JP2023546175A - 脂質ナノ粒子製造の方法及びそれに由来する組成物 - Google Patents

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Abstract

ある特定の新規の驚くほど優れたＬＮＰ製造技法を通して、核酸が装填された脂質ナノ粒子（ｎａＬＮＰ）の効力を増加させる方法が本明細書に開示される。本明細書に記載される製造方法に従って製造されたｎａＬＮＰを含有する薬学的組成物も開示される。本明細書に開示される方法は、以前のＬＮＰ製造技法に関連する主要な技術的困難及び高コストを克服する。したがって、本明細書に開示される方法は、予想外の方法でＬＮＰの工業生産を大幅に改善し、それによって、核酸送達のためのより強力なｎａＬＮＰを提供する。具体的には、本明細書に開示される本発明は、組み立て中の脂質及びｍＲＮＡの増加した混合濃度に起因する増加した効力のｎａＬＮＰを示す方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１４日に出願された、米国仮出願第６３／０９１，６１６号、２０２１年４月２６日に出願された、米国仮出願第６３／１７９，８８５号、２０２０年１０月１４日に出願された、米国仮出願第６３／０９１，６０３号、及び２０２１年４月２６日に出願された、米国仮出願第６３／１７９，８７２号の利益を主張し、これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、薬学的核酸ペイロードの送達のためのナノ粒子製造の分野である。
対象への生物学的に活性な薬剤（治療に関連する化合物を含む）の送達は、多くの場合、化合物が標的細胞または組織に到達することにおける困難によって妨げられる。特に、生細胞内への多くの生物学的活性剤の輸送は、細胞の複雑な膜系によって非常に制限される。これらの制限は、結果を達成するために望ましい濃度よりもはるかに高い濃度の生物学的活性剤を使用する必要性をもたらし得、これは毒性作用及び副作用のリスクを増加させる。この問題に対する１つの解決策は、細胞内への選択的侵入が可能である、特定の担体分子及び担体組成物を利用することである。脂質担体、生分解性ポリマー、及び様々な共役系を使用して、細胞内への生物学的活性剤の送達を改善することができる。
細胞に送達することが特に困難な生物学的活性剤の１つのクラスは、生物学的治療薬（ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ならびにｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ、及び自己複製ＲＮＡ剤などの誘導体を含む）である。一般に、核酸は、細胞または体液中で限られた期間のみ安定である。とりわけ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉ療法、ｍＲＮＡ療法、ＲＮＡ薬、アンチセンス療法、遺伝子療法、及び核酸ワクチン（例えば、ＲＮＡワクチン）の開発は、活性核酸剤を細胞に導入する有効な手段の必要性を増大させた。これらの理由から、核酸ベースの薬剤を安定させて細胞に送達することができる組成物が目的である。
外来核酸の細胞内への輸送を改善するための最もよく研究されたアプローチは、カチオン性脂質を有するウイルスベクターまたは製剤の使用を伴う。ウイルスベクターを使用して、遺伝子をいくつかの細胞型に効率的に移入することができるが、それらを使用して、化学的に合成された分子を細胞に導入することは一般的にはできない。
代替のアプローチは、ある部分で生物学的活性剤と相互作用し、別の部分で膜系と相互作用する、カチオン性脂質を組み込む送達組成物を使用することである。そのような組成物は、組成物及び調製方法に応じて、リポソーム、ミセル、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を提供することが報告されている（総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９０，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５，１６２－１８７、Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９３，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，３，３－１６、Ｇａｌｌａｓ，２０１３，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，４２，７９８３－７９９７、Ｆａｌｓｉｎｉ，２０１３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊｍ４００７９１ｑ、及びその中の参考文献を参照されたい）。
１９６５年におけるＢａｎｇｈａｍ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２３８－２５２）によるリポソームの最初の記載以来、生物学的活性剤の送達のための脂質ベースの担体システムを開発することには持続的な関心及び努力があった（Ａｌｌｅｎ，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５，３６－４８）。正荷電リポソームを使用することによって機能的核酸を培養細胞に導入するプロセスは、Ｐｈｉｌｉｐ Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３－７４１７（１９８７）によって最初に記載された。プロセスは後に、Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８，２７８－２８１（１９８９）によってインビボで実証された。
より最近では、インビトロ及びインビボでの有効性が実証された脂質ナノ粒子製剤が開発されている。（Ｆａｌｓｉｎｉ，２０１３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊｍ４００７９１ｑ、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３，１００２－１００７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１，１１１－１１４．、Ｊａｙａｒａｍａｎ，２０１２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１，８５２９－８５３３．）脂質製剤は、それらの細胞取り込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができるため、魅力的な担体である。様々なクラスの脂質製剤のうち、カチオン性脂質を含有する製剤は、ポリアニオン（例えば、核酸）を送達するために一般的に使用される。そのような製剤は、カチオン性脂質のみを使用し、任意選択的に他の脂質及び両親媒性物質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンを含んで形成することができる。脂質製剤の組成物及びその調製方法の両方が、得られるナノ粒子または凝集体の構造及びサイズに影響を与えることは、当該技術分野で周知である（Ｌｅｕｎｇ，２０１２，Ｊ．Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．Ｃ，１１６，１８４４０－１８４５０）。
遺伝子薬物を含有するＬＮＰ系を製剤化するための様々な方法が開発されている。これらの方法は、予め形成されたＬＮＰを、エタノールの存在下で核酸と混合すること、またはエタノールに溶解された脂質を、核酸を含有する水性媒体と混合することを含み、１００ｎｍ以下の直径及び６５～９５％の核酸カプセル化効率を有するＬＮＰをもたらす。これらの方法の両方は、オリゴヌクレオチド（ＯＧＮ）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のカプセル化を達成して、凝集及び大きな構造の形成を阻害するために、カチオン性脂質の存在に依存する。サイズ及びＯＧＮカプセル化効率を含む、生成されたＬＮＰ系の特性は、イオン強度、脂質及びエタノール濃度、ｐＨ、核酸濃度、ならびに混合率などの様々な製剤化パラメータに感受性がある。一般に、混合時の相対的な脂質及び核酸濃度、ならびに混合率などのパラメータは、現在の製剤化手順を使用して制御することが困難であり、調製物内及び調製物間の両方で、生成されるＬＮＰの特徴のばらつきをもたらす。
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのうち、いくつかは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で送達されるｍＲＮＡコードされた免疫原に基づく。ｍＲＮＡワクチンのこの高い割合は、それらの迅速な実施及び動物モデルにおける優れた有効性に起因する。ｍＲＮＡワクチンでは、免疫原は、多くの場合免疫サイレンシングヌクレオシド置換を使用してｍＲＮＡ配列においてコードされる。ヌクレオシド置換に加えて、ｍＲＮＡ設計は、多くの場合、コドン最適化、ＵＴＲ及びポリＡテール設計、５’キャップ選択、ならびに送達されたｍＲＮＡの翻訳を阻害するために先天性免疫センサを活性化することができる二本鎖ＲＮＡ汚染物質を除去する精製を伴う。
ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチン接種患者における抗体力価は、回復期血清よりも高かったが、中和力価は、公表された試験では回復期と同等であった。両方の試験においてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答があり、Ｔｈ２成分が不在であり、これはワクチン関連の増強された呼吸器疾患８におけるＴｈ２応答の潜在的な役割のために重要である。
しかしながら、局所及び全身有害事象は、蔓延しており、第２のワクチン接種後に増加した重度でより頻繁であった。重篤な生命を脅かす有害事象はなかったが、重度の局所及び全身有害事象のためにいくつかの試験における最も高い用量を中止した。自己増幅型ｍＲＮＡ ＬＮＰは、より低い用量で有効であるが、さらなる安全性の懸念を有する。
ＦＤＡガイドラインは、第３相試験における成功は、重度のＣＯＶＩＤ－１９疾患のエンドポイントに基づく５０％保護対プラセボを必要とすることを示す。ワクチンは、潜在的には１５０億用量を安価に製造し、世界中のほとんどの人々によって接種される必要がある。これら３つの基準の組み合わせは、満たすことが困難であろう。例えば、１年間の５０％保護には、１年当たり数十億の用量が製造され、アクセス及び意欲を有する世界中の人口がワクチン接種される。
現在の用量が臨床試験で成功する場合、増加した効力は、有効性を維持しながら用量及び有害反応を低減し、コストを低減及び製造能力を増加させることによって世界的にワクチン接種する能力を増加させる。代替的に、現在の用量が臨床試験で失敗する場合、これらの同じ用量での増加した効力は、保護を増加させ得る。したがって、ＬＮＰ組み立ての制御を通したｍＲＮＡワクチンにおけるペイロードｍＲＮＡ発現、免疫原性、及び保護によって効力を増加させる大きな必要性がある。
遺伝子薬物を含有するＬＮＰシステムのための方法の開発における進歩にもかかわらず、治療薬材料を含有する脂質ナノ粒子、及び治療薬材料を含有する改善された脂質ナノ粒子を調製するための方法の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たそうとし、さらなる関連する利点を提供する。
本要約は、本明細書に開示される主題のいくつかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形例及び順列を列挙する。本要約は、多くの様々な実施形態の単なる例示である。所与の実施形態の１つ以上の代表的な特徴の言及も同様に例示的である。そのような実施形態は、典型的には、言及される特徴（複数可）の有無にかかわらず存在することができ、同様に、それらの特徴は、本要約に列挙されるか否かにかかわらず、本明細書に開示される主題の他の実施形態に適用することができる。過度の反復を避けるため、本要約は、そのような特徴の全ての可能な組み合わせを列挙または提案することはない。
本発明の一態様は、核酸を含む脂質ナノ粒子（「ｎａＬＮＰ」）を作製するための方法に関し、核酸濃度で少なくとも１つの核酸を含む核酸溶液を提供することと、脂質濃度で少なくとも１つの脂質を含む脂質溶液を提供することと、核酸溶液の一部分と脂質溶液の一部分とを組み合わせて、混合窒素－リン酸塩比及び脂質：核酸比を含む混合溶液を作製することと、混合溶液中のｐＨを生理学的ｐＨに調整して、ｐＨ調整された混合溶液を得ることと、ｐＨ調整された混合溶液からｎａＬＮＰを得ることと、を含み、ｎａＬＮＰは、参照脂質ナノ粒子（「ｒｅｆＬＮＰ」）よりも大きな効力を有し、ｒｅｆＬＮＰは、少なくとも１つの脂質及び少なくとも１つの核酸を含み、参照ＬＮＰ製造方法によって作製される。
一実施形態では、核酸溶液の部分及び脂質溶液の部分は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、及び７：１からなる群から選択される体積比で、ステップ（ｃ）において組み合わされる。別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約４０～約１５０ナノメートルの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、ｎａＬＮＰは、約５０～約１００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約４０～約１００％の核酸カプセル化効率を有する。またさらなる実施形態では、ｎａＬＮＰは、約５０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する。別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約６０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する。なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約６８％～約８３％の核酸カプセル化効率を有する。
なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、ｒｅｆＬＮＰよりも低い核酸カプセル化速度を有する。さらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。なおさらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＲＮＡである。また別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ｍＲＮＡである。また別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである。なお別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、免疫原をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである。さらなる実施形態では、核酸溶液は、緩衝液を含む。また別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２１～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２３～約３ｍｇ／ｍｌである。また別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２５～約３ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２８～約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２９～約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．３０～約３ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．４０～約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．５０～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．６０～約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．７０～約３ｍｇ／ｍｌである。なおさらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約１～約３ｍｇ／ｍｌである。
なお別の実施形態では、脂質溶液は、メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン、及びトルエンからなる群から選択される有機溶媒を含む。さらなる実施形態では、脂質溶液は、ＭＣ３、ＫＣ２、ＤＬｉｎ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、式Ｉ、式ＩＩ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。なお別の実施形態では、脂質溶液中の少なくとも１つの脂質は、ＭＣ３、ＫＣ２、ＤＬｉｎ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。なお別の実施形態では、脂質溶液中の少なくとも１つの脂質は、ｐＫａを有するカチオン性脂質である。またさらなる実施形態では、脂質溶液中の少なくとも１つの脂質は、ｐＫａを有するイオン化可能なカチオン性脂質である。さらに別の実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａより約０～約２単位低いｐＨを有する。またさらなる実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａよりも約０．５～約１．５単位低いｐＨを有する。なおさらなる実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａよりも約０．７５～約１．２５単位低いｐＨを有する。さらなる実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約１ｍＭ～約２００ｍＭである。またさらなる実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約１０ｍＭ～約１５０ｍＭである。また別の実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約５０ｍＭ～約１００ｍＭである。さらなる実施形態では、混合溶液窒素－リン酸塩比は、少なくともまたは約２～少なくともまたは約１０である。
またさらなる実施形態では、混合溶液脂質：核酸重量比は、少なくともまたは約１：０、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１５：１、１７：１、１８：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、または５０：１である。またさらなる実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度を使用して作製される。別の実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度を使用して作製される。また別の実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度及び１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度を使用して作製される。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約１．５倍高い。
別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約２倍高い。また別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約３倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約４倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５倍高い。またさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約６倍高い。なおさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約７倍高い。別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約８倍高い。また別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約９倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１０倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１１倍高い。なおさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１２倍高い。またさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１３倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１４倍高い。またさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１５倍高い。別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２０倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２５倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５０倍高い。
本発明の別の態様は、約５．２５ｍＭ以上の濃度の少なくとも１つのイオン化可能な脂質と、約０．２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の少なくとも１つの核酸を含む溶液であって、酸：脂質比が、約２～約１０の範囲であり、少なくとも１つのイオン化可能な脂質及び少なくとも１つの核酸を含む核酸担持脂質ナノ粒子（「ｎａＬＮＰ」）と、を含み、生理学的ｐＨのｎａＬＮＰは、参照ＬＮＰ製造方法で同じ少なくとも１つのイオン化可能な脂質及び同じ少なくとも１つの核酸で形成された参照脂質ナノ粒子（「ｒｅｆＬＮＰ」）よりも大きな効力を有する溶液に関する。
本発明のこの態様の一実施形態では、ｎａＬＮＰは、約４０～約１５０ナノメートルの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約５０～約１００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、ｎａＬＮＰは、約４０％～約９０％の核酸カプセル化効率を有する。なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約５０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する。なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、約６０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する。なおさらなる実施形態では、ｎａＬＮＰは、約６８％～約８３％の核酸カプセル化効率を有する。また別の実施形態では、ｎａＬＮＰは、ｒｅｆＬＮＰよりも低い核酸カプセル化速度を有する。なお別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＲＮＡである。さらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ｍＲＮＡである。なお別の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである。またさらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸は、免疫原をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである。
また別の実施形態では、溶液は、緩衝液を含む。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２１～約３ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２３～約３ｍｇ／ｍｌである。なおさらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２５～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２８～約３ｍｇ／ｍｌである。またさらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．２９～約３ｍｇ／ｍｌである。また別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．３０～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．４０～約３ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．５０～約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．６０～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約０．７０～約３ｍｇ／ｍｌである。なお別の実施形態では、核酸濃度は、少なくともまたは約１～約３ｍｇ／ｍｌである。
別の実施形態では、溶液は、メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン、及びトルエンからなる群から選択される有機溶媒を含む。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも１つの脂質は、ＭＣ３、ＫＣ２、ＤＬｉｎ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、式Ｉ、式ＩＩ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。またさらなる実施形態では、少なくとも１つの脂質は、ＭＣ３、ＫＣ２、ＤＬｉｎ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。なお別の実施形態では、少なくとも１つの脂質は、ｐＫａを有するカチオン性脂質である。またさらなる実施形態では、少なくとも１つの脂質は、ｐＫａを有するイオン化可能なカチオン性脂質である。さらに別の実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａより約０～約２単位低いｐＨを有する。またさらなる実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａよりも約０．５～約１．５単位低いｐＨを有する。なお別の実施形態では、混合溶液は、ｒｅｆＬＮＰ中の脂質のｐＫａよりも約０．７５～約１．２５単位低いｐＨを有する。またさらなる実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約１ｍＭ～約２００ｍＭである。なお別の実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約１０ｍＭ～約１５０ｍＭである。また別の実施形態では、脂質濃度は、少なくともまたは約５０ｍＭ～約１００ｍＭである。また別の実施形態では、混合溶液窒素－リン酸塩比は、少なくともまたは約２～少なくともまたは約１０である。なお別の実施形態では、混合溶液脂質：核酸重量比は、少なくともまたは約１：０、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１５：１、１７：１、１８：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、または５０：１である。
なお別の実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度を使用して作製される。別の実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度を使用して作製される。またさらなる実施形態では、ｒｅｆＬＮＰは、１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度及び０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度を使用して作製される。なお別の実施形態では、ｎａＬＮＰの効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約１．５倍高い。別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約２倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約３倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも約４倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５倍高い。またさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約６倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約７倍高い。なおさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約８倍高い。またさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約９倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１０倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１１倍高い。また別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１２倍高い。なおさらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１３倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１４倍高い。なお別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１５倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２０倍高い。別の実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２５倍高い。さらなる実施形態では、効力は、ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５０倍高い。
本発明の別の態様は、上記の方法に従って作製されるｎａＬＮＰを含む薬学的組成物に関する。一実施形態では、薬学的組成物は、ワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは、予防用である。さらなる実施形態では、ワクチンは、治療用ワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは、感染性疾患を治療または予防するためのものである。さらなる実施形態では、ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９を治療または予防するためのものである。別の実施形態では、ワクチンは、コロナウイルス感染症を治療または予防するためのものである。さらなる実施形態では、組成物は、ペプチド、抗体、抗体断片、及び小分子治療剤からなる群から選択される生物活性剤を含む。
本開示の主題のより完全な理解は、後続の発明を実施するための形態と併せて考慮されるとき、添付の図面を参照することによって得ることができる。図に示される実施形態は、例示のみを意図しており、本開示の主題を示される実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。以下に記載される図は、以下に記載される様々な実施例からの実験結果に関連付けられている。
ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１Ａに示される実施形態は、実施例１Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１Ｂに示される実施形態は、実施例１Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１Ｃに示される実施形態は、実施例１Ｃに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図２Ａに示される実施形態は、実施例２Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図２Ｂに示される実施形態は、実施例２Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図２Ｃに示される実施形態は、実施例２Ｃに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図３Ａに示される実施形態は、実施例３Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図３Ｂに示される実施形態は、実施例３Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図３Ｃに示される実施形態は、実施例３Ｃに記載される手順に対応する。 Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。図３Ｄに示される実施形態は、実施例３Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図４Ａに示される実施形態は、実施例４Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図４Ｂに示される実施形態は、実施例４Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図４Ｃに示される実施形態は、実施例４Ｃに記載される手順に対応する。 Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。図４Ｄに示される実施形態は、実施例４Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図５Ａに示される実施形態は、実施例５Ａに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図５Ｂに示される実施形態は、実施例５Ｂに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図６Ａに示される実施形態は、実施例６Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図６Ｂに示される実施形態は、実施例６Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図６Ｃに示される実施形態は、実施例６Ｃに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。図６Ｄに示される実施形態は、実施例６Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図７Ａに示される実施形態は、実施例７Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図７Ｂに示される実施形態は、実施例７Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図７Ｃに示される実施形態は、実施例７Ｃに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。ここで、実施例６と比較して、これらのＬＮＰは１００ｍＭ ＮａＯＡｃを使用して製剤化されたことに留意されたい。製剤中の酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を上げると、緩衝能が高くなるためｐＨが低く保たれ、ＬＮＰの透析前のｐＨが低くなる。図７Ｄに示される実施形態は、実施例７Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図８Ａに示される実施形態は、実施例８Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図８Ｂに示される実施形態は、実施例８Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図８Ｃに示される実施形態は、実施例８Ｃに記載される手順に対応する。 Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。図８Ｄに示される実施形態は、実施例８Ｄに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。図８Ｅに示される実施形態は、実施例８Ｅに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図９Ａに示される実施形態は、実施例９Ａに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図９Ｂに示される実施形態は、実施例９Ｂに記載される手順に対応する。 ＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。５ｕｇのカプセル化ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、及び静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。イメージングは４時間と２０時間で行われました。図９Ｃに示される実施形態は、実施例９Ｃに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１０Ａに示される実施形態は、実施例１０Ａに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１０Ｂに示される実施形態は、実施例１０Ｂに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、透析の前に行った。図１０Ｃに示される実施形態は、実施例１０Ｃに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１１Ａに示される実施形態は、実施例１１Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１１Ｂに示される実施形態は、実施例１１Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１１Ｃに示される実施形態は、実施例１１Ｃに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。図１１Ｄに示される実施形態は、実施例１１Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１２Ａに示される実施形態は、実施例１２Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１２Ｂに示される実施形態は、実施例１２Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１２Ｃに示される実施形態は、実施例１２Ｃに記載される手順に対応する。 ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前（ウェル１）及び後に行った。図１２Ｄに示される実施形態は、実施例１２Ｄに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１３Ａに示される実施形態は、実施例１３Ａに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１３Ｂに示される実施形態は、実施例１３Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１３Ｃに示される実施形態は、実施例１３Ｃに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１４Ａに示される実施形態は、実施例１４Ａに示される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１４Ｂに示される実施形態は、実施例１４Ｂに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１４Ｃに示される実施形態は、実施例１４Ｃに示される手順に対応する。 初期ｍＲＮＡ濃度、初期脂質混合濃度、実施例１３及び１４（図１３及び１４）で試験された各特定の初期ｍＲＮＡ濃度について最も高い効力を生成する初期酢酸ナトリウム濃度の表。図１５Ａに示される実施形態は、実施例１５Ａに記載される手順に対応する。 各特定の初期ｍＲＮＡ濃度で最適な酢酸ナトリウム濃度について実施例１３及び１４を組み合わせるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。図１５Ｂに示される実施形態は、実施例１５Ｂに記載される手順に対応する。 ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。図１５Ｃに示される実施形態は、実施例１５Ｃに記載される手順に対応する。 ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。図１５Ｄに示される実施形態は、実施例１５Ｄに記載される手順に対応する。 実施例１６に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例１６に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例１６に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例１７に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例１７に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例１７に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例１８に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例１８に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例１８に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例１９に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例１９に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例１９に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２０に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２０に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２０に記載されるＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２１に記載されるインビボ免疫原性エンドポイントＥＬＩＳＡ抗ＲＢＤ力価。 実施例２１に記載される擬似中和アッセイのインビボ免疫原性ＦＲＮＴ５０力価。 ウイルスチャレンジに対するインビボ保護－実施例２２に記載されるチャレンジモデルにおける生存割合、重量、及び温度。 実施例２２に記載されるチャレンジモデルにおけるインビボ重量及び温度。 実施例２３に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２３に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２３に記載されるＩＭ及びＩＶ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２４に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２４に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２４に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２５に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２５に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２５に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２６に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２６に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２６に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２７に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２７に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２７に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２７に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２７に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２８に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２８に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２８に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例２８に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２８に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例２９に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例２９に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例２９に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例３０に記載されるＩＭ投与における注射部位のインビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例３０に記載されるＩＭ投与におけるエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例３１に記載されるＩＭ投与における注射部位のインビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例３１に記載されるＩＭ投与におけるエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例３２に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例３２に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例３２に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例３３に記載されるｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。 実施例３３に記載されるｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。 実施例３３に記載されるＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。 実施例３３に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。 実施例３３に記載される１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。 マイクロ流体混合中に脂質及びｍＲＮＡの濃度が増加したとき、ＬＮＰ効力及びエンドソームプロトン化が増加することを示す。Ａ）より高い濃度で組み立てられたＫＣ２ ＬＮＰは、１２ｋのＨＥＫ２９３細胞を含有するウェル当たり２５～２００ｎｇの同じ用量でインビトロでより高いＦｌｕｃ発現を生成した。Ｂ）より高い混合濃度で生成され（混合時の総脂質濃度ｍＭは、動物の上に示される）、ＩＭ注射のために５０μＬ中一定の５μｇ用量に希釈されたＬＮＰは、より強力である（カラーバーは、１０７ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒの放射輝度である）。Ｃ）ゼータ電位測定は、高濃度混合によって調製されたＬＮＰについてｐＨが７．４から５に低下したときプロトン化のより大きな増加を明らかにし、より大きなエンドソーム放出を示す。
ある特定の新規の驚くほど優れたＬＮＰ製造技法を通して核酸が装填された脂質ナノ粒子の効力を増加させる方法が本明細書に開示される。本明細書に記載される製造方法に従って製造されたＬＮＰを含有する薬学的組成物も開示される。
本明細書に開示される方法は、以前のＬＮＰ製造技術に関連する主要な技術的困難及び高コストを克服する。したがって、本明細書に開示される方法は、予想外の方法でＬＮＰの工業生産を大幅に改善し、それによって、核酸送達のためのより強力なＬＮＰを提供する。
本明細書に開示される本発明の一実施形態は、組み立て中の脂質及びｍＲＮＡの増加した混合濃度に起因する増加した効力のＬＮＰを示す方法である。
本明細書に開示される方法は、任意のイオン化可能な脂質及び核酸ペイロードに適用可能である。任意の特定の作用機序に縛られることを望まないが、増加したＬＮＰ効力は、増加したエンドソーム放出及びその後のイオン化可能な脂質からのｍＲＮＡの解離を通して媒介されると考えられる。さらに、異なる混合濃度に起因する超構造及びイオン化特性の変化は、エンドソーム脱出及びｍＲＮＡ放出を促進する方法で、電荷状態、分布、またはＬＮＰ成分の状態を改変した（ＬＮＰ周辺により近いイオン化可能な脂質またはコレステロールは、イオン化可能な脂質－ｍＲＮＡ相互作用及び内部構造を、より大きな割合のエンドソームプロトン化に利用可能な非プロトン化イオン化可能な脂質、多層状、ファセット構造に改変した）。好ましくは、本明細書に開示される方法によって形成される、核酸、例えば、ｍＲＮＡコードされた免疫原を送達するＬＮＰは、より強力であり、例えば、同じ用量で現在の低濃度で形成されるものと比較して、ウイルスチャレンジに対するより大きな保護を提供するであろう。
以下の用語は、当業者によってよく理解されていると考えられているが、以下の定義は、本明細書に開示される主題の説明を容易にするために記載されている。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、以下で他に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有することが意図されている。本明細書で使用される技術の言及は、当業者にとって明らかであろうそれらの技術の変形または同等の技術の置換を含む、当該技術分野において一般的に理解される技術を指すことが意図されている。以下の用語は、当業者によってよく理解されていると考えられているが、以下の定義は、本明細書に開示される主題の説明を容易にするために記載されている。よって、他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語、ならびに任意の頭字語は、本開示の主題の分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の情報を伝達するための任意の組成物、方法、キット、及び手段が本開示の主題を実施するために使用することができるが、情報を伝達するための特定の組成物、方法、キット、及び手段が本明細書に記載される。本明細書に記載される情報を伝達するための特定の組成物、方法、キット、及び手段は、例示にすぎず、本開示の主題は、それらの実施形態だけに限定されることを意図するものではないことが理解される。
長年存在している特許法慣例に従って、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含む、本出願で使用されるとき「１つ以上」を指す。例えば、いくつかの実施形態では、「ＬＮＰ」、「核酸」という語句は、それぞれ、１つ以上のＬＮＰまたはヌクレオチドを指す。
本願におけるいくつかのパラメータを記載している全て境界数値（「約」、「少なくとも」、「未満」及び「超」など）では、その記載には必然的に、示されている値を境界とするいずれの範囲も含まれることを理解されたい。したがって、例えば、「少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５」という記載は、とりわけ、１～２、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、３～４、３～５及び４～５などの範囲も示す。
本明細書で重量、時間、用量（例えば、治療用量）などの量のような測定可能な値を指すために使用される「約」という用語は、そのような変動が開示される方法を実施するために適切であるため、指定された量からの、いくつかの実施形態では＋／－２０％、いくつかの実施形態では＋／－１０％、いくつかの実施形態では＋／－５％、いくつかの実施形態では＋／－１％、いくつかの実施形態では＋／－０．１％、いくつかの実施形態では＋／－０．５％、及びいくつかの実施形態では＋／－０．０１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、実体のリストの文脈で使用されるとき、単独で、または任意の及び全ての可能な組み合わせ及び部分組み合わせで存在する実体を指す。よって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／またはＤ」という句は、個々にＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを含むが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意及び全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。複数の可能な選択肢が所与の要素について（すなわち、全ての「マーカッシュ群」及び任意の要素についての任意の構成要素の同様のリストについて）列挙される各例では、いくつかの実施形態では、任意の構成要素は、単独で、または任意の構成要素の任意の組み合わせもしくは部分組み合わせで存在することができることがさらに理解される。これらの形態のリストでは、各及び全ての組み合わせ及び部分組み合わせが想定されており、各そのような組み合わせまたは部分組み合わせは、ただ単に便宜上記載されていないことが暗示されている。追加的に、「または」の全ての列挙は、文脈が列挙された構成要素が代替的にのみ考慮されることを明確に要求しない限り（例えば、構成要素が所与の文脈において相互に排他的である、及び／または互いに組み合わせて使用することができない場合）、「及び／または」として解釈されるものがあることがさらに理解される。
Ｉ．定義
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルであり、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。脂質は、通常、少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪及び油、ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「化合物脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の、すなわち、２つ以上の脂質分子を含む粒子を指す。一実施形態では、ＬＮＰは、核酸ペイロードを担持する。ＬＮＰは、１つ以上の異なるタイプの脂質を有することができる。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア（単一層及び多重層ベシクル、例えば、「リポソーム」－いくつかの実施形態では、実質的に球状であり、より特定の実施形態では、水性コアを含むことができ、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む、ラメラ相脂質二重層）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内部相であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１～約２，５００ｎｍ、約１０～約１，５００ｎｍ、約２０～約１，０００ｎｍ、一実施形態では、約５０～約６００ｎｍ、部分実施形態では、約５０～約４００ｎｍ、部分実施形態では、約５０～約２５０ｎｍ、及び部分実施形態では、約５０～約１５０ｎｍのサイズを有する。他に示されない限り、本明細書で参照される全てのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ上での動的光散乱によって測定される、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、計数率が約２００～４００ｋｃｔｓとなるように、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈される。データは、強度加重平均の変換によって得られる数加重平均として提示される。数加重平均は、電子顕微鏡によって測定される粒子の物理的直径に最も密接に対応するため、好ましい。
本明細書で使用される「ＬＮＰ脂質」は、ＬＮＰを形成する個々の脂質分子を指す。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、またはｐＨが、ＬＮＰ中に存在するとき脂質のイオン化可能な基のｐＫａ（すなわち、水性媒体中のイオン化可能な脂質のｐＫａとは異なるＬＮＰの脂質環境中のイオン化可能な脂質のｐＫａ）未満に低下するが、より高いｐＨ値で徐々により中性となるため、カチオン性になる（プロトン化される）脂質を指す。ｐＫａ未満のｐＨ値では、脂質は次いで、負に荷電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と会合することができる。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、ｐＨ低下に対する正電荷を仮定する双性イオン性脂質を含む。特に、ＤＳＰＣなどのほとんどのヘルパー脂質は、カチオン電荷のバランスをとるリン酸基を有するため、双性イオン性であるが、カチオン性ではない。
「カチオン性脂質」という用語はまた、選択的ｐＨ、例えば、生理学的ｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。そのような脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－－（（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。追加的に、本発明で使用することができるカチオン性脂質のいくつかの商業的調製物が利用可能である。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）からの、ＤＯＴＭＡ及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－アンモニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．からの、エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）が挙げられる。以下の脂質は、カチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
いくつかの実施形態では、「ＬＮＰ脂質」は、以下に示されるＭＣ３、ＤＬｉｎ、及び／またはＫＣ２である。表は、ＬＮＰ中で測定されたイオン化可能な脂質のｐＫａ（ＴＮＳ ｐＫａ）対商業的ソフトウェアＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａによって予測される水性培地中のｐＫａを強調している。
Figure 2023546175000002
いくつかの実施形態では、本発明は、式Ｉによって包含される化合物であるＬＮＰ脂質を包含し、
Figure 2023546175000003
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立して、０～１０の整数であり、式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、及びＳから選択される原子であり、ｍの各々は、０～８の整数であり、式中、Ｌ１及びＬ２の各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
他の実施形態では、本発明は、式ＩＩによって包含される化合物であるＬＮＰ脂質を包含し、
Figure 2023546175000004
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、ＱがＳもしくはＯである場合、ＳもしくはＯに結合したＲ１は、電子対であり、式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、式中、ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立して、０～１０の整数であり、式中、Ｇ及びＱは、各々独立して、ＣＨ、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される原子であり、
式中、ｍ及びｎの各々は、０～８の整数であり、式中、Ｌ１及びＬ２の各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩによって包含される化合物であるＬＮＰ脂質を包含し、
Figure 2023546175000005
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、ＱがＳもしくはＯである場合、ＳもしくはＯに結合したＲ１は、電子対であり、
式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～２０の整数であり、
式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはジスルフィド結合から選択される原子であり、
式中、ｍの各々は、０～４の整数であり、好ましくは０、１、または２であり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは、０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｏである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｓである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＶによって包含される化合物であるＬＮＰ脂質を包含し、
Figure 2023546175000006
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、ＱがＳもしくはＯである場合、ＳもしくはＯに結合したＲ１は、電子対であり、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５’、Ｒ６’、Ｒ５”、及びＲ６”は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｕ、ｖ、ｗ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～２０の整数であり、
式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはジスルフィド結合から選択される原子であり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは、０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｏである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｓである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は以下の構造を有する。
Figure 2023546175000007
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は以下の構造を有する。
Figure 2023546175000008
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は以下の構造を有する。
Figure 2023546175000009
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は以下の構造を有する。
Figure 2023546175000010
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は以下の構造を有する。
Figure 2023546175000011
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000012
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000013
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000014
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000015
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000016
ある特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2023546175000017
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ脂質は、以下の表２における構造から選択される。
Figure 2023546175000018
別の実施形態では、本発明は、式Ｖの本発明のイオン化可能な脂質を包含し、
Figure 2023546175000019
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、ＱがＳもしくはＯである場合、ＳもしくはＯに結合したＲ１は、電子対であり、
式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３、及びＲ１４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１５、及びＲ１６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～１０の整数であり、
式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはジスルフィド結合から選択される原子であり、
式中、ｍの各々は、０～４の整数であり、好ましくは０、１、または２であり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｏである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｓである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩの本発明のイオン化可能な脂質を包含し、
Figure 2023546175000020
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成することができ、式中、ＱがＳもしくはＯである場合、ＳもしくはＯに結合したＲ１は、電子対であり、
式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３、及びＲ２４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～２０の整数であり、
式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはジスルフィド結合から選択される原子であり、
式中、ｍの各々は、０～４の整数であり、好ましくは０、１、または２であり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは、０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｏである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｓである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩの本発明のイオン化可能な脂質を包含し、
Figure 2023546175000021
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒に３～７員ヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環を形成することができ、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５’、Ｒ６’、Ｒ５”、及びＲ６”は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｕ、ｖ、ｗ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～２０の整数であり、
式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはジスルフィド結合から選択される原子であり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは、０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｏである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、Ｓである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩの本発明のイオン化可能な脂質を包含し、
Figure 2023546175000022
式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、または任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、任意選択的に置換されたＣ１０～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ１０～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ１０～Ｃ２２アルキニル、または一緒に３～７員ヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環であり、
Ｘは、ＯＨ、またはＮＲ１Ｒ２であり、
Ｚは、０～５の整数である。
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000023
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000024
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000025
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000026
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000027
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000028
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000029
特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能な脂質は、以下からなる群から選択される。
Figure 2023546175000030
別の実施形態では、本発明は、式ＩＸの本発明のイオン化可能な脂質を包含し、
Figure 2023546175000031
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、独立して、Ｈ、電子対、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１２アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アルキルシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ６アリール、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ６ヘテロアリール、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ８アリールオキシ、任意選択的に置換されたＣ７～Ｃ１０アリールアルキル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、任意選択的に置換されたアミンからなる群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２は、一緒に３～７員ヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環を形成することができ、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５’、Ｒ６’、Ｒ５”、及びＲ６”は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２２アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２２アルキニルからなる群から選択され、
式中、ｕ、ｖ、ｗ、ｙ、及びｚのうちの各々は、独立して、０～２０の整数であり、
式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮであり、
式中、Ｌ１及びＬ２のうちの各々は、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ３～Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、フェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、ベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換Ｃ２～Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは、０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは、２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは、２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、ジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＣＯ２（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ１～Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｑは、ＣＨである。
特定の実施形態では、Ｘは、Ｏである。
特定の実施形態では、Ｘは、Ｓである。
特定の実施形態では、Ｘは、Ｎである。
ある特定の実施形態では、ｍは、０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは、１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。
本明細書で使用される「ｎａＬＮＰ」は、本明細書で開示される方法に従って作製される脂質ナノ粒子を運ぶ核酸ペイロードを指す。ｎａＬＮＰは、参照ＬＮＰと比較して有意により大きな効力を有する。
本明細書で使用される「ｒｅｆＬＮＰの参照ＬＮＰ」は、参照ＬＮＰ製造方法を使用して１つ以上のＬＮＰ脂質で形成される脂質ナノ粒子を指す。一実施形態では、参照ＬＮＰは、核酸及び４つの脂質：アミン基を有するイオン化可能な脂質（５０％）、双性イオン性ヘルパー脂質－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（１０％）、コレステロール（３８．５％）、及びペグ化脂質－１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）（１．５％）（括弧内モル比）を含む５０～１００ｎｍ直径のＬＮＰである。親水性ＤＭＧ－ＰＥＧは、ＬＮＰのシェルを形成する。
「参照ＬＮＰ」は、それらが「参照ＬＮＰ製造方法」によって生成されるという事実によって定義される。
一実施形態では、「参照製造方法」は、以下のように要約され得る。
・核酸溶液：ｍＲＮＡを、１つの濃度及び１つのｐＨ、すなわち、５０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ５もしくは２５ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４、または１０～５０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ４の緩衝液中の０．２０ｍｇ／ｍｌ未満の１つの参照核酸濃度で調製する。
・脂質溶液：所望のＮＰ比（５．６７）及び／または脂質／ｍＲＮＡ重量比（１０：１～３０：１）に対応する１つの参照脂質濃度でエタノール中の脂質混合物を調製する
・ｒｅｆＬＮＰを組み立てる：核酸溶液の部分及び脂質溶液の部分を組み合わせることは、緩衝液中に単一の混合溶液をもたらす。
・ｒｅｆＬＮＰを混合溶液中で生理学的ｐＨに透析する。
・光散乱を使用してｒｅｆＬＮＰサイズを測定する
・Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用してｒｅｆＬＮＰにおけるＲＮＡカプセル化を測定する
・高いカプセル化＞７０％及び５０～１００ｎｍの直径を有するｒｅｆＬＮＰを選択する
本明細書で使用される「混合」は、好ましくは、乱流混合（「Ｔ－ｍｉｘ」）、ボルテックス混合（「Ｖ－ｍｉｘ」）、マイクロ流体混合、または両方を指す。例えば、米国特許公開第２０２００３０６１９１号に記載される混合を参照されたい。
一実施形態では、参照ＬＮＰ製造方法は、Ｈａｓｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１９，１５，１－１１に記載されるものである。別の実施形態では、「参照製造方法」は、米国特許出願第２０１９００３２０８７号に記載される通りである。一実施形態では、参照方法は、（ａ）第１の溶媒中の治療剤（例えば、核酸）を含む第１のストリームをマイクロチャネルに導入することであって、マイクロチャネルが、マイクロチャネルに導入された１つ以上のストリームを流動させるように適合された第１の領域と、１つ以上のストリームの内容物を混合するための第２の領域と、を有する、導入することと、（ｂ）層流条件下で流動する第１及び第２のストリームを提供するためにマイクロチャネルにおける第２の溶媒中のＬＮＰ形成材料（例えば、参照ＬＮＰ脂質）を含む第２のストリームを導入することであって、脂質粒子形成材料が、イオン化可能な脂質を含み、第１及び第２の溶媒が、同じであるか、または同じではない、導入することと、（ｃ）１つ以上の第１のストリーム及び１つ以上の第２のストリームを、マイクロチャネルの第１の領域からマイクロチャネルの第２の領域に流動させることと、（ｄ）カプセル化された治療剤を有する脂質粒子を含む第３のストリームを提供するためにマイクロチャネルの第２の領域における１つ以上の第１のストリーム及び１つ以上の第２のストリームの内容物を混合することと、を含む。
第１及び第２のストリームの内容物は、マイクロ流体チャネルにおけるカオス的移流によって、またはＴミキサーにおけるナノ沈殿によって混合することができる。
一実施形態では、１つ以上の第１のストリーム及び１つ以上の第２のストリームの内容物を混合することは、１つ以上の第１のストリーム及び１つ以上の第２のストリームの濃度または相対混合速度を変動させることを含む。上記の実施形態では、既知の方法とは異なり、方法は、混合後の希釈を含まない。
脂質粒子を含有する第３のストリームをカプセル化された治療剤でさらに安定させるために、方法は、第３のストリームを水性緩衝液で希釈することを含むことができるが、これをさらに含む必要はない。一実施形態では、第３のストリームを希釈することは、第３のストリーム及び水性緩衝液を第２の混合構造に流動させることを含む。別の実施形態では、カプセル化された治療剤を有する脂質粒子を含む水性緩衝液は、透析して第２の溶媒の量を低減する。
第１のストリームは、第１の溶媒中に治療剤を含む。好適な第１の溶媒としては、治療剤が可溶性であり、第２の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第１の溶媒としては、水性緩衝液が挙げられる。代表的な第１の溶媒としては、クエン酸塩及び酢酸塩緩衝液が挙げられる。第１の溶媒は、第２の溶媒が、イオン化可能な脂質をプロトン化するＨＣｌなどのプロトン化剤を含む場合、水のみであり得る。
第２のストリームは、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む。好適な第２の溶媒としては、イオン化可能な脂質が可溶性であり、第１の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第２の溶媒としては、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酸、及びアルコールが挙げられる。代表的な第２の溶媒は、＞５０％の水性エタノールを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は、比較的に急速な混合及び高い流量を利用するマイクロ流体プロセスにおいて有利に形成される。急速混合は、サイズ、均質性、及びカプセル化効率を含む、上記の有利な特性を有する脂質粒子を提供する。本発明の方法の実施で使用される混合速度は、約１００．ｍｕ．ｓｅｃ～約１０ｍｓｅｃの範囲である。代表的な混合速度には、約１～約５ｍｓｅｃが含まれる。流体力学的流れ集束方法は、比較的低い流量（例えば、５～１００ｍｕ．Ｌ／分）で、比較的低い脂質体積で動作するが、本発明の方法は、比較的高い流量及び比較的高い脂質体積で動作する。ある特定の実施形態では、単一の混合領域（すなわち、ミキサー）を組み込む方法について、流量は、約１～約１００ｍＬ／分である。ミキサーアレイ（例えば、１０個のミキサー）を利用する本発明の方法について、４０ｍＬ／分の流量が使用される（１００個のミキサーについて、流量４００ｍＬ／分）。よって、本発明の方法は、厳しい生成要件に必要な量の脂質粒子を提供するように容易にスケーリングすることができる。
本明細書に開示される本発明のＬＮＰ組成物は、抗体（例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、及びその断片など）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、及び他のタイプの抗腫瘍剤、低分子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び酵素核酸を含むが、これらに限定されない、１つ以上の生物学的活性剤を含むことができる。受動的及び能動的装填方法の両方を含む、生物学的活性剤を、リポソーム及び脂質ナノ粒子などの脂質組成物に装填するための様々な方法が、当該技術分野で利用可能である。使用される正確な方法は、例えば、装填される生物学的活性剤、装填してすぐ使用するための保存方法、得られる粒子のサイズ、及び企図される投与レジメンを含むが、これらに限定されない複数の因子に基づいて選択され得る。方法としては、例えば、リポソームが形成または再構成される時点での薬物及び脂質の機械的混合、全ての成分を有機溶媒中に溶解し、それらを乾燥フィルムに濃縮すること、活性剤をリポソームの内部に引き込むためにｐＨまたはイオン勾配を形成すること、膜貫通電位を形成すること、ならびにイオノフォア媒介装填が挙げられる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０８９８６号、米国特許第５，８３７，２８２号、同第５，８３７，２８２号、及び同第７，８１１，６０２号を参照されたい。
「核酸」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸塩－糖－バックボーンオリゴヌクレオチド、他のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及びそれらの組み合わせを指し、一本鎖、二本鎖であり得るか、または必要に応じて、二本鎖及び一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。いくつかの実施形態では、「核酸」は、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイ及びその類似体、プラスミド及び他のタイプの発現ベクター、ならびに小核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（小内部セグメント化干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称性干渉ＲＮＡ）、ならびに細胞培地、対象、または生物中などの、関連する細胞及び／または組織に対するセンス及びアンチセンス鎖間の１つ、２つ以上のミスマッチを含むｓｉＲＮＡを含む。そのような化合物は、精製され得るか、または部分的に精製され得、天然に存在し得るか、または合成であり得、化学的に修飾され得る。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡｉ剤、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するために有用なＲＮＡｉ剤である。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことも意味する。最大５０個のヌクレオチドを含有する断片は、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２０～５０ヌクレオチド長である。本発明の文脈において、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖、及び糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同様に機能する、天然に存在しないモノマーを含むポリマーもしくはオリゴマー、またはそれらの部分も含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼの存在下での増強された細胞取り込み及び増加した安定性などの特性のために、多くの場合天然形態よりも好ましい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’及び３’炭素でリン酸塩に共有結合して、交互、非分岐ポリマーを形成するデオキシリボースと呼ばれる５炭素糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭素糖がリボースである類似の繰り返し構造からなる。本発明による脂質粒子中に存在する核酸は、既知の任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域及び終結領域を含む遺伝子、ならびにウイルスまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡ及び他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、及び三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
別の実施形態では、生物学的活性剤は、ｍＲＮＡである。一実施形態では、核酸は、ＣＯＶＩＤ－１９タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡである。
本明細書で使用される場合、「Ｐｙｒ」、「Ｐｙｒｄ」、及び「ＰｙｒＤ」という用語は、交換可能に使用され、ピリジンまたはピリジル置換基を指す。
本明細書で言及される「効力」は、細胞または組織に核酸ペイロードを送達するＬＮＰの能力を指し、ＬＮＰは、細胞（または組織中の細胞）に内在化され、エンドソームから細胞質に放出され、そこで核酸ペイロードは、脂質から放出され、生物学的に利用可能になる。効力は、当業者に既知の任意の数の方法で測定され得る。例えば、それは、細胞取り込み、核酸ペイロード転写、核酸ペイロード翻訳、または核酸ペイロードによってコードされるポリペプチドの生成の観点で測定され得る。ＬＮＰの核酸ペイロードが、例えば、ＲＮＡｉのような遺伝子発現阻害様式で機能することを意図している場合、ＬＮＰ効力は、標的遺伝子の転写速度の低減、遺伝子標的のｍＲＮＡ転写物半減期の長さ、または標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の翻訳を通した標的遺伝子「ノックダウン」の観点で測定され得る。効力を測定するための追加のアッセイは、ＬＮＰ免疫原性及びＬＮＰ全身分布を測定することに依存する。そのようなアッセイ及びそれらの順列は全て、当技術分野で周知である。
一実施形態では、ＬＮＰ効力を測定する実験は、参照ＬＮＰと並行して行われる。そのような実験は、例えば、レポーター遺伝子などの標準化された核酸ペイロードを使用し得る。レポーター遺伝子（多くの場合単にレポーター）は、研究者らが、細菌、細胞培養物、動物、または植物における目的の別の遺伝子の調節配列に結合する遺伝子である。そのような遺伝子は、それらを発現する生物に付与される特徴が容易に特定及び測定されるため、またはそれらが選択可能なマーカーであるため、レポーターと呼ばれる。レポーター遺伝子は、ある特定の遺伝子が細胞または生物集団によって取り込まれたか、または発現されたかの指標として使用され得る。典型的なレポーター遺伝子は、ｌａｃＺ、ｃａｔ、ｇｆｐ、ｒｆｐ、ｌｕｃであり、これらは、それぞれ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ酵素をコードし、これらは、それぞれの組織化学、アセチル化、蛍光、分光光度、及び生物発光アッセイにおいて使用することができる。そのようなアッセイ及びそれらの順列は全て、当技術分野で周知である。
一実施形態では、ＬＮＰ効力は、既知の用量または複数の用量でのインビトロまたはインビボでのルシフェラーゼレポーター活性によって測定される。相対ＬＮＰ効力は、インビトロまたはインビボでのルシフェラーゼ活性測定によって決定される。例えば、米国特許第１０，２２１，１２７号も参照されたい。
ＬＮＰ効力はまた、例えば、治療的もしくは予防的効果、またはそれにつながる作用機序に対する影響を含む、核酸ペイロードへの所望の生物学的反応の観点で測定され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ効力は、免疫原、例えば、投与後に分泌された同族ＩｇＧ抗体を作製するように免疫系を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを担持するＬＮＰの能力によって測定される。
「ＬＮＰ効力の増加」は、本発明のｎａＬＮＰが参照ＬＮＰよりも大きな効力を有する程度を指す。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される本発明のＬＮＰは、同じ核酸カーゴを送達する同じアッセイにおいて参照ＬＮＰよりも約または少なくとも１．２５、１．５０、１．７５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、４００、５００、７５０、１０００、１０，０００倍大きいＬＮＰ効力の増加を有する。
本明細書で使用される「有機溶媒」は、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）のタイプを指す。ＶＯＣは、室温で蒸発する有機化学物質であり、医薬品の製造におけるある特定の材料及び物質を溶解するための当該技術分野では典型的である。製造における有機溶媒は、典型的には、芳香族化合物、例えば、ベンゼン及びトルエン、アルコール、例えば、メタノールまたはエタノール、エステル及びエーテル、ケトン、例えば、アセトン、アミン、ニトロ化及びハロゲン化炭化水素が使用される。
本明細書で使用される場合、「窒素－リン酸塩または「ＮＰ」比は、核酸バックボーン上のリン酸塩のモルに対するイオン化可能な脂質のモル比として定義される。モルは、混合溶液中の総モル対異なる体積比で混合することができる初期核酸または脂質溶液中の濃度であることに留意されたい。注目すべきは、イオン化可能な脂質当たり２つ以上のアミンの場合である。静電結合は荷電基のみを伴うため、２つ以上が存在するときであっても、ＮＰ比はイオン化可能な脂質当たり１つのアミンで定義されることが最も自然であるように、多くの場合、１つのアミンのみが混合条件下でプロトン化されるであろう。しかしながら、ある特定のイオン化可能な脂質は、混合中に荷電される２つ以上のアミンを有することができる。
本明細書で使用される場合、「脂質／核酸重量比」は、ＮＰ比の代わりに使用され得る重量比である。ＮＰ比と重量比との間の変換は、リン酸塩当たりのモル質量について塩基の数で割ったイオン化可能な脂質及び核酸のモル質量を含む。
一実施形態では、核酸の量は、核酸バックボーン上のリン酸基に対するイオン化可能な脂質上のアミンのＬＮＰモル比によって表され、典型的には、約３～約６である。一実施形態では、ＬＮＰのｐＫａは、初期エンドソームにおけるｐＨに対応する約６～約７の範囲である。ＬＮＰ中のイオン化可能な脂質のｐＫａと遺伝子サイレンシング効率との間の関連は、約６～約７の範囲のＬＮＰ ｐＫａが、イオン化可能な脂質ＤＬｉｎＤＭＡについてより多くのサイレンシングをもたらし、エンドソームの膜を破壊し得る脂質構造を促進することと関連していたことを示している。ＬＮＰのｐＫａは、アニオン性染料ＴＮＳの蛍光増強のｐＨ依存性を使用して測定され得る。
本明細書で使用される場合、「コレステロール」は、特定の分子構成で配置された４つの環を有する生物学的に活性な有機化合物を指す。ステロイドコア構造は、典型的には、４つの「縮合」環：３つの６員シクロヘキサン環（環Ａ、Ｂ、及びＣ）及び１つの５員シクロペンタン環（Ｄ環）で結合した、１７個の炭素原子から構成される。ステロイドは、この４環コアに結合した官能基及び環の酸化状態によって異なる。ステロールは、３位のヒドロキシ基及びコレスタンに由来する骨格を有するステロイドの形態である。ステロイドはまた、環構造の変化、例えば、環のうちの１つを切断することによってなど、より根本的に修飾することができる。環Ｂを切断することは、セコステロイドを生成し、これの１つには、ビタミンＤ３がある。例としては、脂質コレステロール、性ホルモンエストラジオール及びテストステロン、［４］：１０－１９ならびに抗炎症薬デキサメタゾンが挙げられる。ステロイドの多くは、植物、動物、及び真菌に見られる。ステロイドは、好ましくは、ステロールラノステロール（オピストコント）またはシクロアルテノール（植物）からの細胞で製造される。ラノステロール及びシクロアルテノールは、トリテルペンスクアレンの環化に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、例えば、ジヒドロコレステロール、ｅｎｔ－コレステロール、ｅｐｉ－コレステロール、デスモステロール、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、３．ベータ－［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２５（Ｒ）－２７－ヒドロキシコレステロール、２２－オキサコレステロール、２３－オキサコレステロール、２４－オキサコレステロール、シクロアルテノール、２２－ケトステロール、２０－ヒドロキシステロール、７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２２－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、７－デヒドロコレステロール、５．アルファ．－コレスト－７－エン－３．ベータ．－オール、３，６，９－トリオキサオクタン－１－オール－コレステリル－３ｅ－オール、デヒドロエルゴステロール、デヒドロエピアンドロステロン、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、ラノステノール、ルミステロール、シトカルシフェロール、カルシポトリオール、コプロスタノール、コレカルシフェロール、ルペオール、エルゴカルシフェロール、２２－ジヒドロエゴカルシフェロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、ジモステロール、ジオスゲニン、フコステロール、フェコステロール、もしくはフェコステロール、またはその塩もしくはエステルであるコレステロール誘導体を含有する。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはコレステロール誘導体は、コレステロール、コレステロールコハク酸、硫酸コレステロール、ヘミコハク酸コレステロール、フタル酸コレステロール、リン酸コレステロール、バレリン酸コレステロール、酢酸コレステロール、オレイン酸コレステリル、リノール酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、アラキジン酸コレステリル、コレステリルホスホリルコリン、及びコール酸ナトリウムである。他の例示的なステロイドは、米国特許公開第２０２００１２９４４５号に開示されている。
本明細書で使用される場合、「カプセル化された脂質」は、完全カプセル化、部分カプセル化、または両方を有する、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）などの、活性剤または治療剤を提供する脂質ナノ粒子を指す。一実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＬＮＰに完全にカプセル化される。
ＩＩ．ＬＮＰ製造の方法
従来技術は、これまで、ＬＮＰ効力を決定するための主要なパラメータとして、イオン化可能な脂質の同一性及び構造に焦点を当ててきた。二次パラメータは、コレステロールのＤＳＰＥ対ＤＳＰＣまたは異なるコレステロール類似体のような他の脂質の影響及び４つの脂質のモル比を識別することを含む。
また、従来技術は、当業者が、緩衝液濃度はイオン化可能な脂質を高度にプロトンして最大量のｍＲＮＡ（１００％近く）をカプセル化するために十分に高く、ｐＨは十分に低いべきであり、これはＬＮＰ効力を最大化するであろうと考えたことを示す。
さらに、従来技術は、高濃度の核酸及び脂質を有する混合溶液で作業することは、不溶性、望ましくない沈殿、混合不良、不均一なＬＮＰサイズの生成、及び不均一な核酸カプセル化速度を含む、一連の技術的問題につながることを教示する。また、核酸溶液、特に１ｍｇ／ｍｌを超える濃度を有するレポーターｍＲＮＡ溶液は、市販されていない。高濃度溶液が市販されていた場合でも、様々な濃度を試験するための数百の高濃度混合物の性能には、膨大なコストがかかるであろう。これらの一般的な仮定を考慮して、ＬＮＰ製造に関与する科学者らは、高い試験コスト、不要な沈殿、ＬＮＰサイズの不均一性、及びＬＮＰ核酸カプセル化の不均一性を回避するために、低濃度の核酸及び脂質を有する混合溶液を使用することに焦点を当て、ｍＲＮＡ投与量は、下流処理ステップ中に溶液中でそのように作製されたＬＮＰを濃縮することによって後で調整することができると考えた。しかしながら、これは、この従来技術の手順が低効力のＬＮＰをもたらすという基本的な問題を解決しない。
例えば、これまで、＞２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．５ｍｌの高濃度ｍＲＮＡ溶液は、混合物当たり少なくとも１，５００ドルのコストがかかっていたであろう。本明細書に開示されるｎａＬＮＰに到達するために、技術者は、他のコストを考慮せず本明細書に開示される核酸溶液の調製のためだけに、少なくとも１５０，０００ドルのコストで＞１００の混合物を利用したであろう。高濃度核酸溶液を生成する費用の他に、高濃度は、これまで、不溶性、凝集、沈殿、及び／または混合不良を引き起こすと考えられていた。
また、出願人らは、高い核酸濃度の使用が、より低いカプセル化率、例えば、ｎａＬＮＰにおける約７０％対ｒｅｆＬＮＰにおける約９０％をもたらすことを決定した。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、実質的により低いカプセル化率であっても、本明細書に開示されるｎａＬＮＰは、ｒｅｆＬＮＰよりも高いＬＮＰ効力を有したことを見出した。
出願人らは、同一の条件（細胞数など）下での実験の結果、内部組換えＱｕａｎｔｉｌｕｍ標準、及び実験間で同じｒｅｆＬＮＰを比較することによって、ｎａＬＮＰ効力の決定を可能にする、高度に制御された再現可能なインビトロＦＬｕｃアッセイを開発した。
出願人らはさらに、イオン化可能な脂質の非プロトン化画分が、エンドソーム放出、及び／またはより良好なエンドソーム放出のためのｍＲＮＡのより緩い結合、及び／またはＬＮＰにおけるイオン化可能な脂質もしくは核酸、例えば、ｍＲＮＡのより末梢的な分布を増加させることは、これまで知られていなかったことを提示する。
しかしながら、本明細書では、ＬＮＰ効力が、一定のＮＰまたは重量比を維持しながら、核酸：脂質混合物の絶対濃度によって強く影響されるという予想外の発見が開示される。
本明細書で提供されるデータは、混合時の核酸の絶対濃度ならびに緩衝液濃度及びｐＨの両方が、ＬＮＰ効力に強く影響し、これら２つの影響が相互作用することを実証する。この相互作用を媒介する際の重要な変数は、混合中のイオン化可能な脂質のプロトン化レベルであり、それは以前に考えられていたように、カプセル化を最大化するために最大化されるべきではない。むしろ、イオン化可能な脂質のプロトン化レベルは、本明細書に開示される方法に従ってＬＮＰ効力を最大化するレベルであるべきである。
一般的な実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子を製造するための向上された方法を包含し、脂質ナノ粒子送達効率は、イオン化可能な脂質のイオン化及びアルキルテール構造に依存する。
ある特定の実施形態では、高い送達効率を有するＬＮＰは、ＢｉｏＮＴｅｃｈ／Ｐｆｉｚｅｒ及びＭｅｄｅｒｎａからの現在のＣＯＶＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンの成功において極めて重要である。ある特定の実施形態では、これらのワクチン中のＬＮＰは、４つの脂質、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質ＤＳＰＣ、コレステロール、及びｍＲＮＡ配列と約６０ｎｍ１の直径を有するナノ粒子に自己組み立てするＰＥＧ脂質を含有する。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質のプロトン化形態は、ｍＲＮＡのアニオン性リン酸塩バックボーンに静電的に結合して、ＬＮＰにカプセル化し、一方でＤＳＰＣは、親水性ＰＥＧドメインが水性媒体に面しているＰＥＧ脂質テールを含有する末梢二重層を形成する。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質の役割は、エンドソームｐＨが７未満に低下するとプロトン化し、次いでエンドソーム膜と相互作用してこれを開き、ｍＲＮＡを放出することによって、エンドソーム放出を促進することである。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ中のイオン化可能な脂質は、エンドソーム－リソソーム融合の前にＲＮＡを放出するために５～７．４の範囲のｐＫａを有する。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質のアルキルテールはまた、不安定化するためにエンドソーム二重層と不適合性である必要がある。この後者の要件は、円錐形の分岐構造によって、現在のイオン化可能な脂質で達成される。
ある特定の実施形態では、本発明はまた、イオン化可能な脂質の構造からＬＮＰのｐＫａを予測することによって、エンドソーム放出のためのＬＮＰイオン化を合理的に設計する方法も包含する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰのｐＫａは、水相と比較して、ＬＮＰにおけるプロトン溶媒和エネルギーの差によって、イオン化可能な脂質のｐＫａよりも低い。ある特定の実施形態では、これは、増加したエンドソームプロトン化及びｍＲＮＡ翻訳を提供する３つのプロトン化可能な窒素を有する新規のイオン化可能な脂質（Ｃ２Ｃ４）の合理的な設計を可能にした。ある特定の実施形態では、Ｃ２４ＬＮＰは、ｍＲＮＡコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する免疫原性の点で、ＭＣ３ ＬＮＰ、標準参照ＬＮＰよりも１０倍優れていることが見出され、感染に対するより大きな保護をもたらした。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ合理的設計アプローチは、イオン化可能な脂質の構造を使用して、ＬＮＰイオン化、及びイオン化可能な脂質がエンドソーム膜を破壊し、ｍＲＮＡを放出する能力を予測するモデルを開発することによって拡張された。
ある特定の実施形態では、送達効率は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製造プロセスに依存する。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、エタノール中の４つの脂質が、低ｐＨ緩衝液中にあるｍＲＮＡと急速に混合される自己組み立てプロセスを通して、マイクロ流体またはより大規模なＴ－ミキサーを使用して製造される。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ ＬＮＰの形成は、プロトン化されたカチオン性のイオン化可能な脂質の、アニオン性のｍＲＮＡリン酸塩バックボーンとの静電結合を通して生じ、続いて脂質が水相から分離して、親水性ＰＥＧ界面によって安定化されるナノ粒子が形成される。ある特定の実施形態では、多くの因子は、これらに限定されないが、脂質及びｍＲＮＡの絶対及び相対濃度、緩衝液のタイプ、その濃度及びｐＨ、有機相対水相との比、ならびに流量を含み、製造プロセスにおいて変更され得る。我々は、相対濃度を変更することなく、脂質及びｍＲＮＡの絶対濃度をともに増加させることが、得られるｍＲＮＡ ＬＮＰの送達効率を典型的には４倍増加させることができることを発見した（図３４）。ある特定の実施形態では、本発明は、これらの混合濃度を、例えば、６倍、７５ｍＭの総脂質及び１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡに増加させて、同一の用量でインビトロ及びインビボでの送達効率の４倍増加をもたらす方法を包含する（図３４Ｂ）。ｐＨ７．４から５へのゼータ電位増加を測定することによって、我々は、これらのより強力なＬＮＰが、標準条件下で組み立てられたものと比較して、ゼータ電位の２倍大きな増加を示すことを見出した（図３４Ｃ）。理論によって縛られることなく、この結果は、改善された効力が、部分的には、エンドソームプロトン化を増加させるＬＮＰにおけるプロトン化されていないイオン化可能な脂質のより高いレベルによるものであることを示す。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ ＬＮＰは、緩衝液を含まない環境において組み立てられる。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の低ｐＨ緩衝液を使用して、混合時にイオン化可能な脂質をプロトン化するのではなく、イオン化可能な脂質は、緩衝液を含まない水中でｍＲＮＡと混合する前に、ＨＣｌを脂質混合物に添加することによって予めプロトン化される。ある特定の実施形態では、ＴＬＣ－ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲを使用して、脂質分解が発生しなかったことを検証した。ある特定の実施形態では、３つの窒素を有するＣ２４イオン化可能な脂質を使用し、イオン化可能な脂質当たり０．２５のプロトンを添加して、我々は、プロトン化された窒素がｍＲＮＡのリン酸塩と１：１の比であるように、平均で、４つの脂質毎に１つの窒素をプロトン化した（ＮＰ比は４であった）。ある特定の実施形態では、緩衝液を含まない組み立て方法は、ともに高い脂質及びｍＲＮＡ混合濃度を使用して、緩衝液を使用することと比較して、ＩＭ及びＩＶ投与の両方についてＩＶＩＳによって３倍の、さらに高いインビボでの効力をもたらした。ある特定の実施形態では、緩衝液を含まない、高い絶対脂質／ｍＲＮＡ濃度組み立て方法は、したがって、低濃度及び低ｐＨ緩衝液を使用する現在の製造方法よりも１０倍強力であるが、最終製剤の組成を変化させないＬＮＰを作製することができる。ある特定の実施形態では、プレプロトン化方法は、本質的に高速で不均一なプロセスである、脂質に接触し、プロトン化するために対流及び拡散を必要とする緩衝液に対して、特定のレベルのイオン化可能な脂質のプロトン化をより正確に標的化する。ある特定の実施形態では、製造プロセスは、全ての製造スケールで、ならびにマイクロ流体及びＴ混合ジオメトリの両方で容易に実装される高効力ＬＮＰを達成する。
ある特定の実施形態では、製造の方法は、緩衝液を含まないｍＲＮＡと混合する前に、イオン化可能な脂質をプロトン化するステップを含む。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質は、ＨＣＬ、ＤＣＬ、弱酸、エタノール、水、または本明細書に記載される任意の溶媒でプロトン化することができる。ある特定の実施形態では、プロトン化は、他の脂質と混合する前に単独で、または脂質混合物全体で起こる。
ある特定の実施形態では、塩酸は、他の脂質との脂質混合物への混合前に、またはイオン化可能な脂質を脂質混合物中で既に混合された後プロトン化する前に、イオン化可能な脂質ストック自体の直接プロトン化に使用される。脂質混合物中のこの緩衝液を含まない予めプロトン化されたイオン化可能な脂質は、緩衝液を含まないｍＲＮＡ溶液の後に混合される。ある特定の実施形態では、１００％プロトン化は、溶液中のイオン化可能な脂質の各モルについて、１モルのＨＣＬが添加されて、イオン化可能な脂質中の窒素がプロトン化されるであろうことを意味する。多タンパク質のイオン化可能な脂質中の複数の窒素をプロトン化するために、対応するモルのＨＣＬが添加されて、各窒素がプロトン化される。
一般的な実施形態では、本明細書に開示されるｎａＬＮＰを作製するための改善された方法は、以下のように要約され得る。
・核酸溶液：ある特定の緩衝液濃度の緩衝液中の核酸濃度で及びある特定の核酸溶液ｐＨで核酸を提供する。
・脂質溶液：所望の：ｉ）窒素－リン酸塩（「ＮＰ」）比、またはｉｉ）脂質／核酸重量比に対応する脂質溶液脂質濃度で有機溶媒中の脂質を提供する。
・ｎａＬＮＰを組み立てる：核酸溶液及び脂質溶液の一部分を、混合緩衝液濃度及びｐＨを有する混合溶液に組み合わせる。
当業者は、本発明の方法におけるある特定のステップがある特定の順序で実施される必要はないが、他のステップが他の前に実施されなければならないことを理解するであろう。さらに、様々な当事者が全体的な方法の様々なステップを実施し得る。
いくつかの実施形態では、混合溶液中の核酸溶液及び脂質溶液の部分は、約または少なくとも０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、２：１、３：２、３：１、４：１、４：３、５：１、５：３、５：４、６：１、６：５、７：１、８：１、９：１０、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、及び２０：１の体積比である。
次いで、上記の方法に従って作製されたＬＮＰは、当該技術分野において周知の方法に従った使用のためにさらに処理され得る。いくつかの実施形態では、そのようなさらなる処理は、以下のうちの１つ以上を伴う。
・ｎａＬＮＰを、例えば、約４～約２４時間の透析を介して、または代替的に、ＲｅｐｌｉｇｅｎのＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）ＫＲ２ｉもしくはＫＭＰｉ ＳｙｓｔｅｍｓもしくはＣｙｔｉｖａのＡＫＴＡ Ｆｌｕｘ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍなどの接線流濾過及び交換緩衝液の使用を介して、生理学的ｐＨにすること。
・ｎａＬＮＰサイズを、例えば、光散乱によって、測定すること。
・ＲＮＡカプセル化を、例えば、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって、測定すること。
・高いカプセル化、例えば、少なくとももしくは約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのカプセル化効率、または平均直径、少なくとももしくは約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｎＭを有するか、またはそれぞれ、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｎＭの最小直径及び約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｎＭの最大直径を有するｎａＬＮＰを選択すること。
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、核酸を、約または少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ミリグラム／ｍｌの核酸濃度で含有する。
いくつかの実施形態では、核酸は、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の分子種に存在し、その各々は、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のオープンリーディングフレームをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、約または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、８００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、７５０００、１０００００ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、緩衝液を、約または少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭの濃度で含有する。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、塩緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、クエン酸、酢酸、リン酸塩、及びホウ酸塩である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、または酢酸ナトリウムである。他の実施形態では、緩衝液は、クエン酸塩、ＭＥＳ、ヒスチジン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＥＡ、ＡＭＰＤ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＢＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、ＣＨＥＳ、ＰＢＳ、ＳＳＣ、ＴＡＥ、ＴＢＥ、またはＴＥなどであり得る。例えば、“Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ３．６ ｔｏ ５．６）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．”ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ，２９ Ｓｅｐ．２０２０を参照されたい。他の好適な緩衝液は、以下の表に示される。

Figure 2023546175000032
いくつかの実施形態では、核酸溶液は、約または少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４のｐＨである。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、有機溶媒を含有し、ベンゼン、トルエン、アルコール、例えば、メタノール、エステル、エーテル、ケトン、例えば、アセトン、アミン、ニトロ化及び／またはハロゲン化炭化水素、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、有機溶媒は、エタノールである。好ましい溶媒は、揮発性であり、非毒性であり、及び／または微量でのヒトへの投与について許容される。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、１つ以上の脂質を、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、８００、１０００ｍＭの合計濃度で含有する。
いくつかの実施形態では、混合溶液は、約または少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ミリグラム／ｍｌの核酸の混合濃度を有する。
いくつかの実施形態では、混合溶液は、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、８００、１０００ｍＭの脂質の混合合計濃度を有する。
いくつかの実施形態では、混合溶液は、約または少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭの混合緩衝液濃度を有する。
いくつかの実施形態では、緩衝液、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液、混合溶液中の濃度は、任意の特定の混合濃度での効力を最大化するように最適化される。例えば、実施例１３は、１．５ｍｇ／ｍｌの核酸溶液中のｍＲＮＡで、ＬＮＰ効力は、酢酸ナトリウムを５０ｍＭから２５ｍＭに低減するとき、参照ＬＮＰと比較して４４％増加することを示す。核酸溶液中の０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ濃度では、酢酸ナトリウム濃度を２５ｍＭから１０ｍＭに低減することは、ＬＮＰ効力を約２．２倍に増加させる。混合濃度の増加及び緩衝液濃度の最適化された低減は、混合濃度を低下させ、緩衝液濃度を増加させることによって実施例１０のようにカプセル化が誤って最大化された従来技術方法において典型的に得られるよりも低い約７０％のカプセル化効率をもたらす。本明細書に開示される方法に従って作製されたＬＮＰは、わずかに低いカプセル化効率（例えば、６０～８０％対８０～１００％）を有するにもかかわらず、参照ＬＮＰ製造方法に従って作製されたＬＮＰよりも予期せずかつ有意に強力である（例えば、５～１０倍）。
いくつかの実施形態では、混合溶液は、約または少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４のｐＨである。
いくつかの実施形態では、所望の「窒素－リン酸塩または「ＮＰ」」比は、約：１：１００、１：７５、１：５０、１－２５、好ましくは２：１０、より好ましくは３：６である。
いくつかの実施形態では、所望の「）脂質／核酸重量比は、約：１：１～１０００：１、好ましくは５：１～１００：１、より好ましくは１０：１～３０：１である。
いくつかの実施形態では、核酸溶液中のｍＲＮＡ濃度を、全て５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４中の一定のＮＰ比４で０．０５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡから１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡに増加させることは、細胞（図８Ａ）及び動物（図９Ｃ ＩＭ及びＩＶ投与）において同じ用量で試験された１．５ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌの混合濃度を比較してＬＮＰ効力の約１０倍の増加をもたらす。０．０５ｍｇ／ｍｌ～０．１ｍｇ／ｍｌのＬＮＰの範囲の低ｍＲＮＡ濃度は、参照ＬＮＰ製造方法に従って作製されたＬＮＰを表す。好ましくは、本発明の方法は、約または０．２０ｍｇ／ｍｌ超のｍＲＮＡで行われる混合を有し、この時点でＬＮＰ効力の大幅な増加が観察される。
一実施形態では、製造方法は、以下に設定される通りである。
・核酸溶液：単一の緩衝液、例えば、ｐＨ４の２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中の０．０５～３ｍｇ／ｍｌの範囲のいくつかの濃度でｍＲＮＡを調製する。一般的なガイドラインとして、ここでの緩衝液選択及びｐＨは、約７０％のカプセル化を得るために、生成されているＬＮＰのｐＫａの約１ポイント未満である混合中のｐＨを得るように選択されるべきである。例えば、ＮＰ４を生成するためにｐＨ４の２５ｍＭのＮａＯＡｃ中の１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡと７５ｍＭの総脂質濃度（３７．５ｍＭのＫＣ２またはＭＣ３濃度）で混合されたｐＫａ＝約６．５を有するＫＣ２またはＭＣ３は、２体積の核酸溶液が１体積の脂質溶液と混合されるとき、３３％エタノール（ＥＴＯＨ）、６７％Ｈ２Ｏ中の１ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ（３．１ｍＭのリン酸基）、１２．５ｍＭのＫＣ２、及び１６．７ｍＭの酢酸ナトリウムから構成される混合溶液中で５．５のｐＨをもたらす。
・脂質溶液：核酸溶液調製に関して直前に記載されるｍＲＮＡ溶液の各々について所望のＮＰ比または脂質／ｍＲＮＡ重量比に対応するいくつかの濃度でエタノールまたは別の好適な溶媒中の脂質混合物を調製する。
・単一の緩衝液タイプ、濃度、及びｐＨにおいてｍＲＮＡとの上記の複数の混合濃度でｎａＬＮＰを組み立てる。
・ｎａＬＮＰを生理学的ｐＨにする。
・光散乱を使用してｎａＬＮＰサイズを測定する。
・Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用してｎａＬＮＰにおけるＲＮＡカプセル化を測定する。
・カプセル化＞４０％を有するｎａＬＮＰを受け入れる。
・既知の用量またはいくつかの用量でインビトロまたはインビボでのルシフェラーゼ活性を測定する。
・相対ｎａＬＮＰ効力対ｒｅｆＬＮＰは、インビトロまたはインビボで測定されるルシフェラーゼ活性によって決定される。
別の実施形態では、ｎａＬＮＰ効力は、ｍＲＮＡ緩衝液タイプ、濃度、及びｐＨを調整することによって混合中のイオン化可能な脂質の混合及びプロトン化レベルのｐＨを変更することによって任意の所与の混合濃度で最適化され得る。
・核酸溶液：緩衝液タイプ（酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、緩衝液濃度（１～１００ｍＭ）、及びｐＨ（３～７）の範囲で１つの濃度（すなわち、上記の範囲０．０５～３ｍｇ／ｍｌ）でｍＲＮＡを調製する。任意の特定の混合濃度について、選択された緩衝液は、順に３３％ＥＴＯＨ／６７％Ｈ２Ｏ緩衝液のｐＨ、よって、緩衝液のタイプ、濃度、及びｐＨによって決定される、イオン化可能な脂質のプロトン化レベル（４０～９０％）にほぼ対応することができる４０～９０％の範囲に及ぶカプセル化効率をもたらすべきである。
・脂質溶液：核酸溶液調製に関して直前に記載されるｍＲＮＡ溶液について所望のＮＰ比または脂質／ｍＲＮＡ重量比に対応する濃度でエタノールまたは別の好適な溶媒中の脂質混合物を調製する。
・単一の混合濃度で上記の複数の緩衝液中にｎａＬＮＰを組み立てる。
・ｎａＬＮＰを生理学的ｐＨにする。
・光散乱を使用してｎａＬＮＰサイズを測定する。
・Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用してｎａＬＮＰにおけるＲＮＡカプセル化を測定する。
・カプセル化＞４０％を有するｎａＬＮＰを受け入れる。
・既知の用量またはいくつかの用量でインビトロまたはインビボでのルシフェラーゼ活性を測定する。
・相対ｎａＬＮＰ効力は、インビトロまたはインビボで測定されるルシフェラーゼ活性によって決定される。
任意の特定のｎａＬＮＰ製剤について、参照ＬＮＰ製造方法によって作製されたｒｅｆＬＮＰと比較して少なくともまたは約１０倍の効力増加は、本明細書に開示される方法に従って、核酸溶液及び脂質溶液中の濃度、ならびにしたがって混合溶液及びｍＲＮＡ緩衝液濃度ならびにｐＨにおける適切な最適化によって得ることができる。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、核酸溶液から完全に欠損しており、イオン化可能な脂質は、実施例１０に示されるように脂質溶液脂質混合物への酸、例えば、ＨＣｌの制御された添加によって直接プロトン化される。後者は、水中でｍＲＮＡと混合する前に、脂質混合物中で定義されたレベルのプロトン化を達成し、酢酸ナトリウムを使用して最適であることが見出されるものと同様のレベルのカプセル化（７０％）をもたらすことができる。
一実施形態では、２つの液体の組み合わせは、混合によるものである。例えば、混合は、カオス的移流によるマイクロ流体混合によるものである。別の実施形態では、Ｔジャンクション混合は、大規模で使用することができ、同様のＬＮＰをもたらす。
マイクロ流体デバイスは、温度、滞留時間、及び溶質濃度を正確に制御して、ナノリットル規模で流体を制御可能かつ急速に混合する能力を提供する。制御された急速なマイクロ流体混合は、無機ナノ粒子及びマイクロ粒子の合成に以前に適用されており、ナノ粒子の大規模な生成でマクロ規模のシステムを上回ることができる。マイクロ流体二相液滴技法は、薬物送達のための単分散ポリマー微粒子を生成するために、または細胞、タンパク質、もしくは他の生体分子のカプセル化のための大きなベシクルを生成するために適用されている。いくつかの実施形態では、試薬の急速な混合を提供し、制御されたサイズの単分散リポソームを作製するための一般的なマイクロ流体技法である流体力学的流れ集束が使用される。この技法はまた、バルク生成方法と比較して小分子のより高いカプセル化を有する、より小さく、より多くの単分散粒子が得られた、ポリマーナノ粒子の生成において有用であることが証明されている。
一実施形態では、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上の脂質は、エタノールなどの有機溶媒中で可溶化され、核酸は、ｐＨ３～６、好ましくは４の酢酸緩衝液中にある。これらの２つのストリームは、共通のマイクロ流体チャネルで合流し、水性レシピエントウェルに排出される前に数ミリ秒で混合させられる。混合中に２つの事象が発生する：１）初期に中性のイオン化可能な脂質は、低ｐＨ緩衝液に接触し、アニオン性ｍＲＮＡと混合すると同時にプロトン化され、よって、カチオン性脂質とアニオン性核酸との間に静電結合を形成し、２）脂質は、主に水性緩衝液中で不溶性になり、ｍＲＮＡをカプセル化する。ＰＢＳを含有する最終ウェル中のｐＨは、典型的には、酢酸、ＰＢＳ、及びイオン化可能な脂質の混合物のために６～６．５であり、これらの全ては、ある特定の緩衝能及び初期ｐＨを有する緩衝液である。
いくつかの実施形態では、ｎａＬＮＰは、ＰＢＳに対して透析して、ｐＨを約７．４に上昇させ、エタノールを除去する。ＬＮＰ組み立ては、６．５近くのＬＮＰ ｐＫａを有するイオン化可能な脂質が、徐々にｐＨ７．４に中和され、それによって可溶性が低下し、サイズを増加させ、水性電子ルーセントコアを主にイオン化可能な脂質及び核酸を含む電子高密度コアに変換させるＬＮＰの融合を引き起こすので、透析中に継続する。
投与される組成物中の本発明によって提供される脂質の総量は、一実施形態では、生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）１ｍｇ当たり約２～約１００ｍｇの脂質であり、別の実施形態では、生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）１ｍｇ当たり約５～約２５ｍｇの脂質であり、別の実施形態では、生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）１ｍｇ当たり約７～約２５ｍｇの脂質であり、一実施形態では、生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）１ｍｇ当たり約１０～約２０ｍｇの脂質である。
薬学的組成物及び方法
本発明のＬＮＰは、治療剤または予防剤を細胞に、インビトロまたはインビボで送達するために使用され得る。特定の実施形態では、治療剤は、本発明の核酸－脂質粒子を使用して細胞に送達される、核酸である。方法及び組成物は、そのような治療から利益を得るであろう任意の疾患または障害の治療のための任意の好適な治療剤の送達のために容易に適合され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞への導入のための好ましい核酸は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプラスミド、アンチセンス、及びリボザイムである。これらの方法は、本発明の粒子または組成物を細胞内送達が起こるのに十分な期間にわたって細胞と接触させることによって実施され得る。
本発明での使用のための核酸は、任意の利用可能な技法に従って調製され得る。ｍＲＮＡについて、調製の主要な方法論は、限定されないが、酵素合成（インビボ転写とも呼ばれる）であり、これは現在、長い配列特異的ｍＲＮＡを生成するための最も効率的な方法を表す。インビトロ転写は、目的の遺伝子をコードする下流配列に結合した上流バクテリオファージプロモーター配列（例えば、限定されないが、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６コリファージ由来のものを含む）から構成される操作されたＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ分子のテンプレート指向性合成のプロセスを説明する。テンプレートＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ及びポリメラーゼ連鎖反応増幅を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知である適切な技法での、いくつかの供給源からのインビトロ転写のために調製することができる（Ｌｉｎｐｉｎｓｅｌ，Ｊ．Ｌ ａｎｄ Ｃｏｎｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｂｏｗｍａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ａｚｉｚｉ，Ｂ．，Ｌｅｎｚ，Ｔ．Ｋ．，Ｒａｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ｄ．ｉｎ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖ．９４１ Ｃｏｎｎ Ｇ．Ｌ．（ｅｄ），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）
ＲＮＡの転写は、対応するＲＮＡポリメラーゼ及びアデノシン、グアノシン、ウリジン及びシチジンリボヌクレオシド三リン酸塩（ｒＮＴＰ）の存在下で直鎖化ＤＮＡテンプレートを使用して、ポリメラーゼ活性を補助する条件下、得られるｍＲＮＡ転写物の潜在的な分解を最小限に抑えながら、インビトロで生じる。インビトロ転写は、これらに限定されないが、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、様々な市販のキットを使用して、ＲＮＡポリメラーゼ及びｒＮＴＰを含む市販の試薬で行うことができる。ｍＲＮＡのインビトロ転写のための方法論は、当該技術分野で周知である（例えば、それらの全てが参照によって本明細書に組み込まれる、Ｌｏｓｉｃｋ，Ｒ．，１９７２，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖ．４１ ４０９－４６、Ｋａｍａｋａｋａ，Ｒ．Ｔ．ａｎｄ Ｋｒａｕｓ，Ｗ．Ｌ．２００１．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２：１１．６：１１．６．１－１１．６．１７、Ｂｅｃｋｅｒｔ，Ｂ．Ａｎｄ Ｍａｓｑｕｉｄａ，Ｂ．，（２０１０）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ＲＮＡ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ．７０３（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｅｄ），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１０、Ｂｒｕｎｅｌｌｅ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｒ．，２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ Ｆｉｖｅ－－Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｒ ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖ．５３０，１０１－１１４を参照されたい）。
次いで、所望のインビトロ転写ｍＲＮＡは、転写または関連する反応の望ましくない成分（組み込まれていないｒＮＴＰ、タンパク質酵素、塩、短ＲＮＡオリゴなどを含む）から精製される。ｍＲＮＡ転写物の単離のための技法は、当該技術分野において周知である。周知の手順としては、一価カチオンまたは塩化リチウムの存在下、いずれかのアルコール（エタノール、イソプロパノール）でのフェノール／クロロホルム抽出または沈殿が挙げられる。使用することができる精製手順の追加の、非限定的な例としては、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｌｕｋａｖｓｋｙ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｐｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．，２００４，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－ｆｒｅｅ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＲＮＡ ｖ．１０，８８９－８９３）、シリカベースの親和性クロマトグラフィー及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂｏｗｍａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ａｚｉｚｉ，Ｂ．，Ｌｅｎｚ，Ｔ．Ｋ．，Ｒａｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ｄ．ｉｎ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖ．９４１ Ｃｏｎｎ Ｇ．Ｌ．（ｅｄ），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）が挙げられる。精製は、これらに限定されないが、ＳＶ Ｔｏｔａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ）を含む、様々な市販のキットを使用して実施することができる。
さらに、逆転写は、大量のｍＲＮＡをもたらすことができるが、生成物は、望ましくないポリメラーゼ活性に関連する１つ以上の異常なＲＮＡ不純物を含有し得、これらは、全長ｍＲＮＡ調製物から除去する必要があり得る。これらには、転写開始失敗から生じる短ＲＮＡ、ならびにＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ活性によって生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＲＮＡテンプレートからのＲＮＡプライム転写、及び自己相補的３’伸長が含まれる。ｄｓＲＮＡ構造を有するこれらの汚染物質は、特定の核酸構造を認識し、強力な免疫応答を誘導するように機能する真核細胞における様々な先天性免疫センサとの相互作用を通して、望ましくない免疫刺激活性をもたらすことができることが実証されている。これはひいては、タンパク質合成が先天性細胞免疫応答中に低減するため、ｍＲＮＡ翻訳を劇的に低減することができる。したがって、これらのｄｓＲＮＡ汚染物質を除去する追加の技法が開発されており、これに限定されないが、スケーラブルなＨＰＬＣ精製を含み、当該技術分野で知られている（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，２０１１，Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ，ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍＲＮＡ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，ｖ．３９ ｅ１４２、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｐａｒｄｉ，Ｎ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，ａｎｄ Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，ＨＰＬＣ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ．９６９（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｈ．Ｅｄ），２０１３を参照されたい）。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡは、特に初代細胞において及びインビボではるかに高いレベルで翻訳されることが報告されている。
インビトロ転写されたｍＲＮＡの特定の特性を改変し、その有用性を改善するために使用される、かなりの種類の修飾が当該技術分野で説明されている。これらには、ｍＲＮＡの５’及び３’末端への修飾が含まれるが、これらに限定されない。内因性真核生物ｍＲＮＡは、典型的には、成熟分子の５’末端にキャップ構造を含有し、これは、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）の結合を媒介する際に重要な役割を果たし、これはひいては、細胞におけるｍＲＮＡ安定性及びｍＲＮＡ翻訳の効率を増強することに関与する。したがって、最も高いレベルのタンパク質発現は、キャップｍＲＮＡ転写物で達成される。５’－キャップは、５’－末端クレオチドとグアニンヌクレオチドとの間の５’－５’－三リン酸塩結合を含有する。共役グアニンヌクレオチドは、Ｎ７位でメチル化される。追加の修飾には、２’－ヒドロキシル基上の最後及び最後から２番目の末端５’－ヌクレオチドのメチル化が含まれる。
複数の異なるキャップ構造を使用して、インビトロで転写された合成ｍＲＮＡの５’キャップを生成することができる。合成ｍＲＮＡの５’キャッピングは、化学キャップ類似体と共転写的に行うことができる（すなわち、インビトロ転写中のキャッピング）。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、１つのグアニンがＮ７メチル基及び３’－Ｏ－メチル基を含有する５’－５’－三リン酸塩グアニン－グアニン結合を含有することができる。しかしながら、この共転写プロセス中、最大２０％の転写物はキャップされないままであり、合成キャップ類似体は、本物の細胞ｍＲＮＡの５’キャップ構造と同一ではなく、潜在的に翻訳可能性及び細胞安定性を低減する。代替的に、合成ｍＲＮＡ分子はまた、転写後に酵素的にキャップされ得る。これらは、構造的または機能的のいずれかで、キャップ結合タンパク質の増強された結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低減した感受性、及び／または低減した５’デキャッピングを有する内因性５’キャップをより密接に模倣する、より本物の５’キャップ構造を生成し得る。多数の合成５’キャップ類似体が開発されており、ｍＲＮＡ安定性及び翻訳可能性を向上させることが当該技術分野で知られている（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．，Ｓｕ，Ｗ．，Ｋｕｈｎ，Ａ．Ｎ．，Ｓｌｅｐｅｎｋｏｖ，Ｓ．Ｖ．，Ｄａｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｈｏａｄｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ．９６９（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｈ．Ｅｄ），２０１３を参照されたい）。
３’末端では、アデニンヌクレオチド（ポリ－Ａテール）の長鎖は、通常、ＲＮＡ処理中にｍＲＮＡ分子に付加される。転写の直後、転写物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルが遊離され、これにポリ－Ａポリメラーゼはポリアデニル化と呼ばれるプロセスでアデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの翻訳効率及び安定性の両方を向上させることが広く示されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｊ．，１９８９，Ｐｏｌｙ（Ａ），ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ Ｓｃｉ ｖ．１４ ３７３－３７７、Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｊ．Ａｎｄ Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇ．，２００１，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｇｅｎｅ，ｖ．２６５，１１－２３、Ｄｒｅｙｆｕｓ，Ｍ．Ａｎｄ Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｐ．，２００２，Ｔｈｅ ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ ｏｆ ｍＲＮＡｓ：Ｂｏｄｙｇｕａｒｄ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｅｌｌ，ｖ．１１１，６１１－６１３を参照されたい）。
インビトロ転写ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テーリングは、ポリ（Ｔ）トラクトのＤＮＡテンプレートへのクローニング、またはポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いた転写後付加を含むが、これらに限定されない、様々なアプローチを使用して達成することができる。前者の場合は、ポリ（Ｔ）トラクトのサイズに応じて、定義された長さのポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡのインビトロ転写を可能にするが、テンプレートの追加の操作を必要とする。後者の場合は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してインビトロ転写されたｍＲＮＡへのポリ（Ａ）テールの酵素的付加を伴い、これは、アデニン残基のＲＮＡの３’末端上への組み込みを触媒し、ＤＮＡテンプレートの追加の操作を必要としないが、不均一な長さのポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡをもたらす。５’キャッピング及び３’ポリ（Ａ）テーリングは、これらに限定されないが、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔａｉｌｉｎｇキット（ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ）、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット及びＰｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、様々な市販のキットを、市販の試薬、様々なＡＲＣＡキャップ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼなどとともに使用して行うことができる。
５’キャップ及び３’ポリアデニル化に加えて、インビトロ転写物の他の修飾は、翻訳の効率及び安定性に関連する利点を提供することが報告されている。病原性ＤＮＡ及びＲＮＡが、真核生物内の様々なセンサによって認識され、強力な先天性免疫応答を誘発し得ることは、当該技術分野で周知である。天然供給源からのほとんどの核酸が修飾されたヌクレオシドを含有するため、病原性と自己ＤＮＡ及びＲＮＡとを区別する能力は、少なくとも部分的に、構造及びヌクレオシド修飾に基づいていることが示されている。対照的に、インビトロ合成されたＲＮＡは、これらの修飾を欠き、よって免疫刺激性となり、ひいては上記のように効果的なｍＲＮＡ翻訳を阻害し得る。修飾されたヌクレオシドのインビトロ転写されたｍＲＮＡへの導入は、ＲＮＡセンサの認識及び活性化を防止するために使用することができ、よって、この望ましくない免疫刺激活性を緩和し、翻訳能力を増強する（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．Ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．２００７，Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＲＮＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ，ｖ．１０ ５２３－５３２、Ｐａｒｄｉ，Ｎ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ．９６９（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｈ．Ｅｄ），２０１３）、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｗｅｌｓｈ，Ｆ．Ａ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，２００８，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ Ｉｎｔｏ ｍＲＮＡ Ｙｉｅｌｄｓ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｖ．１６，１８３３－１８４０を参照されたい）。修飾されたＲＮＡの合成において使用される修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、当該技術分野で既知の一般的な方法及び手順を使用して、調製、モニター、及び利用することができる。インビトロ転写されたｍＲＮＡにある程度、単独で、または他の修飾されたヌクレオシドと組み合わせて組み込まれ得る、多種多様なヌクレオシド修飾が利用可能である（例えば、ＵＳ２０１２／０２５１６１８を参照されたい）。ヌクレオシド修飾されたｍＲＮＡのインビトロ合成は、付随的な増強された翻訳能力とともに免疫センサを活性化する低減した能力を有することが報告されている。
翻訳可能性及び安定性の観点で利益を提供するために修飾することができるｍＲＮＡの他の成分は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ＵＴＲの最適化（好ましい５’及び３’ＵＴＲは、細胞またはウイルスＲＮＡから得ることができる）は、両方ともまたは独立して、ｍＲＮＡ安定性及びインビトロ転写ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させることが示されている（例えば、Ｐａｒｄｉ，Ｎ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ．９６９（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｈ．Ｅｄ），２０１３を参照されたい）。
ｍＲＮＡに加えて、他の核酸ペイロードが、本発明のために使用され得る。オリゴヌクレオチドについて、調製の方法には、化学合成及び酵素的、より長い前駆体の化学的切断、上述のインビトロ転写などが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドを合成する方法は、広く使用され、当該技術分野で周知である（例えば、その両方が本明細書に参照によって組み込まれる、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４、及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照されたい）。
プラスミドＤＮＡについて、本発明での使用のための調製物は、一般に、目的のプラスミドを含有する細菌の液体培養物中でのプラスミドＤＮＡのインビトロでの増殖及び単離を利用するが、これらに限定されない。特定の抗生物質（ペニシリン、カナマイシンなど）に対する耐性をコードする目的のプラスミド中の遺伝子の存在は、目的のプラスミドを含有するそれらの細菌が抗生物質含有培養物において選択的増殖することを可能にする。プラスミドＤＮＡを単離する方法は、広く使用され、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈｅｉｌｉｇ，Ｊ．，Ｅｌｂｉｎｇ，Ｋ．Ｌ．ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，Ｒ（２００１）Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．４１：ＩＩ：１．７：１．７．１－１．７．１６、Ｒｏｚｋｏｖ，Ａ．，Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｇｉｌｌｓｔｒｏｍ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｎｅｓｔｅｄｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｒ．（２００８），Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９９：５５７－５６６、及びＵＳ６１９７５５３Ｂ１を参照されたい）。プラスミド単離は、これらに限定されないが、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＧｅｎＪＥＴ ｐｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）、及びＰｕｒｅＹｉｅｌｄ ＭａｘｉＰｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キット、ならびに市販の試薬を使用して行うことができる。
典型的な適用は、周知の手順を使用して、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングするためにｓｉＲＮＡの細胞内送達を提供することを含む。代替的に、治療上有用なポリペプチドまたは遺伝子編集成分をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。この方法で、療法は、欠損または不在遺伝子生成物を供給することによって、遺伝子疾患のために提供される。本発明の方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施され得る。例えば、本発明の組成物はまた、当業者に既知の方法を使用して、核酸をインビボで細胞に送達するために使用することができる。
本発明の脂質粒子によるｓｉＲＮＡの送達及び遺伝子発現のサイレンシングにおけるその有効性は、以下に記載される。
インビボ投与について、薬学的組成物は、好ましくは、非経口（例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）投与される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される。他の投与経路には、局所（皮膚、眼、粘膜）、経口、肺、鼻腔内、舌下、直腸、及び膣が含まれる。
一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することができる核酸に関連する本発明のＬＮＰと細胞を接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を改変させることを指す。調節することは、増加させることもしくは増強することを意味することができ、または減少させることもしくは低減することを意味することができる。
関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の薬学的組成物を対象に提供することを含み、治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む、方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明の脂質粒子と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。代表的な薬学的に許容される担体または希釈剤としては、静脈内注射のための溶液（例えば、生理食塩水またはデキストロース）が挙げられる。組成物は、クリーム、軟膏、ゲル、懸濁液、またはエマルジョンの形態をとることができる。
本明細書で使用される場合、「治療」は、改善的、治癒的、及び予防的治療を含む。本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を必要とする、動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
「治療有効量」という用語は、標的化された疾患または状態を治療または改善するために必要な、本発明の化合物及び生物学的活性剤（例えば、治療用化合物）の量を指す。
「免疫学的に有効な量」という用語は、（例えば、病原体の文脈で）免疫原を認識する免疫応答を誘発するために必要な免疫原をコードする本発明の化合物及びＲＮＡの量を指す。「免疫原」という用語は、体内に導入されるとき免疫応答を誘発する任意の物質または生物を指す。「免疫原をコードするＲＮＡ」という語句は、細胞または生物に投与されるとき、そのようなＲＮＡのコドン配列に従ってポリペプチドに翻訳することができる、ポリヌクレオチド、例えば、メッセンジャーＲＮＡまたはレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を指す。
本明細書で使用される「増殖性疾患」は、当該技術分野で知られているように、制御されていない細胞増殖または複製を特徴とする任意の疾患、状態、形質、遺伝子型、または表現型を意味する。一実施形態では、増殖性疾患は、がんである。一実施形態では、増殖性疾患は、腫瘍である。一実施形態では、増殖性疾患は、これらに限定されないが、例えば、液性腫瘍、例えば、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、及び慢性リンパ球性白血病など；ならびに固形腫瘍、例えば、ＡＩＤＳ関連がん、例えば、カポジ肉腫；乳癌；骨癌；脳癌；頭頸部癌、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢癌、及び胆管癌、網膜癌、食道癌、胃腸癌、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌を含む。一実施形態では、増殖性疾患は、腫瘍血管形成に関連する血管新生、黄斑変性（例えば、湿潤／乾燥加齢関連黄斑変性）、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性を含む。一実施形態では、増殖性疾患は、再狭窄及び多嚢胞性腎臓疾患を含む。
本明細書で使用される「自己免疫疾患」とは、当該技術分野で知られているように、自己免疫を特徴とする任意の疾患、状態、形質、遺伝子型、または表現型を意味する。自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、糖尿病、ループス、強皮症、線維筋痛症、移植拒絶（例えば、同種移植拒絶の予防）、悪性貧血、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、重症筋無力症、エリテマトーデス、多発性硬化症、及びグレーブス病が挙げられるが、これらに限定されない。
「感染性疾患」とは、ウイルス、細菌、真菌、プリオン、または寄生虫などの、感染性因子に関連する任意の疾患、障害、または状態を意味する。本発明を使用して、感染性疾患を引き起こす病原体に対して能動的または受動的に免疫化することができる。そのような病原体の例を以下に示す。
「神経性疾患」とは、中枢または末梢神経系に影響を及ぼす任意の疾患、障害、または状態を意味する。神経性疾患には、例えば、アルツハイマー病、動脈瘤、脳損傷、手根管症候群、脳動脈瘤、慢性疼痛、クロイツフェルト－ヤコブ病、てんかん、ハンチントン病、髄膜炎、発作性障害、及び他の神経性疾患、障害、及び症候群を含む、末梢または中枢神経系のいずれかの疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
「呼吸器疾患」とは、気道に影響を及ぼす任意の疾患または状態を意味する。呼吸器疾患は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症または血管狭窄、及び肺気腫を含むが、これらに限定されない。
「心血管疾患」とは、心臓及び血管構造に影響を及ぼす疾患または状態を意味する。心血管疾患は、例えば、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈狭窄、末梢血管疾患、心筋梗塞（心臓発作）、不整脈、虚血、及びうっ血性心不全を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「眼疾患」とは、眼及び関連構造の任意の疾患、状態、形質、遺伝子型、または表現型を意味する。眼疾患は、例えば、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、格子状変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、黄斑変性（例えば、湿潤ＡＭＤまたは乾燥ＡＭＤなどの加齢関連黄斑変性）、トキソプラズマ症、網膜色素変性症、結膜裂傷、角膜裂傷、緑内障などを含むが、これらに限定されない。
「代謝性疾患」とは、代謝経路に影響を与える任意の疾患または状態を意味する。代謝性疾患は、遺伝性酵素異常（先天性代謝異常）による先天性、または内分泌器官の疾患もしくは肝臓などの代謝的に重要な器官の不全による後天性のいずれかである、異常代謝プロセスを引き起こし得る。一実施形態では、代謝性疾患は、肥満、インスリン抵抗性、及び糖尿病（例えば、Ｉ型及び／またはＩＩ型糖尿病）を含む。
「皮膚科的疾患」とは、皮膚、真皮、またはその中の任意の部分構造、例えば、毛髪、濾胞などの任意の疾患または状態を意味する。皮膚科的疾患、障害、状態、及び形質は、乾癬、異所性皮膚炎、皮膚癌、例えば、黒色腫及び基底細胞癌、脱毛、除毛、ならびに色素沈着の改変を含むことができる。
「聴覚疾患」とは、内耳、中耳、外耳、聴覚神経、及びその中の任意の部分構造などの、耳を含む、聴覚系の任意の疾患または状態を意味する。聴覚疾患、障害、状態、及び形質は、聴力喪失、難聴、耳鳴り、めまい、平衡障害、及び運動障害を含むことができる。
「再生疾患」とは、インビボまたはインビトロでの不十分な細胞または組織の生成または再生が、損傷の前もしくは後の適切な器官機能の確立もしくは回復を妨げ、創傷治癒もしくは潰瘍性病変の解消を妨げるかもしくは遅らせ、老化を加速し、または効果的な細胞ベースの療法を妨げる、任意の疾患または状態を意味する。「メッセンジャーリボ核酸」（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）という用語は、細胞質中のリボソームへの遺伝情報の伝達を媒介するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を指し、それはタンパク質合成のためのテンプレートとして機能する。それは、転写のプロセス中にＤＮＡテンプレートから合成される。Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標）．Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｌａｎｇｕａｇｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｕｐｄａｔｅｄ ｉｎ ２００９）．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
真核生物では、ｍＲＮＡは、細胞酵素ＲＮＡポリメラーゼによって染色体でインビボで転写される。インビボでの転写中または転写後、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、ｍＲＮＡの５’末端にインビボで添加される。５’キャップは、第１の転写ヌクレオチドに５’－５’－三リン酸塩結合を通して結合している末端７－メチルグアノシン残基である。加えて、ほとんどの真核ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の３’末端にポリアデニリル部分（「ポリ（Ａ）テール」）を有する。インビボでは、真核細胞は、ポリ（Ａ）テールを、転写後、多くの場合約２５０アデノシン残基（配列番号１２）の長さで付加する。よって、典型的な成熟真核ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡキャップヌクレオチドを有する５’末端で始まり、続いてヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、次いでタンパク質のコード配列である、ヌクレオチド塩基のＡＵＧ三重項である開始コドンで開始し、ヌクレオチド塩基のＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ三重項であり得る終止コドンで終わる、オープンリーディングフレーム、次いでヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及びポリアデノシンテールで終わる構造を有する。典型的な成熟真核ｍＲＮＡの特徴は、インビボで真核細胞において天然に作製されるが、同じまたは構造的及び機能的に同等の特徴は、分子生物学の方法を使用してインビトロで作製することができる。したがって、典型的な成熟真核ｍＲＮＡに類似した構造を有する任意のＲＮＡは、ｍＲＮＡとして機能することができ、「メッセンジャーリボ核酸」という用語の範囲内である。
ｍＲＮＡ分子は、一般に、本発明の脂質ナノ粒子にカプセル化することができるサイズのものである。ｍＲＮＡ分子のサイズは、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ種の同一性に応じて本質的に変動するが、ｍＲＮＡ分子の平均サイズは、５００～１０，０００塩基の平均ｍＲＮＡサイズである。
ＤＮＡは、異なるサイズを有する、少なくとも２つの形態で存在することができる。ＤＮＡの第１の形態は、染色体と呼ばれる非常に大きなサイズのポリマーである。染色体は、細胞におけるタンパク質の多くまたはほとんどの遺伝子情報を含有し、それによって細胞がＤＮＡ分子の複製を制御することができる情報も含有する。細菌細胞は、１つ以上の染色体を含有し得る。真核細胞は、通常、２つ以上の細胞染色体、各染色体を含有する。
ＤＮＡの第２の形態は、より短いサイズの形態である。第２の形態の多くのＤＮＡ分子は、本発明の脂質ナノ粒子にカプセル化することができるサイズのものである。これらのより短い形態のＤＮＡのいくつかは、タンパク質について有用にコードするサイズのものであり得る。これらの第２の、より短い、有用な形態のＤＮＡの例としては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。より詳細な説明については、Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい。
プラスミドは、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離され、これから独立して複製することができる小ＤＮＡ分子である。プラスミドは、一般的には、小環状、二本鎖ＤＮＡ分子としてインビボで存在する。天然では、プラスミドは、生物の生存に有益であり得るタンパク質（例えば、抗生物質耐性）に転写及び翻訳することができる遺伝子を担持する。天然では、プラスミドは、しばしば水平遺伝子導入によってある生物から別の生物に伝達することができる。人工または組換えプラスミドは、分子生物学で広く使用され、組換えＤＮＡ配列の複製及び宿主生物内での有用なタンパク質の発現を可能にする役割を果たす。プラスミドサイズは、約１から２５キロ塩基対を超えて変動することができる。組換えプラスミドは、本発明の脂質ナノ粒子にカプセル化することができるサイズを有するように組換え的に作製することができる。
分子生物学では、ベクターは、ある細胞から、またはインビトロでの生化学的反応から、別の細胞に遺伝子材料を人工的に運ぶためにビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子であり、ＤＮＡは、複製及び／または発現することができる。外来ＤＮＡを含有するベクターは、組換え体と呼ばれる。有用なベクターのタイプの中には、プラスミド及びウイルスベクターがある。標的細胞内へのベクターの挿入は、通常、細菌細胞では形質転換、真核細胞ではトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、多くの場合形質導入と呼ばれる。
ウイルスベクターは、一般に、非感染性にされたが、依然としてウイルスプロモーター及び導入遺伝子を含有し、よってウイルスプロモーターを通した導入遺伝子の翻訳を可能にする、修飾されたウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを担持する組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、挿入物の宿主ゲノムへの恒久的組み込み（一体化）のために設計されており、よって導入遺伝子を組み込んだ後、宿主ゲノムに明確な遺伝子マーカーを残す。ウイルスベクターは、本発明の脂質ナノ粒子にカプセル化することができるサイズを有するように組換え的に作製することができる。
本明細書で使用される「短干渉核酸」（ｓｉＮＡ）という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子サイレンシングを配列特異的な様式で媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方調節することができる任意の核酸分子を指す。これには、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、及び化学修飾短干渉核酸分子が含まれる。ｓｉＲＮＡは、動物及び植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであるＲＮＡ干渉に関与する。ｓｉＲＮＡは、サイレンシングされた遺伝子標的と相同であるか、またはそれに特異的な、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からのリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生成される。
「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）という用語は、ＲＮＡｉ剤を使用して、ＲＮＡｉ剤と同じか、または非常に類似した配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後、標的化遺伝子サイレンシング技法である。以下を参照されたい：Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９－１５２４、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４－４９８、及びＫｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５、Ｆｉｒｅ，ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９、Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８など。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティクスなどの、配列特異的ＲＮＡ干渉を説明するために使用される他の用語と同等である。例えば、本発明の脂質を含有する製剤は、転写後レベル及び／または転写前レベルの両方で遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングするために、ｓｉＮＡ分子と併せて使用することができる。非限定的な例では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介したＲＮＡ（コードまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断、またはあるいは、当該技術分野で既知の翻訳阻害から生じ得る。別の実施形態では、ｓｉＮＡによる遺伝子発現の調節は、例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６－２２２に報告されているような転写阻害から生じ得る。
「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、細胞または患者におけるＲＮＡ干渉機能または活性を下方調節（例えば、低減または阻害）することができる任意の分子である。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質成分、またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの核酸成分を含む、ＲＮＡｉ経路の任意の成分の機能との相互作用またはこれに干渉することによって、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を下方調節、低減、または阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤は、細胞または患者におけるＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ、またはＲＮＡｉ経路の任意の他の成分の機能と相互作用するか、またはこれに干渉するｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、または小分子であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することによって、ＲＮＡｉ阻害剤は、標的遺伝子の発現を調節（例えば、上方調節または下方調節）するために使用することができる。一実施形態では、ＲＮＡ阻害剤は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳阻害、転写サイレンシング、またはＲＩＳＣ媒介性切断を通した遺伝子発現の内因性下方調節または阻害に干渉すること（例えば、低減することまたは防止すること）によって、遺伝子発現を上方調節するために使用される。したがって、内因性抑制、サイレンシング、または遺伝子発現の阻害のメカニズムに干渉することによって、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、機能の喪失に起因する疾患または状態の治療のために遺伝子発現を上方調節するために使用することができる。「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、本明細書における様々な実施形態では、「ｓｉＮＡ」という用語と交換可能に使用される。
本明細書で使用される「酵素的核酸」という用語は、特定の遺伝子標的への基質結合領域において相補性を有し、また標的ＲＮＡを特異的に切断し、それによって標的ＲＮＡ分子を不活性化するように作用する酵素的活性を有する核酸分子を指す。相補性領域は、酵素的核酸分子の標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、よって切断を可能にする。１００％の相補性が好ましいが、５０～７５％ほどの低い相補性も本発明において有用であり得る（例えば、Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２－２０９６、Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５－３１を参照されたい）。核酸は、塩基、糖、及び／またはリン酸基で修飾することができる。酵素的核酸という用語は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム、またはＤＮＡ酵素などの句と交換可能に使用される。これらの用語の全ては、酵素的活性を有する核酸分子を説明する。酵素的核酸分子の主要な特徴は、標的核酸領域の１つ以上に相補的な特定の基質結合部位を有し、核酸切断及び／またはライゲーション活性を分子に付与するその基質結合部位内またはその周囲のヌクレオチド配列を有することである（例えば、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９８７，０７１号、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０を参照されたい）。本発明のリボザイム及び酵素的核酸分子は、例えば、当該技術分野及び本明細書の他の箇所に記載されるように、化学的に修飾することができる。
本明細書で使用される、「アンチセンス核酸」という用語は、ＲＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＤＮＡまたはＲＮＡ－ＰＮＡ（タンパク質核酸、Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用によって標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの活性を改変する非酵素的核酸分子を指す（総説については、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４及びＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成することができるか、または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはその等価物の使用を介して発現することができる。本発明のアンチセンス分子は、例えば、当該技術分野に記載されるように、化学的に修飾することができる。
本明細書で使用される「ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域」という用語は、標的ＲＮＡに結合して、細胞ＲＮａｓｅ Ｈ酵素によって認識される非共有結合複合体を形成することができる核酸分子の領域（一般に、４～２５ヌクレオチド長以上、好ましくは５～１１ヌクレオチド長）を指す（例えば、Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８４９，９０２号、Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，９８９，９１２号を参照されたい）。ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、核酸分子－標的ＲＮＡ複合体に結合し、標的ＲＮＡ配列を切断する。
本明細書で使用される「２－５Ａアンチセンスキメラ」という用語は、５’－リン酸化２’－５’－結合アデニル酸塩残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのキメラは、配列特異的な様式で標的ＲＮＡに結合し、細胞２－５Ａ依存的リボヌクレアーゼを活性化し、ひいては標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，５２２－５３３、Ｐｌａｙｅｒ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７８，５５－１１３）。２－５Ａアンチセンスキメラ分子は、例えば、当該技術分野に記載されるように、化学的に修飾することができる。
本明細書で使用される「三重鎖形成オリゴヌクレオチド」という用語は、配列特異的な様式で二本鎖ＤＮＡに結合して、三本鎖ヘリックスを形成することができるオリゴヌクレオチドを指す。そのような三重ヘリックス構造の形成は、標的化遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ－Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４、Ｆｏｘ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７，１７－３７、Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９，１８１－２０６）。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子は、例えば、当該技術分野に記載されるように、化学的に修飾することができる。
本明細書で使用される「デコイＲＮＡ」という用語は、所定のリガンドに優先的に結合するように設計されたＲＮＡ分子またはアプタマーを指す。そのような結合は、標的分子の阻害または活性化をもたらすことができる。デコイＲＮＡまたはアプタマーは、特定のリガンドの結合について天然に存在する結合標的と競合し得る。同様に、デコイＲＮＡは、受容体に結合し、エフェクター分子の結合を遮断するように設計することができるか、または目的の受容体に結合し、受容体との相互作用を防止するように設計することができる。本発明のデコイ分子は、例えば、当該技術分野に記載されるように、化学的に修飾することができる。
本明細書で使用される「一本鎖ＤＮＡ」（ｓｓＤＮＡ）という用語は、直鎖状一本鎖を含む天然に存在するか、または合成のデオキシリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＤＮＡは、センスまたはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）であり得る。
本明細書で使用される「アロザイム」という用語は、例えば、米国特許第５，８３４，１８６号、同第５，７４１，６７９号、同第５，５８９，３３２号、同第５，８７１，９１４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／２４９３１号、第ＷＯ００／２６２２６号、第ＷＯ９８／２７１０４号、及び第ＷＯ９９／２９８４２号を含む、アロステリック酵素核酸分子を指す。
本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチド組成物を意味し、ポリヌクレオチドは、細胞における標的分子によって通常認識される配列とは異なる配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が核酸に天然に結合しない場合、標的分子に結合する核酸分子であり得る。標的分子は、目的の任意の分子であり得る。本発明のアプタマー分子は、例えば、当該技術分野に記載されるように、化学的に修飾することができる。
ＩＩＩ．ＬＮＰ組成物の薬学的製剤
薬学的使用について、本発明のＬＮＰ組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経口、鼻腔内、直腸、膣、頬側、鼻咽頭、胃腸、または舌下投与を含む、経腸または非経口経路によって投与され得る。投与は、全身（例えば、ＩＶ）または局所（例えば、ＩＭ、ＳＣ、ＴＤ、鼻腔内、または局所）であり得る。局所投与は、例えば、カテーテル留置、植え込み、浸透圧ポンピング、直接注射、皮膚／経皮適用、ステント留置、点耳／眼液、または門脈投与を含み得る。提案された適応症の治療のための最も適切な剤形及び投与経路を選択するために、式（Ｉ）の化合物は、溶解度及び溶液安定性（ｐＨにわたる）、透過性などの、それらの生物薬学的特性について評価されるべきである。
本発明の組成物は、必ずしもではないが、一般に、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を伴った製剤として投与されるであろう。「賦形剤」という用語は、本発明の化合物（複数可）、他の脂質成分（複数可）、及び生物学的活性剤以外の任意の成分を含む。賦形剤は、製剤に機能的（例えば、薬物放出速度制御）及び／または非機能的（例えば、加工助剤または希釈剤）特徴のいずれかを付与し得る。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解度及び安定性に対する賦形剤の効果、ならびに剤形の性質などの因子に大きな程度依存するであろう。
典型的な薬学的に許容される賦形剤としては、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／またはグリシン、潤滑剤、例えば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、及び／またはポリエチレングリコール、結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン、崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、もしくは発泡性混合物、及び／または吸収剤、着色剤、香料、及び／または甘味剤が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ｎａＬＮＰは、凍結して保存され、使用前に解凍される。いくつかの実施形態では、それらは、最大２週間にわたって４℃で安定である。いくつかの実施形態では、それらは、注射時に残っている凍結用の様々な糖を含有する様々な凍結保存溶液中に存在する。
賦形剤は、緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）及び／または糖を任意選択的に含有し得る水溶液担体であり得る。
薬学的に許容される賦形剤の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０００，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）で入手可能である。
本発明の組成物は、経口的に投与され得る。経口投与は、化合物が胃腸管に入るように嚥下すること、及び／または化合物が口から直接血流に入る頬側、舌、もしくは舌下投与を含み得る。
本発明の組成物は、非経口的に投与することができる。本発明の化合物及び組成物は、血流、皮下組織、筋肉、または内臓に直接投与され得る。投与に好適な手段には、静脈内、動脈内、髄腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑膜内、及び皮下が含まれる。投与に好適なデバイスとしては、針（マイクロニードルを含む）注射器、無針注射器、及び注入技法が挙げられる。
非経口製剤は、典型的には、水性または油性溶液である。溶液が水性である場合、賦形剤、例えば、糖（グルコース、マンニトール、ソルビトールなどを含むが、これらに限定されない）、塩、炭水化物、及び緩衝剤（好ましくは３～９のｐＨまで）であるが、いくつかの用途について、それらは、無菌非水性溶液として、または無菌、パイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの好適なビヒクルと併せて使用される乾燥形態として、より好適に製剤化され得る。
非経口製剤としては、ポリエステル（すなわち、ポリ乳酸、ポリラクチド、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド、ポリカプロ－ラクトン、ポリヒドロキシ酪酸塩）、ポリオルトエステル、及びポリ無水物などの分解可能なポリマーに由来するインプラントが挙げられ得る。これらの製剤は、皮下組織、筋肉組織への外科的切開を介して、または特定の器官へ直接的に投与され得る。
例えば、凍結乾燥による、無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技法を使用して容易に達成され得る。
非経口溶液の調製において使用される化合物及び組成物の溶解度は、界面活性剤、ミセル構造、及びシクロデキストリンなどの共溶媒及び溶解度向上剤の組み込みなどの、適切な製剤化技法の使用によって増加され得る。
本発明の組成物は、典型的には乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、または混合成分粒子として、例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合して）、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、微細な霧を生成する電気流体力学を使用するアトマイザー）、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、１，１，１，２－テトラフルオロエタンもしくは１，１，１，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパンなどの、好適な推進剤の使用ありもしくはなしで、または点鼻液として、鼻腔内にまたは吸入によって投与することができる。鼻腔内使用のために、粉末は、生体接着剤、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンを含み得る。
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノール、または本発明の組成物の分散、可溶化、もしくは持続放出のための好適な代替剤、溶媒としての推進剤（複数可）、及び任意の界面活性剤、例えば、ソルビタントリオレエート、オレイン酸、もしくはオリゴ乳酸を含む、本発明の化合物（複数可）の溶液または懸濁液を含有する。
乾燥粉末または懸濁液製剤における使用前に、組成物は、吸入による送達に好適なサイズ（典型的には、５ミクロン未満）に微粒化される。これは、スパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって達成され得る。
吸入器または散布器における使用のための（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製された）カプセル、ブリスター、及びカートリッジは、本発明の化合物または組成物、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤、及びＩ－ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムなどの性能修飾剤の粉末混合物を含有するように製剤化され得る。ラクトースは、無水であり得るか、または一水和物の形態であり得、好ましくは後者である。他の好適な賦形剤としては、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース、及びトレハロースが挙げられる。
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、例えば、ＰＧＬＡを使用して、即時及び／または調節放出であるように製剤化され得る。調節放出製剤としては、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、及びプログラム化放出が挙げられる。
経皮適用のための好適な製剤は、治療有効量の本発明の化合物または組成物を、担体とともに含む。有利な担体としては、宿主の皮膚を通過するのを助ける吸収可能な薬理学的に許容される溶媒が挙げられる。特徴的には、経皮デバイスは、バッキング部材、任意選択的に担体とともに化合物を含有するリザーバ、任意選択的に、長期間かけて制御された所定の速度で、化合物を宿主の皮膚に送達するための速度制御バリア、及びデバイスを皮膚に固定する手段を含む、包帯の形態である。
本発明の脂質組成物は、非経口、静脈内、全身、局所、経口、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、吸入、または任意のそのような送達方法を含む、いくつかの方法のいずれかで投与される。一実施形態では、組成物は、非経口的に、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、リポソーム組成物は、静脈内注入によって、またはボーラス注射によって腹腔内に投与される。
本発明の脂質組成物は、対象への送達に好適な薬学的組成物として製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、多くの場合、１つ以上の緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストロース、またはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤をレシピエントの血液で等張性、低張性、または弱高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤、及び／または防腐剤をさらに含むであろう。代替的に、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化され得る。
本発明における使用に好適な製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。多くの場合、組成物は、水性担体などの、許容される担体に懸濁された脂質ナノ粒子の溶液を含む。
一実施形態では、本発明は、本発明の脂質組成物と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、薬学的組成物（すなわち、製剤）を提供する。別の実施形態では、少なくとも１つの他の脂質成分は、脂質組成物中に存在する。別の実施形態では、脂質組成物は、リポソームの形態である。別の実施形態では、脂質組成物は、脂質ナノ粒子の形態である。別の実施形態では、脂質組成物は、肝臓への送達に適している。別の実施形態では、脂質組成物は、腫瘍への送達に適している。別の実施形態では、脂質組成物は、局所送達用途（眼、耳、皮膚、肺）、筋肉（ｉ．ｍ．）、脂肪、または皮下細胞（ｓ．ｃ．投与）への送達に適している。別の実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
免疫化目的のために、組成物は、一般に、注射可能なものとして調製され、注射によって（例えば、筋肉内注射によって）投与されるであろう。
本発明はまた、本発明の組成物を含有する送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、免疫化のために、対象、例えば、ヒトに薬学的組成物を投与するために使用することができる。
ＩＶ．薬学的組成物によって標的化された細胞及び器官
本発明の化合物、組成物、方法、及び使用は、生物学的活性剤を、患者において以下のうちの１つ以上に送達するために使用することができる：肝臓または肝臓細胞（例えば、肝細胞）、腎臓または腎臓細胞、腫瘍または腫瘍細胞、ＣＮＳまたはＣＮＳ細胞（中枢神経系、例えば、脳及び／または脊髄）、ＰＮＳまたはＰＮＳ細胞（末梢神経系）、肺または肺細胞、血管構造または血管細胞、皮膚または皮膚細胞（例えば、真皮細胞及び／または濾胞細胞）、眼または眼細胞（例えば、黄斑、中心窩、角膜、網膜）、及び耳または耳の細胞（例えば、内耳、中耳、及び／または外耳の細胞）。
本発明の化合物、組成物、方法、及び使用はまた、免疫系の細胞に生物学的活性剤（例えば、免疫原をコードするＲＮＡ）を送達するために使用することができる。
一実施形態では、本発明の化合物、組成物、方法、及び使用は、生物学的活性剤を肝臓細胞（例えば、肝細胞）に送達するためのものである。一実施形態では、本発明の化合物、組成物、方法、及び使用は、生物学的活性剤を腫瘍または腫瘍細胞（例えば、原発性腫瘍または転移性癌細胞）に送達するためのものである。別の実施形態では、化合物、組成物、方法、及び用途は、生物学的活性剤を皮膚脂肪、筋肉、及びリンパ節に送達するためのものである（すなわち、ｓｃ投与）。
肝臓または肝臓細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射、門脈注射、カテーテル留置、ステント留置）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の肝臓または肝臓細胞と接触させる。
腎臓または腎臓細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射、カテーテル留置、ステント留置）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の腎臓または腎臓細胞と接触させる。
腫瘍または腫瘍細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射、カテーテル留置、ステント留置）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の腫瘍または腫瘍細胞と接触させる。
ＣＮＳまたはＣＮＳ細胞（例えば、脳細胞及び／または脊髄細胞）への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射、カテーテル留置、ステント留置、浸透圧ポンプ投与（例えば、髄腔内または脳室））を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者のＣＮＳまたはＣＮＳ細胞（例えば、脳細胞及び／または脊髄細胞）と接触させる。
ＰＮＳまたはＰＮＳ細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者のＰＮＳまたはＰＮＳ細胞と接触させる。
肺または肺細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接肺組織及び細胞への肺投与）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の肺または肺細胞と接触させる。
血管構造または血管細胞への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、クランピング、カテーテル留置、ステント留置）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の血管構造または血管細胞と接触させる。
皮膚または皮膚細胞（例えば、真皮細胞及び／または濾胞細胞）への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接皮膚適用、イオントフォレシス）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の皮膚または皮膚細胞（例えば、真皮細胞及び／または濾胞細胞）と接触させる。
眼または眼細胞（例えば、黄斑、中心窩、角膜、網膜）への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射、眼内注射、眼球周囲注射、網膜下、イオントフォレシス、点眼液の使用、インプラント）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の眼または眼細胞（例えば、黄斑、中心窩、角膜、網膜）と接触させる。
耳または耳の細胞（例えば、内耳、中耳、及び／または外耳の細胞）への生物学的活性剤の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、送達を容易にするために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）または局所投与（例えば、直接注射）を介してなど、当該技術分野で一般に知られているように、患者の耳または耳の細胞（例えば、内耳、中耳、及び／または外耳の細胞）と接触させる。
免疫系の細胞（例えば、専門的な抗原提示細胞を含む、抗原提示細胞）への生物学的活性剤（例えば、免疫原をコードするＲＮＡ）の送達について、一実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内に送達され、その後、免疫細胞は、送達部位に浸潤し、送達されたＲＮＡを処理することができる。そのような免疫細胞は、マクロファージ（例えば、骨髄由来のマクロファージ）、樹状細胞（例えば、骨髄由来の形質細胞様樹状細胞及び／または骨髄由来の骨髄樹状細胞）、単球（例えば、ヒト末梢血単球）などを含むことができる（例えば、ＷＯ２０１２／００６３７２を参照されたい）。
Ｖ．本発明による免疫化
免疫化目的のために、いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原をコードするｍＲＮＡを送達することを包含する。免疫原は、免疫原を認識する免疫応答を誘発するので、病原体に対する、またはアレルゲンに対する、または腫瘍抗原に対する免疫を提供するために使用することができる。病原体によって引き起こされる疾患及び／または感染に対して免疫化することが好ましい。
ある特定の実施形態では、ｎａＬＮＰは、アジュバント特徴を有する。例えば、本明細書に開示されるｎａＬＮＰは、強力な抗体応答をもたらす特異的Ｔ濾胞ヘルパー細胞アジュバント活性を有することができる。非対称性のイオン化可能な脂質ＬＮＰは、タンパク質サブユニット抗原と送達されるとき、強力なＴｈ２バイアスアジュバントとして機能し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｎａＬＮＰ ｍＲＮＡワクチンは、Ｔｆｈ及び胚中心Ｂ細胞の増殖を刺激するＴｆｈバイアス応答、ならびに強力な長期生存中和抗体応答を駆動する。
ＲＮＡは、本発明の脂質組成物（例えば、ＬＮＰとして製剤化される）で送達される。いくつかの実施形態では、本発明は、免疫原をコードするＲＮＡがカプセル化されているリポソームを利用する。ＬＮＰ内でのカプセル化は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することができる。カプセル化効率は、１００％である必要はない。外部ＲＮＡ分子（例えば、リポソームの外側表面上）または「裸の」ＲＮＡ分子（ＬＮＰと会合していないＲＮＡ分子）の存在は、許容される。好ましくは、リポソーム及びＲＮＡ分子を含む組成物について、ＲＮＡ分子の少なくとも半分（例えば、ＲＮＡ分子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）は、ｎａＬＮＰにカプセル化される。
ＲＮＡ分子はまた、ＬＮＰと複合体化され得る。例えば、脂質が（水性コアを有する）リポソームのみを形成する必要はない。いくつかの脂質ナノ粒子は、脂質コアを含み得る（例えば、組成物は、脂質コアを有するリポソーム及びナノ粒子の混合物を含み得る）。そのような場合、ＲＮＡ分子は、水性コアを有するＬＮＰによってカプセル化され、非共有結合相互作用（例えば、負に荷電したＲＮＡとカチオン性脂質との間のイオン性相互作用）によって脂質コアを有するＬＮＰと複合体化され得る。ＬＮＰとのカプセル化及び複合体化（脂質とまたは水性コアとにかかわらず）は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することができる。カプセル化／複合体化効率は、１００％である必要はない。「裸の」ＲＮＡ分子（リポソームと会合していないＲＮＡ分子）の存在は、許容される。好ましくは、ＬＮＰの集団及びＲＮＡ分子の集団を含む組成物について、ＲＮＡ分子の集団の少なくとも半分（例えば、ＲＮＡ分子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）は、ＬＮＰにカプセル化されるか、ＬＮＰと複合体化されるかのいずれかである。
ＶＩ．薬学的組成物中のＲＮＡ分子
免疫化組成物のインビボ投与後、送達されたＲＮＡは、放出され、細胞内部で翻訳されて、免疫原をインサイチュで提供する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、プラス（「＋」）鎖であるため、逆転写などの介在する複製ステップを必要とせずに細胞によって翻訳することができる。それはまた、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７受容体に結合し、それによってアジュバント効果を開始し得る。追加的に、または代替的に、ＲＮＡは、ＲＩＧ Ｉ、ＭＤＡ５、またはＲＩＧ Ｉ及びＭＤＡ５などの他の受容体に結合し得る。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡである。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、いずれのタンパク質もなしでも脊椎動物細胞に送達されるとき、それ自体からの転写によって（それ自体から生成するアンチセンスコピーを介して）複数の娘ＲＮＡの生成をもたらすことができる。よって、ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、細胞への送達後に直接翻訳することができる（＋）鎖分子であり、この翻訳は、次いで、送達されたＲＮＡからアンチセンス及びセンス転写物の両方を生成するＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを提供する。よって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これらの娘ＲＮＡ、及び共線状サブゲノム転写物は、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供するためにそれら自体が翻訳され得るか、または免疫原のインサイチュ発現を提供するために翻訳される送達されたＲＮＡと同じ意味を有するさらなる転写物を提供するために転写され得る。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数の大幅な増幅であり、したがって、コードされた免疫原は、宿主細胞の主要なポリペプチド生成物となる。
自己複製を達成するための１つの好適なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの（＋）鎖状レプリコンは、細胞に送達した後に翻訳され、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ－トランスクリプターゼ）を与える。レプリカーゼは、（＋）鎖送達ＲＮＡのゲノム（－）鎖コピーを作製する複製複合体を提供するために自己切断するポリタンパク質として翻訳される。これらの（－）鎖転写物は、それら自体を転写して、＋鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与えることができ、また免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えることができる。よって、サブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による免疫原のインサイチュ発現をもたらす。好適なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキフォレストウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどからのレプリカーゼを使用することができる。変異体または野生型ウイルス配列を使用することができ、例えば、ＶＥＥＶの減弱されたＴＣ８３変異体がレプリコンにおいて使用されている。
よって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）免疫原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４のうちの１つ以上を含む、アルファウイルスレプリカーゼであり得る。
天然アルファウイルスゲノムは、非構造的レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするが、特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしない。よって、特定の自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらすことができるが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子がそれ自体を感染性形態で永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおける永続化に必要なアルファウイルス構造的タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡからは不在であり、それらの位置は、サブゲノム転写物が構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく免疫原をコードするように、目的の免疫原をコードする遺伝子（複数可）によって取られる。
よって、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し得る。１つのオープンリーディングフレームは、レプリカーゼ、例えば、第１の、（５’）オープンリーディングフレームをコードし、他のオープンリーディングフレームは、免疫原、例えば、第２の、（３’）オープンリーディングフレームをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、追加の（例えば、下流）オープンリーディングフレームを有して、例えば、さらなる免疫原をコードする（以下を参照されたい）か、またはアクセサリーポリペプチドをコードし得る。
自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼと適合性である５’配列を有することができる。
自己複製ＲＮＡ分子は、様々な長さを有することができるが、それらは、典型的には、５０００～２５０００ヌクレオチド長、例えば、８０００～１５０００ヌクレオチド、または９０００～１２０００ヌクレオチドである。よって、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたは従来のｍＲＮＡ送達で見られるよりも長い。いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、約２０００ヌクレオチドよりも大きく、例えば、約：９０００、１２０００、１５０００、１８０００、２１０００、２４０００、またはそれ以上のヌクレオチド長よりも大きい。
ＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を増強することができる。
本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップされたＲＮＡでは、これは、５’－５’架橋を介して７－メチルグアノシンに結合され得る。５’三リン酸塩は、ＲＩＧ－Ｉ結合を増強し、よって、アジュバント効果を促進することができる。
ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有し得る。それはまた、その３’末端近くにポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。
免疫化目的のために本発明で有用なＲＮＡ分子は、典型的には、一本鎖であろう。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼ、及び／またはＰＫＲに結合することによって、アジュバント効果を開始することができる。二本鎖形態で送達されるＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３に結合することができ、この受容体はまた、一本鎖ＲＮＡの複製中または一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって誘導することができる。
免疫化目的のためのＲＮＡ分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって便利に調製することができる。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態で作製及び増殖されるか、または（例えば、遺伝子合成及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作方法によって）合成的に作製された（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用することができる。例えば、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなど）を使用して、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写することができる。適切なキャッピング及びポリＡ付加反応は、必要に応じて使用することができる（ただし、レプリコンのポリＡは、通常、ＤＮＡテンプレート内でコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼは、転写された５’ヌクレオチド（複数可）についてストリンジェントな要件を有することができ、いくつかの実施形態では、これらの要件は、ＩＶＴ転写されたＲＮＡが、その自己コードされたレプリカーゼの基質として効率的に機能することができることを確実にするために、コードされたレプリカーゼの要件と一致しなければならない。
ＷＯ２０１１／００５７９９で論じられるように、自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）修飾核酸塩基を有する１つ以上のヌクレオチドを含むことができる。例えば、自己複製ＲＮＡは、シュードウリジン及び／または５メチルシトシン残基などの、１つ以上の修飾ピリミジン核酸塩基を含むことができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾核酸塩基を含まず、修飾ヌクレオチドを含まない場合があり、すなわち、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの全ては、標準Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵリボヌクレオチドである（７’メチルグアノシンを含み得る、任意の５’キャップ構造を除く）。他の実施形態では、ＲＮＡは、７’メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１、２、または３つの５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位でメチル化され得る。
免疫化目的で本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態では、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、及び／またはメチルホスホネート結合を含有することができる。
本発明は、複数の種のＲＮＡが、異なるクラスのＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせなど）を含む、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の種のＲＮＡなどの、本発明によって提供される脂質組成物と製剤化される実施形態を含む。
ＶＩＩ．免疫原
免疫化目的のために本発明で使用されるＲＮＡ分子は、いくつかの実施形態では、ポリペプチド免疫原をコードする。これらの実施形態では、投与後、ＲＮＡは、インビボで翻訳され、免疫原は、レシピエントにおいて免疫応答を誘発することができる。免疫原は、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫）に対する免疫応答を誘発し得るが、いくつかの実施形態では、アレルゲンまたは腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。免疫応答は、抗体応答（通常、ＩｇＧを含む）及び／または細胞媒介性免疫応答を含み得る。ポリペプチド免疫原は、典型的には、対応する病原体（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ミモトープとして機能して、糖を認識する免疫応答を誘発し得る。免疫原は、典型的には、表面ポリペプチド、例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などであろう。
ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原または複数のポリペプチドをコードすることができる。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示することができる。免疫原がｍＲＮＡから別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１つ以上は、上流ＩＲＥＳまたは追加のウイルスプロモーターエレメントが提供され得る。代替的に、複数の免疫原は、短い自己触媒プロテアーゼ（例えば、口蹄病ウイルス２Ａタンパク質）に融合した個々の免疫原をコードするポリタンパク質から、またはインテインとして発現され得る。
ある特定の実施形態では、ポリペプチド免疫原（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の免疫原）は、単独で、または自己複製ＲＮＡなどの、１つ以上の免疫原（ポリペプチド免疫原と同じであるか、または異なるかのいずれか）をコードする、ＲＮＡ分子と一緒にのいずれかで使用され得る。
いくつかの実施形態では、免疫原は、これらの細菌のうちの１つに対する免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原は、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、自己輸送体、毒素、鉄獲得タンパク質、及びＨ因子結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。３つの有用なポリペプチドの組み合わせは、Ｇｉｕｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（２９）：１０８３４－９に開示されている。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、ＷＯ２００９／０１６５１５に開示されている。これらは、限定されないが、ＲｒｇＢピルスサブユニット、ベータ－Ｎ－アセチル－ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＳＰ－７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／トレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、及びｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｄｈｅｓｉｎ ＰｓａＡを含む。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原は、ＷＯ０２／３４７７１及びＷＯ２００５／０３２５８２に開示されるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ．
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原は、これらに限定されないが、百日咳毒素またはトキソイド（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン、ならびに凝集原２及び３を含む。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原は、これらに限定されないが、ＷＯ２０１０／１１９３４３に開示されるポリペプチド、例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクローム結合タンパク質（ｓｔａ００６）、及び／またはｓｔａ０１１リポタンパク質を含む。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：典型的な免疫原は、破傷風トキソイドである。
Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：典型的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原は、ＷＯ２００６／１１０４１３及びＷＯ２００５／１１１０６６に開示されるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原は、ＷＯ０２／３４７７１に開示されるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原は、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡ、及びＭｕｒＧを含むが、これらに限定されない（例えば、ＷＯ２００５／００２６１９に開示される通り）。ＬｃｒＥ（ＷＯ２００６／１３８００４）及びＨｔｒＡ（ＷＯ２００９／１０９８６０）は、２つの好ましい免疫原である。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原は、ＷＯ０２／０２６０６に開示されるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原は、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、及び／またはウレアーゼを含むが、これらに限定されない（ＷＯ０３／０１８０５４）。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原は、これらに限定されないが、腸管毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）、及び／または腸管内出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原を含む。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）及び髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣ免疫原は、ＷＯ２００６／０９１５１７及びＷＯ２００８／０２０３３０に開示されている。有用なＭＮＥＣ免疫原は、ＷＯ２００６／０８９２６４に開示されている。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプのための有用な免疫原は、ＡｃｆＤ（ＷＯ２００９／１０４０９２）である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原は、ＷＯ２００７／０４９１５５及びＷＯ２００９／０３１０４３に開示されるものを含むが、これらに限定されない。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ、例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、Ｂ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
いくつかの実施形態では、免疫原は、これらのウイルスのうちの１つに対する免疫応答を誘発する。
オルトミクソウイルス：有用な免疫原は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはマトリックスＭ２タンパク質などの、インフルエンザＡ、Ｂ、またはＣウイルスに由来し得る。免疫原は、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、任意のサブタイプ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６に由来し得る。
パラミクソウイルス科ウイルス：免疫原は、これらに限定されないが、ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス）、メタニューモウイルス及びモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものを含む。
ポックスウイルス科：免疫原は、これらに限定されないが、Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ及びＶａｒｉｏｌａ ｍｉｎｏｒを含む、Ｖａｒｉｏｌａ ｖｅｒａなどの、オルトポックスウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
ピコルナウイルス：免疫原は、ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルス、及びアフトウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、１型、２型、及び／または３型ポリオウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、コクサッキーＡまたはＢウイルスである。
ブニヤウイルス：免疫原は、カリフォルニア脳炎ウイルスなどの、オルトブニヤウイルス、リフトバレー熱ウイルスなどの、フレボウイルス、またはクリミア－コンゴ出血熱ウイルスなどの、ナイロウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
ヘパルナウイルス：免疫原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
フィロウイルス：免疫原は、エボラウイルス（ザイール、コートジボワール、レストン、またはスーダンエボラウイルスを含む）またはマールブルグウイルスなどの、フィロウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
トガウイルス：免疫原は、トガウイルスに由来するもの、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスを含むが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。
フラビウイルス：免疫原は、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１、２、３、または４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスなどの、フラビウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
ペスチウイルス：免疫原は、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタ熱（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）などの、ペスチウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
ヘパドナウイルス：免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むことができる。
他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスからの免疫原を含むことができる。
ラブドウイルス：免疫原は、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）及びベシクロウイルス（ＶＳＶ）などの、ラブドウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
カリシウイルス科：免疫原は、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスなどの、カリシウイルス科に由来するものを含むが、これらに限定されない。
コロナウイルス：免疫原は、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳコロナウイルス、鳥類感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものを含むが、これらに限定されない。加えて、パンデミックの可能性を有するコウモリ及びセンザンコウコロナウイルスからの免疫原を使用することができる。コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドまたは他のウイルスタンパク質であり得る。特定のコロナウイルスエピトープは、参照によって本明細書に組み込まれるＳｈｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｅｐｔ．２９，２０２０に包括的に分析され、記載される。
レトロウイルス：免疫原は、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２）、またはスプマウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
レオウイルス：免疫原は、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
パルボウイルス：免疫原は、パルボウイルスＢ１９に由来するものを含むが、これらに限定されない。
ヘルペスウイルス：免疫原は、例としてのみ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１及び２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、及びヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などの、ヒトヘルペスウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。
パポバウイルス：免疫原は、パピローマウイルス及びポリオーマウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない。（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、または６５、例えば、血清型６、１１、１６、及び／または１８のうちの１つ以上からのものであり得る。
アデノウイルス：免疫原は、血清型３６（Ａｄ－３６）に由来するものを含む。
いくつかの実施形態では、免疫原は、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（タイセイヨウサケのピコルナ様ウイルスとしても知られる）、陸封サケウイルス（ＬＳＶ）、タイセイヨウサケロタウイルス（ＡＳＲ）、トラウトストロベリー病ウイルス（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）などの、魚類に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。
真菌免疫原は、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ、ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、及び／またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅを含む、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓに由来し得るか、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｓｐｐ．、Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉに由来し得、あまり一般的でないものは、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ ｓｐｐ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｎｏｓｅｍａ ｓｐｐ．、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａ ｓｐｐ Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ、Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐ．、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ、Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐである。
いくつかの実施形態では、免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属からの寄生虫、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅに対する免疫応答を誘発する。よって、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科からの寄生虫、特にＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ及びＣａｌｉｇｕｓ属からのもの、例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのフナムシに対する免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、免疫原は、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草、及び草花粉アレルゲン）、昆虫またはクモ類アレルゲン（吸入剤、唾液、及び毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリ、及びハエアレルゲン、膜翅目毒液アレルゲン）、獣毛及び頭垢アレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなど由来）、ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）に対する免疫応答を誘発する。樹木、草、及びハーブからの重要な花粉アレルゲンは、これらに限定されないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）及びオリーブ（Ｏｌｅａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含む、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓ、及びｐｌａｔａｎａｃｅａｅの分類目、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、及びＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含む、Ｐｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、及びＰａｒｉｅｔａｒｉａ属のハーブを含む、Ａｓｔｅｒａｌｅｓ及びＵｒｔｉｃａｌｅｓ目に由来する。他の重要な吸入アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ及びＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、貯蔵ダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ、及びＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ、ゴキブリ、ハエ、及びノミからのもの、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ、及びＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ、ならびにネコ、イヌ、及びウマなどの哺乳動物からのもの、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、及びアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含むＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類目からのものなどの刺咬昆虫に由来するものを含む、毒液アレルゲンである。
いくつかの実施形態では、免疫原は、（ａ）がん－精巣抗原、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、及びＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、及びＭＡＧＥ－１２（例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、及び膀胱腫瘍に対処するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（様々な固形腫瘍、例えば、結腸、肺、頭頸部癌に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌、及び結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ－８（例えば、頭頸部癌に関連する）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０１、ベータカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ－ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ－２７、及びＬＤＬＲ－ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＶＶＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、及び卵巣癌に関連する）、マンマグロビン、アルファ－フェトタンパク質（例えば、肝癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、膵臓癌及び胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ－１（例えば、乳癌及び卵巣癌に関連する）、Ｇ－２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳癌、結腸癌に関連する）、ならびに癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌、及び胃腸管の癌、例えば、結腸直腸癌）、（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫－メラニン細胞分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質－１／ＴＲＰ１、及びチロシナーゼ関連タンパク質２－／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関連する）、（ｅ）前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ２、例えば、前立腺癌に関連する、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、黒色腫及びＢ細胞リンパ腫に関連する）から選択される腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、これらに限定されないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｈ－Ｒａｓ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、ＴＳＰ－１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｍｎ－２３Ｈ１、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどを含む。
ＶＩＩＩ．ワクチン組成物
本発明の薬学的組成物、特に免疫化に有用なものは、１つ以上の小分子免疫増強剤を含み得る。例えば、組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０などの、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）、及び／またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のそのようなアゴニストは、理想的には、＜２０００Ｄａの分子量を有する。そのようなアゴニスト（複数可）は、いくつかの実施形態では、ＬＮＰ内にＲＮＡとカプセル化することができるか、またはＬＮＰとカプセル化もしくは複合体化することができるが、他の実施形態では、それらは、カプセル化されていないか、または複合体化されていない。いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば：モンタニドＩＳＡ－５１（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、ＱＳ－２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、オレイン酸、破傷風ヘルパーペプチド（これらに限定されないが、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２３７６）及び／またはＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２３７７）など）、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスサミド、ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、レバミソール、アジメゾン、イソプリニゾン、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、鉱物ゲル、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、核酸（これらに限定されないが、可溶性鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）ジニトロフェノール、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ、これらに限定されないが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／またはＴＬＲ９など）アゴニスト（これらに限定されないが、エンドトキシン、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、及び／またはポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ－ＩＣＬＣ／ＨＩＬＴＯＮＯＬ．ＲＴＭ．、Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、ＩＭＯ－２０５５、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）、ＱＳ－２１（シャボンノキまたはＳｏａｐｂａｒｋとしても知られる、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ樹木の幹からから抽出されたサポニン）、レシキモド（ＴＬＲ７／８アゴニスト）、ＣＤＸ－１４０１（ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原に結合した樹状細胞受容体ＤＥＣ－２０５について特異性を有する完全ヒトモノクローナル抗体からなる融合タンパク質）、；Ｊｕｖａｒｉｓのカチオン性脂質－ＤＮＡ複合体、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ、ならびにそれらの組み合わせである。一実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５９５に由来する異種モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を使用するアジュバントは、動物及びヒトワクチンにおける非相同タンパク質に対するＴｈ－１型免疫応答を誘導するために使用される。例示的なモノホスホリル脂質Ａ型アジュバントを以下に示す：
Figure 2023546175000033
本発明の薬学的組成物は、約または少なくとも１００、１５０、１７５、２００、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し得る。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、約２４０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
本発明の薬学的組成物は、チオメルサールまたは２フェノキシエタノールなどの１つ以上の防腐剤を含み得る。水銀を含まない組成物を作製することができ、防腐剤を含まないワクチンを調製することができる。
組成物は、免疫学的に有効な量の、本明細書に記載される脂質組成物（例えば、リポソーム及びＬＮＰ）、及び必要に応じて、任意の他の成分を含む。免疫学的に有効な量は、単回用量で、または一連の一部としてのいずれかで、個体に投与される量を指し、治療（例えば、病原体に対する予防的免疫応答）に有効である。この量は、治療される個体の健康及び身体的状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、医学的状況の治療医師の評価、ならびに他の関連する因子に応じて変動する。量は、ルーチン試験を通して決定することができる比較的広い範囲に該当することが予想される。本発明の組成物は、一般に、用量当たりのＲＮＡの量に関して表されるであろう。好ましい用量は、．ｌｔｏｒｅｑ．１００．ｍｕ．ｇ ＲＮＡ（例えば、１０～１００．ｍｕ．ｇ、例えば、約１０．ｍｕ．ｇ、２５．ｍｕ．ｇ、５０．ｍｕ．ｇ、７５．ｍｕ．ｇ、または１００．ｍｕ．ｇ）を有するが、発現は、はるかに低いレベル、例えば、．ｌｔｏｒｅｑ．１．ｍｕ．ｇ／用量、．ｌｔｏｒｅｑ．１００ｎｇ／用量、．ｌｔｏｒｅｑ．１０ｎｇ／用量、．ｌｔｏｒｅｑ．１ｎｇ／用量などで見ることができる。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含有する送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、組成物を脊椎動物対象に投与するために使用することができる。
治療の方法及び医学的使用
本明細書に記載されるＬＮＰ製剤化ＲＮＡ及び薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘導するためのインビボ使用のためのものである。
本発明は、有効量の、本明細書に記載される、リポソーム製剤化もしくはＬＮＰ製剤化ＲＮＡ、または薬学的組成物を投与することを含む、脊椎動物における免疫応答を誘導するための方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体及び／または細胞媒介性免疫を伴う。組成物は、プライミング及びブースティング目的の両方のために使用され得る。代替的に、プライム－ブースト免疫化スケジュールは、ＲＮＡ及び対応するポリペプチド抗原（例えば、ＲＮＡプライム、タンパク質ブースト）の混合物であり得る。
本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を誘導する際の使用のためのリポソーム、ＬＮＰ、または薬学的組成物を提供する。本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を誘導するための医薬品の製造におけるリポソーム、ＬＮＰ、または薬学的組成物の使用を提供する。
これらの使用及び方法によって脊椎動物における免疫応答を誘導することによって、脊椎動物は、上記で論じられるように、様々な疾患及び／または感染、例えば、細菌及び／またはウイルス性疾患に対して保護することができる。リポソーム、ＬＮＰ、及び組成物は、免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染を治療するため）のいずれかであり得るが、典型的には、予防的であろう。
脊椎動物は、好ましくは、ヒトまたは大型獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）などの哺乳動物である。本明細書で使用される場合、「大型哺乳動物」は、少なくとも５ｋｇ、好ましくは少なくとも７ｋｇの典型的または平均成体体重を有する哺乳動物を指す。そのような大型哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ブタ、ウシ、シカ、ヤギを含むことができ、マウス、ラット、モルモット、及び他のげっ歯類などの、小型哺乳動物を除外することが意図される。
ワクチンが予防的使用のためである場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児または乳児）またはティーンエージャーであり、ワクチンが治療的使用のためである場合、ヒトは、好ましくは、ティーンエージャーまたは成人である。小児を対象としたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
本発明に従って調製されたワクチンは、小児及び成人の両方を治療するために使用され得る。よって、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１～５歳、５～１５歳、１５～５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受けるための好ましい患者は、高齢者（例えば、．ｇｔｏｒｅｑ．５０歳、．ｇｔｏｒｅｑ．６０歳、及び好ましくは．ｇｔｏｒｅｑ．６５歳）、若齢者（例えば、．ｌｔｏｒｅｑ．５歳）、入院患者、医療従事者、軍関係者、妊婦、慢性疾患患者、または免疫不全患者である。しかしながら、ワクチンは、これらの群にのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に使用され得る。本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されるであろう。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、または組織の間質空間に）達成され得、舌内注射は、典型的には、免疫化目的には使用されない。代替的な送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、頬側、舌下、膣、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、眼、耳、肺、または他の粘膜投与が挙げられる。皮内及び筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は針（例えば、皮下針）を介し得るが、無針注射が代替的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
本発明は、全身及び／または粘膜免疫を誘導するために、好ましくは、増強された全身及び／または粘膜免疫を誘導するために使用され得る。
投与量は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュール及び／またはブースター免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量は、同じまたは異なる経路、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなどによって与えられ得る。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）で投与されるであろう。一実施形態では、世界保健機関の予防接種拡大計画（「ＥＰＩ」）で多くの場合使用されるように、複数回の用量は、出生後約６週間、１０週間、及び１４週間、例えば、６週間、１０週間、及び１４週間の年齢で投与され得る。代替の実施形態では、２回の一次用量は、約２ヶ月間隔、例えば、約７、８、または９週間間隔で投与され、続いて、第２の一次用量の約６ヶ月～１年後、例えば、第２の一次用量の約６、８、１０、または１２ヶ月後、１回以上のブースター用量が投与される。さらなる実施形態では、３回の一次用量は、約２ヶ月間隔、例えば、約７、８、または９週間間隔で投与され、続いて、第３の一次用量の約６ヶ月～１年後、例えば、第３の一次用量の約６、８、１０、または１２ヶ月後、１回以上のブースター用量が投与される。
以下の実施例は、例示的な実施形態を提供する。本開示及び当該技術分野の技術の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図しており、本明細書に開示される主題の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修飾、及び改変を用いることができることを理解するであろう。実施例１Ａ～３３Ｅの各々のデータ及び開示は、図１Ａ～３３Ｅに対応する。
実施例１：脂質の濃度を６から２７ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１４から０．５６ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－１０）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される６～２７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って６～２７ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して１ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１４～０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを、３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例２：脂質の濃度を６から２７ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１４から０．５６ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－１２）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される６～２７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って６～２７ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して１ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１４～０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを、３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例３：脂質の濃度を３から２７ｍＭに、ｍＲＮＡを０．０７から０．５６ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－１４）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される３～２７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って３～２７ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して１ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。１ｍｇ／ｍｌのＦｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．０７～０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを、３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ５０～２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。
実施例４：脂質の濃度を１２．５から５０ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２５から１ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－１６）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される１２．５～５０ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って１２．５～５０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２５～１ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析し、次いで、ＬＮＰを、３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ５０～２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。
実施例５：脂質の濃度を５０から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、ＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＬＮＰ－１４ Ｐａｒｔ ＩＩ）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５０～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得た。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。
Ａ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｂ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例６：脂質の濃度を５０から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－２５）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５０～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得た。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ２５～２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。
Figure 2023546175000034
実施例７：脂質の濃度を５０から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－２６）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５０～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得た。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ２５～２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。ここで、実施例６と比較して、これらのＬＮＰは１００ｍＭのＮａＯＡｃを使用して製剤化されたことに留意されたい。製剤中の酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を増加させることは、より高い緩衝能によってｐＨをより低く保ち、ＬＮＰの透析前のより低いｐＨをもたらす。
Figure 2023546175000035
実施例８：脂質の濃度を２．５から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを０．０５から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－２７）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成させる２．５～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って２．５～５０ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．０５～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ２００ｎｇの用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生存率試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を、予め温められたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）を読み取った。
Ｅ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。
Figure 2023546175000036
実施例９：脂質の濃度を５から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビボでのＬＮＰ送達効率を増加させる（Ｓｔｕｄｙ インビボ－３）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて総脂質濃度を５０ｍＭ（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って５～５０ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。２４μｌの脂質混合物及び４８μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定５上で混合し、７２μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の１４４μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。筋肉内投与のための５０μｌ中の５ｕｇのカプセル化ｍＲＮＡを注射するために、ＬＮＰを濃縮した。増加した混合濃度は、同じ用量での増加した送達効率をもたらし、混合中の濃度がＬＮＰ構造に影響を与え、それによって送達の効率に影響を与えることを示す。この所見は、ｍＲＮＡワクチンの商業的製造にとって重要である。
Ａ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｂ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｃ：ＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。５ｕｇのカプセル化ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、及び静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。イメージングは、４及び２０時間で行った。
実施例１０：イオン化可能な脂質の直接プロトン化及び水中のｍＲＮＡとの混合は、ｍＲＮＡをカプセル化する。ｐＨ４の酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液の濃度を増加させることは、ｍＲＮＡカプセル化を増加させる（Ｓｔｕｄｙ ＬＮＰ－６ Ｐａｒｔ ＩＩ）。
要約：ＬＮＰを、ＭＣ３／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される２７．７４ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。ＭＣ３ストックを、イオン化可能な脂質上のアミンのモルを計算し、ＨＣｌのモルの０％、５０％、１００％を加えることによって１ＭのＨＣｌを使用して０％、５０％、及び１００％の総アミンでプロトン化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して１ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、水、５、１０、２５、及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。結果は、緩衝液を含まない水中でｍＲＮＡと混合したＨＣｌを使用したイオン化可能な脂質の直接プロトン化が、ｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液中での混合と同様のレベルのｍＲＮＡカプセル化をもたらすことを示す。加えて、ｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液中で混合するとき、ｍＲＮＡカプセル化を最大化するために、２５ｍＭの酢酸ナトリウムの濃縮物が必要であった。最大カプセル化のこの基準は、緩衝液濃度及び混合条件を決定するために、全ての先行技術で使用されている。本発明は、緩衝液濃度がＬＮＰ力効力を最大化するために絶対混合濃度に加えて最適化される必要があるため、そのような手順がＬＮＰ効力を最大化しないことを示す。
Ａ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｂ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｃ：ｐＨ測定。測定は、透析の前に行った。
Figure 2023546175000037
実施例１１：脂質の濃度を５０から１５０ｍＭに、ｍＲＮＡを１から３ｍｇ／ｍｌに増加させることは、低濃度の酢酸ナトリウムでのＬＮＰ送達効率を増加させる。５０ｍＭを超えて酢酸ナトリウム濃度を増加させることは、インビトロで全ての濃度でのＬＮＰ効力を低減する（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－３２）。
要約：ＬＮＰを、ＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５０～１２０ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得た。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。１５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ７５／１５／５７．７５／２．２５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１５０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して４．４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５０、１００、及び１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液ｐＨ４中で１～３ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。増加した混合濃度は、５０ｍＭの最も低いＮａＯＡｃ濃度でのみ、同じ用量での増加した送達効率をもたらす。より高いＮａＯＡｃ濃度は、ＬＮＰ効力を低減し、より高い混合濃度ではより低減する。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前及び後に行った。
Figure 2023546175000038
実施例１２：脂質の濃度を１２．５から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２５から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、イオン化可能な脂質ＫＣ２、ＭＣ３、及びＢＯＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２／Ｃ４－ＰｉｐＺについてインビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。酢酸ナトリウム濃度を低下させることは、ｍＲＮＡカプセル化を低下させながらＬＮＰ効力を増加させることができる（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－３３）。
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能なもの（ＫＣ２／ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ）／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される１２．５及び７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って１２．５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２／ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して４．４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５、４３、及び６０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２５及び１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４を含有するウェル１（サイズグラフにおけるＷ１）中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した（サイズグラフにおけるＤ）。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＫＣ２、ＭＣ３、及びＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺイオン化可能な脂質は、ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺがそうでなかったのに対し、より高い濃度１．５ｍｇ／ｍｌ対より低い濃度０．２５ｍｇ／ｍｌで混合されるとき効力の大きな増加を示した。後者の脂質は、混合中により高度にプロトン化されるように、ＬＮＰ（約７．５）対最初の３（約６．５）においてはるかに高いｐＫａを有し、この脂質についてｐＨ及びプロトン化を含む理想的な混合条件が達成されなかったことを潜在的に示す。ＫＣ２、ＭＣ３、及びＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ ＬＮＰも、酢酸ナトリウム濃度が６０ｍＭから２５ｍＭに低減したとき効力を増加させ、ｍＲＮＡカプセル化を低減することができたが、ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺはいずれの効果も示さなかった。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前（ウェル１）及び後に行った。
Figure 2023546175000039
実施例１３：脂質の濃度を１２．５から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２５から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度で酢酸ナトリウム濃度をさらに最適化することは、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（Ｓｔｕｄｙ ＴＲＡＮＳ－３４）。
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能なもの（ＫＣ２／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ）／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される１２．５～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って１２．５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して４．４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５、１０、１２．５、２５、及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４、５、または６中で０．２５～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＬＮＰ効力は、より高い対より低い混合濃度で増加するが、酢酸ナトリウム濃度を調整することによって各濃度でさらに増加させることができる。例えば、１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡでは、ＬＮＰ効力は、酢酸ナトリウムを５０ｍＭから２５ｍＭに低減するときさらに４４％増加する。０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ濃度では、酢酸ナトリウム濃度を２５ｍＭから１０ｍＭに低減することは、効力を２．２倍に増加させる。混合濃度の増加及び緩衝液濃度の最適化された低減は、混合濃度を低下させ、緩衝液濃度を増加させることによってカプセル化が誤って最大化された従来技術において典型的に得られるよりも低い約７０％のカプセル化効率をもたらす。我々はまた、ｐＨを４から５に増加させることが、ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺの効力を増加させることを見出した。ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－ＰｉｐＺは、実施例１２で説明される理由のために異なって挙動した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：ｐＨ測定。測定は、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対する４時間にわたる透析の前（ウェル１）及び後に行った。
Figure 2023546175000040
実施例１４：脂質の濃度を５から１５０ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１から３ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす（ＴＲＡＮＳ－３５）
要約：ＬＮＰを、イオン化可能なＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５～１５０ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を達成し、次いで段階希釈を行って５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。１５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ７５／１５／５７．７５／２．２５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１５０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して４．４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１０、２０、２５、及び３７．５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１～３ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。ＬＮＰを最終的に、３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＬＮＰ効力は、より高い対より低い混合濃度で増加する。各混合濃度効力は、酢酸ナトリウム濃度を調整することによって最適化した。例えば、１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡでは、ＬＮＰ効力は、酢酸ナトリウムを５０ｍＭから２５ｍＭに低減するときさらに４４％増加する。０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ濃度で、酢酸ナトリウム濃度を２５ｍＭから１０ｍＭに低下させることは、効力を２．２倍に増加させる。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例１５：脂質の濃度を５から１５０ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１から３ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－３４／３５）
要約：ＬＮＰを、イオン化可能なＫＣ２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５～１５０ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を達成し、次いで段階希釈を行って５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。１５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ７５／１５／５７．７５／２．２５ｍＭ）を調製するために、ＫＣ２及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１５０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して４．４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１０、２０、２５、及び３７．５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１～３ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。ＬＮＰを最終的に、３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＬＮＰ効力は、より高い対より低い混合濃度で増加する。各混合濃度効力は、酢酸ナトリウム濃度を調整することによって最適化した。例えば、１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡでは、ＬＮＰ効力は、酢酸ナトリウムを５０ｍＭから２５ｍＭに低減するときさらに４４％増加する。０．２５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ濃度で、酢酸ナトリウム濃度を２５ｍＭから１０ｍＭに低下させることは、効力を２．２倍に増加させる。
Ａ．各ｍＲＮＡ濃度で最も高い効力のためのｐＨ４での酢酸ナトリウムの最適濃度
Figure 2023546175000041
Ｂ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｃ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｄ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例１６：脂質の濃度を５から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－３６）
要約：ＬＮＰを、イオン化可能なＭＣ３／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）から構成される５～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３７．５／７．５／２８．８８／１．１３ｍＭ）を調製するために、ＭＣ３及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ５０／１０／３８．５／１．５ｍＭ）を調製するために、ＭＣ３及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、４．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５～３５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。ＬＮＰを最終的に、３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＬＮＰ効力は、より高い対より低い混合濃度で増加する。各混合濃度効力は、酢酸ナトリウム濃度を調整することによって最適化した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例１７：脂質の濃度を５から１００ｍＭに、ｍＲＮＡを０．１から２ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－３７）
要約：ＬＮＰを、イオン化可能なＢＯＤＤ－Ｃ２／Ｃ４－ＰｉｐＺ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される５～１００ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて５０ｍＭの総脂質濃度（それぞれ２４／６．５／１８．５／１ｍＭ）を得、次いで段階希釈を行って５ｍＭに到達させた。７５ｍＭの総脂質濃度（それぞれ３６／９．７５／２７．７５／１．５ｍＭ）を調製するために、イオン化可能なもの及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて７５ｍＭに到達させた。１００ｍＭの総脂質濃度（それぞれ４８／１３／３７／２ｍＭ）を調製するために、イオン化可能なもの及びコレステロールをまず混合し、ＤＳＰＣ及びＰＥＧも同様にして両方の溶液をエタノールに可溶化した後、それらを組み合わせて１００ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、５～３０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．１～２ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。ＬＮＰを最終的に、３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。ＬＮＰ効力は、より高い対より低い混合濃度で増加する。各混合濃度効力は、酢酸ナトリウム濃度を調整することによって最適化した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例１８：脂質の濃度を１２．５から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２５から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－４１）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）から構成される１２．５～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７５ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１２．５ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２５～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例１９：脂質の濃度を１２．５から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２５から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－４３）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される１２．５～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７５ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１２．５ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２５～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例２０：脂質の濃度を１０から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２から１．５ｍｇ／ｍＬに増加させることは、インビボでのＬＮＰ送達効率を増加させる。任意の特定の混合濃度での酢酸ナトリウム濃度の最適化は、さらに増加したＬＮＰ効力をもたらす。（インビボ－７）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）から構成される１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７５ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｂ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｃ：ＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。０．５～５ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４及び２４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
実施例２１：脂質の濃度を１０ｍＭから７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２～１．５ｍｇ／ｍＬに増加させることは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原を送達するとき免疫原性を増加させる（インビボ８）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）から構成される１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７５ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化された２０１９－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ Ｓ－２Ｐ（Ｃｏｖｉｄ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：インビボ免疫原性エンドポイントＥＬＩＳＡ抗ＲＢＤ力価。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。以下にブースト前及びブースト後（３週間後）を示す。
Ｂ：擬似中和アッセイのインビボ免疫原性ＦＲＮＴ５０力価。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。以下にブースト前及びブースト後（３週間後）を示す。
実施例２２：脂質の濃度を１０から７５ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、独自のＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺが０．２５ｕｇを使用して１００％保護的であり、ＭＣ３標準参照が０．５ｕｇを使用して１００％保護的であるチャレンジモデルにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原（インビボ９）を送達するとき、致命的なチャレンジに対する保護を増加させる。
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）から構成される１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７５ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化された２０１９－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ Ｓ－２Ｐ（Ｃｏｖｉｄ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：ウイルスチャレンジに対するインビボ保護－チャレンジモデルにおける生存割合、重量、及び温度。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でブースト前及びブースト後（５週間後）にマウスに注射した。チャレンジは、５×１０４ＰＦＵのイタリア株で使用した。
Ｂ：チャレンジモデルにおけるインビボ重量及び温度。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でブースト前及びブースト後（５週間後）にマウスに注射した。チャレンジは、５×１０４ＰＦＵのイタリア株で使用した。
実施例２３：高濃度の脂質（７７ｍＭ）及びｍＲＮＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ）は、インビボで高いＬＮＰ送達効率をもたらす。（インビボ－１０）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｂ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｃ：ＩＭ及びＩＶ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）及び血管内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４及び２４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
実施例２４：急速マイクロ流体混合のために脂質の濃度を約１６から約２０ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでのＬＮＰ送達効率を増加させる。ＰＥＧ－ＤＭＧを、ＰＥＧ－ＤＭＡと比較して試験した。（ＴＲＡＮＳ－４７）
要約：ＬＮＰを、ＡＬＣ－０３１５イオン化可能なもの／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４６：９．４：４２．９：１．７ｍｏｌ％）から構成される約１２～約１２０ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化し、脂質の各１つを、透明な溶液が観察されるまでエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、約１２０ｍＭの総脂質濃度を得た。約１６ｍＭまでのより低い総脂質濃度についての異なるストックを独立して調製した。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を６で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例２５：急速マイクロ流体混合のために脂質の濃度を１０．２から７７ｍＭに、ｍＲＮＡを０．２から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、インビトロでＬＮＰ送達効率を増加させる。（ＴＲＡＮＳ－４９）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能な脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される１０．２～７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて７７ｍＭの総脂質濃度を得、次いで段階希釈を行って１０．２ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例２６：急速マイクロ流体混合のための高濃度の脂質（７７ｍＭ）及びｍＲＮＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ）は、インビトロで高いＬＮＰ送達効率をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－５２）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能なもの及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、０．８８ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例２７：急速マイクロ流体混合のために脂質の濃度を約１０から約７７ｍＭに、ｍＲＮＡの濃度を０．２から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、異なる酢酸ナトリウム濃度でインビトロでのＬＮＰ送達効率を示す。任意の緩衝液なしで水中のｍＲＮＡと混合する前にイオン化可能な脂質を直接プロトン化することは、ＩＭ及びＩＶ注射におけるインビボでの送達効率を改善した。（インビボ－１２ ｖ．２）
要約：ＢＯＤＤ Ｃ２／Ｃ４ ＰｉｐＺ（Ｃ２４ ＰｉｐＺ）ＬＮＰを、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）とともに７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を、組み合わせて７７ｍＭの総脂質濃度を得、約１０ｍＭまで希釈した。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。また、ｍＲＮＡを水で希釈し、脂質混合物を異なるレベル２００％～２５％でプロトン化して、後に上述の同じ条件で混合した。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５に対して６×１時間透析した。インビボ注射のために、ＬＮＰを－８０Ｃで凍結保存した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．１ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
Ｅ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、血管内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
実施例２８：急速マイクロ流体混合のための総脂質７４ｍＭ及びｍＲＮＡで１．５ｍｇ／ｍｌに混合したＬＮＰ／１８ＰＡは、ＩＶ注射後に低減した肝臓発現及び増加した脾臓発現を示す。（ＴＲＡＮＳ－５５）
要約：ＭＣ３を、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）で７４ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。脂質混合物を１８ＰＡ脂質と混合して、０％、１５％、及び３０％の総脂質とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５に対して６×１時間透析した。インビボ注射のために、ＬＮＰを－８０℃で凍結保存した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。しかしながら、アニオン性１８ＰＡの存在は、バックグラウンドシグナルを増加させる可能性が高い。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．１ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃のスクロース中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
Ｅ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるインビボ及びエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、血管内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
実施例２９：急速マイクロ流体混合のための０．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡと混合した約２５ｍＭの新しい脂質は、インビトロで高いＬＮＰ送達効率を示す。（ＴＲＡＮＳ－５９）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される約２５ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各１つをエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、約２５ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で０．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを、１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．１ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃のスクロース中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例３０：急速マイクロ流体混合のための総脂質濃度７７ｍＭ及びｍＲＮＡ濃度１．５ｍｇ／ｍｌでのＬＮＰの組み立ては、インビボでのＬＮＰ送達効率を示す。（インビボ－１１）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能な脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：ＩＭ投与における注射部位のインビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間で注射部位のライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
Ｂ：ＩＭ投与におけるエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
実施例３１：急速マイクロ流体混合のための総脂質濃度７７ｍＭ及びｍＲＮＡ濃度１．５ｍｇ／ｍｌでのＬＮＰの組み立ては、インビボでのＬＮＰ送達効率を示す。（インビボ－１３）
要約：ＬＮＰを、いくつかのイオン化可能な脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）から構成される７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５に対して６×１時間透析した。凍結されたＬＮＰを、インビボ注射のために－８０℃で保持した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ：ＩＭ投与における注射部位のインビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
Ｂ：ＩＭ投与におけるエクスビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。エクスビボについて、インビボイメージング直後に臓器を抽出し、イメージングした。
実施例３２：急速マイクロ流体混合における約７７ｍＭの脂質の濃度、及び１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡは、異なる酢酸ナトリウム濃度でインビトロでのＬＮＰ送達効率を示す。任意の緩衝液なしで水中のｍＲＮＡと混合する前にイオン化可能な脂質を直接プロトン化することは、インビトロでの改善された送達効率をもたらす（ＴＲＡＮＳ－５４ ｖ．１）。
要約：ＢＯＤＤ Ｃ２／Ｃ４ ＰｉｐＺ（Ｃ２４ ＰｉｐＺ）ＬＮＰを、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）とともに７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を組み合わせて、７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。また、ｍＲＮＡを水で希釈し、脂質混合物を異なるレベル２００％～２５％でプロトン化して、後に上述の同じ条件で混合した。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、０．８８ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
実施例３３：急速マイクロ流体混合のために脂質の濃度を約１０から約７７ｍＭに、ｍＲＮＡの濃度を０．２から１．５ｍｇ／ｍｌに増加させることは、異なる酢酸ナトリウム濃度でインビトロでのＬＮＰ送達効率を示す。任意の緩衝液なしで水中のｍＲＮＡと混合する前にイオン化可能な脂質を直接プロトン化することは、ＩＭ及びＩＶ注射におけるインビボでの改善された送達効率をもたらす。（ＴＲＡＮＳ－５４ ｖ．２／インビボ－１２ ｖ．１）
要約：ＢＯＤＤ Ｃ２／Ｃ４ ＰｉｐＺ（Ｃ２４ ＰｉｐＺ）ＬＮＰを、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）とともに７７ｍＭの総脂質濃度を使用して製剤化した。透明な溶液が観察されるまで、二重脂質ストック（イオン化可能なもの／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４つの脂質を、組み合わせて７７ｍＭの総脂質濃度を得、約１０ｍＭまで希釈した。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、共転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（最適化された３’及び５’ＵＴＲ、１０１ポリＡテールを含有する）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾ヌクレオシドを使用してインビトロ転写し、セルロース精製してｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、洗浄し、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するようにヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを、より高い濃度の溶液からより低い濃度への段階希釈で希釈して、１５～５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４中で１．５ｍｇ／ｍｌに到達させ、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における混合の前に、ＮＰ比を４で一定に保ち、これは、マイクロ流体混合技術を使用した製剤における高い再現性を可能にする。また、ｍＲＮＡを水で希釈し、脂質混合物を異なるレベル２００％～２５％でプロトン化して、後に上述の同じ条件で混合した。１６μｌの脂質混合物及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を、設定３上で混合し、４８μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中に排出した。次いで、形成されたＬＮＰを、追加の９６μｌの１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５に対して６×１時間透析した。インビボ注射のために、ＬＮＰを－８０℃で凍結保存した。次いで、ＬＮＰを３２ｕｌが２５～２００ｎｇを含有するように希釈し、１２ＫのＨＥＫ２９３細胞を同じ用量でトランスフェクトしたが、マイクロ流体ミキサーで異なる濃度で製造した。
Ａ．ｍＲＮＡ送達効率についてのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を室温に３０分間調整した後、ホタルルシフェラーゼアッセイを行った。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼ標準曲線を、５倍段階希釈で１０％ＥＭＥＭ中で調製した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌ～４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲の各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに陽性酵素活性対照（データは示されない）として含めて、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め少なくとも４時間室温に調整されたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、１：１の比で各トランスフェクトされていないウェル、トランスフェクトされたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルに添加した。アッセイプレートを暗所で３分間インキュベートし、直ちにＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に導入して、発光を読み取った。
Ｂ：ｍＲＮＡカプセル化効率についてのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１倍ＴＥ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液（１倍ＴＥ緩衝液中の２％ｖ／ｖ）を、ＬＮＰ当たり黒色マイクロプレートに２連で添加した。ＬＮＰを１倍ＤＰＢＳ ｐＨ７．４中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、１：１の比で各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに添加した。２つの標準曲線をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイに含め、一方はｍＲＮＡ及び１倍ＴＥ緩衝液を含有し、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ緩衝液を含有した。これらの標準曲線の各１つを使用して、各ＴＥ緩衝液またはＴｒｉｔｏｎ緩衝液の各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこのアプローチは、単一の標準曲線と比較して、カプセル化効率及びｍＲＮＡ濃度を計算するためにより正確である。希釈されたＬＮＰをプレートに加えた後、標準物をマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＬＮＰをＴｒｉｔｏｎで抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１倍ＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１：１の比で各ウェルに添加した。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）を読み取った。
Ｃ：ＬＮＰサイズの動的光散乱（赤色の点はＰＤＩ右ｙ軸である）。透析されたＬＮＰをスクロース緩衝液ｐＨ７．５で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移して、１．１ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１倍ＰＢＳ中での１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）における動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、２５℃に予め平衡化された１７３°の後方散乱検出角を使用して３０秒間２連で、各々５回の実行及び１０秒の実行時間で、測定間の遅延なしで行った。各測定は、自動減衰選択を備えた石英キュベットにおいて４．６５の固定位置を有した。データは、通常の解像度で汎用モデルを使用して分析した。
Ｄ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＭ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
Ｅ：１．５ｍｇ／ｍｌで混合されたＬＮＰのＩＶ投与におけるインビボホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを、血管内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。ルシフェリンを注射後４時間で腹腔内投与し、ルシフェラーゼ発現を４時間でライブ動物イメージングによってモニターした。ＲＯＩは、ＩＶＩＳシステムを使用して計算した。
本明細書に引用されている全ての特許、出願またはその他の参照文献（非特許文献及び基準配列情報など）に関しては、あらゆる目的のために、また、示されている陳述について、参照により、その全体が援用されることを理解されたい。本明細書に援用されている文書と本願との間にいずれかの矛盾がある場合には、本願が優先される。例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的アノテーション、対立遺伝子バリアント、ならびに参照ｍＲＮＡ（例えば、エクソン境界または応答エレメントを含む）及びタンパク質配列（保存されたドメイン構造など）、ならびに化学的参照（例えば、構造及びアッセイなどの、その中のアノテーションなどを含む、ＰｕｂＣｈｅｍ化合物、ＰｕｂＣｈｅｍ物質、またはＰｕｂＣｈｅｍバイオアッセイエントリ）を含む、ＧｅｎｅＩＤまたはアクセッション番号（典型的にはＮＣＢＩアクセッション番号を参照する）などの、本出願に開示される参照遺伝子配列に関連する全ての情報は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本願で用いられている見出しは、便宜上のものに過ぎず、本願の解釈には影響を及ぼさない。
本発明が提供する各態様の好ましい特徴は、本発明の他の全ての態様に準用可能であり、限定されることなく、従属クレームによって例示され、本発明の特定的な実施形態と態様（実施例を含む）の個々の特徴（例えば要素（数値範囲及び例示的な実施形態を含む））を組み合わせたものと入れ替えたものも含む。例えば、実施例に例示される特定の実験パラメータは、本発明から逸脱することなく、断片的に、特許請求される本発明における使用に適合させることができる。例えば、開示される材料について、これらの化合物の様々な個別的及び集合的組み合わせ及び順列の各々の具体的な言及は、明示的に開示されない場合があるが、各々は、本明細書において具体的に企図及び記載されている。したがって、要素Ａ、Ｂ及びＣの群と、要素Ｄ、Ｅ及びＦの群が開示されており、要素Ａ～Ｄを組み合わせた例が開示されている場合には、それぞれは、個別に示されていなくても、個別かつ集合的に想定されている。よって、この例では、Ａ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、及びＣ－Ｆの組み合わせの各々は、具体的に企図されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに例となる組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されているとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に企図され、開示されている。よって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、及びＣ－Ｅの部分群は、具体的に企図されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに例となる組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されているとみなされるべきである。この概念は、問題の組成物の要素及び組成物を作製または使用するための方法のステップを含む、本出願の全ての態様に適用される。
本明細書の教示に従って当業者によって認識されるように、本発明の前述の態様は、従来技術に対して新規であり、非自明である限り、任意の組み合わせまたは順列で特許請求することができ、よって、要素は、当業者に既知の１つ以上の参照文献に記載されている限り、とりわけ、特徴または特徴の組み合わせの否定的但し書きまたは免責によって、特許請求される本発明から除外され得る。

Claims (59)

  1. 核酸を含む脂質ナノ粒子（「ｎａＬＮＰ」）を作製するための方法であって、
    ａ．核酸濃度で少なくとも１つの核酸を含む核酸溶液を提供することと、
    ｂ．脂質濃度で少なくとも１つの脂質を含む脂質溶液を提供することと、
    ｃ．前記核酸溶液の一部分と前記脂質溶液の一部分とを組み合わせて、混合窒素－リン酸塩比及び脂質：核酸比を含む混合溶液を作製することと、
    ｄ．任意選択的に、最終混合溶液中のｐＨを生理学的ｐＨに調整して、ｐＨ調整された混合溶液を得ることと、
    ｅ．前記混合溶液から前記ｎａＬＮＰを得ることと、を含み、
    前記ｎａＬＮＰが、参照脂質ナノ粒子（「ｒｅｆＬＮＰ」）よりも大きな効力を有し、前記ｒｅｆＬＮＰが、前記少なくとも１つの脂質及び前記少なくとも１つの核酸を含み、かつ参照ＬＮＰ製造方法によって作製される、前記方法。
  2. 前記核酸溶液の前記部分及び前記脂質溶液の前記部分が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、及び７：１からなる群から選択される体積比で、ステップ（ｃ）において組み合わされる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｎａＬＮＰが、約４０～約１５０ナノメートルの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ｎａＬＮＰが、約５０～約１００ナノメートルの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ｎａＬＮＰが、約４０～約１００％の核酸カプセル化効率を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ｎａＬＮＰが、約５０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ｎａＬＮＰが、約６０％～約８５％の核酸カプセル化効率を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ｎａＬＮＰが、約６８％～約８３％の核酸カプセル化効率を有する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ｎａＬＮＰが、前記ｒｅｆＬＮＰよりも低い核酸カプセル化速度を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つの核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの核酸が、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの核酸が、免疫原をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  15. 前記核酸溶液が、緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 酸が、前記イオン化可能な脂質をプロトン化するために、前記脂質溶液に添加される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．２１～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  18. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．２３～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  19. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．２５～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  20. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．２８～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  21. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．２９～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．３０～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  23. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．４０～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  24. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．５０～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  25. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．６０～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  26. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約０．７０～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  27. 前記核酸濃度が、少なくともまたは約１～約３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  28. 前記脂質溶液が、メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン、及びトルエンからなる群から選択される有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
  29. 前記脂質溶液中の前記少なくとも１つの脂質が、ＭＣ３、ＫＣ２、ＤＬｉｎ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  30. 前記脂質溶液中の前記少なくとも１つの脂質が、ｐＫａを有するイオン化可能なカチオン性脂質である、請求項１に記載の方法。
  31. 前記混合溶液が、前記ｒｅｆＬＮＰ中の前記脂質の前記ｐＫａよりも約０～約２単位低いｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  32. 前記混合溶液が、前記ｒｅｆＬＮＰ中の前記脂質の前記ｐＫａよりも約０．５～約１．５単位低いｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  33. 前記混合溶液が、前記ｒｅｆＬＮＰ中の前記脂質の前記ｐＫａよりも約０．７５～約１．２５単位低いｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
  34. 前記脂質濃度が、少なくともまたは約１ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  35. 前記脂質濃度が、少なくともまたは約１０ｍＭ～約１５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  36. 前記脂質濃度が、少なくともまたは約５０ｍＭ～約１００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  37. 前記混合溶液窒素－リン酸塩比が、少なくともまたは約２～少なくともまたは約１０である、請求項１に記載の方法。
  38. 前記混合溶液脂質：核酸重量比が、少なくともまたは約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１５：１、１７：１、１８：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、または５０：１である、請求項１に記載の方法。
  39. 前記ｒｅｆＬＮＰが、０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度を使用して作製される、請求項１に記載の方法。
  40. 前記ｒｅｆＬＮＰが、１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度を使用して作製される、請求項１に記載の方法。
  41. 前記ｒｅｆＬＮＰが、０．２１ｍｇ／ｍｌ未満の参照核酸濃度及び１０．５ｍＭ未満の参照脂質濃度を使用して作製される、請求項１に記載の方法。
  42. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも約１．５倍高い、請求項１に記載の方法。
  43. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも約２倍高い、請求項１に記載の方法。
  44. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも約３倍高い、請求項１に記載の方法。
  45. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも約４倍高い、請求項１に記載の方法。
  46. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５倍高い、請求項１に記載の方法。
  47. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約６倍高い、請求項１に記載の方法。
  48. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約７倍高い、請求項１に記載の方法。
  49. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約８倍高い、請求項１に記載の方法。
  50. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約９倍高い、請求項１に記載の方法。
  51. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１０倍高い、請求項１に記載の方法。
  52. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１１倍高い、請求項１に記載の方法。
  53. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１２倍高い、請求項１に記載の方法。
  54. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１３倍高い、請求項１に記載の方法。
  55. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１４倍高い、請求項１に記載の方法。
  56. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約１５倍高い、請求項１に記載の方法。
  57. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２０倍高い、請求項１に記載の方法。
  58. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約２５倍高い、請求項１に記載の方法。
  59. 前記効力が、前記ｒｅｆＬＮＰよりも少なくともまたは約５０倍高い、請求項１に記載の方法。
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