TW202228725A - 脂質奈米顆粒製造方法及其衍生的組成物 - Google Patents

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麥克達羅 布施曼
米凱爾 佩基
蘇曼 亞利施堤
曼紐 卡拉斯科
穆罕默德加百列 阿拉梅赫
德魯 韋斯曼
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喬治梅森研究基金會
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Abstract

本文揭示經由某些新穎及意外地極好LNP製造技術來增加核酸負載脂質奈米顆粒(naLNP)之效力的方法。亦揭示含有根據本文描述之製造方法來製造之naLNP的醫藥組成物。本文揭示之方法克服與先前LNP製造技術相關之主要技術難題及高成本。因此，本文揭示之方法以出乎意料之方式極大地改善LNP之工業生產，由此提供用於核酸遞送之更有效naLNP。具體而言，本文揭示之本發明為展示由於在組裝期間脂質及mRNA之混合濃度增加而導致naLNP效力增加的方法。

Description

脂質奈米顆粒製造方法及其衍生的組成物
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年10月14日提交之美國臨時申請案第63/091,616號；2021年4月26日提交之美國臨時申請案第63/179,885號；2020年10月14日提交之美國臨時申請案第63/091,603號；及2021年4月26日提交之美國臨時申請案第63/179,872號之權益，該等申請案中之各者全部以引用方式併入本文中。
本發明屬於遞送醫藥核酸酬載之奈米顆粒製造領域。
將生物活性劑(包括治療相關化合物)遞送至受試者經常受到化合物到達靶細胞或組織之難題的阻礙。具體而言，將許多生物活性劑轉運至活細胞中在極大程度上受到細胞之複雜膜系統的限制。此等限制可導致與達成結果所需要之濃度相比，需要使用高得多濃度之生物活性劑，從而增加毒性作用及副作用之風險。此問題之一解決方案係利用允許選擇性進入細胞中之特異性載體分子及載體組成物。脂質載體、可生物降解聚合物及各種結合物系統可用於改良生物活性劑遞送至細胞。
尤其難以遞送至細胞之一種類別生物活性劑係生物治療劑(包括肽、蛋白、核苷、核苷酸、多核苷酸、核酸及衍生物，諸如mRNA、RNAi/siRNA、及自身複製RNA劑)。通常，核酸在細胞或體液中穩定僅有限的持續時間。尤其CRISPR/CAS9、RNA干擾、RNAi療法、mRNA療法、RNA藥物、反義療法、基因療法、及核酸疫苗(例如，RNA疫苗)之研發增加了對於將活性核酸劑引入細胞中之有效手段的需求。出於此等原因，可使基於核酸之劑穩定並且遞送至細胞中之組成物受到關注。
改良外來核酸傳送至細胞中之最充分研究方法涉及使用病毒載體或具有陽離子脂質之調配物。病毒載體可用於將基因有效地傳遞至一些細胞類型中，但是其通常不能用於將化學合成分子引入細胞中。
替代方法係使用併有陽離子脂質之遞送組成物，該等組成物在一個部分處與生物活性劑相互作用並且在另一個部分處與膜系統相互作用。視組成物及製備方法而定，此類組成物據報道可提供脂質體、膠束、脂質複合體、或脂質奈米顆粒(關於綜述，參見Felgner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 162-187; Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16; Gallas, 2013, Chem.Soc.Rev., 42, 7983-7997; Falsini, 2013, J. Med.Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中之參考文獻)。
自從在1965年由Bangham首次描述脂質體(J. Mol. Biol. 13, 238-252)以來，一直持續關注及努力開發用於遞送生物活性劑的基於脂質之載體系統(Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 36-48)。藉由使用帶正電荷脂質體將功能性核酸引入培養細胞中之方法首先由Philip Felgner等人Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 84, 7413-7417 (1987)描述。該方法後來由K. L. Brigham等人, Am. J. Med.Sci., 298, 278-281 (1989)在活體內證明。
最近，已開發脂質奈米顆粒調配物並且在活體外及活體內展示功效。(Falsini, 2013, J. Med.Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007; Zimmerman, 2006, Nature, 441, 111-114.; Jayaraman, 2012, Angew.Chem.Int. Ed., 51, 8529-8533。)脂質調配物為有吸引力的載體，因為其可保護生物分子免於降解，同時改良其細胞攝取。在各種類別之脂質調配物中，含有陽離子脂質之調配物通常用於遞送聚陰離子(例如核酸)。此類調配物可僅使用陽離子脂質來形成並且視情況包括其他脂質及兩親分子諸如磷脂醯乙醇胺。在此項技術中眾所周知脂質調配物之組成以及其製備方法均影響所得奈米顆粒或聚集物之結構及尺寸(Leung, 2012, J. Phys Chem.C, 116, 18440-18450)。
已開發配製含有遺傳藥物之LNP系統之各種方法。此等方法包括在乙醇存在下，將預成型LNP與核酸混合或將溶解於乙醇中之脂質與含有核酸之水性介質混合並且產生具有100 nm或更小之直徑及65-95%之核酸囊封效率的LNP。此等方法均依賴於存在陽離子脂質以便達成寡核苷酸(oligonucleotide；OGN)及聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)；PEG)之囊封，從而抑制聚集及形成更大結構。所產生之LNP系統之性質，包括尺寸及OGN囊封效率，對於各種調配參數諸如離子強度、脂質及乙醇濃度、pH、核酸濃度及混合比率係敏感的。通常，參數諸如在混合時之相對脂質及核酸濃度，以及混合比率很難使用當前調配程序來控制，從而導致在製劑內部以及在該等製劑之間，所產生之LNP之特性之變化。
在COVID-19疫苗中，若干疫苗係基於在脂質奈米顆粒(lipid nanoparticle；LNP)中遞送之mRNA編碼免疫原。此較高比例之mRNA疫苗歸因於其在動物模型中之快速實施及極好功效。在mRNA疫苗中，免疫原在通常使用免疫沉默核苷取代之mRNA序列中來編碼。除了核苷取代以外，mRNA設計經常涉及密碼子最佳化、UTR及聚腺苷酸尾設計、5’帽選擇、及純化以便移除雙鏈RNA污染物，該等污染物可活化先天免疫感測器以便抑制所遞送mRN之轉譯。
COVID-19 mRNA疫苗接種患者中之抗體效價高於康復期血清，同時中和效價與公開試驗中之康復期相當。在兩個試驗中存在CD4+及CD8+ T細胞反應並且不存在Th2組分，由於Th2反應在疫苗相關增強呼吸道疾病中之潛在作用，Th2組分係至關重要的。
然而，局部及全身不良事件係普遍的，並且在第二次疫苗接種之後，隨著嚴重程度增加而更頻繁。雖然沒有嚴重危及生命之不良事件，但是歸因於嚴重局部及全身不良事件，在一些試驗中，停止使用最高劑量。自身擴增mRNA LNP在較低劑量下有效，但是具有額外安全問題。
FDA準則建議3期試驗中之成功需要基於嚴重COVID-19疾病之端點，相比於安慰劑之50%保護。疫苗需要較廉價地製造以獲得大約150億個劑量並且供應全球大多數人。滿足此等3個標準之組合係極困難的。例如，提供50%保護持續1年，每年製造數十億個劑量並且全球人口可獲取並且願意接種疫苗。
若當前劑量在臨床試驗中成功，則增加之效力在保持功效的同時可減少劑量及不良反應，並且藉由減少成本並且增加製造能力來增加在全球進行疫苗接種之能力。或者，若當前劑量在臨床試驗中失敗，在此等相同劑量下之增加之效力可增加保護。因此，非常需要經由酬載mRNA表現、免疫原性、及經由控制LNP組裝來保護mRNA疫苗而增加效力。
儘管含有遺傳藥物之LNP系統之方法研發中之進步，仍然需要製備含有治療材料之脂質奈米顆粒，以及含有治療材料之經改良脂質奈米顆粒之方法。本發明試圖滿足此需要並且提供進一步相關優勢。
此概述列出目前揭示之標的物之多個實施例，並且在許多情況下列出此等實施例之變化及排列。此概述僅例示許多不同的實施例。提及給定實施例之一或多個代表性特徵同樣地為示例性的。此實施例可通常在具有或不具有所提及特徵的情況下存在；同樣地，彼等特徵可應用於目前揭示之標的物之其他實施例，不論是否在此概述中列出。為了避免過度重複，此概述不列出或暗示此類特徵之所有可能組合。
本發明之一態樣係關於製得包含核酸之脂質奈米顆粒(「lipid nanoparticle comprising a nucleic acid；naLNP」)的方法，提供包含一定核酸濃度下之至少一種核酸之核酸溶液；提供包含一定脂質濃度下之至少一種脂質的脂質溶液；並且將核酸溶液之一部分及脂質溶液之一部分組合以便建置包含混合氮-磷酸鹽比率及脂質:核酸比率的混合溶液；並且將混合溶液中之pH調整至生理pH以便獲得pH調整混合溶液；並且自pH調整混合溶液獲得naLNP；並且其中naLNP具有比參考脂質奈米顆粒(「reference lipid nanoparticle；refLNP」)更大之效力，其中refLNP包含至少一種脂質及至少一種核酸並且藉由參考LNP製造方法來製得。
在一個實施例中，核酸溶液之一部分及脂質溶液之一部分在步驟(c)中以選自由以下組成之群的體積比組合：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1及7:1。在另一實施例中，naLNP具有約40至約150奈米範圍內之平均直徑。在另一實施例中，naLNP具有約50至約100奈米範圍內之平均直徑。在仍然另一實施例中，naLNP具有約40至約100%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有約50%至約85%之核酸囊封效率。在另一實施例中，naLNP具有約60%至約85%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有約68%至約83%之核酸囊封效率。
在仍然另一實施例中，naLNP具有低於refLNP之較低核酸囊封率。在另一實施例中，至少一種核酸為DNA或RNA。在仍然另外的實施例中，至少一種核酸為RNA。在另一實施例中，至少一種核酸為mRNA。在另一實施例中，至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA。在仍然另一實施例中，至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA，該開放解讀碼組編碼免疫原。在另一實施例中，核酸溶液包含緩衝液。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.21至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.23至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.25至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.28至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.29至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.30至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.40至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.50至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.60至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.70至約3 mg/ml。在仍然另外的實施例中，核酸濃度為至少或約1至約3 mg/ml。
在仍然另一實施例中，脂質溶液包含選自由以下組成之群的有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、苯及甲苯。在另一實施例中，脂質溶液選自由以下組成之群：MC3、KC2、DLin、DODMA、DODAP、式I、式II、及其組合。在仍然另一實施例中，脂質溶液中之至少一種脂質選自由以下組成之群：MC3、KC2、DLin、DODMA、DODAP、及其組合。在仍然另一實施例中，脂質溶液中之至少一種脂質為具有pKa之陽離子脂質。在仍另一實施例中，脂質溶液中之至少一種脂質為具有pKa之可電離陽離子脂質。在仍然另一實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0至約2個pH單位的pH。在仍另一實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.5至約1.5個pH單位的pH。在仍然另外的實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.75至約1.25個pH單位的pH。在另一實施例中，脂質濃度為至少或約1 mM至約200 mM。在仍另一實施例中，脂質濃度為至少或約10 mM至約150 mM。在另一實施例中，脂質濃度為至少或約50 mM至約100 mM。在另一實施例中，混合溶液氮-磷酸鹽比率為至少或約2至至少或約10。
在仍另一實施例中，混合溶液脂質:核酸重量比為至少或約1:0、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、15:1、17:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1或50:1。在仍另一實施例中，refLNP使用小於0.21mg/ml之參考核酸濃度來產生。在另一實施例中，refLNP使用小於10.5 mM之參考脂質濃度來產生。在另一實施例中，ref LNP使用小於0.21mg/ml之參考核酸濃度及小於10.5mM之參考脂質濃度來產生。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高約1.5倍。
在另一實施例中，效力比refLNP高約2倍。在另一實施例中，效力比refLNP高約3倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高約4倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約5倍。在仍另一實施例中，效力比refLNP高至少或約6倍。在仍然另外的實施例中，效力比refLNP高至少或約7倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約8倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約9倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約10倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約11倍。在仍然另外的實施例中，效力比refLNP高至少或約12倍。在仍另一實施例中，效力比refLNP高至少或約13倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約14倍。在仍另一實施例中，效力比refLNP高至少或約15倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約20倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約25倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約50倍。
本發明之另一態樣係關於包含約、等於、或大於5.25 mM之濃度之至少一種可電離脂質；約、等於、或大於0.21 mg/ml之濃度之至少一種核酸的溶液；其中酸:脂質比率在約2至約10範圍內；並且帶有核酸之脂質奈米顆粒(「naLNP」)包含至少一種可電離脂質及至少一種核酸；其中生理pH下之naLNP具有大於以參考LNP製造方法用相同至少一種可電離脂質及相同至少一種核酸形成之參考脂質奈米顆粒(「refLNP」)的效力。
在本發明之此態樣之一個實施例中，naLNP具有約40至約150奈米範圍內之平均直徑。在另一實施例中，naLNP具有約50至約100奈米範圍內之平均直徑。在另一實施例中，naLNP具有約40至約90%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有約50%至約85%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有約60%至約85%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有約68%至約83%之核酸囊封效率。在仍然另一實施例中，naLNP具有低於refLNP之較低核酸囊封率。在仍然另一實施例中，至少一種核酸為DNA或RNA。在另一實施例中，至少一種核酸為RNA。在另一實施例中，至少一種核酸為mRNA。在仍然另一實施例中，至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA。在仍另一實施例中，至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA，該開放解讀碼組編碼免疫原。
在另一實施例中，核酸溶液包含緩衝液。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.21至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.23至約3 mg/ml。在仍然另外的實施例中，核酸濃度為至少或約0.25至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.28至約3 mg/ml。在仍另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.29至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.30至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.40至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.50至約3 mg/ml。在另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.60至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約0.70至約3 mg/ml。在仍然另一實施例中，核酸濃度為至少或約1至約3 mg/ml。
在另一實施例中，溶液包含選自由以下組成之群的有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、苯及甲苯。在本發明之此態樣之另一實施例中，至少一種脂質選自由以下組成之群：MC3、KC2、DLin、DODMA、DODAP、式I、式II、及其組合。在仍另一實施例中，至少一種脂質選自由以下組成之群：MC3、KC2、DLin、DODMA、DODAP、及其組合。在仍然另一實施例中，至少一種脂質為具有pKa之陽離子脂質。在仍另一實施例中，至少一種脂質為具有pKa之可電離陽離子脂質。在仍然另一實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0至約2個pH單位的pH。在仍另一實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.5至約0.5個pH單位的pH。在仍然另一實施例中，混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.75至約1.25個pH單位的pH。在仍另一實施例中，脂質濃度為至少或約1 mM至約200 mM。在仍然另一實施例中，脂質濃度為至少或約10 mM至約150 mM。在另一實施例中，脂質濃度為至少或約50 mM至約100 mM。在另一實施例中，混合溶液氮-磷酸鹽比率為至少或約2至至少或約10。在仍然另一實施例中，混合溶液脂質:核酸重量比為至少或約1:0、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、15:1、17:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1或50:1。
在仍然另一實施例中，refLNP使用小於0.21mg/ml之參考核酸濃度來產生。在另一實施例中，refLNP使用小於10.5 mM之參考脂質濃度來產生。在仍另一實施例中，refLNP使用小於10.5 mM之參考脂質濃度及小於0.21 mg/ml之參考核酸濃度來產生。在仍然另一實施例中，naLNP之效力比refLNP高約1.5倍。在另一實施例中，效力比refLNP高約2倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高約3倍。在另一實施例中，效力比refLNP高約4倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約5倍。在仍另一實施例中，效力比refLNP高至少或約6倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約7倍。在仍然另外的實施例中，效力比refLNP高至少或約8倍。在仍另一實施例中，效力比refLNP高至少或約9倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約10倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約11倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約12倍。在仍然另外的實施例中，效力比refLNP高至少或約13倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約14倍。在仍然另一實施例中，效力比refLNP高至少或約15倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約20倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約25倍。在另一實施例中，效力比refLNP高至少或約50倍。
本發明之另一態樣係關於包含根據如上所述方法產生之naLNP的醫藥組成物。在一個實施例中，醫藥組成物為疫苗。在另一實施例中，疫苗為預防性疫苗。在進一步實施例中，疫苗為治療性疫苗。在另一實施例中，疫苗用於治療或預防感染性疾病。在另一實施例中，疫苗用於治療或預防COVID-19。在另一實施例中，疫苗用於治療或預防冠狀病毒感染。在另一實施例中，組成物包含選自由以下組成之群之生物活性劑：肽、抗體、抗體片段、及小分子治療劑。
本文揭示經由某些新穎及意外地極好LNP製造技術來增加核酸負載脂質奈米顆粒之效力的方法。亦揭示含有根據本文描述之製造方法來製造之LNP的醫藥組成物。
本文揭示之方法克服與先前LNP製造技術相關之主要技術難題及高成本。因此，本文揭示之方法以出乎意料之方式極大地改善LNP之工業生產，由此提供用於核酸遞送之更有效LNP。
本文揭示之本發明之一實施例為展示由於在組裝期間脂質及mRNA之混合濃度增加而導致LNP效力增加的方法。
本文揭示之方法可適用於任何可電離脂質及核酸酬載。雖然不希望受任何特定作用機制束縛，但是咸信增加LNP效力經由增加內涵體釋放及隨後mRNA自可電離脂質上解離來介導。此外，以促進內涵體逸出及mRNA釋放之方式，混合濃度之差異、電荷狀態之改變、LNP組分之分佈或狀態導致超微結構及電離性質之變化(可電離脂質或膽固醇更接近於LNP周邊，可電離脂質-mRNA相互作用及內部結構改變，可用於內涵體質子化的更大比例之非質子化可電離脂質，多層、端面結構)。較佳地，與在相同劑量下以當前低濃度形成之LNP相比，藉由本文揭示之方法形成之遞送核酸之LNP，例如，遞送mRNA編碼免疫原之LNP為更有效的，例如，提供針對病毒攻擊之更大保護。
雖然咸信以下術語已得到一般技藝人士充分認識，但是列出以下定義以便有助於說明目前揭示標的物。
除非在下文另外定義，否則本文使用之所有技術及科學術語意欲具有與一般技藝人士通常理解相同的含義。提及本文使用之技術意指如在此項技術中通常理解之技術，包括熟習此項技術者顯而易知的彼等技術之變化或等效技術之取代。雖然咸信以下術語已得到一般技藝人士充分認識，但是列出以下定義以便有助於說明目前揭示標的物。因此，除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語及任何縮寫字具有與目前揭示標的物領域之一般技藝人士通常理解的相同含義。雖然與本文所述類似或等效的任何組成物、方法、套組、及傳達資訊之手段可用於實踐目前揭示標的物，但是本文描述特定組成物、方法、套組、及傳達資訊之手段。應瞭解本文所述類似或等效的任何組成物、方法、套組、及傳達資訊之手段僅為示例性的並且目前揭示標的物不意欲僅限於彼等實施例。
遵循長期存在的專利法慣例，用語「一」及「該」在用於本申請案，包括申請專利範圍中時，係指「一或多個(種)」。例如，在一些實施例中，片語「LNP」、「核酸」分別係指一或多個LNP或核苷酸。
應理解，對於本申請案中描述某個參數之所有數值邊界，諸如「約」、「至少」、「小於」、及「大於」，該描述亦必然地涵蓋由所述及之值界定之任何範圍。因此，舉例而言，描述「至少1、2、3、4、或5」亦尤其描述範圍1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、及4-5，等等。
如本文用於指可量測值諸如重量、時間、劑量(例如，治療劑量)等之量的術語「約」意欲涵蓋相比於規定量的在一些實施例中+/-20%、在一些實施例中+/-10%、在一些實施例中+/-5%、在一些實施例中+/-1%、在一些實施例中+/-0.1%、在一些實施例中+/-0.5%、及在一些實施例中+/-0.01%之變化，因為此類變化適合於執行所揭示方法。
如本文使用，術語「及/或」當用於實體清單之情形中時係指實體單獨或以全部可能組合及子組合存在。因此，例如，片語「A、B、C、及/或D」包括個別地A、B、C、及D，而且包括A、B、C、及D之任何及所有組合及子組合。應進一步瞭解，對於列出給定要素之多個可能選項的每一種情況(亦即，對於任何要素之視情況選用組分的所有「Markush組」及類似清單)，在一些實施例中視情況選用組分可單獨或以視情況選用組分之任何組合或子組合來存在。在此等形式之清單中隱含預見到每個組合及子組合並且完全僅僅出於方便，未列出每一個此組合或子組合。另外，應進一步瞭解所有陳述之「或」應理解為「及/或」，除非上下文明確要求所列出組分僅被視為兩者擇一的(例如，若組分在給定情形中為相互排斥的及/或不可彼此組合使用)。
I. 定義
術語「脂質」係指一組有機化合物，其為脂肪酸酯且特徵在於不溶於水，但可溶於許多有機溶劑。脂質通常劃分成至少三個類別：(1)「簡單脂質」，包括脂肪及油以及蠟；(2)「複合脂質」，包括磷脂及醣脂；及(3)「衍生脂質」諸如類固醇。
本文使用之術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係指顆粒包含藉由分子間力彼此實體上締合之複數個，亦即一個以上脂質分子。在一個實施例中，LNP帶有核酸酬載。LNP可具有一或多個不同類型之脂質。脂質奈米顆粒可為例如微球(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」--層狀相脂質雙層，在一些實施例中大致上為球形的，並且在更特定實施例中可包含水性核心，例如，包含實質性部分之RNA分子)、乳狀液中之分散相、懸浮液中之膠束或內相。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒具有約1至約2,500 nm、約10至約1,500 nm、約20至約1,000 nm，在一個實施例中約50至約600 nm，在一個子實施例中約50至約400 nm，在一個子實施例中約50至約250 nm，及在一個子實施例中約50至約150 nm之大小。除非另外指示，本文提及之所有大小為完全成形奈米顆粒之平均大小(直徑)，如藉由Malvern Zetasizer上之動態光散射來量測。將奈米顆粒樣品在磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline；PBS)中稀釋以使得計數率為大約200-400 kcts。資料呈現為藉由強度加權平均值之轉化獲得之數量加權平均值。數量加權平均值為較佳的，因為其最接近地對應於如藉由電子顯微術量測之顆粒之物理直徑。
如本文使用之「LNP脂質」係指形成LNP之個別脂質分子。在某些實施例中，LNP脂質為可電離陽離子脂質。
如本文使用，術語「陽離子脂質」係指一種脂質，當pH降低至低於存在於LNP中之脂質之可電離基團之pKa(亦即，與水性介質中之可電離脂質之pKa不同的LNP之脂質環境中之可電離脂質之pKa)時，該脂質為陽離子或變成陽離子(質子化)，但是在更高pH值下，逐漸更中性。在低於pKa之pH值下，脂質然後能夠與帶負電荷核酸(例如，寡核苷酸)締合。如本文使用，術語「陽離子脂質」包括在pH減少時呈現正電荷之兩性離子脂質。值得注意地，大多數輔助脂質諸如DSPC為兩性離子但是不為陽離子，因為其具有平衡任何陽離子電荷之磷酸鹽基團。
術語「陽離子脂質」亦係指在選擇性pH，諸如生理pH下帶有淨正電荷之許多脂質物質中之任一者。此類脂質包括但不限於N,N-二油醯基-N,N-二甲基氯化銨(N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride；DODAC)；N-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride；DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide；DDAB)；N-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride；DOTAP)；3-(N--(N’,N’-二甲胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(3-(N--(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol；DC-Chol)及N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide；DMRIE)。另外，可獲得可用於本發明中之許多市售陽離子脂質製劑。此等製劑包括，例如，LIPOFECTIN®(包含DOTMA及1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-3-phosphoethanolamine；DOPE)之市售陽離子脂質體，獲自GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.)；LIPOFECTAMINE®(包含N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲醯胺)乙基)-N,N-二甲基-銨三氟乙酸(N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N-(2-(sperminecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethy- lammonium trifluoroacetate；DOSPA)及(DOPE)之市售陽離子脂質體，獲自GIBCO/BRL)；及TRANSFECTAM®.(包含乙醇中之雙十八烷基醯胺基甘胺醯基羧基精胺(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine；DOGS)之市售陽離子脂質，獲自Promega Corp., Madison, Wis.)。以下脂質為陽離子的並且在低於生理pH時具有正電荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亞油醇氧基-N,N-二甲胺基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane；DLinDMA)、1,2-二亞油醇氧基-N,N-二甲胺基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane；DLenDMA)。
在一些實施例中，「LNP脂質」為MC3、DLin、及/或KC2，如下展示。該表突出在LNP(TNS pKa)中量測之可電離脂質之pKa相比於藉由商用軟體ACDLabs Percepta.斷定之水性介質中之pKa：
Figure 02_image001
在一些實施例中，本發明涵蓋作為由式I涵蓋之化合物的LNP脂質：
Figure 02_image003
式I
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、及R 10獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；其中w、x、y、及z中之各者獨立地為0-10之整數；其中各Q獨立地為選自O、NH、及S之原子；其中各m為0至8之整數；並且其中L 1及L 2中之各者獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在其他實施例中，本發明涵蓋作為由式II涵蓋之化合物的LNP脂質：
Figure 02_image005
式II
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則附接至S或O之R 1為電子對；其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、及R 10獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，其中x、y、及z中之各者獨立地為0-10之整數；其中G及Q各自獨立地為選自CH、O、N、及S之原子；
其中m及n中之各者為0-8之整數；並且其中L 1及L 2中之各者獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-C(=O)O-；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在另一實施例中，本發明涵蓋作為由式III涵蓋之化合物的LNP脂質：
Figure 02_image007
式III
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則附接至S或O之R 1為電子對；
其中各R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15、及R 16獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、x、y、及z中之各者獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S、或二硫鍵之原子；
其中各m為0-4之整數，較佳0、1、或2；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7)；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(CR 1R 2R 3)
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋作為由式IV涵蓋之化合物的LNP脂質：
Figure 02_image009
式IV
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則附接至S或O之R 1為電子對；
其中各R 5、R 6、R 5’、R 6’、R 5”、及R 6”、獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15、及R 16獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、y、及z中之各者獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S、或二硫鍵之原子；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在某些實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image011
。
在某些實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image013
。
在某些實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image015
。
在某些實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image017
。
在某些實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image019
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image021
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image021
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image023
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image025
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image027
。
在某些較佳實施例中，LNP脂質具有以下結構：
Figure 02_image029
。
在某些實施例中，LNP脂質選自下表2中之結構：
Figure 02_image031
表2
在另一實施例中，本發明涵蓋式V之本發明可電離脂質：
Figure 02_image033
式V
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則附接至S或O之R 1為電子對；
其中各R 3、R 4、R 13、及R 14獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 15、及R 16獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中w、x、y、及z中之各者獨立地為0-10之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S、或二硫鍵之原子；
其中各m為0-4之整數，較佳0、1、或2；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(CR 1R 2R 3)
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋式VI之本發明可電離脂質：
Figure 02_image035
式VI
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成環烷基或雜環烷基環，其中若Q為S或O，則附接至S或O之R 1為電子對；
其中各R 3、R 4、R 23及R 24獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基；
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 11、R 12、R 13、R 17、R 18、R 34、R 35、R 36獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、x、y、及z中之各者獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S、或二硫鍵之原子；
其中各m為0-4之整數，較佳0、1、或2；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 3為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 3為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 4為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烷基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22烯基。
在一個較佳實施例中，R 4為經取代或未經取代-C(=O)O-C 1-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，x為0。
在某些實施例中，x為1。
在某些實施例中，x為2。
在某些實施例中，x為3。
在某些實施例中，x為4。
在某些實施例中，x為5。
在某些實施例中，x為6。
在某些實施例中，x為7。
在某些實施例中，x為8。
在某些實施例中，x為9。
在某些實施例中，x為10。
在某些實施例中，x為11。
在某些實施例中，x為12。
在某些實施例中，x為13。
在某些實施例中，x為14。
在某些實施例中，x為15。
在某些實施例中，x為16。
在某些實施例中，x為17。
在某些實施例中，x為18。
在某些實施例中，x為19。
在某些實施例中，x為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O(CR 1R 2R 3)
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋式VII之本發明可電離脂質：
Figure 02_image037
式VII
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成3-7員雜環烷基或雜芳基環；
其中各R 5、R 6、R 5’、R 6’、R 5”、及R 6”獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15、及R 16獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、y、及z中之各者獨立地為0-20之整數；
其中各Q獨立地為選自O、NH、S、或二硫鍵之原子；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，Q為O。
在某些實施例中，Q為S。
在某些實施例中，Q為NH。
在某些實施例中，Q為二硫鍵。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
在另一實施例中，本發明涵蓋式VIII之本發明可電離脂質：
Figure 02_image039
式VIII
其中
R 1及R 2各自獨立地選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基或視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團；
R 3及R 4各自獨立地為視情況經取代之C 10-C 22烷基、視情況經取代之C 10-C 22烯基、視情況經取代之C 10-C 22炔基、或一起形成3-7員雜環烷基或雜芳基環；
X為OH，或NR 1R 2；並且
Z為0至5之整數。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image041
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image043
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image045
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image047
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image049
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image051
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image053
。
在某些實施例中，式VIII之可電離脂質選自由以下組成之群：
Figure 02_image055
。
在另一實施例中，本發明涵蓋式IX之本發明可電離脂質：
Figure 02_image057
式IX
其中各R 1及各R 2獨立地選自由以下組成之群：H、電子對、視情況經取代之C 1-C 12烷基、視情況經取代之C 2-C 12烯基、視情況經取代之C 2-C 12炔基、視情況經取代之C 3-C 6環烷基、視情況經取代之C 4-C 6雜環烷基、視情況經取代之C 4-C 6烷基環烷基、視情況經取代之C 4-C 6芳基、視情況經取代之C 3-C 6雜芳基、視情況經取代之C 4-C 8芳氧基、視情況經取代之C 7-C 10芳基烷基；視情況經取代之C 5-C 10雜芳基烷基基團、視情況經取代之胺；或R 1及R 2可一起形成3-7員雜環烷基或雜芳基環；
其中各R 5、R 6、R 5’、R 6’、R 5”、及R 6”獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中各R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 14、R 15、及R 16獨立地選自由以下組成之群：H、OH、鹵基、苯基、苄基、視情況經取代之C 1-C 22烷基、視情況經取代之C 2-C 22烯基、視情況經取代之C 2-C 22炔基，
其中u、v、w、y、及z中之各者獨立地為0-20之整數；
其中X為O、S、或N；並且
其中各L 1及L 2獨立地選自由以下組成之群：-C(=O)-；OC(=O)-；-OC(=O)O-；-C(=O)O-；-C(=O)O(CR 5R 6R 7) m；-NH-C(=O)-；-C(=O)NH-；-SO-；-SO 2-；-SO 3-；-NSO 2-；-SO 2N-；-NH((C 1-C 8)烷基)；-N((C 1-C 8)烷基) 2；-NH((C 6)芳基)；-N((C 6)芳基) 2；-NHC(=O)NH-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NH-；-NHC(=O)NR 1-；-NHC(=O)O-；-OC(=O)NR 1-；-C(=O)R 1-；-CO((C 1-C 8)烷基)；-CO((C 6)芳基)；-CO 2((C 1-C 8)烷基)；-CO 2((C 6)芳基)；-SO 2((C 1-C 8)烷基)；及-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，R 1為H。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 1為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，R 2為H。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22烯基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 2-C 22炔基
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6雜環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6烷基環烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 6芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 3-C 6雜芳基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 4-C 8芳氧基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 7-C 10芳基烷基。
在某些實施例中，R 2為經取代或未經取代C 5-C 10雜芳基烷基基團。
在某些實施例中，各R 5獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 5為H。
在某些實施例中，R 5為OH。
在某些實施例中，R 5為鹵基。
在某些實施例中，R 5為苯基。
在某些實施例中，R 5為苄基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 5為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，各R 6獨立地為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 6為H。
在某些實施例中，R 6為OH。
在某些實施例中，R 6為鹵基。
在某些實施例中，R 6為苯基。
在某些實施例中，R 6為苄基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 6為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 7為H。
在某些實施例中，R 7為OH。
在某些實施例中，R 7為鹵基。
在某些實施例中，R 7為苯基。
在某些實施例中，R 7為苄基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 7為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 8為H。
在某些實施例中，R 8為OH。
在某些實施例中，R 8為鹵基。
在某些實施例中，R 8為苯基。
在某些實施例中，R 8為苄基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 8為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 9為H。
在某些實施例中，R 9為OH。
在某些實施例中，R 9為鹵基。
在某些實施例中，R 9為苯基。
在某些實施例中，R 9為苄基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 9為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 10為H。
在某些實施例中，R 10為OH。
在某些實施例中，R 10為鹵基。
在某些實施例中，R 10為苯基。
在某些實施例中，R 10為苄基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 10為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H。
在某些實施例中，R 11為OH。
在某些實施例中，R 11為鹵基。
在某些實施例中，R 11為苯基。
在某些實施例中，R 11為苄基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 11為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 11為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 12為H。
在某些實施例中，R 12為OH。
在某些實施例中，R 12為鹵基。
在某些實施例中，R 12為苯基。
在某些實施例中，R 12為苄基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 12為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 13為H。
在某些實施例中，R 13為OH。
在某些實施例中，R 13為鹵基。
在某些實施例中，R 13為苯基。
在某些實施例中，R 13為苄基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 13為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 14為H。
在某些實施例中，R 14為OH。
在某些實施例中，R 14為鹵基。
在某些實施例中，R 14為苯基。
在某些實施例中，R 14為苄基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 14為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 15為H。
在某些實施例中，R 15為OH。
在某些實施例中，R 15為鹵基。
在某些實施例中，R 15為苯基。
在某些實施例中，R 15為苄基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 15為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H、OH、鹵基、苯基、苄基、經取代或未經取代C 1-C 22烷基、經取代或未經取代C 2-C 22烯基；或經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，R 16為H。
在某些實施例中，R 16為OH。
在某些實施例中，R 16為鹵基。
在某些實施例中，R 16為苯基。
在某些實施例中，R 16為苄基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代之C 1-C 22烷基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22烯基。
在某些實施例中，R 16為經取代或未經取代C 2-C 22炔基。
在某些實施例中，u為0。
在某些實施例中，u為1。
在某些實施例中，u為2。
在某些實施例中，u為3。
在某些實施例中，u為4。
在某些實施例中，u為5。
在某些實施例中，u為6。
在某些實施例中，u為7。
在某些實施例中，u為8。
在某些實施例中，u為9。
在某些實施例中，u為10。
在某些實施例中，u為11。
在某些實施例中，u為12。
在某些實施例中，u為13。
在某些實施例中，u為14。
在某些實施例中，u為15。
在某些實施例中，u為16。
在某些實施例中，u為17。
在某些實施例中，u為18。
在某些實施例中，u為19。
在某些實施例中，u為20。
在某些實施例中，v為0。
在某些實施例中，v為1。
在某些實施例中，v為2。
在某些實施例中，v為3。
在某些實施例中，v為4。
在某些實施例中，v為5。
在某些實施例中，v為6。
在某些實施例中，v為7。
在某些實施例中，v為8。
在某些實施例中，v為9。
在某些實施例中，v為10。
在某些實施例中，v為11。
在某些實施例中，v為12。
在某些實施例中，v為13。
在某些實施例中，v為14。
在某些實施例中，v為15。
在某些實施例中，v為16。
在某些實施例中，v為17。
在某些實施例中，v為18。
在某些實施例中，v為19。
在某些實施例中，v為20。
在某些實施例中，w為0。
在某些實施例中，w為1。
在某些實施例中，w為2。
在某些實施例中，w為3。
在某些實施例中，w為4。
在某些實施例中，w為5。
在某些實施例中，w為6。
在某些實施例中，w為7。
在某些實施例中，w為8。
在某些實施例中，w為9。
在某些實施例中，w為10。
在某些實施例中，w為11。
在某些實施例中，w為12。
在某些實施例中，w為13。
在某些實施例中，w為14。
在某些實施例中，w為15。
在某些實施例中，w為16。
在某些實施例中，w為17。
在某些實施例中，w為18。
在某些實施例中，w為19。
在某些實施例中，w為20。
在某些實施例中，y為0。
在某些實施例中，y為1。
在某些實施例中，y為2。
在某些實施例中，y為3。
在某些實施例中，y為4。
在某些實施例中，y為5。
在某些實施例中，y為6。
在某些實施例中，y為7。
在某些實施例中，y為8。
在某些實施例中，y為9。
在某些實施例中，y為10。
在某些實施例中，y為11。
在某些實施例中，y為12。
在某些實施例中，y為13。
在某些實施例中，y為14。
在某些實施例中，y為15。
在某些實施例中，y為16。
在某些實施例中，y為17。
在某些實施例中，y為18。
在某些實施例中，y為19。
在某些實施例中，y為20。
在某些實施例中，z為0。
在某些實施例中，z為1。
在某些實施例中，z為2。
在某些實施例中，z為3。
在某些實施例中，z為4。
在某些實施例中，z為5。
在某些實施例中，z為6。
在某些實施例中，z為7。
在某些實施例中，z為8。
在某些實施例中，z為9。
在某些實施例中，z為10。
在某些實施例中，z為11。
在某些實施例中，z為12。
在某些實施例中，z為13。
在某些實施例中，z為14。
在某些實施例中，z為15。
在某些實施例中，z為16。
在某些實施例中，z為17。
在某些實施例中，z為18。
在某些實施例中，z為19。
在某些實施例中，z為20。
在某些實施例中，L 1為一鍵。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 1為-SO-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2-。
在某些實施例中，L 1為OC(=O)。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 1為-SO 3-。
在某些實施例中，L 1為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 1為-SO 2N。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 1為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 1為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 1為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 1為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為一鍵。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-OC(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-NH-C(=O)-。
在某些實施例中，L 2為-SO-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2-。
在某些實施例中，L 2為OC(=O)。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)O-。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)NH-。
在某些實施例中，L 2為-SO 3-。
在某些實施例中，L 2為-NSO 2-。
在某些實施例中，L 2為-SO 2N。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 1-C 8)烷基) 2。
在某些實施例中，L 2為-NH((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-N((C 6)芳基) 2。
在某些實施例中，L 2為二側氧基吡咯啶-二酮。
在某些實施例中，L 2為-C(=O)R 1-。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，L 2為-CO 2(CR 1R 2R 3)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 1-C 22)烷基)。
在某些實施例中，L 2為-SO 2((C 6)芳基)。
在某些實施例中，Q為CH。
在某些實施例中，X為O。
在某些實施例中，X為S。
在某些實施例中，X為N。
在某些實施例中，m為0。
在某些實施例中，m為1。
在某些實施例中，m為2。
在某些實施例中，m為3。
在某些實施例中，m為4。
在某些實施例中，m為5。
在某些實施例中，m為6。
在某些實施例中，m為7。
在某些實施例中，m為8。
在某些實施例中，m為9。
在某些實施例中，m為10。
在某些實施例中，m為11。
在某些實施例中，m為12。
在某些實施例中，m為13。
在某些實施例中，m為14。
在某些實施例中，m為15。
在某些實施例中，m為16。
在某些實施例中，m為17。
在某些實施例中，m為18。
在某些實施例中，m為19。
在某些實施例中，m為20。
如本文使用之「naLNP」係指根據本文揭示之方法產生的帶有核酸酬載之脂質奈米顆粒。相對於參考LNP，naLNP具有顯著更大效力。
如本文使用之「參考LNP或refLNP」係指使用參考LNP製造方法以一或多個LNP脂質來形成之脂質奈米顆粒。在一個實施例中，參考LNP為包含核酸及4種脂質之50-100nm直徑LNP：具有胺基團之可電離脂質(50%)、兩性離子輔助脂質-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；DSPC)(10%)、膽固醇(38.5%)、及聚乙二醇化脂質-1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000；DMG-PEG2000)(1.5%)(圓括號中為莫耳比率)。親水性DMG-PEG形成LNP之外殼。
「參考LNP」由其藉由「參考LNP製造方法」來產生之事實來定義。
在一個實施例中，「參考製造方法」可概述如下： ● 核酸溶液：在一定濃度及一定pH下之緩衝液中，亦即在50mM檸檬酸pH 5或25mM乙酸鈉pH 4，或10-50mM檸檬酸pH 4中，製備小於0.20 mg/ml之一定參考核酸濃度之mRNA。 ● 脂質溶液：在對應於所需NP比率(5.67)及/或脂質/mRNA重量比(10:1至30:1)之一定參考脂質濃度下，在乙醇中製備脂質混合物 ● 組裝 refLNP ：將核酸溶液之部分及脂質溶液之部分組合，產生緩衝液中之單一混合溶液。 ●  將混合溶液中之refLNP滲析至生理pH。 ●  使用光散射來量測refLNP大小 ●  使用Ribogreen檢定來量測refLNP中之RNA囊封 ●  選擇具有＞70%之較高囊封及50-100nm之直徑的refLNP
如本文使用之「混合」較佳係指湍流混合(「T-混合」)、渦流混合(「V-混合」)、微流控混合、或兩者。參見例如美國公開案第20200306191號中描述之混合。
在一個實施例中，參考LNP製造方法為Hassett等人, Mol. Ther. - Nucleic Acids 2019, 15, 1–11中描述之方法。在另一實施例中，「參考製造方法」如美國申請案第20190032087號所描述。在一個實施例中，參考方法包括：(a)將包含第一溶劑中之治療劑(例如，核酸)之第一液流引入微通道中；其中微通道具有適合於使引入微通道中之一或多個液流流動的第一區域及將一或多個液流之內含物混合的第二區域；(b)將包含第二溶劑中之LNP形成材料(例如，參考LNP脂質)之第二液流引入微通道中以便提供在層流條件下流動之第一及第二液流，其中脂質顆粒形成材料包含可電離脂質，並且其中第一及第二溶劑為相同或不相同的；(c)流動一或多個第一串流及一或多個第二串流第一區微孔道第二區微孔道；及(d)將一或多個第一液流及一或多個第二液流之內含物在微通道之第二區域中混合以便提供包含具有囊封治療劑之脂質顆粒的第三液流。
第一及第二液流之內含物可藉由微流控通道中之混沌對流或藉由T-混合器中之奈米沉澱來混合。
在一個實施例中，將一或多個第一液流及一或多個第二液流之內含物混合包括改變一或多個第一液流及一或多個第二液流之濃度或相對混合速率。在上述實施例中，不同於已知方法，該方法不包括混合之後的稀釋。
為了使含有具有囊封治療劑之脂質顆粒的第三液流進一步穩定，該方法可包括，但是不一定進一步包括，用水性緩衝液來稀釋第三液流。在一個實施例中，稀釋第三液流包括使第三液流及水性緩衝液流至第二混合結構中。在另一實施例中，將包含具有囊封治療劑之脂質顆粒之水性緩衝液滲析以便減少第二溶劑之量。
第一液流包含第一溶劑中之治療劑。合適第一溶劑包括治療劑可溶解於其中並且可與第二溶劑混合的溶劑。合適第一溶劑包括水性緩衝液。代表性第一溶劑包括檸檬酸酯及乙酸酯緩衝液。若第二溶劑包含質子化劑諸如HCl以便將可電離脂質質子化，則第一溶劑可僅為水。
第二液流包含第二溶劑中之脂質顆粒形成材料。合適第二溶劑包括可電離脂質可溶解於其中並且可與第一溶劑混合的溶劑。合適第二溶劑包括1,4-二噁烷、四氫呋喃、丙酮、乙腈、二甲亞碸、二甲基甲醯胺、酸、及醇。代表性第二溶劑包括＞50%之水性乙醇。
在一些實施例中，本發明之脂質顆粒有利地在利用相對快速混合及較高流動速率之微流控過程中形成。快速混合提供具有以上提及之有利性質的脂質顆粒，該等性質包括大小、均質性、及囊封效率。用於實踐本發明方法之混合速率在約100 μsec至約10 msec範圍內。代表性混合速率包括約1至約5 msec。雖然水動力流動聚焦方法在相對較低流動速率(例如，5至100 μL/分鐘)與相對較低脂質體積下操作，但是本發明方法可在相對較高流動速率及相對較高脂質體積下操作。在某些實施例中，對於併有單一混合區域(亦即，混合器)之方法，流動速率為約1至約100 mL/min。對於利用混合器陣列(例如，10個混合器)之本發明方法，使用40毫升/分鐘之流動速率(對於100個混合器，流動速率為400mL/min)。因此，本發明方法可容易地按比例調整以便提供苛刻生產要求所需要的脂質顆粒之數量。
本文揭示之本發明LNP組成物可包括一或多種生物活性劑，包括但不限於抗體(例如，單株、嵌合、人源化、奈米抗體、及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白、化學治療劑及其他類型之抗腫瘤劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、及酶性核酸。可利用此項技術中的將生物活性劑負載至脂質組成物，諸如脂質體及脂質奈米顆粒中之各種方法，包括被動及主動負載方法兩者。所使用確切方法可基於多種因素來選擇，包括但不限於例如待負載之生物活性劑、一旦負載待使用之儲存方法、所得顆粒之大小、及預期給藥方案。方法包括例如在脂質體形成或重構時將藥物及脂質機械混合、將所有組分溶解於有機溶劑中並且將其濃縮成乾燥薄膜、形成pH或離子梯度以便將活性劑拉至脂質體內部、建立跨膜電位、及離子載體介導之負載。參見例如PCT公開案第WO 95/08986號、美國專利第5,837,282；第5,837,282號、及第7,811,602號。
術語「核酸」係指核糖核苷酸、去氧核苷酸、經修飾之核糖核苷酸、經修飾之去氧核糖核苷酸、經修飾之磷酸-糖-主鏈寡核苷酸、其他核苷酸、核苷酸類似物、及其組合、並且可為單鏈、雙鏈、或視情況含有雙鏈及單鏈序列兩者之部分。在一些實施例中，「核酸」包括反義核酸、形成三鏈之寡核苷酸、反義DNA或RNA組成物、嵌合DNA:RNA組成物、同工酶、適體、核糖酶、誘餌及其類似物、質體及其他類型之表現載體、及小核酸分子、RNAi劑、短干擾核酸(short interfering nucleic acid；siNA)、信使核糖核酸」(信使RNA、mRNA)、短干擾RNA(short interfering RNA；siRNA)、雙鏈RNA(double-stranded RNA；dsRNA)、微小RNA(miRNA)、及短髮夾RNA(short hairpin RNA；shRNA)分子、肽核酸(peptide nucleic acid；PNA)、鎖核酸核糖核苷酸(locked nucleic acid ribonucleotide；LNA)、嗎啉基核苷酸、蘇阿糖核酸(threose nucleic acid；TNA)、二醇核酸(glycol nucleic acid；GNA)、sisiRNA(small internally segmented interfering RNA；小內部分段干擾RNA)、aiRNA(asymetrical interfering RNA；不對稱干擾RNA)、及相關細胞及/或組織諸如細胞培養物、受試者或生物體之正義與反義鏈之間具有1、2或更多失配之siRNA。此類化合物可純化或部分純化，並且可天然存在或合成，並且可化學修飾。在一個實施例中生物活性劑為RNAi劑、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、或短髮夾RNA(shRNA)分子。在一個實施例中生物活性劑為適用於介導RNA干擾(RNA interference；RNAi)之RNAi劑。
如本文使用，術語「核酸」亦意欲包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有多達50個核苷酸之片段通常被稱為寡核苷酸，並且更長片段被稱為多核苷酸。在具體實施例中，本發明之寡核苷酸為20-50核苷酸長度。在本發明之上下文中，術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」係指由核苷酸或核苷單體組成之聚合物或寡聚物，該等單體由天然存在的鹼基、糖及糖間(主鏈)鍵組成。術語「多核苷酸」及「寡核苷酸」亦包括包含非天然存在之單體或其功能相似之部分的聚合物或寡聚物。此類經修飾之或經取代之寡核苷酸通常因為以下特性而優於天然形式：諸如增強之細胞攝取及在核酸酶存在下提高之穩定性。寡核苷酸分類為去氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。去氧核糖寡核苷酸係由5-碳糖(稱為去氧核糖)在此糖之5’及3’碳處共價地結合至磷酸組成，由此形成交替未分支聚合物。核糖寡核苷酸係由相似重複結構組成，其中5-碳糖為核糖。存在於根據本發明之脂質顆粒中之核酸包括任何形式之已知核酸。本文使用之核酸可為單鏈DNA或RNA，或雙鏈DNA或RNA，或DNA-RNA併合體。雙鏈DNA之實例包括結構性基因、包括控制及終止區域之基因、及自身複製系統諸如病毒或質體DNA。雙鏈RNA之實例包括siRNA及其他RNA干擾試劑。單鏈核酸包括反義寡核苷酸、核酶、微小RNA、及形成三鏈之寡核苷酸。
在另一實施例中生物活性劑為mRNA。在一個實施例中，核酸為編碼COVID-19蛋白或肽之mRNA。
如本文使用，術語「Pyr」、「Pyrd」及「PyrD」可互換使用並且係指吡啶或吡啶基取代基。
如本文提及之「效力」係指LNP將核酸酬載遞送至細胞或組織之能力，其中LNP內在化至細胞(或組織中之細胞)中並且自內涵體釋放至細胞質，隨後核酸酬載自脂質釋放並且變得為生物利用。效力可藉由為熟習此項技術者已知之許多方法中之任一者來量測。例如，其可在細胞攝取、核酸酬載轉錄、核酸酬載轉譯、或產生由核酸酬載編碼之多肽方面量測。當LNP之核酸酬載意欲以基因表現抑制方式諸如例如RNAi來起作用時，LNP效力可在經由減少目標基因之轉錄率、基因目標之mRNA轉錄物半衰期之持續時間、或目標基因之mRNA轉錄物之轉譯來實現目標基因「敲除」方面進行量測。量測效力之額外檢定取決於量測LNP免疫原性及LNP全身分佈。所有此類檢定及其變換在此項技術中為熟知的。
在一實施例中，量測LNP效力之實驗與參考LNP並行地進行。此實驗可使用標準化核酸酬載諸如例如報道基因。報道基因(經常簡稱為報道物)為研究人員附接至細菌、細胞培養物、動物、或植物中之另一種所關注基因之調控序列的基因。此類基因被稱為報道物，因為其賦予表現其之生物體的特性容易鑑別並量測，或因為其為可選擇標誌物。報道基因可用作是否某種基因吸收或表現於細胞或生物體群體中之指示。典型報道基因係 lacZ 、cat 、gfp 、rfp 、luc，該等基因分別編碼β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶，可用於相應組織化學、乙醯化、螢光、分光光度法、及生物發光檢定中。所有此類檢定及其變換在此項技術中為熟知的。
在一個實施例中，LNP效力在活體外或活體內以已知劑量或多個劑量藉由螢光素酶報道物活性來量測。相對LNP效力藉由螢光素酶活性量度在活體外或活體內決定。亦參見例如美國專利第10,221,127號。
LNP效力亦可在核酸酬載之所需生物反應方面量測，包括例如對於產生該等反應之作用機制的治療或預防效應或影響。在一些實施例中，LNP效力藉由帶有編碼免疫原之mRNA之LNP的能力來量測，例如，在投與之後，誘導免疫系統產生經分泌之同源IgG抗體的多肽。
「增加LNP效力」係指本發明naLNP具有比參考LNP更大效力的程度。在某些實施例中，在遞送相同核酸貨物之相同檢定中，本文揭示之本發明LNP具有比參考LNP高大約或至少1.25、1.50、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、400、500、750、1000、10,000倍的LNP效力增加。
如本文使用之「有機溶劑」係指一種類型之揮發性有機化合物(volatile organic compound；VOC)。VOC係在室溫下蒸發並且在此項技術中在製造醫藥產品中一般用於溶解某些材料及物質的有機化學品。通常在製造中使用有機溶劑：芳族化合物例如苯及甲苯，醇例如甲醇或乙醇，酯及醚，酮例如丙酮，胺，硝化及鹵化烴。
如本文使用，「氮-磷酸或「NP」」比率定義為可電離脂質與核酸主鏈上之磷酸莫耳數之莫耳比。應注意莫耳數為混合溶液中之總莫耳數，而非可以不同體積比率混合之初始核酸或脂質溶液中之濃度。應注意每個可電離脂質一個以上胺之情況。在混合條件下，通常僅一個胺經質子化以使得NP比率最自然地以每個可電離脂質一個胺來定義，即使在存在一個以上胺時亦如此，因為靜電結合僅涉及帶電荷的基團。然而某些可電離脂質可具有在混合期間之帶電荷的兩個或兩個以上胺。
如本文使用，「脂質/核酸重量比」為可代替NP比率來使用之重量比。NP比率與重量比之間之轉換涉及可電離脂質及核酸之莫耳質量除以每個磷酸之莫耳質量之鹼基數目。
在一個實施例中，核酸之量藉由可電離脂質上之胺與核酸主鏈上之磷酸基團之LNP莫耳比率來表示並且通常為約3至約6。在一個實施例中，LNP之pKa在約6至約7範圍內，對應於早期內涵體中之pH。LNP中之可電離脂質之pKa與基因緘默效率之間之聯繫證明約6至約7範圍內之LNP pKa產生可電離脂質DLinDMA之更大緘默並且與促進可干擾內涵體之膜之脂質結構相關。LNP之pKa可使用陰離子染料TNS之螢光增強之pH依賴性來量測。
如本文使用「膽固醇」係指具有以特定分子組態來佈置之四個環的生物活性有機化合物。類固醇核心結構通常由十七個碳原子組成，該等碳原子鍵結成四個「稠合」環：三個六員環己烷環(環A、B及C)及一個五員環戊烷環(D環)。類固醇依據附接至此四環核心之官能基以及該等環之氧化狀態而有所不同。固醇係在第三位置具有羥基基團及衍生自膽甾烷之骨架的類固醇形式。類固醇亦可更徹底地修飾，諸如改變環結構，例如，切割一個環。切割環B產生開環類固醇，其中之一者係維生素D3。實例包括脂質膽固醇、性激素雌二醇及睾酮,[4]:10–19及消炎藥物地塞米松。許多類固醇存在於植物、動物及真菌中。類固醇較佳在細胞中由固醇羊毛甾醇(反角蛋白)或環木蒿醇(植物)製造。羊毛甾醇及環木蒿醇衍生自三萜烯角鯊烯之環化。在一些實施例中，本文揭示之LNP組成物含有膽固醇衍生物，例如，二氫膽甾醇、映-膽固醇、表-膽固醇、鏈甾醇、膽甾烷醇、膽甾酮、膽甾烯酮、膽甾醇基-2'-羥乙基醚、膽甾醇基-4'-羥基丁基醚、3.β.-[N-(N'N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基膽固醇(DC-Chol)、24(S)-羥膽固醇、25-羥膽固醇、25(R)-27-羥膽固醇、22-氧化膽固醇、23-氧化膽固醇、24-氧化膽固醇、環木蒿醇、22-酮甾醇、20-羥基甾醇、7-羥膽固醇、19-羥膽固醇、22-羥膽固醇、25-羥膽固醇、7-脫氫膽固醇、5.α.-膽甾-7-烯-3.β.-醇、3,6,9-三氧化辛-1-醇-膽甾醇基-3e-醇、脫氫麥角甾醇、脫氫表雄酮、羊毛甾醇、二氫羊毛甾醇、羊毛甾醇、光甾醇、谷鈣化醇、卡泊三醇、糞醇、膽鈣化醇、羽扇醇、麥角鈣化醇、22-二氫麥角鈣化醇、麥角固醇、蕪莆甾醇、番茄鹼、番茄苷、烏酸、膽酸、鵝去氧膽酸、黴菌甾醇、薯芋皂素、岩藻甾醇、糞甾醇、或糞甾醇、或鹽或其酯。在一些實施例中，膽固醇或膽固醇衍生物為膽固醇、膽固醇琥珀酸、膽固醇硫酸酯、膽固醇半琥珀酸酯、膽固醇酞酸酯、膽固醇磷酸酯、膽固醇戊酸酯、膽固醇乙酸酯、膽甾醇油酸酯、膽甾醇基亞油酸酯、膽甾醇基肉豆蔻酸酯、膽甾醇基棕櫚酸酯、膽甾醇基花生酸酯、膽甾醇基磷酸膽鹼、及膽酸鈉。其他示例性類固醇揭示於美國公開案第20200129445號中。
如本文使用，「脂質囊封」係指藉由完全囊封、部分囊封、或兩者來提供活性劑或治療劑諸如核酸(例如，mRNA)的脂質奈米顆粒。在一實施例中，核酸(例如，mRNA)完全囊封於LNP中。
II. LNP製造方法
先前技術迄今著重於可電離脂質之特性及結構作為決定LNP效力之主要參數。次要參數包括辨別其他脂質如DSPE與DSPC或膽固醇之不同膽固醇類似物之影響及4種脂質之莫耳比率。
另外，先前技術顯示熟習此項技術者認為緩衝液濃度應足夠高並且pH足夠低以便將可電離脂質高度質子化，從而囊封最大量之mRNA(接近於100%)並且此舉最大化LNP效力。
此外，先前技術教示操作具有高濃度核酸及脂質之混合溶液導致一系列技術問題，包括不溶性、非所需沉澱、混合較差、產生不均勻的LNP大小及不同核酸囊封率。另外，具有大於1 mg/ml之濃度的核酸溶液，尤其報道基因mRNA溶液為不可購得的。即使高濃度溶液為可購得的，執行幾百次高濃度混合來測試各個濃度亦受成本過高限制。鑒於此等普遍假設，參與LNP製造之科學家著重於使用具有低濃度核酸及脂質之混合溶液以便避免高測試成本、不當沉澱、LNP大小不均勻性、及LNP核酸囊封不均勻性，相信可稍後藉由在下游處理步驟期間，將溶液中之由此產生之LNP濃縮來調整mRNA劑量。然而，此舉未解決此先前技術程序產生低效力LNP的基本問題。
例如，迄今，＞2 mg/ml濃度下之0.5 ml高濃度mRNA溶液每個混合物耗費至少$1,500。為了達成本文揭示之naLNP，不考慮到其他成本，技術人員僅僅為了製備本文揭示之 核酸溶液，以至少$150,000之成本使用＞100個混合物。除了產生高濃度核酸溶液之費用以外，高濃度迄今被視為導致不溶性、聚集、沉澱及/或較差混合。
另外，申請人決定使用高核酸濃度導致較低囊封率，例如，在naLNP中為約70%，相比之下，在refLNP中為約90%。然而，發明者意外地發現即使使用實質上較低囊封率，本文揭示之naLNP具有比refLNP更大的LNP效力。
申請人開發高度受控及可重現活體外FLuc檢定，該檢定允許在相同條件(細胞數目等)、內部重組quantilum標準、及各個實驗之相同refLNP下比較實驗結果來決定naLNP效力。
申請人進一步認為可電離脂質之未質子化部分增加內涵體釋放及/或mRNA之更鬆散結合有利於更好內涵體釋放，及/或可電離脂質或核酸例如mRNA在LNP中之更外圍分佈為迄今未知的。
然而，本文揭示以下意外發現：在保持恆定NP或重量比率的同時，LNP效力受核酸:脂質混合物之絕對濃度強烈影響。
本文提供之資料表明混合時之核酸之絕對濃度及緩衝液濃度及pH均強烈影響LNP效力並且此等兩種影響相互作用。介導此相互作用之顯著變數為混合期間之可電離脂質之質子化水準，為了將囊封增加到最大限度，該水準不應最大化，如先前所認為。實情為，根據本文揭示之方法，可電離脂質之質子化水準應處於最大限度地增加LNP效力的水準下。
在通常實施例中，本發明涵蓋製造脂質奈米顆粒之增強方法，其中脂質奈米顆粒遞送效率視可電離脂質電離化及烷基尾區結構而定。
在某些實施例中，具有高遞送效率之LNP在來自BioNTech/Pfizer及Moderna之當前COVD-19 mRNA疫苗之成功中為極其重要的。在某些實施例中，此等疫苗中之LNP含有4種脂質，亦即可電離脂質、輔助脂質DSPC、膽固醇、及PEG脂質，該等脂質與mRNA序列自動組裝成具有約60nm直徑之奈米顆粒。在某些實施例中，質子化形式之可電離脂質與mRNA之陰離子磷酸主鏈靜電結合以便將其囊封於LNP中，同時DSPC形成外圍雙層，該雙層含有PEG-脂質尾區與朝向水性介質之親水性PEG域。在某些實施例中，可電離脂質之作用係藉由當內涵體pH降低至7以下時質子化，然後與內涵體膜相互作用來將其開啟並且釋放mRNA，進而促進內涵體釋放。在某些實施例中，LNP中之可電離脂質具有5至7.4範圍內之pKa以便在內涵體-溶酶體融合之前釋放RNA。在某些實施例中，可電離脂質之烷基尾區亦必需與內涵體雙層不相容，以便使其去穩定化。對於當前可電離脂質，此後一必要條件藉由錐形分支結構來達成。
在某些實施例中，本發明亦涵蓋藉由自可電離脂質之結構來預測LNP之pKa，合理地設計LNP電離化以便內涵體釋放的方法。在某些實施例中，由於與水相相比，LNP中之質子溶劑化能量之差異，LNP之pKa低於可電離脂質之pKa。在某些實施例中，此舉允許合理設計具有3個可質子化氮之新穎可電離脂質(C2C4)，提供增加之內涵體質子化及mRNA轉譯。在某些實施例中，在對於mRNA編碼SARS-CoV-2刺突蛋白之免疫原性方面，發現C24LNP比作為標準參考LNP之MC3 LNP優異10X，並且導致針對感染之更大保護。在某些實施例中，LNP合理設計方法藉由開發模型來擴展，該等模型使用可電離脂質結構來預測LNP電離及可電離脂質干擾內涵體膜並且釋放mRNA之能力。
在某些實施例中，遞送效率視mRNA-LNP製造過程而定。在某些實施例中，mRNA-LNP使用微流控或更大規模T-混合器經由自身組裝過程來製造，其中乙醇中之4種脂質與處於低pH緩衝液中之mRNA快速混合。在某些實施例中，mRNA LNP之形成經由質子化陽離子可電離脂質與陰離子mRNA磷酸主鏈之靜電結合，隨後脂質自水相分離以形成藉由親水性PEG界面來穩定化之奈米顆粒而發生。在某些實施例中，許多因素可在製造過程中改變，包括但不限於脂質及mRNA之絕對及相對濃度、緩衝液類型、其濃度及pH、有機物與水相之比率、及流動速率。我們發現共同地增加脂質及mRNA之絕對濃度，而不更改相對濃度，通常可增加所得mRNA LNP之遞送效率4X(第34圖)。在某些實施例中，本發明涵蓋增加此等混合濃度例如6X達到75mM總脂質及1.5mg/ml mRNA的方法，導致在活體外及活體內在相同劑量下遞送效率增強4X(第34B圖)。藉由量測pH 7.4至5下之仄他電位增加，我們發現與在標準條件下組裝之LNP相比，此等更有效LNP展現zeta電位的2倍更大增加(第34C圖)。不受理論約束，此結果指示改良效力部分地歸因於LNP中之未質子化可電離脂質之更大水準增加內涵體質子化。在某些實施例中，mRNA LNP在無緩衝液環境中組裝。在某些實施例中，代替使用mRNA溶液中之低pH緩衝液以便在混合後使可電離脂質質子化，在無緩衝液水中與mRNA混合之前，將HCl添加至脂質混合物，將可電離脂質預質子化。在某些實施例中，TLC-MS及 1H NMR用於確認脂質降解未發生。在某些實施例中，使用具有3個氮之C24可電離脂質，並且每個可電離脂質添加0.25個質子，我們平均使每4個脂質上之1個氮質子化以使得質子化氮與mRNA之磷酸處於1:1比率下(NP比率為4)。在某些實施例中，藉由IVIS，對於IM及IV投與兩者，與使用緩衝液相比，無緩衝液組裝方法在活體內產生3X更高效力，兩種方法均使用較高脂質及mRNA混合濃度。在某些實施例中，與使用低濃度及低pH緩衝液之當前製造方法相比，無緩衝液、高絕對脂質/mRNA濃度組裝方法可由此產生更有效10X的LNP，但是不改變最終調配物之組成。在某些實施例中，與作為內在地快速並且不均勻的過程，需要對流及擴散以便接觸脂質並且將脂質質子化之緩衝液相比，預質子化方法更精確地將可電離脂質質子化之特定水準作為目標。在某些實施例中，製造過程達成高效力LNP，該等LNP在所有製造規模下以及使用微流控及T-混合幾何形狀兩者來容易地實施。
在某些實施例中，製造方法包括在與無緩衝液mRNA混合之前將可電離脂質質子化的步驟。在某些實施例中，可電離脂質可用HCL、DCL、弱酸、乙醇、水、或本文所述任何溶劑來質子化。在某些實施例中，質子化在與其他脂質或與整個脂質混合物混合之前單獨發生。
在某些實施例中，鹽酸用於在與其他脂質混合成脂質混合物之前將可電離脂質原料本身直接質子化或將一旦已經混合於脂質混合物中之可電離脂質質子化。脂質混合物中之此無緩衝液預質子化可電離脂質然後與無緩衝液mRNA溶液混合。在某些實施例中，100%質子化意味著對於溶液中之每一莫耳可電離脂質，添加一莫耳HCL以便將可電離脂質中之氮質子化。為了將多蛋白可電離脂質中之多個氮質子化，添加相應莫耳HCL以便將各氮質子化。
在通常實施例中，製得本文揭示之naLNP之改良方法可概述如下： ● 核酸溶液：在某一緩衝液濃度下之緩衝液中並且在某一核酸溶液pH下，提供核酸濃度下之核酸。 ● 脂質溶液：在對應於所需：i)氮-磷酸(「Nitrogen-Phosphate；NP」)比率，或ii)脂質/核酸重量比之脂質溶液脂質濃度下，提供有機溶劑中之脂質。 ● 組裝 naLNP：將核酸溶液及脂質溶液部分組合成具有混合緩衝液濃度及pH之混合溶液。
熟習此項技術者理解本發明方法中之某些步驟不一定以某一順序執行，而其他步驟必須在其他步驟之前執行。另外，不同參與者可以執行整個方法之各個步驟。
在一些實施例中，混合溶液中之核酸溶液及脂質溶液之部分處於約或至少0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、2:1、3:2、3:1、4:1、4:3、5:1、5:3、5:4、6:1、6:5、7:1、8:1、9:10、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、及20:1之體積比下。
根據上述方法產生之LNP可然後根據在此項技術中熟知的方法來進一步處理供使用。在一些實施例中，此進一步處理涉及以下中之一或多者： ● 使 naLNP達到生理pH，例如，經由約4至約24小時之間之滲析，或替代地經由使用切向流動過濾及交換緩衝液諸如Repligen之KrosFlo® KR2i或KMPi系統或Cytiva之ÄKTA Flux切向流動過濾系統。 ● 量測 naLNP大小，例如，藉由光散射。 ● 量測 RNA囊封，例如，藉由Ribogreen檢定。 ● 選擇naLNP具有高囊封，例如，至少或約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%囊封效率，或至少或約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500 nM之平均直徑，或分別具有約45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 nM之最小直徑及約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500 nM之最大直徑。
在一些實施例中， 核酸溶液含有約或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20毫克/ml之核酸濃度的核酸。
在一些實施例中，核酸存在於約或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更分子種類各編碼約或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個開放解讀碼組中。
在一些實施例中，核酸分子可為約或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、50、100、200、300、400、500、750、800、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000個核苷酸長度。
在一些實施例中， 核酸溶液含有約或至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500mM之濃度的緩衝液。
在一些實施例中，緩衝液係鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝劑為檸檬酸、乙酸、磷酸、及硼酸。在一些實施例中，緩衝液為乙酸鉀、乙酸鎂、或乙酸鈉。在其他實施例中，緩衝液可為檸檬酸、MES、組胺酸、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、BES、HEPES、DIPSO、TEA、AMPD、Gly-Gly、TAPS、HEPBS、AMPD、TABS、AMP、CAPSO、CAPS、CABS、CHES、PBS、SSC、TAE、TBE、或TE及其類似物。參見例如「Acetate Buffer (pH 3.6至5.6) Preparation.」AAT Bioquest, Inc, 29 Sep. 2020。其他合適緩衝液展示於下表中：
Figure 02_image059
在一些實施例中， 核酸溶液處於約或至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14之pH下。
在一些實施例中， 脂質溶液含有有機溶劑苯、甲苯、醇例如甲醇、酯、醚、酮例如丙酮、胺、硝化及/或鹵化烴，或其組合。在一個實施例中有機溶劑為乙醇。較佳溶劑為揮發性、無毒、且/或微量投與人類為可接受的。
在一些實施例中， 脂質溶液含有約或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、800、1000 mM之總濃度的一或多種脂質。
在一些實施例中， 混合溶液具有約或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20毫克/ml之核酸之混合濃度。
在一些實施例中， 混合溶液具有約或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、800、1000 mM之脂質之混合總濃度。
在一些實施例中， 混合溶液具有約或至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、175、200、250、300、350、400、450、500 mM之混合緩衝液濃度。
在一些實施例中，混合溶液中之緩衝液例如乙酸鈉緩衝液濃度經最佳化以便在任何特定混合濃度下最大化效力。例如，實例13顯示在核酸溶液中之1.5mg/ml之mRNA下，當將乙酸鈉自50mM減少至25mM時，LNP效力相對於參考LNP增加44%。在核酸溶液中之0.25mg/ml之mRNA濃度下，將乙酸鈉濃度自25mM減少至10mM增加LNP效力約2.2X。混合濃度之增加及緩衝液濃度之最佳化減少產生約70%之囊封效率，低於先前技術方法中通常獲得之囊封效率，其中如在實例10中，藉由降低混合濃度及增加緩衝液濃度，囊封錯誤地最大化。根據本文揭示之方法產生之LNP比根據參考LNP製造方法產生之LNP意外及顯著地更有效(例如5-10X)，儘管具有稍微更低囊封效率(例如60-80%相比於80-100%)。
在一些實施例中， 混合溶液處於約或至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14之pH下。
在一些實施例中所需「氮-磷酸或「NP」」比率為約：1:100、1:75、1:50、1-25、較佳2:10、更佳3:6。
在一些實施例中所需脂質/核酸重量比為約：1:1至1000:1，較佳5:1–100:1，更佳10:1–30:1。
在一些實施例中，與在細胞(第8A圖)及動物(第9C圖IM及IV投與)中在相同劑量下測試之1.5mg/ml至0.05mg/ml混合濃度相比，全部在50mM乙酸鈉pH 4中、在恆定NP比率4下，將核酸溶液中之mRNA濃度自0.05 mg/ml mRNA增加至1.5 mg/ml mRNA導致LNP效力增加約10X。0.05mg/ml–0.1mg/ml LNP範圍內之低mRNA濃度表示根據參考LNP製造方法產生之LNP。較佳地，本發明方法使混合在約或高於0.20 mg/ml之mRNA下發生，在此時點觀察到LNP效力之較大增加。
在一實施例中，製造方法如下設定： ● 核酸溶液：在pH 4下之單一緩衝液，例如25mM乙酸鈉緩衝液中，在0.05至3mg/ml範圍內之多個濃度下，製備mRNA。作為一般準則，本文中之緩衝液選擇及pH應選擇以便在混合期間獲得比所產生LNP之pKa低約1點之pH以便獲得約70%囊封。例如，當2體積核酸溶液與1體積脂質溶液混合時，在75 mM總脂質濃度(37.5mM KC2或MC3濃度)下，與pH 4下之25mM NaOAc中之1.5mg/ml之mRNA混合以產生NP 4的具有=~6.5之pKa之KC2或MC3導致在由1mg/ml mRNA(3.1mM磷酸基團)、12.5 mM KC2及33%乙醇(ethanol；ETOH)中之16.7 mM乙酸鈉、67%H2O組成之混合溶液中，混合pH為5.5。 ● 脂質溶液：對於直接上文與 核酸溶液製備有關所描述之mRNA溶液中之各者，在對應於所需NP比率或脂質/mRNA重量比之多個濃度下，在乙醇或另一種合適溶劑中製備脂質混合物。 ●  在單一緩衝液類型、濃度及pH中，在與mRNA之上述多個混合濃度下，組裝naLNP。 ●  使naLNP達到生理pH。 ●  使用光散射來量測naLNP大小 ●  使用Ribogreen檢定，量測naLNP中之RNA囊封 ●  接受具有＞40%之囊封的naLNP ●  在活體外或活體內以已知劑量或多個劑量來量測螢光素酶活性。 ●  相比於refLNP之相對naLNP效力藉由活體外或活體內量測之螢光素酶活性來決定。
在另一實施例中，藉由在混合期間調整mRNA緩衝液類型、濃度及pH來改變混合pH及可電離脂質質子化水準，naLNP效力可在任何給定混合濃度下最佳化： ● 核酸溶液：在一系列緩衝液類型(乙酸鈉、檸檬酸鈉等)、緩衝液濃度(1-100mM)及pH(3-7)中，在一個濃度(亦即在上述0.05至3mg/ml範圍中)下，製備mRNA。對於任何特定混合濃度，選定緩衝液應產生跨越40-90%範圍之囊封效率，該等效率可大致對應於可電離脂質之質子化水準(40-90%)，進而由33%ETOH/67%H 2O緩衝液之pH及因而緩衝液類型、濃度及pH來決定。 ● 脂質溶液：對於直接上文與 核酸溶液製備有關所描述之mRNA溶液，在對應於所需NP比率或脂質/mRNA重量比之濃度下，在乙醇或另一種合適溶劑中製備脂質混合物。 ●  在上述多個緩衝液中以單一混合濃度來組裝naLNP。 ●  使naLNP達到生理pH。 ●  使用光散射來量測naLNP大小 ●  使用Ribogreen檢定，量測naLNP中之RNA囊封 ●  接受具有＞40%之囊封的naLNP ●  在活體外或活體內以已知劑量或多個劑量來量測螢光素酶活性。 ●  相對naLNP效力藉由活體外或活體內量測之螢光素酶活性來決定。
對於任何特定naLNP調配物，相對於藉由參考LNP製造方法產生之參考LNP的至少或約10X之效力增加可藉由根據本文揭示方法，核酸溶液及脂質溶液及因此混合溶液之濃度及mRNA緩衝液濃度及pH之適當最佳化來獲得。
在一些實施例中，緩衝液完全自 核酸溶液溶液中缺失並且可電離脂質藉由將酸例如HCl受控添加至 脂質溶液脂質混合物來直接質子化，如實例10展示。後者在與水中之mRNA混合之前達成脂質混合物中之規定質子化水準並且可產生與使用乙酸鈉時發現為最佳之囊封水準類似的囊封水準(70%)。
在一個實施例中將兩個液體組合係藉由混合。例如，混合係藉由混沌對流來微流控混合。在另一實施例中，T接頭混合可以更大規模使用，由此產生類似LNP。
微流控裝置提供在對於溫度、停留時間、及溶質濃度進行精確控制的情況下，在奈升標度下可控制地及快速混合流體的能力。控制及快速微流控混合先前應用於合成無機奈米顆粒及微粒並且可勝過大規模生產奈米顆粒之宏觀尺度系統。微流控兩相微滴技術用於產生供藥物遞送之單分散聚合物微粒或產生供囊封細胞、蛋白、或其他生物分子之較大囊泡。在一些實施例中，使用一種常用微流控技術水動力流動聚焦來提供試劑之快速混合，以便產生受控大小之單分散脂質體。此技術亦被證明適用於產生聚合物奈米顆粒，其中與大量生產方法相比，獲得更小、更高單分散性之顆粒，並且小分子之囊封程度更高。
在一個實施例中，至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多種脂質溶解於有機溶劑諸如乙醇中，同時核酸在pH 3-6，較佳4乙酸緩衝液中。此等兩個液流在共同微流控通道中相遇並且在被排出至含水接受孔中之前，強制在幾毫秒內混合。在混合時，發生兩個事件：1)在與陰離子mRNA混合同時，最初中性可電離脂質接觸低pH緩衝液並且變得質子化，因而形成陽離子脂質與陰離子核酸之間之靜電鍵結；及2)脂質變得不溶於主要水性緩衝液中並且將mRNA囊封。含有PBS之最終孔中之pH通常為6-6.5，此歸因於乙酸、PBS及可電離脂質之混合物，該等物質皆為具有一定緩衝能力及初始pH之緩衝液。
在一些實施例中，naLNP相對於PBS滲析以便將pH升高至約7.4並且移除乙醇。LNP組裝在滲析期間繼續，此時具有接近6.5之LNP pKa的可電離脂質變得逐漸地中和至pH7.4並且由此可溶性較小，觸發LNP之融合，從而增加大小並且將水性電子透明核心轉變成主要含有可電離脂質及核酸之電子密集核心。
在一個實施例中，所投與組成物中之本發明提供之脂質之總量為約2至約100 mg脂質/mg生物活性劑(例如RNA)，在另一實施例中為約5至約25 mg脂質/mg生物活性劑(例如RNA)，在另一實施例中為約7至約25 mg脂質/mg生物活性劑(例如RNA)並且在一個實施例中為約10至約20 mg脂質/mg生物活性劑(例如RNA)。
醫藥組成物及方法
本發明之LNP可用於在活體外或活體內將治療或預防劑遞送至細胞。在具體實施例中，治療劑為核酸，使用本發明之核酸-脂質顆粒來將該核酸遞送至細胞。方法及組成物可容易地調適以便遞送任何合適治療劑供治療受益於此治療之任何疾病或病症。
在某些實施例中，本發明提供將核酸引入細胞中之方法。引入細胞中之較佳核酸為mRNA、siRNA、miRNA、免疫刺激寡核苷酸、DNA質體、反義及核酶。此等方法可藉由使本發明之顆粒或組成物與細胞接觸足以使細胞內遞送發生的一段時間來執行。
用於本發明之核酸可根據任何可獲得技術來製備。對於mRNA，主要製備方法為但是不限於酶促合成(亦稱為活體外轉錄)，當前代表產生長序列特異性mRNA之最有效方法。活體外轉錄描述模板引導的自工程化DNA模板來合成RNA分子之過程，該模板包含連接至編碼所關注基因之下游序列的上游噬菌體啟動子序列(例如包括但不限於來自T7、T3及SP6大腸菌噬菌體之序列)。可製備模板DNA以便使用在此項技術中熟知之合適技術自許多來源進行活體外轉錄，包括但不限於質體DNA及聚合酶鏈反應擴增(參見Linpinsel, J. L and Conn, G. L., General protocols for preparation of plasmid DNA template and Bowman, J. C., Azizi, B., Lenz, T. K., Ray, P., and Williams, L. D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G. L. (編), New York, N.Y.Humana Press, 2012)。
RNA之轉錄在活體外使用線性化DNA模板，在相應RNA聚合酶及腺苷、鳥苷、尿苷及胞苷核糖核苷三磷酸鹽(ribonucleoside triphosphate；rNTP)存在下，在支援聚合酶活性，同時最大限度地減少所得mRNA轉錄物之潛在降級的條件下發生。活體外轉錄可使用各種商購套組來執行，包括但不限於RiboMax大規模RNA產生系統(Promega)，MegaScript轉錄套組(Life Technologies)以及商購試劑包括RNA聚合酶及rNTP。mRNA之活體外轉錄方法在此項技術中為熟知的。(參見例如Losick, R., 1972, In vitro transcription, Ann Rev Biochem v.41 409-46; Kamakaka, R. T. and Kraus, W. L. 2001.In Vitro Transcription.Current Protocols in Cell Biology.2:11.6:11.6.1-11.6.17; Beckert, B. And Masquida, B., (2010) Synthesis of RNA by In Vitro Transcription in RNA in Methods in Molecular Biology v. 703 (Neilson, H. Ed), New York, N.Y.Humana Press, 2010; Brunelle, J. L. and Green, R., 2013, Chapter Five--In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA, Methods in Enzymology v. 530, 101-114; 所有該等文獻以引用方式併入本文)。
所需活體外轉錄mRNA然後自轉錄或相關反應之非所需組分(包括未併入rNTP、蛋白酶、鹽、短RNA寡核苷酸等)中純化。分離mRNA轉錄物之技術在此項技術中為熟知的。熟知程序包括苯酚/氯仿萃取或在一價陽離子或氯化鋰存在下，用任一種醇(乙醇、異丙醇)來沉澱。可使用之純化程序之額外非限制性實例包括尺寸排阻層析(Lukavsky, P. J. and Puglisi, J. D., 2004, Large-scale preparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleotides, RNA v.10, 889-893)，基於二氧化矽之親和層析及聚丙烯醯胺凝膠電泳(Bowman, J. C., Azizi, B., Lenz, T. K., Ray, P., and Williams, L. D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G. L. (編), New York, N.Y.Humana Press, 2012)。純化可使用各種商購套組來執行，包括但不限於SV Total Isolation System (Promega)及In Vitro Transcription Cleanup and Concentration Kit (NorgenBiotek)。
此外，雖然反轉錄可產生大數量mRNA，但是產物可含有與非所需聚合酶活性相關之一或多種異常RNA雜質，可能需要自全長mRNA製備物中移除。此等雜質包括由無效轉錄起始產生之短RNA以及藉由RNA依賴性RNA聚合酶活性、自RNA模板之RNA預敏化轉錄及自身互補3'延伸部分產生之雙鏈RNA(dsRNA)。已證明具有dsRNA結構之此等污染物可經由與真核細胞中之各種先天免疫感測器之相互作用來產生非所需免疫刺激活性，該等感測器起作用以便識別特定核酸結構並且誘導有效免疫反應。此進而可極大地減少mRNA轉譯，因為蛋白質合成在先天細胞免疫反應期間減少。因此，移除此等dsRNA污染物之額外技術已開發並且在此項技術中為已知的，包括但不限於可擴展的HPLC純化(參見例如Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. and Weissman, D., 2011, Generating the optimal mRNA for therapy:HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucl Acid Res, v. 39 e142; Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H., and Kariko, K., HPLC Purification of in vitro transcribed long RNA in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H.編), 2013)。已報道HPLC純化mRNA在大得多之水準下轉譯，尤其在原代細胞中並且在活體內。
已在此項技術中描述用於改變活體外轉錄mRNA之特定性質並且改善其效用的大量各種修飾。此等修飾包括但不限於mRNA之5'及3'末端之修飾。內源性真核mRNA通常在成熟分子之5'-末端含有帽結構，該結構在介導mRNA帽結合蛋白(Cap Binding Protein；CBP)之結合中發揮重要作用，該蛋白轉而負責增強細胞中之mRNA穩定性及mRNA轉譯效率。因此，最高蛋白表現水準用加帽mRNA轉錄物來達成。5'-帽含有最5'核苷酸與鳥嘌呤核苷酸之間之5'-5'-三磷酸鍵聯。結合鳥嘌呤核苷酸在N7位置處經甲基化。額外修飾包括2'-羥基上之最終及倒數第二最5'-核苷酸之甲基化。
多種不同帽結構可用於產生活體外轉錄合成mRNA之5'-帽。合成mRNA之5'-加帽可共轉錄地用化學帽類似物來執行(亦即在活體外轉錄期間加帽)。例如，反逆帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog；ARCA)帽含有5'-5'-三磷酸鳥嘌呤-鳥嘌呤鍵聯，其中一個鳥嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基。然而，多達20%之轉錄物在此共轉錄過程期間保持無帽並且合成帽類似物與真實細胞mRNA之5'-帽結構不一致，潛在地減少可轉譯性及細胞穩定性。或者，合成mRNA分子亦可在轉錄後酶促加帽。此等分子可產生更真實5'-帽結構，該結構在結構上或功能上更準確地模擬內源性5'-帽，該帽具有帽結合蛋白之增強結合、增加半衰期、減少對於5'核酸內切酶之易感性及/或減少5'脫帽。許多合成5'-帽類似物已開發並且在此項技術中為已知的，以便增強mRNA穩定性及可轉譯性(參見例如Grudzien-Nogalska, E., Kowalska, J., Su, W., Kuhn, A. N., Slepenkov, S. V., Darynkiewicz, E., Sahin, U., Jemielity, J., and Rhoads, R. E., Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H.編), 2013)。
在3'-末端，長鏈腺嘌呤核苷酸(聚腺苷酸尾)通常在RNA處理期間添加至mRNA分子。在轉錄之後，立即將轉錄物之3'末端裂解以便釋放3'羥基，在被稱為聚腺苷酸化之過程中，聚腺苷酸聚合酶將腺嘌呤核苷酸鏈添加至RNA。聚腺苷酸尾區廣泛表明可增強mRNA之轉譯效率及穩定性兩者(參見Bernstein, P. and Ross, J., 1989, Poly (A), poly (A) binding protein and the regulation of mRNA stability, Trends Bio Sci v. 14 373-377; Guhaniyogi, J. And Brewer, G., 2001, Regulation of mRNA stability in mammalian cells, Gene, v. 265, 11-23; Dreyfus, M. And Regnier, P., 2002, The poly (A) tail of mRNAs:Bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria, Cell, v.111, 611-613)。
活體外轉錄mRNA之聚(A)加尾可使用各種方法來達成，包括但不限於將聚(T)序列選殖至DNA模板中或藉由使用聚(A)聚合酶來轉錄後添加。第一種情況允許活體外轉錄具有規定長度之聚(A)尾區的mRNA，此舉視聚(T)序列之大小而定，但是需要對該模板進行額外處理。後一種情況涉及使用催化腺嘌呤殘基併入RNA之3'末端上之聚(A)聚合酶，將聚(A)尾區酶促添加至活體外轉錄之mRNA，不需要對DNA模板進行額外處理，但是導致mRNA具有不一致長度之聚(A)尾區。5'-加帽及3'-聚(A)加尾可使用各種商購套組來執行，包括但不限於Poly (A) Polymerase Tailing套組(Poly (A) Polymerase Tailing)，mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra套組及Poly (A) Tailing套組(Life Technologies)以及商購試劑、各種ARCA帽、聚(A)聚合酶等。
除了5'帽及3'聚腺苷酸化以外，活體外轉錄物之其他修飾已報道可提供與轉譯效率及穩定性相關之益處。在此項技術中眾所周知致病性DNA及RNA可藉由真核生物內之各種感測器來識別並且觸發有效先天免疫反應。區分致病性及自身DNA及RNA之能力已被證明至少部分地基於結構及核苷修飾，因為來自天然來源之大多數核酸含有經修飾之核苷。相比之下，活體外合成之RNA缺少此等修飾，由此使得其具有免疫刺激性，進而可抑制有效mRNA轉譯，如以上概述。將經修飾之核苷引入活體外轉錄mRNA中可用於預防RNA感測器之識別及活化，由此減輕此非所需免疫刺激活性及增強轉譯能力(參見例如Kariko, K. And Weissman, D. 2007, Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA:implication for therapeutic RNA development, Curr Opin Drug Discov Devel, v.10 523-532; Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H.編), 2013); Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F. A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., Weissman, D., 2008, Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Mol Ther v.16, 1833-1840。用於合成經修飾RNA的經修飾核苷及核苷酸可使用在此項技術中已知之一般方法及程序來製備監測及利用。可利用廣泛多種核苷修飾，該等修飾可單獨或在一定程度上與其他經修飾之核苷組合來併入活體外轉錄mRNA中(參見例如US2012/0251618)。活體外合成之核苷修飾mRNA已報道具有活化免疫感測器之減少之能力，同時出現轉譯能力增強。
可經修飾以便在可轉譯性及穩定性方面提供益處的mRNA之其他組分包括5'及3'未轉譯區(untranslated region；UTR)。同時或獨立地，UTR之最佳化(有利5'及3'UTR可獲自細胞或病毒RNA)已被證明增加mRNA穩定性及活體外轉錄mRNA之轉譯效率(參見例如Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H.編), 2013)。
除了mRNA以外，其他核酸酬載可用於本發明。對於寡核苷酸，製備方法包括但不限於化學合成及酶促、較長前驅物之化學裂解、如上所述之活體外轉錄等。合成DNA及RNA核苷酸之方法廣泛地使用並且在此項技術中為熟知的(參見，例如，Gait, M. J. (編) Oligonucleotide synthesis:a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.:IRL Press, 1984；及Herdewijn, P. (編) Oligonucleotide synthesis:methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.)Totowa, N.J.:Humana Press, 2005；該等文獻皆以引用方式併入本文)。
對於質體DNA，用於本發明之製備通常利用但是不限於在活體外在含有所關注質體之細菌之液體培養物中，擴增及分離質體DNA。所關注質體中存在編碼對於特定抗生素(青黴素、卡那黴素等)之抗性的基因允許含有所關注質體之彼等細菌在含有抗生素之培養物中選擇性生長。分離質體DNA之方法廣泛地使用並且在此項技術中為熟知的(參見，例如Heilig, J., Elbing, K. L. and Brent, R (2001) Large-Scale Preparation of Plasmid DNA.Current Protocols in Molecular Biology.41:II:1.7:1.7.1-1.7.16; Rozkov, A., Larsson, B., Gillstrom, S., Bjornestedt, R. and Schmidt, S. R. (2008), Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture.Biotechnol.Bioeng., 99:557-566；及US6197553B1)。質體分離可使用各種商購套組來執行，包括但不限於Plasmid Plus (Qiagen)，GenJET plasmid MaxiPrep (Thermo)及PureYield MaxiPrep(Promega)套組以及使用商購試劑。
典型應用包括使用熟知程序來提供siRNA之細胞內遞送以便敲除或緘默特定細胞靶標。或者，應用包括遞送編碼在治療上有用多肽或基因編輯組分之DNA或mRNA序列。以此方式，藉由供應缺陷或缺失基因產物來提供遺傳疾病之療法。本發明之方法可在活體外、離體、或活體內實施。例如，本發明之組成物亦可用於在活體內使用熟習此項技術者已知之方法來將核酸遞送至細胞。
藉由本發明之脂質顆粒來遞送siRNA及其在緘默基因表現中之有效性於下文描述。
對於活體內投與，醫藥組成物較佳非經腸(例如，關節內、靜脈內、腹膜內、皮下、或肌肉內)投與。在具體實施例中，醫藥組成物藉由快速濃注來靜脈內或腹膜內投與。其他投與途徑包括局部(皮膚、眼睛、黏膜)、經口、肺部、鼻內、舌下、直腸、及陰道。
在一個實施例中，本發明提供調節目標多核苷酸或多肽之表現的方法。此等方法通常包括細胞與本發明之LNP接觸，該LNP與能夠調節目標多核苷酸或多肽之表現的核酸締合。如本文使用，術語「調節」係指改變目標多核苷酸或多肽之表現。調節可意指增加或增強，或其可意指降低或減少。
在相關實施例中，本發明提供治療受試者中之藉由多肽之過度表現來表徵之疾病或病症的方法，包括向受試者提供本發明之醫藥組成物，其中治療劑選自siRNA、微小RNA、反義寡核苷酸、及能夠表現siRNA、微小RNA、或反義寡核苷酸之質體，並且其中siRNA、微小RNA、或反義RNA包含特異性結合至編碼多肽之多核苷酸或其補體的多核苷酸。
在進一步態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，該組成物包含本發明之脂質顆粒及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。代表性醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑包括靜脈內注射之溶液(例如，鹽水或葡萄糖)。組成物可採用乳劑、軟膏、凝膠劑、懸浮液、或乳狀液形式。
如本文使用，「治療」包含改善性、治癒性及預防性治療。如本文使用，「患者」意指需要治療之動物，較佳哺乳動物，較佳人類。
術語「治療有效量」係指本發明化合物及治療或改善目標疾病或病狀所需要之生物活性劑(例如治療性化合物)的量。
術語「免疫有效量」係指本發明化合物及編碼引起識別免疫原(例如在病原體之情形中)之免疫反應所需要之免疫原的RNA的量。術語「免疫原」係指在引入身體中時引起免疫反應之任何物質或生物體。片語「編碼免疫原之RNA」係指在投與細胞或生物體時根據此RNA之密碼子序列能夠轉譯成多肽的多核苷酸，諸如信使RNA或複製子(例如，自身複製RNA)。
如本文使用之「增殖性疾病」意指藉由未經調控之細胞生長或複製來表徵之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型，如在此項技術中已知。在一實施例中，增殖性疾病為癌症。在一實施例中，增殖性疾病為腫瘤。在一個實施例中，增殖性疾病包括但是不限於例如液體腫瘤諸如，例如，白血病，例如，急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia；AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia；CML)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia；ALL)、多發性骨髓瘤、及慢性淋巴細胞白血病；及實體腫瘤，例如，AIDS相關癌症諸如卡波西氏肉瘤；乳腺癌；骨癌；腦癌；頭頸癌、非霍奇金淋巴瘤、腺瘤、鱗狀細胞癌、喉癌、膽囊及膽管癌、視網膜癌、食道癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、睾丸癌、子宮內膜癌、黑素瘤、結直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細胞肺癌)、胰癌、肉瘤、韋爾姆斯氏腫瘤、宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮癌、腎細胞癌、膽囊腺癌、子宮內膜肉瘤、多重抗藥性癌症。在一個實施例中，增殖性疾病包含與腫瘤血管生成相關之新血管形成、黃斑變性(例如濕性/萎縮性年齡相關黃斑變性)、角膜新血管形成、糖尿病性視網膜病、新生血管青光眼、近視性變性。在一個實施例中，增殖性疾病包括再狹窄及多囊性腎病。
如本文使用之「自體免疫疾病」意指藉由自體免疫性來表徵之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型，如在此項技術中已知。自體免疫疾病包括但不限於例如多發性硬化、糖尿病、狼瘡、硬皮病、纖維肌痛、移植排斥(例如預防同種異體移植物排斥)、惡性貧血、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、重症肌無力、紅斑狼瘡、多發性硬化、及葛瑞夫茲氏疾病。
「感染性疾病」意指與感染物諸如病毒、細菌、真菌、普里昂蛋白或寄生蟲相關之任何疾病、病症或病狀。本發明可用於主動地或被動地針對導致 感染性疾病之病原體來免疫。此類病原體之實例在下文給出。
「神經疾病」意指影響中樞或外周神經系統之任何疾病、病症、或病狀。神經疾病包括但不限於周圍或中樞神經系統之疾病或病症包括例如阿茲海默氏病、動脈瘤、腦損傷、腕骨隧道症候群、腦動脈瘤、慢性疼痛、庫賈氏病、癲癇、亨廷頓氏病、腦膜炎、癲癇發作、及其他神經疾病、病症及症候群。
「呼吸道疾病」意指影響呼吸道之任何疾病或病狀。呼吸道疾病包括但不限於例如哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease；COPD)、過敏性鼻炎、鼻竇炎、過敏症、呼吸阻礙、呼吸窘迫症候群、囊性纖維化、肺動脈高壓或血管收縮及肺氣腫。
「心血管疾病」意指影響心臟及血管之疾病或病狀。心血管疾病包括但不限於例如冠心病(coronary heart disease；CHD)、腦血管病(cerebrovascular disease；CVD)、主動脈瓣狹窄、周圍血管疾病、心肌梗塞(心臟病發作)、心律不整、局部缺血、及充血性心力衰竭。
如本文使用之「眼部疾病」意指眼睛及相關結構之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型。眼部疾病包括但不限於例如囊樣黃斑水腫、糖尿病性視網膜病、格子樣變性、視網膜靜脈阻塞、視網膜動脈阻塞、黃斑變性(例如年齡相關黃斑變性諸如濕性AMD或萎縮性AMD)、弓形體病、色素性視網膜炎、結膜裂傷、角膜裂傷、青光眼、及其類似疾病。
「代謝疾病」意指影響代謝途徑之任何疾病或病狀。代謝疾病可導致異常代謝過程，由於遺傳酶異常(天生代謝缺陷)而為先天性的或由於內分泌器官之疾病或代謝重要器官諸如肝臟之衰竭而為獲得性的。在一個實施例中，代謝疾病包含肥胖症、胰島素抵抗、及糖尿病(例如I型及/或II型糖尿病)。
「皮膚疾病」意指皮膚、真皮、或任何子結構其中諸如頭髮、毛囊等之任何疾病或病狀。皮膚疾病、病症、病狀、及性狀可包括牛皮癬、異位皮膚炎、皮膚癌諸如黑素瘤及基底細胞癌、頭髮損失、頭髮移除及色素沉著變化。
「聽覺疾病」意指聽覺系統之任何疾病或病狀，包括耳朵，諸如內耳、中耳、外耳、聽覺神經、及其中之任何子結構。聽覺疾病、病症、病狀、及性狀可包括聽力損失、耳聾、耳鳴、眩暈、平衡及運動病症。
「再生疾病」意指活體內或活體外之不充分細胞或組織產生或再生阻止損傷之前或之後的適當器官功能之建立或恢復、阻止或減緩傷口癒合或潰瘍性病灶之消退、加速老化、或阻止有效基於細胞之療法的任何疾病或病狀。術語「信使核糖核酸」(信使RNA、mRNA)係指介導將遺傳資訊傳遞至細胞質中之核糖體的核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)分子，在該等核糖體中，該分子充當蛋白合成之模板。其在轉錄過程期間自DNA模板合成。參見The American Heritage®.Dictionary of the English Language, Fourth Edition (Updated in 2009).Houghton Mifflin Company。
在真核生物中，mRNA在活體內在染色體處藉由細胞酶RNA聚合酶來轉錄。活體內轉錄期間或之後，5’帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽、或RNA m7G帽)在活體內添加至mRNA之5’末端。5’帽為經由5’-5’-三磷酸鍵來連接至第一轉錄核苷酸之末端7-甲基鳥苷殘基。另外，大多數真核mRNA分子在mRNA分子之3’末端處具有聚腺苷酸部分(「聚(A)尾區」)。在活體內，真核細胞在轉錄之後添加聚(A)尾區，經常為約250個腺苷殘基之長度(SEQ ID NO:12)。因此，典型成熟真核mRNA具有如下結構，在5’末端處以mRNA帽核苷酸開始，繼之以核苷酸之5’未轉譯區(5’UTR)，然後為開放解讀碼組，該開放解讀碼組以作為蛋白編碼序列核苷酸鹼基之AUG三聯體的起始密碼子開始，並且以可作為核苷酸鹼基之UAA、UAG、或UGA三聯體之終止密碼子結束，然後為核苷酸之3’未轉譯區(3’UTR)並且以聚腺苷尾區結束。雖然典型成熟真核mRNA之特徵在天然狀態下在真核細胞活體內產生，但是相同或在結構上及在功能上等效之特徵可在活體外使用分子生物學方法來產生。因此，具有與典型成熟真核mRNA類似之結構的任何RNA可充當mRNA並且在術語「信使核糖核酸」之範圍內。
mRNA分子通常具有使得其可囊封於本發明之脂質奈米顆粒中之大小。雖然mRNA分子之大小在天然狀態下取決於編碼特定蛋白之mRNA種類之特性而變化，但是mRNA分子之平均大小為500-10,000個鹼基之平均mRNA大小。
DNA可以至少兩種形式存在，該等形式具有不同大小。第一種形式之DNA為被稱為染色體之極大尺寸聚合物。染色體含有細胞中之許多或大多數蛋白之遺傳資訊並且亦含有細胞可藉以控制DNA分子之複製的資訊。細菌細胞可含有一或多個染色體。真核細胞通常含有一個以上細胞染色體，各染色體，
第二種形式之DNA為較短尺寸形式。第二種形式之許多DNA分子具有使得其可囊封於本發明之脂質奈米顆粒中之大小。一些此等較短形式之DNA可具有適用於編碼蛋白之大小。此等第二、較短、可用形式之DNA之實例包括質體及其他載體。對於更全面描述，參見Alberts B等人(2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Science。
質體為在實體上與細胞內之染色體DNA分開，並且可獨立地複製的小DNA分子。質體通常在活體內作為較小圓形、雙鏈DNA分子存在。在自然界中，質體帶有基因，該等基因可轉錄及轉譯成可有益於生物體之存活(例如抗生素抗性)之蛋白。在自然界中，質體可經常藉由水平基因轉移自一個生物體傳輸至另一個生物體。人工或重組質體廣泛地用於分子生物學，用於允許複製重組DNA序列及在宿主生物體內表現可用蛋白。質體大小可自約1至超過25個千鹼基對而有所不同。重組質體可重組產生以便具有使得其可囊封於本發明之脂質奈米顆粒中之大小。
在分子生物學中，載體為DNA分子，該分子用作媒介物以便在活體外將遺傳物質自一個細胞或自生化反應人工載運至另一個細胞，其中DNA可得以複製及/或表現。含有外來DNA之載體被稱為重組載體。在多種類型可用載體之中為質體及病毒載體。對於細菌細胞而言，將載體插入靶細胞中通常被稱為轉型，對於真核細胞而言被稱為轉染，但是插入病毒載體經常被稱為轉導。
病毒載體通常為帶有經修飾病毒DNA或RNA之重組病毒，該DNA或RNA已經變得非感染性，但是仍然含有病毒啟動子以及轉殖基因，由此允許經由病毒啟動子來轉譯轉殖基因。在一些實施例中，病毒載體被設計來將插入物永久併入宿主基因組中(整合)，並且由此在併入轉殖基因之後，在宿主基因組中留下獨特遺傳標誌物。病毒載體可重組產生以便具有使得其可囊封於本發明之脂質奈米顆粒中之大小。
如本文使用之術語「短干擾核酸」(siNA)係指能夠藉由以序列特異性方式介導RNA干擾(RNAi)或基因緘默來抑制或下調基因表現或病毒複製的任何核酸分子。其包括短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短干擾寡核苷酸及化學修飾短干擾核酸分子。siRNA負責RNA干擾，該干擾係動物及植物中之序列特異性轉錄後基因緘默過程。siRNA藉由核糖核酸酶III裂解自與緘默基因標靶同源或對於該標靶具有特異性之較長雙鏈RNA(dsRNA)產生。
術語「RNA干擾」(RNAi)係轉錄後、目標基因緘默技術，該技術使用RNAi劑來使含有與RNAi劑相同或極相似之序列的信使RNA(mRNA)降級。參見：Zamore及Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524；Zamore等人, 2000, Cell, 101, 25-33；Elbashir等人, 2001, Nature, 411, 494-498；及Kreutzer等人PCT公開案WO 00/44895；Fire，PCT公開案WO 99/32619；Mello及FirePCT公開案WO 01/29058；及其類似文獻。
如本文使用，RNAi與用於描述序列特異性RNA干擾之其他術語等效，諸如轉錄後基因緘默、轉譯抑制、轉錄抑制、或表現遺傳學。例如，含有本發明之脂質的調配物可與siNA分子聯合使用以便同時在轉錄後水準及/或轉錄前水準使基因得以表觀遺傳學緘默。在非限制性實例中，藉由siNA分子來調節基因表現可藉由siNA介導的經由RISC來裂解RNA(編碼或非編碼RNA)、或替代地藉由轉譯抑制來產生，如在此項技術中已知。在另一實施例中，藉由siNA來調節基因表現可由轉錄抑制產生，諸如例如Janowski等人，2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222所報道。
術語「RNAi抑制劑」為可下調(例如減少或抑制)細胞或患者中之RNA干涉功能或活性之任何分子。RNAi抑制劑可藉由與RNAi路徑之任何組分之功能相互作用或干擾該功能來下調、減少或抑制RNAi(例如RNAi介導之目標多核苷酸之裂解、轉譯抑制、或轉錄緘默)，該組分包括蛋白組分諸如RISC，或核酸組分諸如miRNA或siRNA。RNAi抑制劑可為與RISC、miRNA、或siRNA或細胞或患者中之RNAi路徑之任何其他組分之功能相互作用或干擾該功能的siNA分子、反義分子、適體、或小分子。藉由抑制RNAi(例如RNAi介導之目標多核苷酸之裂解、轉譯抑制、或轉錄緘默)，RNAi抑制劑可用於調節(例如，上調或下調)目標基因之表現。在一個實施例中，RNA抑制劑用於藉由干擾(例如減少或阻止)經由轉譯抑制、轉錄緘默，或RISC介導之多核苷酸(例如mRNA)之裂解的基因表現內源性下調或抑制來上調基因表現。藉由干擾基因表現之內源性阻遏、緘默、或抑制機制，本發明之RNAi抑制劑可因此用於上調基因表現以便治療所由功能損失產生之疾病或病狀。在本文中之各種實施例中，術語「RNAi抑制劑」可與術語「siNA」互換使用。
如本文使用之術語「酶性核酸」係指在受質結合區中具有與指定基因目標之互補性，並且亦具有用於特異性裂解目標RNA，由此使目標RNA分子失活的酶促活性的核酸分子。互補區域允許酶性核酸分子與目標RNA之足夠併合並且由此允許裂解。100%之互補性為較佳的，但是低至50-75%之互補性亦可適用於本發明(參見例如，Werner and Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann等人, 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31)。核酸可在鹼基、糖、及/或磷酸基團處經修飾。術語酶性核酸可互換使用與片語諸如核糖酶、催化RNA、酶性RNA、催化DNA、適體酶或適體結合核糖酶、可調控核糖酶、催化寡核苷酸、核酶、DNA酶、RNA酶、內切核糖核酸酶、內切核酸酶、小酶、鉛酶、寡酶或DNA酶。所有此等術語描述具有酶促活性之核酸分子。酶性核酸分子之關鍵特徵係其具有與一或多個目標核酸區域互補之特異性受質結合位點，並且其具有在該受質結合位點內或周圍之核苷酸序列，該等序列賦予該分子核酸裂解及/或連接活性(參見，例如，Cech等人，美國專利第4,987,071號；Cech等人, 1988, 260 JAMA 3030)。本發明之核酶及酶性核酸分子可化學修飾，例如，如在此項技術中及在本文中別處描述。
如本文使用之術語「反義核酸」係指藉助於RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等人，1993 Nature 365，566)相互作用來結合至目標RNA並且改變目標RNA之活性的非酶性核酸分子(關於評述，參見Stein及Cheng, 1993 Science 261, 1004及Woolf等人，美國專利第5,849,902號)。反義DNA可合成化學或經由使用單鏈DNA表現載體或其等效物來表現。本發明之反義分子可化學修飾，例如如在此項技術中描述。
如本文使用之術語「RNA酶H活化區域」係指核酸分子之區域(通常大於或等於4-25個核苷酸長度，較佳5-11個核苷酸長度)，該區域能夠結合至目標RNA以形成藉由細胞RNA酶H酶來識別之非共價複合物(參見例如，Arrow等人，美國專利第5,849,902號；Arrow等人，美國專利第5,989,912號)。RNA酶H酶結合至核酸分子-目標RNA複合物並且使目標RNA序列裂解。
如本文使用之術語「2-5A反義嵌合體」係指含有5’-磷酸化2’-5’-連接腺苷酸殘基之反義寡核苷酸。此等嵌合體以序列特異性方式結合至目標RNA並且活化細胞2-5A依賴性核糖核酸酶，該核糖核酸酶進而使目標RNA裂解(Torrence等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 1300；Silverman等人, 2000, Methods Enzymol., 313, 522-533; Player and Torrence, 1998, Pharmacol.Ther., 78, 55-113)。2-5A反義嵌合體分子可化學修飾，例如如在此項技術中描述。
如本文使用之術語「三鏈形成寡核苷酸」係指可以序列特異性方式結合至雙鏈DNA以便形成三鏈螺旋之寡核苷酸。形成此三重螺旋結構已被證明抑制目標基因之轉錄(Duval-Valentin等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 504; Fox, 2000, Curr.Med.Chem., 7, 17-37; Praseuth等人, 2000, Biochim.Biophys.Acta, 1489, 181-206)。本發明之三鏈形成寡核苷酸分子可化學修飾，例如如在此項技術中描述。
如本文使用之術語「誘餌RNA」係指被設計來優先結合至預定配體之RNA分子或適體。此結合可導致抑制或活化目標分子。誘餌RNA或適體可與天然存在之結合目標競爭以便結合特異性配體。類似地，誘餌RNA可被設計來結合至受體並且方塊結合效應分子或可被設計來結合至所關注之受體並且阻止與該受體相互作用。本發明之誘餌分子可化學修飾，例如如在此項技術中描述。
如本文使用之術語「單鏈DNA」(single stranded DNA；ssDNA)係指包含線性單鏈之天然存在或合成脫氧核糖核酸分子，例如，ssDNA可為正義或反義基因序列或EST(Expressed Sequence Tag；表現序列標籤)。
如本文使用之術語「等位酶」係指變構酶性核酸分子，包括例如美國專利第5,834,186號；第5,741,679號；第5,589,332號；第5,871,914號；及PCT公開案第WO 00/24931號、第WO 00/26226號、第WO 98/27104號、及第WO 99/29842號。
如本文使用之術語「適體」意指特異性結合至目標分子之多核苷酸組成物，其中多核苷酸具有與通常由細胞中之目標分子識別之序列不同的序列。或者，適體可為結合至目標分子之核酸分子，其中目標分子在天然狀態下不結合至核酸。目標分子可為任何所關注之分子。本發明之適體分子可化學修飾，例如如在此項技術中描述。
III. LNP組成物之醫藥調配物
對於醫藥用途，本發明之LNP組成物可腸內或非經腸途徑投與，包括靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、氣道(氣溶膠)、經口、鼻內、直腸、陰道、經頰、鼻咽部、胃腸或舌下投與。投與可為全身(例如IV)或局部(例如IM、SC、TD、鼻內、或表面)。表面投與可涉及例如導管插入、植入、滲透泵送、直接注射、皮膚/經皮應用、支架植入、滴耳劑/滴眼劑或門靜脈投與。應評定式(I)化合物之生物醫藥性質，諸如溶解度及溶液穩定性(在pH下)、滲透性等，以便選擇用於治療建議適應症之最合適劑型及投與途徑。
本發明之組成物通常但是不一定以與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑締合之調配物形式來投與。術語「賦形劑」包含除了本發明化合物、其他脂質組分及生物活性劑以外的任何成分。賦形劑可賦予該等調配物功能性(例如藥物釋放速率控制)及/或非功能性(例如加工助劑或稀釋劑)特徵。賦形劑之選擇在很大程度上取決於例如特定投與方式、賦形劑對溶解度及穩定性之影響以及劑型之性質的因素。
典型醫藥學上可接受之賦形劑包括：稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素及/或甘胺酸；潤滑劑，例如矽石、滑石、硬脂酸、其鎂或鈣鹽及/或聚乙二醇；黏合劑，例如矽酸鎂鋁、澱粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯基吡咯啶酮；崩解劑，例如澱粉、瓊脂、褐藻酸或其鈉鹽，或泡騰混合物；及/或吸收劑、著色劑、調味劑及/或甜味劑。
在一些實施例中，naLNP儲存冷凍並且在使用之前解凍。在一些實施例中，在4℃下穩定長達2週。在一些實施例中其為含有各種糖之各種冷凍保存溶液形式，以便在注射時保持冷凍。
賦形劑可為水溶液載劑，該載劑可視情況含有緩衝液(例如PBS緩衝液)及/或糖。
醫藥學上可接受之賦形劑之深入論述可在Gennaro，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 2000, 第20版 (ISBN:0683306472)中獲得。
本發明之組成物可經口投與。經口投與可涉及吞咽以使化合物進入胃腸道及/或經頰、經舌或舌下投與以使化合物直接從口腔進入血流。
本發明之組成物可非經腸投與。本發明之化合物及組成物可直接投與血流、皮下組織、肌肉、或內部器官中。用於投與之適合手段包括靜脈內投與、動脈內投與、鞘內投與、心室內投與、尿道內投與、胸骨內投與、顱內投與、肌肉內投與、滑膜內投與、及皮下投與。用於投與之適合裝置包括針型注射器，該等針型注射器包括微針注射器、無針注射器及輸注技術。
非經腸調配物通常為水性或油性溶液。當溶液為水性時，賦形劑諸如糖(包括但是不限於葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳3至9之pH)，但是，對於一些應用，其可更適當地配製為無菌非水溶液或與合適媒劑諸如無菌、無熱原水(WFI)聯合使用之乾燥形式。
非經腸調配物可包括衍生自可降解聚合物諸如聚酯(亦即聚乳酸、聚交酯、聚交酯-共-乙交酯、聚己酸內酯、聚羥基丁酸酯)、聚原酸酯及聚酐之植入物。此等調配物可經由手術切口來投與皮下組織、肌肉組織或直接投與特定器官。
在無菌條件下，例如藉由冷凍乾燥來製備非經腸調配物可容易地使用熟習此項技術者熟知之標準醫藥技術來完成。
用於製備非經腸溶液之化合物及組成物的溶解度可藉由使用合適調配技術，諸如併入共溶劑及/或溶解度增強劑諸如界面活性劑、膠束結構及環糊精來增加。
本發明之組成物可鼻內或藉由吸入來投與，通常以來自乾粉吸入器之乾粉形式(單獨，以混合物形式，例如，呈具有乳糖之乾式混合物形式，或以混合組分顆粒形式，例如，與磷脂諸如磷脂醯膽鹼混合)，以來自加壓容器、泵浦、噴霧器、霧化器(較佳使用電流體動力學來產生細微薄霧之霧化器)、或成霧器之氣溶膠噴霧劑形式，並且使用或不使用合適推進劑，諸如1,1,1,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷，或以滴鼻液形式。對於鼻內使用，該粉末可包括生物黏附劑，例如聚葡萄胺糖或環糊精。
壓力容器、泵浦、噴霧劑、霧化器、或霧化器含有本發明之化合物之溶液或懸浮液，該溶液或懸浮液包含例如用於分散、增溶、或延長本發明之組成物之釋放的乙醇、水性乙醇、或合適替代劑，作為溶劑之推進劑及視情況選用之界面活性劑，諸如山梨醇酐三油酸酯、油酸、或寡聚乳酸。
在用於乾粉或懸浮液調配物中之前，將組成物微粉化至適合於藉由吸入來遞送之大小(通常小於5微米)。此可藉由任何適當的研細方法諸如螺旋噴射碾磨、流化床噴射碾磨、形成奈米顆粒之超臨界流體加工、高壓均質化、或噴霧乾燥來實現。
用於吸入器或吹入器中之膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素製成)、泡罩及藥筒可被配製成含有本發明之化合物或組成物、合適粉末基劑諸如乳糖或澱粉及效能調節劑諸如I-白胺酸、甘露糖醇、或硬脂酸鎂之粉末混合物。乳糖可為無水的或呈一水合物形式，較佳後者。其他適合的賦形劑包括聚葡糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖及海藻糖。
吸入/鼻內投與之調配物可使用例如PGLA來來配製成即刻及/或調控釋放。調控釋放型調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放以及按程序釋放。
經皮應用之合適調配物包括治療有效量之本發明之化合物或組成物與載劑。有利載劑包括輔助穿過宿主之皮膚來傳送之可吸收藥理上可接受溶劑。特徵性地，經皮裝置呈繃帶形式，該繃帶包含背面部件、含有視情況帶有載劑之化合物之儲層、視情況之速率控制障壁層以經長時間以控制之預定速率對主體之皮膚傳遞化合物，以及將該裝置固定於皮膚之構件。
本發明之脂質組成物以許多方法中之任一者來投與，包括非經腸、靜脈內、全身、局部、經口、腫瘤內、肌肉內、皮下、腹膜內、吸入、或任何此類遞送方法。在一個實施例中，組成物非經腸投與，亦即，關節內、靜脈內、腹膜內、皮下、或肌肉內。在具體實施例中，脂質體組成物藉由靜脈內輸注或腹膜內快速濃注來投與。
本發明之脂質組成物可被配製成適合於遞送至受試者之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物經常進一步包含一或多種緩衝液(例如，中性緩衝鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水)，碳水化合物(例如、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或葡聚糖酐)，甘露糖醇，蛋白，多肽或胺基酸諸如甘胺酸，抗氧化劑，抑菌劑，螯合劑諸如EDTA或麩胱甘肽，佐劑(例如，氫氧化鋁)，使得調配物相對於接受者之血液呈等滲、低滲或稍微高滲之溶質，懸浮劑，增稠劑及/或防腐劑。或者，本發明之組成物可被配製成凍乾產物。
用於本發明中之合適調配物可發現於例如Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版(1985)中。經常，組成物包含懸浮於可接受載劑諸如水性載劑中之脂質奈米顆粒之溶液。
在一個實施例中，本發明提供包含本發明之脂質組成物及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組成物(亦即調配物)。在另一實施例中至少一種其他脂質組分存在於脂質組成物中。在另一實施例中脂質組成物呈脂質體形式。在另一實施例中脂質組成物呈脂質奈米顆粒形式。在另一實施例中脂質組成物適合於遞送至肝臟。在另一實施例中脂質組成物適合於遞送至腫瘤。在另一實施例中脂質組成物適合於局部遞送應用(眼睛、耳朵、皮膚、肺部)；遞送肌肉(i.m.)、脂肪、或皮下細胞(s.c. 給藥)。在另一實施例中生物活性劑為RNA或DNA。
對於免疫接種目的，組成物通常製備為可注射劑並且藉由注射(例如肌肉內注射)來投與。
本發明亦提供含有本發明之組成物之遞送裝置(例如，注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、皮膚貼片等)。此裝置可用於將醫藥組成物投與受試者例如人類供免疫接種。
IV. 醫藥組成物靶向之細胞及器官
本發明之化合物、組成物、方法及用途可用於將生物活性劑遞送患者中之以下各者中之一或多者：肝臟或肝臟細胞(例如肝細胞)；腎或腎細胞；腫瘤或腫瘤細胞；CNS或CNS細胞(Central Nervous System；中樞神經系統，例如大腦及/或脊髓)；PNS或PNS細胞(Central Nervous System；外周神經系統)；肺或肺細胞；血管或血管細胞；皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)；眼睛或眼睛細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)、及耳朵或耳朵細胞(例如內耳、中耳及/或外耳細胞)。
本發明之化合物、組成物、方法及用途亦可用於將生物活性劑(例如編碼免疫原之RNA)遞送至免疫系統之細胞。
在一個實施例中，本發明之化合物、組成物、方法及用途用於將生物活性劑遞送至肝臟細胞(例如肝細胞)。在一個實施例中，本發明之化合物、組成物、方法及用途用於將生物活性劑遞送至腫瘤或腫瘤細胞(例如原代腫瘤或轉移性癌細胞)。在另一實施例中，化合物、組成物、方法及用途用於將生物活性劑遞送至皮膚脂肪、肌肉及淋巴結(亦即sc給藥)。
為了將生物活性劑遞送至肝臟或肝臟細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之肝臟或肝臟細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、門靜脈注射、導管插入、支架植入)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至腎或腎細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之腎或腎細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入、支架植入)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至腫瘤或腫瘤細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之腫瘤或腫瘤細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入、支架植入)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至CNS或CNS細胞(例如大腦細胞及/或脊髓細胞)，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，本發明之組成物與患者之CNS或CNS細胞(例如大腦細胞及/或脊髓細胞)接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入、支架植入、滲透泵浦投與(例如鞘內或腦室))，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至PNS或PNS細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之PNS或PNS細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至肺或肺細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之肺或肺細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接肺部投與至肺組織及細胞)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至血管或血管細胞，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之血管或血管細胞接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如夾持、導管插入、支架植入)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接皮膚應用、電離子透入療法)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至眼睛或眼睛細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，使本發明之組成物與患者之眼睛或眼部細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下、電離子透入療法、使用滴眼劑、植入物)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑遞送至耳朵或耳朵細胞(例如內耳、中耳及/或外耳之細胞)，在一個實施例中，如在此項技術中通常已知，本發明之組成物與患者之耳朵或耳朵細胞(例如內耳、中耳及/或外耳細胞)接觸，諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射)，以便促進遞送。
為了將生物活性劑(例如編碼免疫原之RNA)遞送至免疫系統細胞(例如抗原呈遞細胞，包括專門抗原呈遞細胞)，在一個實施例中本發明之組成物肌肉內遞送，然後免疫細胞可浸潤遞送位點並且處理所遞送之RNA。此類免疫細胞可包括巨噬細胞(例如骨髓衍生巨噬細胞)，樹突狀細胞(例如骨髓衍生漿細胞樣樹突狀細胞及/或骨髓衍生骨髓性樹突狀細胞)，單核球(例如人類外周血單核球)等(例如參見WO2012/006372)。
V. 根據本發明之免疫接種
對於免疫接種目的，在一些實施例中，本發明涵蓋遞送編碼免疫原之mRNA。免疫原引起識別免疫原之免疫反應，並且因此可用於提供針對病原體、或針對過敏原、或針對腫瘤抗原之免疫力。針對由病原體造成之疾病及/或感染之免疫接種為較佳的。
在某些實施例中naLNP具有輔助特性。例如，本文揭示之naLNP可具有特異性T濾泡性協助細胞輔助活性，該活性導致有效抗體反應。當與蛋白亞單位抗原一起遞送時，不對稱可電離脂質LNP可充當強烈Th2偏性佐劑。在一些實施例中，本文揭示之naLNP mRNA疫苗驅動Tfh偏性反應，該反應刺激Tfh及生髮中心B細胞之增殖及有效持久中和抗體反應。
RNA與本發明之脂質組成物(例如配製成LNP)一起遞送。在一些實施例中，本發明利用其中囊封有免疫原編碼RNA的脂質體。囊封於LNP內可保護RNA免於RNA酶消化。囊封效率不必為100%。存在外部RNA分子(例如在脂質體之外表面上)或「裸」RNA分子(不與LNP締合之RNA分子)為可接受的。較佳地，對於包含脂質體及RNA分子之組成物，至少一半RNA分子(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%之RNA分子)囊封於naLNP中。
RNA分子亦可與LNP複合。例如，脂質不必要僅形成脂質體(具有水性核心)。一些脂質奈米顆粒可包含脂質核心(例如，組成物可包含具有脂質核心的脂質體與奈米顆粒之混合物)。在此等情況下，藉由非共價相互作用(例如，帶負電荷之RNA與陽離子脂質之間的離子相互作用)，RNA分子可藉由具有水性核心之LNP來囊封，並且與具有脂質核心之LNP複合。藉由LNP(不論具有脂質或水性核心)來囊封及複合可保護RNA免於RNA酶消化。囊封/複合效率不必為100%。存在「裸」RNA分子(不與脂質體締合之RNA分子)為可接受的。較佳地，對於包含LNP群體及RNA分子群體之組成物，至少一半群體之RNA分子(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%之RNA分子)囊封於LNP中，或與LNP複合。
VI. 醫藥組成物中之RNA分子
活體內投與免疫接種組成物之後，所遞送RNA釋放並且在細胞內部轉譯以便原位提供免疫原。在某些實施例中，RNA為正(「+」)鏈的，以使得其可在不需要任何介入複製步驟諸如反轉錄的情況下由細胞來轉譯。其亦可結合至由免疫細胞表現之TLR7受體，由此引發輔助效應。另外，或替代地，RNA可結合其他受體諸如RIG I、MDA5、或RIG I及MDA5。
在某些實施例中，RNA為自身複製RNA。自身複製RNA分子(複製子)可在遞送至甚至沒有任何蛋白之脊椎動物細胞時，導致藉由自身轉錄(經由其自身產生之反義複本)來產生多個子系RNA。因此，在某些實施例中，自身複製RNA分子為可在遞送至細胞之後直接轉譯之(+)鏈分子，並且此轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，該酶然後自所遞送RNA產生反義及正義轉錄物兩者。因此，所遞送RNA導致產生多個子系RNA。此等子系RNA，以及共線的亞基因組轉錄物，可自己轉譯以便提供所編碼免疫原之原位表現，或可轉錄以便提供具有與所遞送RNA相同之意義之進一步轉錄物，該等轉錄物經轉譯以便提供免疫原之原位表現。此系列轉錄之總體結果係所引入複製子RNA之數目之巨大擴增並且因此所編碼免疫原變成宿主細胞之主要多肽產物。
一種達成自身複製之合適系統係使用基於之α病毒之RNA複製子。此等(+)鏈複製子在遞送至細胞之後轉譯以便給出複製酶(或複製酶-轉錄酶)。複製酶轉譯為多聚蛋白，該多聚蛋白自動裂解以便提供複製複合物，該複合物產生(+)鏈所遞送RNA之基因組(-)鏈複本。此等(-)鏈轉錄物可自己轉錄以便給出+鏈母體RNA之進一步複本並且亦給出編碼免疫原之亞基因組轉錄物。因此，亞基因組轉錄物之轉譯導致免疫原藉由感染細胞之原位表現。合適α病毒複製子可使用來自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、東方馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒等之複製酶。可使用突變型或野生型病毒序列，例如VEEV之減毒TC83突變體已用於複製子中。
因此，較佳自身複製RNA分子編碼(i)可從自身複製RNA分子來轉錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶及(ii)免疫原。聚合酶可為α病毒複製酶，例如包含α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3及nsP4中之一或多者。
雖然除了非結構性複製酶多聚蛋白以外，天然α病毒基因組編碼結構性病毒粒子蛋白，但是在具體實施例中，本發明之自身複製RNA分子不編碼α病毒結構性蛋白。因此特定自身複製RNA可導致在細胞中產生自身的基因組RNA複本，但是不產生含有RNA之病毒粒子。不能產生此等病毒顆粒意味著，不同於野生型α病毒，自身複製RNA分子不能自身以傳染性形式永存。在野生型病毒中永存化必不可少的α病毒結構性蛋白不存在於本發明之自身複製RNA中，並且其位置由編碼所關注免疫原之基因代替，以使得亞基因組轉錄物編碼免疫原而非結構性α病毒病毒粒子蛋白。
因此適用於本發明之自身複製RNA分子可具有兩個開放解讀碼組。一個開放解讀碼組編碼複製酶，例如，第一(5’)開放解讀碼組；另一個開放解讀碼組編碼免疫原，例如，第二(3’)開放解讀碼組。在一些實施例中RNA可具有額外(例如，下游)開放解讀碼組，例如，以便編碼進一步免疫原(參見下文)或編碼附屬多肽。
自身複製RNA分子可具有與所編碼複製酶相容之5’序列。
自身複製RNA分子可具有不同長度，但是其通常為5000-25000個核苷酸之長度，例如，8000-15000個核苷酸，或9000-12000個核苷酸。因此，該RNA比siRNA或習知mRNA遞送中發現之RNA更長。在一些實施例中，自身複製RNA大於約2000個核苷酸，諸如大於約：9000、12000、15000、18000、21000、24000、或更多個核苷酸之長度。
RNA分子可具有5’帽(例如，7-甲基鳥苷)。此帽可增強RNA之活體內轉譯。
適用於本發明之RNA分子之5’核苷酸可具有5’三磷酸基團。在加帽RNA中，此可經由5’-至-5’橋來連接至7-甲基鳥苷。5’三磷酸可增強RIG-I結合並且由此促進輔助效應。
RNA分子可具有3’聚腺苷酸尾區。其亦可包括接近其3’末端之聚腺苷酸聚合酶識別序列(例如，AAUAAA)。
出於免疫接種目的，適用於本發明之RNA分子通常為單鏈。單鏈RNA可通常藉由結合至TLR7、TLR8、RNA解旋酶及/或PKR來引發輔助效應。以雙鏈形式(dsRNA)遞送之RNA可結合至TLR3，並且此受體亦可藉由在單鏈RNA複製期間或在單鏈RNA之次級結構內形成之dsRNA來觸發。
出於免疫接種目的之RNA分子可藉由活體外轉錄(in vitro transcription；IVT)來便利地製備。IVT可使用在細菌中以質體形式產生並且增殖，或(例如藉由基因合成及/或聚合酶鏈反應(polymerase chain-reaction；PCR)工程化方法)來合成產生的(cDNA)模板。例如，DNA依賴性RNA聚合酶(諸如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用於自DNA模板轉錄RNA。適當加帽及聚腺苷酸加成反應可根據需要來使用(但是複製子之聚腺苷酸通常在DNA模板內編碼)。此等RNA聚合酶可具有轉錄5’核苷酸之嚴格要求並且在一些實施例中此等要求必須與所編碼複製酶之要求匹配，以便確保IVT轉錄RNA可作為其自身編碼複製酶之受質來有效地起作用。
如WO2011/005799中論述，自身複製RNA可包括(除了任何5’帽結構以外)一或多個具有修飾核苷鹼基之核苷酸。例如，自身複製RNA可包括一或多個修飾嘧啶核鹼基，諸如假尿苷及/或5甲基胞嘧啶殘基。然而，在一些實施例中，RNA不包含修飾核鹼基，並且可不包括修飾核苷酸，亦即RNA中之所有核苷酸為標準A、C、G及U核糖核苷酸(除了可包括7’甲基鳥苷之任何5’帽結構)。在其他實施例中，RNA可包括包含7’甲基鳥苷之5’帽，並且前1、2或3個5’核糖核苷酸可在核糖之2’位置處甲基化。
出於免疫接種目的用於本發明之RNA理想地僅包含核苷之間的磷酸二酯鍵，但是在一些實施例中其可含有胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、及/或甲基膦酸酯鍵。
本發明包含多個RNA種類與藉由本發明提供之脂質組成物一起配製的實施例，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種類之RNA，包括不同類別之RNA(諸如mRNA、siRNA、自身複製RNA、及其組合)。
VII. 免疫原
在一些實施例中，出於免疫接種目的而用於本發明之RNA分子編碼多肽免疫原。在此等實施例中，在投與之後，RNA在活體內轉譯並且免疫原可在接受者中引起免疫反應。免疫原可引起針對病原體(例如，細菌、病毒、真菌或寄生蟲)之免疫反應，但是在一些實施例中，其引起針對過敏原或腫瘤抗原之免疫反應。免疫反應可包含抗體反應(通常包括IgG)及/或細胞介導免疫反應。多肽免疫原通常引起識別相應病原體(或過敏原或腫瘤)多肽之免疫反應，但是在一些實施例中多肽可充當模擬表位以便引起識別醣之免疫反應。免疫原通常為表面多肽例如黏附素、血球凝聚素、包膜醣蛋白、刺突醣蛋白等。
RNA分子可編碼單一多肽免疫原或多個多肽。多次免疫原可呈現為單一多肽免疫原(融合多肽)或作為單獨多肽。若免疫原表現為來自mRNA之單獨多肽，則此等多肽中之一或多者可具有上游IRES或額外病毒啟動子元件。或者，多個免疫原可自多聚蛋白表現，該多聚蛋白編碼融合至短自身催化蛋白酶(例如，口蹄病病毒2A蛋白)之個別免疫原，或表現為內含肽。
在某些實施例中，多肽免疫原(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個免疫原)可單獨或與編碼一或多個免疫原(如多肽免疫原相同或不同)之RNA分子諸如自身複製RNA一起使用。
在一些實施例中，免疫原引起針對此等細菌中之一者的免疫反應：
腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)：可用免疫原包括但不限於膜蛋白諸如黏附素、自動轉運蛋白、毒素、鐵獲取蛋白、及因子H結合蛋白。三個可用多肽之組合揭示於Giuliani等人(2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(29):10834-9中。
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)：可用多肽免疫原揭示於WO2009/016515中。此等免疫原包括但不限於RrgB纖毛亞單位、β-N-乙醯基-己醣胺酶前驅物(spr0057)、spr0096、通用應激蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、絲胺酸/蘇胺酸激酶StkP(SP1732)、及肺炎球菌表面黏附素PsaA。
化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)：可用免疫原包括但不限於WO02/34771及WO2005/032582揭示之多肽。
卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis).
百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis)：可用百日咳免疫原包括但不限於百日咳毒素或類毒素(pertussis toxin；PT)、絲狀血凝素(filamentous haemagglutinin；FHA)、百合素、及凝集原2及3。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：可用免疫原包括但不限於WO2010/119343揭示之多肽，諸如溶血素、esxA、esxB、含鐵色素結合蛋白(sta006)及/或sta011脂蛋白。
破傷風梭菌(Clostridium tetani)：典型免疫原為破傷風類毒素。
白喉棒狀桿菌(Cornynebacterium diphtheriae)：典型免疫原為白喉類毒素。
流感嗜血桿菌：可用免疫原包括但不限於WO2006/110413及WO2005/111066揭示之多肽。
綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)：可用免疫原包括但不限於WO02/34771揭示之多肽。
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)：可用免疫原包括但不限於PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH樣、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA及MurG(例如，如WO2005/002619所揭示)。LcrE(WO2006/138004)及HtrA(WO2009/109860)為兩種較佳免疫原。
肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)：可用免疫原包括但不限於WO02/02606揭示之多肽。
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)：可用免疫原包括但不限於CagA、VacA、NAP、及/或尿素酶(WO03/018054)。
大腸桿菌(Escherichia coli)：可用免疫原包括但不限於衍生自產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic E. coli；ETEC)、腸聚集大腸桿菌(enteroaggregative E. coli；EAggEC)、廣泛黏附大腸桿菌(diffusely adhering E. coli；DAEC)、腸致病性E大腸桿菌(enteropathogenic E coli；EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic E. coli；ExPEC)及/或腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E. coli；EHEC)的免疫原。ExPEC菌株包括尿路致病性大腸桿菌(uropathogenic E. coli；UPEC)及腦膜炎/膿毒症相關大腸桿菌(meningitis/sepsis-associated E. coli；MNEC)。可用UPEC免疫原在WO2006/091517及WO2008/020330中揭示。可用MNEC免疫原在WO2006/089264中揭示。若干大腸桿菌類型之可用免疫原為AcfD(WO2009/104092)。
炭疽桿菌(Bacillus anthracis)
鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)：可用免疫原包括但不限於WO2007/049155及WO2009/031043揭示之免疫原。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)
產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)
伯納特氏柯克斯氏體(Coxiella burnetiid)
布魯氏菌，諸如流產布魯氏菌(B. abortus)、犬布魯氏菌(B. canis)、馬爾他布魯氏菌(B. melitensis)、林鼠布魯氏菌(B. neotomae)、羊布魯氏菌(B. ovis)、豬布魯氏菌(B. suis)、鰭足科布魯氏菌(B. pinnipediae)。
弗朗西斯氏菌，諸如新兇手弗朗西斯氏菌(F. novicida)、蜃樓弗朗西斯氏菌(F. philomiragia)、土拉弗朗西斯氏菌(F. tularensis)
淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)
蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)
杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)
糞腸球菌(Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)
腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)
小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)
立克次體(Rickettsia)
單核細胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)
傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)
伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)
牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)
克雷伯氏菌(Klebsiella)
在一些實施例中，免疫原引起針對此等病毒中之一者的免疫反應：
正黏病毒(Orthomyxovirus)：可用免疫原可來自A型、B型或C型流感病毒，諸如血球凝聚素、神經胺酸酶或基質M2蛋白。當免疫原為A型流感病毒血球凝聚素時，其可來自任何亞型例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。
副黏病毒科病毒：免疫原包括但不限於衍生自肺病毒(例如，呼吸道合胞體病毒，RSV)，風疹病毒(例如，流行性腮腺炎病毒)，副黏病毒(例如，副流感病毒)，偏肺病毒及麻疹病毒(例如，麻疹病毒)之免疫原。
痘病毒科：免疫原包括但不限於衍生自正痘病毒諸如天花病毒(Variola vera)，包括但不限於，重型天花(Variola major)及輕型天花(Variola minor)之免疫原。
小核糖核酸病毒：免疫原包括但不限於衍生自小核糖核酸病毒，諸如腸道病毒、鼻病毒、肝病毒、心臟病毒及口瘡病毒之免疫原。在一個實施例中，腸病毒為脊髓灰質炎病毒例如，1型、2型及/或3型脊髓灰質炎病毒。在另一實施例中，腸病毒為EV71腸病毒。在另一實施例中，腸病毒為柯薩奇A或B病毒。
布尼亞病毒：免疫原包括但不限於衍生自正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)，諸如加利福尼亞腦炎病毒(California encephalitis virus)，靜脈病毒諸如裂谷熱病毒，或內羅病毒(Nairovirus)，諸如克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)之免疫原。
肝RNA病毒：免疫原包括但不限於衍生自肝RNA病毒，諸如A型肝炎病毒(hepatitis A virus；HAV)之免疫原。
絲狀病毒：免疫原包括但不限於衍生自絲狀病毒，諸如埃博拉病毒(Ebola virus)(包括紮伊爾(Zaire)、象牙海岸(Ivory Coast)、萊斯頓(Reston)或蘇丹(Sudan)埃博拉病毒)或馬堡病毒(Marburg virus)之免疫原。
披膜病毒：免疫原包括但不限於衍生自披膜病毒，諸如紅病毒、α病毒、或動脈炎病毒之免疫原。此包含風疹病毒。
黃病毒：免疫原包括但不限於衍生自黃病毒，諸如蜱傳播腦炎(Tick-borne encephalitis；TBE)病毒、登革熱(1型、2型、3型或4型)病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒(Kyasanur Forest Virus)、西尼羅河腦炎病毒(West Nile encephalitis virus)、聖路易斯腦炎病毒(St. Louis encephalitis virus)、俄羅斯春夏腦炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus)、波瓦桑腦炎病毒(Powassan encephalitis virus)之免疫原。
瘟病毒：免疫原包括但不限於衍生自瘟病毒，諸如牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea；BVDV)，古典豬疫(Classical swine fever；CSFV)或邊界疾病(Border disease；BDV)之免疫原。
肝DNA病毒：免疫原包括但不限於衍生自肝DNA病毒，諸如B型肝炎病毒之免疫原。組成物可包括B型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen；HBsAg)。
其他肝炎病毒：組成物可包括來自C型肝炎病毒、δ肝炎病毒、E型肝炎病毒、或G型肝炎病毒之免疫原。
棒狀病毒：免疫原包括但不限於衍生自棒狀病毒，諸如狂犬病毒(例如，狂犬病病毒)及水泡病毒(Vesiculovirus；VSV)之免疫原。
杯狀病毒科：免疫原包括但不限於衍生自杯狀病毒科，諸如諾沃克病毒(Norwalk virus)(諾如病毒(Norovirus))，及諾沃克樣病毒，諸如夏威夷病毒(Hawaii Virus)及雪山病毒之免疫原。
新冠病毒：免疫原包括但不限於衍生自COVID-19、SARS冠狀病毒、鳥類感染性支氣管炎(infectious bronchitis；IBV)、小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus；MHV)、SARS、MERS、及豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus；TGEV)之免疫原。另外，可使用來自具有大流行性潛能之蝙蝠及穿山甲冠狀病毒的免疫原。冠狀病毒免疫原可為刺突多肽或其他病毒蛋白。特定新冠病毒抗原決定基在Shrock等人，Science，2020年9月29日中全面地分析及描述，該文獻以引用方式併入本文。
逆轉錄病毒：免疫原包括但不限於衍生自癌病毒、慢病毒(例如，HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒之免疫原。
呼腸孤病毒：免疫原包括但不限於衍生自正腸病毒、輪狀病毒、環狀病毒、或科羅病毒(Coltivirus)之免疫原。
細小病毒：免疫原包括但不限於衍生自細小病毒B19之免疫原。
疱疹病毒：免疫原包括但不限於衍生自人類疱疹病毒，諸如，僅作為舉例，單純性疱疹病毒(Herpes Simplex Virus；HSV)(例如，HSV 1型及2型)、水痘-帶狀疱疹病毒(Varicella-zoster virus；VZV)、Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus；EBV)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus；CMV)、人類疱疹病毒6(Human Herpesvirus 6；HHV6)、人類疱疹病毒7(Human Herpesvirus 7；HHV7)、及人類疱疹病毒8(Human Herpesvirus 8；HHV8)之免疫原。
乳多空病毒：免疫原包括但不限於衍生自乳頭瘤病毒及多瘤病毒之免疫原。(人類)乳頭瘤病毒可為血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65例如，來自血清型6、11、16及/或18中之一或多者。
腺病毒：免疫原包括衍生自血清型36(Ad-36)之免疫原。
在一些實施例中，免疫原引起針對感染魚之病毒之免疫反應，諸如：感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus；ISAV)、鮭魚胰腺疾病病毒(salmon pancreatic disease virus；SPDV)、感染性胰腺壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus；IPNV)、斑點叉尾鮰病毒(channel catfish virus；CCV)、魚淋巴囊腫疾病病毒(fish lymphocystis disease virus；FLDV)、感染性造血壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus；IHNV)、koi疱疹病毒、鮭魚微小核糖核酸病毒科樣病毒(亦稱為大西洋鮭魚之微小核糖核酸病毒科樣病毒)、陸封鮭魚病毒(landlocked salmon virus；LSV)、大西洋鮭魚輪狀病毒(atlantic salmon rotavirus；ASR)、鱒魚草莓疾病病毒(trout strawberry disease virus；TSD)、銀鮭魚瘤病毒(coho salmon tumor virus；CSTV)、或病毒出血性敗血病病毒(viral hemorrhagic septicemia virus；VHSV)。
真菌免疫原可衍生自皮膚癬菌，包括：絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccusum)、奧杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、 斜小孢子菌(Microsporum distortum)、馬小孢子菌(Microsporum equinum)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypsum)、矮小孢子菌(Microsporum nanum)、同心毛癬菌(Trichophyton concentricum)、馬毛癬菌(Trichophyton equinum)、雞毛癬菌(Trichophyton gallinae)、石膏樣毛癬菌(Trichophyton gypseum)、麥格甯毛癬菌(Trichophyton megnini)、須毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、Trichophyton quinckeanum、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭毛癬菌(Trichophyton schoenleini)、斷發毛癬菌(Trichophyton tonsurans)、疣狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、疣狀毛癬菌(T. verrucosum) var. album、盤狀毛癬菌(var. discoides)、淡黃毛癬菌(var. ochraceum)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)、及/或 Trichophyton faviforme；或來自菸麯黴(Aspergillus fumigatus)、黃麴黴(Aspergillus flavus)、黑麯黴(Aspergillus niger)、構巢麯黴(Aspergillus nidulans)、土麯黴(Aspergillus terreus)、薩氏麯黴(Aspergillus sydowii)、黃麴黴(Aspergillus flavatus)、灰綠麯黴(Aspergillus glaucus)、頭狀裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、念珠菌烯醇酶(Candida enolase)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克魯斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、星狀念珠菌(Candida stellatoidea)、克魯斯念珠菌(Candida kusei)、Candida parakwsei、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、擬熱帶念珠菌(Candida pseudotropicalis)、吉利蒙氏念珠菌(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢黴(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地絲菌(Geotrichum clavatum)、夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子蟲(Microsporidia)、腦胞內原蟲屬(Encephalitozoon spp.)、腸道微孢子蟲(Septata intestinalis)及比氏腸胞蟲 (Enterocytozoon bieneusi)；不太常見者為Brachiola spp、微孢子蟲屬(Microsporidium spp.)、微粒子蟲屬(Nosema spp.)、更新菌屬(Pleistophora spp.)、氣管更新菌屬(Trachipleistophora spp.)、Vittaforma spp 巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、萎凋腐黴(Pythiumn insidiosum)、卵狀糠秕孢子菌(Pityrosporum ovale)、釀酒酵母 (Sacharomyces cerevisae)、鮑氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端賽多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、馬爾尼菲青黴菌(Penicillium marneffei)、馬拉色氏黴菌屬(Malassezia spp.)、著色真菌屬(Fonsecaea spp.)、萬氏黴(Wangiella spp.)、孢子絲菌(Sporothrix spp.)、蛙糞黴屬(Basidiobolus spp.)、耳黴屬(Conidiobolus spp.)、根黴屬(Rhizopus spp)、毛黴(Mucor spp)、犁頭黴(Absidia spp)、被孢黴屬(Mortierella spp)、小克銀漢黴(Cunninghamella spp)、瓶黴屬(Saksenaea spp.)、鏈格孢(Alternaria spp)、彎孢(Curvularia spp)、長蠕孢菌(Helminthosporium spp)、鐮刀菌(Fusarium spp)、麯黴屬(Aspergillus spp)、青黴(Penicillium spp)、鏈核盤菌屬(Monolinia spp)、絲核菌(Rhizoctonia spp)、擬青黴屬(Paecilomyces spp)、木黴屬(Pithomyces spp)、及枝孢菌(Cladosporium spp.)。
在一些實施例中，免疫原引起針對來自瘧原蟲屬(Plasmodium)，諸如惡性瘧原蟲(P. falciparum)、間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malariae)或卵形瘧原蟲(P. ovale)之寄生蟲的免疫反應。因此本發明可用於針對瘧疾來免疫。在一些實施例中，免疫原引起針對來自魚虱科(Caligidae)之寄生蟲的免疫反應，尤其來自瘡痂魚虱屬(Lepeophtheirus)及魚虱屬(Lepeophtheirus)例如海虱諸如鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirus salmonis)或羅傑克雷塞伊魚虱(Caligus rogercresseyi)之寄生蟲。
在一些實施例中，免疫原引起針對以下各者之免疫反應：花粉過敏原(樹木、藥草、野草、及禾草花粉過敏原)；昆蟲或節肢動物過敏原(吸入物、唾液及毒液過敏原，例如，蟎過敏原、蟑螂及蠓過敏原、膜翅目(hymenopthera)毒液過敏原)；動物毛髮及皮屑過敏原(例如，來自犬、貓、馬、大鼠、小鼠等)；及食物過敏原(例如，麩朊)。來自樹木、禾草及藥草之重要花粉過敏原為來源於分類學山毛櫸目(Fagales)、木犀目(Oleales)、松目(Pinales)及懸鈴朩科(platanaceae)之過敏原，包括但不限於樺樹(樺屬(Betula))、赤楊(榿木屬(Alnus))、榛樹(榛屬(Corylus))、角樹(鵝耳櫪屬(Carpinus))及橄欖樹(木犀欖屬(Olea))、雪松(柳杉屬(Cryptomeria)及刺柏屬(Juniperus))、懸鈴樹(懸鈴木屬(Platanus))、禾本目(Poales)，包括黑麥草屬(Lolium)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、絨毛草屬(Holcus)、虉草屬(Phalaris)、黑麥屬(Secale)、及高粱屬(Sorghum)之禾草，菊目(Asterales)及蕁麻目(Urticales)，包括琢草屬(Urticales )、蒿屬(Artemisia)、及牆草屬(Parietaria)之藥草。其他重要吸入過敏原為來自嗜皮蟎屬(Dermatophagoides)及嗜黴蟎屬(Euroglyphus)之屋塵蟎，貯藏蟎例如嗜鱗蟎屬(Lepidoglyphys)、嗜甜蟎屬(Glycyphagus)及腐食蟎屬(Tyrophagus)之過敏原，來自蟑螂、蠓及跳蚤例如小蠊屬(Blatella)、大蠊屬(Periplaneta)、搖蚊屬(Chironomus)及櫛首蚤屬(Ctenocepphalides)之過敏原，及來自哺乳動物諸如貓、犬及馬之過敏原，毒液過敏原包括來源於針刺或叮咬昆蟲之過敏原，諸如來自分類學膜翅目包括蜜蜂(蜜蜂科(Ctenocepphalides))、黃蜂(胡蜂科(Vespidea))、及螞蟻(蟻科(Formicoidae))之過敏原。
在一些實施例中，免疫原腫瘤抗原選自：(a)癌症-睾丸抗原諸如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE及MAGE家族多肽，例如，GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、及MAGE-12(該等抗原可用於例如解決黑素瘤、肺、頭及頸、NSCLC、乳腺、胃腸、及膀胱腫瘤；(b)突變抗原，例如，p53(與各種實體腫瘤例如結直腸、肺、頭及頸癌相關)，p21/Ras(與例如黑素瘤、胰癌及結直腸癌相關)，CDK4(與例如黑素瘤相關)，MUM1(與例如黑素瘤相關)，半胱天冬酶-8(與例如頭及頸癌相關)，CIA 0205 (與例如膀胱癌相關)，HLA-A2-R1701，β連環蛋白(與例如黑素瘤相關)，TCR (與例如T-細胞非霍奇金淋巴瘤相關)，BCR-abl (與例如慢性髓性白血病相關)，磷酸丙糖異構酶，KIA 0205，CDC-27，及LDLR-FUT；(c)過度表現之抗原，例如，半乳糖蛋白4 (與例如結直腸癌相關)，半乳糖蛋白9 (與例如霍奇金疾病相關)，蛋白酶3 (與例如慢性髓性白血病相關)，VVT 1 (與例如各種白血病相關)，碳酸酐酶(與例如腎癌相關)，醛縮酶A(與例如肺相關癌)，PRAME(與例如黑素瘤相關)，HER-2/neu(與例如乳腺、結腸、肺及卵巢癌相關)，乳房珠蛋白，α-胎蛋白(與例如肝癌相關)，KSA(與例如結直腸癌相關)，胃泌素(與例如胰腺及胃癌相關)，端粒酶催化蛋白，MUC-1(與例如乳腺及卵巢癌相關)，G-250(與例如腎細胞癌相關)，p53(與例如乳腺、結腸癌相關)，及癌胚抗原(與例如乳腺癌、肺癌、及胃腸道癌症諸如結直腸癌相關)；(d)共用抗原，例如，黑素瘤-黑素細胞分化抗原諸如MART-1/Melan A、gp 100、MC1R、黑素細胞刺激激素受體、酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白-1/TRP1及酪胺酸酶相關蛋白-2/TRP2(與例如黑素瘤相關)；(e)前列腺相關抗原諸如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，與例如前列腺癌相關；(f)免疫球蛋白獨特型(與例如骨髓瘤及B細胞淋巴瘤相關)。在某些實施例中，腫瘤免疫原包括但不限於p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus；HPV)抗原包括E6及E7、B型及C型肝炎病毒抗原、人類T-細胞嗜淋巴細胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68KP1、CO-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合蛋白/親環蛋白C相關蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、及其類似物。
VIII. 疫苗組成物
本發明之醫藥組成物，尤其適用於免疫接種之組成物，可包括一或多種小分子免疫增強劑。例如，組成物可包括TLR2促效劑(例如，Pam3CSK4)，TLR4促效劑(例如，胺基烷基胺基葡糖苷磷酸，諸如E6020)，TLR7促效劑(例如，咪喹莫特(imiquimod))，TLR8促效劑(例如，雷喹莫特(resiquimod))及/或TLR9促效劑(例如，IC31)。任何此類促效劑理想地具有＜2000 Da之分子量。此類促效劑可在一些實施例中與RNA一起囊封在LNP內部，或藉由LNP來囊封或複合，但是在其他實施例中其未囊封或未複合。在一些實施例中，佐劑為例如：montanide ISA-51(Seppic Inc., Fairfield, N.J., United States of America)；QS-21(Aquila Biopharmaceuticals.Inc., Framingham, 大規模., 美國); Arlacel A; 油酸; 破傷風 輔助 肽 (諸如但不限於 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:2376)及/或AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:2377)；GM-CSF；環磷醯胺；卡介苗(bacillus Calmette-Guerin；BCG)；小型棒狀桿菌；左旋咪唑(levamisole)，阿齊美宗(azimezone)；異普利松(isoprinisone)；二硝基氯苯(dinitrochlorobenezene；DNCB)；匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin；KLH)； 弗氏佐劑(完全及不完全)；礦物凝膠；氫氧化鋁(明礬)；溶血卵磷脂；複合多元醇；聚陰離子；肽；油乳液；核酸(諸如但不限於可溶性鏈RNA；dsRNA)二硝基酚；白喉毒素(diphtheria toxin；DT)；toll樣受體(TLR；諸如但不限於TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、及/或TLR9)促效劑(包括但不限於內毒素諸如脂多醣(lipopolysaccharide；LPS)；單磷醯脂質A (monophosphoryl lipid A；MPL)；及/或聚肌苷-聚胞苷酸(聚-ICLC/HILTONOL.RTM.; Oncovir, Inc., Washington, D.C., United States of America)；IMO-2055；吡喃葡萄糖基脂質A (glucopyranosyl lipid A；GLA)；QS-21(自亦稱為皂莢樹或皂樹之皂皮樹之樹皮萃取的皂角苷)；雷喹莫特(TLR7/8促效劑)；CDX-1401(由連接至NY-ESO-1腫瘤抗原之具有對於樹突狀細胞受體DEC-205之特異性之完全人類單株抗體組成的融合蛋白)；Juvaris陽離子脂質-DNA複合物；Vaxfectin；及其組合。在一個實施例中，使用衍生自明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)R595之異質單磷醯脂質A (MPL)的佐劑用於誘導對於動物及人類疫苗中之異源蛋白的Th-1型免疫反應。示例性單磷醯脂質A型佐劑展示如下：
Figure 02_image061
本發明之醫藥組成物可具有約或至少100、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 mOsm/kg之滲透壓。在一些實施例中，滲透壓在約200 mOsm/kg與400 mOsm/kg之間，例如，約240-360 mOsm/kg之間，或約290-310 mOsm/kg之間。
本發明之醫藥組成物可包括一或多種防腐劑，諸如硫柳汞或2苯氧乙醇。可產生無汞組成物並且可製備無防腐劑疫苗。
組成物包含免疫有效量之本文所述脂質組成物(例如，脂質體及LNP)，以及如需要之任何其他組分。免疫學有效量係指以單一劑量或作為一系列劑量之一部分可有效用於治療(例如，針對病原體之預防性免疫反應)的投與個體之量。此量取決於以下各者而變化：待治療之個體之健康及身體狀況、年齡、待治療之個體之分類學群組(例如，非人類靈長類動物、靈長類動物等)、個體之免疫系統合成抗體之能力、所需保護度、疫苗之調配物、治療醫生對於醫療狀況之評定、及其他相關因素。預期該量落於可經由常規試驗來決定之相對廣泛範圍中。本發明之組成物通常根據每劑量之RNA之量來表示。較佳劑量具有100 μg RNA (例如，10-100 μg，諸如約10 μg、25 μg、50 μg、75 μg或100 μg)，但是可在低得多之水準例如1 μg/劑量、100 ng/劑量、10 ng/劑量、1 ng/劑量等下觀察到表現。
本發明亦提供含有本發明之醫藥組成物之遞送裝置(例如，注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、皮膚貼片等)。此裝置可用於將組成物投與脊椎動物受試者。
治療方法及醫療用途
本文所述之LNP配製RNA及醫藥組成物在活體內用於誘導針對所關注免疫原之免疫反應。
本發明提供誘導脊椎動物之免疫反應之方法，包括投與有效量之如本文描述之脂質體配製或LNP配製RNA、或醫藥組成物。免疫反應較佳為保護性的並且較佳涉及抗體及/或細胞介導免疫力。組成物可用於敏化及補強目的兩者。或者，敏化-補強免疫接種時程可為RNA及相應多肽抗原之混合(例如，RNA敏化、蛋白補強)。
本發明亦提供用於誘導脊椎動物之免疫反應之脂質體、LNP、或醫藥組成物。本發明亦提供脂質體、LNP、或醫藥組成物在製造供誘導脊椎動物之免疫反應之藥物中之用途。
藉由此等用途及方法來誘導脊椎動物之免疫反應，可保護脊椎動物以便避免各種疾病及/或感染例如避免如以上論述之細菌及/或病毒疾病。脂質體、LNP、及組成物為免疫原性的，並且更佳為疫苗組成物。根據本發明之疫苗可為預防性的(亦即，預防感染)或治療性的(亦即，治療感染)但是通常為預防性的。
脊椎動物較佳為哺乳動物，諸如人類或較大獸醫學哺乳動物(例如，馬、牛、鹿、山羊、豬)。如本文使用，「較大哺乳動物」係指具有至少5 kg，較佳至少7 kg之典型或平均成年重量的哺乳動物。此類較大哺乳動物可包括例如人類、非人類靈長類動物、犬、豬、牛、鹿、山羊，並且意欲排除較小哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、豚鼠、及其他齧齒動物。
當疫苗用於預防性用途時，人類較佳為兒童(例如，幼兒或嬰兒)或青少年；當疫苗用於治療性用途時，人類較佳為青少年或成人。意欲用於兒童之疫苗亦可投與成人例如以便評估安全性、劑量、免疫原性等。
根據本發明製備之疫苗可用於治療兒童及成人兩者。因此，人類患者可小於1歲、小於5歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲、或至少55歲。接受疫苗之較佳患者為老年人(例如，50歲、60歲、及較佳65歲)、年輕人(例如，5歲)、住院患者、健康照護工作人員、武裝部隊及軍事人員、懷孕女性、慢性病人、或免疫缺陷患者。然而，疫苗不僅適合用於此等群組，並且可用於一般人群。本發明之組成物通常直接投與患者。直接遞送可藉由非經腸注射來實現(例如，皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮內、或注射至組織之孔隙空間；舌內注射通常不用於免疫接種目的。替代遞送途徑包括直腸、經口(例如，錠劑、噴霧劑)、經頰、舌下、陰道、局部、經皮膚或經皮、鼻內、眼部、耳、肺部或其他黏膜投與。皮內及肌肉內投與為兩個較佳途徑。注射可經由針(例如，皮下注射針)，但是可替代地使用無針注射。典型肌肉內劑量為0.5 ml。
本發明可用於誘導全身及/或黏膜免疫力，較佳引起經增強之全身及/或黏膜免疫力。
劑量可為單一劑量時程或多個劑量時程。多個劑量可用於初次免疫接種時程及/或補強免疫接種時程。在多個劑量時程中，各個劑量可藉由相同或不同途徑來給予，例如，非經腸敏化及黏膜補強，黏膜敏化及非經腸補強等。多個劑量通常間隔至少1週(例如，約2週、約3週、約4週、約6週、約8週、約10週、約12週、約16週等)來投與。在一個實施例中，多個劑量可在出生之後大約6週、10週及14週投與，例如，在6週、10週及14週齡時，如在世界衛生組織之擴大免疫計劃(「Expanded Program on Immunization；EPI」)中通常所使用。在替代實施例中，間隔約兩個月，例如，間隔約7、8或9週，投與兩個初次劑量，隨後在第二初次劑量之後約6個月至1年，例如，在第二初次劑量之後約6、8、10或12個月，投與一或多個補強劑量。在另一實施例中，間隔約兩個月，例如，間隔約7、8或9週，投與三個初次劑量，隨後在第三初次劑量之後約6個月至1年，例如，在第三初次劑量之後約6、8、10或12個月，投與一或多個補強劑量。 實例
以下實例提供示例性實施例。鑒於本揭示案及此項技術中之一般技能水準，熟習此項技術者認識到以下實例意欲僅為示例性的並且可使用許多變化、修改、及變更而不脫離目前揭示標的物之範圍。實例1A-33E中之各者之資料及揭示內容對應於第1A–33E圖。
實例1:將脂質濃度自6 mM增加至27 mM以及將mRNA自0.14 mg/ml增加至0.56 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-10)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之6至27 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到6至27 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase；Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到1 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.14至0.56 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例2:將脂質濃度自6 mM增加至27 mM以及將mRNA自0.14 mg/ml增加至0.56 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-12)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之6至27 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到6至27 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到1 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.14至0.56 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例3:將脂質濃度自3 mM增加至27 mM以及將mRNA自0.07 mg/ml增加至0.56 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-14)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之3至27 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到3至27 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到1 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.07至0.56 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同50-200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。
實例4:將脂質濃度自12.5 mM增加至50 mM以及將mRNA自0.25 mg/ml增加至1 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-16)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之12.5至50 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到12.5至50 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25至1 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同50-200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。
實例5:將脂質濃度自50 mM增加至100 mM以及將mRNA自1 mg/ml增加至2 mg/ml增加LNP遞送效率(研究LNP-14部分II)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。
A：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
B：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例6:將脂質濃度自50 mM增加至100 mM以及將mRNA自1 mg/ml增加至2 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-25)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同25-200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。
樣品 滲析之前的pH 滲析之後的pH
1 mg/ml 6.05 7.38
1.5 mg/ml 6.43 7.32
2 mg/ml 6.5 7.29
實例7:將脂質濃度自50 mM增加至100 mM以及將mRNA自1 mg/ml增加至2 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-26)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得100 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在100 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含200ng並且12K HEK293細胞以相同25-200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。在本文中注意與實例6相比，此等LNP使用100 mM NaOAc來配製。增加調配物中之乙酸鈉緩衝液之濃度由於更高緩衝能力而使pH保持較低，由此在LNP滲析之前，產生較低pH。
樣品 滲析之前的pH 滲析之後的pH
1 mg/ml 5.1 7.22
1.5 mg/ml 5.29 7.31
2 mg/ml 5.41 7.42
實例8:將脂質濃度自2.5 mM增加至100 mM以及將mRNA自0.05 mg/ml增加至2 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率(研究TRANS-27)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之2.5至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到2.5至50 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.05至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同200ng劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。
E:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。
樣品 滲析之前的pH 滲析之後的pH
0.05 mg/ml 6.09 7.31
0.1 mg/ml 6.12 7.35
0.25 mg/ml 6.44 7.33
0.5 mg/ml 6.53 7.4
1 mg/ml 6.65 7.42
1.5 mg/ml 6.67 7.41
2 mg/ml 6.08 7.35
實例9:將脂質濃度自5 mM增加至100 mM以及將mRNA自0.1 mg/ml增加至2 mg/ml在活體內增加LNP遞送效率(研究InVivo-3)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5  mol %)之5至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到5至50 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到3.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。24µl脂質混合物及48µl mRNA溶液在設置5上混合並且排出至72µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外144µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。將LNP濃縮為了排出50 ul中之5 ug囊封mRNA供肌肉內投與。增加混合濃度導致在相同劑量下遞送效率增加，表明在混合期間之濃度影響LNP結構並且由此影響遞送效率。此發現對於mRNA疫苗之商業製造為意義重大的。
A：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
B：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
C：IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將5 ug囊封mRNA以肌肉內(I.M.)、皮內(I.D.)及靜脈內(I.V.)注射來注射至小鼠中。ROI使用IVIS系統來計算。在4及20小時執行成像。
實例10:可電離脂質之直接質子化及與水中之mRNA混合使mRNA得以囊封。在pH4下，增加乙酸鈉(NaOAc)緩衝液之濃度增加mRNA囊封(研究LNP-6部分II)。
概述：使用包含MC3/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之27.74 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。藉由計算可電離脂質上之胺之莫耳數並且將0%、50%、100%之脂質添加至一定莫耳數之HCl中，使用1M HCl，將MC3原料以0%、50%、及100%總胺來質子化。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到1 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在水，5、10、25、及50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.56 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。結果顯示在不使用緩衝液的情況下，使用與水中之mRNA混合之HCl，將可電離脂質直接質子化導致與在pH4下之乙酸鈉緩衝液中混合時類似的mRNA囊封水準。另外，在pH4下之乙酸鈉緩衝液中混合時，需要25mM乙酸鈉之濃度以便最大化mRNA囊封。在所有先前技術中使用此最大囊封標準來決定緩衝液濃度及混合條件。本發明顯示此程序並未使LNP效力最大化，因為除了絕對混合濃度以外，緩衝液濃度需要最佳化以便最大化LNP效力。
A：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
B：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
C:pH量測。在滲析之前進行量測。
樣品 滲析之前的pH
水中之MC3 100%質子化0.56 mg/ml 7.16
水中之MC3 50%質子化0.56 mg/ml 7.35
水中之MC3 0%質子化0.56 mg/ml 7.5
5 mM NaOAc中之MC3 0.56 mg/ml 7.34
10 mM NaOAc中之MC3 0.56 mg/ml 7.21
25 mM NaOAc中之MC3 0.56 mg/ml 6.84
50 mM NaOAc中之MC3 0.56 mg/ml 6.29
實例11:將脂質濃度自50 mM增加至150 mM以及將mRNA自1 mg/ml增加至3 mg/ml在較低乙酸鈉濃度下增加LNP遞送效率。將乙酸鈉濃度增加至50mM以上在活體外在所有濃度下減少LNP效力(研究TRANS-32)。
概述：使用包含KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至120 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。為了製備150 mM總脂質濃度(分別為75/15/57.75/2.25 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到150 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.4 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在50、100、及150 mM乙酸鈉(NaOAc)緩衝液pH 4中達到1至3 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。僅在50 mM之最低NaOAc濃度下，增加混合濃度導致在相同劑量下，遞送效率增加。較高NaOAc濃度減少LNP效力並且在較高混合濃度下更是如此。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。
樣品 稀釋之後、滲析之前的pH 滲析之後的pH
50 mM NaOAc pH4中之LNP 1 mg/ml 6.09 7.51
50 mM NaOAc pH4中之LNP 2 mg/ml 6.29 7.47
50 mM NaOAc pH4中之LNP 3 mg/ml 6.56 7.52
100 mM NaOAc pH4中之LNP 1 mg/ml 5.14 7.5
100 mM NaOAc pH4中之LNP 2 mg/ml 5.34 7.49
100 mM NaOAc pH4中之LNP 3 mg/ml 5.73 7.49
150 mM NaOAc pH4中之LNP 1 mg/ml 4.79 7.45
150 mM NaOAc pH4中之LNP 2 mg/ml 4.9 7.45
150 mM NaOAc pH4中之LNP 3 mg/ml 5.01 7.47
實例12:將脂質濃度自12.5 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.25 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加可電離脂質KC2、MC3及BOD-ADDE-C2/C4-PipZ之LNP遞送效率。降低乙酸鈉濃度可增加LNP效力，同時降低mRNA囊封(研究TRANS-33)。
概述：使用包含若干可電離物(KC2/MC3/DL-ADDE-C2C2-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-PipZ)/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之12.5及75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到12.5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2/MC3/DL-ADDE-C2C2-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-PipZ及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.4 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25、43、及60 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25至1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至含有48µl 1X DPBS pH 7.4之孔1(粒徑圖中之W1)中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4(粒徑圖中之D)中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。KC2、MC3、及BODD-ADDE-C2C4-PipZ可電離脂質證明與更低濃度0.25mg/ml比較，在更高濃度1.5mg/ml下混合時，效力增加較大，而DL-ADDE-C2C2-PipZ不具有上述效果。與前3種脂質(約6.5)比較，後一種脂質在LNP中具有高得多的pKa(約7.5)以致於其在混合期間更加高度質子化，可能指示對於此脂質而言，未達成包括pH及質子化之理想混合條件。當乙酸鈉濃度自60mM減少至25mM時，KC2、MC3、及BODD-ADDE-C2C4-PipZ LNP亦增加效力並且可減少mRNA囊封，而DL-ADDE-C2C2-PipZ不顯示任一種效應。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前(孔1)及之後進行量測。
樣品 來自孔1的滲析之前的pH 滲析之後的pH
43 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 5.29 7.4
43 mM NaOAc pH4中之MC3 1.5 mg/ml 5.34 7.4
43 mM NaOAc pH4中之C2C2PipZ 1.5 mg/ml 5.98 7.38
43 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 5.85 7.42
43 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 4.85 7.4
43 mM NaOAc pH4中之MC3 0.25 mg/ml 4.84 7.38
43 mM NaOAc pH4中之C2C2PipZ 0.25 mg/ml 4.84 7.39
43 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 0.25 mg/ml 4.82 7.35
60 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 5.09 7.4
60 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 5.07 7.41
25 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 6.33 7.35
25 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 6.33 7.38
60 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 4.64 7.31
60 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 0.25 mg/ml 4.67 7.32
25 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 5.45 7.35
25 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 0.25 mg/ml 5.45 7.39
實例13:將脂質濃度自12.5 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.25 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度進一步最佳化導致LNP效力進一步增加。(研究TRANS-34)。
概述：使用包含若干可電離物KC2/DL-ADDE-C2C2-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-PipZ)/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之12.5至75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到12.5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2/DL-ADDE-C2C2-PipZ/BODD-ADDE-C2C4-PipZ及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.4 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在5、10、12.5、25、及50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4、5或6中達到0.25至1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。相較於更低混合濃度，在更高混合濃度下，LNP效力增加，但是藉由調整乙酸鈉濃度，可在各濃度下進一步增加。例如在1.5mg/ml之mRNA下，當將乙酸鈉自50mM減少至25mM時，LNP效力進一步增加44%。在0.25mg/ml之mRNA濃度下，將乙酸鈉濃度自25mM減少至10mM增加效力2.2X。混合濃度之增加及緩衝液濃度之最佳化減少產生約70%之囊封效率，低於先前技術中通常獲得之囊封效率，其中藉由降低混合濃度及增加緩衝液濃度，囊封錯誤地最大化。我們亦發現對於BODD-ADDE-C2C4-PipZ而言，將pH自4增加至5增加效力。出於實例12解釋之原因，DL-ADDE-C2C2-PipZ不同地起作用。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前(孔1)及之後進行量測。
樣品 稀釋之後、滲析之前的pH 滲析之後的pH
5 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 7.18 7.39
10 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 7.04 7.4
25 mM NaOAc pH4中之KC2 0.25 mg/ml 6.53 7.44
12.5 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 6.98 7.39
25 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 6.68 7.38
50 mM NaOAc pH4中之KC2 1.5 mg/ml 6.03 7.32
25 mM NaOAc pH4中之C2C2PipZ 1.5 mg/ml 6.88 7.4
25 mM NaOAc pH4中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 6.76 7.45
25 mM NaOAc pH5中之C2C2PipZ 1.5 mg/ml 7.22 7.4
25 mM NaOAc pH5中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 7.14 7.49
25 mM NaOAc pH6中之C2C2PipZ 1.5 mg/ml 7.64 7.48
25 mM NaOAc pH6中之BODDC2C4PipZ 1.5 mg/ml 7.38 7.46
實例14:將脂質濃度自5 mM增加至150 mM以及將mRNA自0.1 mg/ml增加至3 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加(TRANS-35)
概述：使用包含可電離KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至150 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。為了製備150 mM總脂質濃度(分別為75/15/57.75/2.25 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到150 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.4 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在10、20、25、及37.5 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.1至3 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。最後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。相較於更低混合濃度，在更高混合濃度下，LNP效力增加。各混合濃度效力藉由調整乙酸鈉濃度來最佳化。例如在1.5mg/ml之mRNA下，當將乙酸鈉自50mM減少至25mM時，LNP效力進一步增加44%。在0.25mg/ml之mRNA濃度下，將乙酸鈉濃度自25mM減少至10mM增加效力2.2 X。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例15:將脂質濃度自5 mM增加至150 mM以及將mRNA自0.1 mg/ml增加至3 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(TRANS-34/35)
概述：使用包含可電離KC2/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之50至150 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。為了製備150 mM總脂質濃度(分別為75/15/57.75/2.25 mM)，首先將KC2及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到150 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.4 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在10、20、25、及37.5 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.1至3 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。最後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。相較於更低混合濃度，在更高混合濃度下，LNP效力增加。各混合濃度效力藉由調整乙酸鈉濃度來最佳化。例如在1.5mg/ml之mRNA下，當將乙酸鈉自50mM減少至25mM時，LNP效力進一步增加44%。在0.25mg/ml之mRNA濃度下，將乙酸鈉濃度自25mM減少至10mM增加效力2.2 X。
A. 在各mRNA濃度下，有利於最高效力之pH 4下之乙酸鈉之最佳濃度
mRNA濃度(mg/ml) 脂質混合物濃度(mM) 乙酸鈉pH 4濃度(mM)
0.1 5 10
0.25 12.5 10
0.5 25 20
1 50 25
1.5 75 25
2 100 25
3 150 37.5
B. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
C：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
D：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例16:將脂質濃度自5 mM增加至100 mM以及將mRNA自0.1 mg/ml增加至2 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(TRANS-36)
概述：使用包含可電離MC3/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之5至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為25/5/19.25/0.75 mM)，然後進行連續稀釋以達到5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將MC3及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為50/10/38.5/1.5 mM)，首先將MC3及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到4.6 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在5 - 35 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。最後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。相較於更低混合濃度，在更高混合濃度下，LNP效力增加。各混合濃度效力藉由調整乙酸鈉濃度來最佳化。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例17:將脂質濃度自5 mM增加至100 mM以及將mRNA自0.1 mg/ml增加至2 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(TRANS-37)
概述：使用包含可電離BODD-C2/C4-PipZ/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之5至100 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得50 mM總脂質濃度(分別為24/6.5/18.5/1 mM)，然後進行連續稀釋以達到5 mM。為了製備75 mM總脂質濃度(分別為37.5/7.5/28.88/1.13 mM)，首先將可電離物及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到75 mM。為了製備100 mM總脂質濃度(分別為48/13/37/2 mM)，首先將可電離物及膽固醇混合，對於DSPC及PEG同樣如此，將兩個溶液溶解於乙醇中，然後將其組合，以便達到100 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在5 - 30 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.1至2 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。最後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。相較於更低混合濃度，在更高混合濃度下，LNP效力增加。各混合濃度效力藉由調整乙酸鈉濃度來最佳化。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例18:將脂質濃度自12.5 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.25 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(TRANS-41)
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)之12.5 - 75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得75 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到12.5 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例19:將脂質濃度自12.5 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.25 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(TRANS-43)
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之12.5 - 75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得75 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到12.5 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.25 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持10 7RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例20:將脂質濃度自10 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體內增加LNP遞送效率。在任何特定混合濃度下，將乙酸鈉濃度最佳化導致LNP效力進一步增加。(InVivo-7)
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)之10 - 75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得75 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到10 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
B：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
C：IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將0.5-5 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4及24小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
實例21:在遞送SARS-CoV-2免疫原時(活體內8)，將脂質濃度自10 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml增加免疫原性
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)之10 - 75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得75 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到10 mM。將密碼子最佳化2019-nCoV Wuhan S-2P (Covid)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：活體內免疫原性端點ELISA抗RBD效價。將0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。預補強及後補強(3週之後)如下所示。
B：偽中和檢定之活體內免疫原性FRNT50效價。將0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。預補強及後補強(3週之後)如下所示。
實例22:在攻擊模型中，在遞送SARS-CoV-2免疫原時(活體內9)，將脂質濃度自10 mM增加至75 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml增加針對致死攻擊之保護，其中使用0.25 ug之專屬BODD C2C4 PipZ為100%保護性的並且使用0.5 ug之MC3標準參考為100%保護性的。
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47-50:10-13:37-38.5:1.5-2 mol %)之10 - 75 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得75 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到10 mM。將密碼子最佳化2019-nCoV Wuhan S-2P (Covid)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：攻擊模型中之針對病毒攻擊之活體內保護 - 存活比例、體重及溫度。0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射預補強及後補強(5週之後)來注射至小鼠中。攻擊使用5 x 10 4PFU之意大利菌株。
B：攻擊模型中之活體內體重及溫度。0.1、0.25、0.5、1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射預補強及後補強(5週之後)來注射至小鼠中。攻擊使用5 x 10 4PFU之意大利菌株。
實例23:高濃度脂質(77 mM)及mRNA (1.5 mg/ml)產生活體內之高LNP遞送效率。(InVivo-10)
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
B：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
C：IM及IV投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)及靜脈內(I.V.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4及24小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
實例24:對於快速微流控混合，將脂質濃度自約16 mM增加至約120 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。與PEG-DMA比較，測試PEG-DMG。(TRANS-47)
概述：使用包含ALC-0315可電離/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (46:9.4:42.9:1.7 mol %)之約12 - 約120 mM之總脂質濃度來配製LNP，並且將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得約120 mM總脂質濃度。獨立地製備直至約16 mM之較低總脂質濃度之不同原料。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析6x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例25:對於快速微流控混合，將脂質濃度自10.2 mM增加至77 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外增加LNP遞送效率。(TRANS-49)
概述：使用包含若干可電離脂質及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之10.2 - 77 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度，然後進行連續稀釋以達到10.2 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.2 – 1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例26:對於快速微流控混合，高濃度脂質(77 mM)及mRNA (1.5 mg/ml)導致活體外較高LNP遞送效率。(TRANS-52)
概述：使用包含若干可電離物及DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為0.88 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例27:對於快速微流控混合，將脂質濃度自約10 mM增加至約77 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外不同乙酸鈉濃度下顯示LNP遞送效率。在沒有任何緩衝液的情況下，與水中之mRNA混合之前，將可電離脂質直接質子化改良活體內IM及IV注射中之遞送效率。(InVivo-12 v.2)
概述：使用具有DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製BODD C2/C4 PipZ (C24 PipZ) LNP。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度並且稀釋至約10 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。又，將mRNA在水中稀釋並且脂質混合物在不同水準200%-25%下質子化，以便稍後如上所述之相同條件下混合。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於蔗糖緩衝液pH 7.5滲析6x1小時。將LNP在-80℃下保持冷凍以便活體內注射。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在蔗糖緩衝液pH 7.5中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.1 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
E:以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以血管內(I.V.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
實例28:對於快速微流控混合，以74 mM總脂質混合之LNP/18PA及1.5 mg/ml之mRNA顯示肝臟表現減少並且IV注射之後，脾臟表現增加。(TRANS-55)
概述：使用具有DSPC/膽固醇/PEG-DMG (50:10:38.5:1.5 mol %)之74 mM之總脂質濃度來配製MC3。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。脂質混合物與18PA脂質混合成0%、15%及30%總脂質。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於蔗糖緩衝液pH 7.5滲析6x1小時。將LNP在-80℃下保持冷凍以便活體內注射。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。然而陰離子18PA之存在可能增加背景信號。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在蔗糖緩衝液pH 7.5中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在蔗糖中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.1 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
E:以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以血管內(I.V.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
實例29:對於快速微流控混合，與0.5 mg/ml之mRNA混合的約25 mM之新脂質顯示活體外較高LNP遞送效率。(TRANS-59)
概述：使用包含若干可電離物/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之約25 mM之總脂質濃度來配製LNP。將每一種脂質溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得約25 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在25 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到0.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析4x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在蔗糖緩衝液pH 7.5中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在蔗糖中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.1 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例30:對於快速微流控混合，將具有77 mM之總脂質濃度之LNP與1.5 mg/ml濃度之mRNA組裝顯示活體內LNP遞送效率。(InVivo-11)
概述：使用包含若干可電離物脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製LNP。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在20 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析6x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：IM投與中之注射位點之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由注射部位之活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
B：IM投與中之離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
實例31:對於快速微流控混合，將具有77 mM之總脂質濃度之LNP與1.5 mg/ml濃度之mRNA組裝顯示活體內LNP遞送效率。(InVivo-13)
概述：使用包含若干可電離物脂質/DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製LNP。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於蔗糖緩衝液pH 7.5滲析6x1小時。將冷凍LNP在-80℃下保持以便活體內注射。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A：IM投與中之注射位點之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
B：IM投與中之離體螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。對於離體，器官在活體內成像之後立即提取並成像。
實例32:在快速微流控混合中，約77 mM之脂質濃度及1.5 mg/ml之mRNA在不同乙酸鈉濃度下顯示活體外之LNP遞送效率。在沒有任何緩衝液的情況下，與水中之mRNA混合之前，將可電離脂質直接質子化導致活體外遞送效率改良(TRANS-54 v.1)
概述：使用具有DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製BODD C2/C4 PipZ (C24 PipZ) LNP。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。又，將mRNA在水中稀釋並且脂質混合物在不同水準200%-25%下質子化，以便稍後如上所述之相同條件下混合。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於1X DPBS pH 7.4滲析6x1小時。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為0.88 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
實例33:對於快速微流控混合，將脂質濃度自約10 mM增加至約77 mM以及將mRNA自0.2 mg/ml增加至1.5 mg/ml在活體外不同乙酸鈉濃度下顯示LNP遞送效率。在沒有任何緩衝液的情況下，與水中之mRNA混合之前，將可電離脂質直接質子化導致活體內IM及IV注射中之遞送效率改良。(TRANS-54 v.2/InVivo-12 v.1)
概述：使用具有DSPC/膽固醇/PEG-DMG (47:13:37:2 mol %)之77 mM之總脂質濃度來配製BODD C2/C4 PipZ (C24 PipZ) LNP。將雙重脂質原料(可電離/膽固醇，DSPC/PEG-DMG)溶解於乙醇中直到觀察到透明溶液為止。將四種脂質組合以獲得77 mM總脂質濃度並且稀釋至約10 mM。將密碼子最佳化螢火蟲螢光素酶(Fluc)序列選殖至mRNA質體(最佳化3’及5’UTR並且含有101聚腺苷酸尾區)中以便進行共轉錄加帽，使用N1甲基假尿苷修飾核苷來活體外轉錄並且纖維素純化以移除dsRNA。將經純化mRNA乙醇沉澱，洗滌並且重新懸浮於無核酸酶水中達到5.5 mg/mL之濃度。NP比率保持恆定於4，Fluc mRNA原料在自較高濃度溶液至較低濃度之連續稀釋中稀釋，在15-50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4中達到1.5 mg/ml，然後混合Spark NanoAssmblr (Precision NanoSystems)，在使用微流控混合技術之調配物中允許較高可重現性。又，將mRNA在水中稀釋並且脂質混合物在不同水準200%-25%下質子化，以便稍後如上所述之相同條件下混合。16µl脂質混合物及32µl mRNA溶液在設置3上混合並且排出至48µl 1X DPBS pH 7.4中。然後，將所形成之LNP稀釋至額外96µl 1X DPBS pH 7.4中。然後將LNP相對於蔗糖緩衝液pH 7.5滲析6x1小時。將LNP在-80℃下保持冷凍以便活體內注射。然後將LNP稀釋以使得32ul包含25-200ng並且12K HEK293細胞以相同劑量轉染但是在微流控混合器中以不同濃度製造。
A. mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10-5 mg/ml至4.88 x10-3 mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。
B：mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。
C：LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在蔗糖緩衝液pH 7.5中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.1 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。
D：以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以肌肉內(I.M.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
E:以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將1 ug總mRNA以血管內(I.V.)注射來注射至小鼠中。在注射後4小時，腹膜內投與螢光素，並且在4小時，藉由活動物成像來監測螢光素酶表現。ROI使用IVIS系統來計算。
對於本文引用之所有專利、申請案、或其他參考，諸如非專利文獻及參考序列資訊，應瞭解，其針對所有目的及針對所述及之標的以整體參照之方式併入。當以參照方式併入之文獻與本申請案之間存在任何矛盾時，將以本申請案為準。與本申請案中披露之參考基因序列相關之所有資訊，諸如GeneID或登錄號(通常參考NCBI登錄號)，包括例如基因組位點(genomic loci)、基因組序列、功能注解、等位基因變體、及參考mRNA (包括例如，外顯子邊界或反應元件)及蛋白質序列(諸如保守域結構)、以及化學參考(例如，PubChem化合物、PubChem物質、或PubChem Bioassay實體，包括其中之注解，諸如結構及檢定，等等)，係特此以整體參照之方式併入。
本申請案中使用之標題係僅為了方便之目的且不影響本申請案之解釋。
由本發明提供之每一態樣之較佳特徵原則上適用於本發明之所有其他態樣，且(非限制性地)藉由從屬權利要求例證且亦涵蓋本發明之特定實施例及態樣(包括工作實例)之個別特徵(例如元件，包括數值範圍及例示性實施例)之組合及排列。舉例而言，工作實例中例證之特定實驗參數可適合於逐個地在所要求保護之發明中使用而不背離本發明。舉例而言，對於所披露之材料，雖然此等化合物之各種個別及共同組合及排列中之每一者之具體參考可能未明確地披露，但每一者被具體地涵蓋且於本文描述。因此，若一類元件A、B、及C與一類元件D、E、及F被披露且披露了元件A-D之組合之實例，則，即使未個別地述及每一者，每一者亦個別地且共同地被涵蓋。因此，在此實例中，組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、及C-F中之每一者被具體地涵蓋且應視為自A、B及C；D、E及F；及實例組合A-D之披露而得以披露。同樣地，此等元件之任何子集或組合亦具體地涵蓋及揭示。因此，例如，A-E、B-F、及C-E之子群組係具體地涵蓋且應視為自A、B及C；D、E及F；及實例組合A-D之披露而得以披露。此概念適用於本申請案之所有態樣，包括組合物之要素及製得或使用組成物之方法步驟。
如本技術領域中具有通常知識者根據本說明書之教義將認識到的，本發明之前述態樣可以任何組合或排列要求保護，只要其相對於先前技術為新穎的且非顯而易見的—因此，當元件在由本技術領域中具有通常知識者所知之一或多個參考中被描述時，可藉由該特徵或特徵之組合之負面條件或放棄聲明將其自所要求保護之發明排除在外。
無
目前揭示標的物之更全面理解可藉由參考結合後續詳細說明來考量之隨附圖式來獲得。圖式中示出之實施例僅意欲為示例性的並且不應被視為將目前揭示標的物限制於所示出實施例。以下描述之圖式與來自以下描述之各個實例之實驗結果相關。
第1A圖:mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第1A圖示出之實施例對應於實例1A列出之程序。
第1B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第1B圖示出之實施例對應於實例1B列出之程序。
第1C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(Dynamic Light Scattering；DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第1C圖示出之實施例對應於實例1C列出之程序。
第2A圖:mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第2A圖示出之實施例對應於實例2A列出之程序。
第2B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第2B圖示出之實施例對應於實例2B列出之程序。
第2C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173°反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第2C圖示出之實施例對應於實例2C列出之程序。
第3A圖:mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第3A圖示出之實施例對應於實例3A列出之程序。
第3B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第3B圖示出之實施例對應於實例3B列出之程序。
第3C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173°反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第3C圖示出之實施例對應於實例3C列出之程序。
第3D圖:基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。第3D圖示出之實施例對應於實例3D列出之程序。
第4A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第4A圖示出之實施例對應於實例4A列出之程序。
第4B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第4B圖示出之實施例對應於實例4B列出之程序。
第4C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173°反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第4C圖示出之實施例對應於實例4C列出之程序。
第4D圖:基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。第4D圖示出之實施例對應於實例4D列出之程序。
第5A圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第5A圖示出之實施例對應於實例5A列出之程序。
第5B圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第5B圖示出之實施例對應於實例5B列出之程序。
第6A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第6A圖示出之實施例對應於實例6A列出之程序。
第6B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第6B圖示出之實施例對應於實例6B列出之程序。
第6C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第6C圖示出之實施例對應於實例6C列出之程序。
第6D圖:pH量測。在相對於1x DPBS ph7.4滲析4小時之前及之後進行量測。第6D圖示出之實施例對應於實例6D列出之程序。
第7A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第7A圖示出之實施例對應於實例7A列出之程序。
第7B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第7B圖示出之實施例對應於實例7B列出之程序。
第7C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第7C圖示出之實施例對應於實例7C列出之程序。
第7D圖:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。在本文中注意與實例6相比，此等LNP使用100 mM NaOAc來配製。增加調配物中之乙酸鈉緩衝液之濃度由於更高緩衝能力而使pH保持較低，由此在LNP滲析之前，產生較低pH。第7D圖示出之實施例對應於實例7D列出之程序。
第8A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第8A圖示出之實施例對應於實例8A列出之程序。
第8B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第8B圖示出之實施例對應於實例8B列出之程序。
第8C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第8C圖示出之實施例對應於實例8C列出之程序。
第8D圖:基於Presto Blue HS生存力試劑之毒性檢定。在24小時轉染之後，在37 ℃下將轉染細胞與預溫Presto Blue HS試劑(10% v/v)培育15分鐘。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex540/Em590)。第8D圖示出之實施例對應於實例8D列出之程序。
第8E圖:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。第8E圖示出之實施例對應於實例8E列出之程序。
第9A圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第9A圖示出之實施例對應於實例9A列出之程序。
第9B圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第9B圖示出之實施例對應於實例9B列出之程序。
第9C圖:IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。將5 ug囊封mRNA以肌肉內(intramuscular；I.M.)、皮內(intradermal；I.D.)及靜脈內(intravenous；I.V.)注射來注射至小鼠中。ROI使用IVIS系統來計算。在4及20小時執行成像。第9C圖示出之實施例對應於實例9C列出之程序。
第10A圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第10A圖示出之實施例對應於實例10A列出之程序。
第10B圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第10B圖示出之實施例對應於實例10B列出之程序。
第10C圖:pH量測。在滲析之前進行量測。第10C圖示出之實施例對應於實例10C列出之程序。
第11A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第11A圖示出之實施例對應於實例11A列出之程序。
第11B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第11B圖示出之實施例對應於實例11B列出之程序。
第11C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第11C圖示出之實施例對應於實例11C列出之程序。
第11D圖:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前及之後進行量測。第11D圖示出之實施例對應於實例11D列出之程序。
第12A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第12A圖示出之實施例對應於實例12A列出之程序。
第12B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第12B圖示出之實施例對應於實例12B列出之程序。
第12C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第12C圖示出之實施例對應於實例12C列出之程序。
第12D圖:pH量測。在相對於1X DPBS pH7.4滲析4小時之前(孔1)及之後進行量測。第12D圖示出之實施例對應於實例12D列出之程序。
第13A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第13A圖示出之實施例對應於實例13A列出之程序。
第13B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第13B圖示出之實施例對應於實例13B列出之程序。
第13C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第13C圖示出之實施例對應於實例13C列出之程序。
第14A圖.mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第14A圖示出之實施例對應於實例14A列出之程序。
第14B圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第14B圖示出之實施例對應於實例14B列出之程序。
第14C圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第14C圖示出之實施例對應於實例14C列出之程序。
第15A圖:初始mRNA濃度、初始脂質混合物濃度、對於在實例13及14(第13圖及第14圖)中測試之各特定初始mRNA濃度而言產生最高效力之初始乙酸鈉濃度的表。第15A圖示出之實施例對應於實例15A列出之程序。
第15B圖.將各特定初始mRNA濃度下最佳乙酸鈉濃度之實例13及14加以組合的mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。在24小時轉染之後，在螢火蟲螢光素酶檢定之前30分鐘，將轉染細胞調節至室溫。Quantilum重組螢光素酶標準曲線在10% EMEM中以5倍連續稀釋來製備。3.9 x10 -5mg/ml至4.88 x10 -3mg/ml範圍內之50 ul各標準點包括於微孔板中作為陽性酶活性對照(資料未展示)以保持107 RLU/mg/ml之線性。先前調節至室溫至少4小時之ONE-Glo受質以1:1比率添加至各未轉染、轉染及Quantilum孔。檢定板在黑暗中培育3分鐘並且立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光。第15B圖示出之實施例對應於實例15B列出之程序。
第15C圖:mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。將1X TE緩衝液及Triton緩衝液(1X TE緩衝液中之2% v/v)一式兩份添加至每個LNP之黑色微孔板中。LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至4 ng/ul並且以1:1比率添加至各TE/Triton孔。在Ribogreen檢定中包括兩個標準曲線，一個曲線含有mRNA及1X TE緩衝液並且另一個曲線含有mRNA及Triton緩衝液。此等標準曲線中之各者用於計算各TE緩衝液或Triton緩衝液中之mRNA濃度。與單一標準曲線相比，此使用兩個標準曲線之方法更精確計算囊封效率及mRNA濃度。在將稀釋LNP添加至板之後，將標準品包含在微孔板中。微孔板在37℃培育10分鐘以便提取具有Triton之LNP。將Ribogreen試劑在1X TE緩衝液中1:100稀釋並且以1:1比率添加至各孔。微孔板立即引入Cytation 5細胞成像多模式閱讀器(Biotek)中以便讀取螢光(Ex485/Em528)。第15C圖示出之實施例對應於實例15C列出之程序。
第15D圖:LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。將滲析LNP在1X DPBS pH 7.4中稀釋至6.25 ng/ul並且轉移至石英比色皿(ZEN2112)中，以便在25 ℃下，在1X PBS中，使用1.45之顆粒RI及 0.001之吸收，在Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical)中，藉由動態光散射(DLS)來量測大小，黏度為1.02 cP並且RI為1.335。使用先前重複兩次平衡至25 ℃持續30秒之173 °反向散射偵測角進行量測，各自運作5次並且運作持續時間為10秒，並且量測之間沒有延遲。每次量測在具有自動衰減選擇之石英比色皿中具有4.65之固定位置。使用具有正常解析之通用模型來分析資料。第15D圖示出之實施例對應於實例15D列出之程序。
第16A圖:如實例16列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第16B圖:如實例16列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第16C圖:如實例16列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第17A圖:如實例17列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第17B圖:如實例17列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第17C圖:如實例17列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第18A圖:如實例18列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第18B圖:如實例18列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第18C圖:如實例18列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第19A圖:如實例19列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第19B圖:如實例19列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第19C圖:如實例19列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第20A圖:如實例20列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第20B圖:如實例20列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第20C圖:如實例20列出之IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第21A圖:如實例21列出之活體內免疫原性端點ELISA抗RBD效價。
第21B圖:如實例21列出之偽中和檢定之活體內免疫原性FRNT50效價。
第22A圖:如實例22列出之攻擊模型中之針對病毒攻擊之活體內保護 - 存活比例、體重及溫度。
第22B圖:如實例22列出之攻擊模型中之活體內體重及溫度。
第23A圖:如實例23列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第23B圖:如實例23列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第23C圖:如實例23列出之IM及IV投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第24A圖:如實例24列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第24B圖:如實例24列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第24C圖:如實例24列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第25A圖:如實例25列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第25B圖:如實例25列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第25C圖:如實例25列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第26A圖:如實例26列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第26B圖:如實例26列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第26C圖:如實例26列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第27A圖:如實例27列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第27B圖:如實例27列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第27C圖:如實例27列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第27D圖:如實例27列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。
第27E圖:如實例27列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。
第28A圖:如實例28列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第28B圖:如實例28列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第28C圖:如實例28列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第28D圖:如實例28列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。
第28E圖:如實例28列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與之活體內及離體螢火蟲螢光素酶表現。
第29A圖:如實例29列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第29B圖:如實例29列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第29C圖:如實例29列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第30A圖:如實例30列出之IM投與中之注射位點之活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第30B圖:如實例30列出之IM投與中之離體螢火蟲螢光素酶表現。
第31A圖:如實例31列出之IM投與中之注射位點之活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第31B圖:如實例31列出之IM投與中之離體螢火蟲螢光素酶表現。
第32A圖:如實例32列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第32B圖:如實例32列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第32C圖:如實例32列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第33A圖:如實例33列出之mRNA遞送效率之螢火蟲螢光素酶檢定。
第33B圖:如實例33列出之mRNA囊封效率之Ribogreen檢定。
第33C圖:如實例33列出之LNP大小之動態光散射(紅點為y軸右側之PDI)。
第33D圖:如實例33列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IM投與中之活體內螢火蟲螢光素酶表現。
第33E圖:如實例33列出之以1.5 mg/ml混合之LNP之IV投與之離體螢火蟲螢光素酶表現。
第34圖示出在微流控混合期間脂質及mRNA之濃度增加時，LNP效力及內涵體質子化增加。A)在更高濃度下組裝之KC2 LNP在活體外在含有12k HEK293細胞之每個孔25-200ng之相同劑量下產生更高Fluc表現。B)在更高混合濃度下產生(混合時以mM為單位之總脂質濃度在動物上方展示)，並且在IM注射之50µL中稀釋至恆定5µg劑量的LNP為更有效的(顏色條為以107 p/sec/cm2/sr為單位之輻射率)。C) Zeta電位量測展示對於藉由高濃度混合來製備之LNP，當pH自7.4降低至5時，質子化之更大增加，表明更大內涵體釋放。
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Claims (59)

  1. 一種製造包含核酸之脂質奈米顆粒(「naLNP」)的方法，該方法包括以下步驟： a.  提供包含一定核酸濃度下之至少一種核酸的核酸溶液； b.  提供包含一定脂質濃度下之至少一種脂質的脂質溶液；及 c.  將該核酸溶液之一部分及該脂質溶液之一部分組合以便建置包含混合氮-磷酸鹽比率及脂質:核酸比率的混合溶液；及 d.  視情況將該最終混合溶液中之pH調整至生理pH以便獲得pH調整混合溶液；及 e.  自該混合溶液獲得該等naLNP；及 其中該等naLNP具有比參考脂質奈米顆粒(「refLNP」)更大之效力，其中該refLNP包含至少一種脂質及至少一種核酸並且藉由參考LNP製造方法來製得。
  2. 如請求項1所述之方法，其中核酸溶液之一部分及脂質溶液之一部分在步驟(c)中以選自由以下組成之群的體積比來組合：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1及7:1。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約40至約150奈米範圍內之平均直徑。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約50至約100奈米範圍內之平均直徑。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約40%至約100%之核酸囊封效率。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約50%至約85%之核酸囊封效率。
  7. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約60%至約85%之核酸囊封效率。
  8. 如請求項1所述之方法，其中該等naLNP具有約68%至約83%之核酸囊封效率。
  9. 如請求項1所述之方法，其中該naLNP具有低於refLNP之較低核酸囊封率。
  10. 如請求項1所述之方法，其中該至少一種核酸為DNA或RNA。
  11. 如請求項1所述之方法，其中該至少一種核酸為RNA。
  12. 如請求項1所述之方法，其中該至少一種核酸為mRNA。
  13. 如請求項1所述之方法，其中該至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA。
  14. 如請求項1所述之方法，其中該至少一種核酸為編碼至少一個開放解讀碼組之mRNA，該開放解讀碼組編碼免疫原。
  15. 如請求項1所述之方法，其中該核酸溶液包含緩衝液。
  16. 如請求項1所述之方法，其中將酸添加至該脂質溶液以便將該可電離脂質質子化。
  17. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.21至約3 mg/ml。
  18. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.23至約3 mg/ml。
  19. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.25至約3 mg/ml。
  20. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.28至約3 mg/ml。
  21. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.29至約3 mg/ml。
  22. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.30至約3 mg/ml。
  23. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.40至約3 mg/ml。
  24. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.50至約3 mg/ml。
  25. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.60至約3 mg/ml。
  26. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約0.70至約3 mg/ml。
  27. 如請求項1所述之方法，其中該核酸濃度為至少或約1至約3 mg/ml。
  28. 如請求項1所述之方法，其中該脂質溶液包含選自由以下組成之群的有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、苯及甲苯。
  29. 如請求項1所述之方法，其中脂質溶液中之該至少一種脂質選自由以下組成之群：MC3、KC2、DLin、DODMA、DODAP、式I、式II、式III、式IV及其組合。
  30. 如請求項1所述之方法，其中脂質溶液中之至少一種脂質為具有pKa之可電離陽離子脂質。
  31. 如請求項1所述之方法，其中該混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0至約2個pH單位的pH。
  32. 如請求項1所述之方法，其中該混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.5至約1.5個pH單位的pH。
  33. 如請求項1所述之方法，其中該混合溶液具有比refLNP中之脂質之pKa低約0.75至約1.25個pH單位的pH。
  34. 如請求項1所述之方法，其中該脂質濃度為至少或約1 mM至約200 mM。
  35. 如請求項1所述之方法，其中該脂質濃度為至少或約10 mM至約150 mM。
  36. 如請求項1所述之方法，其中該脂質濃度為至少或約50 mM至約100 mM。
  37. 如請求項1所述之方法，其中混合溶液氮-磷酸鹽比率為至少或約2至至少或約10。
  38. 如請求項1所述之方法，其中混合溶液脂質:核酸重量比為至少或約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、15:1、17:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1或50:1。
  39. 如請求項1所述之方法，其中該refLNP使用小於0.21mg/ml之參考核酸濃度來產生。
  40. 如請求項1所述之方法，其中該refLNP使用小於10.5 mM之參考脂質濃度來產生。
  41. 如請求項1所述之方法，其中該refLNP使用小於0.21mg/ml之參考核酸濃度及小於10.5mM之參考脂質濃度來產生。
  42. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高約1.5倍。
  43. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高約2倍。
  44. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高約3倍。
  45. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高約4倍。
  46. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約5倍。
  47. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約6倍。
  48. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約7倍。
  49. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約8倍。
  50. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約9倍。
  51. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約10倍。
  52. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約11倍。
  53. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約12倍。
  54. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約13倍。
  55. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約14倍。
  56. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約15倍。
  57. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約20倍。
  58. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約25倍。
  59. 如請求項1所述之方法，其中該效力比refLNP高至少或約50倍。
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