能力(RR_IL)的预测。此模型最初将针对固定的NP比率(4)和可离子化脂质如C24，并将脂质组分/比率与pH依赖性NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL和RRIL相关联。对于脂质组分，最初将使用C24、DSPC、胆固醇、PEG-DMG-2000并将根据Cheng添加带负电或带正电的第5种脂质。已发现，通过在与mRNA混合之前向脂质中添加负性18-1PA，在IV施用荧光素酶报告基因后，肝脏表达大幅降低，脾脏表达增加了2-3倍(图96)。尽管这些效应被认为是由于18-1PA产生了带负电的LNP，但迄今为止尚未对这些LNP的表面或净电荷进行测量。建议进行这些测量来开发此模拟模块。将使用若干种负性脂质如18-0PA、18-1PA、18-2PA，其中双键从2减至0的操作预计会使脂质更多地移动到LNP的表面并远离LNP内部。还将通过在混合后的稀释孔中在混合的水性/有机/电解质溶剂中温育LNP，将18PA直接置于LNP表面上，从而促进18PA插入LNP表面，而非在混合之前将18PA添加至乙醇中的其他4种脂质中。将使用带正电的脂质如DOTMA和DOTAP作为第5种脂质来驱动分布至肺部。还将使用带正电或带负电的PEG脂质。将改变PEG烷基尾部的长度，因为这会强烈影响脱落和细胞摄取，如同PEG链本身的长度一样。最终，类似物也将取代PEG-DMG-2000，以便更有效地转染T细胞。NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL将如上所述进行测量并且经由以下一般形式与第5种脂质和PEG脂质结构/添加方法/摩尔分数相关：

(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL)＝f

(第5种脂质结构/添加方法/摩尔分数、PEG脂质结构/添加方法/摩尔分数、pH)

此模型将通过使电荷、尺寸、膜失稳和RNA释放参数与LNP中的第5种脂质和PEG脂质的类型以及其比例和添加方法相关联，实现预测性LNP靶向和表达。在第二阶段，将设计可离子化脂质来改变LNP电荷。

B4)根据LNP制造过程参数对LNP净电荷(NCLNP)、表面电荷(SCLNP)、胞内体质子化(EPLNP)、尺寸(DLNP)、可离子化脂质膜破坏能力(MDIL)和RNA释放能力(RRIL)的预测。此模型将基于使用有限数量(约5)的固定制剂和可离子化脂质的实验，从标准摩尔比的C24/DSPC/胆固醇/PEG-DMG-2000和NP比率4开始，使用2,069核苷酸的FLuc mRNA。已发现两种新颖的LNP组装方法，其可提高mRNA LNP的效力。如上文引言中所述，两种方法都需要在混合前提高脂质和mRNA的浓度。更近来发现的第二种方法从mRNA溶液中去除缓冲液，并通过控制向乙醇中的可离子化脂质中添加HCl直接质子化可离子化脂质，并且如上所示，已经可将效力提高近10倍。测量了含有缓冲液的方法的ζ电位，并发现更负性的高pH平台，并且因此在代表胞内体质子化的pH下降(7->5)期间，ζ电位的增加更大。这种含有缓冲液的方法使DLNP增加了约20nm，而具有更高效力的无缓冲液方法则不会改变DLNP。没有关于这些过程变化的MDIL和RRIL的数据，并且仅有有限的来自CryoTEM的超结构信息。在此，建议使用C24LNP并在没有缓冲液的情况下使用一系列脂质/mRNA浓度、缓冲液浓度和可离子化脂质的质子化水平对其进行组装来完成对这些新颖LNP组装和制造过程的表征。将测量NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL，以及由使用SAXS(小角X射线散射)和SANS(小角中子散射)的CryoTEM成像和散射方法获取超结构信息。已建立这些超结构方法，包括使用氘代脂质的对比度变化SANS，以获得有关脂质组分分布的特定信息，并将根据这些超结构数据来定义参数/描述信息以与组装过程参数相关。一旦针对这些不同组装条件对C24 LNP进行表征，将进一步表征目标LNP。对于特定的LNP，将获得以下一般形式的模型：

(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、超结构参数)＝f(脂质/mRNA浓度、缓冲液类型/浓度、无缓冲液的质子化水平、pH)

此模型将能够根据组装和制造条件预测电荷、尺寸、膜失稳、RNA释放和超结构参数，所述条件会改变脂质/mRNA/缓冲液浓度以及无缓冲液环境中可离子化脂质的质子化水平。

B5)mRNA LNP的连续体和分子动力学模型。此模块的目的是深入了解产生与LNP效力相关的mRNA LNP结构和特性的混合和组装过程。将使用连续流体力学结合扩散和化学反应方程对微流体和T型混合几何形状进行建模。乙醇与水性牛顿流体的混合方式取决于混合的几何形状以及两种溶剂的流速和比率。混合溶剂乙醇/水的粘度由于非理想性而比单独的溶剂高约3倍，并将考虑在内。mRNA、脂质组分和缓冲液将被视为具有从文献中提取的具有浓度依赖性的扩散常数的连续溶质。可根据pH而带电的溶质(缓冲液、可离子化脂质)和永久带电的mRNA将遵循局部净电中性以及具有适当pKa的缓冲液和可离子化脂质的HH方程。初始模拟将确定两种流体的流动和混合模式，并且虑及扩散和电中性以及HH方程，将计算mRNA、4种脂质的空间浓度、可离子化脂质质子化和pH。预计混合期间的LNP组装会因脂质和mRNA浓度阈值和可离子化脂质质子化以及局部含水量增加而成核，导致脂质不溶性，即当所有4个特征均出现在同一位置时。将对已知会影响最终LNP效力的脂质、mRNA和缓冲液浓度的不同值进行模拟。将在高效和低效组装条件下对脂质、mRNA的空间浓度、可离子化脂质质子化、局部含水量和pH进行比较。对于低浓度混合，在微流体通道中观察到空脂质体与含有RNA的结构的混合群体，而在高浓度下，这些结构出现融合(图97C)。假设这些特征可通过混合期间脂质、mRNA的空间重叠程度、质子化可离子化脂质和局部含水量来解释。将去除缓冲液并使用预定的可离子化脂质质子化运行模拟，以模拟第二种高效组装方法。将在产生一系列mRNA LNP效力的条件下检查微流体和T形接头混合几何形状。将计算的重要参数为：

FNML，即mRNA-LNP成核事件的频率，其特征在于高脂质与mRNA浓度的重叠以及高于临界阈值的可离子化脂质质子化和水含量(初始分别>25％和>50％)。

PNIL，即与FNML事件相关的成核时的质子化水平(范围为25-100％)。

FNL，即空LNP成核事件的频率，其特征为不存在高mRNA浓度或可离子化脂质质子化保持在低于临界阈值(<25％)。

我们认为高FNML会产生更有效的LNP，而高FNL会产生效力较低的LNP。还假设PNIL需要高于质子化可离子化脂质与mRNA离子复合的临界阈值(即25％)，但低于上限阈值(即75％)，使得未质子化的可离子化脂质在所述复合物内以如我们的ζ电位测量所示在胞内体中质子化。在此需要注意的是，即使LNP通过透析或TFF被中和至pH 7.4，与未结合的质子化可离子化脂质相比，结合至阴离子mRNA磷酸酯骨架上的质子化可离子化脂质的pKa可由于静电作用而向上移动多达2个点。这将强烈有利于在结合时保持质子化，从而使LNP内存在额外的未质子化未结合的可离子化脂质成为胞内体释放的必要条件。将为层流微流体和湍流T型混合几何形状以及不同流速和溶剂比率推导出以下形式的一般关系：

(FNML、PNIL FNL)＝f(mRNA/脂质浓度、缓冲液浓度、无缓冲液的预质子化水平)

作为此模块的第二补充方面，将使用分子动力学模拟来为局部分子可离子化脂质/mRNA结合以及在一定条件下的LNP组装建模，所述条件已知会在高浓度与低浓度脂质/mRNA以及不同水平的可离子化脂质质子化和由上述连续模拟产生的缓冲液浓度下影响LNP效力。在此，我们认为在高水平的可离子化脂质质子化下的低脂质/mRNA浓度将产生均一的组装，其中高度质子化的可离子化脂质覆盖mRNA骨架并且过量的质子化可离子化脂质聚集在这些结构周围。在较高浓度下，可观察到更粗糙的结构，其中mRNA骨架的内部部分未与质子化可离子化脂质结合，而外部mRNA结构域与质子化可离子化脂质结合，并且过量的未质子化可离子化脂质围绕这些结构。将对与双层和细胞溶质条件相互作用的后一结构进行建模，以确定它们是否更容易在细胞内释放。将对结合后的pKa偏移进行显式建模，以评估这种潜在关键特征的大小。为了对第二种高效组装方法进行建模，将去除缓冲液并将可离子化脂质预质子化至不同水平，以观察在高浓度和低浓度范围内可离子化脂质的质子化和未质子化部分的结构和分布。

我们认为1)高浓度混合可产生更粗糙的离子聚集体，其中mRNA更容易释放；和2)由于存在确定的非缓冲液依赖性水平的非质子化物质能够参与胞内体释放，因此可离子化脂质的较低水平的预质子化更有效。此部分中的模型将提供对生产高效mRNA LNP的制造过程参数的理解。

B6)配体靶向LNP的cGMP相容性生产和配体密度ρL和结合亲和力的测量。当前配体缀合的LNP将细胞特异性靶向增加了至少10倍，但生产方法(直接化学缀合或后插入至LNP)难以控制并致使与cGMP制造相容。像肝脏的器官中的高水平非特异性表达仍然存在并且也成问题。在此，建议开发一种cGMP相容性自组装方法来产生载有配体的LNP，并量化配体密度(ρL)和对靶标的结合亲和力(KDL)，并通过控制LNP电荷来减少脱靶表达。将从已成功与LNP缀合的CD4 T细胞靶向抗体开始，并使用可与PEG部分进行位点特异性连接的scFv抗CD4蛋白。不采用胶束后插入法，而是将抗小鼠CD4 scFv直接与单体DSPE-PEG2000-顺丁烯二酰亚胺化学缀合，并鉴定维持单体状态以放置于稀释孔中的有机/水性/电解质溶剂条件，用于LNP的后微流体混合并掺入LNP表面中。已改变有机/水性/电解质溶剂条件，以维持微流体通道中产生的LNP的结构或诱导LNP融合，如通常发生的那样。因此，将能够在能够控制LNP稳定性并控制缀合脂质向LNP表面中的掺入的稀释孔中对多种有机/水性/电解质溶剂条件进行筛选研究。所得的LNP将通过离心过滤或尺寸排阻色谱法(Sepharose CL-4B)与未结合的scFv分离，并在含LNP的浓缩物和滤液中测量蛋白质含量，以评估与LNP相关的配体的量。此结合配体量将相对于通过纳米颗粒追踪获得的颗粒数量和通过ribogreen测定获得的mRNA含量归一化，以提供配体密度ρL含量作为每个LNP的scFv数量，或者scFv与mRNA的质量或摩尔比。使用先前在实验室中开发的方法，使用表面等离子体共振(SPR)和等温滴定量热法(ITC44)测量抗CD4缀合的LNP与CD4配体KDL的结合亲和力。除了配体密度和结合亲和力的这些定量评估外，还将通过CryoTEM(DTEML)对配体分布进行成像，以便使用具有对比度增强的负染色，通过CD4与配体的温育和结合以及金标记的抗体免疫染色来可视化scFv分布。一旦选择了生产方法，将通过修改稀释孔中的溶剂条件和缀合脂质浓度来产生一系列配体密度和亲和力/亲合力。用于细胞和动物测试的最终LNP将经表征为净电荷和表面电荷。在稍后的阶段，将使用上述B1和B4中的方法修改配体缀合的LNP的电荷，以便结合和协调电荷介导的靶向与配体介导的靶向。例如，电荷调整有望消除肝脏中靶向脾脏T细胞的LNP的脱靶表达(图96)。使用具有cGMP产生和消除的肝脏表达的此公开的CD4靶向LNP将是这种方法的初步概念验证。第二概念验证将应用这些方法来展示神经细胞粘附分子(NCAM)的肽配体以靶向骨骼肌。此处较小的蛋白质组分将显著改变其在LNP表面中掺入所需的有机/水性/电解质溶剂条件。在本模块的初始阶段为原型C24 LNP和抗CD4 PEG脂质推导出的特定模型结果由一般形式表示：

(ρL、KDL、DTEML)＝f(有机/水性/电解质溶剂条件、配体类型/浓度)

此部分中推导出的方法和模型将允许受控制造呈现出一系列配体类型(抗体、肽)的LNP，所述配体类型具有特征性配体密度和亲和力。

C)递送效率、毒性和反应原性的体外评估。

C1)递送效率的体外评估。使用荧光素酶报告基因的mRNA LNP转染的方法将对代表轻易可转染的细胞(HEK293)、悬浮细胞(CHO)、内皮细胞(HUVEC)、肌肉细胞(C212)、巨噬细胞(RAW)、肝细胞(Hep G2)和T细胞(Jurkat)以及原代人类CD4+T细胞的细胞类型进行。代谢毒性将由Alamar Blue评估。在此建立的关系如下：

在细胞(j)中(效率、毒性)＝f(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、剂量)

C2)毒性和反应原性的体外预测因子。为了使先天免疫反应原性与LNP结构和mRNALNP制剂相关联，将通过先天免疫活化的无细胞和基于细胞的测定进行高通量筛选。血浆中的补体和FXIIa活化被视为LNP诱导的急性类过敏反应的潜在驱动因素。补体活化将通过使人类柠檬酸盐化血浆暴露于LNP，接着进行C3酶原转化为C3b的蛋白质印迹(Western blot)分析来测量。如果在LNP与血浆接触后阴离子RNA表面暴露出来，则可能会导致因子XII(FXII)活化，从而产生缓激肽，一种与过敏反应相关的血管扩张剂。作为接触途径的起始步骤，FXII活化之后会产生凝血酶，这会增加凝血病的风险。将使用我们实验室开发的血栓弹力图(TEG)测定测量RNA LNP对FXII的活化，其中阴离子表面可诱导微粒耗乏血浆的突然凝固，否则在添加钙后无法凝结。基于细胞的反应将包括红细胞的溶血和渗透脆性，在肺(约pH 7.4)和血管外空间(约pH 6.7)中所见的pH水平下LNP剂量逐渐增加。已通过将编码eGFP的LNP与肝素化人血在37℃下温育4小时，接着测量反应原性细胞因子(IL-6、IL-8)的产生来评估LNP在外周白细胞中诱导先天免疫活化的潜力。LNP也在一种新颖的培养凝结测定中测试，采用未经修饰的人类全血，其中C24 LNP的反应原性低于MC3 LNP。经培养的凝结细胞在24小时后表达eGFP，但在肝素化血液中未观察到eGFP表达，表明新颖的培养凝结测定在筛选毒性和LNP制剂的表达方面具有优越性。LNP加料培养凝结的RNAseq将使得能够测试LNP mRNA表达与特定先天免疫反应相关的假设，所述先天免疫反应先于成功的适应性免疫反应。将在此建立的关系的一般形式如下：

(FXII活化、补体活化、炎症/抗原呈递细胞因子)＝f(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、可离子化脂质描述信息、剂量、pH)

此模型将根据LNP特征预测毒性和反应原性反应。

D)在啮齿动物和非人类灵长类动物(NHP)模型中评估递送效率、靶向性和毒性/反应原性。使用上述预测模型设计的mRNA LNP将在小鼠、大鼠和NHP模型中表征器官和细胞特异性递送效率以及毒性。

D1)表达和靶向的小鼠模型评估。在对小鼠进行IV施用时，将使用3种mRNA编码的报告基因：荧光素酶、mCherry和Cre重组酶报告基因在Ai6 RCL-ZsGreen1转基因小鼠中评估mRNA表达和生物分布，它们不依赖于肝脏、肺、脾脏、淋巴结、心脏、骨髓、骨骼肌、眼睛、大脑、睾丸和卵巢的表达。离体IVIS成像将用于荧光素酶报告基因，而组织学和流式细胞术将用于mCherry和Cre活化的ZsGreen。在施用后的前72小时期间，将对来自接受mCherry和Cre报告基因的动物的器官进行匀浆化，并将细胞酶促释放以供如前所述的流式细胞术。这两个报告基因是互补的，因为一旦Cre-R在Ai6模型中表达，细胞便会永久保持绿色，但水平可为细胞类型依赖性的，并具有一定的异质性。mCherry表达是瞬时的，但可指示mRNA翻译的强度。

将推导出器官特异性靶向的5个量度：

器官(i)IVIS_表达＝4小时时集成的器官IVIS信号(光子/秒)

器官(i)mCherryF_表达＝每个器官的总细胞mCherry荧光强度(Fluo/器官)

器官(i)ZsGreenF_表达＝每个器官的总细胞ZsGreen荧光强度(Fluo/器官)

器官(i)mCherryC_表达＝每个器官的总mCherry阳性细胞(Fluo/器官)

器官(i)ZsGreenC_表达＝每个器官的总ZsGreen阳性细胞(Fluo/器官)

在流式细胞术中，基质细胞、血液细胞、抗原呈递细胞和器官特异性细胞类型的特定标记将指示每种细胞类型的mCherry和ZsGreen表达，提供以下指标：

器官中(i)的细胞(j)mCherryF_表达＝总mCh荧光强度(j)细胞/总强度

器官中(i)的细胞(j)ZsGreenF_表达＝总ZsG荧光强度(j)细胞/总强度

器官中(i)的细胞(j)mCherryC_表达＝总mCh阳性(j)细胞/总阳性细胞

器官中(i)的细胞(j)ZsGreenC_表达＝总ZsG阳性(j)细胞/总阳性细胞

对于IV施用，将获得所有解剖器官的IVIS指标，而细胞特异性表达最初仅限于脾脏和肝脏。在肝脏单细胞悬浮液中，细胞表面标记将使用以下标记指示肝细胞、肝窦内皮细胞、库弗细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞：(ASGR1、CD16/CD32、CD31、CD11c、CD11b、CD209、CD64、CD45、ESAM、Ly-6g、CD49b、CD19、CD3e、I-A/I-E、Tim-4、CD206、F4/80、CD24、CD86、OX40L)。在脾脏单细胞悬浮液中，细胞表面标记将使用以下标记指示T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞：(B220、CCR2、CD3、CD14、CD19、CD49b、CD68、CD71、CD103、CD117、CD169、CD206、Mac2、Mac3、MerTK、Siglec F、CD24、CD86、OX40L)。在组织学中，将使用定量组织形态测定法图像分析来评估细胞类型特异性表达，作为每个具有阳性表达的细胞类型的面积％。为了评估与表达无关的生物分布，将对器官匀浆使用分支DNA(bDNA)测定。另外的器官也将在处理之前灌注以去除间质LNP，接着通过bDNA对器官的单细胞悬浮液进行分析，并测量悬浮液中的bDNA和表达。上述器官和细胞特异性表达和分布数据将通过以下类型的综合模型与前一部分中表征的LNP参数相关联：

器官(i)表达/分布＝f(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、剂量)

细胞(j)器官(i)表达/分布＝f(NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、剂量)

希望上述关系是可普遍化的，并且在LNP设计中为我们提供指导，因为已知驱动表达和靶向的LNP特征位于上述表达式的右侧。还将在多级模型的第二阶段中探索与可离子化脂质结构描述信息、配制和制造参数的潜在关系，以充分利用此数据集。极其多样化的可离子化脂质文库与配制和制造的大修改空间相结合，可能会提供显著改变靶向的能力。将使用图94中可离子化脂质家族的初步发现来设置基线，接着对其他文库家族和候选物进行采样，以绘制出针对我们设计空间的图。这些结果则将指导我们进一步进行可离子化脂质设计和配制/制造改变。

在对小鼠进行IM施用时，将使用上述相同的评估，但此外，将添加注射部位和引流淋巴结的离体IVIS成像。将在流式细胞术中分析注射部位和引流淋巴结的mCherry和ZsGreen表达，以便使用上面列出的脾细胞标记来鉴定嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和树突状细胞。注射部位的组织学分析将与上述IV施用的相同，并且具体包括肌细胞和脂肪细胞。此部分的结果将预测针对LNP特征的器官和细胞特异性靶向和表达，所述特征预计会强烈影响这些性能参数，但以前从未与靶向和表达相关。结果应阐明这些依赖性，并为设计新型可离子化脂质、配制和制造过程提供指导，以进一步改善mRNA LNP的靶向表达。

D2)毒性和反应原性的小鼠模型评估。LNP的毒性已通过将可降解酯掺入可离子化脂质中来降低，所述脂质由体内水解酶切割并产生足够小且亲水性足以在尿液和粪便中排泄的片段。MC3中单一缓慢降解的二级酯产生二亚油酸，其消除时间非常缓慢，并且在组织中累积的趋势很强。将额外的可降解酯并入烷基尾部会加速降解。将快速降解的一级酯并入Moderna的可离子化脂质的支链中也比MC3产生快得多的降解，并且降低了IV施用后啮齿动物的全身毒性61并且减轻IM施用后注射部位的炎症。另一组报告了类似的发现，将另一种可离子化脂质与产生比MC3毒性更低的多种一级酯进行比较。因此，体内降解速率是决定毒性和反应原性的重要因素。目前的可离子化脂质文库含有>100种合成的专有化合物，其结构包含0至6个可降解酯，产生具有一系列可预测尺寸的片段。描述这些可降解特性的化学描述信息将与体内毒性和可降解性测量相关。将使用已公开的应用于提取组织匀浆的LC-MS方法测量体内可降解性。将使用已建立的方法评估毒性，所述方法测量血清中的全身细胞因子以及血液和肝脏/脾脏组织病理学中的ALT和AST水平。对于IM施用，还将评估注射部位和引流淋巴结的组织匀浆中的促炎细胞因子，以便与毒性和APC活化相关联。组织学分析将包括免疫染色，以鉴定参与注射部位和引流淋巴结中的炎症反应的细胞类型。这些结果将允许建立以下关系：

(可降解性、炎症/APC活化)＝f(可离子化脂质描述信息、LNP描述信息、剂量)

D3)免疫原性和佐剂性的小鼠模型评估。除了提供高递送效率外，用于mRNA疫苗的LNP也需要充当佐剂，以增加引流淋巴结中抗原特异性T滤泡辅助(Tfh)细胞和生发中心B(GC B)细胞的数量。此LNP特异性佐剂活性有助于驱动免疫球蛋白类别转换、亲和力成熟以及长期B细胞记忆和浆细胞的发育64。由于已知这些效应取决于可离子化脂质，因此将测量引流淋巴结和脾脏中的抗原特异性Tfh和GC B细胞反应，并将它们与可离子化脂质的结构特征相关联。还将使用当前用于SARS-CoV-2的mRNA编码的核苷修饰的免疫原，即双脯氨酸稳定的刺突蛋白(S2P)来评估免疫原性。在Balb/c小鼠中以0.1至1μg的低剂量进行初免和加强后，测量针对SARS-CoV-2假病毒的结合滴度和中和滴度，如最近所公布的5。在此确定的关系为：

(滴度、Tfh、GC B)＝f(可离子化脂质描述信息、NCLNP、SCLNP、EPLNP、DLNP、MDIL、RRIL、ρL、KDL、剂量)

将用空间转录组学补充上述注射部位和引流淋巴结中的细胞反应和细胞因子反应的分析。转录组图谱将指示免疫活化、脂质代谢和毒性，并描绘由特定可离子化脂质特征诱导的分子事件的动力学。

D4)表达、靶向性、毒性、反应原性、免疫原性的大鼠和非人类灵长类动物模型评估。以上相对高通量的小鼠模型之后将在大鼠和非人类灵长类动物中进行选定研究，因为这些是人类研究的必要先决条件，并且可揭示物种依赖性。非人类灵长类动物通常显示出与啮齿动物模型的明显差异，并且关于大鼠中的LNP靶向的传闻报道表明，与小鼠相比，大鼠可能更接近于代表非人类灵长类动物。因此，将在此项目的第二年以与上述类似的方式针对靶向性进行选定的大鼠研究。根据迄今为止获得的全部数据，将在第3年进行数量有限的非人类灵长类动物研究。

E)预测模型开发。上述研究中生成的数据集将用于开发预测模型，所述模型将部分C和D中测量的mRNA LNP性能与目前预计会强烈影响以上部分B中所述的性能的LNP特征相关联。这些LNP特征反之还取决于化学结构、配制参数和制造过程，从而创建了一组多层相互依赖的模型和用于开发那些模型的基础数据。因此，将开发与在多个级别收集的参数数据相关的机器学习、知识网络和多级功能模拟模块，这些数据将被统计和机械建模(使用上面开发的计算机模拟工具)以了解潜在的关系。分子、配制和制造参数将用于预测已知影响性能的LNP特征，并且这些LNP特征将用于预测动物模型中例如表达、靶向性和毒性的性能。计算机模型将使用由体外和体内实验生成的数据进行指导和调整。这些预测模型将使用当前最新的机器学习算法进行训练，这些算法将有助于鉴定来自不同领域(分子、配制、制造、LNP、性能)的相关变量。将根据交叉验证策略严格评估预测性能和各个变量的重要性。

前述详细说明和所附实施例仅为说明性的，并且不应解释为对本发明范围的限制，本发明范围仅由所附权利要求及其等同方案确定。

对所公开的实施方案的各种改变和修改是本领域技术人员显而易见的。此类更改和修改，包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和使用方法，旨在落入本发明的精神和范围内。

对于本文引用的所有专利、申请或其他参考文献，例如非专利文献和参考序列信息，应了解，其针对所有目的和针对所述的主题通过引用整体并入。当通过引用并入的文献与本申请之间存在任何矛盾时，将以本申请为准。与本申请中公开的参考基因序列相关的所有信息，例如GeneID或登录号(通常参考NCBI登录号)，包括例如基因组位点(genomicloci)、基因组序列、功能注解、等位基因变体和参考mRNA(包括例如外显子边界或反应元件)和蛋白质序列(例如保守域结构)以及化学参考(例如，PubChem化合物、PubChem物质或PubChem Bioassay实体，包括其中的注解，例如结构和测定，等等)，特此通过引用整体并入。

本申请中使用的标题是仅为了方便的目的并且不影响本申请的解释。

由本发明提供的每一方面的优选特征原则上适用于本发明的所有其他方面，并且(非限制性地)通过从属权利要求示例并且还涵盖本发明的特定实施方案和方面(包括工作实施例)的个别特征(例如元件，包括数值范围和示例性实施方案)的组合和排列。例如，工作实施例中示例的特定实验参数可适合于逐个地在所要求保护的发明中使用而不偏离本发明。例如，对于所公开的材料，虽然这些化合物的各种个别和共同组合和排列中的每一者的具体参考可能未明确地公开，但每一者被具体地涵盖并且于本文描述。因此，如果公开了一类元件A、B、和C与一类元件D、E、和F并且公开了元件A-D的组合的实例，则，即使未个别地叙述每一者，每一者也个别地且共同地被涵盖。因此，在此实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一者被具体地涵盖并且应视为从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容而得以公开。同样，这些任何子集或组合也被具体地涵盖并公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组被具体地涵盖并且应视为从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容而得以公开。此概念适用于本申请的所有方面，包括物质组合物的要素和制备或使用所述组合物的方法的步骤。

如本领域普通技术人员根据本说明书的教导将认识到的，本发明的前述方面可以任何组合或排列要求保护，只要其相对于现有技术是新颖的而非显而易见的，因此，当要素在由本领域普通技术人员所知的一个或多个参考中被描述时，尤其可通过所述特征或特征的组合的负面条件或放弃声明将其从所要求保护的发明排除在外。

Claims (19)

1.一种式V化合物：

其中每个R¹和每个R²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C⁶杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成环烷基环或杂环烷基环；

其中每个R³、R⁴、R¹³和R¹⁴独立地选自由以下组成的组：-H、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹⁵和R¹⁶独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中w、y和z各自独立地为0-10的整数；

其中每个Q独立地为选自O、NH、NR¹、S的原子或二硫键；

其中每个m为0-20的整数，并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁶R⁷)_m-；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

2.一种式III化合物：

其中每个R¹'、R¹、R²、R¹¹和R¹²独立地选自由以下组成的组：H、任选地被取代的C₁-C₁₂烷基、任选地被取代的C₂-C₁₂烯基、任选地被取代的C₂-C₁₂炔基、任选地被取代的C₃-C₆环烷基、任选地被取代的C₄-C₆杂环烷基、任选地被取代的C₄-C₆烷基环烷基、任选地被取代的C₄-C₆芳基、任选地被取代的C₃-C₆杂芳基、任选地被取代的C₄-C₈芳氧基、任选地被取代的C₇-C₁₀芳烷基、任选地被取代的C₅-C₁₀杂芳烷基、任选地被取代的胺；或者R¹与R²可一起形成环烷基环或杂环烷基环，其中如果Q为S或O，则与S或O连接的R¹为电子对；

其中每个R³和R⁴独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基；

其中每个R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤基、苯基、苄基、任选地被取代的C₁-C₂₂烷基、任选地被取代的C₂-C₂₂烯基、任选地被取代的C₂-C₂₂炔基，

其中x、y和z各自独立地为0-10的整数；

其中G和Q各自独立地为选自CH、O、N和S的原子；

其中m和n各自为0-20的整数；并且

其中L¹和L²各自独立地选自由以下组成的组：-C(＝O)-；OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-C(＝O)O-；-C(＝O)O(CR⁶R⁷)_m-；-NH-C(＝O)-；-C(＝O)NH-；-SO-；-SO₂-；-SO₃-；-NSO₂-；-SO₂N-；-NH((C₁-C₈)烷基)；-N((C₁-C₈)烷基)₂；-NH((C₆)芳基)；-N((C₆)芳基)₂；-NHC(＝O)NH-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NR¹-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NR¹-；-C(＝O)R¹-；-CO((C₁-C₈)烷基)；-CO((C₆)芳基)；-CO₂((C₁-C₈)烷基)；-CO₂((C₆)芳基)；-SO₂((C₁-C₈)烷基)；和-SO₂((C₆)芳基)。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

4.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

5.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

6.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

7.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

8.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

9.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

10.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

11.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

12.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

13.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

14.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：

i)权利要求1所述的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或预防剂或其药学上可接受的盐，封装于所述脂质纳米颗粒内或与所述脂质纳米颗粒结合。

15.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：

i)权利要求2所述的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或预防剂或其药学上可接受的盐，封装于所述脂质纳米颗粒内或与所述脂质纳米颗粒结合。

16.一种将核酸递送至受试者的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)权利要求1所述的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)核酸或其药学上可接受的盐，封装于所述脂质纳米颗粒内或与所述脂质纳米颗粒结合。

17.一种将核酸递送至受试者的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)权利要求2所述的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)核酸或其药学上可接受的盐，封装于所述脂质纳米颗粒内或与所述脂质纳米颗粒结合。

18.一种将包含治疗性蛋白质、疫苗、基因编辑RNA的治疗剂递送至受试者的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含以下各物的脂质纳米颗粒：

i)权利要求1所述的化合物；

ii)第二脂质，例如，中性或两性离子脂质；

iii)类固醇；

iv)聚合物缀合脂质；和

v)治疗剂或其药学上可接受的盐，封装于所述脂质纳米颗粒内或与所述脂质纳米颗粒结合。

19.一种将包含治疗剂或预防剂的脂质纳米颗粒(LNP)体内靶向递送至细胞或组织的方法，所述方法包括：

1.)预测可离子化脂质的分子pKa，合成所述可离子化脂质，用例如NMR的分析方法测量pKa；

2.)使用包括TNS和ζ电位的分析方法测量LNP pKa；

3.)使用选自由荧光素酶、mCherry、Cre报告基因组成的组的报告基因评估体内细胞和器官靶向性；

4.)调整可离子化脂质结构以找出用于细胞或组织靶向的最佳分子pKa；

5.)选择具有与靶向所需细胞或组织相关的所需pKa的头部基团、间隔基团和尾部基团；以及

6.)重复步骤1-4，直至实现最佳细胞和组织靶向。