JP2023546908A - イオン化可能脂質ならびにその製造及び使用の方法 - Google Patents

イオン化可能脂質ならびにその製造及び使用の方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規のイオン化可能脂質化合物、ならびに、例えばがんワクチンとして使用するために含めることのできる核酸の哺乳動物対象への送達、遺伝子編集治療薬、抗体をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、感染性疾患用ワクチン、及びタンパク質補充治療薬の送達に有用である、脂質ナノ粒子送達系におけるそれらの使用を包含する。さらに、本発明は、脂質ナノ粒子中に該イオン化可能脂質を含む組成物及び治療薬、ならびに、医薬組成物、特にワクチン（例えば、感染性疾患、腫瘍もしくはがん疾患、希少疾患、アレルギー、または自己免疫疾患の予防または処置に使用するため）の調製のための、組成物及び治療薬の使用を包含する。本発明は、先述の疾患の処置または予防の方法を包含する。【選択図】図１

Description

Ｉ． 関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／０９１，６１６号、２０２１年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／１７９，８８５号、２０２０年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／０９１，６０３号、及び２０２１年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／１７９，８７２号の利益を主張するものであり、各仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１２月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＥＸＲ－００１－０２ＵＳ－３４３２６９－２０１４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１，４６０バイトのサイズである。
ＩＩ． 発明の分野
本発明は、新規のイオン化可能脂質化合物、ならびに、例えばがんワクチンとして使用するために含めることのできる核酸の哺乳動物対象への送達、遺伝子編集療法の送達、抗体をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、感染性疾患用ワクチン、及びタンパク質補充治療薬の送達において有用である、脂質ナノ粒子送達系におけるそれらの使用を包含する。さらに、本発明は、脂質ナノ粒子中にイオン化可能脂質を含む組成物及び治療薬、ならびに、医薬組成物、特にワクチン（例えば、感染性疾患、腫瘍もしくはがん疾患、希少疾患、アレルギー、または自己免疫疾患の予防または処置に使用するため）の調製のための、組成物及び治療薬の使用を包含する。本発明は、先述の疾患の処置または予防の方法も包含する。
ＩＩ． 発明の背景
遺伝子療法及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の中で最も有望かつ急速に発展している方法に属する。これらは、多種多様な疾患の療法のための高度に特異的で個別の選択肢を提供し得る。基本的な生物学的概念として、細胞機構は、遺伝的にコードされたタンパク質を合成するための情報の一時的な担体としてｍＲＮＡを利用する。したがって、理論的な観点から、ｍＲＮＡは、治療目的でＤＮＡまたは組換えタンパク質を置き換えることができるはずである。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤は、望ましくない遺伝子発現に関連する悪性腫瘍、感染症、自己免疫疾患、及び神経疾患などの幅広い疾患を処置するための治療剤として強い可能性を有する。
これらの透過性が低く、分解しやすい高分子の全身投与には、安全かつ効率的な送達プラットフォームが非常に望ましい。脂質及び／またはリン脂質で作られたナノ担体は、高い生体適合性、生分解性、及び臨床使用の確かな実績から、ＲＮＡ送達を容易にするために一般的に用いられている（例えばリポソーム、脂質ナノ粒子、及び脂質ナノエマルジョン）。
遺伝子ワクチン接種は、細菌表面の特徴的成分、ウイルス粒子、腫瘍抗原などのような選択された抗原に対する所望の免疫応答を誘起する。遺伝子ワクチン（すなわち、遺伝子ワクチン接種用のワクチン）は、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏで病原体または腫瘍抗原に特徴的なペプチドまたはタンパク質（すなわち、抗原）フラグメントの発現を可能にする遺伝子工学操作された核酸分子から構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与されると、ターゲット細胞に取り込まれた後に発現する。投与された核酸の発現は、コードされたタンパク質の産生をもたらす。これらのタンパク質が患者の免疫系によって異物として認識される場合、免疫応答が引き起こされる。
ＤＮＡは、ＲＮＡと同様に、遺伝子ワクチン接種との関連で投与するための核酸分子として使用され得る。ＤＮＡは、比較的安定で扱いやすいことで知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡフラグメントが患者のゲノムに不必要に挿入されるリスクがあり、損なわれた遺伝子の機能喪失などの変異原性事象が発生する可能性がある。さらなるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の望まれない生成が生じ得る。別の欠点は、結果として生じるｍＲＮＡが翻訳され得る前にＤＮＡが転写されるために核に入る必要があるため、ＤＮＡ投与の際に達成可能なコードされたペプチドまたはタンパク質の発現レベルが限られることである。他にも理由はあるが、投与されたＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。そのような因子が存在しなければ、ＤＮＡ転写は十分な量のＲＮＡを産生しない。結果として、得られる翻訳されたペプチドまたはタンパク質のレベルが限られる。
遺伝子療法及び遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを使用することにより、望まれないゲノムへの組込み及び抗ＤＮＡ抗体の生成のリスクが最小限に抑えられるか、または回避される。しかし、ＲＮＡは、遍在性のＲＮＡｓｅｓにより容易に分解され得る、いくぶん不安定な分子種であると考えられている。当技術分野では、抗原の早期分解によって、または細胞内のｍＲＮＡの非効率的な放出に起因するｍＲＮＡの非効率的な翻訳によって投与が著しく損なわれない、適応免疫応答の誘発を可能にするｍＲＮＡ投与のための（例えば、ワクチン接種のための）効率的な方法を提供する必要がある。さらに、潜在的な安全性の懸念を減少させ、ワクチンを第三世界で入手しやすくするために、ｍＲＮＡワクチンの用量を減少させる必要がある。
生物系における望ましい応答に影響を与える核酸の送達には、多くの課題が伴う。ワクチンなどの核酸ベースの治療薬には極めて大きな可能性があるが、この可能性を実現するためには、細胞、組織、または生物における適切な部位に核酸をより効果的に送達する必要が残っている。しかし、治療との関連でオリゴヌクレオチドを使用するに当たっては、現在３つの問題がある。第１に、遊離ＲＮＡは血漿中でヌクレアーゼ消化を受けやすい。第２に、遊離ＲＮＡは、関連する翻訳機構が存在する細胞内コンパートメントにアクセスする能力が限られている。第３に、内部移行したオリゴヌクレオチドのうち、細胞質中に放出されて生物活性をもつようになるのはほんの一部である。中性脂質、ステロイド、ＰＥＧ、ＰＥＧ化脂質、及びオリゴヌクレオチドなどの他の脂質成分と組み合わせた本発明のイオン化可能脂質（本明細書で定義される）から形成された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、血漿中のＲＮＡの分解をブロックし、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを容易にするために使用されている。これらは、正しく設計されていれば、治療レベルのオリゴヌクレオチドを細胞質中に放出し得る。
限局性の送達により、ＲＮＡが全身に存在することになり、望まれない副作用及び効能の低減が生じる。ワクチンは通常、筋肉内（ＩＭ）注射によって投与され、ＩＭ経路を介して樹状細胞に送達するためのＬＮＰの要件は、肝細胞への静脈内（ＩＶ）送達とは異なる。肝細胞のターゲティングは、ＬＮＰ取り込みを肝細胞ＬＤＬ受容体へターゲティングするＡｐｏＥとＬＮＰが会合することによるものだが、ＡｐｏＥは、ＩＭ投与において同じ役割を有しない可能性がある。ＬＮＰの第２のターゲティング機序は、正味電荷である。負に荷電されたＬＮＰはＩＶ投与すると脾臓をターゲティングし、正に荷電されたＬＮＰは肺をターゲティングし、中性に近いＬＮＰは肝臓をターゲティングする。発表されている研究で、ＩＭ投与におけるＬＮＰ電荷の影響を評価したものはない。
オリゴヌクレオチドの送達のための改善されたイオン化可能脂質及び脂質ナノ粒子が依然として必要である。
脂質ナノ粒子に含まれる本発明のイオン化可能脂質（本明細書で定義される）は、最適な薬物：脂質の比をもたらし、核酸を分解及び血清中のクリアランスから保護し、全身送達または局所送達に好適であり、核酸の細胞内送達を行う。さらに、脂質－核酸粒子に含まれる本発明のイオン化可能脂質は、核酸の有効量での患者の処置が、患者に対する容認できない毒性及び／またはリスクに関連しないように、忍容性良好であり、十分な治療指数をもたらす。本発明は、これら及び関連する利点を提供する。
ＩＩＩ． 発明の概要
本発明は、例えば、ｍＲＮＡワクチンを成功させるための３つの基準である、（１）保護が持続的であること、（２）年間製造量が高いこと、及び（３）世界人口がワクチン接種にアクセスでき、ワクチン接種を受ける意思があることを満たす能力を大いに促進するワクチン候補に使用するための、核酸送達（例えば、ｍＲＮＡ）の効力の増大をもたらす脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に使用するための、本発明のイオン化可能脂質（以下に定義する）の驚くべき予想外の発見を提供する。本発明のイオン化可能脂質によってもたらされる効力の増大は、必要な用量及び有害反応を低減させるとともに、効能を維持し、コストを削減して製造能力を増大させることにより、世界的にワクチン接種を行う能力を増大させる。ある特定の実施形態では、これらの同じ用量での効力の増大により、保護が増大する。
本発明者らは、驚くべきことに、また予想外に、次の２つの手段：
１）改善されたイオン化可能脂質の設計及び性能、ならびに
２）ＬＮＰアセンブリのコントロールによる、より効率的な脂質ナノ粒子の生産
により、脂質ナノ粒子の設計によって、効力、すなわちｍＲＮＡ発現、免疫原性、及び保護（例えば、ワクチンの送達に使用した場合）を増大させる、ＬＮＰに使用できる新たなクラスのイオン化可能脂質を発見した。
ある特定の実施形態では、効力増大の尺度は、以前の臨床試験で使用されたものを代表する標準的なＬＮＰと同じレベルでウイルスチャレンジからの保護を得るために本発明のＬＮＰが達成する用量の低減である。
ある特定の実施形態では、本発明は、送達効率をコントロールすることが知られている、（１）エンドソームｐＨ範囲内のイオン化、（２）生理学的ｐＨでの正味電荷、ならびに（３）分岐及び飽和／不飽和に関連する脂質尾部の立体構造という３つの構造的特徴に焦点を当てた、イオン化可能脂質の設計の新規手法を包含する。
本発明は、予測された不適切な特性に基づいて望ましくない候補を排除することができる、合成候補のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析も包含する。本発明は、イオン化可能脂質を作製するための新規合成方法を包含する。他の実施形態では、新規方法は、水溶性アナログのＮＭＲを使用して本発明のイオン化可能脂質の分子イオン化を解析すること、及びあるｐＨ範囲（３～１０）にかけてＬＮＰのゼータ電位を測定することにより、設計ストラテジーを順守する。ある特定の実施形態では、候補の評価及び構造－機能関係（ＳＦＲ）の解明の手法は包括的であり、翻訳及び毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ評価、細胞取り込み、エンドソーム放出及び自然免疫センサー活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価、分布及び細胞輸送、免疫原性、及びウイルスチャレンジ研究における現在及び発展中の齧歯類及び非齧歯類動物モデルの使用のｉｎ ｖｉｖｏ解析を含むがこれに限定されない。
ある特定の実施形態では、脂質及びｍＲＮＡの混合濃度の上昇に起因するｍＲＮＡ ＬＮＰの増大したｉｎ ｖｉｖｏ発現（例えば、５倍超）が、アセンブリ中に達成される。ある特定の実施形態では、これらのパラメータを系統的に検査することに関連する主要な技術的課題及び高コストが克服される。本発明は、この所見を数々のイオン化可能脂質に汎用することにより、より効力のあるＬＮＰの工業生産を変容させ得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡワクチンの筋肉内送達、及び所望の細胞、組織、または臓器への集中投与のための、効力のあるイオン化可能脂質の設計及び合成を包含する。
別の実施形態では、本発明は、以前の送達方法と比較して効力を増大させるとともに用量を低減させ（例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍）、かつ同様の発現、免疫原性、及びウイルスチャレンジからの保護を維持する、イオン化可能脂質を包含する。
別の実施形態では、本発明は、中性ｐＨで正に荷電されたＬＮＰを生産して全身への拡散を制限するとともに、エンドソームのイオン化を増大させてワクチン効力を増大させる、本発明のイオン化可能脂質の多価頭部基のイオン化特性の最適化を包含し、高度に分岐した分解性の脂質尾部は、エンドソーム放出によって効力をさらに増大させることができ、イオン化可能脂質の電荷及び構造は、ＬＮＰアジュバント性に影響を与え得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＬＮＰは、効力を増大させて有害事象を制限し、製造コストを削減し、世界的なワクチン接種能力を増大させる。
他の実施形態では、本発明は、より効力のある系及び基礎となる構造－機能関係（ＳＦＲ）を特定するために物理化学的特性及び生物学的特性を評価するためのイオン化可能脂質及びＬＮＰの設計及び合成を包含する。
別の実施形態では、本発明は、ＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａを含むソフトウェアを使用したイオン化可能脂質のｐＫａの予測により、本発明のイオン化可能脂質の設計を大幅に加速する方法を包含する。
他の実施形態では、脂質について予測される水性ｐＫａはすべて、ＴＮＳによって測定されるものよりも有意に高い。ある特定の実施形態では、水性環境からＬＮＰ環境にかけてのｐＫａの低下（例えば、１～３ポイントの低下）は、ＬＮＰの文献ではこれまでに認められていないが、脂質膜中の塩基性アミノ酸については公知である。理論に拘束されるものではないが、合理的な説明は、水相と比較して脂質相のプロトンの溶媒和エネルギーが高いこと、及びカチオン性ＬＮＰからのプロトンの静電反発から見出すことができ、これらが組み合わさって、ｐＫａを水相から脂質相にかけて１～３ポイント低減させ得る。ある特定の実施形態では、潜在的候補のｐＫａ表を調べ、適切なｐＫａ値をもつものだけを選択することにより、特定の頭部基及び炭素スペーサーを選択するために、この能力が利用される。候補の大半をこの様式で正確に排除することができ、合成及び試験の時間及び費用が大幅に節約される。
ある特定の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に使用される最適化された本発明のイオン化可能脂質を包含する。例示的なＬＮＰは、本発明のイオン化可能脂質と、第２の脂質と、ステロイドと、ポリマー共役脂質と、ＬＮＰに封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩とを含む。
ある特定の実施形態では、本発明者らは、本発明のイオン化可能脂質の最適化された製剤の特徴が、治療剤の送達に関連するＬＮＰ特性の重要な改善（例えば、安定性の増大及び送達の増強）をもたらすことを予想外に発見した。
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子に含まれる本発明のイオン化可能脂質は、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及び／またはメッセンジャーＲＮＡなどの核酸を送達するために使用される。
したがって、一実施形態では、ＬＮＰであって、
ｉ）本発明のイオン化可能脂質と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはその薬学的に許容される塩と
を含む、ＬＮＰが提供される。
別の実施形態は、ＬＮＰであって、
ｉ）５．５超の有効ＬＮＰ ｐＫａを有する０．１～７５モルパーセントの本発明のイオン化可能脂質と、
ｉｉ）０～５０モルパーセントの中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）０～５０モルパーセントのアニオン性脂質と、
ｉｖ）１０～５５モルパーセントのステロイドと、
ｖ）０．１～１０モルパーセントのポリマー共役脂質と、
ｖｉ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、ＬＮＰを提供し、
モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。
別の実施形態は、脂質ナノ粒子であって、
ｉ）有効ｐＫａを有する本発明のイオン化可能脂質と、
ｉｉ）中性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと
を含む、脂質ナノ粒子を提供する。
他の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子に使用するための本発明のイオン化可能脂質を含む医薬組成物、ならびに感染性物質、がん、及び／またはタンパク質の不足によって引き起こされるものなどの様々な疾患または状態の処置のためにそれを使用する方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、治療剤の標的投与（例えば、特定の組織または臓器への）を、それを必要とする患者に行う方法であって、本発明のイオン化可能脂質またはそれを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
ある特定の具体的な実施形態では、本発明は、式Ｖ：
Figure 2023546908000002
 の化合物を包含し、
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員ヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３及びＲ１４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１５、及びＲ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｗ、ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、
各Ｑは、独立的に、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、及びＳから選択される原子であり、
ｍの各々は、０～８の整数、好ましくは０、１、または２であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
式ＩＩＩの化合物：
Figure 2023546908000003
 ［式中、各Ｒ１’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１１、及びＲ１２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成してもよく、ここで、ＱがＳまたはＯである場合、ＳまたはＯに結合しているＲ１は電子対であり、
各Ｒ３及びＲ４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、
Ｇ及びＱは各々独立的に、ＣＨ、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される原子であり、
ｍ及びｎの各々は、０～８の整数であり、
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される］。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000004
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000005
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000006
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000007
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000008
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000009
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000010
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000011
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000012
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000013
 を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、該化合物は、次の構造：
Figure 2023546908000014
 を有する。
他の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子であって、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される化合物と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤、例えばｍＲＮＡ、またはその薬学的に許容される塩と
を含む、脂質ナノ粒子を包含する。
他の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子であって、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される化合物と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、脂質ナノ粒子を包含する。
他の実施形態では、本発明は、対象への核酸の標的送達を行う方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、脂質ナノ粒子が、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される化合物と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤、例えばｍＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、またはその薬学的に許容される塩と
を含む、方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、対象への核酸の標的送達を行う方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、脂質ナノ粒子が、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される化合物と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子であって、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される本発明のイオン化可能脂質と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、脂質ナノ粒子を包含する。
他の実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子であって、
ｉ）次の構造の化合物と、
Figure 2023546908000015
 ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、脂質ナノ粒子を包含する。
他の実施形態では、本発明は、対象に核酸を送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、脂質ナノ粒子が、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される本発明のイオン化可能脂質と、
ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、対象に核酸を送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、脂質ナノ粒子が、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される本発明のイオン化可能脂質、例えば、次式の化合物と、
Figure 2023546908000016
 ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質、ワクチン、遺伝子編集ＲＮＡを含む治療剤を対象に送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、脂質ナノ粒子が、
ｉ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの構造に包含される本発明のイオン化可能脂質、例えば、次の構造の化合物と、
Figure 2023546908000017
 ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
ｉｉｉ）ステロイドと、
ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
ｖ）脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
を含む、方法を包含する。
ＩＶ． 図面の簡単な説明
脂質ナノ粒子に含まれる本発明のイオン化可能脂質を使用して、ｍＲＮＡの効力及び送達を増強及び改善するための例示的な手法を示す。 Ａは、ｐＨ７からｐｈ１２にかけて滴定されたＭＣ３のカスタム合成された水溶性頭部基の水相ｐＫａと、ＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａにより予測された９．４と同様の９．４５のｐＫａが得られるように、測定されたジメチルアミンプロトンをＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式（ＨＨ）に当てはめた場合の化学シフトとのグラフを示す。Ｂは、５つのアザンジイルジエステル（ＡＤＤＥ）ＬＮＰ、ならびにＭＣ３及びＫＣ２標準を用いて作製された２つのＬＮＰのゼータ電位が、ｐＨ３からｐＨ１０にかけて測定されたグラフを示す。Ｃは、ＨＨに当てはめた従来型のＴＮＳ法を使用して測定されたＬＮＰ ｐＫａを示す。 Ａは、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイを示す。Ｂは、注射４時間後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＲＮＡ Ｆｌｕｃのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を示す。Ｃは、空のＬＮＰのｃｒｙｏＴＥＭ画像を示す。 例示的な本発明の第１世代ＡＤＤＥイオン化可能脂質が呈したロバストな結合抗体応答を示す。Ａは、ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的ＩｇＧを示す。Ｂは、ＶＳＶＤＧ－ＲＦＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する中和抗体を示す。 空のＬＮＰのｃｒｙｏＴＥＭ画像を示す。ｍＲＮＡを含まないＫＣ２ ＬＮＰを混合し、ｐＨ４バッファーに排出すると、ｐＨ７での高電子密度に対して、小さな低電子密度構造が示された。 Ａは、マイクロ流体混合中の脂質及びｍＲＮＡの濃度を上昇させた場合のＬＮＰ効力の増大を示す。Ｂは、本発明のＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏターゲティングを示す。 実施例１Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例１Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１Ｄに例示する、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生死判定試薬に基づく毒性アッセイのグラフを示す。 実施例２Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例２Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例２Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例３Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例３Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例３Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例３Ｄに例示する、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生死判定試薬に基づく毒性アッセイのグラフを示す。 実施例４Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例４Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例４Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例５Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例５Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例５Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例５Ｄに例示する、注射４時間後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＲＮＡ ＦｌｕｃのＩｎ ｖｉｖｏ翻訳のグラフを示す。 実施例６Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例６Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例６Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例７Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例７Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例７Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 イオン化及び電荷の分子解析及びＬＮＰ解析のグラフを示す。ｐＨ７からｐＨ１２にかけて滴定されたＭＣ３のカスタム合成された水溶性頭部基の水相ｐＫａと、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ（ＨＨ）の式を当てはめるために測定されたＤＭＡプロトンの化学シフトとを示す。 イオン化及び電荷の分子解析及びＬＮＰ解析のグラフを示す。ｐＨ３からｐＨ１０にかけて測定された、５つのＡＤＤＥ ＬＮＰ、ならびにＭＣ３及びＫＣ２標準を用いて作製された２つのＬＮＰのゼータ電位を示す。 イオン化及び電荷の分子解析及びＬＮＰ解析のグラフを示す。ＨＨ式に当てはめた、ＬＮＰへの結合によるＴＮＳの従来型の蛍光増強を使用して測定されたＬＮＰ ｐＫａを示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼレポーター発現を示す。１２０００個（１２ｋ）の細胞を含むウェル当たり２５～２００ｎｇの用量で、血清含有培地中のＨＥＫ ２９３細胞に、５つのＡＤＤＥ ＬＮＰならびにＭＣ３及びＫＣ２ ＬＮＰにおいて送達されたＦｌｕｃ ｍＲＮＡを示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼレポーター発現を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＭ注射によって送達された２．５μｇのＦｌｕｃ ｍＲＮＡを示す（ＭＣ３及びＫＣ２含有ＬＮＰは、肝臓内でオフターゲットの全身性発現を示すが、ＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰは、発現を筋肉及び流入領域リンパ節にターゲティングする（ｅｘ ｖｉｖｏ参照）。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼレポーター発現を示す。６５ｎｍのＤＬＳ個数粒径によって測定された直径に対応する直径を有する球状ＬＮＰを示す、ＣｒｙｏＴＥＭを使用してイメージングされたＫＣ２含有ＬＮＰを示す。 ４つの異なるＬＮＰ中の０．３ｍｇ（緑）及び１０ｍｇ（青）のＳ－２Ｐ ｍＲＮＡコード免疫原で第０週及び第３週に免疫し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的ＩｇＧについてＥＬＩＳＡによって評価したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）における、ロバストな結合抗体応答を誘発するＡＤＤＥイオン化可能脂質を示す。 ＶＳＶΔＧ－ＲＦＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する中和抗体を示す。 実施例８Ａに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例８Ｂに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例８Ｃに例示する、ＬＮＰの電荷、ｐＫａ及びＰｉに対するゼータ電位のグラフを示す。 実施例８Ｄに例示する、ＬＮＰ ｐＫａのためのＴＮＳアッセイのグラフを示す。 実施例９Ａに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例９Ｂに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。左から右に（ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ）の４時間のｉｎ－ｖｉｖｏイメージング（左は第１群、右は第２群）を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。左から右に（ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ）の筋肉内投与後の全身分布及び局所濃度を示す、筋肉及び肝臓における存在を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。左から右に（ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ）の２４時間のｉｎ－ｖｉｖｏイメージング（左は第１群、右は第２群）を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。左から右に（ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ）の筋肉内投与後の全身分布及び局所濃度を示す、筋肉及び肝臓における存在を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。筋肉内投与後のＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺのサンプルの分布を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。筋肉内投与後のＭＣ３のサンプルの分布を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。筋肉内投与後のＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺのサンプルの分布を示す。 筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でのマウスにおける５ｕｇの封入ｍＲＮＡのＩＭ投与におけるｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。筋肉内投与後のＢＯＤＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺのサンプルの分布を示す。 実施例１０Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例１０Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１０Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１１Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例１１Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１１Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１２Ｂに例示する、ホタルルシフェラーゼアッセイを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ効力に基づく安定性アッセイのグラフを示す。 実施例１２Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１３Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例１３Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１３Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１４Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイのグラフを示す。 実施例１４Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１４Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１５Ａに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１５Ｂに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏで標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す、高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを示す。 実施例１６Ａに例示する、Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性エンドポイントＥＬＩＳＡ抗ＲＢＤ力価（ブースト前）を示す。 実施例１６Ａに例示する、Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性エンドポイントＥＬＩＳＡ抗ＲＢＤ力価（ブースト後）を示す。 実施例１６Ｂに例示する、偽中和アッセイのＩｎ ｖｉｖｏ免疫原性ＦＲＮＴ５０力価を示す。 実施例１７Ａに例示するチャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏでのウイルスチャレンジからの保護（生存割合、体重及び体温）を示す。Ａ（生存割合：ＭＣ３－ＳＲ）；Ｂ（生存割合：ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺ－ＨＯ）。 実施例１７Ｂに例示するチャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏの体重及び体温を示す。 実施例１７Ｂに例示するチャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏの体重及び体温を示す。 実施例１７Ｂに例示するチャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏの体重及び体温を示す。 実施例１７Ｂに例示するチャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏの体重及び体温を示す。 実施例１８Ａに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１８Ｂに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 実施例１８Ｃに例示する、ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現を示す。 ＭＣ３標準より優れている、ＩＭ投与用の複数の本発明の第２世代イオン化可能脂質のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示す。 ＭＣ３標準より優れている、ＩＶ投与用の複数の本発明の第２世代イオン化可能脂質のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示す。 実施例１９Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイを示す。 実施例１９Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイを示す。 実施例１９Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例１９Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例２０Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイを示す。 実施例２０Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例２０Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例２１Ａに例示する、ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイを示す。 実施例２１Ｂに例示する、ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイのグラフを示す。 実施例２１Ｃに例示する、ＬＮＰサイズのための動的光散乱のグラフを示す（白い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。 実施例２２Ａに例示する、ＩＭ投与における注射部位のＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２２Ａに例示する、ＩＭ投与における注射部位のＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２２Ｂに例示する、ＩＭ投与における注射部位のＥｘ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２２Ｂに例示する、ＩＭ投与における注射部位のＥｘ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２３Ａに例示する、ＩＭ投与における注射部位のｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２３Ａに例示する、ＩＭ投与における注射部位のｉｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２３Ｂに例示する、ＩＭ投与における注射部位のｅｘ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２３Ｂに例示する、ＩＭ投与における注射部位のｅｘ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 実施例２３Ｂに例示する、ＩＭ投与における注射部位のｅｘ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現の結果を示す。 Ａ～Ｆは、マルチプロトン性Ｃ２４イオン化可能脂質が、ＬＮＰ内の多段階プロトン化、及びＭＣ３ ＬＮＰよりも高度のエンドソームｐＨ範囲内のプロトン化をもたらす結果と、ＭＣ３ ＬＮＰ及びＣ２４ ＬＮＰの比較データとを示す。 Ａ～Ｃは、Ｃ２４及びＭＣ３脂質ナノ粒子の構造特性の効果を示す。Ａ～Ｃは、空のＬＮＰを示す。 Ａ～Ｆは、Ｃ２４ ＬＮＰを用いた場合、ＭＣ３よりも有意に高いオンターゲットｍＲＮＡ発現及び低いオフターゲットｍＲＮＡ発現を示す、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける筋肉内（ＩＭ）投与後のルシフェラーゼ発現の結果を示す。 Ａ～Ｅは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた免疫原性研究において、Ｃ２４ ＬＮＰが、ＭＣ３ ＬＮＰよりも１０倍高い結合及び偽中和抗体力価を生じる結果を示す。 Ａ～Ｉは、Ｓ２Ｐ免疫原の低用量での致死性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する防御能があり、肺感染を完全に消失させるＣ２４ ＬＮＰを示す。Ｂ～Ｉは、ＭＣ３及びＣ２４ ＬＮＰの比較データを示す。 Ａ～Ｉは、Ｃ２４の局所注射部位の炎症がＭＣ３ ｍＲＮＡ ＬＮＰよりも低度であることを示す。 Ａ～Ｆは、２週間にわたり、４℃では安定であるが、より高い温度では低下する、Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰの生物活性及びｍＲＮＡ完全性を示す。 ０．１～１．０μｇの範囲の用量でのｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰのプライム－ブーストワクチン接種後０日目の致死量チャレンジにかけられたＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおける体重及び体温の効果を示す。 マイクロ流体混合中の脂質及びｍＲＮＡの濃度を上昇させると、ＬＮＰ効力及びエンドソームプロトン化が増大することを示す。Ａ）より高い濃度でアセンブルされたＫＣ２ ＬＮＰは、１２０００個のＨＥＫ２９３細胞を含むウェル当たり２５～２００ｎｇの同じ用量で、より高いｉｎ ｖｉｔｒｏのＦｌｕｃ発現をもたらした。Ｂ）より高い混合濃度で生成し（混合時の総脂質濃度をｍＭ単位で動物の上に示してある）、ＩＭ注射用に５０μＬ中５μｇの一定用量に希釈したＬＮＰは、より効力が高い（カラーバーは、１０７ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒの輝度である）。Ｃ）ゼータ電位測定は、高濃度混合によって調製されたＬＮＰではｐＨが７．４から５に低下するとプロトン化が大幅に増大することを示し、より高度のエンドソーム放出を示唆している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び動物モデルで測定され、モデル化され、送達効率、ターゲティング、毒性及び反応原性と関連付けられる、ＬＮＰ性能の決定因子を示す。 イオン化可能脂質の例示的なＢＯＤＤ ＰｉｐＺタイプを示す。このファミリーの１２のメンバーを、異なる炭素スペーサーを用いて合成し、２ポイント範囲に及ぶ分子マクロイオン化定数（上のＮに示されている）を有するイオン化可能脂質を生成して、得られたＬＮＰ電荷及びエンドソームプロトン化を解析し、これらの特徴を送達効率及びターゲティングと関連付けた。 負に荷電されたＬＮＰは、肝臓発現を低減させ、脾臓での発現を増大させることを示す。ｍＲＮＡ ＬＮＰアセンブリ前に、総脂質１５％及び３０％で、アニオン性脂質１８－１ＰＡを脂質ミックスに加えた。総脂質１５％で１８－１ＰＡを加えると、ＩＶ投与時のＦＬｕｃの肝臓発現が低減し、脾臓発現が２．５倍増大した。 標準的濃度（Ａ、Ｂにおける０．２ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ）及び高濃度（Ｃ、Ｄにおける１．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ）でのＦｌｕｃ ＬＮＰのアセンブリを、１：２ｖ／ｖでのエタノール／水への排出後（Ａ、Ｃ）、またはＰＢＳ中でｐＨ７．４への透析後（Ｂ、Ｄ）にイメージングしたことを示す。高い混合濃度で生成された高効力ｍＲＮＡ ＬＮＰは、混合直後により高いレベルの融合構造を示し（Ｃ対Ａ）、これらは透析後により均質なＬＮＰに変換された。
Ｖ． 本発明の詳細な説明
Ｖ．１． 定義
別段の定義がない限り、または特定の文脈上別段の解釈を必要としない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、関連する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
数字の文脈におけるパーセンテージは、それぞれの項目の総数に相対的なものとして理解されるべきである。他の場合では、文脈上別段の定めがない限り、パーセンテージは重量パーセンテージ（重量％）またはモルパーセンテージ（モル％）として理解されるべきである。
文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むと理解されるべきである。「ある実施形態」、「具体的な実施形態」、「一実施形態」などの表現は、特定の特徴、特性もしくは特質、または特徴、特性もしくは特質の特定の群もしくは組み合わせが、それぞれの表現と組み合わせて言及される場合、本発明の実施形態の少なくとも１つに存在することを意味する。本明細書全体の様々な箇所でのこれらの表現の記載は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、特性または特質は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、「適応免疫系」は、病原体の増殖及び複製を排除または防止する、高度に特殊化された全身の細胞及びプロセスから構成される。適応免疫応答は、脊椎動物の免疫系に、特定の病原体を認識及び記憶し（例えば、免疫を生成するため）、該病原体に遭遇するたびにより強力な攻撃を展開する能力を与える。この系は、体細胞高頻度突然変異（体細胞突然変異の頻度が増大するプロセス）、及びＶ（Ｄ）Ｊ組換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組換え）のため、適応性が高い。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の異なる抗原受容体を生成することができ、抗原受容体は次いで、各個のリンパ球で固有に発現される。遺伝子再構成は各細胞のＤＮＡに不可逆的な変化をもたらすため、その細胞の後代（子孫）のすべてが、長期の特異的免疫に重要である記憶Ｂ細胞及び記憶Ｔ細胞を含め、同じ受容体特異性をコードする遺伝子を受け継ぐことになる。免疫ネットワーク理論は、適応免疫系がどのように機能するかについての理論であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞の受容体の可変領域と、可変領域を有するＴ細胞及びＢ細胞によって作られる分子との間の相互作用に基づいている。本明細書で使用される場合、「適応免疫応答」という用語は、典型的には、抗原特異的であると理解される。抗原特異性は、特定の抗原、病原体、または病原体感染細胞に合わせて調整された応答の生成を可能にする。これらの調整された応答を展開する能力は、体内で「記憶細胞」によって維持される。病原体が身体に複数回感染した場合、それを迅速に排除するために、これらの特定の記憶細胞が使用される。この文脈において、適応免疫応答の最初のステップは、ナイーブ抗原特異的Ｔ細胞、または抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が絶えず通過しているリンパ組織及び臓器で起こる。抗原提示細胞として機能できる細胞型は、とりわけ、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これらの細胞は各々、免疫応答を誘発する際に異なる機能を有する。樹状細胞は、ファゴサイトーシス及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込み、例えば外来抗原との接触によって刺激されて局所リンパ組織に移動し、そこで成熟型樹状細胞に分化する。マクロファージは、細菌などの粒子状抗原を摂取し、ＭＨＣ分子を発現するように感染性因子または他の適切な刺激によって誘導される。可溶性タンパク質抗原に受容体を介して結合し、それらを内部移行させるＢ細胞のユニークな能力も、Ｔ細胞を誘導するために重要である可能性がある。ＭＨＣ分子上に抗原が提示されるとＴ細胞が活性化され、それらの増殖、及び武装したエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞による感染細胞の殺傷、及びＴｈ１細胞によるマクロファージの活性化（これらが合わさって細胞性免疫を構成する）、ならびにＴｈ２細胞とＴｈ１細胞との両方によるＢ細胞の活性化によって異なるクラスの抗体を産生し、したがって液性免疫応答を推進することである。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体によって抗原を認識し、Ｔ細胞受容体は、抗原を直接認識してそれに結合することはないが、代わりに、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来タンパク質抗原などの短いペプチドフラグメントを認識する。
本明細書で使用される場合、最も広い意味での「アジュバントまたはアジュバント成分」という用語は、典型的には、薬物またはワクチンなどの他の薬剤の効能を改変し得る、例えば増強し得る、（例えば、薬理学的または免疫学的）薬剤または組成物である。慣例的に、この用語は、本発明の文脈において、免疫原及び／または他の薬学的活性のある化合物のための担体または補助物質として機能する化合物または組成物を指す。これは広義に解釈されるものとし、問題のアジュバントに組み込まれるまたは問題のアジュバントと共投与される抗原の免疫原性を増大させることができる広範囲の物質を指す。本発明の文脈において、アジュバントは、好ましくは、本発明の活性剤の特異的な免疫原性効果を増強する。典型的に、「アジュバント」または「アジュバント成分」は同じ意味を有し、相互に使用され得る。アジュバントは、例えば、免疫強化剤、抗原性送達系、またはさらにはそれらの組み合わせに分けられ得る。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、典型的には、それ自体で免疫を付与する薬剤を含まないものと理解される。アジュバントは、例えば、免疫系への抗原の提示または非特異的な自然免疫応答の誘導を促進することにより、免疫系を非特異的に補助して抗原特異的免疫応答を増強する。さらに、アジュバントは、好ましくは、例えば、優勢なＴｈ２ベースの抗原特異的応答を、よりＴｈ１ベースの抗原特異的応答に、またはその逆にシフトすることなどにより、抗原特異的免疫応答を調節し得る。したがって、アジュバントは、サイトカイン発現／分泌、抗原提示、免疫応答のタイプなどを有利に調節することができる。
本明細書で使用される場合、「アルキル基」という用語は、飽和した一価の非分岐状または分岐状（置換または未置換）の炭化水素鎖を意味する。アルキル基の例は、（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２メチル２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２メチル－３－ブチル、２，２ジメチル１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３メチル－１－ペンチル、４メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４メチル２ペンチル、２，２ジメチル１ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びヘキシル、ならびにより長いアルキル基、例えばヘプチル、オクチル、デシル、ドデシルなどを含むがこれに限定されない。アルキル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。
本明細書で使用される場合、「アルケニル基」という用語は、中に１つ以上の二重結合を有する一価で非分岐状または分岐状の炭化水素鎖を意味する。アルケニル基の二重結合は、別の不飽和基と共役していなくても共役していてもよい。好適なアルケニル基は、（Ｃ２－Ｃ２２）アルケニル基、例えばビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、２－エチルヘキセニル、２－プロピル－２－ブテニル、４－（２－メチル－３－ブテン）－ペンテニルを含むがこれに限定されない。アルケニル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ基」という用語は、－Ｏ－アルキル基を意味し、ここでアルキルは、上記で定義したとおりである。アルコキシ基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、アルキルオキシ基のアルキル鎖は、炭素原子１～６個の長さであり、本明細書では「（Ｃ１－Ｃ２２）アルコキシ」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「アルコキシカルボニル」基という用語は、式－Ｃ（Ｏ）－アルコキシの一価基を意味する。好ましくは、アルコキシカルボニル基の炭化水素鎖は、炭素原子１～２２個の長さである。
本明細書で使用される場合、「アルキニル基」という用語は、中に１つ以上の三重結合を有する一価で非分岐状または分岐状の炭化水素鎖を意味する。アルキニル基の三重結合は、別の不飽和基と共役していなくても共役していてもよい。好適なアルキニル基は、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル基、例えばエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、メチルプロピニル、４－メチル－１－ブチニル、４－プロピル－２－ペンチニル、及び４－ブチル－２－ヘキシニルを含むがこれに限定されない。アルキニル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈において、「抗原」は、典型的には、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識されることができ、抗原特異的免疫応答を（例えば、適応免疫応答の一部としての抗体及び／または抗原特異的Ｔ細胞の形成により）引き起こすことができる物質を指す。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチドまたはタンパク質であり得るか、またはそれらを含み得る。本発明の意味において、抗原は、提供された核酸分子、好ましくは本明細書で提示されるｍＲＮＡの翻訳産物であり得る。この文脈において、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド及びタンパク質のフラグメント、バリアント及び誘導体も、抗原として理解される。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈における「抗原を提供するｍＲＮＡ」という用語は、典型的には、そのｍＲＮＡを供給された細胞または生物によって翻訳され得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡであり得る。この翻訳の産物は、抗原として、好ましくは免疫原として作用し得る、ペプチドまたはタンパク質である。この産物は、２つ以上の免疫原から構成された融合タンパク質（例えば、同じまたは異なるウイルスタンパク質に由来する２つ以上のエピトープ、ペプチドまたはタンパク質からなる融合タンパク質）である場合もあり、ここで、エピトープ、ペプチドまたはタンパク質は、リンカー配列によって連結されていてもよい。
本明細書で使用される場合、「人工ｍＲＮＡ（配列）」という用語は、典型的には、天然に発生しないｍＲＮＡ分子であると理解され得る。換言すると、人工ｍＲＮＡ分子は、非天然ｍＲＮＡ分子として理解され得る。そのようなｍＲＮＡ分子は、その個々の配列（天然に発生しない）のために、及び／または他の修飾、例えば天然に発生しないヌクレオチドの構造修飾のために、非天然であり得る。典型的には、人工ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に対応する遺伝子工学操作方法によって設計及び／または生成され得る。この文脈において、人工配列は通常、天然に発生しない可能性がある配列であり、すなわち、少なくとも１ヌクレオチドだけ野生型配列と異なる。「野生型」という用語は、天然に発生する配列として理解され得る。さらに、「人工核酸分子」という用語は、「単一の分子」を意味することに限定されず、典型的には、同一の分子の集合体を含むと理解される。したがって、これは、アリコートに含まれる複数の同一分子に関連し得る。
本明細書で使用される場合、「アリール基」という用語は、炭素原子及び水素原子を含む単環式または多環式の芳香族ラジカルを意味する。好適なアリール基の例は、フェニル、トリル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、及びナフチル、ならびに５，６，７，８－テトラヒドロナフチルなどのベンゾ縮合炭素環式部分を含むがこれに限定されない。アリール基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、アリール基は、環が６個の炭素原子を含む単環式環であり、本明細書では「（Ｃ６）アリール」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「アリールオキシ基」という用語は、－Ｏ－アリール基を意味し、ここでアリールは、上記で定義したとおりである。アリールオキシ基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、アリールオキシ基のアリール環は、環が６個の炭素原子を含む単環式環であり、本明細書では「（Ｃ６）アリールオキシ」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞エピトープ」という用語は、典型的には、抗体によって認識され得る、すなわち天然型である、好ましくは５～１５個のアミノ酸を有し、より好ましくは５～１２個のアミノ酸を有し、さらにより好ましくは６～９個のアミノ酸を有する、本明細書で定義される（天然）タンパク質またはペプチド抗原の外表面に位置するフラグメントである。タンパク質またはペプチドのそのようなエピトープはさらに、本明細書で言及される、そのようなタンパク質またはペプチドのバリアントのいずれかから選択され得る。この文脈において、抗原決定基は、本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造でまとめられる、本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドのセグメントで構成された立体構造エピトープもしくは不連続エピトープでもよく、または単一のポリペプチド鎖で構成された連続エピトープもしくは線状エピトープでもよい。
本明細書で使用される場合、「ベンジル」という用語は、－ＣＨ２－フェニルを意味する。
本明細書で使用される場合、「バイ／マルチシストロン性ｍＲＮＡ」という用語は、典型的には２つ（バイシストロン性）またはそれ以上（マルチシストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（コード領域またはコード配列）を有し得るｍＲＮＡである。これに関連するオープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質へと翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。そのようなｍＲＮＡの翻訳により、２つ（バイシストロン性）またはそれ以上（マルチシストロン性）の異なる翻訳産物が得られる（ただし、ＯＲＦが同一でないことを条件とする）。真核生物における発現では、そのようなｍＲＮＡは、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＰアナログ」という用語は、ＲＮＡ分子の５’末端に組み込まれるとＲＮＡ分子の翻訳もしくは局在化を容易にする及び／または分解を防止するという点で、ＣＡＰ機能を有する非重合性ジヌクレオチドを指す。非重合性とは、ＣＡＰアナログが、５’三リン酸をもたず、したがって鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長することができないため、５’末端でのみ組み込まれることを意味する。ある特定の実施形態では、５’－ｃａｐアナログは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｌｅａｎＣａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｃｌｅａｎｃａｐを利用する。本明細書で使用される場合、「ＣＡＰアナログ」という用語は、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣからなる群から選択される化学構造、非メチル化ＣＡＰアナログ（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化ＣＡＰアナログ（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化ＣＡＰアナログ（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称ＣＡＰアナログ（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースＣＡＰアナログ（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１．ＲＮＡ ７（１０）：１４８６－９５）を含むがこれに限定されない。さらなるＣＡＰアナログについては既報であり（米国特許第７，０７４，５９６号、ＷＯ２００８／０１６４７３、ＷＯ２００８／１５７６８８、ＷＯ２００９／１４９２５３、ＷＯ２０１１／０１５３４７、及びＷＯ２０１３／０５９４７５）、これらは全体が本明細書に組み込まれる。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドＣＡＰアナログの合成については最近報告されており（Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２１（１５）： ４５７０－４）、これは全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「５’－ＣＡＰ構造」という用語は、典型的には、ｍＲＮＡ分子の５’末端に付加された修飾ヌクレオチド（ＣＡＰアナログ）、特にグアニンヌクレオチドである。好ましくは、５’－ＣＡＰは、５’－５’－三リン酸結合を使用して付加される（別名ｍ７ＧｐｐｐＮ）。５’－ＣＡＰ構造のさらなる例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－反転ヌクレオチド部分、３’－３’－反転脱塩基部分、３’－２’－反転ヌクレオチド部分、３’－２’－反転脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。これらの修飾型５’－ＣＡＰ構造は、本発明の文脈において、本発明の組成物のｍＲＮＡ配列を修飾するために使用され得る。本発明の文脈において使用され得るさらなる修飾型５’－ＣＡＰ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の２番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の３番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の４番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースＣＡＰアナログ）、修飾型ＡＲＣＡ（例えばホスホチオエート修飾型ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンである。本発明の文脈では、ｃＣＡＰアナログを使用した化学的なＲＮＡ合成もしくはＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（同時転写キャッピング）において５’－ＣＡＰ構造を形成してもよく、またはキャッピング酵素（例えば、市販のキャッピングキット）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＰ構造を形成してもよい。
本明細書で使用される場合、「カルバモイル」基は、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２基を意味し、ここで、Ｒ’は、水素、アルキル、及びアリールからなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、「カルボニル」基は、式－Ｃ＝（Ｏ）－の二価基である。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈における「担体」という用語は、典型的には、別の化合物の輸送及び／または複合体化を容易にする化合物であり得る。前記担体は、前記他の化合物と複合体を形成し得る。ポリマー担体は、ポリマーから形成された担体である。
特定の文脈から異なる意味が明らかである場合を除き、「カチオン性」という用語は、それぞれの構造が、恒久的に、または恒久的ではないがｐＨなどのある特定の条件に応答して、正電荷を帯びることを意味する。したがって、「カチオン性」という用語は、「恒久的にカチオン性」及び「カチオン化可能」の両方をカバーする。本明細書で使用される場合、「恒久的にカチオン性」は、それぞれの化合物、または基もしくは原子が、その環境のいずれのｐＨ値または水素イオン活性でも正に荷電されていることを意味する。典型的には、正電荷は、第四級窒素原子の存在の結果である。化合物がそのような正電荷を複数有する場合、それは恒久的にポリカチオン性と呼ばれることがあり、これは恒久的にカチオン性のサブカテゴリーである。
本明細書で使用される場合、「細胞性免疫／細胞性免疫応答」という用語は、典型的には、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答した様々なサイトカインの放出に関する。より一般的に言えば、細胞性免疫は、抗体ではなく免疫系の細胞の活性化に関連する。細胞性免疫応答は、例えば、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を含む細胞、及び腫瘍抗原を提示するがん細胞など、表面に抗原のエピトープを提示する体細胞のアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させること、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが病原体を破壊できるようにすること、ならびに適応免疫応答及び自然免疫応答に関与する他の細胞の機能に影響を与える種々のサイトカインを分泌させるように細胞を刺激することによって特徴付けられる。
本発明の文脈において、「組成物」は、特定の成分が、場合により任意のさらなる構成成分と併せて、通常は少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と共に組み込まれ得る、あらゆるタイプの組成物を指す。したがって、組成物は、粉末もしくは顆粒などの乾燥組成物、または凍結乾燥形態もしくは錠剤などの固体単位であり得る。代替的に、組成物は液体の形態でもよく、各構成成分が溶解または分散した（例えば懸濁または乳化した）形態で独立的に組み込まれていてもよい。好ましい実施形態の１つにおいて、組成物は、水性液体担体で再構成するための粉末または凍結乾燥形態などの無菌固体組成物として製剤される。そのような製剤は、以下でさらに詳細に説明するような核酸カーゴを含むバージョンの組成物にも好ましい。
本明細書で使用される場合、「化合物」は、本質的に同じ化学構造及び特性を有する複数の分子からなる物質である化学物質（例えば、本発明のイオン化可能脂質）を意味する。低分子化合物の場合、これらの分子は通常、原子組成及び構造的構成に関して同一である。高分子化合物またはポリマー化合物の場合、化合物の分子同士は高度に類似しているが、それらのすべてが必ずしも同一であるとは限らない。例えば、５０個の単量体単位からなると称されるポリマーのセグメントは、例えば４８個または５３個の単量体単位を有する個々の分子も含み得る。
文脈上別段の記載がある場合または別段の解釈を必要とする場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉ならびに同様の表現は、本明細書及び特許請求の範囲では、オープンかつ包括的な意味で、「を含むがこれに限定されない」として解釈されるものとする。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル基」という用語は、炭素原子及び水素原子を含み、炭素－炭素多重結合を有しない、単環式または多環式の飽和環を意味する。シクロアルキル基の例は、（Ｃ３－Ｃ７）シクロアルキル基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチル、ならびに飽和環式及び二環式テルペンを含むがこれに限定されない。シクロアルキル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基によって置換されていてもよい。好ましくは、シクロアルキル基は、単環式環または二環式環である。
本明細書で使用される場合、「ペプチドまたはタンパク質の誘導体」という用語は、典型的には、前記ペプチドまたはタンパク質などの別の分子に由来する分子であると理解される。ペプチドまたはタンパク質の「誘導体」には、本発明で使用されるペプチドまたはタンパク質を含む融合物も包含される。例えば、融合物は、例えば、エピトープ、例えば、ＦＬＡＧエピトープまたはＶ５エピトープなどの標識を含む。例えば、エピトープはＦＬＡＧエピトープである。そのようなタグは、例えば、融合タンパク質を精製するために有用である。
本明細書で使用される場合、「エピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）」という用語は、本発明の文脈におけるＴ細胞エピトープまたはタンパク質の一部を指し、好ましくは約６個～約２０個またはさらに多くのアミノ酸の長さを有するフラグメント、例えば、好ましくは約８個～約１０個、例えば８個、９個、もしくは１０個のアミノ酸（またはさらには１１個もしくは１２個のアミノ酸）の長さを有する、ＭＨＣクラスＩ分子によってプロセシング及び提示されるフラグメント、または、好ましくは約１３個以上のアミノ酸、例えば１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、もしくはさらに多くのアミノ酸の長さを有する、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロセシング及び提示されるフラグメントを含み得、これらのフラグメントは、アミノ酸配列のいずれの部分から選択されてもよい。これらのフラグメントは通常、ペプチドフラグメント及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈におけるタンパク質またはペプチドの「フラグメント」という用語は、典型的には、本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドの配列であって、そのアミノ酸配列（またはそのコードされた核酸分子）に関し、元の（天然の）タンパク質のアミノ酸配列（またはそのコードされた核酸分子）と比較してＮ末端及び／またはＣ末端で切断されている配列を含み得る。したがって、そのような切断は、アミノ酸レベルまたは対応する核酸レベルのいずれでも起こり得る。したがって、本明細書で定義されるようなフラグメントに関する配列同一性は、好ましくは、本明細書で定義されるタンパク質もしくはペプチドの全体、またはそのようなタンパク質もしくはペプチドの（コード）核酸分子の全体を指し得る。この文脈において、タンパク質のフラグメントは、典型的には、それぞれの天然に発生する完全長タンパク質のアミノ酸配列との、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈における「タンパク質またはペプチドのフラグメント」という用語は、例えば少なくとも５個のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも７個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも９個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１１個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１３個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１６個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１７個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１８個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１９個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、または最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸の長さを有する、本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドの配列をさらに含み得る。例えば、そのようなフラグメントは、約６個～約２０個またはさらに多くのアミノ酸の長さを有してもよく、例えば、好ましくは約８個～約１０個、例えば８個、９個、もしくは１０個のアミノ酸（またはさらには６個、７個、１１個もしくは１２個のアミノ酸）の長さを有する、ＭＨＣクラスＩ分子によってプロセシング及び提示されるフラグメント、または、好ましくは約１３個以上のアミノ酸、例えば１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、もしくはさらに多くのアミノ酸の長さを有する、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロセシング及び提示されるフラグメントであり得、これらのフラグメントは、アミノ酸配列のいずれの部分から選択されてもよい。これらのフラグメントは通常、ペプチドフラグメント及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識され、すなわち、これらのフラグメントは通常、天然型では認識されない。タンパク質またはペプチドのフラグメントは、これらのタンパク質またはペプチドの少なくとも１つのエピトープを含み得る。さらに、細胞外ドメイン、細胞内ドメインまたは膜貫通ドメインのような、タンパク質のドメイン、及びタンパク質の短縮型または切断型も、タンパク質のフラグメントを構成すると理解され得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「完全長タンパク質」という用語は、典型的には、天然に発生するタンパク質のアミノ酸配列全体を実質的に含むタンパク質を指す。しかしながら、例えばタンパク質における突然変異によるアミノ酸の置換も、完全長タンパク質という用語に包含される。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。したがって、「ハロ」及び「Ｈａｌ」という用語の意味は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを包含する。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール基」という用語は、炭素原子、水素原子、ならびに窒素、酸素、及び硫黄から独立的に選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくは１～３つのヘテロ原子を含む、単環式または多環式の芳香環を意味する。ヘテロアリール基の具体例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジル、トリアジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、（１，２，３）－トリアゾリル及び（１，２，４）－トリアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、フリル、チオフェニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリル、フェニル、イソオキサゾリル、ならびにオキサゾリルを含むがこれに限定されない。ヘテロアリール基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、ヘテロアリール基は、環が２～５個の炭素原子及び１～３個のヘテロ原子を含む単環式環であり、本明細書では「（Ｃ２－Ｃ５）ヘテロアリール」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキル基」という用語は、炭素原子及び水素原子、ならびに窒素、酸素、及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１～３つのヘテロ原子を含み、不飽和を有しない、単環式または多環式の環を意味する。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピロリジニル、ピロリジノ、ピペリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、ピペラジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、ジオキソラニル、チオモルホリノ、及びピラニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、ヘテロシクロアルキル基は、環が３～６個の炭素原子及び１～３個のヘテロ原子を含む単環式環または二環式環、より好ましくは単環式環であり、本明細書では（Ｃ１－Ｃ６）ヘテロシクロアルキルと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「複素環式ラジカル」または「複素環式環」という用語は、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基を意味する。
本明細書で使用される場合、「液性免疫」という用語は、典型的には、抗体産生及びそれに付随し得る補助的プロセスを指す。液性免疫応答は、典型的には、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心形成及びアイソタイプスイッチ、親和性成熟及び記憶細胞生成によって特徴付けられ得る。液性免疫はまた、典型的には、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、ならびにファゴサイトーシス及び病原体排除のオプソニン促進を含む、抗体のエフェクター機能を指し得る。
本明細書で使用される場合、「水和物」という用語は、本発明の化合物またはその塩であって、非共有分子間力により結合した化学量論量または非化学量論量の水をさらに含む化合物またはその塩を意味する。水和物という用語には、非共有分子間力により結合した化学量論量または非化学量論量の溶媒である溶媒和物が含まれる。好ましい溶媒は、揮発性、非毒性、及び／または微量でのヒトへの投与に許容されるものである。
本明細書で使用される場合、「ヒドロカルビル」基という用語は、１つまたは２つの好適な置換基で場合により置換されている、（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２２）アルケニル、及び（Ｃ２－Ｃ８）アルキニルから選択される一価基を意味する。好ましくは、ヒドロカルビル基の炭化水素鎖は、炭素原子１～２２個の長さであり、本明細書では、ある特定の場合に「（Ｃ１－Ｃ２２）ヒドロカルビル」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「配列の同一性」という用語は、２つの配列、例えば本明細書で定義される核酸配列またはアミノ酸配列、好ましくは本明細書で定義されるポリマー担体の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列またはアミノ酸配列自体が同一であるパーセンテージを意味し、これらの配列は、後に互いと比較されるためにアラインされ得る。したがって、例えば、第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と比較され得る。第１の配列における位置が、第２の配列における位置と同様に同じ成分（残基）で占められていれば、２つの配列はその位置において同一である。そうでなければ、これらの配列はその位置で異なっている。第１の配列と比較して第２の配列に挿入が生じる場合、第１の配列にギャップを挿入して、さらなるアラインメントを可能にしてもよい。第１の配列と比較して第２の配列に欠失が生じる場合、第２の配列にギャップを挿入して、さらなるアラインメントを可能にしてもよい。よって、２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列でのみ占められている位置を含む位置の総数で割った関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。使用できる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９０：５８７３－５８７７またはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９－３４０２のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。このプログラムにより、ある程度まで本発明の配列と同一である配列を識別することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫系」という用語は、生物を感染から保護し得る。病原体が生物の物理的バリアを突破してこの生物に侵入した場合、自然免疫系は、速やかだが非特異的な応答をもたらす。病原体がこの先天的応答を逃れた場合、脊椎動物は防御の第２層である適応免疫系を備えている。ここで、免疫系は、病原体の認識を改善するように感染中の応答を適応させる。この応答の改善は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇するたびに適応免疫系がより迅速でより強力な攻撃を展開できるようにする。これによると、免疫系は自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分の各々には、いわゆる液性成分及び細胞成分が含まれる。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、典型的には、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（いわゆる特異的免疫応答もしくは適応免疫応答）または自然免疫系の非特異的反応（いわゆる非特異的免疫応答もしくは自然免疫応答）のいずれかであり得る。本発明は、適応免疫系の特異的反応（適応免疫応答）の中核に関する。特に、本発明は、例えばインフルエンザウイルスのようなウイルスによる感染に対する適応免疫応答に関する。しかし、この特異的応答は、追加の非特異的反応（自然免疫応答）によってサポートされ得る。したがって、本発明は、効率的な適応免疫応答を誘起するために自然免疫系及び適応免疫系を同時に刺激するための化合物にも関する。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈における「免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）」という用語は、典型的には、自然免疫応答自体を誘導することができるＲＮＡであり得る。これは通常オープンリーディングフレームを有せず、したがってペプチド抗原または免疫原をもたらさないが、例えば特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）または他の好適な受容体に結合することにより、自然免疫応答を誘発する。しかし、当然ながら、オープンリーディングフレームを有し、ペプチド／タンパク質（例えば抗原性機能）をコードするｍＲＮＡも、自然免疫応答を誘導し得る。
本明細書で使用される場合、「インフルエンザパンデミックまたはパンデミックインフル」という用語は、非ヒト（新規）インフルエンザウイルスが、効率的かつ持続的にヒトからヒトに伝染する能力を獲得して、世界的に広がる場合に起こり得る。パンデミックを引き起こす可能性を有するインフルエンザウイルスは、「パンデミックの可能性があるインフルエンザウイルス」または「パンデミックインフルエンザウイルス」と呼ばれる。パンデミックの可能性があるインフルエンザウイルスの例としては、２つの異なる「トリインフル」ウイルスであるトリインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）及びトリインフルエンザＡ（Ｈ７Ｎ９）が挙げられる。これらは非ヒトウイルスである（すなわち、ヒトの間では新規であり、世界の一部の鳥類で循環している）ため、ヒトにおいてこれらのウイルスに対する免疫はほとんどまたはまったくない。これらのウイルスへのヒトの感染は稀にしか起こっていないが、これらのウイルスのいずれかが、ヒトに容易に感染してヒトからヒトへと容易に広がることができるように変化した場合、インフルエンザパンデミックが発生し得る。
本明細書で使用される場合、非特異的免疫系としても知られる「自然免疫系」という用語は、他の生物による感染から宿主を非特異的に防御する細胞及び機序を含む。これは、自然系の細胞が包括的に病原体を認識してそれに応答するが、適応免疫系とは異なり、長期的または防御的な免疫を宿主に付与しないことを意味する。自然免疫系は、例えば、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、または他の補助物質、例えばリポ多糖、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ４０リガンド、もしくはサイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキンもしくはケモカイン、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、成長因子、及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２もしくはＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ－Ｉ様受容体のリガンド、免疫刺激性核酸、免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ－ＤＮＡ、抗菌剤、または抗ウイルス剤によって活性化され得る。典型的には、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊化した化学媒介物質を含む化学因子の産生による、感染部位への免疫細胞の動員；補体カスケードの活性化；特殊化した白血球による、臓器、組織、血液及びリンパに存在する外来物質の識別及び除去；抗原提示として知られるプロセスによる適応免疫系の活性化；及び／または感染性因子に対する物理的バリア及び化学的バリアとしての作用を含む。
本明細書で使用される場合、「イオン化可能」という用語（例えば、「本発明のイオン化可能脂質」という用語で使用される場合）は、化合物、または基もしくは原子が、その環境のある特定のｐＨでは荷電され、別のｐＨでは無電荷であることを意味する。また、ｐＨ値を決定できない非水性環境では、イオン化可能な化合物、基、または原子は、水素イオン濃度が高いと正に荷電され、水素イオンの濃度または活性が低いと負に荷電されるかまたは非荷電である。どのｐＨまたは水素イオン濃度で荷電されるまたは非荷電であるかは、イオン化可能またはポリイオン化可能な化合物の個々の特性、特にそれぞれのイオン化可能な基または原子のｐＫａに依存する。希釈水性環境において、電荷を有するイオン化可能な化合物、基、または原子の割合は、当業者に周知である、いわゆるＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式を使用して推定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、化合物または部分がイオン化可能である場合、約１～９、好ましくは４～９、５～８、またはさらには６～８のｐＨ値、より好ましくは９以下、８以下、７以下のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ値、例えば約７．３～７．４、すなわち生理学的条件下、特にｉｎ ｖｉｖｏの細胞の生理学的塩条件下でそれが正に荷電されていることが好ましい。他の実施形態では、イオン化可能な化合物または部分は、生理学的ｐＨ値、例えば約７．０～７．４で主に中性であるが、より低いｐＨ値では正に荷電された状態になる。いくつかの実施形態では、カチオン化可能な化合物または部分のｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。
本明細書で使用される場合、「本発明のイオン化可能脂質」という語句は、本明細書で開示されるイオン化可能脂質ナノ粒子化合物を含む、本明細書で開示される化合物を意味する。本発明の特定の化合物は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸの化合物、及びそれらの薬学的に許容される塩、水和物、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、ラセミ体、または立体異性体の混合物である。したがって、「本発明のイオン化可能脂質」は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸの化合物、及びそれらの薬学的に許容される塩、水和物、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、ラセミ体、または立体異性体の混合物を集合的に意味する。本発明のイオン化可能脂質は、本明細書では、それらの化学構造及び／または化学名によって識別される。化合物が化学構造及び化学名の両方によって言及され、化学構造及び化学名が矛盾する場合、化学構造により多くの重みが与えられる。「本発明のイオン化可能脂質」という用語は、典型的には、荷電されることが可能な分子であって、例えば、典型的には約１～９のｐＨ値で正に荷電されている（カチオン性）、分子を指す。いくつかの実施形態では、カチオン性成分／化合物は、好ましくは、９以下（例えば５～９）、８以下（例えば５～８）、７以下（例えば５～７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ値、例えば約７．３～７．４、及びエンドソームのｐＨ値、例えば約７～５で荷電されている。したがって、本発明の一実施形態によるカチオン性ペプチド、タンパク質、多糖、脂質またはポリマーは、ある特定の実施形態では、生理学的条件下、特にｉｎ ｖｉｖｏの細胞の生理学的塩条件下で正に荷電されている。別の好ましい実施形態では、本発明による脂質ナノ粒子、カチオン性ペプチド、タンパク質、多糖、脂質またはポリマーは、生理学的条件下、特にｉｎ ｖｉｖｏの細胞の生理学的塩条件下で、非荷電であるか、中性電荷を有するか、またはそれぞれ電気的に中性である。カチオン性のペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、他のアミノ酸残基よりも多数のカチオン性アミノ酸、例えば多数のＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＯｒｎ（特に、ＡｓｐまたはＧｌｕのようなアニオン性アミノ酸残基よりも多くのカチオン性アミノ酸）を含むか、または主にカチオン性アミノ酸残基によって形成されたブロックを含む。「カチオン性」という表現は、「ポリカチオン性」成分／化合物を指す場合もある。カチオン性成分／化合物は、正に荷電されることができるカチオン性脂質を指す場合もある。例示的なカチオン性脂質は、正電荷を有する１つ以上のアミン基（複数可）を含む。好ましいカチオン性脂質は、ｐＨに応じて正荷電または中性の形態で存在することができるようにイオン化可能である。カチオン性脂質のイオン化は、異なるｐＨ条件下で脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の表面電荷に影響を与える。この電荷状態は、血漿タンパク質の吸収、血中クリアランス、及び組織分布（Ｓｅｍｐｌｅ， Ｓ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３２：３－１７ （１９９８））、ならびに核酸の細胞内送達に極めて重要な非二重層構造を形成する能力（Ｈａｆｅｚ， Ｉ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１１８８－１１９６ （２００１））に影響し得る。他の箇所に記載されるように、製剤されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸を送達するためのＬＮＰの有効性と相関している（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２）， ５１（３４）， ８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８， １７２－１７６ （２０１０）を参照されたい）。本発明のいくつかの実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。好ましい実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、ｐＨ７付近でわずかな正電荷または負電荷をもつ中性電荷を有する。本発明のイオン化可能脂質は、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含むことができ、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、鏡像異性体、またはジアステレオ異性体などの立体異性体として存在する。本発明によれば、本明細書で示される化学構造、したがって本発明のイオン化可能脂質は、対応する化合物の鏡像異性体及び立体異性体のすべて、すなわち、異性的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオ異性的に純粋）、ならびに鏡像異性体及び立体異性体の混合物の両方を包含する。本発明のイオン化可能脂質は、化合物が特定のキラル中心に関して約９０％ｅｅ（鏡像異性体過剰率）またはそれ以上、好ましくは９５％ｅｅ以上であるとき、キラル中心に関して光学活性である、または鏡像異性的に濃縮されている（すなわち、実質的にＲ型または実質的にＳ型）とみなされる。本発明のイオン化可能脂質は、化合物が特定のキラル中心に関して約１％ｅｅ超、好ましくは約５％ｅｅ超、より好ましくは約１０％ｅｅ超の鏡像異性体過剰率を有するとき、鏡像異性的に濃縮された形態にあるとみなされる。本発明のイオン化可能脂質は、化合物が特定のキラル中心に関して約９０％ｄｅ（ジアステレオ異性体過剰率）またはそれ以上、好ましくは９５％ｄｅ以上である場合、複数のキラル中心に関してジアステレオ異性的に純粋であるとみなされる。本発明のイオン化可能脂質は、化合物が特定のキラル中心に関して約１％ｄｅ超、好ましくは約５％ｄｅ超、より好ましくは約１０％ｄｅ超のジアステレオ異性体過剰率を有するとき、ジアステレオ異性的に濃縮された形態にあるとみなされる。本明細書で使用される場合、ラセミ混合物は、分子内のすべてのキラル中心に対して、約５０％が１つの鏡像異性体であり、約５０％が対応する鏡像異性体であるものを意味する。したがって、本発明は、式ＩからＶの化合物の、鏡像異性的に純粋な、鏡像異性的に濃縮された、ジアステレオ異性的に純粋な、ジアステレオ異性的に濃縮された、及びラセミ混合物をすべて包含する。鏡像異性体混合物及びジアステレオ異性体混合物は、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化などの周知の方法により、それらの成分である鏡像異性体または立体異性体に分割され得る。鏡像異性体及びジアステレオ異性体は、周知の不斉合成方法により、ジアステレオ異性的にまたは鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。本発明のイオン化可能脂質は、本明細書では、それらの化学構造及び／または化学名によって定義される。化合物が化学構造及び化学名の両方によって言及され、化学構造及び化学名が矛盾する場合、化学構造が化合物の同一性を決定する。患者に、例えば、獣医学的使用のためもしくは家畜の改良のために動物に、または臨床使用のためにヒトに投与される場合、本発明のイオン化可能脂質は、単離形態で、または医薬組成物中の単離形態として投与される。本明細書で使用される場合、「単離」とは、本発明の化合物が、（ａ）植物もしくは細胞、好ましくは細菌培養物などの天然源、または（ｂ）合成有機化学反応混合物のいずれかの他の成分から分離されていることを意味する。好ましくは、従来の技術によって、本発明のイオン化可能脂質が精製される。本明細書で使用される場合、「精製」とは、単離されたとき、単離物が単一の本発明のヒドロキシ化合物を単離物の重量基準で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ジェット注射」という用語は、少なくとも１つの本発明のｍＲＮＡ配列と、場合によりさらなる好適な賦形剤とを含む流体をオリフィスに押し込むことにより、哺乳動物の皮膚、そして注射の設定に応じて皮下組織または筋組織に浸透することができる高圧の超微細液体流が生成される無針注射法を指す。原理上、液体流が皮膚に穴を形成し、これを通って液体流がターゲット組織に押し込まれる。好ましくは、ジェット注射は、本発明によるｍＲＮＡ配列の皮内注射、皮下注射、または筋肉内注射のために使用される。好ましい実施形態では、ジェット注射は、本発明によるｍＲＮＡ配列の筋肉内注射のために使用される。さらなる好ましい実施形態では、ジェット注射は、本発明によるｍＲＮＡ配列の皮内注射のために使用される。
本明細書で使用される場合、「リピドイド化合物」という用語は、単にリピドイドとも呼ばれ、脂質様化合物、すなわち脂質様の物理的特性を有する両親媒性化合物である。本発明の文脈において、脂質という用語は、リピドイドを包含するとみなされる。
本明細書で使用される場合、「マイクロニードル注射」という用語は、様々なバリアを越えてワクチンまたは他の薬物を送達するために使用される微視的なアプリケータを指す。経皮適用がマイクロニードルの最もポピュラーな用途であるが、眼内及び蝸牛内のマイクロニードル薬物送達系が出現している。マイクロニードルは、フォトリソグラフィープロセスまたはマイクロ成形を通常含む様々な方法によって構築される。これらの方法は、マイクロニードルを成型するために微視的構造を樹脂またはシリコンにエッチングすることを伴う。マイクロニードルは、シリコン、チタン、ステンレス鋼、及びポリマーなどの種々の材料から作製される。いくつかのマイクロニードルは、身体に送達される薬物で作製されているが、皮膚を貫通するように針の形に成形されている。マイクロニードルは、サイズ、形状、及び機能が様々であるが、すべて、従来の皮下針または他の注射装置のような他の送達方法に代わる手段として使用される。
本明細書で使用される場合、「モノシストロン性ｍＲＮＡ」という用語は、典型的には、１つのオープンリーディングフレーム（コード配列またはコード領域）のみを含むｍＲＮＡであり得る。これに関連するオープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質へと翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。この用語は、ポリヌクレオチド及び／またはオリゴヌクレオチドに対して使用され得る。特定のタンパク質及び／またはペプチドをコードする核酸または核酸配列が本明細書で言及される場合は常に、前記核酸または核酸配列はそれぞれ、好ましくは、ヒトなどの好適な宿主におけるその発現、すなわち特定のタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列の転写及び／または翻訳を可能にする制御配列も含む。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド修飾」という用語は、本発明の文脈において、ヌクレオシド修飾という用語は、通常はｍＲＮＡの一部ではないヌクレオシド、好ましくは非天然ヌクレオシドを含む、ｍＲＮＡ分子または化合物を指す。特に、この用語は、好ましくは、アデニン以外、グアニン以外、シトシン以外、ウラシル以外、また場合によってはチミン以外のｍＲＮＡヌクレオシドを指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸単量体のオリゴマーまたはポリマーである。通常、これらの単量体はペプチド結合によって連結されている。「ペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマー鎖の長さを限定しない。本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは例えば５０未満の単量体単位を含み得る。より長いペプチドはポリペプチドとも呼ばれ、典型的には５０～６００の単量体単位、より具体的には５０～３００の単量体単位を有する。
本明細書に記載される場合、「ヌクレオシド」は、五炭糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体、及び有機塩基、プリンもしくはピリミジン、またはそれらの誘導体を含む化合物と定義される。本明細書に記載される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基からなるヌクレオシドと定義される。いくつかの実施形態では、化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－ｌ－メチル－シュードウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンを含む。他の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンを含む。いくつかの実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、ｌ－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンを含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩（複数可）」という表現は、本発明の化合物に存在し得る酸性基または塩基性基の塩を含むがこれに限定されない。塩基性の性質をもつ化合物は、様々な無機酸及び有機酸と多種多様な塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ）塩、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ）塩、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ）塩、酢酸（ａｃｅｔｉｃ）塩、シュウ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸（ｓｕｌｆａｔｅ）塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）、過クエン酸塩（ａｃｉｄ ｃｉｔｒａｔｅ）、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩（ｍａｌｅａｔｅ）、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩を含むがこれに限定されない、薬理学的に許容されるアニオンを含む塩を形成するものである。アミノ部分を含む本発明の化合物も、上述の酸に加えて、様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。酸性の性質をもつ本発明の化合物は、様々な薬理学的に許容されるカチオンと塩基塩を形成することができる。そのような塩の例としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、特に、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウムリチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、及び鉄塩が挙げられる。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈における「薬学的有効量」という用語は、典型的には、免疫応答を誘導するのに十分な量であると理解される。
本明細書で使用される場合、「フェニル」という用語は、－Ｃ６Ｈ５を意味する。フェニル基は、未置換でもよく、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換されていてもよく、ここで置換基は、フェニル基のＨを置き換える。本明細書で使用される場合、「Ｐｈ」は、フェニル基または置換フェニル基を表す。
本明細書で使用される場合、「ポリ」という接頭辞は、化合物においてそれぞれの特性を有する複数の原子または基を指す。括弧に入っている場合、複数の存在は任意である。例えば、（ポリ）カチオン性は、カチオン性及び／またはポリカチオン性を意味する。しかし、この接頭辞がないことが、複数を除外するように解釈されてはならない。例えば、ポリカチオン性化合物もカチオン性化合物であり、そのように呼ばれる場合がある。
本明細書で使用される場合、「ポリＡ尾部」という用語は、「３’－ポリ（Ａ）尾部またはポリ（Ａ）配列」とも呼ばれ、典型的には、ＲＮＡの３’末端に付加された、最大約４００個のアデノシンヌクレオチド、例えば約２５～約４００個、好ましくは約５０～約４００個、より好ましくは約５０～約３００個、さらにより好ましくは約５０～約２５０個、最も好ましくは約６０～約２５０個のアデノシンヌクレオチドからなる、アデノシンヌクレオチドの長い配列である。さらに、ポリ（Ａ）配列またはポリ（Ａ）尾部は、例えばＥ．ｃｏｌｉまたは酵母に由来するポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用する、ＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」という用語は、典型的には、ＲＮＡ分子などの核酸分子への、例えば未成熟ｍＲＮＡへの、ポリ（Ａ）配列の付加であると理解される。ポリアデニル化は、いわゆるポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化されるＲＮＡ分子などの核酸分子の３’末端のヌクレオチドの区間内に位置する。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなる六量体、好ましくは六量体配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくは六量体配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的には、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に起こる。典型的には、ＲＮＡの成熟（ｐｒｅ－ｍＲＮＡから成熟型ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化のステップを含む。
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ｃ）配列」という用語は、典型的にはシトシンヌクレオチドの長い配列であり、典型的には約１０～約２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０～約１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約１０～約７０個のシトシンヌクレオチド、またはさらにより好ましくは約２０～約５０個、またはさらには約２０～約３０個のシトシンヌクレオチドである。ポリ（Ｃ）配列は、好ましくは、核酸に含まれるコード領域の３’側に位置し得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、典型的には、生物学的機能を促進する３次元形態に折り畳まれた１つ以上のペプチド及び／またはポリペプチドからなる。
本明細書で使用される場合、「Ｐｙｒ」、「Ｐｙｒｄ」及び「ＰｙｒＤ」という用語は同義に使用され、ピリジンまたはピリジル置換基を指す。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ及び修飾型メッセンジャーＲＮＡ、ならびにコードＲＮＡ（ｃＲＮＡ）及び非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を包含し、これらはハウスキーピングｎｃＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ（すなわち、ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（すなわち、ｒＲＮＡ））、及び制御性ｎｃＲＮＡを含み、これらはさらに、それらのサイズに従って、少なくとも２００個のヌクレオチドを有する長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ならびにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含む２００個未満のヌクレオチドを有する低分子ｎｃＲＮＡなどに分類される。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」または「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」という用語は、ＲＮＡが無細胞系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で合成されるプロセスに関する。ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡは、ＲＮＡ転写物の生成の鋳型として使用される。ＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のＤＮＡ依存性ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができ、ＤＮＡ鋳型は、本発明によれば、好ましくは線状化プラスミドＤＮＡ鋳型である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写をコントロールするためのプロモーターは、いずれのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのいずれのプロモーターでもよい。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの特定例は、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されるそれぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡをクローニングし、これをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための適切なベクターに、例えばプラスミドＤＮＡに導入することによって得ることができる。本発明の好ましい実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される前に、好適な制限酵素で線状化される。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写または化学合成によって得ることができる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型は、遺伝子合成によって得ることもできる。本明細書で使用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５（２）： １５２－１５９、Ｂｒｕｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５３０：１０１－１４を参照されたい）。前記方法で使用される試薬は、典型的には以下を含む：
１）バクテリオファージにコードされるＲＮＡポリメラーゼなどのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対して高い結合親和性を有するプロモーター配列をもつ線状化ＤＮＡ鋳型、
２）４つの塩基（アデニン、シトシン、グアニン及びウラシル）のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、
３）場合により、上記で定義したＣＡＰアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ）または１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｖ５７０１）：ｃａｐ１を得るために、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを含むｍ７Ｇキャッピングキット（ＳｃｒｉｐｔＣａｐ、ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ）を使用してＲＮＡをキャップした）、
４）線状化ＤＮＡ鋳型内のプロモーター配列に結合することができるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、
５）場合により、夾雑ＲＮａｓｅを不活性化するためのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害因子、
６）場合により、転写を阻害し得るピロリン酸を分解するためのピロホスファターゼ、
７）ポリメラーゼの補助因子としてＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２、
８）好適なｐＨ値を維持するためのバッファー（抗酸化剤（例えばＤＴＴ）及び／またはスペルミジンなどのポリアミンを最適濃度で含んでいてもよい）。
本明細書で使用される場合、「安定化された核酸、好ましくはｍＲＮＡ」という用語は、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解）及び／またはｅｘ ｖｉｖｏ分解（例えばワクチン投与前の製造プロセスによる、例えば投与されるワクチン溶液の調製の過程における）に対する抵抗性を増大させる修飾を呈する。ＲＮＡの安定化は、例えば、５’－ＣＡＰ構造、ポリＡ尾部、または任意の他のＵＴＲ修飾を提供することによって達成することができる。これは、化学修飾または核酸のＧ／Ｃ含有量の修飾によって達成することもできる。様々な他の方法が当技術分野で公知であり、本発明の文脈において考えられる。
本明細書で使用される場合、化合物を「実質的に」含む組成物とは、組成物が、約８０重量％超、より好ましくは約９０重量％超、さらにより好ましくは約９５重量％超、最も好ましくは約９７重量％超の化合物を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「実質的に完全」な反応物とは、反応物が、約８０重量％超の所望の生成物、より好ましくは約９０重量％超の所望の生成物、さらにより好ましくは約９５重量％超の所望の生成物、最も好ましくは約９７重量％超の所望の生成物を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、化合物を「実質的に含まない」組成物とは、組成物が、約２０重量％未満、より好ましくは約１０重量％未満、さらにより好ましくは約５重量％未満、最も好ましくは約３重量％未満の化合物を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「置換」または「置換基」は各々、本発明の化合物またはそれらの調製に有用な中間体の合成的または薬学的有用性を無効にしない基を意味する。好適な置換基の例は、－ＮＨ２、ＣＮ、ハロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアリール、（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２２）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ２２）アルキニル、（Ｃ６）アリール、（Ｃ２－Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ３－Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１－Ｃ８）アルコキシ、（Ｃ６）アリールオキシ、－ＣＮ、－ＯＨ、オキソ、ハロ、－ＣＯ２Ｈ、－ＮＨ２、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＣＨＯ、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）、または好適な置換基として作用し得る本明細書で特定される基のいずれかを含むがこれに限定されない。当業者は、本発明の化合物の安定性ならびに薬理学的活性及び合成活性に基づいて、好適な置換基を容易に選択することができる。
本明細書で使用される場合、「５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）」という用語は、典型的には、ある特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域、またはある特定の遺伝子の機能的実体、例えば転写領域の５’末端領域など、核酸分子の５’末端領域に位置するピリミジンヌクレオチドの区間である。この配列は、通常は転写開始部位に対応するシチジンから開始し、これに通常約３～３０個のピリミジンヌクレオチドの区間が続く。例えば、ＴＯＰは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはさらに多くのヌクレオチドを含み得る。ピリミジンの区間、ひいては５’－ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドの１ヌクレオチド分５’側で終了する。５’末端オリゴピリミジントラクトを含むメッセンジャーＲＮＡは、しばしばＴＯＰ ｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、そのようなメッセンジャーＲＮＡをもたらす遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードする遺伝子及びｍＲＮＡに見出されている。
本明細書で使用される場合、「ＴＯＰモチーフ」という用語は、上記で定義した５’－ＴＯＰに対応する核酸配列である。したがって、本発明の文脈におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３～３０ヌクレオチドの長さを有するピリミジンヌクレオチドの区間である。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、ピリミジンヌクレオチドの区間は、好ましくはその５’末端でシトシンヌクレオチドから開始する。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰ ｍＲＮＡにおいて、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端で転写開始部位から開始し、前記遺伝子またはｍＲＮＡの最初のプリン残基の１ヌクレオチド分５’側で終了する。本発明の意味におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’－ＵＴＲを表す配列の５’末端または５’－ＵＴＲをコードする配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３つ以上のピリミジンヌクレオチドの区間が、本発明のｍＲＮＡ、本発明のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲエレメント、または本明細書に記載されるＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列など、それぞれの配列の５’末端に位置する場合、この区間は、本発明の意味での「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。換言すると、５’－ＵＴＲまたは５’－ＵＴＲエレメントの５’末端ではなく、５’－ＵＴＲまたは５’－ＵＴＲエレメント内のどこかに位置する３つ以上のピリミジンヌクレオチドの区間は、「ＴＯＰモチーフ」と呼ばないことが好ましい。
本明細書で使用される場合、「ＴＯＰ遺伝子」という用語は、典型的には、５’末端オリゴピリミジントラクトの存在によって特徴付けられる。さらに、ほとんどのＴＯＰ遺伝子は、成長に関連する翻訳制御によって特徴付けられる。しかし、組織特異的な翻訳制御を伴うＴＯＰ遺伝子も知られている。上記で定義したように、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは、好ましくは５’－ＣＡＰの３’側に位置するヌクレオチドから開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで伸びる、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟型ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲの配列に対応する。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは、開始コドンを含まないことが一般的であり、上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）または上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含まないことが好ましい。ここで、上流ＡＵＧ及び上流オープンリーディングフレームは、典型的には、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側で生じるＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲは、一般的にかなり短い。ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチドから最大５００ヌクレオチドまで様々であり得、典型的には約２００ヌクレオチド未満、好ましくは約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味におけるＴＯＰ遺伝子の例示的な５’－ＵＴＲは、国際特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１及び配列番号１４２２による配列、またはそのホモログもしくはバリアント（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において、５位のヌクレオチドから開始コドン（例えばＡＴＧ）のすぐ５’側に位置するヌクレオチドまで伸びる核酸配列である。この文脈において、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲの特に好ましいフラグメントは、５’－ＴＯＰモチーフを欠いているＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲである。「ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくは、天然に発生するＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲを指す。
本明細書で使用される場合、「３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）」は、典型的には、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（すなわちオープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの一部である。ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲは、アミノ酸配列に翻訳されない。３’－ＵＴＲ配列は、一般に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコードされる。ゲノム配列が、まず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。未成熟ｍＲＮＡは次に、成熟プロセスにおいて成熟型ｍＲＮＡへとさらにプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’－キャッピング、任意のイントロン及び未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化などの３’末端の修飾を切除するための未成熟ｍＲＮＡのスプライシング、ならびに任意のエンドヌクレアーゼ切断またはエキソヌクレアーゼ切断などのステップを含む。本発明の文脈において、３’－ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンの３’側、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンのすぐ３’側に位置し、ポリ（Ａ）配列の５’側まで、好ましくはポリ（Ａ）配列のすぐ５’側のヌクレオチドまで伸びる、成熟型ｍＲＮＡの配列に対応する。「に対応する」という用語は、３’－ＵＴＲ配列が、３’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列、またはそのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、「アルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ」のような「遺伝子の３’－ＵＴＲ」という用語は、この遺伝子に由来する成熟型ｍＲＮＡ、すなわち遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに対応する配列である。「遺伝子の３’－ＵＴＲ」という用語は、３’－ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を包含する。
本明細書で使用される場合、「５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）」という用語は、典型的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定のセクションであると理解される。これは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’側に位置する。典型的には、５’－ＵＴＲは転写開始部位から開始し、オープンリーディングフレームの開始コドンの１ヌクレオチド前で終了する。５’－ＵＴＲは、制御エレメントとも呼ばれる、遺伝子発現をコントロールするためのエレメントを含み得る。そのような制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位または５’末端オリゴピリミジントラクトであり得る。５’－ＵＴＲは、例えば５’－ＣＡＰの付加により、転写後に修飾されてもよい。本発明の文脈において、５’－ＵＴＲは、５’－ＣＡＰと開始コドンとの間に位置する成熟型ｍＲＮＡの配列に対応する。好ましくは、５’－ＵＴＲは、５’－ＣＡＰの３’側に位置するヌクレオチドから、好ましくは５’－ＣＡＰのすぐ３’側に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンのすぐ５’側に位置するヌクレオチドまで伸びる配列に対応する。成熟型ｍＲＮＡの５’－ＣＡＰのすぐ３’側に位置するヌクレオチドは、典型的には、転写開始部位に対応する。「に対応する」という用語は、５’－ＵＴＲ配列が、５’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列、またはそのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、「ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ」のような「遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、この遺伝子に由来する成熟型ｍＲＮＡ、すなわち遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに対応する配列である。「遺伝子の５’－ＵＴＲ」という用語は、５’－ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を包含する。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、典型的には、少なくとも１つの抗原または抗原性機能を提供する予防用または治療用の物質であると理解される。抗原または抗原性機能は、適応免疫応答をもたらすように身体の適応免疫系を刺激し得る。本明細書で使用される場合、「パンデミックインフルエンザ／インフル用ワクチンまたはパンデミックインフルエンザ／インフルワクチン」という用語は、パンデミックインフルエンザウイルスに対するワクチンを指し、本明細書では、パンデミックインフルエンザ／インフル用ワクチンまたはパンデミックインフルエンザ／インフルワクチンと呼ばれる。本明細書で使用される場合、「季節性インフルエンザ／インフル用ワクチンまたは季節性インフルエンザ／インフルワクチン」という用語は、インフルの季節に季節的に発生するインフルエンザウイルスに対するワクチンを指し、本明細書では、「季節性インフルエンザ／インフル用ワクチンまたは季節性インフルエンザ／インフルワクチン」と称される。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈において定義されるタンパク質またはペプチドの「バリアント」という用語は、アミノ酸（複数可）の１つ以上の置換、挿入、及び／または欠失のような１つ以上の突然変異（複数可）において元の配列と異なるアミノ酸配列を有するように生成され得る。好ましくは、これらのフラグメント及び／またはバリアントは、完全長の天然タンパク質、例えばその特異的抗原性特性と比較して、同じ生物学的機能または特異的活性を有する。本発明の文脈において定義されるタンパク質またはペプチドの「バリアント」は、それらの天然配列、すなわち突然変異していない生理学的配列と比較して、保存的アミノ酸置換（複数可）を含み得る。これらのアミノ酸配列及びそれらをコードするヌクレオチド配列は、特に、本明細書で定義されるバリアントという用語に該当する。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正または負に荷電された側鎖、側鎖またはアミノ酸中の芳香族基を有するアミノ酸であり、これらの側鎖は、水素橋に入ることができる、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖である。これは、例えば極性側鎖を有するアミノ酸が、同様の極性側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられること、または例えば、疎水性側鎖によって特徴付けられるアミノ酸が、同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されることを意味する（例えば、セリン（スレオニン）のスレオニン（セリン）による置換、またはロイシン（イソロイシン）のイソロイシン（ロイシン）による置換）。挿入及び置換は、特に、三次元構造の修飾を引き起こさない、または結合領域に影響を与えない配列位置で可能である。挿入（複数可）または欠失（複数可）による三次元構造の修飾は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）（Ｕｒｒｙ， １９８５， Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ， Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ ＯＲＤ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を使用して容易に決定できる。
本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドの「バリアント」という用語は、そのようなタンパク質またはペプチドの１０、２０、３０、５０、７５または１００アミノ酸の区間にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得る。さらに、核酸分子によってコードされ得る、本明細書で定義されるタンパク質またはペプチドのバリアントは、コード核酸配列のヌクレオチドが、タンパク質またはペプチドのそれぞれのアミノ酸配列の改変をもたらすことなく、遺伝コードの縮重に従って交換されている配列を含んでもよく、すなわち、アミノ酸配列または少なくともその一部が、上記の意味の範囲内の１つ以上の突然変異（複数可）において元の配列と異なっていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「ビヒクル」という用語は、医薬組成物またはワクチンの成分を個体に投与することを容易にするために医薬組成物またはワクチン中に通常使用できる薬剤、例えば担体を意味する。
Ｖ．２． 例示的な本発明のイオン化可能脂質
本発明者らは、２つ以上のイオン化可能アミン頭部基、２つ以上の分解性リンカー基、及び２つ以上の飽和または不飽和または分岐状のアルキル尾部を含んで合成された、新たなクラスのイオン化可能脂質である本発明のイオン化可能脂質を発見した。
本発明のイオン化可能脂質は、その最も広い実施形態において、式Ｉ：
Figure 2023546908000018
 の構造を有し、ここで、ｐＫａは、身体の特定の組織または臓器への標的送達を実現するために調整することができる。
ある特定の実施形態では、例示的な尾部基、頭部基、及びリンカー基は各々、以下の表１のそれぞれのカテゴリーで特定される置換基から独立的に選択される。以下の表に示される置換基Ｒ基は、本明細書で有効とされ、定義される置換基Ｒ基のすべてを含む。
Figure 2023546908000019
Figure 2023546908000020
Figure 2023546908000021
Figure 2023546908000022
ある特定の実施形態では、スペーサーは任意であり、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル基である。好ましい実施形態では、各スペーサーは、独立的に、置換または非置換のＣ１炭素、置換もしくは非置換のＣ２炭素、置換もしくは非置換のＣ３炭素、置換もしくは非置換のＣ４炭素、置換もしくは非置換のＣ５炭素、置換もしくは非置換のＣ６炭素、置換もしくは非置換のＣ７炭素、置換もしくは非置換のＣ８炭素、置換もしくは非置換のＣ９炭素、置換もしくは非置換のＣ１０炭素、置換もしくは非置換のＣ１１炭素、置換もしくは非置換のＣ１２炭素、置換もしくは非置換のＣ１３炭素、置換もしくは非置換のＣ１４炭素、置換もしくは非置換のＣ１５炭素、置換もしくは非置換のＣ１６炭素、置換もしくは非置換のＣ１７炭素、置換もしくは非置換のＣ１８炭素、置換もしくは非置換のＣ１９炭素、置換もしくは非置換のＣ２０炭素、置換もしくは非置換のＣ２１炭素、または置換もしくは非置換のＣ２２炭素である。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、ＤＬ＝ジリノール酸、ＡＤＤＥ＝アザンジイルジエチル、Ｃｘ／Ｃｙ＝炭素スペーサー、ＤＭＡ＝ジメチルアミン、Ｐｙｒ＝ピリジン、ＰｉｐＺ＝ピペラジン、ＰｉｐＤ＝ピペリジン、ＤＩＰＡ＝ジイソプロピルアミン、ＤＭ＝ジメチル、ＢＯＤ＝ビスオクチルデシル頭部基の候補頭部基構造、及びｐＫａのＰｅｒｃｅｐｔａ予測を含む。
ある特定の実施形態では、ジメチルアミン（表２）、ピペリジン（表３）、ピロリジン（表４）、及びピペラジン（表５）の各々の例示的で非限定的な頭部基が以下に示される。ある特定の実施形態では、２つのアミンのｐＫａは、特定の組織または臓器への送達を容易にする特定の値を達成するように調整することができる。ｐＫａのＰｅｒｃｅｐｔａ予測は、クラシック（ｃｌａｓｓｉｃ）アルゴリズムについては黒で、Ｇａｌａｓアルゴリズムについては赤で示されている。アミンを互いから遠ざけると、荷電部位間の静電反発が低減するため、２つのｐＫａが近くなる。内部アミンをエステル結合から遠ざけると、アミンのプロトン結合自由電子対が電子求引性エステルからさらに除去されるため、そのｐＫａが上昇する。適切なｐＫａをもつ頭部基構造の選択は、ＩＭ局在化のためのわずかな正電荷または中性ＬＮＰと、エンドリソソーム放出能力のためのｐＨ７未満で強く増大する正電荷との両方を達成すると期待される。

Figure 2023546908000023
Figure 2023546908000024
Figure 2023546908000025
Figure 2023546908000026
ある特定の実施形態では、表２、４、及び５に示したジメチルアミン、ピロリジン、及びピペラジンと併せて追加の二価頭部基を選択することができ、ここで、炭素スペーサーは、特定の分子ｐＫａをもたらすように変更することができる。特定のイオン化特性に加えて、いくつかの頭部基は、増大した免疫アジュバント性を有し得る。
Figure 2023546908000027
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、１つ以上のリンカー基、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー基を含む。
例示的なリンカーを以下の表７Ａ～７Ｅに示す。
Figure 2023546908000028
Figure 2023546908000029
Figure 2023546908000030
Figure 2023546908000031
Figure 2023546908000032
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質のアルキル尾部の形状は、好ましくは、非二重層逆六角形または他の構造を作り出すことによってエンドリソソーム放出を促進するために、円錐形で末広である。例示的なアルキル尾部を表８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃに示す。ある特定の実施形態では、これは、飽和結合または分岐を追加することによって達成することができる。他の実施形態では、エステル結合を追加すると、より迅速な分解を通じて忍容性を増大させることができる。

Figure 2023546908000033
Figure 2023546908000034
Figure 2023546908000035
ジメチルアミン、ピロリジン、及びピペラジン頭部基、エステルリンカー、Ｃ４スペーサー、ならびにアルキル／アルキレン尾部を有する本発明のイオン化可能脂質の例示的な非限定的例が表９に示されており、これらは、ＩＭ局在化のためのｐＨ７．４で正に荷電されたＬＮＰを可能にするｐＫａと、エンドソーム酸性化中にさらにイオン化して放出をもたらし得る６．５付近のｐＫａをもつ第２の内部アミンとを有し得る。

Figure 2023546908000036
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩ：
Figure 2023546908000037
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、もしくは場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基からなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ３及びＲ４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロ芳香環を構成し、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、ジオキソロピロリジン－ジオン、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
本発明のイオン化可能脂質は、場合により、第１の窒素と第２の窒素との間の炭素スペーサー（すなわち、上記式ＩＩのＣＲ５Ｒ６）及び第２の窒素とエステルリンカーとの間の炭素スペーサー（すなわち、上記式ＩＩのＣＲ７Ｒ８及びＣＲ９Ｒ１０）を含み得る。ある特定の実施形態では、尾部は、例えば、ジリノール酸（ＤＬ）及び分岐ビスオクチルデシル（ＢＯＤ）を含めて対称である。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の好ましい実施形態において、Ｒ３及び／またはＲ４での置換には、末端ジオキソラン基が含まれる。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｘは０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１である。
ある特定の実施形態では、ｘは２である。
ある特定の実施形態では、ｘは３である。
ある特定の実施形態では、ｘは４である。
ある特定の実施形態では、ｘは５である。
ある特定の実施形態では、ｘは６である。
ある特定の実施形態では、ｘは７である。
ある特定の実施形態では、ｘは８である。
ある特定の実施形態では、ｘは９である。
ある特定の実施形態では、ｘは１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ：
Figure 2023546908000038
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１１、及びＲ１２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成してもよく、ここで、ＱがＳまたはＯである場合、ＳまたはＯに結合しているＲ１は電子対であり、
各Ｒ３及びＲ４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～２０の整数であり、
Ｇ及びＱは各々独立的に、ＣＨ、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される原子であり、
ｍ及びｎの各々は、０～４の整数であり、
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール、及びジスルフィド結合からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｘは０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１である。
ある特定の実施形態では、ｘは２である。
ある特定の実施形態では、ｘは３である。
ある特定の実施形態では、ｘは４である。
ある特定の実施形態では、ｘは５である。
ある特定の実施形態では、ｘは６である。
ある特定の実施形態では、ｘは７である。
ある特定の実施形態では、ｘは８である。
ある特定の実施形態では、ｘは９である。
ある特定の実施形態では、ｘは１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＱはＯである。
ある特定の実施形態では、ＱはＳである。
ある特定の実施形態では、ＱはＮである。
ある特定の実施形態では、ＧはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＧはＯである。
ある特定の実施形態では、ＧはＳである。
ある特定の実施形態では、ＧはＮである。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＶ：
Figure 2023546908000039
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、Ｒ１は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、及び場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基からなる群から選択され、
各Ｒ３及びＲ４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｘは０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１である。
ある特定の実施形態では、ｘは２である。
ある特定の実施形態では、ｘは３である。
ある特定の実施形態では、ｘは４である。
ある特定の実施形態では、ｘは５である。
ある特定の実施形態では、ｘは６である。
ある特定の実施形態では、ｘは７である。
ある特定の実施形態では、ｘは８である。
ある特定の実施形態では、ｘは９である。
ある特定の実施形態では、ｘは１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
別の実施形態では、本発明は、式Ｖ：
Figure 2023546908000040
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３、及びＲ１４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１５、及びＲ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｗ、ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、
各Ｑは、独立的に、Ｏ、ＮＨ、Ｓから選択される原子、またはジスルフィド結合であり、
ｍの各々は、０～４の整数、好ましくは０、１、または２であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｗは０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１である。
ある特定の実施形態では、ｗは２である。
ある特定の実施形態では、ｗは３である。
ある特定の実施形態では、ｗは４である。
ある特定の実施形態では、ｗは５である。
ある特定の実施形態では、ｗは６である。
ある特定の実施形態では、ｗは７である。
ある特定の実施形態では、ｗは８である。
ある特定の実施形態では、ｗは９である。
ある特定の実施形態では、ｗは１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは２０である。
ある特定の実施形態では、ｘは０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１である。
ある特定の実施形態では、ｘは２である。
ある特定の実施形態では、ｘは３である。
ある特定の実施形態では、ｘは４である。
ある特定の実施形態では、ｘは５である。
ある特定の実施形態では、ｘは６である。
ある特定の実施形態では、ｘは７である。
ある特定の実施形態では、ｘは８である。
ある特定の実施形態では、ｘは９である。
ある特定の実施形態では、ｘは１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＱはＯである。
ある特定の実施形態では、ＱはＳである。
ある特定の実施形態では、ＱはＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１である。
ある特定の実施形態では、ｍは２である。
ある特定の実施形態では、ｍは３である。
ある特定の実施形態では、ｍは４である。
ある特定の実施形態では、ｍは５である。
ある特定の実施形態では、ｍは６である。
ある特定の実施形態では、ｍは７である。
ある特定の実施形態では、ｍは８である。
ある特定の実施形態では、ｍは９である。
ある特定の実施形態では、ｍは１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩ：
Figure 2023546908000041
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３及びＲ２４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～２０の整数であり、
各Ｑは、独立的に、Ｏ、ＮＨ、Ｓから選択される原子、またはジスルフィド結合であり、
ｍの各々は、０～４の整数、好ましくは０、１、または２であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ３は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルケニルである。
好ましい実施形態では、Ｒ４は、置換または非置換の－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１である。
ある特定の実施形態では、ｕは２である。
ある特定の実施形態では、ｕは３である。
ある特定の実施形態では、ｕは４である。
ある特定の実施形態では、ｕは５である。
ある特定の実施形態では、ｕは６である。
ある特定の実施形態では、ｕは７である。
ある特定の実施形態では、ｕは８である。
ある特定の実施形態では、ｕは９である。
ある特定の実施形態では、ｕは１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１である。
ある特定の実施形態では、ｖは２である。
ある特定の実施形態では、ｖは３である。
ある特定の実施形態では、ｖは４である。
ある特定の実施形態では、ｖは５である。
ある特定の実施形態では、ｖは６である。
ある特定の実施形態では、ｖは７である。
ある特定の実施形態では、ｖは８である。
ある特定の実施形態では、ｖは９である。
ある特定の実施形態では、ｖは１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１である。
ある特定の実施形態では、ｗは２である。
ある特定の実施形態では、ｗは３である。
ある特定の実施形態では、ｗは４である。
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ある特定の実施形態では、ｗは６である。
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ある特定の実施形態では、ｗは１０である。
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ある特定の実施形態では、ｗは１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは２０である。
ある特定の実施形態では、ｘは０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１である。
ある特定の実施形態では、ｘは２である。
ある特定の実施形態では、ｘは３である。
ある特定の実施形態では、ｘは４である。
ある特定の実施形態では、ｘは５である。
ある特定の実施形態では、ｘは６である。
ある特定の実施形態では、ｘは７である。
ある特定の実施形態では、ｘは８である。
ある特定の実施形態では、ｘは９である。
ある特定の実施形態では、ｘは１０である。
ある特定の実施形態では、ｘは１１である。
ある特定の実施形態では、ｘは１２である。
ある特定の実施形態では、ｘは１３である。
ある特定の実施形態では、ｘは１４である。
ある特定の実施形態では、ｘは１５である。
ある特定の実施形態では、ｘは１６である。
ある特定の実施形態では、ｘは１７である。
ある特定の実施形態では、ｘは１８である。
ある特定の実施形態では、ｘは１９である。
ある特定の実施形態では、ｘは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＱはＯである。
ある特定の実施形態では、ＱはＳである。
ある特定の実施形態では、ＱはＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１である。
ある特定の実施形態では、ｍは２である。
ある特定の実施形態では、ｍは３である。
ある特定の実施形態では、ｍは４である。
ある特定の実施形態では、ｍは５である。
ある特定の実施形態では、ｍは６である。
ある特定の実施形態では、ｍは７である。
ある特定の実施形態では、ｍは８である。
ある特定の実施形態では、ｍは９である。
ある特定の実施形態では、ｍは１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩ：
Figure 2023546908000042
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員ヘテロシクロアルキルもしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５’、Ｒ６’、Ｒ５”、及びＲ６”は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｕ、ｖ、ｗ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～２０の整数であり、
各Ｑは、独立的に、Ｏ、ＮＨ、Ｓから選択される原子、またはジスルフィド結合であり、かつ
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１である。
ある特定の実施形態では、ｕは２である。
ある特定の実施形態では、ｕは３である。
ある特定の実施形態では、ｕは４である。
ある特定の実施形態では、ｕは５である。
ある特定の実施形態では、ｕは６である。
ある特定の実施形態では、ｕは７である。
ある特定の実施形態では、ｕは８である。
ある特定の実施形態では、ｕは９である。
ある特定の実施形態では、ｕは１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１である。
ある特定の実施形態では、ｖは２である。
ある特定の実施形態では、ｖは３である。
ある特定の実施形態では、ｖは４である。
ある特定の実施形態では、ｖは５である。
ある特定の実施形態では、ｖは６である。
ある特定の実施形態では、ｖは７である。
ある特定の実施形態では、ｖは８である。
ある特定の実施形態では、ｖは９である。
ある特定の実施形態では、ｖは１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１である。
ある特定の実施形態では、ｗは２である。
ある特定の実施形態では、ｗは３である。
ある特定の実施形態では、ｗは４である。
ある特定の実施形態では、ｗは５である。
ある特定の実施形態では、ｗは６である。
ある特定の実施形態では、ｗは７である。
ある特定の実施形態では、ｗは８である。
ある特定の実施形態では、ｗは９である。
ある特定の実施形態では、ｗは１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＱはＯである。
ある特定の実施形態では、ＱはＳである。
ある特定の実施形態では、ＱはＮＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑはジスルフィド結合である。
ある特定の実施形態では、ｍは０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１である。
ある特定の実施形態では、ｍは２である。
ある特定の実施形態では、ｍは３である。
ある特定の実施形態では、ｍは４である。
ある特定の実施形態では、ｍは５である。
ある特定の実施形態では、ｍは６である。
ある特定の実施形態では、ｍは７である。
ある特定の実施形態では、ｍは８である。
ある特定の実施形態では、ｍは９である。
ある特定の実施形態では、ｍは１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは２０である。
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩ：
Figure 2023546908000043
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、式中、
Ｒ１及びＲ２は各々、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、または場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基からなる群から独立的に選択され、
Ｒ３及びＲ４は各々独立的に、場合により置換されているＣ１０－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ１０－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ１０－Ｃ２２アルキニルであるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
Ｘは、ＯＨまたはＮＲ１Ｒ２であり、
Ｚは、０～５の整数である。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000044
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000045
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000046
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000047
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000048
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000049
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000050
 からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩＩのイオン化可能脂質は、
Figure 2023546908000051
 からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＸ：
Figure 2023546908000052
 の本発明のイオン化可能脂質を包含し、
式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、電子対、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、３～７員複素環もしくはヘテロアリール環を形成してもよく、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ５’、Ｒ６’、Ｒ５”、及びＲ６”は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
ｕ、ｖ、ｗ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～２０の整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮであり、
Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ５Ｒ６Ｒ７）ｍ、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ６アリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ３－Ｃ６ヘテロアリールである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ４－Ｃ８アリールオキシである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ７－Ｃ１０アリールアルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換または非置換のＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基である。
ある特定の実施形態では、各Ｒ５は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、各Ｒ６は、独立的に、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ７は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ８は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ９は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１３は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１４は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１５は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ２２アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はハロである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６はベンジルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ１－Ｃ２２アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルケニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１６は、置換または非置換のＣ２－Ｃ２２アルキニルである。
ある特定の実施形態では、ｕは０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１である。
ある特定の実施形態では、ｕは２である。
ある特定の実施形態では、ｕは３である。
ある特定の実施形態では、ｕは４である。
ある特定の実施形態では、ｕは５である。
ある特定の実施形態では、ｕは６である。
ある特定の実施形態では、ｕは７である。
ある特定の実施形態では、ｕは８である。
ある特定の実施形態では、ｕは９である。
ある特定の実施形態では、ｕは１０である。
ある特定の実施形態では、ｕは１１である。
ある特定の実施形態では、ｕは１２である。
ある特定の実施形態では、ｕは１３である。
ある特定の実施形態では、ｕは１４である。
ある特定の実施形態では、ｕは１５である。
ある特定の実施形態では、ｕは１６である。
ある特定の実施形態では、ｕは１７である。
ある特定の実施形態では、ｕは１８である。
ある特定の実施形態では、ｕは１９である。
ある特定の実施形態では、ｕは２０である。
ある特定の実施形態では、ｖは０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１である。
ある特定の実施形態では、ｖは２である。
ある特定の実施形態では、ｖは３である。
ある特定の実施形態では、ｖは４である。
ある特定の実施形態では、ｖは５である。
ある特定の実施形態では、ｖは６である。
ある特定の実施形態では、ｖは７である。
ある特定の実施形態では、ｖは８である。
ある特定の実施形態では、ｖは９である。
ある特定の実施形態では、ｖは１０である。
ある特定の実施形態では、ｖは１１である。
ある特定の実施形態では、ｖは１２である。
ある特定の実施形態では、ｖは１３である。
ある特定の実施形態では、ｖは１４である。
ある特定の実施形態では、ｖは１５である。
ある特定の実施形態では、ｖは１６である。
ある特定の実施形態では、ｖは１７である。
ある特定の実施形態では、ｖは１８である。
ある特定の実施形態では、ｖは１９である。
ある特定の実施形態では、ｖは２０である。
ある特定の実施形態では、ｗは０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１である。
ある特定の実施形態では、ｗは２である。
ある特定の実施形態では、ｗは３である。
ある特定の実施形態では、ｗは４である。
ある特定の実施形態では、ｗは５である。
ある特定の実施形態では、ｗは６である。
ある特定の実施形態では、ｗは７である。
ある特定の実施形態では、ｗは８である。
ある特定の実施形態では、ｗは９である。
ある特定の実施形態では、ｗは１０である。
ある特定の実施形態では、ｗは１１である。
ある特定の実施形態では、ｗは１２である。
ある特定の実施形態では、ｗは１３である。
ある特定の実施形態では、ｗは１４である。
ある特定の実施形態では、ｗは１５である。
ある特定の実施形態では、ｗは１６である。
ある特定の実施形態では、ｗは１７である。
ある特定の実施形態では、ｗは１８である。
ある特定の実施形態では、ｗは１９である。
ある特定の実施形態では、ｗは２０である。
ある特定の実施形態では、ｙは０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１である。
ある特定の実施形態では、ｙは２である。
ある特定の実施形態では、ｙは３である。
ある特定の実施形態では、ｙは４である。
ある特定の実施形態では、ｙは５である。
ある特定の実施形態では、ｙは６である。
ある特定の実施形態では、ｙは７である。
ある特定の実施形態では、ｙは８である。
ある特定の実施形態では、ｙは９である。
ある特定の実施形態では、ｙは１０である。
ある特定の実施形態では、ｙは１１である。
ある特定の実施形態では、ｙは１２である。
ある特定の実施形態では、ｙは１３である。
ある特定の実施形態では、ｙは１４である。
ある特定の実施形態では、ｙは１５である。
ある特定の実施形態では、ｙは１６である。
ある特定の実施形態では、ｙは１７である。
ある特定の実施形態では、ｙは１８である。
ある特定の実施形態では、ｙは１９である。
ある特定の実施形態では、ｙは２０である。
ある特定の実施形態では、ｚは０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１である。
ある特定の実施形態では、ｚは２である。
ある特定の実施形態では、ｚは３である。
ある特定の実施形態では、ｚは４である。
ある特定の実施形態では、ｚは５である。
ある特定の実施形態では、ｚは６である。
ある特定の実施形態では、ｚは７である。
ある特定の実施形態では、ｚは８である。
ある特定の実施形態では、ｚは９である。
ある特定の実施形態では、ｚは１０である。
ある特定の実施形態では、ｚは１１である。
ある特定の実施形態では、ｚは１２である。
ある特定の実施形態では、ｚは１３である。
ある特定の実施形態では、ｚは１４である。
ある特定の実施形態では、ｚは１５である。
ある特定の実施形態では、ｚは１６である。
ある特定の実施形態では、ｚは１７である。
ある特定の実施形態では、ｚは１８である。
ある特定の実施形態では、ｚは１９である。
ある特定の実施形態では、ｚは２０である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は結合である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はＯＣ（＝Ｏ）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ３－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＳＯ２－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２Ｎである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２はジオキソロピロリジン－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＣＯ２（ＣＲ１Ｒ２Ｒ３）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ２２）アルキル）である。
ある特定の実施形態では、Ｌ２は－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）である。
ある特定の実施形態では、ＱはＣＨである。
ある特定の実施形態では、ＸはＯである。
ある特定の実施形態では、ＸはＳである。
ある特定の実施形態では、ＸはＮである。
ある特定の実施形態では、ｍは０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１である。
ある特定の実施形態では、ｍは２である。
ある特定の実施形態では、ｍは３である。
ある特定の実施形態では、ｍは４である。
ある特定の実施形態では、ｍは５である。
ある特定の実施形態では、ｍは６である。
ある特定の実施形態では、ｍは７である。
ある特定の実施形態では、ｍは８である。
ある特定の実施形態では、ｍは９である。
ある特定の実施形態では、ｍは１０である。
ある特定の実施形態では、ｍは１１である。
ある特定の実施形態では、ｍは１２である。
ある特定の実施形態では、ｍは１３である。
ある特定の実施形態では、ｍは１４である。
ある特定の実施形態では、ｍは１５である。
ある特定の実施形態では、ｍは１６である。
ある特定の実施形態では、ｍは１７である。
ある特定の実施形態では、ｍは１８である。
ある特定の実施形態では、ｍは１９である。
ある特定の実施形態では、ｍは２０である。
Ｖ．３． 例示的な本発明のイオン化可能脂質
本発明のイオン化可能脂質の例示的な非限定的例を表１０に示す（「方法」という見出しの縦列は、以下のセクションＶ．４．本発明のイオン化可能脂質を作製する方法で定められる特定の化合物を合成する方法を指す）。
Figure 2023546908000053
Figure 2023546908000054
Figure 2023546908000055
Figure 2023546908000056
Figure 2023546908000057
Figure 2023546908000058
Figure 2023546908000059
Figure 2023546908000060
Figure 2023546908000061
Figure 2023546908000062
Figure 2023546908000063
Figure 2023546908000064
Figure 2023546908000065
Figure 2023546908000066
Figure 2023546908000067
Figure 2023546908000068
Figure 2023546908000069
Figure 2023546908000070
本発明の別の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質のｐＫａを調整することで、特定の組織または臓器に対して脂質ナノ粒子－核酸複合体（ＬＮＰ－ＮＡ）の投与を指向することができる。本発明者らは、驚くべきことに、ソフトウェア、例えばＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａを使用したイオン化可能脂質のｐＫａの予測を使用することで、本発明のイオン化可能脂質の設計を大幅に加速できることを見出した。本発明者らは、イオン化可能脂質の予測された水性ｐＫａはすべて、ＴＮＳによって測定されたものよりも有意に高いことを見出した。ある特定の実施形態では、水性環境からＬＮＰ環境にかけてのｐＫａの低下は、文献ではこれまでに認められていない。理論に拘束されるものではないが、合理的な説明は、水相と比較して脂質相のプロトンの溶媒和エネルギーが高いこと、及びＬＮＰ中の本発明のイオン化可能脂質からのプロトンの静電反発から見出すことができ、これらが組み合わさって、ｐＫａを水相から脂質相にかけて１～３ポイント低減させ得る。ある特定の実施形態では、潜在的候補のｐＫａ表を調べ、適切なｐＫａ値をもつものだけを選択することにより、特定の頭部基及び炭素スペーサーを選択するために、この予測能力が使用され得る。複数の候補をこの様式で正確に排除することができ、合成及び試験の時間及び費用が大幅に節約される。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに含まれる本発明のイオン化可能脂質のｐＫａは、イオン化可能脂質を含むＬＮＰに結合するアニオン性親油性色素ＴＮＳの蛍光増強によって測定される。以前の研究では、ＩＶ投与の際に肝臓に効率的に送達するにはＴＮＳのｐＫａが６．５付近である必要があることが示されている。水相のｐＫａはＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａなどのソフトウェアによって予測することができ、ＴＮＳのｐＫａよりも高いｐＫａが得られる。我々は、効率の決定におけるＬＮＰ ｐＫａの重要性を考慮して、効果的なｍＲＮＡ送達系を合理的に設計するために、イオン化可能脂質の固有のｐＫａをＬＮＰイオン化特性と関係付ける新たな方法（ゼータ電位、１Ｈ ＮＭＲ、モデリング）を開発した。
Figure 2023546908000071
Figure 2023546908000072
Figure 2023546908000073
Figure 2023546908000074
Figure 2023546908000075
Figure 2023546908000076
Figure 2023546908000077
Figure 2023546908000078
Figure 2023546908000079
Figure 2023546908000080
Figure 2023546908000081
ある特定の実施形態では、本発明は、２つのイオン化可能アミンと、リノール酸尾部または分岐状尾部に対する２つの分解性エステルリンカーとを有する、合成された新たなクラスのイオン化可能脂質（本発明のイオン化可能脂質）を包含する。ＤＬ＝ジリノール酸、ＡＤＤＥ＝アザンジイルジエチル、Ｃｘ／Ｃｙ＝炭素スペーサー、ＤＭＡ＝ジメチルアミン、Ｐｙｒ＝ピリジン、ＰｉｐＺ＝ピペラジン、ＰｉｐＤ＝ピペリジン、ＤＩＰＡ＝ジイソプロピルアミン、ＤＭ＝ジメチル、ＢＯＤ＝ビスオクチルデシル。おそらく頭部基の嵩高さ及び制限された立体構造が原因で活性がなかった下掲の４つを除いて、ほとんどのＡＤＤＥイオン化可能脂質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＥＫ ２９３細胞をトランスフェクトするのに成功した。
Figure 2023546908000082
Figure 2023546908000083
Figure 2023546908000084
Figure 2023546908000085
ある特定の実施形態では、表１３Ａに示すように、１つのイオン化可能アミンと、分解性エステルを介してイソペンチルアミン（ＩＰ）、エチルアルコール（ＥＡ）、プロピルアルコール（ＰＡ）などの頭部基に連結された２つのリノール酸尾部とを有する、追加のイオン化可能脂質を合成した。
Figure 2023546908000086
ある特定の実施形態では、第２のクラスの脂質は、１つのイオン化可能基（ＤＭＡ）ならびに２つの異なるリンカー：分解性エステル及び非分解性オクタスルホンアミド（ＯＳＡ）を含む。さらに、これらの脂質は、表１３Ｂに示すように、線状尾部（リノイル）または分岐状尾部（オクタデカニル）のいずれかを含む。
Figure 2023546908000087
ある特定の実施形態では、第３のクラスのイオン化可能脂質は、表１３Ｃに示すように、１つのイオン化可能アミン及び１つのリノール酸（Ｌ）尾部を有し、その両方が非分解性アミドを介して（アミノエタン（ＡＥ）、ジメチルアミン、及びアミノエチルジスルホニル（ＡＥＤＳ））などの頭部基に連結されている。
Figure 2023546908000088
ある特定の実施形態では、アルキル脂質を含む例示的な本発明のイオン化可能脂質が、合成の方法を含めてＡＣＤ Ｃｌａｓｓｉｃ及びＡＣＤ Ｇａｌａｓからの予測ｐＫａと共に示され、表１３Ｄに示されている。

Figure 2023546908000089
Figure 2023546908000090
Figure 2023546908000091
Figure 2023546908000092
Figure 2023546908000093
Figure 2023546908000094
Figure 2023546908000095
Figure 2023546908000096
Figure 2023546908000097
Figure 2023546908000098
Figure 2023546908000099
Figure 2023546908000100
Figure 2023546908000101
Figure 2023546908000102
Figure 2023546908000103
Figure 2023546908000104
Figure 2023546908000105
Figure 2023546908000106
Figure 2023546908000107
Figure 2023546908000108
Ｖ．４． 本発明のイオン化可能脂質を作製する方法の例
本発明のイオン化可能脂質は、市販の試薬を使用して様々な経路によって合成することができる。以下の方法は、本発明のイオン化可能脂質を作製するための例示的な技術を提供する。
一般的反応スキーム１
Figure 2023546908000109
 ２つの分解性エステルを有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ａ－７）は、一般的反応スキーム１（「方法Ａ」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和鎖及び二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム１を参照すると、構造Ａ－１の化合物は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。溶媒エタノール中のＡ－１の混合物を触媒量の硫酸で処理すると、エステルＡ－２が与えられ、次いで、ＬＡＨ（例えば、水素化アルミニウムリチウム）を含む無水ＴＨＦでＡ－２を９～１０時間処理すると、アルコール誘導体Ａ－３が得られる。精製されたＡ－３を、ジクロロメタン中の塩化アクリロイル誘導体（ここで、Ｒａ＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５及び／またはイソプロピル基である）のＡ－４、塩基（例えば、トリエチルアミン）と４～５時間反応させると、置換アシル化生成物Ａ－５が得られる。アシル化生成物及び頭部基（Ｒ１）Ｎ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－６の混合物を十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＡ－７が生成される。
一般的反応スキーム２
Figure 2023546908000110
 リンカーと内部アミンとの間に増加した炭素スペーサーを有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｂ－３）は、一般的反応スキーム２（「方法Ｂ」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム２を参照すると、構造Ａ－２の化合物は、当業者によく知られる方法に従って調製される。溶媒としての二塩化メチレン中のＢ－１及びＡ－２の混合物を、トリエチルアミンなどの塩基と共に、触媒量のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で処理すると、エステル誘導体Ｂ－２が与えられ、次いで、Ｂ－２及びＡ－６の混合物を、十分な温度で十分な時間の２～５日間加熱した無水ＴＨＦ中の塩基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンまたは１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン）で処理すると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＢ－３が生成される。
一般的反応スキーム３
Figure 2023546908000111
 本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（４つのエステル基について対称）（例えば、化合物Ｃ－４）は、一般的反応スキーム３（「方法Ｃ」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｍは、－１～２の整数であり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム３を参照すると、構造Ａ－２の化合物は、当業者によく知られる方法に従って調製される。窒素ガスをパージした（無水条件下に維持された）シュレンク管内で無溶媒条件にて、エステル誘導体Ｃ－２をもたらすような温度で加熱した触媒量の有機触媒１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン（ＴＢＤ）で、Ｃ－１及びＡ－２の混合物を処理する。トリエチルアミンの存在下で溶媒として塩化メチレンを使用し、精製されたＣ－２を塩化アクリロイルＡ－４と混合する。次いで、出発物質が消費されるまで反応物を室温で攪拌させると、Ｃ－３が得られる。アシル化生成物及び頭部基Ｃ－３ならびにＮ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－６の混合物を十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＣ－４が生成される。
一般的反応スキーム４

Figure 2023546908000112
 本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（４つのエステル基について非対称）（例えば、化合物Ｃ－７）は、一般的反応スキーム４（「方法Ｃ１」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｍは、－１～２の整数であり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム４を参照すると、構造Ａ－２の化合物は、当業者によく知られる方法に従って調製される。窒素ガスをパージした（無水条件下に維持された）シュレンク管内で無溶媒条件にて、エステル誘導体Ｃ－２をもたらすような温度で加熱した触媒量の有機触媒１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン（ＴＢＤ）で、Ｃ－１及びＡ－２の混合物を処理する。トリエチルアミンの存在下で溶媒として塩化メチレンを使用し、精製されたＣ－２を塩化アクリロイルＡ－４と混合する。出発物質が消費されるまで反応物を室温で攪拌させると、Ｃ－３が得られる。等量のアシル化Ｃ－３生成物と頭部基Ｎ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－６との混合物を、十分な温度及び時間で加熱しながら反応させると、Ｃ－５が生成される。さらに精製したＣ－５を同じ当量のＣ－６（二重層尾部）で処理し、十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＣ－７が生成される。
一般的反応スキーム５

Figure 2023546908000113
 ６つの分解性エステルを有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｄ－８）は、一般的反応スキーム５（「方法Ｄ」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数であり、Ｒ２は、アルキル、環式、複素環式置換基であり、Ｒ４は、アルキル鎖を有するエステル誘導体である。一般的反応スキーム５を参照すると、構造Ｂ－１、Ａ－１、Ａ－２、Ａ－５及びＡ－６の化合物は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。エタノールの存在下で触媒量の硫酸を使用したＢ－１のエステル化により、Ｄ－１が得られた。さらに、古典的なフィンケルシュタイン反応によって、ヨウ化ナトリウムのアセトン溶液により、臭化アルキルが対応するヨウ化アルキルＤ－２に変換される。Ｄ－２及びＤ－３の混合物をエタノール中のナトリウムエトキシド（ＮａＯＥｔ）と還流下で反応させ、続いて低ｐＨに酸性化すると、Ｄ－４が得られる。ステップ４では、二塩化メチレン中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）及び触媒量の４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）の存在下でエステル化を一晩行うことで、Ｄ－５が得られた。さらに、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の存在下でＤ－５を対応するアルコールに還元すると、Ｄ－６が得られる。精製されたＤ－６を、テトラヒドロフラン溶媒中の塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下で、塩化アクリロイル誘導体（ここで、Ｒａ＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５及び／またはイソプロピル基である）のＡ－５と４～５時間反応させると、置換アシル化生成物Ｄ－７が得られる。アシル化生成物Ｄ－７及び頭部基（Ｒ１）Ｎ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－６の混合物を十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＤ－８が生成される。
一般的反応スキーム６
Figure 2023546908000114
 分解性及び非分解性エステルを有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｅ、Ｆ及びＧ）は、一般的反応スキーム６（「方法Ｅ」）に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数であり、Ｒ２は、アルキル、環式、複素環式置換基である。一般的反応スキーム６を参照すると、構造Ｅ－１、Ａ－４、Ｅ－２、Ａ－５及びＡ－６の化合物は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。試薬トリエチルアミンの存在下で塩化メチレン中の塩化アクリロイルＡ－４とＥ－１を反応させると、Ｅ－２が得られる。ステップ２では、Ａ－６をＡ－５と反応させることで、モノアルキル化生成物がｉｎ ｓｉｔｕで得られる。無溶媒条件下でＡ－５をさらに滴加し、続いて十分な時間加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＥ－３が生成される。ステップ３では、窒素雰囲気下、無溶媒条件下でＡ－６を２当量のアクリロイルアミドと反応させ、続いて十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後に化合物Ｆが生成される。ステップ４では、Ａ－６を１当量のＥ－２と反応させてモノアルキル化生成物を得て、これをさらにアルキルスルホニルクロリドと反応させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後に非分解性リンカー誘導体Ｇが得られる。
一般的反応スキーム７
Figure 2023546908000115
 スピロジオキソラン誘導体を有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｈ）は、一般的反応スキーム７（「方法Ｈ」）に従って調製され、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数であり、Ｒ２は、アルキル、環式、複素環式置換基である。一般的反応スキーム５を参照すると、構造Ａ－６、Ｈ－１、Ｈ－５の化合物及び必要な触媒は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。無水マレイン酸は、３－（ジメチルアミノ）－１－プロピルアミン（ＤＭＡＰＡ）と反応して、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）プロピルマレアミド酸Ｈ－２をもたらす。この反応は、クロロホルム中、室温でアミンを無水マレイン酸に加え、続いて６０℃に加熱することによって行った。精製後、Ｈ－２を無水酢酸中の酢酸ナトリウムと反応させ、十分な温度及び時間で加熱すると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＧ－３が生成される。ステップ３では、無水ＴＨＦ中の四酸化オスミウムを使用してヒドロキシル化反応を一晩行うことで、Ｈ－４が得られる。Ｈ－４及びＨ－５の混合物をトルエン溶媒に溶解させ、丸底フラスコにＤｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置を取り付け、反応物をその後８時間にわたり加熱還流し、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置内で得られた水を別個のフラスコに収集し、出発物質が消費されるまで反応を継続することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＨ－６が得られる。
一般的反応スキーム８
Figure 2023546908000116
 スピロジオキソラン誘導体を有する本発明のイオン化可能脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｉ）は、一般的反応スキーム８（「方法Ｉ」）に従って調製され、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数であり、Ｒ２は、アルキル、環式、複素環式置換基である。一般的反応スキーム８を参照すると、構造Ｉ－１、Ｉ－５の化合物及び必要な触媒は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。トルエン中のＩ－１、１，２，５－ペンタントリオール及びｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウムの混合物を、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置によって窒素下で一晩還流して水を除去し、反応物質が完全に消費されるまで反応物を還流させると、Ｉ－２が得られる。ステップ２ではエステル化を行い、二塩化メチレン中のＥＤＣ・ＨＣｌ及び４－ＤＭＡＰのような試薬を用いて、異なるアルキル飽和／不飽和の線状または二重層の酸とＩ－２を一晩反応させることで、Ｉ－３が得られた。アミンの脱保護により、Ｉ－４誘導体がもたらされる。ステップ３では、Ｉ－４及びＩ－５をＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ及びＤＭＡＰまたはトリエチルアミンの存在下で反応させる。これらの混合物すべてをジメチルホルムアミドに溶解させ、出発物質が消費されるまで室温で攪拌させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＩ－６が得られる。
一般的反応スキーム９
Figure 2023546908000117
 ２つの分解性エステルを有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ａ－５）は、一般的反応スキーム９に従って調製することができ、式中、Ｒ１は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム９を参照すると、構造Ａ－１の化合物は、商業的供給源から購入され、及び／または当業者によく知られる方法に従って調製される。Ａ－１を、塩化メチレン溶媒中の触媒量の塩基（例えば、トリエチルアミン）と共に、Ａ－２塩化アクリロイル誘導体（ここで、Ｒａ＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５及び／またはイソプロピル基である）と４～５時間反応させると、置換アシル化生成物Ａ－３が得られる。アシル化生成物ならびに頭部基（Ｒ１）Ｎ，Ｎ－ジメチルジアミン及びまたは第一級アミン置換基（Ｎ－アルキル、非環式、環式、複素環式、芳香族アミンなど）のＡ－４の混合物を十分な温度及び時間で加熱することで、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＡ－５が生成される。
一般的反応スキーム１０
Figure 2023546908000118
 リンカーと内部アミンとの間に増加した炭素スペーサーを有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｂ－２）は、一般的反応スキーム１０に従って調製することができ、式中、Ｒ１及びＲ２は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～６の整数である。一般的反応スキーム１０を参照すると、構造Ｂ－２の化合物は、当業者によく知られる方法に従って調製される。溶媒としての二塩化メチレン中のＢ－１及びＢ－２の混合物を、トリエチルアミンなどの塩基と共に、化学量論量のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）またはＤＣＣジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で処理すると、エステル誘導体Ｂ－３が与えられ、次いで、Ｂ－３及びＡ－４の混合物を、６７℃の温度で１６時間加熱した無水アセトニトリル溶媒中の塩基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）で処理すると、必要なワークアップ及びまたは精製の後にＢ－４が生成される。
一般的反応スキーム１１
Figure 2023546908000119
 分解性／非分解性を有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｃ－２）は、一般的反応スキーム１１に従って調製することができ、式中、Ｒ尾部は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～８の整数である。一般的反応スキーム１１を参照すると、構造Ａ－４の化合物は、商業的供給源から購入され、及びまたは当業者によく知られる方法に従って調製される。アセトニトリル溶媒中で触媒量の塩基（例えば、炭酸カリウム、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ヨウ化カリウム）と共に、Ａ－４をＣ－１と１６時間６７℃の温度で反応させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＣ－２が生成される。
一般的反応スキーム１２
Figure 2023546908000120
 分解性／非分解性を有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｄ－４）は、一般的反応スキーム１２に従って調製することができ、式中、Ｒ尾部は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～１２の整数である。一般的反応スキーム１２を参照すると、構造Ａ－４の化合物は、商業的供給源から購入され、及びまたは当業者によく知られる方法に従って調製される。アセトニトリル溶媒中で触媒量の塩基（例えば、炭酸カリウム、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ヨウ化カリウム）と共に、過剰当量のＡ－４を１当量のＣ－１と１６時間６７℃の温度で反応させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＤ－１が生成される。次いで、ステップ１と同様にＤ－１をＤ－２と反応させるとＤ－３が生成される。Ａ－３をＤ－３と無溶媒条件下で反応させると、スキーム１に従う手順ではＤ－４が生成される。さらに、一般的反応スキーム１０と同じ手順でＢ－３及びＤ－３を反応させることにより、Ｎ，Ｎ－アルキル化が行われる。
一般的反応スキーム１３
Figure 2023546908000121
 分解性／非分解性を有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｅ－２）は、一般的反応スキーム１３に従って調製することができ、式中、Ｒ尾部は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～１２の整数である。一般的反応スキーム１３を参照すると、構造Ａ－４及びＥ－１の化合物は、商業的供給源から購入され、及びまたは当業者によく知られる方法に従って調製される。塩化メチレン溶媒中で化学量論量のトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムと共に、過剰当量のＥ－１を１当量のＡ－４と４～５時間室温で反応させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＥ－２が生成される。
一般的反応スキーム１４
Figure 2023546908000122
 分解性／非分解性を有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｆ－２）は、一般的反応スキーム１４に従って調製することができ、式中、Ｒ尾部は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～１４の整数である。一般的反応スキーム１４を参照すると、構造Ａ－４及びＦ－１の化合物は、商業的供給源から購入され、及びまたは当業者によく知られる方法に従って調製される。テトラヒドロフラン溶媒中で触媒量のフッ化テトラブチルアンモニウムと共に、過剰当量のＦ－１を１当量のＡ－４と３日間８０℃で反応させると、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＦ－２が生成される。
一般的反応スキーム１５
Figure 2023546908000123
 ６つの分解性エステルを有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｄ－８）は、一般的反応スキーム１５に従って調製することができ、式中、Ｒ尾部は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎは、１～８の整数であり、Ｒ頭部は、アルキル、環式、複素環式置換基である。一般的反応スキーム７を参照すると、構造Ｂ－１及びＡ－４の化合物は、商業的供給源から購入してもよく、または当業者によく知られる方法に従って調製してもよい。エタノールの存在下で触媒量の硫酸を使用したＢ－１のエステル化により、Ｇ－１が得られた。さらに、古典的なフィンケルシュタイン反応によって、ヨウ化ナトリウムのアセトン溶液により、臭化アルキルが対応するヨウ化アルキルＧ－２に変換される。Ｇ－２及びＧ－３の混合物をエタノール中のナトリウムエトキシド（ＮａＯＥｔ）と還流下で反応させ、続いて低ｐＨに酸性化するとＧ－４が得られる。ステップ４では、二塩化メチレン中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）及び触媒量の４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）の存在下でＦｉｓｃｈｅｒエステル化を一晩行うことで、Ｇ－５が得られた。さらに、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の存在下でＧ－５を対応する還元的アミノ化物に還元すると、Ｇ－６が得られる。精製されたＧ－６を、テトラヒドロフラン溶媒中、塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下で、アシルまたはスルホニルクロリド誘導体Ｇ－８と４～５時間、必要なワークアップ及びまたは精製ステップの後にＤ－８を生成するのに十分な温度及び時間で反応させると、置換アシル化生成物Ｇ－９が得られる。
一般的反応スキーム１６
Figure 2023546908000124
 リンカーと内部アミンとの間に増加した炭素スペーサーを有する脂質の例示的実施形態（例えば、化合物Ｈ－４）は、一般的反応スキーム１６に従って調製することができ、式中、Ｒ１及びＲ２は、線状鎖または飽和／不飽和で二重層尾部（対称及び非対称）を有する飽和または不飽和のＣ１－Ｃ１８アルキルであり、ｎ及びｎ１は、１～６の整数である。一般的反応スキーム１６を参照すると、構造Ｈ－４の化合物は、当業者によく知られる方法に従って調製される。溶媒としての二塩化メチレン中のＢ－１及びＢ－２の混合物を、トリエチルアミンなどの塩基と共に、化学量論量のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）またはＤＣＣジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で処理すると、エステル誘導体Ｂ－３が与えられる。一方、Ｈ－１を生成するための以前の方法に従ってアミンＨ－１の保護を行い、次いで、Ｂ－３及びＨ－１の混合物を、６７℃の温度で１６時間加熱した無水アセトニトリル溶媒中の塩基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）で処理すると、Ｈ－３が生成され、次いで、酸媒体の存在下で脱保護を行い、続いてＮ－アルキル化を行うと、必要なワークアップ及びまたは精製の後にＨ－４が生成される。
Ｖ．５． 本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰの標的送達
ある特定の実施形態では、驚くべきことに、本発明のイオン化可能脂質を筋肉内（ＩＭ）注射用のワクチンに使用する場合、ＩＭ経路を介して樹状細胞に送達するためのＬＮＰの要件が、肝細胞への静脈内（ＩＶ）送達とは異なることが見出された。ある特定の実施形態では、肝細胞のターゲティングは、ＬＮＰ取り込みを肝細胞ＬＤＬ受容体へターゲティングするＡｐｏＥとＬＮＰが会合することによるものだが、ＡｐｏＥは、ＩＭ投与において同じ役割を有しない可能性がある。ある特定の実施形態では、ＬＮＰの第２のターゲティング機序は、正味電荷である。ある特定の実施形態では、負に荷電されたＬＮＰはＩＶ投与すると脾臓をターゲティングし、正に荷電されたＬＮＰは肺をターゲティングし、中性に近いＬＮＰは肝臓をターゲティングする。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、これまでに知られているＬＮＰがＩＭ投与の際に急速に拡散して全身で発現するのに対し、ＬＮＰに利用される本発明のイオン化可能脂質は、生理学的ｐＨでわずかな正電荷を有するまたは中性付近になるように調整することができ、拡散せず、筋肉及び流入領域リンパ節で局所的に発現して、標的送達によってロバストな免疫応答を生成するという所見に基づく、重要な電荷効果を発見した。ある特定の実施形態では、発現の局在化は、効力を増大させ、オフターゲット発現を回避することによって全身の有害事象を低減させ得る。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質のプロトン化及び分岐脂質尾部が、エンドソーム放出を促進し、ＬＮＰ電荷がターゲティングに影響を与える。他の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、そのアジュバント性に対するＬＮＰ構造に影響を与える。ある特定の実施形態では、非対称イオン化可能脂質ＬＮＰは、タンパク質サブユニット抗原と共に送達された場合、強力なＴｈ２バイアス型アジュバントとして作用した。
ある特定の実施形態では、これらのＬＮＰにより推進されるアジュバント効果の多様性は、頭部基の環状対線状の性質を含み得るこれらの特性をコントロールする構造機能関係（ＳＦＲ）の特定を動機付ける。
理論に拘束されるものではないが、本発明は、例えばｍＲＮＡワクチンに使用するための、本発明のイオン化可能脂質及び効力の高いＬＮＰを包含し、これは、ＬＮＰのイオン化、電荷及び構造を、筋肉内投与の送達効率、ターゲティング、及びアジュバント性と結び付けるＳＦＲの理解に基づくものであり、他の送達部位に適用される可能性がある。
ある特定の実施形態では、イオン化可能脂質についてはＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａから、イオン化可能脂質を含むＬＮＰについてはゼータ電位及びＴＮＳによって、ｐＫａを得た。他の実施形態では、ＬＮＰの等電点ｐＩはゼータ電位から得られ、ＬＮＰの直径はＤＬＳからの数平均である。ＬＮＰ当たりの平均ｍＲＮＡコピーは、分子容モデル及びＤＬＳ直径を使用して計算され、ＬＮＰ体積に比例する。
ある特定の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
Figure 2023546908000125
 の構造に包含される本発明のイオン化可能脂質を包含し、ここで、ｐＫａは、身体の特定の組織または臓器への標的送達を実現するために調整することができる。当業者は、式Ｉ～ＩＸの本発明のイオン化可能脂質及びそれらの具体的な実施形態がＬＮＰの標的送達に使用され得ることを認識するであろう。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、全身に拡散せず、局所的に、例えば、筋肉及び流入領域リンパ節で発現して、標的送達によってロバストな免疫応答を生成するように、生理学的ｐＨでわずかな正電荷を有するまたは中性付近になるように調整することができる。ある特定の実施形態では、発現の局在化は、効力を増大させ、オフターゲット発現を回避することによって全身の有害事象を低減させ得る。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに使用するための本発明のイオン化可能脂質におけるプロトン化及び分岐脂質尾部の利用が、エンドソーム放出を促進し、第３のＳＦＲであるターゲティングに影響するＬＮＰ電荷が、そのアジュバント性に対するＬＮＰ構造の影響である。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ中の本発明の非対称イオン化可能脂質は、タンパク質サブユニット抗原と共に送達されると強力なＴｈ２バイアス型アジュバントとして作用し、ＬＮＰ ｍＲＮＡワクチンは、Ｔｆｈ及び胚中心Ｂ細胞の増殖を刺激するＴｆｈバイアス型応答ならびに強力な長期の中和抗体応答を推進する。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、送達効率をコントロールすることが知られている、エンドソームｐＨ範囲内のイオン化、生理学的ｐＨでの正味電荷、ならびに分岐及び飽和／不飽和に関連する脂質尾部立体構造という３つの構造的特徴を備えて設計される。ある特定の実施形態では、候補の評価及び構造－機能関係（ＳＦＲ）の解明の手法は、翻訳及び毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ評価、細胞取り込み、エンドソーム放出及び自然免疫センサー活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価、分布及び細胞輸送、免疫原性、及びウイルスチャレンジ研究における現在及び発展中の齧歯類及び非齧歯類動物モデルの使用のｉｎ ｖｉｖｏ解析を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、アセンブリ中の脂質及びｍＲＮＡの混合濃度の上昇に起因するｍＲＮＡ ＬＮＰの増大したｉｎ ｖｉｖｏ発現（５倍超）を有する。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰの標的送達には、１）生理学的ｐＨでわずかに正または中性付近のＬＮＰの両方を生成して全身への拡散を制限し、ワクチン効力を増大させるエンドソームのイオン化を増大させることができる、多価頭部基のイオン化特性の最適化が関わる。他の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰの標的送達には、エンドソーム放出を通じて効力をさらに増大させることができる、高度に分岐した分解性脂質尾部が関わる。他の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰの標的送達には、ＬＮＰアジュバント性に影響し得る本発明のイオン化可能脂質の電荷及び構造が関わる。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰの効力は、有害事象を制限し、製造コストを削減し、大きな人口群にワクチン接種する能力を増大させるように増大している。
ある特定の実施形態では、本発明は、ワクチン中の現在のＬＮＰよりも、低い用量での保護、低い反応原性、低い全身分布、及び高い保存安定性を示す、現在のＬＮＰよりも優れたＬＮＰ送達系を包含する。ある特定の実施形態では、第１世代Ｃ２４ ＬＮＰは、これらの特性のすベてに関して、当該分野の標準参照ＬＮＰであるＭＣ３よりも優れており、前臨床研究において公表されたワクチンの中和力価を上回った。ある特定の実施形態では、Ｃ２４を改良したものである我々の最新の第２世代ＬＮＰを使用した、開示されたワクチン製剤との直接比較。ある特定の実施形態では、本発明は、ワクチン応答に関与する細胞型及び細胞反応を特定するための作用機序を包含する。ある特定の実施形態では、オフターゲット肝臓発現をなくし、脾臓ターゲティングを増大させる電荷媒介性ターゲティングを、Ｔ細胞における特異的な細胞取り込みのためのリガンド媒介性ターゲティングと組み合わせることにより、我々は、脾臓Ｔ細胞への送達を正確にターゲティングする。ある特定の実施形態では、非常に効力が高いイオン化可能脂質の多様かつユニークなライブラリの系統的スクリーニングが、製剤及び製造プロセスパラメータと組み合わせた電荷媒介性ターゲティング及びリガンド媒介性ターゲティングにより最適化される幾つかの他の達成可能な細胞特異的ターゲットの特定を可能にする。
ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡにコードされた３つのレポーター、ルシフェラーゼ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣｒｅ－リコンビナーゼ、ならびにｍＲＮＡにコードされた１つの免疫原、Ｓ２Ｐ ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２免疫原の使用を包含する。ある特定の実施形態では、これらの構築物は、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の発現、ターゲティング及び毒性の一般原理及びモデルを開発するのに十分である。ある特定の実施形態では、小さいか（ｓｉＲＮＡ）大きいか（自己増幅ＲＮＡ、多価ワクチン、遺伝子編集設計）に関係なく、他のＲＮＡ配列の置換は、ＬＮＰの製剤及び製造に対する比較的軽微または中等度の改変を必要とする。
ある特定の実施形態では、本発明は、ターゲティング性能属性を予測するＬＮＰ特徴を特定する方法を包含し、それらを測定する方法を提供する。ある特定の実施形態では、改善された製造プロセスにより、高効力ＬＮＰの一貫した製造を保証する適切なインプロセスコントロール（ＩＰＣ）の特定が可能になる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、治療剤または予防剤の標的送達を必要とする様々な系において実施され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、構造及び理論上のイオン化特性を系統的に変化させたイオン化可能脂質の新規ライブラリを包含する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される一連のプロジェクトモジュールにより、予測モデルが、ＬＮＰの性能決定特性を、分子、製剤及び製造のパラメータ（以下の左端の３つのボックスの各矢印に対する複数のモデル）と関連付けることを可能にする、データセットの取得が可能になる。
Figure 2023546908000126
ある特定の実施形態では、いくつかのモデルは、機械学習手法を用いる統計的なものであり、いくつかは機械的なものである。ある特定の実施形態では、性能に影響すると現在理解されている特徴について解析されているＬＮＰの性能（上記の中央のボックスで、上述のように予測される）。ある特定の実施形態では、測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの性能は、発現効率、臓器及び細胞のターゲティング、毒性、分解性、ならびに免疫原性を含む（上記の右端のボックス）。
ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養に基づく解析及び動物モデルにおける性能のｉｎ ｖｉｖｏ解析は、ＬＮＰ特徴からＬＮＰ性能を予測する（上記の中央のボックスから右端のボックスへの矢印）。
ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ－ＬＮＰ発現及びターゲティングの決定因子は、ＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、エンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）、サイズ（ＤＬＮＰ）、イオン化可能脂質膜破壊能力（ＭＤＩＬ）、イオン化可能脂質ＲＮＡ放出能力（ＲＲＩＬ）、ターゲティングリガンド密度（ρＬ）及び結合親和性（ＫＬ）を含むがこれに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのパラメータは、イオン化可能脂質のイオン化及び構造特性、ならびに製剤パラメータ（例えば、脂質のタイプ及びモル比）、製造プロセス（例えば、濃度、バッファー、ｐＨ、溶媒比、流量）、及びリガンド共役によって決定される。ある特定の実施形態では、モデルは、イオン化可能脂質の特性、製剤パラメータ及び製造プロセスパラメータ、ならびにＬＮＰのｍＲＮＡ安定性を予測するモデルから、ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ、ＲＲＩＬ、ρＬ及びＫＬを予測する。
一実施形態では、ＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、及びエンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）の予測は、イオン化可能脂質の構造及びイオン化特性から導出される。一実施形態では、本発明は、モノプロトン性イオン化可能脂質の分子イオン化定数からＬＮＰイオン化特性を理論的に予測する方法を包含し、ＬＮＰのエンドソームプロトン化及び正味電荷の両方をコントロールする可能性がより大きいマルチプロトン性イオン化可能脂質に拡大適用される。
一実施形態では、脂質尾部の構造は、ｍＲＮＡ ＬＮＰの送達、放出、及び発現効率にとって重要であり、それらのエンドソーム膜破壊能力及びＲＮＡ放出能力によるものと考えられる。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＬＮＰにおける保存中のｍＲＮＡ切断を評価する方法を包含する。一実施形態では、イオン化可能脂質は、この反応の動態のｐＨ依存性を通じて切断速度に影響を与える。
一実施形態では、ＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、エンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）、サイズ（ＤＬＮＰ）、イオン化可能脂質膜破壊能力（ＭＤＩＬ）及びＲＮＡ放出能力（ＲＲＩＬ）の予測が、ＬＮＰ製剤から得られる。一実施形態では、ＬＮＰ電荷は、製剤比を変更すること、第５の脂質を加えること、及び特定のイオン化特性をイオン化可能脂質の設計に取り入れることによって改変され得る。一実施形態では、異なるＰＥＧ脂質構造も発現及びターゲティングに影響し得る。
一実施形態では、混合及び自己アセンブリの前に脂質溶液及びｍＲＮＡ溶液を調製する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのレポーター発現によるとより効率的な送達ビヒクルであるＬＮＰを形成する。一実施形態では、これらの新規溶液は、自己アセンブリ中により高い濃度の脂質及びｍＲＮＡを有し、イオン化可能脂質をプロトン化するための特定の方法も有する。一実施形態では、統計的機械学習モデルが、製造パラメータをＬＮＰ特徴と関連付ける。
一実施形態では、インタクトなＬＮＰに直接共役されたターゲティングリガンドは、細胞特異的ターゲティングの大きな増大を示す。
他の実施形態では、ある特定のＬＮＰについて、ＬＮＰの細胞取り込みのためにＡｐｏＥ吸着が必要である。ある特定の実施形態では、肝細胞におけるＰＥＧ脂質含有量が高いＬＮＰの活性の減少は、ＡｐｏＥとＬＮＰの会合の低減をもたらした。ある特定の実施形態では、５％のＰＥＧ脂質を含むＬＮＰは、１．５％のＰＥＧ脂質を含むＬＮＰと比較して低いＡｐｏＥとの結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、高度にＰＥＧ化されたＬＮＰにユニークなターゲティングリガンドを導入することにより、ＡｐｏＥ媒介性細胞取り込みをブロックすることができ、ＬＮＰの選択的送達を達成することができる。
ある特定の実施形態では、マンノース共役ナノ粒子が様々な標的送達研究において調査され、これらのナノ粒子は安全であることが証明されている。マンノース部分をＬＮＰの表面に導入するために、マンノース－ＰＥＧ脂質が使用される。
Ｖ．６． 本発明のイオン化可能脂質を含む脂質ナノ粒子
ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の本発明のイオン化可能脂質を含む脂質ナノ粒子を包含する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、第２の脂質を含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ステロイドを含む。他の実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質を含む。他の実施形態では、ＬＮＰは、核酸、好ましくはｍＲＮＡを含む。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、ＬＮＰとも呼ばれ、本発明のイオン化可能脂質、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、もしくは（ＩＸ）に包含される本発明のイオン化可能脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む、少なくとも１つの寸法がナノメートルのオーダー（例えば、１～１，０００ｎｍ）である粒子を指す。いくつかの実施形態では、そのような脂質ナノ粒子は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＩＸ）に包含される本発明のイオン化可能脂質、ならびに中性脂質、荷電脂質、ステロイド及びポリマー共役脂質（例えば、ＰＥＧ化脂質）から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、核酸、好ましくはｍＲＮＡ、またはその一部は、脂質ナノ粒子の脂質部分、または脂質ナノ粒子の脂質部分の一部もしくは全部に包まれた水性空間に封入され、それにより、酵素分解、または宿主生物もしくは細胞の機序によって誘導される他の望ましくない効果、例えば有害な免疫応答から保護される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡまたはその一部は、脂質ナノ粒子と会合している。
本発明の文脈において、脂質ナノ粒子は、いずれかの特定の形態に制限されず、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＩＸ）に包含される本発明のイオン化可能脂質と、場合により１つ以上のさらなる脂質とが、例えば水性環境及び／または核酸化合物の存在下で組み合わされると生成される、あらゆる形態を含むと解釈されるべきである。例えば、リポソーム、脂質複合体、リポプレックスなどは、脂質ナノ粒子の範囲内にある。
様々な実施形態において、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性がある。本明細書で使用される場合、平均直径は、動的光散乱によって決定される数加重平均によって表され得る。
ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合するまたは１つ以上の核酸分子が封入される粒子を形成することができる、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）に包含される本発明のイオン化可能脂質のいずれを含んでもよい。「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えばエステル）であり、水に不溶であるが多くの有機溶媒に可溶であることを一般に特徴とする有機化合物の群を指す。脂質は通常、（１）脂肪及び油ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」という少なくとも３つのクラスに分けられる。
一実施形態では、ｍＲＮＡを含むＬＮＰは、本明細書で定義される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＩＸ）に包含される１つ以上の本発明のイオン化可能脂質と、１つ以上の安定化脂質とを含む。安定化脂質は、中性脂質及びＰＥＧ化脂質を含む。
言及したように、ＬＮＰは、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＩＸ）に包含される本発明のイオン化可能脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、好ましくはカチオン化可能である（すなわち、ｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫａ未満に低下するとプロトン化される）が、より高いｐＨ値では徐々に中性寄りになる。ある特定の実施形態では、脂質は、正に荷電されると、負に荷電された核酸と会合することができる。ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、ｐＨが低下すると正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合するまたは１つ以上の核酸分子が封入される粒子を形成することができる、任意の脂質を含み得る。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、さらなるカチオン性またはカチオン化可能脂質（すなわち、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を帯びるいくつかの脂質種のいずれか）を含み得る。そのような脂質の例は、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ－（１，２ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）を含むがこれに限定されない。
さらに、本発明で使用できるいくつかの市販の脂質調製物が利用可能である。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．から市販されているカチオン性リポソーム）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｎ－（１－（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されているカチオン性リポソーム）、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）をエタノールに含む、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から市販されているカチオン性脂質）が含まれる。次の脂質は、カチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
さらなる実施形態では、さらなる脂質は、アミノ脂質である。本発明において有用な好適なアミノ脂質には、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものが含まれる。代表的なアミノ脂質は、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）を含むがこれに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、粒子の形成中にその形成を安定化する１つ以上の追加の脂質を含む。
好適な安定化脂質は、中性脂質及びアニオン性脂質を含む。「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電または中性の双性イオン性形態で存在するいくつかの脂質種のうちのいずれか１つを指す。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。
例示的な中性脂質としては、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌカルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイルホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ならびに１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が挙げられる。一実施形態では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される中性脂質を含む。様々な実施形態において、本発明のイオン化可能脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）の構造に包含される脂質）の、中性脂質に対するモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。ある特定の実施形態では、このモル比は、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１、１１：１、１５：１、２０：１、３０：１、５０：１、及びこれらの範囲内に含まれるすべてのモル比である。
様々な実施形態において、ＬＮＰは、ステロイドまたはステロイドアナログをさらに含む。
ある特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイドアナログは、コレステロールである。これらの実施形態のいくつかにおいて、本発明のイオン化可能脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）の構造に包含される脂質）の、ステロイドに対するモル比は、約５：１～１：１の範囲である。ある特定の実施形態では、このモル比は、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１、１１：１、１５：１、２０：１、３０：１、５０：１、及びこれらの範囲内に含まれるすべてのモル比である。
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電されているあらゆる脂質を指す。これらの脂質は、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎグルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基を含む。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ポリマー共役脂質を含む。「ポリマー共役脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分との両方を含む分子を指す。ポリマー共役脂質の一例は、ＰＥＧ化脂質である。「ＰＥＧ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分との両方を含む分子を指す。ＰＥＧ化脂質は当技術分野で公知であり、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧ）などを含む。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ化脂質）である追加の安定化脂質を含む。好適なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及びＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧが挙げられる。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。他の実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば、４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えば、ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメートもしくは２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートを含む。様々な実施形態において、カチオン性脂質のＰＥＧ化脂質に対するモル比は、約４００：１～約１０：１の範囲である。
言及したように、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、次の構造を有するＰＥＧ化脂質：
Figure 2023546908000127
 またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を含み得、式中、
Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１０～３０個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、このアルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって場合により中断されており、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。
ＰＥＧ化脂質の前述の実施形態のいくつかにおいて、ｗが４２であるとき、Ｒ８及びＲ９の両方がｎ－オクタデシルであることはない。いくつかの他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１０～１８個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１２～１６個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１２個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１６個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。なおもさらなる実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、各々独立的に、１８個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。さらに他の実施形態では、Ｒ８は、１２個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、Ｒ９は、１４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。
様々な実施形態において、ｗは、ＰＥＧ部分が約４００～約６０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するように選択される範囲にわたる。いくつかの実施形態では、平均ｗは、約５０である。
ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ナノ粒子の総脂質含有量に対して、約１～約１０モルパーセントの量でＬＮＰ中に存在する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、約１～約５モルパーセントの量でＬＮＰ中に存在する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、約１モルパーセントまたは約１．５モルパーセントでＬＮＰ中に存在する。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰを細胞または細胞集団にターゲティングすることができる１つ以上のターゲティング部分を含む。例えば、一実施形態において、ターゲティング部分は、細胞表面上に見られる受容体にＬＮＰを指向するリガンドである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上の内部移行ドメインを含む。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは、細胞に結合してＬＮＰの内部移行を誘導する１つ以上のドメインを含む。例えば、一実施形態において、１つ以上の内部移行ドメインは、細胞表面上に見られる受容体に結合して、ＬＮＰの受容体媒介性取り込みを誘導する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ｉｎ ｖｉｖｏで生体分子に結合することができ、ＬＮＰが結合した生体分子は次に、細胞表面受容体によって認識され、内部移行を誘導することができる。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは、全身性ＡｐｏＥと結合し、これがＬＮＰ及び関連するカーゴの取り込みをもたらす。
他の例示的なＬＮＰ及びそれらの製造については、当技術分野において、例えば米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２７６２０９号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２８（２）：１７２－１７６、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， １８（７）： １３５７－１３６４、Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １９（１２）： ２１８６－２２００、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｃ Ｎａｎｏｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ， １１６（３４）： １８４４０－１８４５０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， １３１（５）： Ｅ７８１－９０、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １： ｅ３７、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ５１（３４）： ８５２９－８５３３、Ｍｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２， ｅ１３９、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， ２１（８）： １５７０－１５７８、及びＴａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９（５）： ６６５－７４に記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。言及したように、平均直径は、動的光散乱によって決定される数加重平均に対応し得る。
別の好ましい本発明の実施形態では、脂質ナノ粒子は、それぞれ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約６０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の流体力学直径を有する。
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性がある。
脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの総量は様々であり、総脂質に対するｍＲＮＡのｗ／ｗ比に応じて定義され得る。ある特定の実施形態では、ナノ粒子比は２～１０である。本発明の一実施形態において、総脂質に対するｍＲＮＡの比は、０．０６ｗ／ｗ未満、好ましくは０．０３～０．０４ｗ／ｗである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）の構造のいずれかに包含される本発明のイオン化可能脂質、上記で定義したｍＲＮＡ化合物、中性脂質、ステロイド及びＰＥＧ化脂質を含む。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰを細胞または細胞集団にターゲティングすることができる１つ以上のターゲティング部分を含む。例えば、一実施形態において、ターゲティング部分は、細胞表面上に見られる受容体にＬＮＰを指向するリガンドである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上の内部移行ドメインを含む。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは、細胞に結合してＬＮＰの内部移行を誘導する１つ以上のドメインを含む。例えば、一実施形態において、１つ以上の内部移行ドメインは、細胞表面上に見られる受容体に結合して、ＬＮＰの受容体媒介性取り込みを誘導する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ｉｎ ｖｉｖｏで生体分子に結合することができ、ＬＮＰが結合した生体分子は次に、細胞表面受容体によって認識され、内部移行を誘導することができる。例えば、一実施形態において、ＬＮＰは、全身性ＡｐｏＥと結合し、これがＬＮＰ及び関連するカーゴの取り込みをもたらす。
特に、本発明は、以下の非限定的で具体的な実施形態に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）に従う本発明のイオン化可能脂質、及び少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物、及びＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質を、約５０：１０：３８．５：１の比で含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に関する。
特定の好ましい実施形態において、本発明は、本発明のイオン化可能脂質、ＰＥＧ脂質、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物、ステロイド及び中性脂質を含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、好ましくは、これらを約５０：１０：３８．５：１．５の比で含み、未修飾の、１－メチルシュードウリジン修飾型の、またはコドン最適化されたｍＲＮＡを封入する、脂質ナノ粒子に関する。好ましくは、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルギー性抗原、もしくは自己免疫自己抗原、またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する。
ある特定の実施形態では、本発明は、核酸及び４つの脂質：アミン基を有する本発明のイオン化可能脂質（５０％）、第２の脂質（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ））（１０％）、ステロイド（例えば、コレステロール）（３８．５％）、及びＰＥＧ化脂質（例えば、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００））（１．５％）（括弧内はモル比）から構成された本発明のイオン化可能脂質を含む直径５０～１００ｎｍのＬＮＰを包含する。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに含まれる本発明のイオン化可能脂質の量は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４．２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４．６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１０、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４．１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４．１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、２０、２１．１、２１．２、２１．３、２１．４、２１．５、２１．６、２１．７、２１．８、２１．９、３０、３１、３１．１、３１．２、３１．３、３１．４、３１．５、３１．６、３１．７、３１．８、３１．９、３２、３２．１、３２．２、３２．３、３２．４．３２．５、３２．６、３２．７、３２．８、３２．９、３３、３３．１、３３．２、３３．３、３３．４、３３．５、３３．６、３３．７、３３．８、３３．９、３４、３４．１、３４．２、３４．３、３４．４、３４．５、３４．６、３４．７、３４．８、３４．９、３５、３５．１、３５．２、３５．３、３５．４、３５．５、３５．６、３５．７、３５．８、３５．９、３６、３６．１、３６．２、３６．３、３６．４．３６．５、３６．６、３６．７、３６．８、３６．９、３７、３７．１、３７．２、３７．３、３７．４、３７．５、３７．６、３７．７、３７．８、３７．９、３８、３８．１、３８．２、３８．３、３８．４、３８．５、３８．６、３８．７、３８．８、３８．９、３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４．４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４．４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、５０、５５、６０、６５、７０、または７５モルパーセントである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに含まれる第２の脂質の量は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４．２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４．６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１０、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４．１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４．１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、２０、２１．１、２１．２、２１．３、２１．４、２１．５、２１．６、２１．７、２１．８、２１．９、３０、３１、３１．１、３１．２、３１．３、３１．４、３１．５、３１．６、３１．７、３１．８、３１．９、３２、３２．１、３２．２、３２．３、３２．４．３２．５、３２．６、３２．７、３２．８、３２．９、３３、３３．１、３３．２、３３．３、３３．４、３３．５、３３．６、３３．７、３３．８、３３．９、３４、３４．１、３４．２、３４．３、３４．４、３４．５、３４．６、３４．７、３４．８、３４．９、３５、３５．１、３５．２、３５．３、３５．４、３５．５、３５．６、３５．７、３５．８、３５．９、３６、３６．１、３６．２、３６．３、３６．４．３６．５、３６．６、３６．７、３６．８、３６．９、３７、３７．１、３７．２、３７．３、３７．４、３７．５、３７．６、３７．７、３７．８、３７．９、３８、３８．１、３８．２、３８．３、３８．４、３８．５、３８．６、３８．７、３８．８、３８．９、３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、または４０モルパーセントである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに含まれるステロイドの量は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４．２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４．６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１０、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４．１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４．１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、２０、２１．１、２１．２、２１．３、２１．４、２１．５、２１．６、２１．７、２１．８、２１．９、３０、３１、３１．１、３１．２、３１．３、３１．４、３１．５、３１．６、３１．７、３１．８、３１．９、３２、３２．１、３２．２、３２．３、３２．４．３２．５、３２．６、３２．７、３２．８、３２．９、３３、３３．１、３３．２、３３．３、３３．４、３３．５、３３．６、３３．７、３３．８、３３．９、３４、３４．１、３４．２、３４．３、３４．４、３４．５、３４．６、３４．７、３４．８、３４．９、３５、３５．１、３５．２、３５．３、３５．４、３５．５、３５．６、３５．７、３５．８、３５．９、３６、３６．１、３６．２、３６．３、３６．４．３６．５、３６．６、３６．７、３６．８、３６．９、３７、３７．１、３７．２、３７．３、３７．４、３７．５、３７．６、３７．７、３７．８、３７．９、３８、３８．１、３８．２、３８．３、３８．４、３８．５、３８．６、３８．７、３８．８、３８．９、３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４．４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４．４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、５０、５５、６０、６５、７０、または７５モルパーセントである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰに含まれるＰＥＧ化脂質の量は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４．２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４．６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１０、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４．１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４．１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、または２０モルパーセントである。
ある特定の実施形態では、親水性ＤＭＧ－ＰＥＧは、ＬＮＰのシェルを形成する。核酸の量は、イオン化可能脂質のアミンの、核酸骨格のリン酸基に対するＮＰモル比によって表され、典型的には３～６である。ある特定の実施形態では、ＬＮＰのｐＫａは、初期エンドソーム内のｐＨに対応する６～７の範囲となる。ＬＮＰ中のイオン化可能脂質のｐＫａと遺伝子サイレンシング効率との間の関連性は、６～７の範囲のＬＮＰ ｐＫａがイオン化可能脂質ＤＬｉｎＤＭＡのより多くのサイレンシングをもたらし、エンドソームの膜を破壊し得る脂質構造の促進に関連していることを示した。ＬＮＰのｐＫａは、アニオン性色素ＴＮＳの蛍光増強のｐＨ依存性を使用して測定した。ある特定の実施形態では、ｐＫａ依存性エンドソーム放出機序は、イオン化可能脂質の末広で円錐形の脂質尾部が膜の破壊を促進する、カチオン性のプロトン化されたイオン化可能脂質とアニオン性のエンドソームリン脂質との間のイオン対形成事象として説明された。
特に好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子に含まれるｍＲＮＡを含み、好ましくは、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質１（Ｍ１）、基質タンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、もしくはポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する。より好ましくは、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）、またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する。さらにより好ましくは、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）の少なくとも１つの完全長タンパク質及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の少なくとも１つの完全長タンパク質、あるいはそのバリアントである。さらなる好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルスから選択される。特に好ましい実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８からなる群から選択されるヘマグルチニン（ＨＡ）によって特徴付けられるインフルエンザウイルスから選択され、及び／またはＡ型インフルエンザウイルスは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、及びＮ１１からなる群から選択されるノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって特徴付けられるインフルエンザウイルスから選択される。好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、及びＨ１０Ｎ７からなる群から選択され、好ましくはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１から選択される。最も好ましくは、ｍＲＮＡ配列は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントと、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントとをコードする、少なくとも１つのコード領域を含む。特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、及びＨ１０Ｎ７からなる群から選択される、好ましくはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１から選択される、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする、少なくとも１つのコード領域を含む。
Ｖ．７． 本発明のＬＮＰを作製する方法
本発明はさらに、脂質ナノ粒子を調製する方法に関し、この方法は、
（ｉ）組み合わせるステップであって、
（ａ）上記で定義した本発明のイオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体、
（ｂ）ＰＥＧ脂質、
（ｃ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物、及び
（ｄ）場合によりステロイド、及び
（ｅ）場合により中性脂質を組み合わせるステップと、
（ｉｉ）イオン化可能脂質及び／またはＰＥＧ脂質、ならびに場合により中性脂質及び／またはステロイドもしくはステロイド誘導体をエタノールに可溶化するステップと、
（ｉｉｉ）エタノール性脂質溶液を、ｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む水溶液と混合するステップと、
（ｉｖ）エタノールを除去して、ｍＲＮＡポリヌクレオチドを封入するまたはｍＲＮＡポリヌクレオチドと会合する脂質ナノ粒子を形成するステップと、場合により、
（ｖ）希釈、透析、または濾過によるｐＨ調整のステップと、
（ｖｉ）脂質ナノ粒子を分離または精製するステップとを含む。
エタノールは、脂質または脂質ナノ粒子の形成に悪影響を及ぼさない任意の好適な方法によって除去され得る。本発明の一実施形態において、エタノールは、透析によって除去される。代替的な実施形態では、エタノールは、透析濾過によって除去される。
脂質ナノ粒子の分離及び最適な精製も、任意の好適な方法によって行われ得る。好ましくは、脂質ナノ粒子は濾過され、より好ましくは、脂質ナノ粒子は、無菌フィルターによる濾過によって分離または精製される。
Ｖ．８． 本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のイオン化可能脂質及び核酸を含む医薬組成物及び／またはワクチンも包含する。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡを含む本発明による医薬組成物またはワクチンは、およそ５０：１０：３８．５：１．５、好ましくは４７．５：１０：４０．８：１．７、またはより好ましくは４７．４：１０：４０．９：１．７のモル比（すなわち、エタノール中に可溶化した、本発明のイオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の割合（ｍｏｌ％））を有する、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、このモル比は、４８：１２：３８：２である。
本発明はさらに、本発明による少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書で定義される少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む。
本発明の一実施形態において、ｍＲＮＡ配列は、１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。本発明の代替的な実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、２つ以上の抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
本発明の一実施形態において、医薬組成物は、本発明による脂質ナノ粒子を含み、脂質ナノ粒子は、２つ以上のｍＲＮＡ化合物を含み、その各々が、抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする異なるｍＲＮＡ配列を含む。
本発明の代替的な実施形態では、医薬組成物は、第２の脂質ナノ粒子を含み、第２の脂質ナノ粒子に含まれるｍＲＮＡ化合物は、第１の脂質ナノ粒子に含まれるｍＲＮＡ化合物とは異なる。
さらなる態様において、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ここで、ｍＲＮＡは、本明細書で定義される少なくとも１つのコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。本発明による組成物は、好ましくは、医薬組成物またはワクチンとして提供される。
好ましい実施形態によれば、本発明による医薬組成物またはワクチンは、上記で定義した少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、好ましくはインフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質または糖タンパク質のいずれか１つ、またはこれらのタンパク質のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントをコードする。
好ましくは、本発明による医薬組成物またはワクチンは、上記で定義した少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード配列は、好ましくはインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質のいずれか１つ、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、インフルエンザウイルスのタンパク質に由来するタンパク質は、好ましくは、これらの配列のいずれか１つのアミノ酸配列またはフラグメントもしくはバリアントのいずれか１つを含むか、またはそれからなる。代替的には、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、狂犬病ウイルス、好ましくは狂犬病ウイルスの糖タンパク質、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントに由来する。
好ましくは、本発明による医薬組成物またはワクチンは、上記で定義した少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み、ｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード配列は、インフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する。
したがって、本発明による医薬組成物またはワクチンは、好ましくはインフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする、少なくとも１つのコード領域を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み得、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、例えば本明細書で定義されるインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する１つの特異的抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。
代替的に、本発明の医薬組成物またはワクチンは、本発明による少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物を含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み得、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列は、例えば本明細書で定義されるインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の異なる抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。
この文脈において、医薬組成物またはワクチンに含まれる少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物は、例えばインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の異なる抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする、バイシストロン性またはマルチシストロン性のｍＲＮＡであることが特に好ましい。少なくとも１つのｍＲＮＡ配列がモノシストロン性であり得、少なくとも１つの他のｍＲＮＡ配列がバイシストロン性またはマルチシストロン性であり得る、２つ以上のｍＲＮＡ配列を含む組成物のような、これらの実施形態の間の混合物も想定される。
したがって、本発明による医薬組成物またはワクチン、好ましくは、その中に含まれるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード配列は、本明細書で定義される核酸配列の任意の組み合わせを含み得る。
好ましくは、医薬組成物またはワクチンは、本発明によるｍＲＮＡ配列を複数すなわち２つ以上含む、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含み、各ｍＲＮＡ配列は、インフルエンザウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
特に好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または１００個の異なるｍＲＮＡ配列を含み、その各々が、例えば、上記で定義したインフルエンザウイルスのタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する、例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
別の実施形態では、組成物は、４つの異なるｍＲＮＡ配列を含み、その各々が、好ましくは、上記で定義したインフルエンザウイルスのタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する、例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはそのフラグメントもしくはバリアントに由来する、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
この文脈において、各ｍＲＮＡ配列が、同じ病原体、例えばインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの異なる抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードすることが特に好ましく、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、同じ病原体、例えばインフルエンザウイルスの異なるタンパク質に由来することが特に好ましい。好ましくは、組成物は、少なくとも２つのｍＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードし、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列は、同じインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
別の好ましい実施形態において、各ｍＲＮＡ配列は、異なる病原体、例えばインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する、少なくとも１つの異なる抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。好ましくは、各ｍＲＮＡ配列は、異なるインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする。
好ましくは、本発明による医薬組成物またはワクチンは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質を各々がコードする複数のｍＲＮＡ配列を含み、２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または１００個の異なるインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質が、複数のｍＲＮＡ配列によってコードされる。
この文脈において、医薬組成物またはワクチンは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５のタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、及び場合により、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７のタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、及び／または場合により、Ａ型インフルエンザウイルスＨ９のタンパク質、好ましくはヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含むことが特に好ましい。
好ましくは、医薬組成物またはワクチンは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、及び場合により、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスＨ７のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、及び／または場合により、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスＨ９のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む。
具体的な実施形態において、医薬組成物またはワクチンは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む。
さらに、医薬組成物またはワクチンは、好ましくは、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子をさらに含む。
Ｖ．９． 本発明のＬＮＰに使用するための核酸
本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に含まれる少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍ－ＲＮＡ）が、頻繁な投与を必要としない低投与量及び投薬レジメンで、コードされた抗原性ペプチドまたはタンパク質に対する抗原特異的免疫応答を非常に効率的に誘導するという驚くべき所見に基づく。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に含まれる少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする本発明のｍＲＮＡの別の利点は、強力な液性免疫応答の誘導；ｂ細胞記憶の誘導；免疫防御のより迅速な開始；誘導される免疫応答が長期にわたること；広範な細胞性ｔ細胞応答の誘導；（局所的かつ一過性の）炎症促進性環境の誘導；全身性サイトカインまたはケモカイン応答を誘導しないこと；忍容性良好であり、副作用がなく、非毒性であること；有利な安定性特性；多くの異なる抗原との製剤の適合性：同じ（生産）技術に基づいて実現可能な抗原カクテルがより大きいこと；ベクター免疫がない、すなわち、同じ対象に複数の（異なる）抗原に対する複数回のワクチン接種を行うために技術が使用され得ること；生産の速度、適応性、単純性、及びスケーラビリティである。
特に、本発明は、脂質ナノ粒子及びその使用に関する。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも、
（ｉ）本発明のイオン化可能脂質及び／またはＰＥＧ脂質、ならびに
（ｉｉ）抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む。
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、さらなる化合物、例えば１つ以上の中性脂質、ステロイド、及び前記化合物の組み合わせを含み得る。好適な化合物については、以下に詳細に記載する。
ある特定の実施形態では、抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、ｍＲＮＡ分子であり得る。本発明の一実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、天然の非修飾ｍＲＮＡである。本発明の文脈において、天然の非修飾ｍＲＮＡは、化学修飾または配列の変化を伴わずにｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたｍＲＮＡを包含する。
本発明の代替的な実施形態では、ｍＲＮＡ化合物は、人工ｍＲＮＡを含む。本発明の文脈において、人工ｍＲＮＡは、化学修飾、配列修飾または非天然配列を有するｍＲＮＡを包含する。
本発明の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物はヌクレオシド修飾を含まず、特に塩基修飾を含まない。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡ化合物は、１－メチルシュードウリジン修飾を含まない。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシドのみを含む。さらなる好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ化合物は、化学修飾を含まず、場合により配列修飾を含む。本発明のさらなる好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ化合物は、天然に存在するヌクレオシドであるアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンのみを含む。
本発明のある特定の実施形態によれば、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは本明細書で定義されるように、モノシストロン性、バイシストロン性、またはマルチシストロン性である。バイシストロン性またはマルチシストロン性ｍＲＮＡのコード配列は、好ましくは、本明細書で定義される別個のペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。好ましくは、２つ以上のペプチドまたはタンパク質をコードするコード配列は、バイシストロン性またはマルチシストロン性ｍＲＮＡにおいて、以下に定義するように、少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって分離されていてもよい。したがって、「２つ以上のペプチドまたはタンパク質をコードする」という用語は、本明細書で提供される定義においては、バイシストロン性またはさらにはマルチシストロン性のｍＲＮＡが、例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の（好ましくは異なる）ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードし得ることを意味し得るが、これに限定されるものではない。より好ましくは、バイシストロン性またはさらにはマルチシストロン性のｍＲＮＡは、例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の（好ましくは異なる）、本明細書で定義されるペプチドもしくはタンパク質または本明細書で定義されるそれらのフラグメントもしくはバリアントをコードし得るが、これに限定されるものではない。
この文脈において、上記で定義したいわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列は、唯一のリボソーム結合部位として機能することができるが、互いに独立してリボソームによって翻訳される幾つかのペプチドまたはタンパク質をコードする、上記で定義したバイシストロン性またはさらにはマルチシストロン性のｍＲＮＡを提供する機能を果たすこともできる。本発明に従って使用され得るＩＲＥＳ配列の例は、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス角膜白斑ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）に由来するものである。我々が使用するＴＥＶ、タバコエッチウイルスの５’ＵＴＲはＩＲＥＳである。
さらなる実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、アミノ酸リンカー配列ありまたはなしで連結された、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、及びそれ以上の本明細書で定義されるペプチドまたはタンパク質（またはそれらのフラグメント及び誘導体）をコードし得、前記リンカー配列は、剛性リンカー、可撓性リンカー、切断可能なリンカー（例えば、自己切断ペプチド）、またはそれらの組み合わせを含み得る。ここで、ペプチドまたはタンパク質は、同一であっても異なっていてもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。特定のペプチドまたはタンパク質の組み合わせは、本明細書で説明する少なくとも２つのペプチドまたはタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡ（本明細書では「多抗原構築物／ｍＲＮＡ」とも呼ばれる）によってコードされ得る。
本発明の特定の態様において、脂質ナノ粒子は、抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらのフラグメント、バリアントもしくは誘導体をコードするｍＲＮＡ配列を含む、ｍＲＮＡ化合物を含む。
これらの抗原性ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは本明細書で定義されるような、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルギー性抗原または自己免疫自己抗原に由来し得る。本発明の文脈において、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、ルシフェラーゼを除外する。
Ｖ．９．１． 病原性抗原
このような病原性抗原は、対象、特に哺乳動物対象、より具体的にはヒトによる免疫学的反応を誘起する、病原性生物、特に細菌、ウイルス、または原生動物（多細胞）の病原性生物に由来する。より具体的には、病原性抗原は、ウイルスまたは細菌もしくは原生動物の表面に位置する表面抗原、例えばタンパク質（またはタンパク質のフラグメント、例えば表面抗原の外部部分）であることが好ましい。
病原性抗原は、好ましくは感染性疾患に関連する病原体に由来するペプチドまたはタンパク質抗原であり、好ましくは、病原体のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａ属、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、アストロウイルス科、Ｂａｂｅｓｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、ＢＫウイルス、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ、ブニヤウイルス科、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ及び他のバークホルデリア種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、カリシウイルス科、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ属種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、ＣＤプリオン、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属種、コロナウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３及びＤＥＮ－４）、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１及びＯ１０４：Ｈ４、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ及びＦａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ属種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルスニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、クーループリオン、ラッサウイルス、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ属種、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ属種、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ、パルボウイルスＢ１９、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ、ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、ＳＡＲＳコロナウイルス、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｔａｅｎｉａ属、Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓまたはＴｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡または小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、黄熱病ウイルス、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、ならびにＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来する抗原から選択される。
この文脈において特に好ましいのは、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、プラスモジウム、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、デングウイルス、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ブルセラ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、狂犬病ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択される病原体に由来する抗原である。
さらに、病原性抗原（感染性疾患に関連する病原体に由来する抗原）は、好ましくは、次の抗原から選択され得る：外膜タンパク質Ａ ＯｍｐＡ、バイオフィルム関連タンパク質Ｂａｐ、輸送タンパク質ＭｕｃＫ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、アシネトバクター感染症））；変異表面糖タンパク質ＶＳＧ、微小管関連タンパク質ＭＡＰＰ１５、トランスシアリダーゼＴＳＡ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症））；ＨＩＶ ｐ２４抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質（Ｇｐ１２０、Ｇｐ４１、Ｇｐ１６０）、ポリタンパク質ＧＡＧ、ネガティブファクタータンパク質Ｎｅｆ、転写トランス活性化因子Ｔａｔ（ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群））；ガラクトース阻害性接着タンパク質ＧＩＡＰ、２９ｋＤａ抗原Ｅｈ２９、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃレクチン、タンパク質ＣＲＴ、１２５ｋＤａ免疫優性抗原、タンパク質Ｍ１７、アドヘシンＡＤＨ１１２、タンパク質ＳＴＩＲＰ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、アメーバ症）；主要表面タンパク質１～５（ＭＳＰ１ａ、ＭＳＰ１ｂ、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５）、ＩＶ型分泌系タンパク質（ＶｉｒＢ２、ＶｉｒＢ７、ＶｉｒＢ１１、ＶｉｒＤ４）（Ａｎａｐｌａｓｍａ属、アナプラズマ症）；防御抗原ＰＡ、浮腫因子ＥＦ、致死因子ＬＦ、Ｓ層相同性タンパク質ＳＬＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、炭疽）；アクラノリシン、ホスホリパーゼＤ、コラーゲン結合タンパク質ＣｂｐＡ（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ感染症）；ヌクレオカプシドタンパク質ＮＰ、糖タンパク質前駆体ＧＰＣ、糖タンパク質ＧＰ１、糖タンパク質ＧＰ２（フニンウイルス、アルゼンチン出血熱）；キチンタンパク質層タンパク質、１４ｋＤａ表面抗原Ａ１４、主要精子タンパク質ＭＳＰ、ＭＳＰ重合組織化タンパク質ＭＰＯＰ、ＭＳＰ線維タンパク質２ ＭＦＰ２、ＭＳＰ重合活性化キナーゼＭＰＡＫ、ＡＢＡ－１様タンパク質ＡＬＢ、タンパク質ＡＢＡ－１、クチクリンＣＵＴ－１（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、回虫症）；４１ｋＤａアレルゲンＡｓｐ ｖ１３、アレルゲンＡｓｐ ｆ３、主要分生子表面タンパク質ｒｏｄｌｅｔ Ａ、プロテアーゼＰｅｐ１ｐ、ＧＰＩ固定タンパク質Ｇｅｌ１ｐ、ＧＰＩ固定タンパク質Ｃｒｆ１ｐ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、アスペルギルス症）；ファミリーＶＰ２６タンパク質、ＶＰ２９タンパク質（アストロウイルス科、アストロウイルス感染症）；桿小体関連タンパク質１ ＲＡＰ－１、メロゾイト表面抗原ＭＳＡ－１、ＭＳＡ－２（ａ１、ａ２、ｂ、ｃ）、１２Ｄ３、１１Ｃ５、２１Ｂ４、Ｐ２９、変異赤血球表面抗原ＶＥＳＡ１、頂端膜抗原１ ＡＭＡ－１（Ｂａｂｅｓｉａ属、バベシア症）；溶血素、エンテロトキシンＣ、ＰＸＯ１－５１、グリコール酸オキシダーゼ、ＡＢＣ輸送体、ペニシリン結合タンパク質、亜鉛輸送体ファミリータンパク質、シュードウリジンシンターゼＲｓｕ、プラスミド複製タンパク質ＲｅｐＸ、オリゴエンドペプチダーゼＦ、プロファージ膜タンパク質、タンパク質ＨｅｍＫ、鞭毛抗原Ｈ、２８．５－ｋＤａ細胞表面抗原（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ感染症）；ラージＴ抗原ＬＴ、スモールＴ抗原、カプシドタンパク質ＶＰ１、カプシドタンパク質ＶＰ２（ＢＫウイルス、ＢＫウイルス感染症）；２９ｋＤａタンパク質、カスパーゼ－３様抗原、糖タンパク質（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ感染症）；酵母表面アドヘシンＷＩ－１（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、ブラストミセス症）；ヌクレオタンパク質Ｎ、ポリメラーゼＬ、基質タンパク質Ｚ、糖タンパク質ＧＰ（マチュポウイルス、ボリビア出血熱）；外表面タンパク質Ａ ＯｓｐＡ、外表面タンパク質ＯｓｐＢ、外表面タンパク質ＯｓｐＣ、デコリン結合タンパク質Ａ ＤｂｐＡ、デコリン結合タンパク質Ｂ ＤｂｐＢ、鞭毛フィラメント４１ｋＤａコアタンパク質Ｆｌａ、塩基性膜タンパク質Ａ前駆体ＢｍｐＡ（免疫優性抗原Ｐ３９）、外表面２２ｋＤａリポタンパク質前駆体（抗原ＩＰＬＡ７）、変異表面リポタンパク質ｖｌｓＥ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、ボレリア感染症）；ボツリヌス神経毒ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、組換えボツリヌス毒素Ｆ ＨｅドメインＦＨｃ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、ボツリヌス症（及び乳児ボツリヌス症））；ヌクレオカプシド、糖タンパク質前駆体（サビアウイルス、ブラジル出血熱）；銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼＳｏｄＣ、バクテリオフェリチンＢｆｒ、５０Ｓリボソームタンパク質ＲｐｌＬ、ＯｍｐＡ様膜貫通ドメイン含有タンパク質Ｏｍｐ３１、免疫原性３９－ｋＤａタンパク質Ｍ５ Ｐ３９、亜鉛ＡＢＣ輸送体ペリプラズム亜鉛結合タンパク質ｚｎｕＡ、ペリプラズム免疫原性タンパク質Ｂｐ２６、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１２ ＲｐｓＬ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧａｐ、２５ｋＤａ外膜免疫原性タンパク質前駆体Ｏｍｐ２５、侵入タンパク質Ｂ ｌａｌＢ、トリガー因子Ｔｉｇ、分子シャペロンＤｎａＫ、推定上のペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＳｕｒＡ、リポタンパク質Ｏｍｐ１９、外膜タンパク質ＭｏｔＹ Ｏｍｐ１６、保存された外膜タンパク質Ｄ１５、リンゴ酸デヒドロゲナーゼＭｄｈ、ＩＶ型分泌系成分（Ｔ４ＳＳ）ＶｉｒＪ、機能未知のリポタンパク質ＢＡＢ１＿０１８７（Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、ブルセラ症）；ＡＢＣ輸送体ファミリーのメンバー（ＬｏｌＣ、ＯｐｐＡ、及びＰｏｔＦ）、推定上のリポタンパク質放出系膜貫通タンパク質ＬｏｌＣ／Ｅ、フラジェリンＦｌｉＣ、バークホルデリア細胞内運動因子Ａ ＢｉｍＡ、細菌伸長因子Ｔｕ ＥＦ－Ｔｕ、１７ｋＤａ ＯｍｐＡ様タンパク質、ｂｏａＡコードタンパク質、ｂｏａＢコードタンパク質（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ及び他のバークホルデリア種、バークホルデリア感染症）；ミコリルトランスフェラーゼＡｇ８５Ａ、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６５、タンパク質ＴＢ１０．４、１９ｋＤａ抗原、タンパク質ＰｓｔＳ３、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ７０（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、ブルーリ潰瘍）；ノロウイルス主要及び非主要ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２、ゲノムポリタンパク質、サポウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、タンパク質Ｖｐ３、ゲノムポリタンパク質（カリシウイルス科、カリシウイルス感染症（ノロウイルス及びサポウイルス））；主要外膜タンパク質ＰｏｒＡ、フラジェリンＦｌａＡ、表面抗原ＣｊａＡ、フィブロネクチン結合タンパク質ＣａｄＦ、アスパラギン酸／グルタミン酸結合ＡＢＣ輸送体タンパク質Ｐｅｂ１Ａ、タンパク質ＦｓｐＡ１、タンパク質ＦｓｐＡ２（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、カンピロバクター症）；糖分解酵素エノラーゼ、分泌型アスパルチルプロテイナーゼＳＡＰ１－１０、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞壁タンパク質、タンパク質Ｈｙｒ１、補体受容体３関連タンパク質ＣＲ３－ＲＰ、アドヘシンＡｌｓ３ｐ、熱ショックタンパク質９０ｋＤａ ｈｓｐ９０、細胞表面疎水性タンパク質ＣＳＨ（通常はＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及び他のカンジダ種、カンジダ症）；１７－ｋＤａ抗原、タンパク質Ｐ２６、三量体オートトランスポーターアドヘシンＴＡＡ、ＢａｒｔｏｎｅｌｌａアドヘシンＡ ＢａｄＡ、可変発現外膜タンパク質Ｖｏｍｐｓ、タンパク質Ｐａｐ３、タンパク質ＨｂｐＡ、エンベロープ関連プロテアーゼＨｔｒＡ、タンパク質ＯＭＰ８９、タンパク質ＧｒｏＥＬ、タンパク質ＬａｌＢ、タンパク質ＯＭＰ４３、ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼＳｕｃＢ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、ネコひっかき病）；無鞭毛型表面タンパク質２、無鞭毛型特異的表面タンパク質ＳＳＰ４、クルジパイン、トランスシアリダーゼＴＳ、錐鞭毛型表面糖タンパク質ＴＳＡ－１、補体制御タンパク質ＣＲＰ－１０、タンパク質Ｇ４、タンパク質Ｇ２、副鞭毛棹タンパク質ＰＡＲ２、副鞭毛桿成分Ｐａｒ１、ムチン関連表面タンパク質ＭＰＳＰ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症））；エンベロープ糖タンパク質（ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ）（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘）；主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ、推定される外膜タンパク質ＰＭＰＣ、外膜複合タンパク質Ｂ ＯｍｃＢ、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６０ ＨＳＰ１０、タンパク質ＩｎｃＡ、ＩＩＩ型分泌系のタンパク質、リボヌクレオチドレダクターゼ小鎖タンパク質ＮｒｄＢ、プラスミドタンパク質Ｐｇｐ３、クラミジア外側タンパク質Ｎ ＣｏｐＮ、抗原ＣＴ５２１、抗原ＣＴ４２５、抗原ＣＴ０４３、抗原ＴＣ００５２、抗原ＴＣ０１８９、抗原ＴＣ０５８２、抗原ＴＣ０６６０、抗原ＴＣ０７２６、抗原ＴＣ０８１６、抗原ＴＣ０８２８（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、クラミジア）；低カルシウム応答タンパク質Ｅ ＬＣｒＥ、クラミジア外側タンパク質Ｎ ＣｏｐＮ、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰｋｎＤ、アシル担体タンパク質Ｓ－マロニルトランスフェラーゼＦａｂＤ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｂ、主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ、外膜タンパク質２ Ｏｍｐ２、多型膜タンパク質ファミリー（Ｐｍｐ１、Ｐｍｐ２、Ｐｍｐ３、Ｐｍｐ４、Ｐｍｐ５、Ｐｍｐ６、Ｐｍｐ７、Ｐｍｐ８、Ｐｍｐ９、Ｐｍｐ１０、Ｐｍｐ１１、Ｐｍｐ１２、Ｐｍｐ１３、Ｐｍｐ１４、Ｐｍｐ１５、Ｐｍｐ１６、Ｐｍｐ１７、Ｐｍｐ１８、Ｐｍｐ１９、Ｐｍｐ２０、Ｐｍｐ２１）（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症）；コレラ毒素Ｂ ＣＴＢ、毒素同時制御ピリンＡ ＴｃｐＡ、毒素同時制御ピリンＴｃｐＦ、毒素同時制御線毛生合成タンパク質Ｆ ＴｃｐＦ、コレラエンテロトキシンサブユニットＡ、コレラエンテロトキシンサブユニットＢ、熱安定性エンテロトキシンＳＴ、マンノース感受性ヘマグルチニンＭＳＨＡ、外膜タンパク質ＵポリンｏｍｐＵ、ポリン（Ｐｏｒｉｎｇ）Ｂタンパク質、多型膜タンパク質Ｄ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、コレラ）；プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼＰＣＣ、１４－３－３タンパク質、プロヒビチン、システインプロテアーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、ゲルソリン、カテプシンＬプロテイナーゼＣａｔＬ、テグメントタンパク質２０．８ｋＤａ ＴＰ２０．８、テグメントタンパク質３１．８ｋＤａ ＴＰ３１．８、リゾホスファチジン酸ホスファターゼＬＰＡＰ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、肝吸虫症）；表面層タンパク質ＳＬＰ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ抗原ＧＤＨ、毒素Ａ、毒素Ｂ、システインプロテアーゼＣｗｐ８４、システインプロテアーゼＣｗｐ１３、システインプロテアーゼＣｗｐ１９、細胞壁タンパク質ＣｗｐＶ、鞭毛タンパク質ＦｌｉＣ、鞭毛タンパク質ＦＩｉＤ、Ｚｍｐ－１、ＣｄｅＭ、ＣｄｅＣ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症）；ライノウイルス：カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４；コロナウイルス：スパイクタンパク質Ｓ、エンベロープタンパク質Ｅ、膜タンパク質Ｍ、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（通常はライノウイルス及びコロナウイルス、普通感冒（急性ウイルス性鼻咽喉炎；急性コリーザ））；プリオンタンパク質Ｐｒｐ（ＣＪＤプリオン、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ））；エンベロープタンパク質Ｇｃ、エンベロープタンパク質Ｇｎ、ヌクレオカプシドタンパク質（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ））；ビルレンス関連ＤＥＡＤ－ボックスＲＮＡヘリカーゼＶ
ＡＤ１、ガラクトキシロマンナン－タンパク質ＧａｌＸＭ、グルクロノキシロマンナンＧＸＭ、マンノプロテインＭＰ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、クリプトコッカス症）；酸性リボソームタンパク質Ｐ２ ＣｐＰ２、ムチン抗原Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３ Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ６、Ｍｕｃ７、表面接着タンパク質ＣＰ２０、表面接着タンパク質ＣＰ２３、表面タンパク質ＣＰ１２、表面タンパク質ＣＰ２１、表面タンパク質ＣＰ４０、表面タンパク質ＣＰ６０、表面タンパク質ＣＰ１５、表面関連グリコペプチドｇｐ４０、表面関連グリコペプチドｇｐ１５、オーシスト壁タンパク質ＡＢ、プロフィリンＰＲＦ、アピラーゼ（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、クリプトスポリジウム症）；脂肪酸及びレチノール結合タンパク質１ ＦＡＲ－１、組織メタロプロテイナーゼ阻害因子ＴＩＭＰ（ＴＭＰ）、システインプロテイナーゼＡＣＥＹ－１、システインプロテイナーゼＡＣＣＰ－１、表面抗原Ａｃ－１６、分泌型タンパク質２ ＡＳＰ－２、メタロプロテアーゼ１ ＭＴＰ－１、アスパルチルプロテアーゼ阻害因子ＡＰＩ－１、表面関連抗原ＳＡＡ－１、成体特異的分泌型第Ｘａ因子セリンプロテアーゼ阻害因子抗凝固剤ＡＰ、カテプシンＤ様アスパラギン酸プロテアーゼＡＲＲ－１（通常はＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ；複数の他の寄生生物、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ））；カテプシンＬ様プロテアーゼ、５３／２５－ｋＤａ抗原、８ｋＤａファミリーメンバー、わずかなトリプシン様活性を有する嚢虫タンパク質ＴｓＡｇ５、六鉤幼虫タンパク質ＴＳＯＬ１８、六鉤幼虫タンパク質ＴＳＯＬ４５－１Ａ、乳酸デヒドロゲナーゼＡ ＬＤＨＡ、乳酸デヒドロゲナーゼＢ ＬＤＨＢ（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ、嚢虫症）；ｐｐ６５抗原、膜タンパク質ｐｐ１５、カプシド近位テグメントタンパク質ｐｐ１５０、タンパク質Ｍ４５、ＤＮＡポリメラーゼＵＬ５４、ヘリカーゼＵＬ１０５、糖タンパク質ｇＭ、糖タンパク質ｇＮ、糖タンパク質Ｈ、糖タンパク質Ｂ ｇＢ、タンパク質ＵＬ８３、タンパク質ＵＬ９４、タンパク質ＵＬ９９（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サイトメガロウイルス感染症）；カプシドタンパク質Ｃ、プレメンブレンタンパク質ｐｒＭ、膜タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ（ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩ）、タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＳ２Ａ、タンパク質ＮＳ２Ｂ、タンパク質ＮＳ３、タンパク質ＮＳ４Ａ、タンパク質２Ｋ、タンパク質ＮＳ４Ｂ、タンパク質ＮＳ５（デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３及びＤＥＮ－４）－フラビウイルス、デング熱）；３９ｋＤａタンパク質（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ、二核アメーバ症）；ジフテリア毒素前駆体Ｔｏｘ、ジフテリア毒素ＤＴ、ピリン特異的ソルターゼＳｒｔＡ、シャフトピリンタンパク質ＳｐａＡ、チップピリンタンパク質ＳｐａＣ、非主要ピリンタンパク質ＳｐａＢ、表面関連タンパク質ＤＩＰ１２８１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ジフテリア）；糖タンパク質ＧＰ、ヌクレオタンパク質ＮＰ、非主要基質タンパク質ＶＰ２４、主要基質タンパク質ＶＰ４０、転写活性化因子ＶＰ３０、ポリメラーゼ補助因子ＶＰ３５、ＲＮＡポリメラーゼＬ（エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エボラ出血熱）；プリオンタンパク質（ｖＣＯＤプリオン、異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＯＤ、ｎｖＣＯＤ））；ＵｖｒＡＢＣ系タンパク質Ｂ、タンパク質Ｆｌｐ１、タンパク質Ｆｌｐ２、タンパク質Ｆｌｐ３、タンパク質ＴａｄＡ、ヘモグロビン受容体ＨｇｂＡ、外膜タンパク質ＴｄｈＡ、タンパク質ＣｐｓＲＡ、制御因子ＣｐｘＲ、タンパク質ＳａｐＡ、１８ｋＤａ抗原、外膜タンパク質ＮｃａＡ、タンパク質ＬｓｐＡ、タンパク質ＬｓｐＡ１、タンパク質ＬｓｐＡ２、タンパク質ＬｓｐＢ、外膜成分ＤｓｒＡ、レクチンＤｌｔＡ、リポタンパク質Ｈｉｐ、主要外膜タンパク質ＯＭＰ、外膜タンパク質ＯｍｐＡ２（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、軟性下疳）；アスパルチルプロテアーゼ１ Ｐｅｐ１、ホスホリパーゼＢ ＰＬＢ、アルファ－マンノシダーゼ１ ＡＭＮ１、グルカノシルトランスフェラーゼＧＥＬ１、ウレアーゼＵＲＥ、ペルオキシソーム基質タンパク質Ｐｍｐ１、プロリンリッチ抗原Ｐｒａ、ヒトＴ細胞反応性タンパク質ＴｃｒＰ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ及びＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ、コクシジオイデス症）；アレルゲンＴｒｉ ｒ ２、熱ショックタンパク質６０ Ｈｓｐ６０、真菌アクチンＡｃｔ、抗原Ｔｒｉ ｒ２、抗原Ｔｒｉ ｒ４、抗原Ｔｒｉ ｔ１、タンパク質ＩＶ、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧｐｄ１、浸透圧センサーＨｗＳｈｏ１Ａ、浸透圧センサーＨｗＳｈｏ１Ｂ、ヒスチジンキナーゼＨｗＨｈｋ７Ｂ、アレルゲンＭａｌａ ｓ １、アレルゲンＭａｌａ ｓ １１、チオレドキシンＴｒｘ Ｍａｌａ ｓ １３、アレルゲンＭａｌａ ｆ、アレルゲンＭａｌａ ｓ（通常はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属種、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属種、Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、皮膚糸状菌症）；タンパク質ＥＧ９５、タンパク質ＥＧ１０、タンパク質ＥＧ１８、タンパク質ＥｇＡ３１、タンパク質ＥＭ１８、抗原ＥＰＣ１、抗原Ｂ、抗原５、タンパク質Ｐ２９、タンパク質１４－３－３、８－ｋＤａタンパク質、ミオフィリン、熱ショックタンパク質２０ ＨＳＰ２０、糖タンパク質ＧＰ－８９、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＰＢ（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、エキノコックス症）；主要表面タンパク質２ ＭＳＰ２、主要表面タンパク質４ ＭＳＰ４、ＭＳＰバリアントＳＧＶ１、ＭＳＰバリアントＳＧＶ２、外膜タンパク質ＯＭＰ、外膜タンパク質１９ ＯＭＰ－１９、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－２、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１Ｂ、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－３、Ｅｒｕｍ２５１０コードタンパク質、タンパク質ＧｒｏＥＬ、タンパク質ＧｒｏＥＳ、３０－ｋＤＡ主要外膜タンパク質、ＧＥ １００－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １３０－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １６０－ｋＤａタンパク質（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属、エーリキア症）；分泌型抗原ＳａｇＡ、ｓａｇＡ様タンパク質ＳａｌＡ及びＳａｌＢ、コラーゲンアドヘシンＳｃｍ、表面タンパク質Ｆｍｓ１（ＥｂｐＡ（ｆｍ）、Ｆｍｓ５（ＥｂｐＢ（ｆｍ）、Ｆｍｓ９（ＥｐｂＣ（ｆｍ）及びＦｍｓ１０、タンパク質ＥｂｐＣ（ｆｍ）、９６ｋＤａ免疫防御糖タンパク質Ｇ１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、エンテロコッカス感染症）；ゲノムポリタンパク質、ポリメラーゼ３Ｄ、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ３、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ４、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼ３Ｃ（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ属、エンテロウイルス感染症）；外膜タンパク質ＯＭ、６０ｋＤａ外膜タンパク質、細胞表面抗原ＯｍｐＡ、細胞表面抗原ＯｍｐＢ（ｓｃａ５）、１３４ｋＤａ外膜タンパク質、３１ｋＤａ外膜タンパク質、２９．５ｋＤａ外膜タンパク質、細胞表面タンパク質ＳＣＡ４、細胞表面タンパク質Ａｄｒ１（ＲＰ８２７）、細胞表面タンパク質Ａｄｒ２（ＲＰ８２８）、細胞表面タンパク質ＳＣＡ１、侵入タンパク質ｉｎｖＡ、細胞分裂タンパク質ｆｔｓ、分泌タンパク質ｓｅｃ ０ファミリー、ビルレンスタンパク質ｖｉｒＢ、ｔｌｙＡ、ｔｌｙＣ、パルブリン様タンパク質Ｐｉｐ、前タンパク質トランスロカーゼＳｅｃＡ、１２０－ｋＤａ表面タンパク質抗原ＳＰＡ、１３８ｋＤ複合抗原、主要１００－ｋＤタンパク質（タンパク質Ｉ）、細胞質内タンパク質Ｄ、防御表面タンパク質抗原ＳＰＡ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、流行性チフス）；エプスタイン・バー核抗原（ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－リーダータンパク質（ＥＢＮＡ－ＬＰ））、潜在型膜タンパク質（ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２Ａ、ＬＭＰ－２Ｂ）、早期抗原ＥＢＶ－ＥＡ、膜抗原ＥＢＶ－ＭＡ、ウイルスカプシド抗原ＥＢＶ－ＶＣＡ、アルカリ性ヌクレアーゼＥＢＶ－ＡＮ、糖タンパク質Ｈ、糖タンパク質ｇｐ３５０、糖タンパク質ｇｐ１１０、糖タンパク質ｇｐ４２、糖タンパク質ｇＨｇＬ、糖タンパク質ｇＢ（エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス感染性単核球症）；カプシドタンパク質ＶＰ２、カプシドタンパク質ＶＰ１、主要タンパク質ＮＳ１（パルボウイルスＢ１９、伝染性紅斑（第五病））；ｐｐ６５抗原、糖タンパク質１０５、主要カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｈ、タンパク質Ｕ５１（ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、突発性発疹）；チオレドキシン－グルタチオンレダクターゼＴＧＲ、カテプシンＬ１及びＬ２、Ｋｕｎｉｔｚ型タンパク質ＫＴＭ、ロイシンアミノペプチダーゼＬＡＰ、システインプロテイナーゼＦａｓ２、サポシン様タンパク質２ ＳＡＰ－２、チオレドキシンペルオキシダーゼＴＰｘ、Ｐｒｘ－１、Ｐｒｘ－２、カテプシンＩシステインプロテイナーゼＣＬ３、プロテアーゼカテプシンＬ ＣＬ１、ホスホグリセリン酸キナーゼＰＧＫ、２７－ｋＤａ分泌性タンパク質、６０ｋＤａタンパク質ＨＳＰ３５アルファ、グルタチオントランスフェラーゼＧＳＴ、２８．５ｋＤａテグメント抗原２８．５ｋＤａ ＴＡ、カテプシンＢ３プロテアーゼＣａｔＢ３、Ｉ型シスタチンステフィン－１、カテプシンＬ５、カテプシンＬｌｇ及びカテプシンＢ、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ、ロイシンアミノペプチダーゼＬＡＰ（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ及びＦａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ、肝蛭症）；プリオンタンパク質（ＦＦＩプリオン、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ））；毒液アレルゲンホモログ様タンパク質ＶＡＬ－１、大量幼虫転写物（ａｂｕｎｄａｎｔ ｌａｒｖａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）ＡＬＴ－１、大量幼虫転写物ＡＬＴ－２、チオレドキシンペルオキシダーゼＴＰＸ、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、チオレドキシンペルオキシダーゼ２ ＴＰＸ－２、抗原タンパク質ＳＸＰ（ペプチドＮ、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３）、活性化関連タンパク質１ ＡＳＰ－１、チオレドキシンＴＲＸ、トランスグルタミナーゼＢｍＴＧＡ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＧＳＴ、ミオシン、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、１７５ｋＤａコラゲナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ、クチクラコラーゲンＣｏｌ－４、分泌型幼虫酸性タンパク質ＳＬＡＰ、キチナーゼＣＨＩ－１、マルトース結合タンパク質ＭＢＰ、糖分解酵素フルクトース－１，６－二リン酸アルドラーゼＦｂａ、トロポミオシンＴＭＹ－１、線虫特異的遺伝子産物ＯｖＢ２０、オンコシスタチンＣＰＩ－２、Ｃｏｘ－２（フィラリア上科、フィラリア症）；ホスホリパーゼＣ ＰＬＣ、熱不安定性エンテロトキシンＢ、イオタ毒素成分Ｉｂ、タンパク質ＣＰＥ１２８１、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、伸長因子Ｇ ＥＦ－Ｇ、パーフリンゴリジンＯ Ｐｆｏ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧａｐＣ、フルクトース－二リン酸アルドラーゼＡｌｆ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシンＣＰＥ、アルファ毒素ＡＴ、アルファトキソイドＡＴｄ、イプシロン－トキソイドＥＴｄ、タンパク質ＨＰ、大型細胞毒ＴｐｅＬ、エンド－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＮａｇｌｕ、ホスホグリセロムターゼＰｇｍ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる食中毒）；ロイコトキシンＩｋｔＡ、接着ＦａｄＡ、外膜タンパク質ＲａｄＤ、高分子量アルギニン結合タンパク質（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、フソバクテリウム感染症）；ホスホリパーゼＣ ＰＬＣ、熱不安定性エンテロトキシンＢ、イオタ毒素成分Ｉｂ、タンパク質ＣＰＥ１２８１、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、伸
長因子Ｇ ＥＦ－Ｇ、パーフリンゴリジンＯ Ｐｆｏ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧａｐＣ、フルクトース－二リン酸アルドラーゼＡｌｆ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシンＣＰＥ、アルファ毒素ＡＴ、アルファトキソイドＡＴｄ、イプシロン－トキソイドＥＴｄ、タンパク質ＨＰ、大型細胞毒ＴｐｅＬ、エンド－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＮａｇｌｕ、ホスホグリセロムターゼＰｇｍ（通常はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；他のクロストリジウム種、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死））；リパーゼＡ、リパーゼＢ、ペルオキシダーゼＤｅｃ１（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、ゲオトリクム症）；プリオンタンパク質（ＧＳＳプリオン、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ））；嚢胞壁タンパク質ＣＷＰ１、ＣＷＰ２、ＣＷＰ３、変異表面タンパク質ＶＳＰ、ＶＳＰ１、ＶＳＰ２、ＶＳＰ３、ＶＳＰ４、ＶＳＰ５、ＶＳＰ６、５６ｋＤａ抗原、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼＰＦＯＲ、アルコールデヒドロゲナーゼＥ ＡＤＨＥ、アルファ－ジアルジン、アルファ８－ジアルジン、アルファ１－ギアルジン（ｇｕｉａｒｄｉｎ）、ベータ－ジアルジン、システインプロテアーゼ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＧＳＴ、アルギニンデイミナーゼＡＤＩ、フルクトース－１，６－二リン酸アルドラーゼＦＢＡ、Ｇｉａｒｄｉａ ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ抗原ＧＴＡ（ＧＴＡ１、ＧＴＡ２）、オルニチンカルボキシルトランスフェラーゼＯＣＴ、横紋線維アセブリン様タンパク質ＳＡＬＰ、ウリジンホスホリル様タンパク質ＵＰＬ、アルファ－チューブリン、ベータ－チューブリン（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、ジアルジア症）；ＡＢＣ輸送体ファミリーのメンバー（ＬｏｌＣ、ＯｐｐＡ、及びＰｏｔＦ）、推定上のリポタンパク質放出系膜貫通タンパク質ＬｏｌＣ／Ｅ、フラジェリンＦｌｉＣ、バークホルデリア細胞内運動因子Ａ ＢｉｍＡ、細菌伸長因子－Ｔｕ ＥＦ－Ｔｕ、１７ｋＤａ ＯｍｐＡ様タンパク質、ｂｏａＡコードタンパク質（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、鼻疽）；シクロフィリンＣｙＰ、２４ｋＤａ第３期幼虫タンパク質ＧＳ２４、排泄分泌産物ＥＳＰ（４０、８０、１２０及び２０８ｋＤａ）（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ及びＧｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｈｉｓｐｉｄｕｍ、顎口虫症）；ピリンタンパク質、非主要ピリン関連サブユニットｐｉｌＣ、主要ピリンサブユニット及びバリアントｐｉｌＥ、ｐｉｌＳ、相変異タンパク質ｐｏｒＡ、ポリンＢ ＰｏｒＢ、タンパク質ＴｒａＤ、ナイセリア外膜抗原Ｈ．８、７０ｋＤａ抗原、主要外膜タンパク質ＰＩ、外膜タンパク質ＰＩＡ及びＰＩＢ、Ｗ抗原、表面タンパク質Ａ ＮｓｐＡ、トランスフェリン結合タンパク質ＴｂｐＡ、トランスフェリン結合タンパク質ＴｂｐＢ、ＰＢＰ２、ｍｔｒＲコードタンパク質、ｐｏｎＡコードタンパク質、膜パーミアーゼＦｂｐＢＣ、ＦｂｐＡＢＣタンパク質系、ＬｂｐＡＢタンパク質、外膜タンパク質Ｏｐａ、外膜輸送体ＦｅｔＡ、鉄抑制制御因子ＭｐｅＲ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、淋病）；外膜タンパク質Ａ ＯｍｐＡ、外膜タンパク質Ｃ ＯｍｐＣ、外膜タンパク質Ｋ１７ ＯｍｐＫ１７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、鼠径部肉芽腫（ドノバン症））；フィブロネクチン結合タンパク質Ｓｆｂ、フィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質ＦＢＰ５４、フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＡ、Ｍタンパク質１型Ｅｍｍ１、Ｍタンパク質６型Ｅｍｍ６、免疫グロブリン結合タンパク質３５ Ｓｉｂ３５、表面タンパク質Ｒ２８ Ｓｐｒ２８、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ、Ｃ５ａペプチダーゼＳｃｐＡ、抗原Ｉ／ＩＩ ＡｇＩ／ＩＩ、アドヘシンＡｓｐＡ、Ｇ関連アルファ２－マクログロブリン結合タンパク質ＧＲＡＢ、表面線維性タンパク質Ｍ５（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群連鎖球菌感染症）；Ｃタンパク質Ｐ３抗原、アルギニンデイミナーゼタンパク質、アドヘシンＢｉｂＡ、１０５ｋＤＡタンパク質ＢＰＳ、表面抗原ｃ、表面抗原Ｒ、表面抗原Ｘ、トリプシン抵抗性タンパク質Ｒ１、トリプシン抵抗性タンパク質Ｒ３、トリプシン抵抗性タンパク質Ｒ４、表面免疫原性タンパク質Ｓｉｐ、表面タンパク質Ｒｉｂ、ロイシンリッチリピートタンパク質ＬｒｒＧ、セリンリッチリピートタンパク質Ｓｒｒ－２、Ｃタンパク質アルファ抗原Ｂｃａ、ベータ抗原Ｂａｇ、表面抗原イプシロン、アルファ様タンパク質ＡＬＰ１、アルファ様タンパク質ＡＬＰ５表面抗原デルタ、アルファ様タンパク質ＡＬＰ２、アルファ様タンパク質ＡＬＰ３、アルファ様タンパク質ＡＬＰ４、Ｃベータタンパク質Ｂａｃ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｂ群連鎖球菌感染症）；トランスフェリン結合タンパク質２ Ｔｂｐ２、ホスファターゼＰ４、外膜タンパク質Ｐ６、ペプチドグリカン関連リポタンパク質Ｐａｌ、タンパク質Ｄ、タンパク質Ｅ、接着及び透過タンパク質Ｈａｐ、外膜タンパク質２６ Ｏｍｐ２６、外膜タンパク質Ｐ５（フィンブリン）、外膜タンパク質Ｄ１５、外膜タンパク質ＯｍｐＰ２、５’－ヌクレオチダーゼＮｕｃＡ、外膜タンパク質Ｐ１、外膜タンパク質Ｐ２、外膜リポタンパク質Ｐｃｐ、リポタンパク質Ｅ、外膜タンパク質Ｐ４、フクロキナーゼＦｕｃＫ、［Ｃｕ，Ｚｎ］－スーパーオキシドジスムターゼＳｏｄＣ、プロテアーゼＨｔｒＡ、タンパク質０１４５、アルファ－ガラクトシルセラミド（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染症）；ポリメラーゼ３Ｄ、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ３、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ４、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼ３Ｃ（エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、手足口病（ＨＦＭＤ））；ＲＮＡポリメラーゼＬ、タンパク質Ｌ、糖タンパク質Ｇｎ、糖タンパク質Ｇｃ、ヌクレオカプシドタンパク質Ｓ、エンベロープ糖タンパク質Ｇ１、ヌクレオタンパク質ＮＰ、タンパク質Ｎ、ポリタンパク質Ｍ（シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ））；熱ショックタンパク質ＨｓｐＡ、熱ショックタンパク質ＨｓｐＢ、クエン酸シンターゼＧｌｔＡ、タンパク質ＵｒｅＢ、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６０、好中球活性化タンパク質ＮＡＰ、カタラーゼＫａｔＡ、空胞化細胞毒ＶａｃＡ、ウレアーゼアルファＵｒｅＡ、ウレアーゼベータＵｒｅｂ、タンパク質Ｃｐｎ１０、タンパク質ｇｒｏＥＳ、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ１０、タンパク質ＭｏｐＢ、細胞毒性関連１０ｋＤａタンパク質ＣＡＧ、３６ｋＤａ抗原、ベータ－ラクタマーゼＨｃｐＡ、ベータ－ラクタマーゼＨｃｐＢ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染症）；膜内在性タンパク質、易凝集性タンパク質、Ｏ－抗原、毒素抗原Ｓｔｘ２Ｂ、毒素抗原Ｓｔｘ１Ｂ、接着抗原フラグメントＩｎｔ２８、タンパク質ＥｓｐＡ、タンパク質ＥｓｐＢ、インチミン、タンパク質Ｔｉｒ、タンパク質ＩｎｔＣ３００、タンパク質Ｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１及びＯ１０４：Ｈ４、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ））；ＲＮＡポリメラーゼＬ、タンパク質Ｌ、糖タンパク質Ｇｎ、糖タンパク質Ｇｃ、ヌクレオカプシドタンパク質Ｓ、エンベロープ糖タンパク質Ｇ１、ヌクレオタンパク質ＮＰ、タンパク質Ｎ、ポリタンパク質Ｍ（ブニヤウイルス科、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ））；糖タンパク質Ｇ、基質タンパク質Ｍ、ヌクレオタンパク質Ｎ、融合タンパク質Ｆ、ポリメラーゼＬ、タンパク質Ｗ、タンパク質Ｃ、リンタンパク質ｐ、非構造タンパク質Ｖ（ヘニパウイルス（ヘンドラウイルスニパウイルス）、ヘニパウイルス感染症）；ポリタンパク質、糖タンパク質Ｇｐ２、Ａ型肝炎表面抗原ＨＢＡｇ、タンパク質２Ａ、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４、タンパク質Ｐ１Ｂ、タンパク質Ｐ２Ａ、タンパク質Ｐ３ＡＢ、タンパク質Ｐ３Ｄ（Ａ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎）；Ｂ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎コア抗原ＨｂｃＡｇ、ポリメラーゼ、タンパク質Ｈｂｘ、ｐｒｅＳ２中央表面タンパク質、表面タンパク質Ｌ、大型Ｓタンパク質、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎）；エンベロープ糖タンパク質Ｅ１ ｇｐ３２ ｇｐ３５、エンベロープ糖タンパク質Ｅ２ ＮＳ１ ｇｐ６８ ｇｐ７０、カプシドタンパク質Ｃ、コアタンパク質Ｃｏｒｅ、ポリタンパク質、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４、抗原Ｇ、タンパク質ＮＳ３、タンパク質ＮＳ５Ａ（Ｃ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎）；ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４、大型肝炎デルタ抗原、小型肝炎デルタ抗原（Ｄ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎）；ウイルスタンパク質ＶＰ１、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ウイルスタンパク質ＶＰ３、ウイルスタンパク質ＶＰ４、カプシドタンパク質Ｅ２（Ｅ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎）；糖タンパク質Ｌ ＵＬ１、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼＵＬ２、タンパク質ＵＬ３、タンパク質ＵＬ４、ＤＮＡ複製タンパク質ＵＬ５、ポータルタンパク質ＵＬ６、ビリオン成熟タンパク質ＵＬ７、ＤＮＡヘリカーゼＵＬ８、複製起点結合タンパク質ＵＬ９、糖タンパク質Ｍ ＵＬ１０、タンパク質ＵＬ１１、アルカリ性エキソヌクレアーゼＵＬ１２、セリン－スレオニンタンパク質キナーゼＵＬ１３、テグメントタンパク質ＵＬ１４、ターミナーゼＵＬ１５、テグメントタンパク質ＵＬ１６、タンパク質ＵＬ１７、カプシドタンパク質ＶＰ２３ ＵＬ１８、主要カプシドタンパク質ＶＰ５ ＵＬ１９、膜タンパク質ＵＬ２０、テグメントタンパク質ＵＬ２１、糖タンパク質Ｈ（ＵＬ２２）、チミジンキナーゼＵＬ２３、タンパク質ＵＬ２４、タンパク質ＵＬ２５、カプシドタンパク質Ｐ４０（ＵＬ２６、ＶＰ２４、ＶＰ２２Ａ）、糖タンパク質Ｂ（ＵＬ２７）、ＩＣＰ１８．５タンパク質（ＵＬ２８）、主要ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８（ＵＬ２９）、ＤＮＡポリメラーゼＵＬ３０、核基質タンパク質ＵＬ３１、エンベロープ糖タンパク質ＵＬ３２、タンパク質ＵＬ３３、内核膜タンパク質ＵＬ３４、カプシドタンパク質ＶＰ２６（ＵＬ３５）、大型テグメントタンパク質ＵＬ３６、カプシドアセンブリタンパク質ＵＬ３７、ＶＰ１９Ｃタンパク質（ＵＬ３８）、リボヌクレオチドレダクターゼ（大サブユニット）ＵＬ３９、リボヌクレオチドレダクターゼ（小サブユニット）ＵＬ４０、テグメントタンパク質／ビリオン宿主遮断ＶＨＳタンパク質（ＵＬ４１）、ＤＮＡポリメラーゼ処理能力因子ＵＬ４２、膜タンパク質ＵＬ４３、糖タンパク質Ｃ（ＵＬ４４）、膜タンパク質ＵＬ４５、テグメントタンパク質ＶＰ１１／１２（ＵＬ４６）、テグメントタンパク質ＶＰ１３／１４（ＵＬ４７）、ビリオン成熟タンパク質ＶＰ１６（ＵＬ４８、アルファ－ＴＩＦ）、エンベロープタンパク質ＵＬ４９、ｄＵＴＰジホスファターゼＵＬ５０、テグメントタンパク質ＵＬ５１、ＤＮＡヘリカーゼ／プライマーゼ複合タンパク質ＵＬ５２、糖タンパク質Ｋ（ＵＬ５３）、転写制御タンパク質ＩＥ６３（ＩＣＰ２７、ＵＬ５４）、タンパク質ＵＬ５５、タンパク質ＵＬ５６、ウイルス複製タンパク質ＩＣＰ２２（ＩＥ６８、ＵＳ１）、タンパク質ＵＳ２、セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼＵＳ３、糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）、糖タンパク質Ｊ（ＵＳ５）、糖タンパク質Ｄ（ＵＳ６）、糖タンパク質Ｉ（ＵＳ７）、糖タンパク質Ｅ（ＵＳ８）、テグメントタンパク質ＵＳ９、カプシド／テグメントタンパク質ＵＳ１０、Ｖｍｗ２１タンパク
質（ＵＳ１１）、ＩＣＰ４７タンパク質（ＩＥ１２、ＵＳ１２）、主要転写活性化因子ＩＣＰ４（ＩＥ１７５、ＲＳ１）、Ｅ３ユビキチンリガーゼＩＣＰＯ（ＩＥ１１０）、潜伏期関連タンパク質１ ＬＲＰ１、潜伏期関連タンパク質２ ＬＲＰ２、神経毒力因子ＲＬ１（ＩＣＰ３４．５）、潜伏期関連転写物ＬＡＴ（単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２）、単純ヘルペス）；熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６０、細胞表面タンパク質Ｈ１Ｃ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ型ＤｐｐＩＶ、Ｍ抗原、７０ｋＤａタンパク質、１７ｋＤａヒストン様タンパク質（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ヒストプラスマ症）；脂肪酸及びレチノール結合タンパク質１ ＦＡＲ－１、組織メタロプロテイナーゼ阻害因子ＴＩＭＰ（ＴＭＰ）、システインプロテイナーゼＡＣＥＹ－１、システインプロテイナーゼＡＣＣＰ－１、表面抗原Ａｃ－１６、分泌型タンパク質２ ＡＳＰ－２、メタロプロテアーゼ１ ＭＴＰ－１、アスパルチルプロテアーゼ阻害因子ＡＰＩ－１、表面関連抗原ＳＡＡ－１、表面関連抗原ＳＡＡ－２、成体特異的分泌型第Ｘａ因子、セリンプロテアーゼ阻害因子抗凝固剤ＡＰ、カテプシンＤ様アスパラギン酸プロテアーゼＡＲＲ－１、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＧＳＴ、アスパラギン酸プロテアーゼＡＰＲ－１、アセチルコリンエステラーゼＡＣｈＥ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ及びＮｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、鉤虫感染症）；タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＰ１、タンパク質ＶＰ１、タンパク質ＶＰ２、タンパク質ＶＰ３（ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトボカウイルス感染症）；主要表面タンパク質２ ＭＳＰ２、主要表面タンパク質４ ＭＳＰ４、ＭＳＰバリアントＳＧＶ１、ＭＳＰバリアントＳＧＶ２、外膜タンパク質ＯＭＰ、外膜タンパク質１９ ＯＭＰ－１９、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－２、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１Ｂ、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－３、Ｅｒｕｍ２５１０コードタンパク質、タンパク質ＧｒｏＥＬ、タンパク質ＧｒｏＥＳ、３０－ｋＤＡ主要外膜タンパク質、ＧＥ １００－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １３０－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １６０－ｋＤａタンパク質（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ、ヒトＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ症）；主要表面タンパク質１～５（ＭＳＰ１ａ、ＭＳＰ１ｂ、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５）、ＩＶ型分泌系タンパク質ＶｉｒＢ２、ＶｉｒＢ７、ＶｉｒＢ１１、ＶｉｒＤ４（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、ヒト顆粒球アナプラズマ症（ＨＧＡ））；タンパク質ＮＳ１、低分子疎水性タンパク質ＮＳ２、ＳＨタンパク質、融合タンパク質Ｆ、糖タンパク質Ｇ、基質タンパク質Ｍ、基質タンパク質Ｍ２－１、基質タンパク質Ｍ２－２、リンタンパク質Ｐ、ヌクレオタンパク質Ｎ、ポリメラーゼＬ（ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトメタニューモウイルス感染症）；主要表面タンパク質２ ＭＳＰ２、主要表面タンパク質４ ＭＳＰ４、ＭＳＰバリアントＳＧＶ１、ＭＳＰバリアントＳＧＶ２、外膜タンパク質ＯＭＰ、外膜タンパク質１９ ＯＭＰ－１９、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－２、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１Ｂ、主要抗原タンパク質ＭＡＰ１－３、Ｅｒｕｍ２５１０コードタンパク質、タンパク質ＧｒｏＥＬ、タンパク質ＧｒｏＥＳ、３０－ｋＤＡ主要外膜タンパク質、ＧＥ １００－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １３０－ｋＤａタンパク質、ＧＥ １６０－ｋＤａタンパク質（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、ヒト単球エーリキア症）；複製タンパク質Ｅ１、制御性タンパク質Ｅ２、タンパク質Ｅ３、タンパク質Ｅ４、タンパク質Ｅ５、タンパク質Ｅ６、タンパク質Ｅ７、タンパク質Ｅ８、主要カプシドタンパク質Ｌ１、非主要カプシドタンパク質Ｌ２（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症）；融合タンパク質Ｆ、ヘマグルチニン－ノイラミダーゼＨＮ、糖タンパク質Ｇ、基質タンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ、ヌクレオタンパク質Ｎ、ポリメラーゼＬ（ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス感染症）；ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質（ＮＥＰタンパク質：核外輸送タンパク質）、ＰＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質（ポリメラーゼ塩基性１タンパク質）、ＰＢ１－Ｆ２タンパク質及びＰＢ２タンパク質（オルトミクソウイルス科、インフルエンザウイルス（インフル））；ゲノムポリタンパク質、タンパク質Ｅ、タンパク質Ｍ、カプシドタンパク質Ｃ（日本脳炎ウイルス、日本脳炎）；ＲＴＸ毒素、ＩＶ型線毛、主要線毛サブユニットＰｉｌＡ、制御性転写因子ＰｉｌＳ及びＰｉｌＲ、タンパク質シグマ５４、外膜タンパク質（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ感染症）；プリオンタンパク質（クーループリオン、クールー）；ヌクレオタンパク質Ｎ、ポリメラーゼＬ、基質タンパク質Ｚ、糖タンパク質ＧＰ（ラッサウイルス、ラッサ熱）；ペプチドグリカン関連リポタンパク質ＰＡＬ、６０ｋＤａシャペロニンＣｐｎ６０（ｇｒｏＥＬ、ＨｓｐＢ）、ＩＶ型線毛ＰｉｌＥ、外膜タンパク質ＭＩＰ、主要外膜タンパク質ＭｏｍｐＳ、亜鉛メタロプロテイナーゼＭＳＰ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、レジオネラ症（レジオネラ病、ポンティアック熱））；Ｐ４ヌクレアーゼ、タンパク質ＷＤ、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２、表面膜糖タンパク質Ｐｇ４６、システインプロテイナーゼＣＰ、グルコース制御タンパク質７８ ＧＲＰ－７８、段階特異的Ｓ抗原様タンパク質Ａ２、ＡＴＰａｓｅ Ｆ１、ベータ－チューブリン、熱ショックタンパク質７０ Ｈｓｐ７０、ＫＭＰ－１１、糖タンパク質ＧＰ６３、タンパク質ＢＴ１、ヌクレオシドヒドロラーゼＮＨ、細胞表面タンパク質Ｂ１、リボソームタンパク質Ｐ１様タンパク質Ｐ１、ステロール２４－ｃ－メチルトランスフェラーゼＳＭＴ、ＬＡＣＫタンパク質、ヒストンＨ１、ＳＰＢ１タンパク質、チオール特異的抗酸化剤ＴＳＡ、タンパク質抗原ＳＴＩ１、シグナルペプチダーゼＳＰ、ヒストンＨ２Ｂ、表面抗原ＰＳＡ－２、システインプロテイナーゼｂ Ｃｐｂ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、リーシュマニア症）；主要膜タンパク質Ｉ、セリンリッチ抗原－４５ｋＤａ、１０ｋＤａカペロニンＧｒｏＥＳ、ＨＳＰ ｋＤａ抗原、アミノ－オキソノナノエートシンターゼＡＯＮＳ、タンパク質リコンビナーゼＡ ＲｅｃＡ、アセチル／プロピオニル補酵素Ａカルボキシラーゼアルファ、アラニンラセマーゼ、６０ｋＤａシャペロニン２、ＥＳＡＴ－６様タンパク質ＥｃｘＢ（Ｌ－ＥＳＡＴ－６）、タンパク質Ｌｓｒ２、タンパク質ＭＬ０２７６、ヘパリン結合ヘマグルチニンＨＢＨＡ、熱ショックタンパク質６５ Ｈｓｐ６５、ｍｙｃＰ１またはＭＬ００４１コードタンパク質、ｈｔｒＡ２またはＭＬ０１７６コードタンパク質、ｈｔｒＡ４またはＭＬ２６５９コードタンパク質、ｇｃｐまたはＭＬ０３７９コードタンパク質、ｃｌｐＣまたはＭＬ０２３５コードタンパク質（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ、らい病）；外膜タンパク質ＬｉｐＬ３２、膜タンパク質ＬＩＣ１０２５８、膜タンパク質ＬＰ３０、膜タンパク質ＬＩＣ１２２３８、Ｏｍｐａ様タンパク質Ｌｓａ６６、表面タンパク質ＬｉｇＡ、表面タンパク質ＬｉｇＢ、主要外膜タンパク質ＯｍｐＬ１、外膜タンパク質ＬｉｐＬ４１、タンパク質ＬｉｇＡｎｉ、表面タンパク質ＬｃｐＡ、接着タンパク質ＬｉｐＬ５３、外膜タンパク質ＵｐＬ３２、表面タンパク質Ｌｓａ６３、フラジェリンＦｌａＢ１、膜リポタンパク質ＬｉｐＬ２１、膜タンパク質ｐＬ４０、レプトスピラ表面アドヘシンＬｓａ２７、外膜タンパク質ＯｍｐＬ３６、外膜タンパク質ＯｍｐＬ３７、外膜タンパク質ＯｍｐＬ４７、外膜タンパク質ＯｍｐＬ５４、アシルトランスフェラーゼＬｐｘＡ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、レプトスピラ症）；リステリオリジンＯ前駆体Ｈｌｙ（ＬＬＯ）、侵入関連タンパク質Ｉａｐ（Ｐ６０）、リステリオリジン制御性タンパク質ＰｒｆＡ、亜鉛メタロプロテイナーゼＭｐｌ、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ ＰＬＣ（ＰｌｃＡ、ＰｌｃＢ）、Ｏ－アセチルトランスフェラーゼＯａｔ、ＡＢＣ輸送体パーミアーゼＩｍ．Ｇ＿１７７１、接着タンパク質ＬＡＰ、ＬＡＰ受容体Ｈｓｐ６０、アドヘシンＬａｐＢ、溶血素リステリオリジンＯ ＬＬＯ、タンパク質ＡｃｔＡ、インターナリンＡ ＩｎｌＡ、タンパク質ＩｎｌＢ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、リステリア症）；外表面タンパク質Ａ ＯｓｐＡ、外表面タンパク質ＯｓｐＢ、外表面タンパク質ＯｓｐＣ、デコリン結合タンパク質Ａ ＤｂｐＡ、デコリン結合タンパク質Ｂ ＤｂｐＢ、鞭毛フィラメント４１ｋＤａコアタンパク質Ｆｌａ、塩基性膜タンパク質Ａ ＢｍｐＡ（免疫優性抗原Ｐ３９）、外表面２２ｋＤａリポタンパク質前駆体（抗原ＩＰＬＡ７）、変異表面リポタンパク質ｖｌｓＥ（通常はＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ及び他のボレリア種、ライム病（ライムボレリア症））；毒液アレルゲンホモログ様タンパク質ＶＡＬ－１、大量幼虫転写物ＡＬＴ－１、大量幼虫転写物ＡＬＴ－２、チオレドキシンペルオキシダーゼＴＰＸ、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、チオレドキシンペルオキシダーゼ２ ＴＰＸ－２、抗原タンパク質ＳＸＰ（ペプチドＮ、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３）、活性化関連タンパク質１ ＡＳＰ－１、チオレドキシンＴＲＸ、トランスグルタミナーゼＢｍＴＧＡ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＧＳＴ、ミオシン、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、１７５ｋＤａコラゲナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ、クチクラコラーゲンＣｏｌ－４、分泌型幼虫酸性タンパク質ＳＬＡＰ、キチナーゼＣＨＩ－１、マルトース結合タンパク質ＭＢＰ、糖分解酵素フルクトース－１，６－二リン酸アルドラーゼＦｂａ、トロポミオシンＴＭＹ－１、線虫特異的遺伝子産物ＯｖＢ２０、オンコシスタチンＣＰＩ－２、タンパク質Ｃｏｘ－２（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ及びＢｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ、リンパ管フィラリア症（象皮症））；糖タンパク質ＧＰ、基質タンパク質Ｚ、ポリメラーゼＬ、ヌクレオタンパク質Ｎ（リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、リンパ性脈絡髄膜炎）；トロンボスポンジン関連無名タンパク質ＴＲＡＰ、ＳＳＰ２スポロゾイト表面タンパク質２、頂端膜抗原１ ＡＭＡ１、桿小体膜抗原ＲＭＡ１、酸性塩基性リピート抗原ＡＢＲＡ、細胞横断タンパク質ＰＦ、タンパク質Ｐｖｓ２５、メロゾイト表面タンパク質１ ＭＳＰ－１、メロゾイト表面タンパク質２ ＭＳＰ－２、リング感染赤血球表面抗原ＲＥＳＡ肝臓段階抗原３ ＬＳＡ－３、タンパク質Ｅｂａ－１７５、セリンリピート抗原５ ＳＥＲＡ－５、スポロゾイト周囲タンパク質ＣＳ、メロゾイト表面タンパク質３ ＭＳＰ３、メロゾイト表面タンパク質８ ＭＳＰ８、エノラーゼＰＦ１０、肝細胞赤血球タンパク質１７ｋＤａ ＨＥＰ１７、赤血球膜タンパク質１ ＥＭＰ１、タンパク質Ｋベータメロゾイト表面タンパク質４／５ ＭＳＰ ４／５、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０、グルタミン酸リッチタンパク質ＧＬＵＲＰ、メロゾイト表面タンパク質４ ＭＳＰ－４、タンパク質ＳＴＡＲＰ、スポロゾイト周囲タンパク質関連抗原前駆体ＣＲＡ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、マラリア）；ヌクレオタンパク質Ｎ、膜関連タンパク質ＶＰ２４、非主要ヌクレオタンパク質ＶＰ３０、ポリメラーゼ補助因子ＶＰ３５、ポリメラーゼＬ、基質タンパク質ＶＰ４０、エンベロープ糖タンパク質ＧＰ（マールブルグウイルス、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ））；タンパク質Ｃ、基質タンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ、非構造タンパク質Ｖ、ヘマグルチニン糖タンパク質Ｈ、ポリメラ
ーゼＬ、ヌクレオタンパク質Ｎ、融合タンパク質Ｆ（麻疹ウイルス、麻疹）；ＡＢＣ輸送体ファミリーのメンバー（ＬｏｌＣ、ＯｐｐＡ、及びＰｏｔＦ）、推定上のリポタンパク質放出系膜貫通タンパク質ＬｏｌＣ／Ｅ、フラジェリンＦｌｉＣ、バークホルデリア細胞内運動因子Ａ ＢｉｍＡ、細菌伸長因子－Ｔｕ ＥＦ－Ｔｕ、１７ｋＤａ ＯｍｐＡ様タンパク質、ｂｏａＡコードタンパク質、ｂｏａＢコードタンパク質（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、類鼻疽（ホイットモア病））；ピリンタンパク質、非主要ピリン関連サブユニットｐｉｌＣ、主要ピリンサブユニット及びバリアントｐｉｌＥ、ｐｉｌＳ、相変異タンパク質ｐｏｒＡ、ポリンＢ ＰｏｒＢ、タンパク質ＴｒａＤ、ナイセリア外膜抗原Ｈ．８、７０ｋＤａ抗原、主要外膜タンパク質ＰＩ、外膜タンパク質ＰＩＡ及びＰＩＢ、Ｗ抗原、表面タンパク質Ａ ＮｓｐＡ、トランスフェリン結合タンパク質ＴｂｐＡ、トランスフェリン結合タンパク質ＴｂｐＢ、ＰＢＰ２、ｍｔｒＲコードタンパク質、ｐｏｎＡコードタンパク質、膜パーミアーゼＦｂｐＢＣ、ＦｂｐＡＢＣタンパク質系、ＬｂｐＡＢタンパク質、外膜タンパク質Ｏｐａ、外膜輸送体ＦｅｔＡ、鉄抑制制御因子ＭｐｅＲ、Ｈ因子結合タンパク質ｆＨｂｐ、アドヘシンＮａｄＡ、タンパク質ＮｈｂＡ、リプレッサーＦａｒＲ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌性疾患）；６６ｋＤａタンパク質、２２ｋＤａタンパク質（通常はＭｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ、横川吸虫症）；極性管タンパク質（Ｇｌｕｇｅａ属では３４、７５、及び１７０ｋＤａ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ属では３５、５５及び１５０ｋＤａ）、キネシン関連タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ最大サブユニット、同様のｏｔ膜内在性タンパク質ＹＩＰＡ、抗サイレンシングタンパク質１、熱ショック転写因子ＨＳＦ、タンパク質キナーゼ、チミジンキナーゼ、ＮＯＰ－２様核小体タンパク質（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ、微胞子虫症）；ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス制御因子、グルタチオンペルオキシダーゼＧＰＸ１、ＲＮＡヘリカーゼＮＰＨ－ＩＩ ＮＰＨ２、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ触媒サブユニットＰＡＰＬ、主要エンベロープタンパク質Ｐ４３Ｋ、初期転写因子７０ｋＤａサブユニットＶＥＴＦＳ、初期転写因子８２ｋＤａサブユニットＶＥＴＦＬ、メタロエンドペプチダーゼＧ１型、ヌクレオシドトリホスファターゼＩ ＮＰＨ１、複製タンパク質Ａ２８様ＭＣ１３４Ｌ、ＲＮＡポリメラーゼ７ｋＤａサブユニットＲＰＯ７（伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、伝染性軟属腫（ＭＣ））；基質タンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ／Ｖ、低分子疎水性タンパク質ＳＨ、ヌクレオタンパク質Ｎ、タンパク質Ｖ、融合糖タンパク質Ｆ、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼＨＮ、ＲＮＡポリメラーゼＬ（ムンプスウイルス、ムンプス）；外膜タンパク質ＯＭ、細胞表面抗原ＯｍｐＡ、細胞表面抗原ＯｍｐＢ（ｓｃａ５）、細胞表面タンパク質ＳＣＡ４、細胞表面タンパク質ＳＣＡ１、細胞質内タンパク質Ｄ、結晶性表面層タンパク質ＳＬＰ、防御表面タンパク質抗原ＳＰＡ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、発疹熱（地方病性チフス））；アドヘシンＰ１、接着Ｐ３０、タンパク質ｐ１１６、タンパク質Ｐ４０、細胞骨格タンパク質ＨＭＷ１、細胞骨格タンパク質ＨＭＷ２、細胞骨格タンパク質ＨＭＷ３、ＭＰＮ１５２コードタンパク質、ＭＰＮ４２６コードタンパク質、ＭＰＮ４５６コードタンパク質、ＭＰＮ－５００コードタンパク質（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、マイコプラズマ肺炎）；ＮｏｃＡ、鉄依存性制御性タンパク質、ＶａｐＡ、ＶａｐＤ、ＶａｐＦ、ＶａｐＧ、カゼイン分解性プロテアーゼ、フィラメント先端関連４３－ｋＤａタンパク質、タンパク質Ｐ２４、タンパク質Ｐ６１、１５－ｋＤａタンパク質、５６－ｋＤａタンパク質（通常はＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ及び他のノカルジア種、ノカルジア症）；毒液アレルゲンホモログ様タンパク質ＶＡＬ－１、大量幼虫転写物ＡＬＴ－１、大量幼虫転写物ＡＬＴ－２、チオレドキシンペルオキシダーゼＴＰＸ、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、チオレドキシンペルオキシダーゼ２ ＴＰＸ－２、抗原タンパク質ＳＸＰ（ペプチドＮ、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３）、活性化関連タンパク質１ ＡＳＰ－１、チオレドキシンＴＲＸ、トランスグルタミナーゼＢｍＴＧＡ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＧＳＴ、ミオシン、スズメバチ科アレルゲンホモログＶＡＨ、１７５ｋＤａコラゲナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ、クチクラコラーゲンＣｏｌ－４、分泌型幼虫酸性タンパク質ＳＬＡＰ、キチナーゼＣＨＩ－１、マルトース結合タンパク質ＭＢＰ、糖分解酵素フルクトース－１，６－二リン酸アルドラーゼＦｂａ、トロポミオシンＴＭＹ－１、線虫特異的遺伝子産物ＯｖＢ２０、オンコシスタチンＣＰＩ－２、Ｃｏｘ－２（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ、オンコセルカ症（河川盲目症））；４３ｋＤａ分泌型糖タンパク質、糖タンパク質ｇｐ０、糖タンパク質ｇｐ７５、抗原Ｐｂ２７、抗原Ｐｂ４０、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ６５、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ７０、熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０、タンパク質Ｐ１０、トリオースリン酸イソメラーゼＴＰＩ、Ｎ－アセチル－グルコサミン結合レクチンパラコクシン（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｎ）、２８ｋＤａタンパク質Ｐｂ２８（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、パラコクシジオイデス症（南アメリカブラストミセス症））；２８－ｋＤａクルジパイン様システインプロテアーゼＰｗ２８ＣＣＰ（通常はＰａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ及び他のパラゴニムス種、肺吸虫症）；外膜タンパク質ＯｍｐＨ、外膜タンパク質Ｏｍｐ２８、タンパク質ＰＭ１５３９、タンパク質ＰＭ０３５５、タンパク質ＰＭ１４１７、修復タンパク質ＭｕｔＬ、タンパク質ＢｃｂＣ、タンパク質ＰＭ０３０５、ギ酸デヒドロゲナーゼ－Ｎ、タンパク質ＰＭ０６９８、タンパク質ＰＭ１４２２、ＤＮＡギラーゼ、リポタンパク質ＰｌｐＥ、接着性タンパク質Ｃｐ３９、ヘム獲得系受容体ＨａｓＲ、３９ｋＤａ莢膜タンパク質、鉄制御型ＯＭＰ ＩＲＯＭＰ、外膜タンパク質ＯｍｐＡ８７、線毛タンパク質Ｐｔｆ、線毛サブユニットタンパク質ＰｔｆＡ、トランスフェリン結合タンパク質Ｔｂｐｌ、エステラーゼ酵素ＭｅｓＡ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ毒素ＰＭＴ、接着性タンパク質Ｃｐ３９（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、パスツレラ症）；“フィラメント状ヘマグルチニンＦｈａＢ、アデニル酸シクラーゼＣｙａＡ、百日咳毒素サブユニット４前駆体ＰｔｘＤ、パータクチン前駆体Ｐｒｎ、毒素サブユニット１ ＰｔｘＡ、タンパク質Ｃｐｎ６０、タンパク質ｂｒｋＡ、百日咳毒素サブユニット２前駆体ＰｔｘＢ、百日咳毒素サブユニット３前駆体ＰｔｘＣ、百日咳毒素サブユニット５前駆体ＰｔｘＥ、パータクチンＰｒｎ、タンパク質Ｆｉｍ２、タンパク質Ｆｉｍ３；“（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ））；“Ｆ１莢膜抗原、ビルレンス関連Ｖ抗原、分泌型エフェクタータンパク質ＬｃｒＶ、Ｖ抗原、外膜プロテアーゼＰｌａ、分泌型エフェクタータンパク質ＹｏｐＤ、推定上の分泌型タンパク質チロシンホスファターゼＹｏｐＨ、ニードル複合体主要サブユニットＹｓｃＦ、タンパク質キナーゼＹｏｐＯ、推定上のオートトランスポータータンパク質ＹａｐＦ、内膜ＡＢＣ輸送体ＹｂｔＱ（Ｉｒｐ７）、推定上の糖結合タンパク質ＹＰ００６１２、熱ショックタンパク質９０ ＨｔｐＧ、推定上のスルファターゼタンパク質ＹｄｅＮ、外膜リポタンパク質担体タンパク質ＬｏｌＡ、分泌シャペロンＹｅｒＡ、推定上のリポタンパク質ＹＰ００４２０、溶血素活性化因子タンパク質ＨｐｍＢ、ペスチシン／エルシニアバクチン外膜受容体Ｐｓｎ、分泌型エフェクタータンパク質ＹｏｐＥ、分泌型エフェクタータンパク質ＹｏｐＦ、分泌型エフェクタータンパク質ＹｏｐＫ、外膜タンパク質ＹｏｐＮ、外膜タンパク質ＹｏｐＭ、コアグラーゼ／フィブリノリジン前駆体Ｐｌａ；“（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、ペスト）；タンパク質ＰｈｐＡ、表面アドヘシンＰｓａＡ、ニューモリシンＰｌｙ、ＡＴＰ依存性プロテアーゼＣｌｐ、リポエート－タンパク質リガーゼＬｐｌＡ、細胞壁表面固定タンパク質ｐｓｒＰ、ソルターゼＳｒｔＡ、グルタミル－ｔＲＮＡシンテターゼＧｌｔＸ、コリン結合タンパク質Ａ ＣｂｐＡ、肺炎球菌表面タンパク質Ａ ＰｓｐＡ、肺炎球菌表面タンパク質Ｃ ＰｓｐＣ、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼＧｎｄ、鉄結合タンパク質ＰｉａＡ、ムレインヒドロラーゼＬｙｔＢ、タンパク質ＬｙｔＣ、プロテアーゼＡ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、肺炎球菌感染症）；主要表面タンパク質Ｂ、ケキシン様プロテアーゼＫＥＸ１、タンパク質Ａ１２、５５ｋＤａ抗原Ｐ５５、主要表面糖タンパク質Ｍｓｇ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ））；ゲノムポリタンパク質、ポリメラーゼ３Ｄ、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ３、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ４、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼ３Ｃ（ポリオウイルス、急性灰白髄炎）；タンパク質Ｎｆａ１、エキセンディン－３、分泌性リパーゼ、カテプシンＢ様プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、カテプシン、ペルオキシレドキシン、タンパク質Ｃｒｙ１Ａｃ（通常はＮａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ））；アグノプロテイン、ラージＴ抗原、スモールＴ抗原、主要カプシドタンパク質ＶＰ１、非主要カプシドタンパク質Ｖｐ２（ＪＣウイルス、進行性多巣性白質脳症）；低カルシウム応答タンパク質Ｅ ＬＣｒＥ、クラミジア外側タンパク質Ｎ ＣｏｐＮ、セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼＰｋｎＤ、アシル担体タンパク質Ｓ－マロニルトランスフェラーゼＦａｂＤ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｂ、主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ、外膜タンパク質２ Ｏｍｐ２、多型膜タンパク質ファミリー（Ｐｍｐ１、Ｐｍｐ２、Ｐｍｐ３、Ｐｍｐ４、Ｐｍｐ５、Ｐｍｐ６、Ｐｍｐ７、Ｐｍｐ８、Ｐｍｐ９、Ｐｍｐ１０、Ｐｍｐ１１、Ｐｍｐ１２、Ｐｍｐ１３、Ｐｍｐ１４、Ｐｍｐ１５、Ｐｍｐ１６、Ｐｍｐ１７、Ｐｍｐ１８、Ｐｍｐ１９、Ｐｍｐ２０、Ｐｍｐ２１）（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、オウム病）；外膜タンパク質Ｐ１、熱ショックタンパク質Ｂ ＨｓｐＢ、ペプチドＡＢＣ輸送体、ＧＴＰ結合タンパク質、タンパク質ＩｃｍＢ、リボヌクレアーゼＲ、ホスファターゼＳｉｘＡ、タンパク質ＤｓｂＤ、外膜タンパク質ＴｏｌＣ、ＤＮＡ結合タンパク質ＰｈｏＢ、ＡＴＰａｓｅ ＤｏｔＢ、熱ショックタンパク質Ｂ ＨｓｐＢ、膜タンパク質Ｃｏｍ１、２８ｋＤａタンパク質、ＤＮＡ－３－メチルアデニングリコシダーゼＩ、外膜タンパク質ＯｍｐＨ、外膜タンパク質ＡｄａＡ、グリシン切断系Ｔ－タンパク質（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｑ熱）；ヌクレオタンパク質Ｎ、大型構造タンパク質Ｌ、リンタンパク質Ｐ、基質タンパク質Ｍ、糖タンパク質Ｇ（狂犬病ウイルス、狂犬病）；融合タンパク質Ｆ、ヌクレオタンパク質Ｎ、基質タンパク質Ｍ、基質タンパク質Ｍ２－１、基質タンパク質Ｍ２－２、リンタンパク質Ｐ、小型疎水性タンパク質ＳＨ、主要表面糖タンパク質Ｇ、ポリメラーゼＬ、非構造タンパク質１ ＮＳ１、非構造タンパク質２ ＮＳ２（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス感染症）；ゲノムポリタンパク質、ポリメラーゼ３Ｄ、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ３、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ４、プロテアーゼ２Ａ、プロテアーゼ３Ｃ（ライノウイルス、ライノウイルス感染症）；外膜タンパク質ＯＭ、細胞表面抗原ＯｍｐＡ、細胞表面抗原ＯｍｐＢ（ｓｃ
ａ５）、細胞表面タンパク質ＳＣＡ４、細胞表面タンパク質ＳＣＡ１、タンパク質ＰＳ１２０、細胞質内タンパク質Ｄ、防御表面タンパク質抗原ＳＰＡ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、リケッチア感染症）；外膜タンパク質ＯＭ、細胞表面抗原ＯｍｐＡ、細胞表面抗原ＯｍｐＢ（ｓｃａ５）、細胞表面タンパク質ＳＣＡ４、細胞表面タンパク質ＳＣＡ１、細胞質内タンパク質Ｄ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、リケッチア痘症）；エンベロープ糖タンパク質ＧＰ、ポリメラーゼＬ、ヌクレオタンパク質Ｎ、非構造タンパク質ＮＳＳ（リフトバレー熱ウイルス、リフトバレー熱（ＲＶＦ））；外膜タンパク質ＯＭ、細胞表面抗原ＯｍｐＡ、細胞表面抗原ＯｍｐＢ（ｓｃａ５）、細胞表面タンパク質ＳＣＡ４、細胞表面タンパク質ＳＣＡ１、細胞質内タンパク質Ｄ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ））；非構造タンパク質６ ＮＳ６、非構造タンパク質２ ＮＳ２、中間カプシドタンパク質ＶＰ６、内側カプシドタンパク質ＶＰ２、非構造タンパク質３ ＮＳ３、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬ、タンパク質ＶＰ３、非構造タンパク質１ ＮＳ１、非構造タンパク質５ ＮＳ５、外側カプシド糖タンパク質ＶＰ７、非構造糖タンパク質４ ＮＳ４、外側カプシドタンパク質ＶＰ４；（ロタウイルス、ロタウイルス感染症）；ポリタンパク質Ｐ２００、糖タンパク質Ｅ１、糖タンパク質Ｅ２、タンパク質ＮＳ２、カプシドタンパク質Ｃ（風疹ウイルス、風疹）；シャペロニンＧｒｏＥＬ（ＭｏｐＡ）、イノシトールリン酸ホスファターゼＳｏｐＢ、熱ショックタンパク質ＨｓｌＵ、シャペロンタンパク質ＤｎａＪ、タンパク質ＴｖｉＢ、タンパク質ＩｒｏＮ、フラジェリンＦｌｉＣ、侵入タンパク質ＳｉｐＣ、糖タンパク質ｇｐ４３、外膜タンパク質ＬａｍＢ、外膜タンパク質ＰａｇＣ、外膜タンパク質ＴｏｌＣ、外膜タンパク質ＮｍｐＣ、外膜タンパク質ＦａｄＬ、輸送タンパク質ＳａｄＡ、トランスフェラーゼＷｇａＰ、エフェクタータンパク質ＳｉｆＡ、ＳｔｅＣ、ＳｓｅＬ、ＳｓｅＪ及びＳｓｅＦ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、サルモネラ症）；“タンパク質１４、非構造タンパク質ＮＳ７ｂ、非構造タンパク質ＮＳ８ａ、タンパク質９ｂ、タンパク質３ａ、ヌクレオタンパク質Ｎ、非構造タンパク質ＮＳ３ｂ、非構造タンパク質ＮＳ６、タンパク質７ａ、非構造タンパク質ＮＳ８ｂ、膜タンパク質Ｍ、エンベロープ小型膜タンパク質ＥｓＭ、レプリカーゼポリタンパク質１ａ、スパイク糖タンパク質Ｓ、レプリカーゼポリタンパク質ｌａｂ；ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群））；セリンプロテアーゼ、非定型ヒゼンダニ抗原１ ＡＳＡ１、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＧＳＴ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アポリポタンパク質（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、疥癬）；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＧＳＴ、パラミオシン、ヘモグロビナーゼＳＭ３２、主要卵抗原、１４ｋＤａ脂肪酸結合タンパク質Ｓｍ１４、主要幼虫表面抗原Ｐ３７、２２．６ｋＤａテグメント抗原、カルパインＣＡＮＰ、三リン酸イソメラーゼＴｉｍ、表面タンパク質９Ｂ、外側カプシドタンパク質ＶＰ２、２３ｋＤａ膜内在性タンパク質Ｓｍ２３、Ｃｕ／Ｚｎ－スーパーオキシドジスムターゼ、糖タンパク質Ｇｐ、ミオシン（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属、住血吸虫症（ビルハルツ住血吸虫症））；６０ｋＤａシャペロニン、５６ｋＤａ型特異的抗原、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、４－ヒドロキシベンゾエートオクタプレニルトランスフェラーゼ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、ツツガムシ病）；デヒドロゲナーゼＧｕａＢ、侵入タンパク質Ｓｐａ３２、インベイシンＩｐａＡ、インベイシンＩｐａＢ、インベイシンＩｐａＣ、インベイシンＩｐａＤ、インベイシンＩｐａＨ、インベイシンＩｐａＪ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、シゲラ症（細菌性赤痢））；タンパク質Ｐ５３、ビリオンタンパク質ＵＳ１０ホモログ、転写制御因子ＩＥ６３、転写トランス活性化因子ＩＥ６２、プロテアーゼＰ３３、アルファトランス誘導因子７４ｋＤａタンパク質、デオキシウリジン５’－三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ、転写トランス活性化因子ＩＥ４、膜タンパク質ＵＬ４３ホモログ、核リンタンパク質ＵＬ３ホモログ、核タンパク質ＵＬ４ホモログ、複製起点結合タンパク質、膜タンパク質２、リンタンパク質３２、タンパク質５７、ＤＮＡポリメラーゼ処理能力因子、ポータルタンパク質５４、ＤＮＡプライマーゼ、テグメントタンパク質ＵＬ１４ホモログ、テグメントタンパク質ＵＬ２１ホモログ、テグメントタンパク質ＵＬ５５ホモログ、トリパータイトターミナーゼサブユニットＵＬ３３ホモログ、トリパータイトターミナーゼサブユニットＵＬ１５ホモログ、カプシド結合タンパク質４４、ビリオンパッケージングタンパク質４３（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、帯状疱疹（帯状ヘルペス））；切断型３－ベータヒドロキシ－５－エンステロイドデヒドロゲナーゼホモログ、ビリオン膜タンパク質Ａ１３、タンパク質Ａ１９、タンパク質Ａ３１、切断型タンパク質Ａ３５ホモログ、タンパク質Ａ３７．５ホモログ、タンパク質Ａ４７、タンパク質Ａ４９、タンパク質Ａ５１、セマフォリン様タンパク質Ａ４３、セリンプロテイナーゼ阻害因子１、セリンプロテイナーゼ阻害因子２、セリンプロテイナーゼ阻害因子３、タンパク質Ａ６、タンパク質Ｂ１５、タンパク質Ｃ１、タンパク質Ｃ５、タンパク質Ｃ６、タンパク質Ｆ７、タンパク質Ｆ８、タンパク質Ｆ９、タンパク質Ｆ１１、タンパク質Ｆ１４、タンパク質Ｆ１５、タンパク質Ｆ１６（大痘瘡または小痘瘡、天然痘（痘瘡））；アドヘシン／糖タンパク質ｇｐ７０、プロテアーゼ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、スポロトリクム症）；ヘム鉄結合タンパク質ＩｓｄＢ、コラーゲンアドヘシンＣｎａ、クランピング因子Ａ ＣｌｆＡ、タンパク質ＭｅｃＡ、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ ＦｎｂＡ、エンテロトキシンＡ型ＥｎｔＡ、エンテロトキシンＢ型ＥｎｔＢ、エンテロトキシンＣ型ＥｎｔＣ１、エンテロトキシンＣ型ＥｎｔＣ２、エンテロトキシンＤ型ＥｎｔＤ、エンテロトキシンＥ型ＥｎｔＥ、毒素性ショック症候群毒素－１ ＴＳＳＴ－１、スタフィロキナーゼ、ペニシリン結合タンパク質２ａ ＰＢＰ２ａ（ＭｅｃＡ）、分泌性抗原ＳｓｓＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ブドウ球菌食中毒）；ヘム鉄結合タンパク質ＩｓｄＢ、コラーゲンアドヘシンＣｎａ、クランピング因子Ａ ＣｌｆＡ、タンパク質ＭｅｃＡ、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ ＦｎｂＡ、エンテロトキシンＡ型ＥｎｔＡ、エンテロトキシンＢ型ＥｎｔＢ、エンテロトキシンＣ型ＥｎｔＣ１、エンテロトキシンＣ型ＥｎｔＣ２、エンテロトキシンＤ型ＥｎｔＤ、エンテロトキシンＥ型ＥｎｔＥ、毒素性ショック症候群毒素－１ ＴＳＳＴ－１、スタフィロキナーゼ、ペニシリン結合タンパク質２ａ ＰＢＰ２ａ（ＭｅｃＡ）、分泌性抗原ＳｓｓＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばａｕｒｅｕｓ、ブドウ球菌感染症）；抗原Ｓｓ－ＩＲ、抗原ＮＩＥ、ストロンギラスタシン、Ｎａ＋－Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ Ｓｓｅａｔ－６、トロポマイシンＳｓＴｍｙ－１、タンパク質ＬＥＣ－５、４１ｋＤａ抗原Ｐ５、４１－ｋＤａ幼虫タンパク質、３１－ｋＤａ幼虫タンパク質、２８－ｋＤａ幼虫タンパク質（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、糞線虫症）；グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼＧｌｐＱ（Ｇｐｄ）、外膜タンパク質ＴｍｐＢ、タンパク質Ｔｐ９２、抗原ＴｐＦ１、リピートタンパク質Ｔｐｒ、リピートタンパク質Ｆ ＴｐｒＦ、リピートタンパク質Ｇ ＴｐｒＧ、リピートタンパク質Ｉ ＴｐｒＩ、リピートタンパク質Ｊ ＴｐｒＪ、リピートタンパク質Ｋ ＴｐｒＫ、トレポネーマ膜タンパク質Ａ ＴｍｐＡ、リポタンパク質、１５ｋＤａ Ｔｐｐ１５、４７ｋＤａ膜抗原、ミニフェリチンＴｐＦ１、アドヘシンＴｐ０７５１、リポタンパク質ＴＰ０１３６、タンパク質ＴｐＮ１７、タンパク質ＴｐＮ４７、外膜タンパク質ＴＰ０１３６、外膜タンパク質ＴＰ０１５５、外膜タンパク質ＴＰ０３２６、外膜タンパク質ＴＰ０４８３、外膜タンパク質ＴＰ０９５６（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、梅毒）；カテプシンＬ様プロテアーゼ、５３／２５－ｋＤａ抗原、８ｋＤａファミリーメンバー、わずかなトリプシン様活性を有する嚢虫タンパク質ＴｓＡｇ５、六鉤幼虫タンパク質ＴＳＯＬ１８、六鉤幼虫タンパク質ＴＳＯＬ４５－１Ａ、乳酸デヒドロゲナーゼＡ ＬＤＨＡ、乳酸デヒドロゲナーゼＢ ＬＤＨＢ（Ｔａｅｎｉａ属、テニア症）；破傷風毒素ＴｅｔＸ、破傷風毒素Ｃ ＴＴＣ、１４０ｋＤａ Ｓ層タンパク質、フラボタンパク質ベータ－サブユニットＣＴ３、ホスホリパーゼ（レシチナーゼ）、ホスホキャリアタンパク質ＨＰｒ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、破傷風（牙関緊急））；ゲノムポリタンパク質、タンパク質Ｅ、タンパク質Ｍ、カプシドタンパク質Ｃ（ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、ダニ媒介性脳炎）；５８－ｋＤａ抗原、６８－ｋＤａ抗原、トキソカラ幼虫排泄分泌抗原ＴＥＳ、３２－ｋＤａ糖タンパク質、糖タンパク質ＴＥＳ－７０、糖タンパク質ＧＰ３１、排泄分泌抗原ＴｃＥＳ－５７、腸周囲液抗原Ｐｅ、可溶性抽出物抗原Ｅｘ、排泄／分泌性幼虫抗原ＥＳ、抗原ＴＥＳ－１２０、ポリタンパク質アレルゲンＴＢＡ－１、カテプシンＬ様システインプロテアーゼｃ－ｃｐｌ－１、２６－ｋＤａタンパク質（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓまたはＴｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ、トキソカラ症（眼幼虫移行症（ＯＬＭ）及び内臓幼虫移行症（ＶＬＭ）））；ミクロネームタンパク質（ＭＩＣ１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ３、ＭＩＣ４、ＭＩＣ５、ＭＩＣ６、ＭＩＣ７、ＭＩＣ８）、桿小体タンパク質Ｒｏｐ２、桿小体タンパク質（Ｒｏｐ１、Ｒｏｐ２、Ｒｏｐ３、Ｒｏｐ４、Ｒｏｐ５、Ｒｏｐ６、Ｒｏｐ７、Ｒｏｐ１６、Ｒｊｏｐ１７）、タンパク質ＳＲｉ、表面抗原Ｐ２２、主要抗原ｐ２４、主要表面抗原ｐ３０、密顆粒タンパク質（ＧＲＡ１、ＧＲＡ２、ＧＲＡ３、ＧＲＡ４、ＧＲＡ５、ＧＲＡ６、ＧＲＡ７、ＧＲＡ８、ＧＲＡ９、ＧＲＡ１０）、２８ｋＤａ抗原、表面抗原ＳＡＧ１、ＳＡＧ２関連抗原、ヌクレオシド－トリホスファターゼ１、ヌクレオシド－トリホスファターゼ２、タンパク質Ｓｔｔ３、ＨｅｓＢ様ドメイン含有タンパク質、ロンボイド様プロテアーゼ５、トキソメプシン１（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、トキソプラズマ症）；４３ｋＤａ分泌型糖タンパク質、５３ｋＤａ分泌型糖タンパク質、パラミオシン、抗原Ｔｓ２１、抗原Ｔｓ８７、抗原ｐ４６０００、ＴＳＬ－１抗原、カベオリン－１ ＣＡＶ－１、４９ｋＤａ新生幼虫抗原、プロサポシンホモログ、セリンプロテアーゼ、セリンプロテイナーゼ阻害因子、４５－ｋＤａ糖タンパク質Ｇｐ４５（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、旋毛虫症）；Ｍｙｂ様転写因子（Ｍｙｂ１、Ｍｙｂ２、Ｍｙｂ３）、接着タンパク質ＡＰ２３、接着タンパク質ＡＰ３３、アドヘシンタンパク質ＡＰ３３－３、アドヘシンＡＰ５１、アドヘシンＡＰ６５、接着タンパク質ＡＰ６５－１、アルファ－アクチニン、キネシン関連タンパク質、テネウリン、６２ｋＤａプロテイナーゼ、スブチリシン様セリンプロテアーゼＳＵＢ１、システインプロテイナーゼ遺伝子３ ＣＰ３、アルファ－エノラーゼＥｎｏｌ、システインプロテイナーゼＣＰ３０、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０）、免疫原性タンパク質Ｐ２７０（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、トリコモナス症）；ベータ－チューブリン、４７－ｋＤａタンパク質、分泌性白血球様プロテイナーゼ－１ ＳＬＰ－１、５０－ｋＤａタンパク質ＴＴ５０、１７ｋＤａ抗原、４３／４７ｋＤａタンパク質（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、鞭虫症（鞭虫感染症））；タンパク質ＥＳＡＴ－６（ＥｓｘＡ）、１０ｋＤａ濾過性抗原ＥｓｘＢ、分泌型抗原８５－Ｂ ＦＢＰＢ、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ ＦｂｐＡ（Ａｇ８５Ａ）、セリンプロテアーゼＰｅｐＡ、ＰＰＥファミリータンパク質ＰＰＥ
１８、フィブロネクチン結合タンパク質Ｄ ＦｂｐＤ、免疫原性タンパク質ＭＰＴ６４、分泌型タンパク質ＭＰＴ５１、カタラーゼ－ペルオキシダーゼ－ペルオキシニトリターゼＴ ＫＡＴＧ、ペリプラズムリン酸結合リポタンパク質ＰＳＴＳ３（ＰＢＰ－３、Ｐｈｏｓ－１）、鉄制御型ヘパリン結合ヘマグルチニンＨｂｈａ、ＰＰＥファミリータンパク質ＰＰＥ１４、ＰＰＥファミリータンパク質ＰＰＥ６８、タンパク質Ｍｔｂ７２Ｆ、タンパク質Ａｐａ、免疫原性タンパク質ＭＰＴ６３、ペリプラズムリン酸結合リポタンパク質ＰＳＴＳ１（ＰＢＰ－１）、分子シャペロンＤｎａＫ、細胞表面リポタンパク質Ｍｐｔ８３、リポタンパク質Ｐ２３、リン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ｐｓｔＡ、１４ｋＤａ抗原、フィブロネクチン結合タンパク質Ｃ ＦｂｐＣ１、アラニンデヒドロゲナーゼＴＢ４３、グルタミンシンテターゼ１、ＥＳＸ－１タンパク質、タンパク質ＣＦＰ１０、ＴＢ１０．４タンパク質、タンパク質ＭＰＴ８３、タンパク質ＭＴＢ１２、タンパク質ＭＴＢ８、Ｒｐｆ様タンパク質、タンパク質ＭＴＢ３２、タンパク質ＭＴＢ３９、クリスタリン、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５、タンパク質ＰＳＴ－Ｓ（通常はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、結核）；外膜タンパク質ＦｏｂＡ、外膜タンパク質ＦｏｂＢ、細胞内成長遺伝子座ＩｇＩＣ１、細胞内成長遺伝子座ＩｇＩＣ２、アミノトランスフェラーゼＷｂｔ１、シャペロニンＧｒｏＥＬ、１７ｋＤａ主要膜タンパク質ＴＵＬ４、リポタンパク質ＬｐｎＡ、キチナーゼファミリー１８タンパク質、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、Ｎｉｆ３ファミリータンパク質、ＩＶ型線毛グリコシル化タンパク質、外膜タンパク質ｔｏｌＣ、ＦＡＤ結合ファミリータンパク質、ＩＶ型ピリン多量体外膜タンパク質、二成分センサータンパク質ＫｄｐＤ、シャペロンタンパク質ＤｎａＫ、タンパク質ＴｏＩＱ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、野兎病）；“ＭＢ抗原、ウレアーゼ、タンパク質ＧｙｒＡ、タンパク質ＧｙｒＢ、タンパク質ＰａｒＣ、タンパク質ＰａｒＥ、脂質関連膜タンパク質ＬＡＭＰ、チミジンキナーゼＴＫ、ホスホリパーゼＰＬ－Ａ１、ホスホリパーゼＰＬ－Ａ２、ホスホリパーゼＰＬ－Ｃ、表面発現９６－ｋＤａ抗原；“（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ感染症）；非構造ポリタンパク質、構造ポリタンパク質、カプシドタンパク質ＣＰ、タンパク質Ｅ１、タンパク質Ｅ２、タンパク質Ｅ３、プロテアーゼＰ１、プロテアーゼＰ２、プロテアーゼＰ３（ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎）；糖タンパク質ＧＰ、基質タンパク質Ｚ、ポリメラーゼＬ、ヌクレオタンパク質Ｎ（グアナリトウイルス、ベネズエラ出血熱）；ポリタンパク質、タンパク質Ｅ、タンパク質Ｍ、カプシドタンパク質Ｃ、プロテアーゼＮＳ３、タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＳ２Ａ、タンパク質ＡＳ２Ｂ、タンパク質ＮＳ４Ａ、タンパク質ＮＳ４Ｂ、タンパク質ＮＳ５（西ナイルウイルス、西ナイル熱）；カプシドタンパク質ＣＰ、タンパク質Ｅ１、タンパク質Ｅ２、タンパク質Ｅ３、プロテアーゼＰ２（西部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎）；ゲノムポリタンパク質、タンパク質Ｅ、タンパク質Ｍ、カプシドタンパク質Ｃ、プロテアーゼＮＳ３、タンパク質ＮＳ１、タンパク質ＮＳ２Ａ、タンパク質ＡＳ２Ｂ、タンパク質ＮＳ４Ａ、タンパク質ＮＳ４Ｂ、タンパク質ＮＳ５（黄熱病ウイルス、黄熱病）；推定上のＹｏｐターゲティングタンパク質ＹｏｂＢ、エフェクタータンパク質ＹｏｐＤ、エフェクタータンパク質ＹｏｐＥ、タンパク質ＹｏｐＨ、エフェクタータンパク質ＹｏｐＪ、タンパク質トランスロケーションタンパク質ＹｏｐＫ、エフェクタータンパク質ＹｏｐＴ、タンパク質ＹｐｋＡ、鞭毛生合成タンパク質ＦｌｈＡ、ペプチダーゼＭ４８、カリウム流出系ＫｅｆＡ、転写制御因子ＲｏｖＡ、アドヘシンＩｆｐ、トランスロケータータンパク質ＬｃｒＶ、タンパク質ＰｃｒＶ、インベイシンＩｎｖ、外膜タンパク質ＯｍｐＦ様ポリン、アドヘシンＹａｄＡ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ１、タンパク質ＰｓａＡ、マンノシルトランスフェラーゼ様タンパク質ＷｂｙＫ、タンパク質ＹｓｃＵ、抗原ＹＰＭａ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症）；エフェクタータンパク質ＹｏｐＢ、６０ｋＤａシャペロニン、タンパク質ＷｂｃＰ、チロシン－タンパク質ホスファターゼＹｏｐＨ、タンパク質ＹｏｐＱ、エンテロトキシン、ガラクトシドパーミアーゼ、レダクターゼＮｒｄＥ、タンパク質ＹａｓＮ、インベイシンＩｎｖ、アドヘシンＹａｄＡ、外膜ポリンＦ ＯｍｐＦ、タンパク質ＵｓｐＡ１、タンパク質ＥｉｂＡ、タンパク質Ｈｉａ、細胞表面タンパク質Ａｉｌ、シャペロンＳｙｃＤ、タンパク質ＬｃｒＤ、タンパク質ＬｃｒＧ、タンパク質ＬｃｒＶ、タンパク質ＳｙｃＥ、タンパク質ＹｏｐＥ、制御タンパク質ＴｙｅＡ、タンパク質ＹｏｐＭ、タンパク質ＹｏｐＮ、タンパク質ＹｏｐＯ、タンパク質ＹｏｐＴ、タンパク質ＹｏｐＤ、プロテアーゼＣｌｐＰ、タンパク質ＭｙｆＡ、タンパク質ＦｉｌＡ、ならびにタンパク質ＰｓａＡ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、エルシニア症）。
先行するセクションにおける括弧は、抗原（複数可）の由来である特定の病原体または病原体のファミリー、及び病原体が関連する感染性疾患を示す。
本発明の第１の態様の特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ化合物は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質１（Ｍ１）、基質タンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、もしくはポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む。
この文脈において、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質１（Ｍ１）、基質タンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、もしくはポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）に由来する任意のペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントから、または任意の合成的に工学操作されたインフルエンザウイルスペプチドもしくはタンパク質から選択され得る。
本発明の好ましい実施形態において、コード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。この文脈において、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、同じインフルエンザウイルスから選択されても異なるインフルエンザウイルスから選択されてもよい。
この文脈において、少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質１（Ｍ１）、基質タンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、もしくはポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）の少なくとも１つの完全長タンパク質、またはそのバリアントをコードすることが特に好ましい。
特に好ましい実施形態では、少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）の少なくとも１つの完全長タンパク質、及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の少なくとも１つの完全長タンパク質、あるいはそのバリアントをコードする。
本明細書で使用される「完全長タンパク質」という用語は、典型的には、天然に発生するタンパク質のアミノ酸配列全体を実質的に含むタンパク質を指す。
具体的な実施形態では、インフルエンザウイルスペプチドまたはタンパク質は、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型のインフルエンザウイルス（株）に由来する。
具体的な実施形態では、ウイルスペプチドまたはタンパク質は、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳなど（株）に由来する。
Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８からなる群から選択されるヘマグルチニン（ＨＡ）によって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルスから選択され得る。好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５またはＨ９からなる群から選択されるヘマグルチニン（ＨＡ）によって特徴付けられるインフルエンザウイルスから選択される。
さらに、特に好ましいのは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、及びＮ１１からなる群から選択されるノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルスである。最も好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ８からなる群から選択されるノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって特徴付けられる。
特に好ましい実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ８、及びＨ１０Ｎ７からなる群から選択され、好ましくはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、及びＨ５Ｎ８から選択される。
この文脈において、本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ８及びＨ１０Ｎ７からなる群から選択される、好ましくはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ８から選択される、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくタンパク質、及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードすることが特に好ましい。
本発明の文脈において、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域によってコードされるタンパク質またはそのバリアントのフラグメントは、典型的には、それぞれの天然に発生する完全長タンパク質またはそのバリアントのアミノ酸配列との、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
具体的な実施形態では、抗原性ペプチドまたはタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質に由来する。
さらに、この文脈において、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体をコードするコード領域は、任意のインフルエンザウイルス分離株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするコード領域を含む任意の核酸配列から選択され得る。
本発明の第１の態様の特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｇに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするコード領域を含む。
この文脈において、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する任意のペプチドもしくはタンパク質またはフラグメントもしくはバリアントから、または任意の合成的に工学操作された狂犬病ウイルスペプチドもしくはタンパク質から選択され得る。
本発明の好ましい実施形態において、コード領域は、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。
この文脈において、少なくとも１つのコード領域は、狂犬病ウイルスの糖タンパク質の少なくとも１つの完全長タンパク質またはそのバリアントをコードすることが特に好ましい。
本明細書で使用される場合、「完全長タンパク質」という用語は、好ましくは、本発明の配列表に示されるタンパク質の完全長配列に関する。
この文脈において、本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード配列は、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードすることがさらに好ましい。狂犬病ウイルスの各糖タンパク質は、対応するタンパク質のデータベースアクセッション番号によって識別される（タンパク質または核酸のアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）を示す配列表の識別番号＜２２３＞を参照されたい）。それぞれのタンパク質または核酸のアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）が配列表においてさらに検索される場合、次の配列番号は、前記タンパク質をコードする野生型ｍＲＮＡの核酸配列に対応する識別番号＜２２３＞の下に前記タンパク質または核酸のアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）を示す。
さらに、この文脈において、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体をコードするコード領域は、任意の狂犬病ウイルス分離株に由来する糖タンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするコード領域を含む任意の核酸配列から選択され得る。
エボラウイルス及び遺伝的に関連するマールブルグウイルスは、重篤な疾患を引き起こすヒト病原体である。エボラウイルス及びマールブルグウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするエンベロープウイルスであるフィロウイルスである。フィロウイルス科は、エボラウイルス、マールブルグウイルス、及びクウェバウイルスの３つの属を含む。クウェバウイルス属及びマールブルグウイルス属は、１つの種のみ、すなわち、Ｌｌｏｖｉｕクウェバウイルス（Ｌｌｏｖｉｕウイルス－ＬＬＯＶ）と、Ｍａｒｂｕｒｇウイルス（ＭＡＲＶ）及びＲａｖｎウイルス（ＲＡＶＶ）に細分されるＭａｒｂｕｒｇマールブルグウイルスとをそれぞれ含む。エボラウイルス属は、５つの既知種、すなわちブンディブギョエボラウイルス（ブンディブギョウイルス－ＢＤＢＶ）、レストンエボラウイルス（レストンウイルス－ＲＥＳＴＶ）、スーダンエボラウイルス（スーダンウイルス－ＳＵＤＶ）、タイフォレストエボラウイルス（タイフォレストウイルス－ＴＡＦＶ）（＝コートジボワールエボラウイルス）、及びザイールエボラウイルス（エボラウイルス－ＥＢＯＶ）を含む。クウェバウイルスはコウモリから単離されており、ヒトにおける病原体としてのその可能性は未だ不明であるが、エボラウイルス及びマールブルグウイルスはいずれも、出血熱及び極めて高い死亡率を特徴とするエボラウイルス疾患（ＥＶＤ）及びマールブルグウイルス疾患をそれぞれ引き起こすヒト病原体である。本発明の文脈において、上掲の科及び属のウイルスに属する、またはそれらに関連する、またはそれらに由来する、あらゆるウイルス、ウイルスメンバー、ウイルス株、ウイルスタイプ、ウイルスサブタイプ、ウイルス分離株、ウイルスバリアント、またはウイルス血清型、またはウイルスの遺伝的再集合体が、「エボラウイルス」であるとみなされる。
本発明の第１の態様の特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、エボラウイルス属もしくはマールブルグウイルス属のウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）及び／または基質タンパク質４０（ＶＰ４０）及び／またはヌクレオタンパク質（ＮＰ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体をコードするコード領域を含む。
この文脈において、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、エボラウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）及び／または基質タンパク質４０（ＶＰ４０）及び／またはヌクレオタンパク質（ＮＰ）糖タンパク質に由来する任意のペプチドもしくはタンパク質またはフラグメントもしくはバリアントから、または任意の合成的に工学操作されたエボラウイルスペプチドもしくはタンパク質から選択され得る。
本発明の好ましい実施形態において、コード領域は、エボラウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする。この文脈において、少なくとも１つのコード領域は、エボラウイルスの糖タンパク質の少なくとも１つの完全長タンパク質またはそのバリアントをコードすることが特に好ましい。
特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、エボラウイルスの糖タンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、エボラウイルスのＶＰ４０をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、エボラウイルスのＮＰをコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、次のＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列を含むエボラウイルスの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
エボラウイルスのＧＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ：特許出願第ＷＯ２０１６０９７０６５号の配列番号３７～３９、またはこれらの配列のフラグメントもしくはバリアント。この文脈において、ＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号３７～３９及びＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号３７～３９に関する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
エボラウイルスのＶＰ４０をコードするｍＲＮＡ：特許出願第ＷＯ２０１６０９７０６５号の配列番号４０～４２、またはこれらの配列のフラグメントもしくはバリアント。この文脈において、ＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号４０～４２及びＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号４０～４２に関する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
エボラウイルスのＮＰをコードするｍＲＮＡ：特許出願第ＷＯ２０１６０９７０６５号の配列番号４３～４４、またはこれらの配列のフラグメントもしくはバリアント。この文脈において、ＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号４３～４４及びＷＯ２０１６０９７０６５の配列番号４３～４４に関する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｖ．９．３． 腫瘍抗原
好ましくは、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の少なくとも１つのコード配列は、好ましくは本明細書で定義されるような腫瘍抗原、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードし、腫瘍抗原は、好ましくは、１Ａ０１＿ＨＬＡ－Ａ／ｍ、１Ａ０２、５Ｔ４、ＡＣＲＢＰ、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ４、アルファ－アクチニン－４／ｍ、アルファ－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＮＤＲ、ＡＲＴ－４、ＡＲＴＣ１／ｍ、ＡＵＲＫＢ、Ｂ２ＭＧ、Ｂ３ＧＮ５、Ｂ４ＧＮ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ－１、ＢＡＳＩ、ＢＣＬ－２、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＩＮＧ－４、ＢＩＲＣ７、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＹ５５、カルレティキュリン、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＡＳＰＡ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ１Ｅ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７６、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４４アイソフォーム１、ＣＤ４４アイソフォーム６、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８Ａ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＥ３０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＥＡ、ＣＥＡＭ６、ＣＨ３Ｌ２、ＣＬＣＡ２、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２、ＣＰ１Ｂ１、ＣＳＡＧ２、ＣＴ４５Ａ１、ＣＴ５５、ＣＴ－＿９／ＢＲＤ６、ＣＴＡＧ２アイソフォームＬＡＧＥ－１Ａ、ＣＴＡＧ２アイソフォームＬＡＧＥ－１Ｂ、ＣＴＣＦＬ、Ｃｔｅｎ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ－１０、ＤＥＰ１Ａ、Ｅ７、ＥＦ１Ａ２、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＬＮ３、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ６、ＥＷＳ、ＥＺＨ２、ＦＡＢＰ７、ＦＣＧＲ３Ａバージョン１、ＦＣＧＲ３Ａバージョン２、ＦＧＦ５、ＦＧＦＲ２、フィブロネクチン、ＦＯＳ、ＦＯＸＰ３、ＦＵＴ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ７ｂ、ＧＡＧＥ－８＿（ＧＡＧＥ－２Ｄ）、ＧＡＳＲ、ＧｎＴ－Ｖ、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＧＲＭ３、ＨＡＧＥ、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＧ１、ＨＳ７１Ａ、ＨＳ７１Ｂ、ＨＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＦ２Ｂ３、ＩＬ１０、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ２－ＲＡ、ＩＬ２－ＲＢ、ＩＬ２－ＲＧ、ＩＬ－５、ＩＭＰ３、ＩＴＡ５、ＩＴＢ１、ＩＴＢ６、カリクレイン－２、カリクレイン－４、ＫＩ２０Ａ、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＬＤＬＲ、ＬＧＭＮ、ＬＩＲＢ２、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＡ５、ＭＡＧＡ８、ＭＡＧＡＢ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥ－Ｂ１７、ＭＡＧＥ－＿Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－＿Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ、ＭＡＲＴ－２、ＭＣ１＿Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、メソテリン、ＭＩＴＦ、ＭＭＰ１＿１、ＭＭＰ７、ＭＵＣ－１、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＹＣＮ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｃ、ＭＹＯ１Ｄ、ＭＹＯ１Ｅ、ＭＹＯ１Ｆ、ＭＹＯ１Ｇ、ＭＹＯ１Ｈ、ＮＡ１７、ＮＡ８８－Ａ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ／ｍ、ＮＧＥＰ、ＮＰＭ、ＮＲＣＡＭ、ＮＳＥ、ＮＵＦ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ－９、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４、ＰＡＩ－１、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ、ＰＡＴＥ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＥＦ、ＰＥＣＡ１、ＰＧＣＢ、ＰＧＦＲＢ、Ｐｉｍ－１キナーゼ、Ｐｉｎ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＭＥＬ、ＰＭＬ、ＰＯＴＥＦ、ＰＯＴＥ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＲＭ２、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ、ＰＳＢ９、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭ、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＧＥ－１、ＲＡＲＡ、ＲＡＳＨ、ＲＡＳＫ、ＲＡＳＮ、ＲＧＳ５、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＨＯＣ、ＲＳＳＡ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＲＵＮＸ１、Ｓ－１００、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－＿１、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、ＳＥＰＲ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＩＡ７Ｆ、ＳＩＡ８Ａ、ＳＩＡＴ９、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＯＸ１０、ＳＰ１７、ＳＰＮＸＡ、ＳＰＸＮ３、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ３、ＳＳＸ－４、ＳＴ１Ａ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＭＰ－１、ＳＴＥＡＰ－１、サバイビン－２Ｂ、サバイビン、ＳＹＣＰ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＡＲＰ、ＴＣＲｇ、ＴＦ２ＡＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＲ２、ＴＧＭ－４、ＴＩＥ２、ＴＫＴＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＧＶ１１、ＴＲＧＶ９、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰ－ｐ８、ＴＳＧ１０、ＴＳＰＹ１、ＴＶＣ＿（ＴＲＧＶ３）、ＴＸ１０１、チロシナーゼ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲＰ２、ＵＰＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＷＴ１、及びＸＡＧＥ１からなる群から選択される。
本発明に有用なさらなる抗原を本明細書の以下に示す（遺伝子名の後に括弧書きでタンパク質アクセッション番号が続く）。
１Ａ０１＿ＨＬＡ－Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３０４４３）、１Ａ０２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８９２）、５Ｔ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３６４１）、ＡＣＲＢＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＥＢ７）、ＡＦＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２７７１）、ＡＫＡＰ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＪＱＣ９）、アルファ－アクチニン－４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＳＸ０）、アルファ－アクチニン－４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４Ｅ３３７）、アルファ－アクチニン－４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０４３７０７）、アルファ－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＥ１６）、アルファ－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ８ＫＡＣ３）、ＡＮＤＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１０２７５）、ＡＲＴ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＬＸ３）、ＡＲＴＣｉ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５２９６１）、ＡＵＲＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＧＤ４）、Ｂ２ＭＧ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６１７６９）、Ｂ３ＧＮ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＹＧ０）、Ｂ４ＧＮ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ００９７３）、Ｂ７Ｈ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７Ｚ７Ｄ３）、ＢＡＧＥ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３０７２）、ＢＡＳＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３５６１３）、ＢＣＬ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＱＸＧ９）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＥＺ４）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＥＺ７）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＥＺ８）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＥＺ９）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ００）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０１）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０３）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０４）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０５）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０６）、ｂｃｒ／ａｂｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ９ＵＦ０８）、ベータ－カテニン／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３５２２２）、ベータ－カテニン／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＹＡ６）、ＢＩＮＧ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５２１３）、ＢＩＲＣ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＣＡ５）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ１Ｖ０）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ１Ｖ７）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＩＺ８）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０６８ＢＦＸ７）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｃ６ＹＢ４５）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｃ６ＹＢ４７）、ＢＲＣＡ１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ３ＸＡＣ３）、ＢＹ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９５９７１）、カルレティキュリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＨＲ１）、カルレティキュリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４Ｅ２Ｙ９）、カルレティキュリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２７７９７）、カルレティキュリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６Ｌ１２）、ＣＡＭＥＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９５９８７）、ＣＡＳＰ－８／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４７９０）、ＣＡＳＰＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９２８５１－４）、カテプシンＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ３７４）、カテプシンＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７８５８）、カテプシンＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ２７６）、カテプシンＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７７１１）、カテプシンＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＢＱ７）、ＣＤ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０６１２６）、ＣＤ１Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９０１６）、ＣＤ１Ｃ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９０１７）、ＣＤ１Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５８１３）、ＣＤ１Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５８１２）、ＣＤ２０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１８３６）、ＣＤ２２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０６０９２６）、ＣＤ２２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２０２７３）、ＣＤ２２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０ＥＡＦ５）、ＣＤ２７６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＺＰＲ３）、ＣＤ３３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＦ５１）、ＣＤ３３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２０１３８）、ＣＤ３３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５４６Ｇ０）、ＣＤ３Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７７６６）、ＣＤ３Ｚ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２０９６３）、ＣＤ４４アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６０７０）、ＣＤ４４アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６０７０－６）、ＣＤ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１７３０）、ＣＤ５２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３１３５８）、ＣＤ５２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＩＢＤ０）、ＣＤ５２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＨＷＮ９）、ＣＤ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ１ＡＰ１５）、ＣＤ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ３ＤＴ８５）、ＣＤ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ３ＤＴ８６）、ＣＤ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８１７４）、ＣＤ５６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１３５９１）、ＣＤ８０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ｎ０Ｐ２）、ＣＤ８０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３３６８１）、ＣＤ８６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４２０８１）、ＣＤ８Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１７３２）、ＣＤＣ２７／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ５ＥＡ３６）、ＣＤＣ２７／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３０２６０）、ＣＤＥ３０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８９０８）、ＣＤＫ４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＢＢ６）、ＣＤＫ４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１８０２）、ＣＤＫ４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＬＣ８３）、ＣＤＫ４／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＢＥ９）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ１ＬＹＸ３）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ３ＸＡＧ３）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｋ７ＰＭＬ８）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８Ｅ９４１）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｎ７２６）、ＣＥＡ（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４３５４）、ＣＥＡＭ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４０１９９）、ＣＨ３Ｌ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５７８２）、ＣＬＣＡ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＱＣ９）、ＣＭＬ２８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＱＴ４）、ＣＭＬ６６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＲＳ６）、ＣＯＡ－１／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５Ｔ１２４）、コアクトシン様タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４０１９）、コラーゲンＸＸＩＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８ＥＡＳ４）、コラーゲンＸＸＩＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８６Ｙ２２）、ＣＯＸ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＺＹＫ７）、ＣＰ１Ｂ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６６７８）、ＣＳＡＧ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｐ２－２）、ＣＳＡＧ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｐ２）、ＣＴ４５Ａ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＨＹＮ５）、ＣＴ５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＵＥ５）、ＣＴ－＿９／ＢＲＤ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５８Ｆ２１）、ＣＴＡＧ２アイソフォームＬＡＧＥ－１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５６３８－２）、ＣＴＡＧ２アイソフォームＬＡＧＥ－１Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５６３８）、ＣＴＣＦＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＩ５１）、Ｃｔｅｎ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＩＺＷ８）、サイクリンＢ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１４６３５）、サイクリンＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４３８５）、ｃｙｐ－Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２３２８４）、ＤＡＭ－１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６６）、ＤＥＰ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＴＢ３０）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０３１２９）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０６７８８）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７３８７）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０６４２９）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２７２３０）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４８３７）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２１７３６）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６５５８）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３６８３１）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３６８３３）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＱＣＺ１）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８１９６５）、Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８０９５６）、ＥＦ１Ａ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０５６３９）、ＥＦＴＵＤ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５０２９）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｂ４Ｊ１Ｙ５）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｅ７ＢＳＶ０）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ０Ｒ６Ｇ１）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ００５３３－２）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ００５３３）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４７Ｔ７）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５０４Ｕ８）、ＥＧＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＤＵ８）、ＥＧＬＮ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ６Ｚ９）、ＥＬＦ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７Ｚ７２０）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５４Ａ５１）、ＥｐＣａｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６４２２）、ＥｐｈＡ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９３１７）、ＥｐｈＡ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９３２０）、ＥｐｈＡ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６Ｐ４Ｒ６）、ＥｒｂＢ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ３ＫＷＧ５）、ＥｒｂＢ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＧＱ７）、ＥＲＢＢ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５３０３）、ＥＲＧ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１３０８）、ＥＴＶ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４１２１２）、ＥＷＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１８４４）、ＥＺＨ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｆ２ＹＭＭ１）、ＥＺＨ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ３ＸＡＬ２）、ＥＺＨ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ０Ｒ８５５）、ＥＺＨ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５９１０）、ＥＺＨ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｓ４Ｓ３Ｒ８）、ＦＡＢＰ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５５４０）、ＦＣＧＲ３Ａバージョン１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８６３７）、ＦＣＧＲ３Ａバージョン２（ＣＣＤＳ：ＣＣＤＳ１２３２．１）、ＦＧＦ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１２０３４）、ＦＧＦ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６０５１８）、ＦＧＦＲ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２１８０２）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ５Ｉ６）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＢ０１）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤＴ９）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤＶ５）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ６ＮＨ４４）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ８Ｋ６Ａ５）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ２Ｒ６２７）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ３ＫＸＭ５）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＩＣ５）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＮ２１）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＳ９８）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＴＨ２）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＴＫ１）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＵ１６）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７Ｚ３Ｗ５）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７Ｚ９３９）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ５Ｅ９Ｘ３）、フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ３８２）、ＦＯＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１００）、ＦＯＸＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＺＳ１）、ＦＵＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１９５２６）、Ｇ２５０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６７９０）、ＧＡＧＥ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ８２７４４）、ＧＡＧＥ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＮＴ４６）、ＧＡＧＥ－３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３０６７）、ＧＡＧＥ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３０６８）、ＧＡＧＥ－５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３０６９）、ＧＡＧＥ－６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３０７０）、ＧＡＧＥ７ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７６０８７）、ＧＡＧＥ－８＿（ＧＡＧＥ－２Ｄ）（ＵｎｉＰｒｏｔ
ＫＢ：Ｑ９ＵＥＵ５）、ＧＡＳＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３２２３９）、ＧｎＴ－Ｖ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０９３２８）、ＧＰＣ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ６ＱＴＧ３）、ＧＰＣ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５１６５４）、ＧＰＣ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＩＹＧ２）、ＧＰＮＭＢ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＡ５５）、ＧＰＮＭＢ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４９５６）、ＧＰＮＭＢ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＩＸＪ５）、ＧＰＮＭＢ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６Ｆ５８）、ＧＲＭ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４８３２）、ＨＡＧＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＸＺ２）、ヘプシン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ２ＺＤＱ２）、ヘプシン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５９８１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＴＲ１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８Ｅ８Ｇ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４６２６）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＫ７９）、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９５３８７）、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＭＹＦ８）、ホメオボックスＮＫＸ３．１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９８０１）、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ２ＲＢＱ６）、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｐ１２７）、ＨＰＧ１（Ｐｕｂｍｅｄ：１２５４３７８４）、ＨＳ７１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０ＤＭＶ８）、ＨＳ７１Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０ＤＭＶ９）、ＨＳＴ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１０７６７）、ｈＴＥＲＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９４８０７）、ｉＣＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０００７４８）、ＩＦ２Ｂ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０００４２５）、ＩＬ１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２２３０１）、ＩＬ－１３Ｒａ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４６２７）、ＩＬ２－ＲＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１５８９）、ＩＬ２－ＲＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１４７８４）、ＩＬ２－ＲＧ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３１７８５）、ＩＬ－５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５１１３）、ＩＭＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＶ３１）、ＩＴＡ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８６４８）、ＩＴＢ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５５５６）、ＩＴＢ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１８５６４）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ４Ｊ４）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ４Ｎ３）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ０ＡＺＵ９）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＵ７７）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２０１５１）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６Ｔ７７４）、カリクレイン－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６Ｔ７７５）、カリクレイン－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＦＱ５）、カリクレイン－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＢＱＡ０）、カリクレイン－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＰＴＯ）、カリクレイン－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＰＴ１）、カリクレイン－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｋ２）、ＫＩ２０Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９５２３５）、ＫＩＡＡ０２０５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９２６０４）、ＫＩＦ２Ｃ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９６６１）、ＫＫ－ＬＣ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５Ｈ９４３）、ＬＤＬＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１３０）、ＬＧＭＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９５３８）、ＬＩＲＢ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｎ４２３）、ＬＹ６Ｋ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１７ＲＹ６）、ＭＡＧＡ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３５９）、ＭＡＧＡ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６１）、ＭＡＧＡＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６４）、ＭＡＧＥ－Ａ１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＣ１４）、ＭＡＧＥ－Ａ１２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６５）、ＭＡＧＥ－Ａ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３５５）、ＭＡＧＥ－Ａ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３５６）、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３５７）、ＭＡＧＥ－Ａ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＣ１２）、ＭＡＧＥ－Ａ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３５８）、ＭＡＧＥ－Ａ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＲＮ３３）、ＭＡＧＥ－Ａ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ８Ｋ０７２）、ＭＡＧＥ－Ａ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６０）、ＭＡＧＥ－Ａ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＦＨＩ５）、ＭＡＧＥ－Ａ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３３６２）、ＭＡＧＥ－Ｂ１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＬＺ２）、ＭＡＧＥ－Ｂ１６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２Ａ３６８）、ＭＡＧＥ－Ｂ１７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ８ＭＸＴ２）、ＭＡＧＥ－Ｂ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＴＧ１）、ＭＡＧＥ－Ｂ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５４７９）、ＭＡＧＥ－Ｂ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５４８０）、ＭＡＧＥ－Ｂ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５４８１）、ＭＡＧＥ－Ｂ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＺ８１）、ＭＡＧＥ－Ｂ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｎ７Ｘ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０６０７３２）、ＭＡＧＥ－Ｃ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＢＦ１）、ＭＡＧＥ－Ｃ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＴＤ９１）、ＭＡＧＥ－Ｄ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｖ３）、ＭＡＧＥ－Ｄ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＮＦ１）、ＭＡＧＥ－Ｄ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＪＧ８）、ＭＡＧＥ－＿Ｅ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＩＡＩ７）、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＣＩ５）、ＭＡＧＥ－Ｅ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＴＤ９０）、ＭＡＧＥ－Ｆ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＡＹ２）、ＭＡＧＥ－Ｈ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ２１３）、ＭＡＧＥＬ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＪ５５）、マンマグロビンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３２９６）、マンマグロビンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＮＸ７０）、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６６５５）、ＭＡＲＴ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＶＴＹ９）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１７２６）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＬ４）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＬ６）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＬ８）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＬ９）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＭ０）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＭ２）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＭ３）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＭ４）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１ＪＵＭ５）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９２）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９４）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９５）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９６）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９７）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９８）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲ９９）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＵＲＡ０）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８６ＹＷ１）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ５Ｓ２）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ６７１）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ７８３）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ７Ｆ１）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ８Ｎ１）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ９７７）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ９Ｐ５）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９Ｑ９Ｒ８）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＡＥ０）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＡＲ２）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＡＷ３）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＢ０２）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＢ５８）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＢＹ６）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＣ１７）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＣ６６）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＣＱ４）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＤＦ４）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＤＮ７）、ＭＣ１＿Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＱＤＱ６）、Ｍ－ＣＳＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０９６０３）、メソテリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３４２１）、ＭＩＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５０３０－８）、ＭＩＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５０３０－９）、ＭＩＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５０３０）、ＭＭＰ１＿１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ３ＫＱＳ８）、ＭＭＰ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０９２３７）、ＭＵＣ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６００１９）、ＭＵＭ－１／ｍ（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿１１６２４２）、ＭＵＭ－２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ５Ｒ８）、ＭＹＣＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４１９８）、ＭＹＯ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＢＣ５）、ＭＹＯ１Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０４３７９５）、ＭＹＯ１Ｃ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０００１５９）、ＭＹＯ１Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９４８３２）、ＭＹＯ１Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１２９６５）、ＭＹＯ１Ｆ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０００１６０）、ＭＹＯ１Ｇ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ０Ｉ１Ｔ２）、ＭＹＯ１Ｈ（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１０９４８９１）、ＮＡ１７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ３Ｖ５Ｌ５）、ＮＡ８８－Ａ（Ｐｕｂｍｅｄ：１０７９０４３６）、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＷＴ３）、ＮＦＹＣ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３９５２）、ＮＧＥＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＩＷＨ７）、ＮＰＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０６７４８）、ＮＲＣＡＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９２８２３）、ＮＳＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０９１０４）、ＮＵＦ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＺＤ４）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８３５８）、ＯＡ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５１８１０）、ＯＧＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５２９４）、ＯＳ－９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４ＤＨ１１）、ＯＳ－９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ４Ｅ３２１）、ＯＳ－９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７Ｚ８Ｅ７）、ＯＳ－９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３４３８）、オステオカルシン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２８１８）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤＥ２）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤＥ６）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤＪ０）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７Ｚ３５１）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｆ２ＹＱ２１）、オステオポンチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１０４５１）、ｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４６３７）、ＰＡＧＥ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０６０８２９）、ＰＡＩ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５１２１）、ＰＡＩ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５１２０）、ＰＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０６１４１）、ＰＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５３Ｓ５６）、ＰＡＴＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＸＡ２）、ＰＡＸ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２３７６０）、ＰＡＸ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２５４８）、ＰＤ１Ｌ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＺＱ７）、ＰＤＣＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６）、ＰＤＥＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０９５２３８）、ＰＥＣＡ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６２８４）、ＰＧＣＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＧＷ７）、ＰＧＦＲＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０９６１９）、Ｐｉｍ－１＿－Ｋｉｎａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＤ２５）、Ｐｉｎ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５４２８）、Ｐｉｎ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３５２６）、Ｐｉｎ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ４９ＡＲ７）、ＰＬＡＣ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＢＪ０）、ＰＭＥＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４０９６７）、ＰＭＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９５９０）、ＰＯＴＥＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ５Ａ３Ｅ０）、ＰＯＴＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８６ＹＲ６
）、ＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４Ｒ１Ｅ６）、ＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８３９５）、ＰＲＤＸ５／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３００４４）、ＰＲＭ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４５５４）、プロステイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＪＴ２）、プロテイナーゼ－３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ６ＣＨＥ９）、プロテイナーゼ－３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４１５８）、ＰＳＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５５７８６）、ＰＳＢ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８０６５）、ＰＳＣＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ３ＤＷＩ６）、ＰＳＣＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０４３６５３）、ＰＳＧＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ２５５）、ＰＳＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０４６０９）、ＰＴＰＲＣ（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００２８２９）、ＲＡＢ８Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６１００６）、ＲＡＧＥ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＱ０７）、ＲＡＲＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１０２７６）、ＲＡＳＨ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１１２）、ＲＡＳＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１１６）、ＲＡＳＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１１１）、ＲＧＳ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５５３９）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５３３０）、ＲＨＯＣ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８１３４）、ＲＳＳＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８８６５）、ＲＵ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＨＪ３）、ＲＵ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＨＧ０）、ＲＵＮＸ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１１９６）、Ｓ－１００（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ９ＨＷ３９）、ＳＡＧＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＸＺ１）、ＳＡＲＴ－＿１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０４３２９０）、ＳＡＲＴ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＬ０１）、ＳＡＲＴ－３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５０２０）、ＳＥＰＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１２８８４）、ＳＥＲＰＩＮＢ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３６９５２）、ＳＩＡ７Ｆ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６９Ｘ２）、ＳＩＡ８Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９２１８５）、ＳＩＡＴ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＮＰ４）、ＳＩＲＴ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＯＧ８）、ＳＩＲＴ２／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＩＸＪ６）、ＳＯＸ１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５６６９３）、ＳＰ１７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５５０６）、ＳＰＮＸＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＳ２６）、ＳＰＸＮ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＭＪ０９）、ＳＳＸ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６３８４）、ＳＳＸ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６３８５）、ＳＳＸ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９９０９）、ＳＳＸ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０６０２２４）、ＳＴ１Ａ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５０２２５）、ＳＴＡＧ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｎ３Ｕ４－２）、ＳＴＡＭＰ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＮＦＴ２）、ＳＴＥＡＰ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＡ６３）、ＳＴＥＡＰ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＨＥ８）、サバイビン－２Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５３９２－２）、サバイビン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０１５３９２）、ＳＹＣＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＲＯＩ２）、ＳＹＣＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ７ＺＬＳ９）、ＳＹＣＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５４３１）、ＳＹＣＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ３ＭＨＣ４）、ＳＹＴ－ＳＳＸ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ４ＰＩＶ７）、ＳＹＴ－ＳＳＸ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ４ＰＩＶ８）、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ４ＰＩＶ９）、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ４ＰＩＷ０）、ＴＡＲＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０ＶＧＭ３）、ＴＣＲｇ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＪＧＶ３）、ＴＦ２ＡＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５２６５５）、ＴＧＦＢ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１１３７）、ＴＧＦＲ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３７１７３）、ＴＧＭ－４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ２Ｒ７Ｄ１）、ＴＩＥ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２７６３）、ＴＫＴＬ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５１８５４）、ＴＰＩ／ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６０１７４）、ＴＲＧＶ１１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９６０１）、ＴＲＧＶ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ４Ｄ１Ｘ２）、ＴＲＧＶ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９６０３）、ＴＲＧＶ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９６０４）、ＴＲＰＣ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４８９９５）、ＴＲＰ－ｐ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７Ｚ２Ｗ７）、ＴＳＧ１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＺＷ７）、ＴＳＰＹ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１５３４）、ＴＶＣ＿（ＴＲＧＶ３）（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ１３２３１．１）、ＴＸ１０１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＹ１４－２）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＯＡ０２４ＤＢＧ７）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８Ｂ０８２）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８Ｂ０８６）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｌ８Ｂ０Ｂ９）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：０７５７６７）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１４６７９）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｕ３Ｍ８ＮＯ）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｕ３Ｍ９Ｄ５）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｕ３Ｍ９Ｊ２）、ＴＹＲＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７６４３）、ＴＹＲＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４０１２６）、ＵＰＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＮＺ９）、ＶＥＧＦＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ５Ａ９２４）、ＷＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｈ５ＡＵＹ０）、ＷＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１９５４４）、ＷＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０６２５０）、ＸＡＧＥ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＤ６４）。
Ｖ．９．４． チェックポイント阻害因子
活性化Ｔ細胞において上方制御されてその活性を弱め、したがって腫瘍細胞の殺傷における前記活性化Ｔ細胞の有効性を低減させる、負の制御性Ｔ細胞表面分子が発見された。これらの阻害性分子は、Ｔ細胞共刺激性分子ＣＤ２８との相同性から、負の共刺激性分子と名付けられた。免疫チェックポイントタンパク質とも呼ばれるこれらのタンパク質は、初期活性化シグナルの減衰、正の共刺激の競合、及び抗原提示細胞の直接阻害を含む複数の経路で機能する（Ｂｏｕｒ－Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２４１（１）：１８０－２０５）。
本発明の文脈において、チェックポイント調節剤は、典型的には、免疫チェックポイントタンパク質の機能を調節する、タンパク質（例えば抗体）、ドミナントネガティブ受容体、デコイ受容体、もしくはリガンド、またはそのフラグメントもしくはバリアントなどの分子であり、例えば、チェックポイント阻害因子（または阻害性チェックポイント分子）の活性を阻害するもしくは低減させるか、またはチェックポイント刺激因子（または刺激性チェックポイント分子）の活性を刺激するもしくは増強させる。したがって、本明細書で定義されるチェックポイント調節剤は、チェックポイント分子の活性に影響を与える。
この文脈において、阻害性チェックポイント分子は、チェックポイント阻害因子と定義され、同義に使用され得る。さらに、刺激性チェックポイント分子は、チェックポイント刺激因子と定義され、同義に使用され得る。
好ましくは、チェックポイント調節剤は、アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、リガンド、ドミナントネガティブ受容体、及びデコイ受容体、またはそれらの組み合わせから選択される。
ｍＲＮＡコード抗体を生成及び使用する方法は、当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ２００８／０８３９４９またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０２２６）。
本発明の文脈におけるチェックポイント調節剤によって阻害され得る好ましい阻害性チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３／ＨＡＶＣＲ２、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＣＤ１６０、ＣＤ１５５、ＧＡＬ９、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１及びＶＩＳＴＡである。
本発明の文脈におけるチェックポイント調節剤によって刺激され得る好ましい刺激性チェックポイント分子は、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０及びＣＤ７０である。
好ましい実施形態によれば、本発明のＲＮＡを含む医薬組成物またはワクチンは、本明細書に記載される使用のためのものであり、この使用は、追加の薬学的活性成分として、ＰＤ－１阻害因子、ＰＤ－Ｌ１阻害因子、ＰＤ－Ｌ２阻害因子、ＣＴＬＡ－４阻害因子、ＬＡＧ３阻害因子、ＴＩＭ３阻害因子、ＴＩＧＩＴ－阻害因子、ＯＸ４０刺激因子、４－１ＢＢ刺激因子、ＣＤ４０Ｌ刺激因子、ＣＤ２８刺激因子及びＧＩＴＲ刺激因子からなる群から選択されるチェックポイント調節剤からなる群から選択されるチェックポイント調節剤を含む。
好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるチェックポイント調節剤は、ＰＤ－１経路のメンバーをターゲティングする。ＰＤ－１経路のメンバーは、典型的には、ＰＤ－１シグナル伝達に関連するタンパク質である。一方で、この群は、例えばＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２、ならびにシグナル伝達受容体ＰＤ－１として、ＰＤ－１の上流でＰＤ－１シグナル伝達を誘導するタンパク質を含む。一方で、この群は、ＰＤ－１受容体の下流のシグナル伝達タンパク質を含む。本発明の文脈におけるＰＤ－１経路のメンバーとして特に好ましいのは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２である。
本発明の文脈において、ＰＤ－１経路アンタゴニスト（またはＰＤ－１阻害因子）は、好ましくは、ＰＤ－１経路シグナル伝達、好ましくはＰＤ－１受容体によって媒介されるシグナル伝達を損なうことができる化合物として本明細書で定義される。したがって、ＰＤ－１経路アンタゴニストは、ＰＤ－１経路シグナル伝達をアンタゴナイズすることができるＰＤ－１経路の任意のメンバーに対して指向された任意のアンタゴニストであり得る。
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるチェックポイント調節剤は、ＰＤ－１阻害因子またはＰＤ－Ｌ１阻害因子であり、ＰＤ－１阻害因子は、好ましくは、ＰＤ－１に対して指向されたアンタゴニスト抗体であり、ＰＤ－Ｌ１阻害因子は、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１に対して指向されたアンタゴニスト抗体である。
この文脈において、アンタゴニストは、ＰＤ－１経路の任意のメンバーをターゲティングする、本明細書で定義されるアンタゴニスト抗体、好ましくはＰＤ－１受容体、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に対して指向されたアンタゴニスト抗体であり得る。そのようなアンタゴニスト抗体は、核酸によってコードされてもよい。また、ＰＤ－１経路アンタゴニストは、ＰＤ１リガンドの活性をブロックするＰＤ－１受容体のフラグメントであり得る。Ｂ７－１またはそのフラグメントも、ＰＤ１をアンタゴナイズするリガンドとして作用し得る。さらに、ＰＤ－１経路アンタゴニストは、ＰＤ－１に結合することができるアミノ酸配列を含むが、例えばＰＤ－１及びＢ７－Ｈ１またはＢ７－ＤＬ相互作用を阻害することによりＰＤ－１シグナル伝達を防止する（ＷＯ２０１４／１２７９１７、ＷＯ２０１２０６２２１８）、タンパク質（またはそれをコードする核酸）であり得る。
特に好ましいのは、抗ＰＤ１抗体ニボルマブ（ＭＤＸ－１１０６／ＢＭＳ－９３６５５８／ＯＮＯ－４５３８）（Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２８（１９）：３１６７－７５、ＰＭＩＤ：２０５１６４４６）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １４（１０）：３０４４－５１、ＰＭＩＤ：１８４８３３７０）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ ９００４７５）、ＡＭＰ－２２４、及びＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）である。
また、特に好ましいのは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＭＤＸ－１１０５／ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３６６（２６）：２４５５－６５、ＰＭＩＤ：２２６５８１２８）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、及びアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８）である。
別の実施形態によれば、本明細書で使用されるチェックポイント調節剤はＯＸ４０刺激因子である。ＯＸ４０は受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、抗原によって活性化される哺乳動物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上で発現する。ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ、別称ｇｐ３４、ＡＣＴ－４－Ｌ、及びＣＤ２５２）は、ＯＸ４０受容体と特異的に相互作用するタンパク質である。ＯＸ４０Ｌという用語には、ＯＸ４０リガンド全体、可溶性ＯＸ４０リガンド、及びタンパク質ドメインなどの第２の部分に共有結合したＯＸ４０リガンドの機能的に活性な部分を含む融合タンパク質が含まれる。ＯＸ４０Ｌの定義には、天然に発生するＯＸ４０Ｌとはアミノ酸配列が異なるが、ＯＸ４０受容体に特異的に結合する能力を保持しているバリアントも含まれる。さらに、ＯＸ４０Ｌの定義には、ＯＸ４０の生物学的活性を増強するそのバリアントが含まれる。ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０の生物学的活性、例えばＯＸ４０によって媒介されるシグナル伝達を誘導または増強する分子である。ＯＸ４０アゴニストは、好ましくは、ＯＸ４０への特異的結合が可能な結合分子として本明細書で定義される。したがって、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０シグナル伝達を刺激することができる任意のアゴニストであり得る。この文脈において、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０に結合するアゴニスト抗体であり得る。
ＯＸ４０アゴニスト及び抗０Ｘ４０モノクローナル抗体については、ＷＯ１９９５／０２１２５１、ＷＯ１９９５／０１２６７３及びＷＯ１９９５／２１９１５に記載されている。特に好ましいのは、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインに対して指向されたマウス抗０Ｘ４０モノクローナル抗体である抗０Ｘ４０抗体９Ｂ１２である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２９（６）：５７５－５８５）。
別の実施形態では、本明細書で使用されるチェックポイント調節剤は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗Ｖｉｓｔａ、抗Ｔｉｍ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ－３、及び抗ＢＴＬＡからなる群から選択されるアンタゴニスト抗体である。
好ましくは、チェックポイント調節剤として使用され得る抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞毒性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）に対して指向されている。ＣＴＬＡ－４は主に、Ｔ細胞の細胞内コンパートメント内で発現する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したナイーブＴ細胞への強力または長期的な刺激の後、ＣＴＬＡ－４が細胞表面に輸送され、免疫学的シナプスに集中する。次いで、ＣＴＬＡ－４はＣＤ２８とＣＤ８０／ＣＤ８６を競合し、Ａｋｔシグナル伝達に対する作用を介してＴＣＲシグナル伝達を下方制御する。したがって、ＣＴＬＡ－４はシグナル抑制因子として生理学的に機能する（Ｗｅｂｅｒ， Ｊ． ２０１０． Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３７（５）：４３０－９）。
好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡを含む医薬組成物またはワクチンは、本明細書に記載される使用のためのものであり、この使用は、追加の薬学的活性成分としてＣＴＬＡ４アンタゴニストを含み、これは、好ましくはＣＴＬＡ４に対して指向されたアンタゴニスト抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体）である。本明細書で使用される「ＣＴＬＡ４アンタゴニスト」という用語は、ＣＴＬＡ４の生理学的機能をアンタゴナイズする抗体などの任意の化合物を含む。本発明の文脈において、「抗ＣＴＬＡ４抗体」という用語は、ＣＴＬＡ４に対して指向されたアンタゴニスト抗体（または前記抗体の機能的フラグメントもしくはバリアント）、または前記アンタゴニスト抗体（またはその機能的フラグメント）をコードする核酸、好ましくはＲＮＡを指し得る。抗ＣＴＬＡ４抗体の機能的フラグメントまたはバリアントは、好ましくはＣＴＬＡ４アンタゴニストとして作用する。より好ましくは、「抗ＣＴＬＡ４抗体」という用語は、ＣＴＬＡ４に対して指向されたモノクローナル抗体（またはそのような抗体の機能的フラグメントもしくはバリアント）、またはＣＴＬＡ４に対して指向されたモノクローナル抗体（またはそのような抗体の機能的フラグメントもしくはバリアント）をコードする核酸を指す。本明細書で使用される「抗ＣＴＬＡ４抗体」という用語は、重鎖または軽鎖をそれぞれ指す場合もあれば、抗体の両鎖（重鎖及び軽鎖）、またはこれらの鎖のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを指す場合もある。好ましくは、本明細書で使用される抗ＣＴＬＡ４抗体のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは本明細書に記載されるような機能的フラグメントまたはバリアントである。
特に好ましいのは、抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、トレメリムマブ、及びＡＧＥＮ－１８８４である。本明細書で使用されるさらなる好ましい抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＢＭＳ７３４０１６、ＢＭＳ－７３４０１６、ＢＭＳ７３４０１６、ＭＤＸ０１０、ＭＤＸ１０１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、ＭＤＸ－ＣＴＬＡ－４、ＭＤＸ－ＣＴＬＡ４、ＭＤＸ０１０、Ｗｉｎｇｌｏｒｅ、及びＹｅｒｖｏｙ、またはこれらの抗体のいずれか１つの機能的フラグメントもしくはバリアントを含む。
さらなる実施形態によれば、本明細書で使用されるチェックポイント調節剤は、表１に記載される少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントもしくはバリアントである。
Ｖ．５． 併用がん療法
より好ましくは、本発明のＲＮＡを含む医薬組成物もしくはワクチン、それらの組み合わせ、または前記ＲＮＡ（複数可）を含む医薬組成物もしくはワクチンを受ける対象は、本明細書に記載される腫瘍もしくはがん疾患を患っており、化学療法（例えば第一選択または第二選択の化学療法）、放射線療法、化学放射線療法（化学療法と放射線療法との組み合わせ）、キナーゼ阻害因子、抗体療法及び／またはチェックポイント調節剤（例えば、ＣＴＬＡ４阻害因子、ＰＤ１経路阻害因子）を受けた、もしくは受ける患者か、または上記の処置のうちの１つ以上を受けた後に部分的応答もしくは安定疾患を達成した患者である。より好ましくは、対象は、本明細書に記載される腫瘍またはがん疾患を患っており、本明細書に記載されるこれらの疾患のいずれかで従来使用されている化合物を受けた、または受ける患者であり、より好ましくは、チェックポイント調節剤を受ける、または受けた患者である。
次の化合物は、好ましくは標準療法において使用され、本発明のＲＮＡを含む医薬組成物またはワクチンと組み合わせて適用され得る好ましい化合物である：セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パクリタキセルアルブミン結合型（Ａｂｒａｘａｎｅ）、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）（ＴＳ－１）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｄｏｘｅｌ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ Ａｎ、Ｄｏｃｅｌ、Ｎａｎｏｘｅｌ Ｍ、Ｔａｕｔａｘ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ＡＳ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－Ｍ、Ｑｖｉｄａｄｏｔａｘ、Ｒｅｌｉｄｏｃｅ、Ｔａｘｅｌｏ、Ｏｎｃｏｄｏｃｅｌ、Ｄｏｘｏｔｅｌ、Ｐａｃａｎｃｅｒ、Ｄｏｃｅｔｒｕｓｔ、Ｄｏｄｅｔａｘ、Ｄｏｄａｂｕｒ、Ｓｏｕｌａｘｃｉｎ、Ｔａｘｅｄｏｌ、Ｄｏｃｅｆｉｍ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｒｉｂｏｄｏｃｅｌ、Ｃｒｉｔｉｄｏｃ、Ａｓｏｄｏｃ、Ｃｈｅｍｏｄｏｃ、Ｄｏｃｅｌｉｂｂｓ、Ｄｏｃｅｎａｔ、Ｄｉｎｃｉｌｅｚａｎ、Ｄｏｓｔｒａｄｉｘｉｎｏｌ、Ｄｏｃｅｆｒｅｚ、Ｃａｍｉｔｏｔｉｃ、Ｏｎｃｏｔａｘｅｌ、Ｓｏｍａｔｉｘｅｌ、Ｂｅｌｏｔａｘｅｌ、Ｑｖｉｄａｄｏｔａｘ、Ｔａｘｃｅｕｓ、Ｃｅｔａｄｏｃｕｒｅ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ＣＴ、Ｔｅｖａｘｔｅｒ、Ｄｏｃｉｒｅｎａ、Ｅｕｒｏｔｅｒｅ、Ａｘｔｅｒｅ、Ｃｅｌｏｔａｘ、Ｔａｘａｎｉｔ、Ｄｒｏｂａｎｏｓ、Ｃｅｔａｄｏ、Ｄｏｘｏｃａｄ、Ｔａｘｃｅｕｓ、Ｅｇｉｄｏｘ、Ｔｅｄｏｃａｄ、Ｄｏｃｅｃａｄ、Ｄｏｃｅｌｅｘ、Ｄｏｃｅｔａｘ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｄｏｃｅｔｅｒｅ、Ｄｏｔａｘ、Ｔａｘｕｂａ、Ｍｏｎｏｔａｘｅｌ、Ｔａｃｅｅｄｏ、Ｄｅｔａｘｌ、Ｄｏｃｅｔ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｆｅｒｄｏｔａｘ、Ｗｉｎｔａｘｅｌ）、（テガフール＋ウラシル）（Ｕｆｔ、Ｕｆｔ Ｅ、Ｔｅｆｕｄｅｘ、Ｕｎｉｔｏｒａｌ、Ｌｕｐｏｒａｌ、Ｔａｇｒａｃｉｌ）、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）ＯＤＴ（ＴＳ－１配合ＯＤ）、ブレオマイシン硫酸塩（Ｔｅｃｎｏｍｉｃｉｎａ、Ｃｉｎａｌｅｏ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、Ｂｌｏｉｃｉｎ－Ｓ、Ｂｏｎａｒ、Ｂｌｅｏｃｉｎ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、Ｂｌｅｏ、Ｂｌｅｏｃｅｌ、Ｂｌｅｏｔｅｘ、Ｏｎｃｏｂｌｅｏ、Ｂｌｅｏｎｃｏ、Ｂｌｅｏｓｏｌ、Ｌｙｏｂｌｅ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、Ｂｌｅｎａｍａｘ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ、Ｂｌｅｏｍｉｃｉｎａ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ Ｂｅｌｌｏｎ、Ｂｌｅｏｐｒｉｍ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、Ｐｌａｔａｍｉｎｅ ＣＳ、Ｃａｒｂａｃｃｏｒｄ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎａ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｏ、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ、Ｃａｒｂｏｓｉｎ、Ｔｅｃｎｏｃａｒｂ、Ｃａｒｂｏｍｅｒｃｋ、Ｐａｒａｃｔ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｅ ＣＴＲＳ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｅ Ｉｎｔｓｅｌ Ｃｈｉｍｏｓ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、Ｃａｒｂｏｋｅｍ、Ｃａｒｂｏｔｉｎｏｌ、Ｆａｕｌｄｃａｒｂｏ、Ｅｖｏｃａｒｂ、Ｃｉｔｏｐｌａｔｉｎａ、Ｐｌａｔｉｎ）、シプロフロキサシン（Ｈｙｐｏｆｌｏｘ、Ｕｆｅｘｉｌ）、シプロフロキサシン塩酸塩（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ Ｐｈａｒｍａ、Ｐｒｏｄｉｎ、Ｃｉｐｒｏｘｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｓｔｒｉｔｉｎ、Ｉｆａｐｌａ、Ａｃｃｏｃｉｔ、Ｕｎｉｓｔｉｎ、Ｃａｎｃｅｒｔｉｎ、Ｃｉｓｐｌａｎ、Ｃｉｔｏｐｌａｘ、Ｎｕｏｘｉｎ、Ｐｌａｃｉｓ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｏ、Ｄｉｓｐｌａｎｏｒ、Ｒａｎｄａ、Ｃｉｓｐｌａ、Ｆａｕｌｄｃｉｓｐｌａ、Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ、Ｐｌａｔｉｎｅｘ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ、Ｐｌａｔｉｎｅｘ、Ｒｉｂｏｐｌａｔｉｎ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｅ、Ｐｌａｔｉｓｔｉｎｅ ＣＳ、Ｐｌａｔｏｓｉｎ、Ａｃｃｏｃｉｔ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｏ）シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ、Ｍａｙ Ｖｌａｄｉｍｉｒ）、ドキソルビシン（ドキソルビシン塩酸塩、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ＲＤＦ、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ＰＦＳ）、エピルビシン、塩酸塩（Ｂｒｅｃｉｌａ、Ｃｌｏｒｉｄｒａｔｏ Ｄｅ Ｅｐｉｒｒｕｂｉｃｉｎａ、Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ、Ｆａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎａ、Ｎｕｏｖｏｄｏｘ、Ａｄｎｅｘａ、４－Ｅｐｐｅｄｏ、Ｆａｖｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（Ａｇｉｃｉｌ、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、Ｆａｕｌｄｆｌｕｏｒ、Ｏｎｃｏｕｒｃｉｌ、Ｆｌｏｃｉｌ、５ Ｆｌｕｃｅｌ）、葉酸＋メトトレキサート（Ｔｒｕｘｏｆｏｌ）、ヒトアデノウイルス５型（組換え）（Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）、ヒドロキシ尿素（Ｏｘｙｒｅａ、Ｄｕｒｅａ、Ｍｙｅｌｏｓｔａｔ、Ｒｉｂｏｒｅａ、Ｕｎｉｄｒｅａ、Ｏｎｄｒｅａ、Ｈｙｄｒａｎ、Ｌｅｕｋｏｃｅｌ、Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ、Ｈｙｄｒｅａ）、イホスファミド（Ｈｏｌｏｘａｎ、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ ＥＧ）、レバミソール（Ｚｉｒｓｏｌ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（Ｔｒａｔｏｂｅｎ、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｆｒｅｓｅｘａｔｅ、Ｎｅｏｍｅｔｈｏ、Ｆａｕｌｄｍｅｔｒｏ、メトトレキサートナトリウム、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ、Ｈｙｔａｓ、Ｍｅｔｈａｃｃｏｒｄ、Ｍｅｔｈｏｆｉｌｌ、Ｍｅｔｏｔｒｅｘａｔｏ、Ｔｒａｘａｃｏｒｄ、Ｐｌａｓｔｏｍｅｔ、Ｔｅｖａｔｒｅｘ、Ｍｅｔｒｅｘ、Ｃａｄｉｔｒｅｘ、Ｃａｒｄｉｔｒｅｘ、Ｖｉｂｚｉ、Ｉｍｕｔｒｅｘ、Ｂｉｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｍｅｔｈｏｒｅｘ、Ｍｅｘａｔｅ、Ｎｅｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｏｎｃｏｔｒｅｘ、Ｒｅｍｔｒｅｘ、Ｔｒｉｘｉｌｅｍ、Ｈｉ－Ｔｒｅｘ、Ｍｅｔｏｒｅｘ、Ｔｒｅｘ、Ｕｎｉｔｒｅｘａｔｅ、Ｅｂｅｔｒｅｘａｃ、Ｆａｕｌｄｅｘａｔｏ、Ｌａｎｔａｒｅｌ、Ｍａｘｔｒｅｘ、Ｍｉａｎｔｒｅｘ ＣＳ、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｆｏｌｅｘ、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ、Ｔｅｖａｍｅｔｈｏ、Ｔｒｅｘａｌｌ、Ｅｍｔｈｅｘａｔｅ、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ、Ｍｅａｄｏｗ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ、Ｍｉｔｏｎｃｏ、Ｌｙｏｍｉｔ）、ネダプラチン（Ｊｉｅｂａｉｓｈｕ、Ａｏｘｉａｎｄａ、Ａｑｕｐｌａ）、ニメスリド（Ｎｉｍｕｌｉｄ）、ニモツズマブ（Ｂｉｏｍａｂ ＥＧＦＲ、Ｌａｅｄｅｍａｂ）、ニトロフラントイン（Ｆｕｒａｔｓｉｌｉｎ）、オフロキサシン（Ｅｎｔｏｆ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｔａｘｏｌ）、ペプロマイシン硫酸塩（Ｐｅｐｌｅｏ）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）、ピラルビシン（ピラルビシン塩酸塩、Ｔｈｅｒａｒｕｂｉｃｉｎ、Ｐｉｎｏｒｕｂｉｎ）、グリシジダゾールナトリウム（ＣＭＮａ）、テガフール（Ｕｔｅｆｏｓ、Ｉｃａｒｕｓ、Ｆｕｔｒａｆｕｌ、テガフールギメラシルオテラシルカリウム）、テモポルフィン（Ｆｏｓｃａｎ）、トポテカン塩酸塩（トポテカン）、ウベニメクス（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ビンブラスチン硫酸塩（ビンブラスチン、Ｖｂｌａｓｔｉｎ）、ビンクリスチン硫酸塩（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ビンクリスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ、Ｓｕｔｉｖｉｎ、ビンデシン硫酸塩（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｅ Ｑｕａｌｉｍｅｄ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｅ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｏ、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（Ｋａｍｄｏｃｏｎ、Ｎａｌｔｏｘａｔｅｒ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｅ、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート（メトトレキサートナトリウム、Ｍｅｘａｔｅ、Ｍｅｘａｔｅ Ａｑ、Ｂｉｏｍｅｔｒｏｘ、Ｍｅｄｓａｔｒｅｘａｔｅ、Ｏｔａｘｅｍ）、ビンクリスチン硫酸塩（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、フルオロウラシル、スニチニブリンゴ酸塩、アシトレチン、フィブリンシーラント、セツキシマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、シスプラチン；ドセタキセル；フルオロウラシル、未開示の抗がん薬、ゲフィチニブ、プラバスタチンナトリウム、シロリムス、未開示の化学療法、シスプラチン；ドセタキセル；フルオロウラシル、シロリムス、フルオロウラシル；未開示のタキサン、アミノレブリン酸メチル塩酸塩、シスプラチン；ドセタキセル；フルオロウラシル、エルロチニブ塩酸塩、セツキシマブ、イミキモド、未開示の漢方薬、アスピリン；エナラプリルマレイン酸塩、未開示の化学療法、セツキシマブ、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）；カルボプラチン；シスプラチン、シスプラチン；フルオロウラシル；ニモツズマブ、カルボプラチン；パクリタキセルアルブミン結合型、シスプラチン；ネダプラチン、ブレオマイシン、ネダプラチン、シスプラチン；パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン結合型、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）、ブレオマイシン；未開示の化学療法、アパチニブ；ドセタキセル、未開示の免疫調節補助剤、ＢＣＭ－９５、アミノレブリン酸塩酸塩、ネダプラチン、シスプラチン；パリフェルミン、セツキシマブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、ベラゲンプマツセル－Ｌ、シスプラチン；チラパザミン、シスプラチン；チラパザミン、シスプラチン；ゲムシタビン；パクリタキセル；トポテカン；ビノレルビン、シスプラチン；フルオロウラシル、パニツムマブ、カルボプラチン；ドセタキセル；ゲムシタビン塩酸塩；ビノレルビン酒石酸塩、アミホスチン；フルオロウラシル、シスプラチン；フルオロウラシル、カルボプラチン；パクリタキセル、チラパザミン、シスプラチン；エポエチンアルファ、フィギツムマブ、メルファラン；腫瘍壊死因子ａｌｆ、シスプラチン、シスプラチン；フルオロウラシル、シスプラチン；未開示の化学療法、ドセタキセル、コンツスジーンラデノベック、シスプラチン；フルオロウラシル；パクリタキセル、ドセタキセル、ヒトパピローマウイルス［血清型１６、１８］（二価）ワクチン、イソトレチノイン、シスプラチン；フルオロウラシル、ミソニダゾール、パクリタキセル、パリフェルミン、エンドスタチン、ピロカルピン、シスプラチン；ドセタキセル；フィルグラスチム；フルオロウラシル；パクリタキセル、シスプラチン；ドセタキセル；フィルグラスチム；フルオロウラシル；パクリタキセル、シスプラチン；イリノテカン塩酸塩、シスプラチン；ゲムシタビン、シスプラチン；エピルビシン；フルオロウラシル；未開示の化学療法、アミノレブリン酸メチル塩酸塩、カルボプラチン；パクリタキセル、カルボゲン；二酸化炭素；ナイアシンアミド、シスプラチン；フルオロウラシル、タリモジーンラハーパレプベック、エポエチンアルファ、シスプラチン；フルオロウラシル；パニツムマブ、シスプラチン；フルオロウラシル、シスプラチン；フルオロウラシル、アルデスロイキン、シスプラチン；フルオロウラシル、シスプラチン；パクリタキセル、シスプラチン；フルオロウラシル、フルオロウラシル；ロイコボリン；ロバプラチン、シスプラチン、シスプラチン；エチルメルカプタン；イホスファミド；メスナ；ミトラクトール、ドキソルビシン；レバミソール、（テガフール＋ウラシル）、シスプラチン；フルオロウラシル、シスプラチン；ビノレルビン、カルボプラチン；シスプラチン；ゲムシタビン塩酸塩、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ；ドキソルビシン、カペシタビン；シスプラチン；フルオロウラシル；パクリタキセル、フルオロウラシル；ロイコボリン；メトトレキサート、ｒＡｄ－ｐ５３、セツキシマブ；シスプラチン；ドセタキセル、ＰＶ－１０、アミノレブリン酸メチル塩酸塩、シスプラチン；フルオロウラシル、パクリタキセル；トポテカン塩酸塩、カルボプラチン；シスプラチン；パクリタキセル、シスプラチン；トポテカン塩酸塩、シスプラチン；エトポシド、ドセタキセル；フルオロウラシル、アスピリン、シスプラチン；ゲムシタビン、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＣＤ２、シスプラチン；ドセタキセル、フォスブレタブリントロメタミン、パニツムマブ、フルオロウラシル、パクリタキセル、カルボプラチン；シスプラチン；ドセタキセル；フルオロウラシル、フルオロウラシ
ル、エルロチニブ塩酸塩、シスプラチン；未開示の化学療法；ビノレルビン、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）；カルボプラチン、セツキシマブ、コンツスジーンラデノベック、セツキシマブ、アミノレブリン酸メチル塩酸塩、シクロホスファミド、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）；シスプラチン、パクリタキセルアルブミン結合型、カルボプラチン；パクリタキセル、シスプラチン；ゲムシタビン、カペシタビン；シスプラチン、ドセタキセル、Ｚ－１００、シスプラチン；イホスファミド；パクリタキセル、ニモツズマブ、イリノテカン塩酸塩、セレコキシブ；メトトレキサート、Ｎｕｔｒｉｓｏｎ、カルボプラチン；シスプラチン；フルオロウラシル；パクリタキセル、シスプラチン；パクリタキセル、シスプラチン；ドセタキセル；ビノレルビン、パクリタキセル、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）；シスプラチン、カルボプラチン；パクリタキセル、アミノレブリン酸メチル塩酸塩、Ａｉｂｉｎ、シスプラチン；フルオロウラシル、ポルフィマーナトリウム、カルボプラチン；シスプラチン；トコトリエノール；ビノレルビン、（ギメラシル＋オテラシル＋テガフール）；シスプラチン；パクリタキセル、ドセタキセル、イピリムマブ、シスプラチン、ＶＢ－４８４７、セレコキシブ；サリドマイド、シスプラチン；エピルビシン；フルオロウラシル、シスプラチン；フルオロウラシル、フルオロウラシル、カルボプラチン；パクリタキセル、セツキシマブ；シスプラチン；ドセタキセル、自家サイトカイン誘導キラー細胞、シスプラチン；ドセタキセル；フルオロウラシル、シスプラチン；エピルビシン；フルオロウラシル、テルゲンプマツセル－Ｌ、セツキシマブ；シスプラチン；ドセタキセル、Ｅｌｅｎｔａｌ、シスプラチン；ニモツズマブ；パクリタキセル、エイコサペンタエン酸；未開示の栄養補助剤、パルボシクリブ、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ニモツズマブ、アパトルセン、及びダコミチニブ。
本明細書で使用される場合、「腫瘍」、「がん」または「がん疾患」という用語は、好ましくは、腺嚢癌腫（腺様嚢胞癌）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹膠腫、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発不明癌、原発性中枢神経系リンパ腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫／悪性膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、結腸癌、菌状息肉症及びセザリー症候群を含む皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリーのユーイング肉腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌（胃のがん）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外、または卵巣の胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の膠腫、小児大脳星状細胞腫、小児視経路及び視床下部膠腫、胃カルチノイド、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連癌、下咽頭癌、小児視床下部及び視経路膠腫、眼内黒色腫、島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、口唇口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、小児髄芽腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、成人悪性中皮腫、小児中皮腫、頭部癌または頸部癌、口のがん、小児多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、多発性骨髄腫（骨髄癌）、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、小児松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫（腎臓癌）、腎盂尿管癌、網膜芽細胞腫、小児横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング腫瘍ファミリー肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、軟部組織肉腫（ＳＴＳ）、小児テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌（セミノーマ及び非セミノーマ）、喉のがん、小児胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、小児甲状腺癌、腎盂尿管移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、小児視経路及び視床下部膠腫、外陰癌、ならびに小児ウィルムス腫瘍（腎臓癌）からなる群から選択される悪性疾患を指す。
Ｖ．９．アレルギー性抗原
アレルギーまたはアレルギー性疾患に関連する抗原（アレルゲンまたはアレルギー性抗原）は、好ましくは、以下からなるリストから選択される供給源に由来する。
Ａｃａｒｕｓ属種（Ａｃａ ｓ １、Ａｃａ ｓ １０、Ａｃａ ｓ １０．０１０１、Ａｃａ ｓ １３、Ａｃａ ｓ １３．０１０１、Ａｃａ ｓ ２、Ａｃａ ｓ ３、Ａｃａ ｓ ７、Ａｃａ ｓ ８）、Ａｃａｎｔｈｏｃｙｂｉｕｍ属種（Ａｃａ ｓｏ １）、Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ属種（Ａｃａ ｖ ３、Ａｃａ ｖ ３．０１０１）、Ａｃｅｔｅｓ属種（Ａｃｅ ｊａ １）、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ属種（Ａｃｔ ａ １、Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｃ １０、Ａｃｔ ｃ １０．０１０１、Ａｃｔ ｃ ２、Ａｃｔ ｃ ４、Ａｃｔ ｃ ５、Ａｃｔ ｃ ５．０１０１、Ａｃｔ ｃ ８、Ａｃｔ ｃ ８．０１０１、Ａｃｔ ｃキチナーゼ、Ａｃｔ ｄ １、Ａｃｔ ｄ １．０１０１、Ａｃｔ ｄ １０、Ａｃｔ ｄ １０．０１０１、Ａｃｔ ｄ １０．０２０１、Ａｃｔ ｄ １１、Ａｃｔ ｄ １１．０１０１、Ａｃｔ ｄ ２、Ａｃｔ ｄ ２．０１０１、Ａｃｔ ｄ ３、Ａｃｔ ｄ ３．０１０１、Ａｃｔ ｄ ３．０２、Ａｃｔ ｄ ４、Ａｃｔ ｄ ４．０１０１、Ａｃｔ ｄ ５、Ａｃｔ ｄ ５．０１０１、Ａｃｔ ｄ ６、Ａｃｔ ｄ ６．０１０１、Ａｃｔ ｄ ７、Ａｃｔ ｄ ７．０１０１、Ａｃｔ ｄ ８、Ａｃｔ ｄ ８．０１０１、Ａｃｔ ｄ ９、Ａｃｔ ｄ ９．０１０１、Ａｃｔ ｄキチナーゼ、Ａｃｔ ｅ １、Ａｃｔ ｅ ５）、Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ属種（Ａｃｙ ｐｉ ７、Ａｃｙ ｐｉ ７．０１０１、Ａｃｙ ｐｉ ７．０１０２）、Ａｄｅｎｉａ属種（Ａｄｅ ｖ ＲＩＰ）、Ａｅｄｅｓ属種（Ａｅｄ ａ １、Ａｅｄ ａ １．０１０１、Ａｅｄ ａ ２、Ａｅｄ ａ ２．０１０１、Ａｅｄ ａ ３、Ａｅｄ ａ ３．０１０１、Ａｅｄ ａ ４、Ａｅｄ ａ ７、Ａｅｄ ａ ７．０１０１、Ａｅｄ ａ ７．０１０２、Ａｅｄ ａ ７．０１０３、Ａｅｄ ａ ７．０１０４、Ａｅｄ ａ ７．０１０５、Ａｅｄ ａ ７．０１０６、Ａｅｄ ａ ７．０１０７、Ａｅｄ ａ ７．０１０８、Ａｅｄ ａ ７．０１０９、Ａｅｄ ａ ７．０１１０、Ａｅｄ ａ ７．０１１１、Ａｅｄ ａｌ １、Ａｅｄ ａｌ ３、Ａｅｄ ａｌ ３７ｋＤ、Ａｅｄ ｖ ３７ｋＤ、Ａｅｄ ｖ ６３ｋＤ）、Ａｅｇｉｌｏｐｓ属種（Ａｅｇ ｔａ ２８、Ａｅｇ ｔａアルファグリアジン、Ａｅｇ ｕｍ ２８、Ａｅｇ ｕｎ ２８）、Ａｅｔｈａｌｏｐｅｒｃａ属種（Ａｅｔ ｒｏ １）、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属種（Ａｇｒ ｃ ７）、Ａｇｒｏｓｔｉｓ属種（Ａｇｒ ｃａ １、Ａｇｒ ｃａ ５、Ａｇｒ ｇ １、Ａｇｒ ｇ ４、Ａｇｒ ｓ ５）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種（Ａｇｒ ｓｐ ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ）、Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ属種（Ａｉｌ ｍｅホスビチン、Ａｉｌ ｍｅ ＴＣＴＰ）、Ａｉｘ属種（Ａｉｘ ｇａ １、Ａｉｘ ｓｐ １）、Ａｌｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属種（Ａｌｅ ｏ １、Ａｌｅ ｏ １０、Ａｌｅ ｏ １０．０１０１、Ａｌｅ ｏ １０．０１０２、Ａｌｅ ｏ １３、Ａｌｅ ｏ １４、Ａｌｅ ｏ ２、Ａｌｅ ｏ ２０、Ａｌｅ ｏ ３、Ａｌｅ ｏ ５、Ａｌｅ ｏ ７、Ａｌｅ ｏ ８、Ａｌｅ ｏ ９）、Ａｌｌｉｕｍ属種（Ａｌｌ ａ ３、Ａｌｌ ａアリインリアーゼ、Ａｌｌ ｃ ３、Ａｌｌ ｃ ３０ｋＤ、Ａｌｌ ｃ ４、Ａｌｌ ｃアリインリアーゼ、Ａｌｌ ｐアリインリアーゼ、Ａｌｌ ｓアリインリアーゼ）、Ａｌｎｕｓ属種（Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｎ ｇ １．０１０１、Ａｌｎ ｇ １／Ｂｅｔ ｖ １／Ｃｏｒ ａ １ ＴＰＣ７、Ａｌｎ ｇ １／Ｂｅｔ ｖ １／Ｃｏｒ ａ １ ＴＰＣ９、Ａｌｎ ｇ ２、Ａｌｎ ｇ ４、Ａｌｎ ｇ ４．０１０１）、Ａｌｏｐｏｃｈｅｎ属種（Ａｌｏ ａｅ １）、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ属種（Ａｌｏ ｐ １、Ａｌｏ ｐ ５）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属種（Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ １．０１０１、Ａｌｔ ａ １．０１０２、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １０．０１０１、Ａｌｔ ａ １２、Ａｌｔ ａ １２．０１０１、Ａｌｔ ａ １３、Ａｌｔ ａ １３．０１０１、Ａｌｔ ａ ２、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ３．０１０１、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ４．０１０１、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ５．０１０１、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ６．０１０１、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ７．０１０１、Ａｌｔ ａ ７０ｋＤ、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ ８．０１０１、Ａｌｔ ａ ９、Ａｌｔ ａ ＭｎＳＯＤ、Ａｌｔ ａ ＮＴＦ２、Ａｌｔ ａ ＴＣＴＰ、Ａｌｔ ａｒ １、Ａｌｔ ａｒｇ １、Ａｌｔ ｂ １、Ａｌｔ ｂｌ １、Ａｌｔ ｂｒ １、Ａｌｔ ｃ １、Ａｌｔ ｃａ １、Ａｌｔ ｃｅ １、Ａｌｔ ｃｈ １、Ａｌｔ ｃｉ １、Ａｌｔ ｃｏ １、Ａｌｔ ｃｒ １、Ａｌｔ ｃｔ １、Ａｌｔ ｃｕ １、Ａｌｔ ｃｙ １、Ａｌｔ ｄ １、Ａｌｔ ｄｕ １、Ａｌｔ ｅ １、Ａｌｔ ｅｔ １、Ａｌｔ ｅｕ １、Ａｌｔ ｇａ １、Ａｌｔ ｇｒ １、Ａｌｔ ｊ １、Ａｌｔ Ｉ １、Ａｌｔ ｌｏ １、Ａｌｔ ｍ １、Ａｌｔ ｍｅ １、Ａｌｔ ｍｉ １、Ａｌｔ ｍｏ １、Ａｌｔ ｏ １、Ａｌｔ ｐ １、Ａｌｔ ｐｈ １、Ａｌｔ ｐｏ １、Ａｌｔ ｐｓ １、Ａｌｔ ｒ １、Ａｌｔ ｓ １、Ａｌｔ ｓｅ １、Ａｌｔ ｓｍ １、Ａｌｔ ｓｏ １、Ａｌｔ ｓｕ １、Ａｌｔ ｔ １、Ａｌｔ ｔｅ １、Ａｌｔ ｔｏ １）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ属種（Ａｍａ ｒ ２、Ａｍａ ｒ ２．０１０１、Ａｍａ ｖ ２、Ａｍａ ｖ ２．０１０１、Ａｍａ ｖ ２．０２０１）、Ａｍｂｒｏｓｉａ属種（Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ １．０１０１、Ａｍｂ ａ １．０２０１、Ａｍｂ ａ １．０２０２、Ａｍｂ ａ １．０３０１、Ａｍｂ ａ １．０３０２、Ａｍｂ ａ １．０３０３、Ａｍｂ ａ １．０３０４、Ａｍｂ ａ １．０３０５、Ａｍｂ ａ １．０４０１、Ａｍｂ ａ １．０４０２、Ａｍｂ ａ １．０５０１、Ａｍｂ ａ １．０５０２、Ａｍｂ ａ １０、Ａｍｂ ａ １０．０１０１、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ３．０１０１、Ａｍｂ ａ ４、Ａｍｂ ａ ４．０１０１、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ５．０１０１、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ６．０１０１、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ７．０１０１、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ８．０１０１、Ａｍｂ ａ ８．０１０２、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ ９．０１０１、Ａｍｂ ａ ９．０１０２、Ａｍｂ ａ ＣＰＩ、Ａｍｂ ｐ １、Ａｍｂ ｐ ５、Ａｍｂ ｐ ５．０１０１、Ａｍｂ ｐ ５．０２０１、Ａｍｂ ｔ ５、Ａｍｂ ｔ ５．０１０１、Ａｍｂ ｔ ８）、Ａｍｍｏｔｈｅａ属種（Ａｍｍ ｈ ７、Ａｍｍ ｈ ７．０１０１）、Ａｎａｄａｒａ属種（Ａｎａ ｂｒ １）、Ａｎａｎａｓ属種（Ａｎａ ｃ １、Ａｎａ ｃ １．０１０１、Ａｎａ ｃ ２、Ａｎａ ｃ ２．０１０１、Ａｎａ ｃ ２．０１０１（ＭＵＸＦ３））、Ａｎａｓ属種（Ａｎａ ｃａ １）、Ａｎａｒｈｉｃｈａｓ属種（Ａｎａ Ｉ １）、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ属種（Ａｎａ ｏ １、Ａｎａ ｏ １．０１０１、Ａｎａ ｏ １．０１０２、Ａｎａ ｏ ２、Ａｎａ ｏ ２．０１０１、Ａｎａ ｏ ３、Ａｎａ ｏ ３．０１０１）、Ａｎａｓ属種（Ａｎａ ｐ １、Ａｎａ ｐ ２、Ａｎａ ｐ ３）、Ａｎｇｕｉｌｌａ属種（Ａｎｇ ａ １、Ａｎｇ ｊ １）、Ａｎｉｓａｋｉｓ属種（Ａｎｉ ｓ １、Ａｎｉ ｓ １．０１０１、Ａｎｉ ｓ １０、Ａｎｉ ｓ １０．０１０１、Ａｎｉ ｓ １１、Ａｎｉ ｓ １１．０１０１、Ａｎｉ ｓ １２、Ａｎｉ ｓ １２．０１０１、Ａｎｉ ｓ ２、Ａｎｉ ｓ ２．０１０１、Ａｎｉ ｓ ２４ｋＤ、Ａｎｉ ｓ ３、Ａｎｉ ｓ ３．０１０１、Ａｎｉ ｓ ４、Ａｎｉ ｓ ４．０１０１、Ａｎｉ ｓ ５、Ａｎｉ ｓ ５．０１０１、Ａｎｉ ｓ ６、Ａｎｉ ｓ ６．０１０１、Ａｎｉ ｓ ７、Ａｎｉ ｓ ７．０１０１、Ａｎｉ ｓ ８、Ａｎｉ ｓ ８．０１０１、Ａｎｉ ｓ ９、Ａｎｉ ｓ ９．０１０１、Ａｎｉ ｓ ＣＣＯＳ３、Ａｎｉ ｓチトクロームＢ、Ａｎｉ ｓ ＦＢＰＰ、Ａｎｉ ｓ ＮＡＤＨＤＳ４Ｌ、Ａｎｉ ｓ ＮＡＲａＳ、Ａｎｉ ｓ ＰＥＰＢ、Ａｎｉ ｓトロポニン）、Ａｎｎｏｎａ属種（Ａｎｎ ｃキチナーゼ）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ属種（Ａｎｏ ｄａ １７、Ａｎｏ ｄａ １７．０１０１、Ａｎｏ ｄａ ２７、Ａｎｏ ｄａ ２７．０１０１、Ａｎｏ ｄａ ７、Ａｎｏ ｄａ ７．０１０１、Ａｎｏ ｇ ７、Ａｎｏ ｇ ７．０１０１）、Ａｎｓｅｒ属種（Ａｎｓ ａ １、Ａｎｓ ａ ２、Ａｎｓ ａ ３、Ａｎｓ ｉｎ １）、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ属種（Ａｎｔ ｏ １、Ａｎｔ ｏ １．０１０１、Ａｎｔ ｏ １２、Ａｎｔ ｏ １３、Ａｎｔ ｏ ２、Ａｎｔ ｏ ４、Ａｎｔ ｏ ５、Ａｎｔ ｏ ６、Ａｎｔ ｏ ７）、Ａｐｉｓ属種（Ａｐｉ ｃ １、Ａｐｉ ｃ １．０１０１、Ａｐｉ ｃ １０、Ａｐｉ ｃ ２、Ａｐｉ ｃ ４、Ａｐｉ ｄ １、Ａｐｉ ｄ １．０１０１、Ａｐｉ ｄ ４、Ａｐｉ ｆｌ ４）、Ａｐｉｕｍ属種（Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ １．０１０１、Ａｐｉ ｇ １．０２０１、Ａｐｉ ｇ ２、Ａｐｉ ｇ ２．０１０１、Ａｐｉ ｇ ３、Ａｐｉ ｇ ３．０１０１、Ａｐｉ ｇ ４、Ａｐｉ ｇ ４．０１０１、Ａｐｉ ｇ ５、Ａｐｉ ｇ ５．０１０１、Ａｐｉ ｇ ６、Ａｐｉ ｇ ６．０１０１）、Ａｐｉｓ属種（Ａｐｉ ｍ １、Ａｐｉ ｍ １．０１０１、Ａｐｉ ｍ １０、Ａｐｉ ｍ １０．０１０１、Ａｐｉ ｍ １１、Ａｐｉ ｍ １１．０１０１、Ａｐｉ ｍ １１．０２０１、Ａｐｉ ｍ １３ｋＤ、Ａｐｉ ｍ ２、Ａｐｉ ｍ ２．０１０１、Ａｐｉ ｍ ３、Ａｐｉ ｍ ３．０１０１、Ａｐｉ ｍ ４、Ａｐｉ ｍ ４．０１０１、Ａｐｉ ｍ ５、Ａｐｉ ｍ ５．０１０１、Ａｐｉ ｍ ６、Ａｐｉ ｍ ６．０１０１、Ａｐｉ ｍ ７、Ａｐｉ ｍ ７．０１０１、Ａｐｉ ｍ ８、Ａｐｉ ｍ ８．０１０１、Ａｐｉ ｍ ９、Ａｐｉ ｍ ９．０１０１、Ａｐｉ ｍ Ａ１－Ａ２、Ａｐｉ ｍ Ａ１－Ａ２－Ａ３、Ａｐｉ ｍアパルブミン１、Ａｐｉ ｍアパルブミン２、Ａｐｉ ｍｅ １、Ａｐｉ ｍｅ ４）、Ａｒａｃｈｉｓ属種（Ａｒａ ｄ ２、Ａｒａ ｄ ６、Ａｒａ ｆ ３、Ａｒａ ｆ ４、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ １．０１０１、Ａｒａ ｈ １０、Ａｒａ ｈ １０．０１０１、Ａｒａ ｈ １０．０１０２、Ａｒａ ｈ １１、Ａｒａ ｈ １１．０１０１、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ２．０１０１、Ａｒａ ｈ ２．０１０２、Ａｒａ ｈ ２．０２０１、Ａｒａ ｈ ２．０２０２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ３．０１０１、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ４．０１０１、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ５．０１０１、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ６．０１０１、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ７．０１０１、Ａｒａ ｈ ７．０２０１、Ａｒａ ｈ ７．０２０２、Ａｒａ ｈ ８、Ａｒａ ｈ ８．０１０１、Ａｒａ ｈ ８．０２０１、Ａｒａ ｈ ９、Ａｒａ ｈ ９．０１０１、Ａｒａ ｈ ９．０２０１、Ａｒａ ｈアグルチニン、Ａｒａ ｈオレオシン１８ｋＤ、Ａｒａ ｉ ２、Ａｒａ ｉ ６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属種（Ａｒａ ｔ ３、Ａｒａ ｔ ８、Ａｒａ ｔ ＧＬＰ）、Ａｒｃｈｏｓａｒｇｕｓ属種（Ａｒｃ ｐｒ １）、Ａｒｃｈａｅｏｐｏｔａｍｏｂｉｕｓ属種（Ａｒｃ ｓ ８、Ａｒｃ ｓ ８．０１０１）、Ａｅｑｕｉｐｅｃｔｅｎ属種（Ａｒｇ ｉ １）、Ａｒｇａｓ属種（Ａｒｇ ｒ １、Ａｒｇ ｒ １．０１０１）、Ａｒｉｏｐｓｉｓ属種（Ａｒｉ ｆｅ １）、Ａｒｍｏｒａｃｉａ属種（Ａｒｍ ｒ ＨＲＰ）、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ属種（Ａｒｒ ｅ １、Ａｒｒ ｅ ５）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属種（Ａｒｔ ａ １、Ａｒｔ ａｐ １）、Ａｒｔｅｍｉａ属種（Ａｒｔ ｆｒ １、Ａｒｔ ｆｒ １．０１０１、Ａｒｔ ｆｒ ５、Ａｒｔ ｆｒ ５．０１０１）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属種（Ａｒｔ ｇｌ ＣＯ）、Ａｃｈｏｒｉｏｎ
属種（Ａｒｔ ｇｙ ７）、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ属種（Ａｒｔ ｈ １７ｋＤ、Ａｒｔ ｈ ４）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属種（Ａｒｔ ｐ１ベータフィコシアニン）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属種（Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ １．０１０１、Ａｒｔ ｖ １．０１０２、Ａｒｔ ｖ １．０１０３、Ａｒｔ ｖ １．０１０４、Ａｒｔ ｖ １．０１０５、Ａｒｔ ｖ １．０１０６、Ａｒｔ ｖ １．０１０７、Ａｒｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ２．０１０１、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ３．０１０１、Ａｒｔ ｖ ３．０２０１、Ａｒｔ ｖ ３．０２０２、Ａｒｔ ｖ ３．０３０１、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ４．０１０１、Ａｒｔ ｖ ４．０２０１、Ａｒｔ ｖ ４７ｋＤ、Ａｒｔ ｖ ５、Ａｒｔ ｖ ５．０１０１、Ａｒｔ ｖ ６、Ａｒｔ ｖ ６．０１０１、Ａｒｔ ｖ ６０ｋＤ）、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ属種（Ａｒｔ ｖａ ４）、Ａｓｃａｒｉｓ属種（Ａｓｃ １ ３、Ａｓｃ １ ３．０１０１、Ａｓｃ １ ３．０１０２、Ａｓｃ Ｉ ３４ｋＤ、Ａｓｃ ｓ １、Ａｓｃ ｓ １．０１０１、Ａｓｃ ｓ ３、Ａｓｃ ｓ ３．０１０１、Ａｓｃ ｓ ＧＳＴ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種（Ａｓｐ ａｗグルコアミラーゼ、Ａｓｐ ｃ ２２、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ １．０１０１、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １０．０１０１、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １１．０１０１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １２．０１０１、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １３．０１０１、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １５．０１０１、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １６．０１０１、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １７．０１０１、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ １８．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ２．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２２、Ａｓｐ ｆ ２２．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２３．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２７．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２８．０１０１、Ａｓｐ ｆ ２９、Ａｓｐ ｆ ２９．０１０１、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ３．０１０１、Ａｓｐ ｆ ３４、Ａｓｐ ｆ ３４．０１０１、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ４．０１０１、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ５．０１０１、Ａｓｐ ｆ ５６ｋＤ、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ６．０１０１、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ７．０１０１、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ８．０１０１、Ａｓｐ ｆ ９９、Ａｓｐ ｆ ９．０１０１、Ａｓｐ ｆ ＡｆＣａｌＡｐ、Ａｓｐ ｆ ＡＴ＿Ｖ、Ａｓｐ ｆカタラーゼ、Ａｓｐ ｆキトサナーゼ、Ａｓｐ ｆ ＣＰ、Ａｓｐ ｆ ＤＰＰＶ、Ａｓｐ ｆ ＦＤＨ、Ａｓｐ ｆガンマアクチン、Ａｓｐ ｆグルコシダーゼ、Ａｓｐ ｆ ＧＰＩ、Ａｓｐ ｆ ＧＳＴ、Ａｓｐ ｆ ＧＴ、Ａｓｐ ｆ ＩＡＯ、Ａｓｐ ｆ ＩＰＭＩ、Ａｓｐ ｆ ＬＰＬ１、Ａｓｐ ｆ ＬＰＬ３、Ａｓｐ ｆマンノシダーゼ、Ａｓｐ ｆ ＭＤＨ、Ａｓｐ ｆ ＰＬ、Ａｓｐ ｆ ＰＵＰ、Ａｓｐ ｆ ＲＰＳ３、Ａｓｐ ｆ ＳＸＲ、Ａｓｐ ｆｌ １３、Ａｓｐ ｆｌ １３．０１０１、Ａｓｐ ｆｌ １８、Ａｓｐ ｆｌ ２、Ａｓｐ ｆｌ ２１、Ａｓｐ ｆｌ ３、Ａｓｐ ｆｌ ４、Ａｓｐ ｆｌ ７、Ａｓｐ ｆｌ ８、Ａｓｐ ｆｌ ９、Ａｓｐ ｍｅセアプローゼ、Ａｓｐ ｎ １４、Ａｓｐ ｎ １４．０１０１、Ａｓｐ ｎ １８、Ａｓｐ ｎ １８．０１０１、Ａｓｐ ｎ ２５、Ａｓｐ ｎ ２５．０１０１、Ａｓｐ ｎ ３０、Ａｓｐ ｎグルコアミラーゼ、Ａｓｐ ｎヘミセルラーゼ、Ａｓｐ ｎペクチナーゼ、Ａｓｐ ｏ １３、Ａｓｐ ｏ １３．０１０１、Ａｓｐ ｏ ２１、Ａｓｐ ｏ ２１．０１０１、Ａｓｐ ｏ ３、Ａｓｐ ｏ ４、Ａｓｐ ｏ ７、Ａｓｐ ｏ ８、Ａｓｐ ｏラクターゼ、Ａｓｐ ｏリパーゼ、Ａｓｐ ｏｃ １３、Ａｓｐ ｒ １、Ａｓｐ ｓａ ＡＰ、Ａｓｐ ｓｐグルコアミラーゼ、Ａｓｐ ｓｐグルコースオキシダーゼ、Ａｓｐ ｓｐ ＰＬ、Ａｓｐ ｓｐ ＰＭＥ、Ａｓｐ ｓｙ １３、Ａｓｐ ｖ １３、Ａｓｐ ｖ １３．０１０１、Ａｓｐ ｖカタラーゼＡ、Ａｓｐ ｖエノラーゼ、Ａｓｐ ｖ ＧＡＰＤＨ、Ａｓｐ ｖ ＭＤＨ、Ａｓｐ ｖ ＳＸＲ）、Ａｓｐａｒａｇｕｓ属種（Ａｓｐａ ｏ １、Ａｓｐａ ｏ １．０１、Ａｓｐａ ｏ １．０２、Ａｓｐａ ｏ １７ｋＤ、Ａｓｐａ ｏ ４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種（Ａｓｐｅ ｎｉ ２、Ａｓｐｅ ｎｉ ３、Ａｓｐｅ ｎｉ ４、Ａｓｐｅ ｎｉ ７、Ａｓｐｅ ｎｉ ８、Ａｓｐｅ ｎｉ ９）、Ａｖｅｎａ属種（Ａｖｅ ｓ １、Ａｖｅ ｓ １２、Ａｖｅ ｓ １３、Ａｖｅ ｓ ２、Ａｖｅ ｓ ４、Ａｖｅ ｓ ５、Ａｖｅ ｓ ７）、Ｂａｂｙｌｏｎｉａ属種（Ｂａｂ ｊａ １）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種（Ｂａｃ ａｌサブチリシン、Ｂａｃ ｃｌサブチリシン、Ｂａｃ Ｉサブチリシン、Ｂａｃ ｌｉ ａＡ、Ｂａｃ ｌｉサブチリシン）、Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ属種（Ｂａｃ ｏｌ ２７、Ｂａｃ ｏｌ ２７．０１０１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種（Ｂａｃ ｓｐ ａＡ１、Ｂａｃ ｓｐ ａＡ３、Ｂａｃ ｓｐデカルボキシラーゼ、Ｂａｃ ｓｔ ａｍｙＭ、Ｂａｃ ｓｕサブチリシン、Ｂａｃ ｔ Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｂａｃ ｔ Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｂａｃ ｔ Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｂａｃ ｔ Ｃｒｙ９ｃ）、Ｂａｇｒｅ属種（Ｂａｇ ｍａ １）、Ｂａｌｉｓｔｅｓ属種（Ｂａｌ ｃａ １）、Ｂａｌａｎｕｓ属種（Ｂａｌ ｒ １、Ｂａｌ ｒ １．０１０１）、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属種（Ｂｅａ ｂ Ａｉｄ、Ｂｅａ ｂ Ｅｎｏｌ、Ｂｅａ ｂ ｆ２、Ｂｅａ ｂ Ｈｅｘ）、Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ属種（Ｂｅｒ ｅ １、Ｂｅｒ ｅ １．０１０１、Ｂｅｒ ｅ ２、Ｂｅｒ ｅ ２．０１０１）、Ｂｅｒｙｘ属種（Ｂｅｒ ｓｐ １）、Ｂｅｔｕｌａ属種（Ｂｅｔ ａｂ １、Ｂｅｔ ａｌ １、Ｂｅｔ ｃｈ １、Ｂｅｔ ｃｏ １、Ｂｅｔ ｄａ １、Ｂｅｔ ｇｒ １、Ｂｅｔ ｈｕ １、Ｂｅｔ ｌｅ １、Ｂｅｔ ｍｅ １、Ｂｅｔ ｎ １、Ｂｅｔ ｐ １、Ｂｅｔ ｐａ １、Ｂｅｔ ｐｏ １、Ｂｅｔ ｐｕ １、Ｂｅｔ ｐｕ ２、Ｂｅｔ ｐｕ ４、Ｂｅｔ ｐｕ ６、Ｂｅｔ ｐｕ ７、Ｂｅｔ ｓｃ １、Ｂｅｔ ｕｔ １、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １ Ｂ１－Ｂ１－Ｂ１、Ｂｅｔ ｖ １ ｆｖ Ｍａｌ ４ｘ、Ｂｅｔ ｖ １．０１０１、Ｂｅｔ ｖ １．０１０２、Ｂｅｔ ｖ １．０１０３、Ｂｅｔ ｖ １．０２０１、Ｂｅｔ ｖ １．０３０１、Ｂｅｔ ｖ １．０４０１、Ｂｅｔ ｖ １．０４０２、Ｂｅｔ ｖ １．０５０１、Ｂｅｔ ｖ １．０６０１、Ｂｅｔ ｖ １．０６０２、Ｂｅｔ ｖ １．０７０１、Ｂｅｔ ｖ １．０８０１、Ｂｅｔ ｖ １．０９０１、Ｂｅｔ ｖ １．１００１、Ｂｅｔ ｖ １．１１０１、Ｂｅｔ ｖ １．１２０１、Ｂｅｔ ｖ １．１３０１、Ｂｅｔ ｖ １．１４０１、Ｂｅｔ ｖ １．１４０２、Ｂｅｔ ｖ １．１５０１、Ｂｅｔ ｖ １．１５０２、Ｂｅｔ ｖ １．１６０１、Ｂｅｔ ｖ １．１７０１、Ｂｅｔ ｖ １．１８０１、Ｂｅｔ ｖ １．１９０１、Ｂｅｔ ｖ １．２００１、Ｂｅｔ ｖ １．２１０１、Ｂｅｔ ｖ １．２２０１、Ｂｅｔ ｖ １．２３０１、Ｂｅｔ ｖ １．２４０１、Ｂｅｔ ｖ １．２５０１、Ｂｅｔ ｖ １．２６０１、Ｂｅｔ ｖ １．２７０１、Ｂｅｔ ｖ １．２８０１、Ｂｅｔ ｖ １．２９０１、Ｂｅｔ ｖ １．３００１、Ｂｅｔ ｖ １．３１０１、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ２．０１０１、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ３．０１０１、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ４．０１０１、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ６．０１０１、Ｂｅｔ ｖ ６．０１０２、Ｂｅｔ ｖ ７、Ｂｅｔ ｖ ７．０１０１、Ｂｅｔ ｖ ８、Ｂｅｔ ｖグルカナーゼ）、Ｂｅｔａ属種（Ｂｅｔａ ｖ １、Ｂｅｔａ ｖ １．０１０１、Ｂｅｔａ ｖ ２、Ｂｅｔａ ｖ ２．０１０１）、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ属種（Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ １．０１０１、Ｂｌａ ｇ １．０１０２、Ｂｌａ ｇ １．０１０３、Ｂｌａ ｇ １．０２０１、Ｂｌａ ｇ １．０２０２、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ２．０１０１、Ｂｌａ ｇ ２．０２０１、Ｂｌａ ｇ ３６ｋＤ、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ４．０１０１、Ｂｌａ ｇ ４．０２０１、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ５．０１０１、Ｂｌａ ｇ ５．０２０１、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ６．０１０１、Ｂｌａ ｇ ６．０２０１、Ｂｌａ ｇ ６．０３０１、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ７．０１０１、Ｂｌａ ｇ ８、Ｂｌａ ｇ ８．０１０１、Ｂｌａ ｇ ９、Ｂｌａ ｇエノラーゼ、Ｂｌａ ｇ ＧＳＴＤ１、Ｂｌａ ｇ ＲＡＣＫ１、Ｂｌａ ｇ ＴＰＩ、Ｂｌａ ｇトリプシン、Ｂｌａ ｇビテロゲニン）、Ｂｌａｔｔａ属種（Ｂｌａ ｏ １、Ｂｌａ ｏ ７）、Ｂｌｏｍｉａ属種（Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ １．０１０１、Ｂｌｏ ｔ １．０２０１、Ｂｌｏ ｔ １０、Ｂｌｏ ｔ １０．０１０１、Ｂｌｏ ｔ １０．０１０２、Ｂｌｏ ｔ １１、Ｂｌｏ ｔ １１．０１０１、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｂｌｏ ｔ １２．０１０１、Ｂｌｏ ｔ １２．０１０２、Ｂｌｏ ｔ １３、Ｂｌｏ ｔ １３．０１０１、Ｂｌｏ ｔ １４、Ｂｌｏ ｔ １５、Ｂｌｏ ｔ １８、Ｂｌｏ ｔ １９、Ｂｌｏ ｔ １９．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ２、Ｂｌｏ ｔ ２．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ２．０１０２、Ｂｌｏ ｔ ２．０１０３、Ｂｌｏ ｔ ２０、Ｂｌｏ ｔ ２１、Ｂｌｏ ｔ ２１．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ３．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ４、Ｂｌｏ ｔ ４．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ ５．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ６、Ｂｌｏ ｔ ６．０１０１、Ｂｌｏ ｔ ７、Ｂｌｏ ｔ ８、Ｂｌｏ ｔ ９、Ｂｌｏ ｔ ＨＳＰ７０）、Ｂｏｍｂｕｓ属種（Ｂｏｍ ａｒ ４、Ｂｏｍ ｈｙ ４、Ｂｏｍ ｐ １、Ｂｏｍ ｐ １．０１０１、Ｂｏｍ ｐ ２、Ｂｏｍ ｐ ３、Ｂｏｍ ｐ ４、Ｂｏｍ ｐ ４．０１０１、Ｂｏｍ ｔ １、Ｂｏｍ ｔ １．０１０１、Ｂｏｍ ｔ ４、Ｂｏｍ ｔ ４．０１０１）、Ｂｏｍｂｙｘ属種（Ｂｏｍｂ ｍ １、Ｂｏｍｂ ｍ １．０１０１、Ｂｏｍｂ ｍ ７、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０１、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０２、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０３、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０４、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０５、Ｂｏｍｂ ｍ ７．０１０６）、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ属種（Ｂｏｏ ｍ １、Ｂｏｏ ｍ ７、Ｂｏｏ ｍ ７．０１０１）、Ｂｏｓ属種（Ｂｏｓ ｄ ２、Ｂｏｓ ｄ ２．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ２．０１０２、Ｂｏｓ ｄ ２．０１０３、Ｂｏｓ ｄ ３、Ｂｏｓ ｄ ３．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ４．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ５．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ５．０１０２、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ６（ＭＤＡ）、Ｂｏｓ ｄ ６．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ７．０１０１、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｂｏｓ ｄ ８アルファＳ１、Ｂｏｓ ｄ ８アルファＳ２、Ｂｏｓ ｄ ８ベータ、Ｂｏｓ ｄ ８カッパ、Ｂｏｓ ｄアルファ２Ｉ、Ｂｏｓ ｄアルファ２Ｉ．０１０１、Ｂｏｓ ｄキモシン、Ｂｏｓ ｄフィブリン、Ｂｏｓ ｄゼラチン、Ｂｏｓ ｄ ＨＧ、Ｂｏｓ ｄインスリン、Ｂｏｓ ｄラクトフェリン、Ｂｏｓ ｄラクトペルオキシダーゼ、Ｂｏｓ ｄミオグロビン、Ｂｏｓ ｄ ＯＢＰ、Ｂｏｓ ｄ ＯＳＣＰ、Ｂｏｓ ｄホスビチン、Ｂｏｓ ｄ ＰＬＡ２、Ｂｏｓ ｄ ＰＲＶＢ、Ｂｏｓ ｄトロンビン、Ｂｏｓ ｄ ＴＩ、Ｂｏｓ ｇｒ ＡＬＡ、Ｂｏｓ ｇｒミオグロビン）、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ属種（Ｂｏｔ ａｓ １、Ｂｏｔ ａｔ １）、Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ属種（Ｂｏｕ ｇ １）、Ｂｉｔｉｎｇ属種（Ｂｏｖ ｏｖ １）、Ｂｒａｍａ属種（Ｂｒａ ｄｕ １）、Ｂｒａｓｓｉｃａ属種（Ｂｒａ ｊ １、Ｂｒａ ｊ １．０１０１、Ｂｒａ ｎ １、Ｂｒａ ｎ １．０１０１、Ｂｒａ ｎ ４、Ｂｒａ ｎ ７、Ｂｒａ ｎ ８、Ｂｒａ ｎ ＰＧ、Ｂｒａ ｎｉ ８、Ｂｒ
ａ ｏ ３、Ｂｒａ ｏ ３．０１０１、Ｂｒａ ｒ １、Ｂｒａ ｒ １．０１０１、Ｂｒａ ｒ ２、Ｂｒａ ｒ ２．０１０１、Ｂｒａ ｒ ３、Ｂｒａ ｒ ４、Ｂｒａ ｒ ７）、Ｂｒｏｍｕｓ属種（Ｂｒｏ ａ １、Ｂｒｏ ａ ４）、Ｂｒｏｓｍｅ属種（Ｂｒｏ ｂｒ １）、Ｂｒｏｍｕｓ属種（Ｂｒｏ ｉ １、Ｂｒｏ ｉ ５、Ｂｒｏ ｉ ７）、Ｂｒｕｇｉａ属種（Ｂｒｕ ｍ ３、Ｂｒｕ ｍ ３．０１０１、Ｂｒｕ ｍ Ｂｍ３３）、Ｂｕｂａｌｕｓ属種（Ｂｕｂ ｂ ＡＬＡ、Ｂｕｂ ｂ ＢＬＧ、Ｂｕｂ ｂカゼイン、Ｂｕｂ ｂカゼインアルファＳ１、Ｂｕｂ ｂカゼインアルファＳ２、Ｂｕｂ ｂカゼインベータ、Ｂｕｂ ｂカゼインカッパ）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属種（Ｃａｅ ｂ ３、Ｃａｅ ｂ ３．０１０１、Ｃａｅ ｂｒ ３、Ｃａｅ ｂｒ ３．０１０１、Ｃａｅ ｅ ３、Ｃａｅ ｅ ３．０１０１、Ｃａｅ ｅ ３．０１０２、Ｃａｅ ｒｅ １３、Ｃａｅ ｒｅ １３．０１０１）、Ｃａｊａｎｕｓ属種（Ｃａｊ ｃ １）、Ｃａｌｉｇｕｓ属種（Ｃａｌ ｃｌ １、Ｃａｌ ｃｌ １．０１０１、Ｃａｌ ｃｌ １．０１０２）、Ｃａｌａｍｕｓ属種（Ｃａｌ ｌｅ １）、Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓ属種（Ｃａｌ ｓ ２）、Ｃａｍｅｌｕｓ属種（Ｃａｍ ｄ ＡＬＡ、Ｃａｍ ｄカゼイン、Ｃａｍ ｄカゼインアルファＳ１、Ｃａｍ ｄカゼインアルファＳ２、Ｃａｍ ｄカゼインベータ、Ｃａｍ ｄカゼインカッパ）、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ属種（Ｃａｍ ｆｌ ７、Ｃａｍ ｆｌ ７．０１０１）、Ｃａｎｉｓ属種（Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ １．０１０１、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ２．０１０１、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ３．０１０１、Ｃａｎ ｆ ４、Ｃａｎ ｆ ４．０１０１、Ｃａｎ ｆ ５、Ｃａｎ ｆ ５．０１０１、Ｃａｎ ｆ ６、Ｃａｎ ｆ ６．０１０１、Ｃａｎ ｆ Ｆｅｌｄ１様、Ｃａｎ ｆ Ｈｏｍｓ２様、Ｃａｎ ｆホスビチン、Ｃａｎ ｆ ＴＣＴＰ）、Ｃａｎｔｈｉｄｅｒｍｉｓ属種（Ｃａｎ ｍａ １）、Ｃａｎｃｅｒ属種（Ｃａｎ ｍｇ ２、Ｃａｎ ｐ １）、Ｃａｎｎａｂｉｓ属種（Ｃａｎ ｓ ３）、Ｃａｎｄｉｄａ属種（Ｃａｎｄ ａ １、Ｃａｎｄ ａ １．０１０１、Ｃａｎｄ ａ ３、Ｃａｎｄ ａ ３．０１０１、Ｃａｎｄ ａ ＣＡＡＰ、Ｃａｎｄ ａ ＣｙＰ、Ｃａｎｄ ａエノラーゼ、Ｃａｎｄ ａ ＦＰＡ、Ｃａｎｄ ａ ＭｎＳＯＤ、Ｃａｎｄ ａ ＰＧＫ、Ｃａｎｄ ｂ ２、Ｃａｎｄ ｂ ２．０１０１、Ｃａｎｄ ｂ ＦＤＨ、Ｃａｎｄ ｒリパーゼ）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属種（Ｃａｐ ａ １、Ｃａｐ ａ １．０１０１、Ｃａｐ ａ １７ｋＤ、Ｃａｐ ａ ２、Ｃａｐ ａ ２．０１０１、Ｃａｐ ａ ３０ｋＤ、Ｃａｐ ａグルカナーゼ、Ｃａｐ ｃｈ １７ｋＤ）、Ｃａｐｒｅｌｌａ属種（Ｃａｐ ｅ １）、Ｃａｐｒａ属種（Ｃａｐ ｈ ＡＬＡ、Ｃａｐ ｈ ＢＬＧ、Ｃａｐ ｈカゼイン、Ｃａｐ ｈカゼインアルファＳ１、Ｃａｐ ｈカゼインアルファＳ２、Ｃａｐ ｈカゼインベータ、Ｃａｐ ｈカゼインカッパ、Ｃａｐ ｈ ＧＳＡ）、Ｃａｐｉｔｕｌｕｍ属種（Ｃａｐ ｍ １）、Ｃａｒａｓｓｉｕｓ属種（Ｃａｒ ａｕ １）、Ｃａｒｐｉｎｕｓ属種（Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｒ ｂ １．０１０１、Ｃａｒ ｂ １．０１０２、Ｃａｒ ｂ １．０１０３、Ｃａｒ ｂ １．０１０４、Ｃａｒ ｂ １．０１０５、Ｃａｒ ｂ １．０１０６、Ｃａｒ ｂ １．０１０７、Ｃａｒ ｂ １．０１０８、Ｃａｒ ｂ １．０１０９、Ｃａｒ ｂ １．０１１０、Ｃａｒ ｂ １．０１１１、Ｃａｒ ｂ １．０１１２、Ｃａｒ ｂ １．０１１３、Ｃａｒ ｂ １．０２０１、Ｃａｒ ｂ １．０３０１、Ｃａｒ ｂ １．０３０２、Ｃａｒ ｂ ２、Ｃａｒ ｂ ４）、Ｃａｒａｎｘ属種（Ｃａｒ ｃｒ １）、Ｃａｒｙａ属種（Ｃａｒ ｉ １、Ｃａｒ ｉ １．０１０１、Ｃａｒ ｉ ２、Ｃａｒ ｉ ４、Ｃａｒ ｉ ４．０１０１）、Ｃａｒｃｉｎｕｓ属種（Ｃａｒ ｍａ ２）、Ｃａｒｙｏｔａ属種（Ｃａｒ ｍｉ ２）、Ｃａｒｉｃａ属種（Ｃａｒ ｐ １、Ｃａｒ ｐキチナーゼ、Ｃａｒ ｐキモパパイン、Ｃａｒ ｐエンドプロテイナーゼ）、Ｃａｓｔａｎｅａ属種（Ｃａｓ ｃ ２４ｋＤ、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ １．０１０１、Ｃａｓ ｓ １．０１０２、Ｃａｓ ｓ １．０１０３、Ｃａｓ ｓ ２、Ｃａｓ ｓ ５、Ｃａｓ ｓ ５．０１０１、Ｃａｓ ｓ ８、Ｃａｓ ｓ ８．０１０１、Ｃａｓ ｓ ９、Ｃａｓ ｓ ９．０１０１）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ属種（Ｃａｔ ｒ １、Ｃａｔ ｒ １．０１０１、Ｃａｔ ｒ １７ｋＤ、Ｃａｔ ｒ ２）、Ｃａｕｌｏｌａｔｉｌｕｓ属種（Ｃａｕ ｃｈ １）、Ｃａｖｉａ属種（Ｃａｖ ｐ １、Ｃａｖ ｐ １．０１０１、Ｃａｖ ｐ ２、Ｃａｖ ｐ ２．０１０１、Ｃａｖ ｐ ３、Ｃａｖ ｐ ３．０１０１、Ｃａｖ ｐゼラチン、Ｃａｖ ｐ ＧＳＡ）、Ｃｅｎｔｒｏｐｒｉｓｔｉｓ属種（Ｃｅｎ ｓ １）、Ｃｅｐｈａｌｏｐｈｏｌｉｓ属種（Ｃｅｐ ｓｏ １）、Ｃｈａｒｙｂｄｉｓ属種（Ｃｈａ ｆ １、Ｃｈａ ｆ １．０１０１）、Ｃｈａｅｔｏｄｉｐｔｅｒｕｓ属種（Ｃｈａ ｆａ １）、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ属種（Ｃｈａ ｏ １、Ｃｈａ ｏ １．０１０１、Ｃｈａ ｏ ２、Ｃｈａ ｏ ２．０１０１）、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ属種（Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ １．０１０１、Ｃｈｅ ａ ２、Ｃｈｅ ａ ２．０１０１、Ｃｈｅ ａ ３、Ｃｈｅ ａ ３．０１０１）、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ属種（Ｃｈｉ ｋ １、Ｃｈｉ ｋ １０、Ｃｈｉ ｋ １０．０１０１）、Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ属種（Ｃｈｉ Ｉ ２１ｋＤ＿ａ、Ｃｈｉ Ｉ ２１ｋＤ＿ｂ）、Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ属種（Ｃｈｉ ｏ １、Ｃｈｉ ｏ １．０１０１、Ｃｈｉ ｏ ２、Ｃｈｉ ｏ ４、Ｃｈｉ ｏ ６、Ｃｈｉ ｏアルファアクチン、Ｃｈｉ ｏ ＳＥＲＣＡ）、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ属種（Ｃｈｉ ｔ １、Ｃｈｉ ｔ １．０１０１、Ｃｈｉ ｔ １．０２０１、Ｃｈｉ ｔ ２、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０２、Ｃｈｉ ｔ ３、Ｃｈｉ ｔ ３．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ４、Ｃｈｉ ｔ ４．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ５、Ｃｈｉ ｔ ５．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ６、Ｃｈｉ ｔ ６．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ６．０２０１、Ｃｈｉ ｔ ７、Ｃｈｉ ｔ ７．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ８、Ｃｈｉ ｔ ８．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ９、Ｃｈｉ ｔ ９．０１０１）、Ｃｈｌａｍｙｓ属種（Ｃｈｌ ｎ １）、Ｃｈｌｏｅｐｈａｇａ属種（Ｃｈｌ ｐｉ １）、Ｃｈｏｒｔｏｇｌｙｐｈｕｓ属種（Ｃｈｏ ａ １０）、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａ属種（Ｃｈｒ ｔｒ ７、Ｃｈｒ ｔｒ ７．０１０１）、Ｃｉｃｅｒ属種（Ｃｉｃ ａ ２Ｓアルブミン、Ｃｉｃ ａアルブミン）、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ属種（Ｃｉｃ ｉ １）、Ｃｉｍｅｘ属種（Ｃｉｍ Ｉニトロフォリン）、Ｃｉｔｒｕｓ属種（Ｃｉｔ Ｉ １、Ｃｉｔ Ｉ ３、Ｃｉｔ Ｉ ３．０１０１）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ属種（Ｃｉｔ ｌａ ２、Ｃｉｔ ｌａ ＭＤＨ、Ｃｉｔ ｌａ ＴＰＩ）、Ｃｉｔｒｕｓ属種（Ｃｉｔ ｒ ３、Ｃｉｔ ｒ ３．０１０１、Ｃｉｔ ｓ １、Ｃｉｔ ｓ １．０１０１、Ｃｉｔ ｓ ２、Ｃｉｔ ｓ ２．０１０１、Ｃｉｔ ｓ ３、Ｃｉｔ ｓ ３．０１０１、Ｃｉｔ ｓ ３．０１０２、Ｃｉｔ ｓ ＩＦＲ）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属種（Ｃｌａ ｃ １４、Ｃｌａ ｃ １４．０１０１、Ｃｌａ ｃ ９、Ｃｌａ ｃ ９．０１０１、Ｃｌａ ｈ １、Ｃｌａ ｈ １０、Ｃｌａ ｈ １０．０１０１、Ｃｌａ ｈ １２、Ｃｌａ ｈ １２．０１０１、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ２．０１０１、Ｃｌａ ｈ ４２ｋＤ、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ５．０１０１、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ６．０１０１、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ７．０１０１、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ８ ＣＳＰ、Ｃｌａ ｈ ８．０１０１、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ ９．０１０１、Ｃｌａ ｈ ａｂＨ、Ｃｌａ ｈ ＧＳＴ、Ｃｌａ ｈ ＨＣｈ１、Ｃｌａ ｈ ＨＳＰ７０、Ｃｌａ ｈ ＮＴＦ２、Ｃｌａ ｈ ＴＣＴＰ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種（Ｃｌｏ ｈｉコラゲナーゼ、Ｃｌｏ ｔトキソイド）、Ｃｌｕｐｅａ属種（Ｃｌｕ ｈ １、Ｃｌｕ ｈ １．０１０１、Ｃｌｕ ｈ １．０２０１、Ｃｌｕ ｈ １．０３０１）、Ｃｏｃｏｓ属種（Ｃｏｃ ｎ ２、Ｃｏｃ ｎ ４、Ｃｏｃ ｎ ５）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属種（Ｃｏｃ ｐｏ ８）、Ｃｏｆｆｅａ属種（Ｃｏｆ ａ １、Ｃｏｆ ａ １．０１０１）、Ｃｏｌｕｍｂａ属種（Ｃｏｌ Ｉ ＰＳＡ）、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属種（Ｃｏｐ ｃ １、Ｃｏｐ ｃ １．０１０１、Ｃｏｐ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ ２．０１０１、Ｃｏｐ ｃ ３、Ｃｏｐ ｃ ３．０１０１、Ｃｏｐ ｃ ４、Ｃｏｐ ｃ ５、Ｃｏｐ ｃ ５．０１０１、Ｃｏｐ ｃ ６、Ｃｏｐ ｃ ７、Ｃｏｐ ｃ ７．０１０１）、Ｃｏｒｙｌｕｓ属種（Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ １．０１０１、Ｃｏｒ ａ １．０１０２、Ｃｏｒ ａ １．０１０３、Ｃｏｒ ａ １．０１０４、Ｃｏｒ ａ １．０２０１、Ｃｏｒ ａ １．０３０１、Ｃｏｒ ａ １．０４０１、Ｃｏｒ ａ １．０４０２、Ｃｏｒ ａ １．０４０３、Ｃｏｒ ａ １．０４０４、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １０．０１０１、Ｃｏｒ ａ １１、Ｃｏｒ ａ １１．０１０１、Ｃｏｒ ａ １２、Ｃｏｒ ａ １２．０１０１、Ｃｏｒ ａ １３、Ｃｏｒ ａ １３．０１０１、Ｃｏｒ ａ １４、Ｃｏｒ ａ １４．０１０１、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ２．０１０１、Ｃｏｒ ａ ２．０１０２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ８．０１０１、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ ９．０１０１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種（Ｃｏｒ ｄトキソイド）、Ｃｏｒｙｌｕｓ属種（Ｃｏｒ ｈｅ １）、Ｃｏｒｙｐｈａｅｎａ属種（Ｃｏｒ ｈｉ １）、Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ属種（Ｃｏｒ ｓ １、Ｃｏｒ ｓ １１ｋＤ、Ｃｏｒ ｓ ２）、Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ属種（Ｃｏｔ Ｉ ３）、Ｃｒａｎｇｏｎ属種（Ｃｒａ ｃ １、Ｃｒａ ｃ １．０１０１、Ｃｒａ ｃ ２、Ｃｒａ ｃ ２．０１０１、Ｃｒａ ｃ ４、Ｃｒａ ｃ ４．０１０１、Ｃｒａ ｃ ５、Ｃｒａ ｃ ５．０１０１、Ｃｒａ ｃ ６、Ｃｒａ ｃ ６．０１０１、Ｃｒａ ｃ ８、Ｃｒａ ｃ ８．０１０１）、Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ属種（Ｃｒａ ｇ １）、Ｃｒｉｃｅｔｕｓ属種（Ｃｒｉ ｃ ＨＳＡ）、Ｃｒｉｖｅｌｌｉａ属種（Ｃｒｉ ｐａ １）、Ｃｒｏｃｕｓ属種（Ｃｒｏ ｓ １、Ｃｒｏ ｓ １．０１０１、Ｃｒｏ ｓ ２、Ｃｒｏ ｓ ２．０１０１、Ｃｒｏ ｓ ３、Ｃｒｏ ｓ ３．０１、Ｃｒｏ ｓ ３．０２）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属種（Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ １．０１０１、Ｃｒｙ ｊ １．０１０２、Ｃｒｙ ｊ １．０１０３、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｒｙ ｊ ２．０１０１、Ｃｒｙ ｊ ２．０１０２、Ｃｒｙｊ ３、Ｃｒｙｊ ３．１、Ｃｒｙｊ ３．２、Ｃｒｙｊ ３．３、Ｃｒｙｊ ３．４、Ｃｒｙｊ ３．５、Ｃｒｙｊ ３．６、Ｃｒｙｊ ３．７、Ｃｒｙｊ ３．８、Ｃｒｙｊ ４、Ｃｒｙｊ ＡＰ、Ｃｒｙ ｊキチナーゼ、Ｃｒｙ ｊ ＣＰＡ９、Ｃｒｙ ｊ ＩＦＲ、Ｃｒｙ ｊ ＬＴＰ、Ｃｒｙ ｊ Ｐ１－Ｐ２）、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ属種（Ｃｒｙ ｐ ＡＰ）、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ属種（Ｃｔｅ ｆ １、Ｃｔｅ ｆ １．０１０１、Ｃｔｅ ｆ ２、Ｃｔｅ ｆ ２．０１０１、Ｃｔｅ ｆ ３、Ｃｔｅ ｆ ３．０１０１）、Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ属種（Ｃｔｅ ｉｄ １）、Ｃｕｃｕｍｉｓ属種（Ｃｕｃ ｍ １、Ｃｕｃ ｍ １．０１０１、Ｃｕｃ ｍ ２、Ｃｕｃ ｍ ２．０１０１、Ｃｕｃ ｍ ３、Ｃｕｃ ｍ ３．０１０１、Ｃｕｃ ｍ Ｌｅｃ１７、Ｃｕｃ ｍ ＭＤＨ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属種（Ｃｕｃ ｍａ １８ｋＤ、Ｃｕｃ ｍａ ２、Ｃｕｃ ｐ ２、Ｃｕｃ ｐ ＡｓｃＯ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ属種（Ｃｕｃ ｓ ２）、Ｃｕｌ
ｉｃｏｉｄｅｓ属種（Ｃｕｌ ｎ １、Ｃｕｌ ｎ １０、Ｃｕｌ ｎ １１、Ｃｕｌ ｎ ２、Ｃｕｌ ｎ ３、Ｃｕｌ ｎ ４、Ｃｕｌ ｎ ５、Ｃｕｌ ｎ ６、Ｃｕｌ ｎ ７、Ｃｕｌ ｎ ８、Ｃｕｌ ｎ ９、Ｃｕｌ ｎ ＨＳＰ７０）、Ｃｕｌｅｘ属種（Ｃｕｌ ｑ ２８ｋＤ、Ｃｕｌ ｑ ３５ｋＤ、Ｃｕｌ ｑ ７、Ｃｕｌ ｑ ７．０１０１、Ｃｕｌ ｑ ７．０１０２）、Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ属種（Ｃｕｌ ｓｏ １）、Ｃｕｍｉｎｕｍ属種（Ｃｕｍ ｃ １、Ｃｕｍ ｃ ２）、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ属種（Ｃｕｐ ａ １、Ｃｕｐ ａ １．０１０１、Ｃｕｐ ａ １．０２、Ｃｕｐ ａ ２、Ｃｕｐ ａ ３、Ｃｕｐ ａ ４、Ｃｕｐ ａ ４．０１０１、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ １．０１０１、Ｃｕｐ ｓ １．０１０２、Ｃｕｐ ｓ １．０１０３、Ｃｕｐ ｓ １．０１０４、Ｃｕｐ ｓ １．０１０５、Ｃｕｐ ｓ ３、Ｃｕｐ ｓ ３．０１０１、Ｃｕｐ ｓ ３．０１０２、Ｃｕｐ ｓ ３．０１０３、Ｃｕｐ ｓ ８）、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属種（Ｃｕｒ Ｉ １、Ｃｕｒ Ｉ １．０１０１、Ｃｕｒ Ｉ ２、Ｃｕｒ Ｉ ２．０１０１、Ｃｕｒ Ｉ ３、Ｃｕｒ Ｉ ３．０１０１、Ｃｕｒ Ｉ ４、Ｃｕｒ Ｉ ４．０１０１、Ｃｕｒ Ｉ ＡＤＨ、Ｃｕｒ Ｉ ＧＳＴ、Ｃｕｒ Ｉ ＭｎＳＯＤ、Ｃｕｒ Ｉ Ｏｒｙｚｉｎ、Ｃｕｒ Ｉ Ｔｒｘ、Ｃｕｒ Ｉ ＺＰＳ１）、Ｃｙａｎｏｃｈｅｎ属種（Ｃｙａ ｃｙ １）、Ｃｙｎｏｓｃｉｏｎ属種（Ｃｙｎ ａｒ １）、Ｃｙｎｏｓｕｒｕｓ属種（Ｃｙｎ ｃｒ １、Ｃｙｎ ｃｒ ５）、Ｃｙｎｏｄｏｎ属種（Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ １．０１０１、Ｃｙｎ ｄ １．０１０２、Ｃｙｎ ｄ １．０１０３、Ｃｙｎ ｄ １．０１０４、Ｃｙｎ ｄ １．０１０５、Ｃｙｎ ｄ １．０１０６、Ｃｙｎ ｄ １．０１０７、Ｃｙｎ ｄ １．０２０１、Ｃｙｎ ｄ １．０２０２、Ｃｙｎ ｄ １．０２０３、Ｃｙｎ ｄ １．０２０４、Ｃｙｎ ｄ １０、Ｃｙｎ ｄ １１、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １２．０１０１、Ｃｙｎ ｄ １３、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ １５．０１０１、Ｃｙｎ ｄ ２、Ｃｙｎ ｄ ２２、Ｃｙｎ ｄ ２２．０１０１、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２３．０１０１、Ｃｙｎ ｄ ２４、Ｃｙｎ ｄ ２４．０１０１、Ｃｙｎ ｄ ４、Ｃｙｎ ｄ ５、Ｃｙｎ ｄ ６、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ ７．０１０１）、Ｃｙｎｏｓｃｉｏｎ属種（Ｃｙｎ ｎｅ １）、Ｃｙｎｏｍｙｓ属種（Ｃｙｎ ｓｐ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）、Ｃｙｐｒｉｎｕｓ属種（Ｃｙｐ ｃ １、Ｃｙｐ ｃ １．０１、Ｃｙｐ ｃ １．０２）、Ｄａｂｏｉａ属種（Ｄａｂ ｒｕ １）、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属種（Ｄａｃ ｇ １、Ｄａｃ ｇ １．０１、Ｄａｃ ｇ １．０１０１、Ｄａｃ ｇ １．０２、Ｄａｃ ｇ １２、Ｄａｃ ｇ １３、Ｄａｃ ｇ ２、Ｄａｃ ｇ ２．０１０１、Ｄａｃ ｇ ３、Ｄａｃ ｇ ３．０１０１、Ｄａｃ ｇ ４、Ｄａｃ ｇ ４．０１０１、Ｄａｃ ｇ ５、Ｄａｃ ｇ ５．０１０１、Ｄａｃ ｇ ７）、Ｄａｍａ属種（Ｄａｍ ｄ ＣＳＡ）、Ｄａｎｉｏ属種（Ｄａｎ ｒｅ １、Ｄａｎ ｒｅ ２、Ｄａｎ ｒｅアルファ２Ｉ、Ｄａｎ ｒｅ ＣＫ）、Ｄａｓｙａｔｉｓ属種（Ｄａｓ ａｋ １、Ｄａｓ ａｍ １、Ｄａｓ ｓａ １）、Ｄａｕｃｕｓ属種（Ｄａｕ ｃ １、Ｄａｕ ｃ １．０１０１、Ｄａｕ ｃ １．０１０２、Ｄａｕ ｃ １．０１０３、Ｄａｕ ｃ １．０１０４、Ｄａｕ ｃ １．０１０５、Ｄａｕ ｃ １．０２０１、Ｄａｕ ｃ １．０３０１、Ｄａｕ ｃ ３、Ｄａｕ ｃ ４、Ｄａｕ ｃ ４．０１０１、Ｄａｕ ｃ ＣｙＰ）、Ｄｅｃａｐｔｅｒｕｓ属種（Ｄｅｃ ｒｕ １）、Ｄｅｎｄｒｏｎｅｐｈｔｈｙａ属種（Ｄｅｎ ｎ １、Ｄｅｎ ｎ １．０１０１）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属種（Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ １．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １．０１０２、Ｄｅｒ ｆ １．０１０３、Ｄｅｒ ｆ １．０１０４、Ｄｅｒ ｆ １．０１０５、Ｄｅｒ ｆ １．０１０６、Ｄｅｒ ｆ １．０１０７、Ｄｅｒ ｆ １．０１０８、Ｄｅｒ ｆ １．０１０９、Ｄｅｒ ｆ １．０１１０、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １０．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １０．０１０２、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １１．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １３、Ｄｅｒ ｆ １３．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １４．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １５．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １６．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １７．０１０１、Ｄｅｒ ｆ １８、Ｄｅｒ ｆ １８．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｆ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１４、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１５、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１６、Ｄｅｒ ｆ ２．０１１７、Ｄｅｒ ｆ ２０、Ｄｅｒ ｆ ２１、Ｄｅｒ ｆ ２２、Ｄｅｒ ｆ ２２．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ３．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ４、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ６、Ｄｅｒ ｆ ６．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ７．０１０１、Ｄｅｒ ｆ ８、Ｄｅｒ ｆ ９、Ｄｅｒ ｆ ＨＳＰ７０）、Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ属種（Ｄｅｒ ｇ １０、Ｄｅｒ ｇ １０．０１０１）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属種（Ｄｅｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｍ １．０１０１、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ １．０１０１、Ｄｅｒ ｐ １．０１０２、Ｄｅｒ ｐ １．０１０３、Ｄｅｒ ｐ １．０１０４、Ｄｅｒ ｐ １．０１０５、Ｄｅｒ ｐ １．０１０６、Ｄｅｒ ｐ １．０１０７、Ｄｅｒ ｐ １．０１０８、Ｄｅｒ ｐ １．０１０９、Ｄｅｒ ｐ １．０１１０、Ｄｅｒ ｐ １．０１１１、Ｄｅｒ ｐ １．０１１２、Ｄｅｒ ｐ １．０１１３、Ｄｅｒ ｐ １．０１１４、Ｄｅｒ ｐ １．０１１５、Ｄｅｒ ｐ １．０１１６、Ｄｅｒ ｐ １．０１１７、Ｄｅｒ ｐ １．０１１８、Ｄｅｒ ｐ １．０１１９、Ｄｅｒ ｐ １．０１２０、Ｄｅｒ ｐ １．０１２１、Ｄｅｒ ｐ １．０１２２、Ｄｅｒ ｐ １．０１２３、Ｄｅｒ ｐ １．０１２４、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １０．０１０１、Ｄｅｒ ｐ １０．０１０２、Ｄｅｒ ｐ １０．０１０３、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １１．０１０１、Ｄｅｒ ｐ １３、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ １４．０１０１、Ｄｅｒ ｐ １５、Ｄｅｒ ｐ １８、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０３、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０４、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０５、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０６、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０７、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０８、Ｄｅｒ ｐ ２．０１０９、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１０、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１１、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１２、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１３、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１４、Ｄｅｒ ｐ ２．０１１５、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２０．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｄｅｒ ｐ ２１．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ２３、Ｄｅｒ ｐ ２３．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ３．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ４．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ５．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ５．０１０２、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ６．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ７．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ８．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ ９．０１０１、Ｄｅｒ ｐ ９．０１０２、Ｄｅｒ ｐ Ｐ１－Ｐ２、Ｄｅｒ ｐ Ｐ２－Ｐ１、Ｄｅｒ ｓ １、Ｄｅｒ ｓ ２、Ｄｅｒ ｓ ３）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ属種（Ｄｉａ ｃ ＲＩＰ）、Ｄｉｃｒａｎｏｐｔｅｒｉｓ属種（Ｄｉｃ Ｉ ２Ｓアルブミン）、Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ属種（Ｄｉｏ ｋ １７ｋＤ、Ｄｉｏ ｋ ４、Ｄｉｏ ｋ ＩＦＲ）、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ属種（Ｄｉｏ ｐ ＴＳＰ）、Ｄｉｐｌｏｄｕｓ属種（Ｄｉｐ ｈｏ １）、Ｄｉｓｔｉｃｈｌｉｓ属種（Ｄｉｓ ｓ １、Ｄｉｓ ｓ ７）、Ｄｉｔｒｅｍａ属種（Ｄｉｔ ｔｅ １）、Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ属種（Ｄｏｌ ａ １、Ｄｏｌ ａ ２、Ｄｏｌ ａ ５、Ｄｏｌ ａ ５．０１０１）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ属種（Ｄｏｌ ｂアグルチニン）、Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ属種（Ｄｏｌ ｍ １、Ｄｏｌ ｍ １．０１０１、Ｄｏｌ ｍ １．０２、Ｄｏｌ ｍ ２、Ｄｏｌ ｍ ２．０１０１、Ｄｏｌ ｍ ５、Ｄｏｌ ｍ ５．０１０１、Ｄｏｌ ｍ ５．０２）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属種（Ｄｒｏ ａｎ ７、Ｄｒｏ ａｎ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｅｒ ７、Ｄｒｏ ｅｒ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｅｒ ７．０１０２、Ｄｒｏ ｇｒ ７、Ｄｒｏ ｇｒ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｇｒ ７．０１０２、Ｄｒｏ ｍ ７、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０２、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０３、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０４、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０５、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０６、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０７、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０８、Ｄｒｏ ｍ ７．０１０９、Ｄｒｏ ｍ ７．０１１０、Ｄｒｏ ｍ ７．０１１１、Ｄｒｏ ｍ ７．０１１２、Ｄｒｏ ｍ ７．０１１３、Ｄｒｏ ｍ ９、Ｄｒｏ ｍ ＭｎＳＯＤ、Ｄｒｏ ｍｏ ７、Ｄｒｏ ｍｏ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｐｐ ７、Ｄｒｏ ｐｐ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｓｅ ７、Ｄｒｏ ｓｅ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｓｉ ７、Ｄｒｏ ｓｉ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｓｉ ７．０１０２、Ｄｒｏ ｖｉ ７、Ｄｒｏ ｖｉ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｗｉ ７、Ｄｒｏ ｗｉ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｙ ７、Ｄｒｏ ｙ ７．０１０１、Ｄｒｏ ｙ ７．０１０２、Ｄｒｏ ｙ ７．０１０３）、Ｅｃｈｉｕｍ属種（Ｅｃｈ ｐチトクロームＣ）、Ｅｌａｅｉｓ属種（Ｅｌａ ｇ ２、Ｅｌａ ｇ Ｂｄ３１ｋＤ）、Ｅｌｏｐｓ属種（Ｅｌｏ ｓａ １）、Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ属種（Ｅｍｂ ａ １、Ｅｍｂ ｉ １、Ｅｍｂ ｎｚ １、Ｅｍｂ ｔ １）、Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ属種（Ｅｎｇ ｅ １）、Ｅｎｔｅｒｏｃｔｏｐｕｓ属種（Ｅｎｔ ｄ １）、Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ属種（Ｅｐｉ ｂｌ １、Ｅｐｉ ｃｏ １、Ｅｐｉ ｆｌ １、Ｅｐｉ ｍｃ １、Ｅｐｉ ｍｏ １）、Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ属種（Ｅｐｉ ｐ １、Ｅｐｉ ｐ １．０１０１、Ｅｐｉ ｐ １２ｋＤ、Ｅｐｉ ｐ ＧＳＴ）、Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ属種（Ｅｐｉ ｐｏ １、Ｅｐｉ ｕｎ １）、Ｅｑｕｉｓｅｔｕｍ属種（Ｅｑｕ ａ １７ｋＤ）、Ｅｑｕｕｓ属種（Ｅｑｕ ａｓ ４、Ｅｑｕ ａｓ ＤＳＡ、Ｅｑｕ ｂｕ ４、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ １．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ２．０１０２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ３．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ４．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ５、Ｅｑｕ ｃ ５．０１０１、Ｅｑｕ ｃ ＡＬＡ、Ｅｑｕ ｃ ＢＬＧ、Ｅｑｕ ｃカゼイン、Ｅｑｕ ｃカゼインベータ、Ｅｑｕ ｃカゼインカッパ、Ｅｑｕ ｃ ＰＲＶＢ、Ｅｑｕ ｈｅ ４、Ｅｑｕ ｚ ＺＳＡ）、Ｅｒｉｍａｃｒｕｓ属種（Ｅｒｉ ｉ １、Ｅｒｉ ｉ １．０１０１、Ｅｒｉ ｉ １．０１０２）、Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ属種（Ｅｒｉ ｓ １、Ｅｒｉ ｓ １．０１０１、Ｅｒｉ ｓ ２）、Ｅｒｗｉｎｉａ属種（Ｅｒｗ ｃｈアスパラギナーゼ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種（Ｅｓｃ ｃアスパラギナーゼ、Ｅｓｃ ｃベータＧＡＬ）、Ｅｓｏｘ属種（Ｅｓｏ Ｉ １）、Ｅｕｐｈａｕｓｉａ属種（Ｅｕｐ ｐ １、Ｅｕｐ ｐ １．０１０１）、Ｅｕｐｈａｓｉａ属種（Ｅｕｐ ｓ １、Ｅｕｐ ｓ １．０１０１）、Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属種（Ｅｕｒ ｍ １、Ｅｕｒ ｍ １．０１０１、Ｅｕｒ ｍ １．０１０２、
Ｅｕｒ ｍ １．０１０３、Ｅｕｒ ｍ １０、Ｅｕｒ ｍ １４、Ｅｕｒ ｍ １４．０１０１、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｅｕｒ ｍ ２．０１０１、Ｅｕｒ ｍ ２．０１０２、Ｅｕｒ ｍ ３、Ｅｕｒ ｍ ３．０１０１、Ｅｕｒ ｍ ４、Ｅｕｒ ｍ ４．０１０１）、Ｅｖｙｎｎｉｓ属種（Ｅｖｙ ｊ １）、Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ属種（Ｆａｇ ｅ １、Ｆａｇ ｅ １．０１０１、Ｆａｇ ｅ １０ｋＤ、Ｆａｇ ｅ １９ｋＤ、Ｆａｇ ｅ ２、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１、Ｆａｇ ｅ ＴＩ）、Ｆａｇｕｓ属種（Ｆａｇ ｓ １、Ｆａｇ ｓ １．０１０１、Ｆａｇ ｓ ２、Ｆａｇ ｓ ４）、Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ属種（Ｆａｇ ｔ １、Ｆａｇ ｔ １０ｋＤ、Ｆａｇ ｔ ２、Ｆａｇ ｔ ２．０１０１）、Ｆｅｌｉｓ属種（Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ １．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ２．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ３．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ４．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ５、Ｆｅｌ ｄ ５．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ６、Ｆｅｌ ｄ ６．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ７、Ｆｅｌ ｄ ７．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ８、Ｆｅｌ ｄ ８．０１０１、Ｆｅｌ ｄ ＩｇＧ）、Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｆｅｎ ｃ １、Ｆｅｎ ｃ ２、Ｆｅｎ ｍｅ １、Ｆｅｎ ｍｅ １．０１０１）、Ｆｅｓｔｕｃａ属種（Ｆｅｓ ｅ １、Ｆｅｓ ｅ １３、Ｆｅｓ ｅ ４、Ｆｅｓ ｅ ５、Ｆｅｓ ｅ ７、Ｆｅｓ ｐ １、Ｆｅｓ ｐ １３、Ｆｅｓ ｐ ４、Ｆｅｓ ｐ ４．０１０１、Ｆｅｓ ｐ ５、Ｆｅｓ ｒ １、Ｆｅｓ ｒ ５）、Ｆｉｃｕｓ属種（Ｆｉｃ ｃ １７ｋＤ、Ｆｉｃ ｃ ４、Ｆｉｃ ｃ Ｆｉｃｉｎ）、Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ属種（Ｆｏｅ ｖ １、Ｆｏｅ ｖ ２）、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ属種（Ｆｏｒ ｓ １）、Ｆｏｒｃｉｐｏｍｙｉａ属種（Ｆｏｒ ｔ １、Ｆｏｒ ｔ １．０１０１、Ｆｏｒ ｔ ２、Ｆｏｒ ｔ ２．０１０１、Ｆｏｒ ｔ ７、Ｆｏｒ ｔ ＦＰＡ、Ｆｏｒ ｔ Ｍｙｏｓｉｎ、Ｆｏｒ ｔ ＴＰＩ）、Ｆｒａｇａｒｉａ属種（Ｆｒａ ａ １、Ｆｒａ ａ １．０１０１、Ｆｒａ ａ ３、Ｆｒａ ａ ３．０１０１、Ｆｒａ ａ ３．０１０２、Ｆｒａ ａ ３．０２０１、Ｆｒａ ａ ３．０２０２、Ｆｒａ ａ ３．０２０３、Ｆｒａ ａ ３．０２０４、Ｆｒａ ａ ３．０３０１、Ｆｒａ ａ ４、Ｆｒａ ａ ４．０１０１、Ｆｒａ ｃ １）、Ｆｒａｘｉｎｕｓ属種（Ｆｒａ ｅ １、Ｆｒａ ｅ １．０１０１、Ｆｒａ ｅ １．０１０２、Ｆｒａ ｅ １．０２０１、Ｆｒａ ｅ １２、Ｆｒａ ｅ ２、Ｆｒａ ｅ ３、Ｆｒａ ｅ ９）、Ｆｒａｇａｒｉａ属種（Ｆｒａ ｖ １）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種（Ｆｕｓ ｃ １、Ｆｕｓ ｃ １．０１０１、Ｆｕｓ ｃ ２、Ｆｕｓ ｃ ２．０１０１、Ｆｕｓ ｃ ３、Ｆｕｓ ｓ １、Ｆｕｓ ｓ ４５ｋＤ、Ｆｕｓ ｓｐリパーゼ）、Ｇａｄｕｓ属種（Ｇａｄ ｃ １、Ｇａｄ ｃ １．０１０１、Ｇａｄ ｃ ＡＰＤＨ、Ｇａｄ ｍ １、Ｇａｄ ｍ １．０１０１、Ｇａｄ ｍ １．０１０２、Ｇａｄ ｍ １．０２０１、Ｇａｄ ｍ １．０２０２、Ｇａｄ ｍ ４５ｋＤ、Ｇａｄ ｍゼラチン、Ｇａｄ ｍａ １）、Ｇａｌｌｕｓ属種（Ｇａｌ ｄ １、Ｇａｌ ｄ １．０１０１、Ｇａｌ ｄ ２、Ｇａｌ ｄ ２．０１０１、Ｇａｌ ｄ ３、Ｇａｌ ｄ ３．０１０１、Ｇａｌ ｄ ４、Ｇａｌ ｄ ４．０１０１、Ｇａｌ ｄ ５、Ｇａｌ ｄ ５．０１０１、Ｇａｌ ｄ ６、Ｇａｌ ｄ ６．０１０１、Ｇａｌ ｄ Ａｐｏ Ｉ、Ｇａｌ ｄ Ａｐｏ ＶＩ、Ｇａｌ ｄ ＧＰＩ、Ｇａｌ ｄ ＨＧ、Ｇａｌ ｄ ＩｇＹ、Ｇａｌ ｄ Ｌ－ＰＧＤＳ、Ｇａｌ ｄオボムチン、Ｇａｌ ｄホスビチン、Ｇａｌ ｄ ＰＲＶＢ、Ｇａｌ ｌａ ４）、Ｇａｌｌｅｒｉａ属種（Ｇａｌ ｍ １８ｋＤ、Ｇａｌ ｍ ２４ｋＤ）、Ｇａｌｌｕｓ属種（Ｇａｌ ｓｏ ４）、Ｇａｍｍａｒｕｓ属種（Ｇａｍ ｓ ＴＭ）、Ｇｅｌｏｎｉｕｍ属種（Ｇｅｌ ｍ ＲＩＰ）、Ｇｅｏｔｈｅｌｐｈｕｓａ属種（Ｇｅｏ ｄｅ １）、Ｇｌｏｓｓｉｎａ属種（Ｇｌｏ ｍ ５、Ｇｌｏ ｍ ５．０１０１、Ｇｌｏ ｍ ７、Ｇｌｏ ｍ ７．０１０１、Ｇｌｏ ｍ ７．０１０２、Ｇｌｏ ｍ ７．０１０３）、Ｇｌｙｃｉｎｅ属種（Ｇｌｙ ａ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ａｒ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｃａ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｃｌ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｃｕ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｃｙ Ｂｄ３０Ｋ）、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ属種（Ｇｌｙ ｄ １０、Ｇｌｙ ｄ １０．０１０１、Ｇｌｙ ｄ １３、Ｇｌｙ ｄ ２、Ｇｌｙ ｄ ２．０１０１、Ｇｌｙ ｄ ２．０２０１、Ｇｌｙ ｄ ２．０３、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｌ１、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｌ２、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｌ３、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｌ４、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｒ１、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｒ２、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｒ３、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｒ４、Ｇｌｙ ｄ ２／Ｌｅｐ ｄ ２ Ｒ５、Ｇｌｙ ｄ ２０、Ｇｌｙ ｄ ３、Ｇｌｙ ｄ ５、Ｇｌｙ ｄ ５．０１、Ｇｌｙ ｄ ５．０２、Ｇｌｙ ｄ ７、Ｇｌｙ ｄ ８）、Ｇｌｙｃｉｎｅ属種（Ｇｌｙ ｆ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ Ｉ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ １．０１０１、Ｇｌｙ ｍ １．０１０２、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ２．０１０１、Ｇｌｙ ｍ ２Ｓアルブミン、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ３．０１０１、Ｇｌｙ ｍ ３．０１０２、Ｇｌｙ ｍ ３９ｋＤ、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｇｌｙ ｍ ４．０１０１、Ｇｌｙ ｍ ５、Ｇｌｙ ｍ ５．０１０１、Ｇｌｙ ｍ ５．０２０１、Ｇｌｙ ｍ ５．０３０１、Ｇｌｙ ｍ ５．０３０２、Ｇｌｙ ｍ ５０ｋＤ、Ｇｌｙ ｍ ６、Ｇｌｙ ｍ ６．０１０１、Ｇｌｙ ｍ ６．０２０１、Ｇｌｙ ｍ ６．０３０１、Ｇｌｙ ｍ ６．０４０１、Ｇｌｙ ｍ ６．０５０１、Ｇｌｙ ｍ ６８ｋＤ、Ｇｌｙ ｍアグルチニン、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ２８Ｋ、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ６０Ｋ、Ｇｌｙ ｍ ＣＰＩ、Ｇｌｙ ｍ ＥＡＰ、Ｇｌｙ ｍ ＴＩ、Ｇｌｙ ｍｉ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｓ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｔ Ｂｄ３０Ｋ、Ｇｌｙ ｔｏ Ｂｄ３０Ｋ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ属種（Ｇｏｓ ｈビシリン）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属種（Ｈａｅ ｉｎ Ｐ６）、Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ属種（Ｈａｅ Ｉ ７、Ｈａｅ Ｉ ７．０１０１、Ｈａｅ ｑ ７、Ｈａｅ ｑ ７．０１０１）、Ｈａｌｉｏｔｉｓ属種（Ｈａｌ ａ １、Ｈａｌ ｄ １、Ｈａｌ ｄｉ １、Ｈａｌ ｄｉ ＰＭ、Ｈａｌ ｍ １、Ｈａｌ ｍ １．０１０１、Ｈａｌ ｒ １、Ｈａｌ ｒ ４９ｋＤ、Ｈａｌ ｒｕ １）、Ｈａｒｍｏｎｉａ属種（Ｈａｒ ａ １、Ｈａｒ ａ １．０１０１、Ｈａｒ ａ ２、Ｈａｒ ａ ２．０１０１）、Ｈａｒｐｅｇｎａｔｈｏｓ属種（Ｈａｒ ｓａ ７、Ｈａｒ ｓａ ７．０１０１、Ｈａｒ ｓａ ７．０１０２）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属種（Ｈｅｌ ａ １、Ｈｅｌ ａ １．０１０１、Ｈｅｌ ａ ２、Ｈｅｌ ａ ２．０１０１、Ｈｅｌ ａ ２Ｓアルブミン、Ｈｅｌ ａ ３、Ｈｅｌ ａ ３．０１０１、Ｈｅｌ ａ ４）、Ｈｅｌｉｘ属種（Ｈｅｌ ａｐ １、Ｈｅｌ ａｓ １、Ｈｅｌ ａｓ １．０１０１）、Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ属種（Ｈｅｌ ｐ ３、Ｈｅｌ ｐ ３．０１０１）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属種（Ｈｅｌ ｔｕ １）、Ｈｅｍａｎｔｈｉａｓ属種（Ｈｅｍ ｌｅ １）、Ｈｅｍｉｆｕｓｕｓ属種（Ｈｅｍ ｔ １）、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ属種（Ｈｅｔ ｇ ３、Ｈｅｔ ｇ ３．０１０１）、Ｈｅｖｅａ属種（Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ １．０１０１、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １０．０１０１、Ｈｅｖ ｂ １０．０１０２、Ｈｅｖ ｂ １０．０１０３、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １１．０１０１、Ｈｅｖ ｂ １１．０１０２、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １２．０１０１、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｅｖ ｂ １３．０１０１、Ｈｅｖ ｂ １４、Ｈｅｖ ｂ １４．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ２．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ３．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ４．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ５．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０２０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ７．Ｄ２、Ｈｅｖ ｂ ７．Ｓ２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ８．０１０１、Ｈｅｖ ｂ ８．０１０２、Ｈｅｖ ｂ ８．０２０１、Ｈｅｖ ｂ ８．０２０２、Ｈｅｖ ｂ ８．０２０３、Ｈｅｖ ｂ ８．０２０４、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ ９．０１０１、Ｈｅｖ ｂクエン酸結合タンパク質、Ｈｅｖ ｂ ＧＡＰＤＨ、Ｈｅｖ ｂ ＨＳＰ８０、Ｈｅｖ ｂ ＩＦＲ、Ｈｅｖ ｂプロテアソームサブユニット、Ｈｅｖ ｂロタマーゼ、Ｈｅｖ ｂ ＳＰＩ、Ｈｅｖ ｂ Ｔｒｘ、Ｈｅｖ ｂ ＵＤＰＧＰ）、Ｈｅｘａｇｒａｍｍｏｓ属種（Ｈｅｘ ｏｔ １）、Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ属種（Ｈｉｐ ｈ １）、Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ属種（Ｈｉｐ ｐｌ １）、Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ属種（Ｈｉｐ ｓｔ １）、Ｈｉｒｕｄｏ属種（Ｈｉｒ ｍｅヒルジン）、Ｈｏｌｃｕｓ属種（Ｈｏｌ Ｉ １、Ｈｏｌ Ｉ １．０１０１、Ｈｏｌ Ｉ １．０１０２、Ｈｏｌ Ｉ ２、Ｈｏｌ Ｉ ４、Ｈｏｌ Ｉ ５、Ｈｏｌ Ｉ ５．０１０１、Ｈｏｌ Ｉ ５．０２０１）、Ｈｏｌｏｃｎｅｍｕｓ属種（Ｈｏｌ ｐ１ ９、Ｈｏｌ ｐ１ヘモシアニン）、Ｈｏｍａｒｕｓ属種（Ｈｏｍ ａ １、Ｈｏｍ ａ １．０１０１、Ｈｏｍ ａ １．０１０２、Ｈｏｍ ａ １．０１０３、Ｈｏｍ ａ ３、Ｈｏｍ ａ ３．０１０１、Ｈｏｍ ａ ４、Ｈｏｍ ａ ６、Ｈｏｍ ａ ６．０１０１、Ｈｏｍ ｇ １、Ｈｏｍ ｇ ２）、Ｈｏｍｏ属種（Ｈｏｍ ｓ １、Ｈｏｍ ｓ １．０１０１、Ｈｏｍ ｓ ２、Ｈｏｍ ｓ ２．０１０１、Ｈｏｍ ｓ ３、Ｈｏｍ ｓ ３．０１０１、Ｈｏｍ ｓ ４、Ｈｏｍ ｓ ４．０１０１、Ｈｏｍ ｓ ５、Ｈｏｍ ｓ ５．０１０１、Ｈｏｍ ｓ ＡＡＴ、Ｈｏｍ ｓ ＡＣＴＨ、Ｈｏｍ ｓアダリムマブ、Ｈｏｍ ｓ ＡＬＡ、Ｈｏｍ ｓアルファアクチン、Ｈｏｍ ｓアルファ－ガラクトシダーゼ、Ｈｏｍ ｓ ＡＰＤＨ、Ｈｏｍ ｓアリルスルファターゼＢ、Ｈｏｍ ｓカゼイン、Ｈｏｍ ｓ ＣｙＰ Ａ、Ｈｏｍ ｓ ＣｙＰ Ｂ、Ｈｏｍ ｓ ＣｙＰ Ｃ、Ｈｏｍ ｓ ＤＳＦ７０、Ｈｏｍ ｓ ＤＳＧ３、Ｈｏｍ ｓ ｅＩＦ６、Ｈｏｍ ｓエタネルセプト、Ｈｏｍ ｓ第ＩＸ因子、Ｈｏｍ ｓ第ＶＩＩ因子、Ｈｏｍ ｓ第ＶＩＩＩ因子、Ｈｏｍ ｓ Ｇ－ＣＳＦ、Ｈｏｍ ｓグルコセレブロシダーゼ、Ｈｏｍ ｓグルコシダーゼ、Ｈｏｍ ｓ ＨＬＡ－ＤＲ－アルファ、Ｈｏｍ ｓ ＨＳＡ、Ｈｏｍ ｓイズロニダーゼ、Ｈｏｍ ｓイデュルスルファーゼ、Ｈｏｍ ｓ ＩｇＡ、Ｈｏｍ ｓインスリン、Ｈｏｍ ｓラクトフェリン、Ｈｏｍ ｓラミニンガンマ＿２、Ｈｏｍ ｓ ＭｎＳＯＤ、Ｈｏｍ ｓオキシトシン、Ｈｏｍ ｓ Ｐ２、Ｈｏｍ ｓホスビチン、Ｈｏｍ ｓプロフィリン、Ｈｏｍ ｓ ＰＳＡ、Ｈｏｍ ｓ ＲＰ１、Ｈｏｍ ｓ ＴＣＴＰ、Ｈｏｍ ｓ ＴＬ、Ｈｏｍ ｓ ＴＰＡ、Ｈｏｍ ｓ ＴＰＯ、Ｈｏｍ ｓトランスアルドラーゼ、Ｈｏｍ ｓ Ｔｒｘ、Ｈｏｍ ｓチューブリン－アルファ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍバシリキシマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍセツキシマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍセツキシマブ（Ｇａｌ－Ｇａｌ）、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍインフリキシマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍナタリズマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍオマリズマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍパリビズマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍリツキシマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍトシリズマブ、Ｈｏｍ ｓ／Ｍｕｓ ｍトラスツズマブ）、Ｈｏｐｌｏｓｔｅｔｈｕｓ属種（Ｈｏｐ ａ １）、Ｈｏｒｄｅ
ｕｍ属種（Ｈｏｒ ｖ １、Ｈｏｒ ｖ １２、Ｈｏｒ ｖ １２．０１０１、Ｈｏｒ ｖ １３、Ｈｏｒ ｖ １４、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １５．０１０１、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １６．０１０１、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ １７．０１０１、Ｈｏｒ ｖ １８ｋＤ、Ｈｏｒ ｖ ２、Ｈｏｒ ｖ ２１、Ｈｏｒ ｖ ２１．０１０１、Ｈｏｒ ｖ ２８、Ｈｏｒ ｖ ３３、Ｈｏｒ ｖ ４、Ｈｏｒ ｖ ５、Ｈｏｒ ｖ ５．０１０１、Ｈｏｒ ｖ ＢＤＡＩ、Ｈｏｒ ｖ ＢＴＩ）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属種（Ｈｕｍ ｉｎセルラーゼ）、Ｈｕｍｕｌｕｓ属種（Ｈｕｍ ｊ １、Ｈｕｍ ｊ １．０１０１、Ｈｕｍ ｊ １０ｋＤ、Ｈｕｍ ｊ ２）、Ｈｕｓｏ属種（Ｈｕｓ ｈ １）、Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ属種（Ｈｙｌ ｕｎ ＬＴＰ）、Ｈｙｍｅｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ属種（Ｈｙｍ ｓｔ １）、Ｈｙｐｅｒｏｇｌｙｐｈｅ属種（Ｈｙｐ ｂｙ １）、Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｈｙｐ ｍｏ １）、Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙ属種（Ｈｙｐ ｎｏ １）、Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ属種（Ｉｃｔ ｆｕ １、Ｉｃｔ ｐ １）、Ｉｍｐｅｒａｔａ属種（Ｉｍｐ ｃ ４、Ｉｍｐ ｃ ５、Ｉｍｐ ｃ ＶＩＩＩｅｌ）、Ｉｘｏｄｅｓ属種（Ｉｘｏ ｒ ２、Ｉｘｏ ｓｃ ７、Ｉｘｏ ｓｃ ７．０１０１）、Ｊａｓｕｓ属種（Ｊａｓ ｌａ １、Ｊａｓ ｌａ １．０１０１、Ｊａｓ ｌａ １．０１０２）、Ｊｕｇｌａｎｓ属種（Ｊｕｇ ｃａ １、Ｊｕｇ ｃａ ２、Ｊｕｇ ｃｉ １、Ｊｕｇ ｃｉ ２、Ｊｕｇ ｎ １、Ｊｕｇ ｎ １．０１０１、Ｊｕｇ ｎ ２、Ｊｕｇ ｎ ２．０１０１、Ｊｕｇ ｒ １、Ｊｕｇ ｒ １．０１０１、Ｊｕｇ ｒ ２、Ｊｕｇ ｒ ２．０１０１、Ｊｕｇ ｒ ３、Ｊｕｇ ｒ ３．０１０１、Ｊｕｇ ｒ ４、Ｊｕｇ ｒ ４．０１０１、Ｊｕｇ ｒ ５）、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ属種（Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ １．０１０１、Ｊｕｎ ａ １．０１０２、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ２．０１０１、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ａ ３．０１０１、Ｊｕｎ ｃ １、Ｊｕｎ ｏ １、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｏ ４．０１０１、Ｊｕｎ ｒ ３、Ｊｕｎ ｒ ３．１、Ｊｕｎ ｒ ３．２、Ｊｕｎ ｖ １、Ｊｕｎ ｖ １．０１０１、Ｊｕｎ ｖ １．０１０２、Ｊｕｎ ｖ ３、Ｊｕｎ ｖ ３．０１０１、Ｊｕｎ ｖ ３．０１０２、Ｊｕｎ ｖ ４）、Ｋａｔｓｕｗｏｎｕｓ属種（Ｋａｔ ｐ １）、Ｋｙｐｈｏｓｕｓ属種（Ｋｙｐ ｓｅ １）、Ｌａｃｈｎｏｌａｉｍｕｓ属種（Ｌａｃ ｍａ １）、Ｌａｃｈｅｓｉｓ属種（Ｌａｃ ｍｕ １）、Ｌａｃｔｕｃａ属種（Ｌａｃ ｓ １、Ｌａｃ ｓ １．０１０１）、Ｌａｇｏｃｅｐｈａｌｕｓ属種（Ｌａｇ ｌａ １）、Ｌａｒｕｓ属種（Ｌａｒ ａ １、Ｌａｒ ａ ２、Ｌａｒ ａ ３）、Ｌａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｌａｒ ｐｏ １）、Ｌａｔｅｓ属種（Ｌａｔ ｃ １）、Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘ属種（Ｌａｔ ｊａ １）、Ｌａｔｈｙｒｕｓ属種（Ｌａｔ ｏｃアグルチニン）、Ｌｅｉｏｓｔｏｍｕｓ属種（Ｌｅｉ ｘａ １）、Ｌｅｎｓ属種（Ｌｅｎ ｃ １、Ｌｅｎ ｃ １．０１０１、Ｌｅｎ ｃ １．０１０２、Ｌｅｎ ｃ １．０１０３、Ｌｅｎ ｃ ２、Ｌｅｎ ｃ ２．０１０１、Ｌｅｎ ｃ ３、Ｌｅｎ ｃ ３．０１０１、Ｌｅｎ ｃアグルチニン）、Ｌｅｏｐａｒｄｕｓ属種（Ｌｅｏ ｐ １）、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ属種（Ｌｅｐ ｄ １０、Ｌｅｐ ｄ １０．０１０１、Ｌｅｐ ｄ １２、Ｌｅｐ ｄ １３、Ｌｅｐ ｄ １３．０１０１、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ２．０１０１、Ｌｅｐ ｄ ２．０１０２、Ｌｅｐ ｄ ２．０２０１、Ｌｅｐ ｄ ２．０２０２、Ｌｅｐ ｄ ３、Ｌｅｐ ｄ ３９ｋＤ、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ５．０１０１、Ｌｅｐ ｄ ５．０１０２、Ｌｅｐ ｄ ５．０１０３、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ ７．０１０１、Ｌｅｐ ｄ ８、Ｌｅｐ ｄアルファチューブリン）、Ｌｅｐｏｍｉｓ属種（Ｌｅｐ ｇｉ １）、Ｌｅｐｔｏｍｅｌａｎｏｓｏｍａ属種（Ｌｅｐ ｉ １）、Ｌｅｐｏｍｉｓ属種（Ｌｅｐ ｍａ １）、Ｌｅｐｉｓｍａ属種（Ｌｅｐ ｓ １、Ｌｅｐ ｓ １．０１０１、Ｌｅｐ ｓ １．０１０２）、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属種（Ｌｅｐ ｓａ １、Ｌｅｐ ｓａ １．０１０１、Ｌｅｐ ｓａ １．０１０２、Ｌｅｐ ｓａ １．０１０３）、Ｌｅｐｔａｉｌｕｒｕｓ属種（Ｌｅｐ ｓｅ １）、Ｌｅｐｉｄｏｒｈｏｍｂｕｓ属種（Ｌｅｐ ｗ １、Ｌｅｐ ｗ １．０１０１）、Ｌｅｔｈｏｃｅｒｕｓ属種（Ｌｅｔ ｉｎ ７、Ｌｅｔ ｉｎ ７．０１０１、Ｌｅｔ ｉｎ ７．０１０２）、Ｌｅｕｃｉｓｃｕｓ属種（Ｌｅｕ ｃｅ １）、Ｌｅｗｉａ属種（Ｌｅｗ ｉｎ １）、Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ属種（Ｌｉｇ ｖ １、Ｌｉｇ ｖ １．０１０１、Ｌｉｇ ｖ １．０１０２、Ｌｉｇ ｖ ２）、Ｌｉｌｉｕｍ属種（Ｌｉｌ Ｉ ２、Ｌｉｌ Ｉ ＰＧ）、Ｌｉｍａｎｄａ属種（Ｌｉｍ ｆｅ １）、Ｌｉｍｎｏｎｅｃｔｅｓ属種（Ｌｉｍ ｍ １）、Ｌｉｍｕｌｕｓ属種（Ｌｉｍ ｐ １、Ｌｉｍ ｐ １．０１０１、Ｌｉｍ ｐ ２、Ｌｉｍ ｐ ＬＰＡ）、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ属種（Ｌｉｐ ｂ １、Ｌｉｐ ｂ １．０１０１）、Ｌｉｔｃｈｉ属種（Ｌｉｔ ｃ １、Ｌｉｔ ｃ １．０１０１、Ｌｉｔ ｃ ＩＦＲ、Ｌｉｔ ｃ ＴＰＩ）、Ｌｉｔｈｏｂａｔｅｓ属種（Ｌｉｔ ｃａ １）、Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｌｉｔ ｓｅ １、Ｌｉｔ ｖ １、Ｌｉｔ ｖ １．０１０１、Ｌｉｔ ｖ ２、Ｌｉｔ ｖ ２．０１０１、Ｌｉｔ ｖ ３、Ｌｉｔ ｖ ３．０１０１、Ｌｉｔ ｖ ４、Ｌｉｔ ｖ ４．０１０１）、Ｆｉｌｉａｒｉａ属種（Ｌｏａ ｌｏ ３、Ｌｏａ ｌｏ ３．０１０１）、Ｌｏｂｏｔｅｓ属種（Ｌｏｂ ｓｕ １）、Ｌｏｃｕｓｔａ属種（Ｌｏｃ ｍ ７、Ｌｏｃ ｍ ７．０１０１）、Ｌｏｌｉｇｏ属種（Ｌｏｌ ｂ １、Ｌｏｌ ｅ １）、Ｌｏｌｉｕｍ属種（Ｌｏｌ ｍ ２、Ｌｏｌ ｍ ５、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ １．０１０１、Ｌｏｌ ｐ １．０１０２、Ｌｏｌ ｐ １．０１０３、Ｌｏｌ ｐ １０、Ｌｏｌ ｐ １１、Ｌｏｌ ｐ １１．０１０１、Ｌｏｌ ｐ １２、Ｌｏｌ ｐ １３、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ２．０１０１、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ３．０１０１、Ｌｏｌ ｐ ４、Ｌｏｌ ｐ ４．０１０１、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ ５．０１０１、Ｌｏｌ ｐ ５．０１０２、Ｌｏｌ ｐ ７、Ｌｏｌ ｐ ＣｙＰ、Ｌｏｌ ｐ ＦＴ、Ｌｏｌ ｐ Ｌｅｇｕｍｉｎ）、Ｌｏｎｏｍｉａ属種（Ｌｏｎ ｏ ７、Ｌｏｎ ｏ ７．０１０１）、Ｌｏｐｈｏｄｙｔｅｓ属種（Ｌｏｐ ｃｕ １）、Ｌｏｐｈｏｎｅｔｔａ属種（Ｌｏｐ ｓｐ １）、Ｌｕｐｉｎｕｓ属種（Ｌｕｐ ａ １、Ｌｕｐ ａアルファコングルチン、Ｌｕｐ ａデルタコングルチン、Ｌｕｐ ａガンマコングルチン、Ｌｕｐ ａｎ １、Ｌｕｐ ａｎ １．０１０１、Ｌｕｐ ａｎアルファコングルチン、Ｌｕｐ ａｎデルタコングルチン、Ｌｕｐ ａｎガンマコングルチン、Ｌｕｐ Ｉ １７ｋＤ）、Ｌｕｔｊａｎｕｓ属種（Ｌｕｔ ａ １、Ｌｕｔ ｃ １、Ｌｕｔ ｃｙ １、Ｌｕｔ ｇｒ １、Ｌｕｔ ｇｕ １、Ｌｕｔ ｊｏ １）、Ｌｕｔｒａｒｉａ属種（Ｌｕｔ ｐ １）、Ｌｕｔｊａｎｕｓ属種（Ｌｕｔ ｐｕ １、Ｌｕｔ ｓｙ １）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属種（Ｌｙｃ ｅ １、Ｌｙｃ ｅ １．０１０１、Ｌｙｃ ｅ １１Ｓグロブリン、Ｌｙｃ ｅ ２、Ｌｙｃ ｅ ２．０１０１、Ｌｙｃ ｅ ２．０１０２、Ｌｙｃ ｅ ３、Ｌｙｃ ｅ ３．０１０１、Ｌｙｃ ｅ ４、Ｌｙｃ ｅ ４．０１０１、Ｌｙｃ ｅ ＡＲＰ６０Ｓ、Ｌｙｃ ｅキチナーゼ、Ｌｙｃ ｅグルカナーゼ、Ｌｙｃ ｅペルオキシダーゼ、Ｌｙｃ ｅ ＰＧ、Ｌｙｃ ｅ ＰＭＥ、Ｌｙｃ ｅ ＰＲ２３、Ｌｙｃ ｅビシリン）、Ｍａｃｏｎｅｌｌｉｃｏｃｃｕｓ属種（Ｍａｃ ｈ ７、Ｍａｃ ｈ ７．０１０１）、Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ属種（Ｍａｃ ｍａ １、Ｍａｃ ｎ １）、Ｍａｃｌｕｒａ属種（Ｍａｃ ｐｏ １７ｋＤ）、Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ属種（Ｍａｃ ｒｏ １、Ｍａｃ ｒｏ １．０１０１、Ｍａｃ ｒｏヘモシアニン）、Ｍａｃｒｏｐｕｓ属種（Ｍａｃｒ ｓゼラチン）、Ｍａｌｕｓ属種（Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ １．０１０１、Ｍａｌ ｄ １．０１０２、Ｍａｌ ｄ １．０１０３、Ｍａｌ ｄ １．０１０４、Ｍａｌ ｄ １．０１０５、Ｍａｌ ｄ １．０１０６、Ｍａｌ ｄ １．０１０７、Ｍａｌ ｄ １．０１０８、Ｍａｌ ｄ １．０１０９、Ｍａｌ ｄ １．０２０１、Ｍａｌ ｄ １．０２０２、Ｍａｌ ｄ １．０２０３、Ｍａｌ ｄ １．０２０４、Ｍａｌ ｄ １．０２０５、Ｍａｌ ｄ １．０２０６、Ｍａｌ ｄ １．０２０７、Ｍａｌ ｄ １．０２０８、Ｍａｌ ｄ １．０３０１、Ｍａｌ ｄ １．０３０２、Ｍａｌ ｄ １．０３０３、Ｍａｌ ｄ １．０３０４、Ｍａｌ ｄ １．０４０１、Ｍａｌ ｄ １．０４０２、Ｍａｌ ｄ １．０４０３、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ２．０１０１、Ｍａｌ ｄ ３、Ｍａｌ ｄ ３．０１０１、Ｍａｌ ｄ ３．０１０２、Ｍａｌ ｄ ３．０２０１、Ｍａｌ ｄ ３．０２０２、Ｍａｌ ｄ ３．０２０３、Ｍａｌ ｄ ４、Ｍａｌ ｄ ４．０１０１、Ｍａｌ ｄ ４．０１０２、Ｍａｌ ｄ ４．０２０１、Ｍａｌ ｄ ４．０２０２、Ｍａｌ ｄ ４．０３０１、Ｍａｌ ｄ ４．０３０２）、Ｍａｌｐｉｇｈｉａ属種（Ｍａｌ ｇ ４、Ｍａｌ ｇヘベイン）、Ｍａｌｕｓ属種（Ｍａｌ ｐ １）、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属種（Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ２．０１０１、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ３．０１０１、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｆ ４．０１０１、Ｍａｌａ ｇ １０、Ｍａｌａ ｓ １、Ｍａｌａ ｓ １．０１０１、Ｍａｌａ ｓ １０、Ｍａｌａ ｓ １０．０１０１、Ｍａｌａ ｓ １１、Ｍａｌａ ｓ １１．０１０１、Ｍａｌａ ｓ １２、Ｍａｌａ ｓ １２．０１０１、Ｍａｌａ ｓ １３、Ｍａｌａ ｓ １３．０１０１、Ｍａｌａ ｓ ５、Ｍａｌａ ｓ ５．０１０１、Ｍａｌａ ｓ ６、Ｍａｌａ ｓ ６．０１０１、Ｍａｌａ ｓ ７、Ｍａｌａ ｓ ７．０１０１、Ｍａｌａ ｓ ８、Ｍａｌａ ｓ ８．０１０１、Ｍａｌａ ｓ ９、Ｍａｌａ ｓ ９．０１０１）、Ｍａｎｉｈｏｔ属種（Ｍａｎ ｅ ５、Ｍａｎ ｅ ５．０１０１、Ｍａｎ ｅ ＦＰＡ、Ｍａｎ ｅ ＧＡＰＤＨ）、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ属種（Ｍａｎ ｉ １、Ｍａｎ ｉ １４ｋＤ、Ｍａｎ ｉ ２、Ｍａｎ ｉ ３、Ｍａｎ ｉ ３．０１、Ｍａｎ ｉ ３．０２、Ｍａｎ ｉキチナーゼ）、Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｍａｒ ｊ １、Ｍａｒ ｊ １．０１０１、Ｍａｒ ｊ ２、Ｍａｒ ｊ ４）、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属種（Ｍａｔ ｃ １７ｋＤ）、Ｍｅｃｏｐｏｄａ属種（Ｍｅｃ ｅ ７）、Ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ属種（Ｍｅｇ ａｍ ２、Ｍｅｇ ａｍ ＣＫ）、Ｍｅｇａｔｈｕｒａ属種（Ｍｅｇ ｃヘモシアニン）、Ｍｅｇａｌｏｐｓ属種（Ｍｅｇ ｓｐ １）、Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍｕｓ属種（Ｍｅｌ ａ １）、Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ属種（Ｍｅｌ ｇ １、Ｍｅｌ ｇ ２、Ｍｅｌ ｇ ３、Ｍｅｌ ｇ ＰＲＶＢ、Ｍｅｌ ｇ ＴＳＡ）、Ｍｅｌｉｃｅｒｔｕｓ属種（Ｍｅｌ Ｉ １）、Ｍｅｎｔｉｃｉｒｒｈｕｓ属種（Ｍｅｎ ａｍ １）、Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ属種（Ｍｅｒ ａ １、Ｍｅｒ ａ １．０１０１）、Ｍｅｒｌｕｃｃｉｕｓ属種（Ｍｅｒ ａｐ １、Ｍｅｒ ａｕ １、Ｍｅｒ ｂｉ １、Ｍｅｒ ｃａ １、Ｍｅｒ ｇａ １、Ｍｅｒ ｈｕ １）、Ｍｅｒｌａｎｇｉｕｓ属種（Ｍｅｒ ｍｅ １）、Ｍｅｒｌｕｃｃｉｕｓ属種（Ｍｅｒ ｍｒ １、Ｍｅｒ ｐａ １、Ｍｅｒ ｐｏ １、Ｍｅｒ ｐｒ １、Ｍｅｒ ｓｅ １）、Ｍｅｒｉｏｎｅｓ属種（Ｍｅｒ ｕｎ ２３ｋＤ）、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ属種（Ｍｅｔ ａ ３０）、Ｍｅｔａｐｅｎａｅｏｐｓｉｓ属種（Ｍｅｔ ｂａ １）、Ｍｅｔ
ａｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｍｅｔ ｅ １、Ｍｅｔ ｅ １．０１０１、Ｍｅｔ ｅ ２）、Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ属種（Ｍｅｔ ｇｌ ２）、Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｍｅｔ ｊ １、Ｍｅｔ ｊ ２）、Ｍｅｔａｎｅｐｈｒｏｐｓ属種（Ｍｅｔ ｊａ １）、Ｍｅｔａｐｅｎａｅｏｐｓｉｓ属種（Ｍｅｔ ｌａ １）、Ｍｅｔａｎｅｐｈｒｏｐｓ属種（Ｍｅｔ ｔ ２）、Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓ属種（Ｍｉｃ ｐｏ １）、Ｍｉｃｒｏｐｏｇｏｎｉａｓ属種（Ｍｉｃ ｕｎ １）、Ｍｉｍａｃｈｌａｍｙｓ属種（Ｍｉｍ ｎ １）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ属種（Ｍｏｍ ｃ ＲＩＰ）、Ｍｏｒｕｓ属種（Ｍｏｒ ａ １７ｋＤ、Ｍｏｒ ａ ４）、Ｍｏｒｏｎｅ属種（Ｍｏｒ ａｍ １）、Ｍｏｒｕｓ属種（Ｍｏｒ ｎ ３、Ｍｏｒ ｎ ３．０１０１）、Ｍｏｒｏｎｅ属種（Ｍｏｒ ｓａ １、Ｍｏｒ ｓｃ １）、Ｍｕｇｉｌ属種（Ｍｕｇ ｃ １）、Ｍｕｒａｅｎｏｌｅｐｉｓ属種（Ｍｕｒ ｍｉ １）、Ｍｕｓａ属種（Ｍｕｓ ａ １、Ｍｕｓ ａ １．０１０１、Ｍｕｓ ａ ２、Ｍｕｓ ａ ２．０１０１、Ｍｕｓ ａ ３、Ｍｕｓ ａ ３．０１０１、Ｍｕｓ ａ ４、Ｍｕｓ ａ ４．０１０１、Ｍｕｓ ａ ５、Ｍｕｓ ａ ５．０１０１、Ｍｕｓ ａ ５．０１０２）、Ｍｕｓ属種（Ｍｕｓ ｍ １、Ｍｕｓ ｍ １．０１０１、Ｍｕｓ ｍ １．０１０２、Ｍｕｓ ｍ ２、Ｍｕｓ ｍゼラチン、Ｍｕｓ ｍ ＩｇＧ、Ｍｕｓ ｍ ＭＳＡ、Ｍｕｓ ｍムロモナブ、Ｍｕｓ ｍホスビチン）、Ｍｕｓｔｅｌａ属種（Ｍｕｓ ｐ １７ｋＤ）、Ｍｕｓａ属種（Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｍｕｓ ｘｐ ２、Ｍｕｓ ｘｐ ５）、Ｍｙｃｔｅｒｏｐｅｒｃａ属種（Ｍｙｃ ｂｏ １、Ｍｙｃ ｍｉ １、Ｍｙｃ ｐｈ １）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属種（Ｍｙｃ ｓｐラッカーゼ）、Ｍｙｒｍｅｃｉａ属種（Ｍｙｒ ｐ １、Ｍｙｒ ｐ １．０１０１、Ｍｙｒ ｐ ２、Ｍｙｒ ｐ ２．０１０１、Ｍｙｒ ｐ ２．０１０２、Ｍｙｒ ｐ ３、Ｍｙｒ ｐ ３．０１０１）、Ｍｙｔｉｌｕｓ属種（Ｍｙｔ ｅ １、Ｍｙｔ ｇ １、Ｍｙｔ ｇ ＰＭ）、Ｍｙｚｕｓ属種（Ｍｙｚ ｐ ７、Ｍｙｚ ｐ ７．０１０１）、Ｎｅｍｏｒｈｅｄｕｓ属種（Ｎａｅ ｇｏ Ｈｙａ）、Ｎｅｃａｔｏｒ属種（Ｎｅｃ ａカルレティキュリン）、Ｎｅｍｉｐｔｅｒｕｓ属種（Ｎｅｍ ｖｉ １）、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属種（Ｎｅｏ ｆｉ １、Ｎｅｏ ｆｉ ２２）、Ｎｅｏｃｈｅｎ属種（Ｎｅｏ ｊｕ １）、Ｎｅｏｓｃｏｎａ属種（Ｎｅｏ ｎ ７、Ｎｅｏ ｎ ７．０１０１）、Ｎｅｐｈｅｌｉｕｍ属種（Ｎｅｐ Ｉ ＧＡＰＤＨ）、Ｎｅｐｈｒｏｐｓ属種（Ｎｅｐ ｎ １、Ｎｅｐ ｎ ＤＦ９）、Ｎｅｐｔｕｎｅａ属種（Ｎｅｐ ｐｏ １、Ｎｅｐ ｐｏ １．０１０１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属種（Ｎｉｃ ｔ ８、Ｎｉｃ ｔオスモチン、Ｎｉｃ ｔビリン）、Ｎｉｍｂｙａ属種（Ｎｉｍ ｃ １、Ｎｉｍ ｓ １）、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ属種（Ｎｉｐ ｂ Ａｇｌ）、Ｎｙｃｔｉｃｅｂｕｓ属種（Ｎｙｃ ｃ １）、Ｏｃｔｏｐｕｓ属種（Ｏｃｔ ｆ １、Ｏｃｔ Ｉ １、Ｏｃｔ ｖ １、Ｏｃｔ ｖ １．０１０１、Ｏｃｔ ｖ ＰＭ）、Ｏｃｙｕｒｕｓ属種（Ｏｃｙ ｃｈ １）、Ｏｌｅａ属種（Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ １．０１０１、Ｏｌｅ ｅ １．０１０２、Ｏｌｅ ｅ １．０１０３、Ｏｌｅ ｅ １．０１０４、Ｏｌｅ ｅ １．０１０５、Ｏｌｅ ｅ １．０１０６、Ｏｌｅ ｅ １．０１０７、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｏｌｅ ｅ １０．０１０１、Ｏｌｅ ｅ １１、Ｏｌｅ ｅ １１．０１０１、Ｏｌｅ ｅ １１．０１０２、Ｏｌｅ ｅ １２、Ｏｌｅ ｅ １３、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ２．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ３．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ３６ｋＤ、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ４．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ５．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ６．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ７．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ８．０１０１、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ ９．０１０１）、Ｏｍｍａｓｔｒｅｐｈｅｓ属種（Ｏｍｍ ｂ １、Ｏｍｍ ｂ １．０１０１）、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ属種（Ｏｎｃ ｋｅ １、Ｏｎｃ ｋｅ １８ｋＤ、Ｏｎｃ ｋｅアルファ２Ｉ、Ｏｎｃ ｋｅビテロゲニン、Ｏｎｃ ｍ １、Ｏｎｃ ｍ １．０１０１、Ｏｎｃ ｍ １．０２０１、Ｏｎｃ ｍアルファ２Ｉ、Ｏｎｃ ｍプロタミン、Ｏｎｃ ｍビテロゲニン、Ｏｎｃ ｍａ １、Ｏｎｃ ｍａ ＦＰＡ、Ｏｎｃ ｍａ ＦＳＡ、Ｏｎｃ ｍａ ＴＰＩ、Ｏｎｃ ｎ １）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ属種（Ｏｎｃ ｏ ３、Ｏｎｃ ｏ ３．０１０１）、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ属種（Ｏｎｃ ｔｓ １）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ属種（Ｏｎｃ ｖ ３、Ｏｎｃ ｖ ３．０１０１）、Ｏｒａｔｏｓｑｕｉｌｌａ属種（Ｏｒａ ｏ １、Ｏｒａ ｏ １．０１０１）、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属種（Ｏｒｅ ａ １、Ｏｒｅ ｍｏ １、Ｏｒｅ ｍｏ ２、Ｏｒｅ ｍｏ ＦＰＡ、Ｏｒｅ ｍｏ ＳＣＡＦ７１４５、Ｏｒｅ ｎｉ １、Ｏｒｅ ｎｉ １８ｋＤ、Ｏｒｅ ｎｉ ４５ｋＤ）、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ属種（Ｏｒｎ ｓｙ １０、Ｏｒｎ ｓｙ １０．０１０１、Ｏｒｎ ｓｙ １０．０１０２）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ属種（Ｏｒｙ ｃ １、Ｏｒｙ ｃ １．０１０１、Ｏｒｙ ｃ ２、Ｏｒｙ ｃカゼイン、Ｏｒｙ ｃホスビチン、Ｏｒｙ ｃ ＲＳＡ）、Ｏｒｙｚａ属種（Ｏｒｙ ｓ １、Ｏｒｙ ｓ １．０１０１、Ｏｒｙ ｓ １１、Ｏｒｙ ｓ １２、Ｏｒｙ ｓ １２．０１０１、Ｏｒｙ ｓ １３、Ｏｒｙ ｓ １４、Ｏｒｙ ｓ １７ｋＤ、Ｏｒｙ ｓ １９ｋＤ、Ｏｒｙ ｓ ２、Ｏｒｙ ｓ ２３、Ｏｒｙ ｓ ３、Ｏｒｙ ｓ ７、Ｏｒｙ ｓ ａＡ＿ＴＩ、Ｏｒｙ ｓ ＧＬＰ５２、Ｏｒｙ ｓ ＧＬＰ６３、Ｏｒｙ ｓグリオキサラーゼＩ、Ｏｒｙ ｓ ＮＲＡ）、Ｏｓｔｒｙａ属種（Ｏｓｔ ｃ １、Ｏｓｔ ｃ １．０１０１）、Ｏｖｉｓ属種（Ｏｖｉ ａ ＡＬＡ、Ｏｖｉ ａ ＢＬＧ、Ｏｖｉ ａカゼイン、Ｏｖｉ ａカゼインアルファＳ１、Ｏｖｉ ａカゼインアルファＳ２、Ｏｖｉ ａカゼインベータ、Ｏｖｉ ａカゼインカッパ、Ｏｖｉ ａホスビチン、Ｏｖｉ ａ ＳＳＡ）、Ｐａｃｈｙｃｏｎｄｙｌａ属種（Ｐａｃ ｃ ３）、Ｐａｇｒｕｓ属種（Ｐａｇ ｍ １、Ｐａｇ ｐａ １）、Ｐａｍｐｕｓ属種（Ｐａｍ ａｒ １、Ｐａｍ ｃ １）、Ｐａｎｄａｌｕｓ属種（Ｐａｎ ｂ １、Ｐａｎ ｂ １．０１０１）、Ｐａｎｇａｓｉｕｓ属種（Ｐａｎ ｂｏ １）、Ｐａｎｄａｌｕｓ属種（Ｐａｎ ｅ １、Ｐａｎ ｅ １．０１０１、Ｐａｎ ｅ ４）、Ｐａｎｕｌｉｒｕｓ属種（Ｐａｎ ｈ １、Ｐａｎ ｈｙ １）、Ｐａｎｇａｓｉｕｓ属種（Ｐａｎ ｈｙ １８ｋＤ、Ｐａｎ ｈｙ ４５ｋＤ）、Ｐａｎｕｌｉｒｕｓ属種（Ｐａｎ ｊ １）、Ｐａｎｔｈｅｒａ属種（Ｐａｎ Ｉ １、Ｐａｎ ｏ １、Ｐａｎ ｐ １）、Ｐａｎｕｌｉｒｕｓ属種（Ｐａｎ ｓ １、Ｐａｎ ｓ １．０１０１）、Ｐａｎｔｈｅｒａ属種（Ｐａｎ ｔ １）、Ｐａｎ属種（Ｐａｎ ｔｒ ＴＣＴＰ）、Ｐａｐａｖｅｒ属種（Ｐａｐ ｓ １７ｋＤ、Ｐａｐ ｓ ２、Ｐａｐ ｓ ３４ｋＤ）、Ｐａｐｉｌｉｏ属種（Ｐａｐ ｘｕ ７、Ｐａｐ ｘｕ ７．０１０１、Ｐａｐ ｘｕ ７．０１０２）、Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｐａｒ ａ １）、Ｐａｒａｓｉｌｕｒｕｓ属種（Ｐａｒ ａｓ １、Ｐａｒ ｃ １）、Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ属種（Ｐａｒ ｃ １．０１０１、Ｐａｒ ｃ １．０１０２、Ｐａｒ ｆ １）、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属種（Ｐａｒ ｈ １）、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ属種（Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ １．０１０１、Ｐａｒ ｊ １．０１０２、Ｐａｒ ｊ １．０１０３、Ｐａｒ ｊ １．０２０１、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ２．０１０１、Ｐａｒ ｊ ２．０１０２、Ｐａｒ ｊ ３、Ｐａｒ ｊ ３．０１０１、Ｐａｒ ｊ ３．０１０２、Ｐａｒ ｊ ４、Ｐａｒ ｊ ４．０１０１、Ｐａｒ ｊ Ｊ１－Ｊ２）、Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｐａｒ ｌｅ １）、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ属種（Ｐａｒ ｍ １、Ｐａｒ ｏ １、Ｐａｒ ｏ １．０１０１）、Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｐａｒ ｏｌ １、Ｐａｒ ｏｌアルファ２Ｉ）、Ｐａｒａｈｕｃｈｏ属種（Ｐａｒ ｐｅビテロゲニン）、Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ属種（Ｐａｓ ｅキチナーゼ、Ｐａｓ ｅヘベイン）、Ｐａｓｐａｌｕｍ属種（Ｐａｓ ｎ １、Ｐａｓ ｎ １．０１０１、Ｐａｓ ｎ １３）、Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ属種（Ｐａｔ ｙ １）、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ属種（Ｐｅｄ ｈ ７、Ｐｅｄ ｈ ７．０１０１）、Ｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ａ １．０１０１、Ｐｅｎ ａ １．０１０２、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１０３－１１７）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１０９－１２３）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１－１５）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１１５－１２９）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１２１－１３５）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１２７－１４１）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１３－２７）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１３３－１４７）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１３９－１５３）、Ｐｅｎ ａ １．０１０２（１４５－１５９））、Ｆａｒｆａｎｔｅｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｐｅｎ ａ 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ｃ ２４、Ｐｅｎ ｃ ２４．０１０１、Ｐｅｎ ｃ ３、Ｐｅｎ ｃ ３．０１０１、Ｐｅｎ ｃ ３０、Ｐｅｎ ｃ ３０．０１０１、Ｐｅｎ ｃ ３２、Ｐｅｎ ｃ ３２．０１０１、Ｐｅｎ ｃ ＭｎＳＯＤ、Ｐｅｎ ｃｈ １３、Ｐｅｎ ｃｈ １３．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ １８、Ｐｅｎ ｃｈ
１８．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ ２０、Ｐｅｎ ｃｈ ２０．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ ３１、Ｐｅｎ ｃｈ ３１．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ ３３、Ｐｅｎ ｃｈ ３３．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ ３５、Ｐｅｎ ｃｈ ３５．０１０１、Ｐｅｎ ｃｈ ＭｎＳＯＤ）、Ｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｐｅｎ ｉ １、Ｐｅｎ ｉ １．０１０１、Ｐｅｎ ｍ １、Ｐｅｎ ｍ １．０１０１、Ｐｅｎ ｍ １．０１０２、Ｐｅｎ ｍ ２、Ｐｅｎ ｍ ２．０１０１、Ｐｅｎ ｍ ３、Ｐｅｎ ｍ ３．０１０１、Ｐｅｎ ｍ ４、Ｐｅｎ ｍ ４．０１０１、Ｐｅｎ ｍ ６、Ｐｅｎ ｍ ６．０１０１）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属種（Ｐｅｎ ｏ １８、Ｐｅｎ ｏ １８．０１０１）、Ｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｐｅｎａ ｏ １、Ｐｅｎａ ｏ １．０１０１）、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属種（Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ １．０１０１、Ｐｅｒ ａ １．０１０２、Ｐｅｒ ａ １．０１０３、Ｐｅｒ ａ １．０１０４、Ｐｅｒ ａ １．０１０５、Ｐｅｒ ａ １．０２０１、Ｐｅｒ ａ １０、Ｐｅｒ ａ １０．０１０１、Ｐｅｒ ａ ２、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ３．０１０１、Ｐｅｒ ａ ３．０２０１、Ｐｅｒ ａ ３．０２０２、Ｐｅｒ ａ ３．０２０３、Ｐｅｒ ａ ４、Ｐｅｒ ａ ５、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ６．０１０１、Ｐｅｒ ａ ７、Ｐｅｒ ａ ７．０１０１、Ｐｅｒ ａ ７．０１０２、Ｐｅｒ ａ ７．０１０３、Ｐｅｒ ａ ９、Ｐｅｒ ａ ９．０１０１、Ｐｅｒ ａカテプシン、Ｐｅｒ ａ ＦＡＢＰ、Ｐｅｒ ａトリプシン、Ｐｅｒ ｆ １、Ｐｅｒ ｆ ７、Ｐｅｒ ｆ ７．０１０１）、Ｐｅｒｎａ属種（Ｐｅｒ ｖ １）、Ｐｅｒｓｅａ属種（Ｐｅｒｓ ａ １、Ｐｅｒｓ ａ １．０１０１、Ｐｅｒｓ ａ ４）、Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ属種（Ｐｅｔ ｃ １、Ｐｅｔ ｃ ２、Ｐｅｔ ｃ ３）、Ｐｈａｌａｒｉｓ属種（Ｐｈａ ａ １、Ｐｈａ ａ １．０１０１、Ｐｈａ ａ ５、Ｐｈａ ａ ５．０１０１、Ｐｈａ ａ ５．０２、Ｐｈａ ａ ５．０３、Ｐｈａ ａ ５．０４）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属種（Ｐｈａ ｖ ３、Ｐｈａ ｖ ３．０１０１、Ｐｈａ ｖ ３．０２０１、Ｐｈａ ｖ ａＡＩ、Ｐｈａ ｖ ａＡＩ．０１０１、Ｐｈａ ｖキチナーゼ、Ｐｈａ ｖ ＰＨＡ、Ｐｈａ ｖファゼオリン）、Ｐｈｌｅｕｍ属種（Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ １．０１０１、Ｐｈｉ ｐ １．０１０２、Ｐｈｉ ｐ １１、Ｐｈｉ ｐ １１．０１０１、Ｐｈｉ ｐ １２、Ｐｈｉ ｐ １２．０１０１、Ｐｈｉ ｐ １２．０１０２、Ｐｈｉ ｐ １２．０１０３、Ｐｈｉ ｐ １３、Ｐｈｌ ｐ １３．０１０１、ＰｈＩ ｐ ２、Ｐｈｉ ｐ ２．０１０１、Ｐｈｉ ｐ ３、Ｐｈｉ ｐ ３．０１０１、ＰｈＩ ｐ ３．０１０２、Ｐｈｉ ｐ ４、Ｐｈｉ ｐ ４．０１０１、Ｐｈｉ ｐ ４．０１０２、Ｐｈｌ ｐ ４．０２０１、Ｐｈｌ ｐ ４．０２０２、Ｐｈｌ ｐ ４．０２０３、Ｐｈｌ ｐ ４．０２０４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０１、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０２、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０３、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０４、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０５、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０６、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０７、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０８、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０９、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０１、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０２、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０３、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０４、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０５、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０６、Ｐｈｌ ｐ ５．０２０７、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ６．０１０１、Ｐｈｌ ｐ ６．０１０２、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ ７．０１０１、Ｐｈｌ ｐ Ｐ１－Ｐ２－Ｐ５－Ｐ６、Ｐｈｌ ｐ Ｐ２－Ｐ６、Ｐｈｌ ｐ Ｐ５－Ｐ１、Ｐｈｌ ｐ Ｐ６－Ｐ２）、Ｐｈｏｅｎｉｘ属種（Ｐｈｏ ｄ ２、Ｐｈｏ ｄ ２．０１０１、Ｐｈｏ ｄ ４０ｋＤ、Ｐｈｏ ｄ ９０ｋＤ）、Ｐｈｏｄｏｐｕｓ属種（Ｐｈｏ ｓ ２１ｋＤ）、Ｐｈｏｍａ属種（Ｐｈｏ ｔ １）、Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ属種（Ｐｈｒ ａ １、Ｐｈｒ ａ １２、Ｐｈｒ ａ １３、Ｐｈｒ ａ ４、Ｐｈｒ ａ ５）、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ属種（Ｐｈｙ ａ ＲＩＰ）、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属種（Ｐｉｍ ａ １、Ｐｉｍ ａ ２）、Ｐｉｎｎａ属種（Ｐｉｎ ａ １）、Ｐｉｐｅｒ属種（Ｐｉｐ ｎ １４ｋＤ、Ｐｉｐ ｎ ２８ｋＤ）、Ｐｉｓｕｍ属種（Ｐｉｓ ｓ １、Ｐｉｓ ｓ １．０１０１、Ｐｉｓ ｓ １．０１０２、Ｐｉｓ ｓ ２、Ｐｉｓ ｓ ２．０１０１、Ｐｉｓ ｓ ５、Ｐｉｓ ｓアグルチニン、Ｐｉｓ ｓアルブミン）、Ｐｉｓｔａｃｉａ属種（Ｐｉｓ ｖ １、Ｐｉｓ ｖ １．０１０１、Ｐｉｓ ｖ ２、Ｐｉｓ ｖ ２．０１０１、Ｐｉｓ ｖ ２．０２０１、Ｐｉｓ ｖ ３、Ｐｉｓ ｖ ３．０１０１、Ｐｉｓ ｖ ４、Ｐｉｓ ｖ ４．０１０１、Ｐｉｓ ｖ ５、Ｐｉｓ ｖ ５．０１０１）、Ｐｌａｔａｎｕｓ属種（Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ １．０１０１、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ２．０１０１、Ｐｌａ ａ ３、Ｐｌａ ａ ３．０１０１、Ｐｌａ ａ ８）、Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓ属種（Ｐｌａ ｆ １）、Ｐｌａｎｔａｇｏ属種（Ｐｌａ Ｉ １、Ｐｌａ Ｉ １．０１０１、Ｐｌａ Ｉ １．０１０２、Ｐｌａ Ｉ １．０１０３、Ｐｌａ ＩチトクロームＣ）、Ｐｌａｔａｎｕｓ属種（Ｐｌａ ｏｃ １、Ｐｌａ ｏｒ １、Ｐｌａ ｏｒ １．０１０１、Ｐｌａ ｏｒ ２、Ｐｌａ ｏｒ ２．０１０１、Ｐｌａ ｏｒ ３、Ｐｌａ ｏｒ ３．０１０１、Ｐｌａ ｏｒ ４、Ｐｌａ ｏｒ ＣｙＰ、Ｐｌａ ｒ １）、Ｐｌｅｃｔｒｏｐｏｍｕｓ属種（Ｐｉｅ ａｒ １）、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属種（Ｐｉｅ ｈ １）、Ｐｌｅｃｔｒｏｐｏｍｕｓ属種（Ｐｉｅ ｌｅ １）、Ｐｌｏｄｉａ属種（Ｐｌｏ ｉ １、Ｐｌｏ ｉ １．０１０１、Ｐｌｏ ｉ ２、Ｐｌｏ ｉ ２．０１０１）、Ｐｏａ属種（Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ １．０１０１、Ｐｏａ ｐ １０、Ｐｏａ ｐ １２、Ｐｏａ ｐ １３、Ｐｏａ ｐ ２、Ｐｏａ ｐ ４、Ｐｏａ ｐ ５、Ｐｏａ ｐ ５．０１０１、Ｐｏａ ｐ ６、Ｐｏａ ｐ ７）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属種（Ｐｏｌ ａ １、Ｐｏｌ ａ １．０１０１、Ｐｏｌ ａ ２、Ｐｏｌ ａ ２．０１０１、Ｐｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ａ ５．０１０１、Ｐｏｌ ｄ １、Ｐｏｌ ｄ １．０１０１、Ｐｏｌ ｄ １．０１０２、Ｐｏｌ ｄ １．０１０３、Ｐｏｌ ｄ １．０１０４、Ｐｏｌ ｄ ４、Ｐｏｌ ｄ ４．０１０１、Ｐｏｌ ｄ ５、Ｐｏｌ ｄ ５．０１０１、Ｐｏｌ ｅ １、Ｐｏｌ ｅ １．０１０１、Ｐｏｌ ｅ ２、Ｐｏｌ ｅ ４、Ｐｏｌ ｅ ４．０１０１、Ｐｏｌ ｅ ５、Ｐｏｌ ｅ ５．０１０１、Ｐｏｌ ｆ ５、Ｐｏｌ ｆ ５．０１０１、Ｐｏｌ ｇ １、Ｐｏｌ ｇ １．０１０１、Ｐｏｌ ｇ ２、Ｐｏｌ ｇ ４、Ｐｏｌ ｇ ５、Ｐｏｌ ｇ ５．０１０１、Ｐｏｌ ｈｅ ＭＬＴ、Ｐｏｌ ｍ ５、Ｐｏｌ ｍ ５．０１０１）、Ｐｏｌｙｐｅｄｉｌｕｍ属種（Ｐｏｌ ｎ １）、Ｐｏｌｌｉｃｉｐｅｓ属種（Ｐｏｌ ｐｏ １）、Ｐｏｌｌａｃｈｉｕｓ属種（Ｐｏｌ ｖｉ １）、Ｐｏｌｙｂｉａ属種（Ｐｏｌｙ ｐ １、Ｐｏｌｙ ｐ １．０１０１、Ｐｏｌｙ ｐ ２、Ｐｏｌｙ ｐ ５、Ｐｏｌｙ ｓ ５、Ｐｏｌｙ ｓ ５．０１０１）、Ｐｏｍａｔｏｍｕｓ属種（Ｐｏｍ ｓａ １）、Ｐｏｎｇｏ属種（Ｐｏｎ ａｂ ＨＳＡ）、Ｐｏｎｔａｓｔａｃｕｓ属種（Ｐｏｎ Ｉ ４、Ｐｏｎ Ｉ ４．０１０１、Ｐｏｎ Ｉ ７、Ｐｏｎ Ｉ ７．０１０１）、Ｐｏｒｔｕｎｕｓ属種（Ｐｏｒ ｓ １、Ｐｏｒ ｓ １．０１０１、Ｐｏｒ ｓ １．０１０２、Ｐｏｒ ｔｒ １、Ｐｏｒ ｔｒ １．０１０１）、Ｐｒｏｔｏｒｔｏｎｉａ属種（Ｐｒｏ ｃａ ３８ｋＤ）、Ｐｒｏｃｕｍｂａｒｕｓ属種（Ｐｒｏ ｃｌ １、Ｐｒｏ ｃｌ １．０１０１、Ｐｒｏ ｃｌ ２１ｋＤ）、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ属種（Ｐｒｏ ｊ ２０ｋＤ）、Ｐｒｕｎｕｓ属種（Ｐｒｕ ａｒ １、Ｐｒｕ ａｒ １．０１０１、Ｐｒｕ ａｒ ３、Ｐｒｕ ａｒ ３．０１０１、Ｐｒｕ ａｖ １、Ｐｒｕ ａｖ １．０１０１、Ｐｒｕ ａｖ １．０２０１、Ｐｒｕ ａｖ １．０２０２、Ｐｒｕ ａｖ １．０２０３、Ｐｒｕ ａｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ２．０１０１、Ｐｒｕ ａｖ ３、Ｐｒｕ ａｖ ３．０１０１、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｒｕ ａｖ ４．０１０１、Ｐｒｕ ｃ １、Ｐｒｕ ｄ １、Ｐｒｕ ｄ ２、Ｐｒｕ ｄ ３、Ｐｒｕ ｄ ３．０１０１、Ｐｒｕ ｄ ４、Ｐｒｕ ｄｕ １、Ｐｒｕ ｄｕ ２、Ｐｒｕ ｄｕ ２Ｓアルブミン、Ｐｒｕ ｄｕ ３、Ｐｒｕ ｄｕ ３．０１０１、Ｐｒｕ ｄｕ ４、Ｐｒｕ ｄｕ ４．０１０１、Ｐｒｕ ｄｕ ４．０１０２、Ｐｒｕ ｄｕ ５、Ｐｒｕ ｄｕ ５．０１０１、Ｐｒｕ ｄｕ ６、Ｐｒｕ ｄｕ ６．０１０１、Ｐｒｕ ｄｕ ６．０２０１、Ｐｒｕ ｄｕコングルチン、Ｐｒｕ ｐ １、Ｐｒｕ ｐ １．０１０１、Ｐｒｕ ｐ ２、Ｐｒｕ ｐ ２．０１０１、Ｐｒｕ ｐ ２．０２０１、Ｐｒｕ ｐ ２．０３０１、Ｐｒｕ ｐ ３、Ｐｒｕ ｐ ３．０１０１、Ｐｒｕ ｐ ３．０１０２、Ｐｒｕ ｐ ４、Ｐｒｕ ｐ ４．０１０１、Ｐｒｕ ｐ ４．０２０１、Ｐｒｕ ｓａ ３）、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ属種（Ｐｓｉ ｃ １、Ｐｓｉ ｃ １．０１０１、Ｐｓｉ ｃ ２、Ｐｓｉ ｃ ２．０１０１）、Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ属種（Ｐｓｏ ｏ １、Ｐｓｏ ｏ １０、Ｐｓｏ ｏ １０．０１０１、Ｐｓｏ ｏ １１、Ｐｓｏ ｏ １３、Ｐｓｏ ｏ １４、Ｐｓｏ ｏ ２、Ｐｓｏ ｏ ２１、Ｐｓｏ ｏ ３、Ｐｓｏ ｏ ５、Ｐｓｏ ｏ ７）、Ｐｕｍａ属種（Ｐｕｍ ｃ １）、Ｐｕｎｉｃａ属種（Ｐｕｎ ｇ ３）、Ｐｙｒｕｓ属種（Ｐｙｒ ｃ １、Ｐｙｒ ｃ １．０１０１、Ｐｙｒ ｃ ３、Ｐｙｒ ｃ ３．０１０１、Ｐｙｒ ｃ ４、Ｐｙｒ ｃ ４．０１０１、Ｐｙｒ ｃ ５、Ｐｙｒ ｃ ５．０１０１、Ｐｙｒ ｐｙ ２）、Ｑｕｅｒｃｕｓ属種（Ｑｕｅ ａ １、Ｑｕｅ ａ １．０１０１、Ｑｕｅ ａ １．０２０１、Ｑｕｅ ａ １．０３０１、Ｑｕｅ ａ １．０４０１、Ｑｕｅ ａ ２、Ｑｕｅ ａ ４）、Ｒａｃｈｙｃｅｎｔｒｏｎ属種（Ｒａｃ ｃａ １）、Ｒａｎａ属種（Ｒａｎ ｅ １、Ｒａｎ ｅ １．０１０１、Ｒａｎ ｅ ２、Ｒａｎ ｅ ２．０１０１）、Ｒａｎｉｎａ属種（Ｒａｎ ｒａ １）、Ｒａｎｇｉｆｅｒ属種（Ｒａｎ ｔ ＢＬＧ）、Ｒａｔｔｕｓ属種（Ｒａｔ ｎ １、Ｒａｔ ｎ １．０１０１、Ｒａｔ ｎカゼイン、Ｒａｔ ｎゼラチン、Ｒａｔ ｎ ＩｇＧ、Ｒａｔ ｎホスビチン、Ｒａｔ ｎ ＲＳＡ、Ｒａｔ ｎトランスフェリン）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属種（Ｒｈｉ ｍ ＡＰ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属種（Ｒｈｉ ｎｖリパーゼ、Ｒｈｉ ｏリパーゼ）、Ｒｈｏｍｂｏｐｌｉｔｅｓ属種（Ｒｈｏ ａｕ １）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属種（Ｒｈｏ ｍ １、Ｒｈｏ ｍ １．０１０１、Ｒｈｏ ｍ ２、Ｒｈｏ ｍ ２．０１０１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ属種（Ｒｉｃ ｃ １、Ｒｉｃ ｃ １．０１０１、Ｒｉｃ ｃ ２、Ｒｉｃ ｃ ３、Ｒｉｃ ｃ ８、Ｒｉｃ ｃ ＲＩＰ）、Ｒｉｖｕｌｕｓ属種（Ｒｉｖ ｍａ １）、Ｒｏｂｉｎｉａ属種（Ｒｏｂ ｐ ２、Ｒｏｂ ｐ ４、Ｒｏｂ ｐグルカナーゼ）、Ｒｏｓａ属種（Ｒｏｓ ｒ ３）、Ｒｏｙｓｔｏｎｅａ属種（Ｒｏｙ ｅ ２）、Ｒｕｂｕｓ属種（Ｒｕｂ ｉ １、Ｒｕｂ ｉ １．０１０１、Ｒｕｂ ｉ ３、Ｒｕｂ ｉ ３．０１０１、Ｒｕｂ ｉキチナーゼ、Ｒｕｂ ｉ ＣｙＰ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種（Ｓａｃ ｃカルボキシペプチダーゼＹ、Ｓａｃ ｃ ＣｙＰ、Ｓａｃ ｃエノラーゼ、Ｓａｃ ｃグルコシダーゼ、Ｓａｃ ｃインベルターゼ、Ｓａｃ ｃ ＭｎＳＯＤ、Ｓａｃ ｃ Ｐ２、Ｓａｃ ｃプロフィリン）、Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ属種（Ｓａｌ ｆ １）、Ｓａｌｓｏｌａ属種（Ｓａｌ ｋ １、Ｓａｌ ｋ １．０１０１、Ｓａｌ ｋ １．０２０１、Ｓａｌ ｋ １．０３０１、Ｓａｌ ｋ １．０３０２、Ｓａｌ ｋ ２、Ｓａ
ｌ ｋ ２．０１０１、Ｓａｌ ｋ ３、Ｓａｌ ｋ ３．０１０１、Ｓａｌ ｋ ４、Ｓａｌ ｋ ４．０１０１、Ｓａｌ ｋ ４．０２０１、Ｓａｌ ｋ ５、Ｓａｌ ｋ ５．０１０１）、Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ属種（Ｓａｌ ｌｅビテロゲニン）、Ｓａｌｍｏ属種（Ｓａｌ ｓ １、Ｓａｌ ｓ １．０１０１、Ｓａｌ ｓ １．０２０１、Ｓａｌ ｓ ２、Ｓａｌ ｓ ２．０１０１、Ｓａｌ ｓゼラチン）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ属種（Ｓａｍ ｎ １）、Ｓａｎｄｅｒ属種（Ｓａｎ ｌｕ １）、Ｓａｐｏｎａｒｉａ属種（Ｓａｐ ｏ ＲＩＰ）、Ｓａｒｄｉｎｏｐｓ属種（Ｓａｒ ｍ １）、Ｓａｒｋｉｄｉｏｒｎｉｓ属種（Ｓａｒ ｍｌ １）、Ｓａｒｄｉｎａ属種（Ｓａｒ ｐ １）、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ属種（Ｓａｒ ｓ １、Ｓａｒ ｓ １４、Ｓａｒ ｓ ３、Ｓａｒ ｓ ＧＳＴ、Ｓａｒ ｓ ＰＭ）、Ｓａｒｄｉｎｏｐｓ属種（Ｓａｒ ｓａ １、Ｓａｒ ｓａ １．０１０１）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属種（Ｓｃｈ ｊ ＧＳＴ、Ｓｃｈ ｊ ＰＭ、Ｓｃｈ ｊ Ｓｊ２２、Ｓｃｈ ｊ Ｓｊ６７、Ｓｃｈ ｍａ Ｓｍ２０、Ｓｃｈ ｍａ Ｓｍ２１、Ｓｃｈ ｍａ Ｓｍ２２、Ｓｃｈ ｍａ Ｓｍ３１）、Ｓｃｉａｅｎｏｐｓ属種（Ｓｃｉ ｏｃ １）、Ｓｃｏｍｂｅｒ属種（Ｓｃｏ ａ １）、Ｓｃｏｍｂｅｒｍｏｒｕｓ属種（Ｓｃｏ ｃａ １）、Ｓｃｏｍｂｅｒｏｍｏｒｕｓ属種（Ｓｃｏ ｇ １）、Ｓｃｏｍｂｅｒ属種（Ｓｃｏ ｊ １、Ｓｃｏ ｍａ １、Ｓｃｏ ｓ １）、Ｓｃｏｌｏｐｅｎｄｒａ属種（Ｓｃｏ ｙ ７、Ｓｃｏ ｙ ７．０１０１）、Ｓｃｙｌｌａ属種（Ｓｃｙ ｏ １、Ｓｃｙ ｏ １．０１０１、Ｓｃｙ ｏ ２、Ｓｃｙ ｐａ １、Ｓｃｙ ｐａ ２、Ｓｃｙ ｓ １、Ｓｃｙ ｓ １．０１０１、Ｓｃｙ ｓ ２）、Ｓｅｂａｓｔｅｓ属種（Ｓｅｂ ｆａ １、Ｓｅｂ ｉｎ １、Ｓｅｂ ｍ １、Ｓｅｂ ｍ １．０１０１、Ｓｅｂ ｍ １．０２０１）、Ｓｅｃａｌｅ属種（Ｓｅｃ ｃ １、Ｓｅｃ ｃ １２、Ｓｅｃ ｃ １３、Ｓｅｃ ｃ ２、Ｓｅｃ ｃ ２０、Ｓｅｃ ｃ ２０．０１０１、Ｓｅｃ ｃ ２０．０２０１、Ｓｅｃ ｃ ２８、Ｓｅｃ ｃ ３、Ｓｅｃ ｃ ４、Ｓｅｃ ｃ ４．０１０１、Ｓｅｃ ｃ ４．０２０１、Ｓｅｃ ｃ ５、Ｓｅｃ ｃ ５．０１０１、Ｓｅｃ ｃ ａＡ＿ＴＩ、Ｓｅｃ ｃ ａＡ＿ＴＩ．０１０１）、Ｓｅｎｅｃｉｏ属種（Ｓｅｎ ｊ ＭＤＨ、Ｓｅｎ ｊ ＰＬ）、Ｓｅｐｉａ属種（Ｓｅｐ ｅ １、Ｓｅｐ ｅ １．０１０１）、Ｓｅｐｉｏｔｅｕｔｈｉｓ属種（Ｓｅｐ Ｉ １、Ｓｅｐ １ １．０１０１）、Ｓｅｐｉａ属種（Ｓｅｐ ｍ １）、Ｓｅｒｉｏｌａ属種（Ｓｅｒ ｄ １、Ｓｅｒ ｌａ １）、Ｓｅｒｇｅｓｔｅｓ属種（Ｓｅｒ ｌｕ １）、Ｓｅｒｉｏｌａ属種（Ｓｅｒ ｑ １、Ｓｅｒ ｒｉ １）、Ｓｅｓａｍｕｍ属種（Ｓｅｓ ｉ １、Ｓｅｓ ｉ １．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ２、Ｓｅｓ ｉ ２．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ３、Ｓｅｓ ｉ ３．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ４、Ｓｅｓ ｉ ４．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ５、Ｓｅｓ ｉ ５．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ６、Ｓｅｓ ｉ ６．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ７、Ｓｅｓ ｉ ７．０１０１、Ｓｅｓ ｉ ８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属種（Ｓｈｉ ｂｏ ＧＳＴ、Ｓｈｉ ｄｙ ＧＳＴ）、Ｓｉｍｕｌｉａ属種（Ｓｉｍ ｖｉ １、Ｓｉｍ ｖｉ ２、Ｓｉｍ ｖｉ ３、Ｓｉｍ ｖｉ ４、Ｓｉｍ ｖｉ ７０ｋＤ）、Ｓｉｎａｐｉｓ属種（Ｓｉｎ ａ １、Ｓｉｎ ａ １．０１０１、Ｓｉｎ ａ １．０１０４、Ｓｉｎ ａ １．０１０５、Ｓｉｎ ａ １．０１０６、Ｓｉｎ ａ １．０１０７、Ｓｉｎ ａ １．０１０８、Ｓｉｎ ａ ２、Ｓｉｎ ａ ２．０１０１、Ｓｉｎ ａ ３、Ｓｉｎ ａ ３．０１０１、Ｓｉｎ ａ ４、Ｓｉｎ ａ ４．０１０１）、Ｓｉｎｏｎｏｖａｃｕｌａ属種（Ｓｉｎ ｃ １、Ｓｉｎ ｃ １．０１０１）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ属種（Ｓｏｌ ｇ ２、Ｓｏｌ ｇ ２．０１０１、Ｓｏｌ ｇ ３、Ｓｏｌ ｇ ３．０１０１、Ｓｏｌ ｇ ４、Ｓｏｌ ｇ ４．０１０１、Ｓｏｌ ｇ ４．０２０１、Ｓｏｌ ｉ １、Ｓｏｌ ｉ １．０１０１、Ｓｏｌ ｉ ２、Ｓｏｌ ｉ ２．０１０１、Ｓｏｌ ｉ ３、Ｓｏｌ ｉ ３．０１０１、Ｓｏｌ ｉ ４、Ｓｏｌ ｉ ４．０１０１）、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ属種（Ｓｏｌ ｍｅ １）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ属種（Ｓｏｌ ｒ １、Ｓｏｌ ｒ ２、Ｓｏｌ ｒ ２．０１０１、Ｓｏｌ ｒ ３、Ｓｏｌ ｒ ３．０１０１、Ｓｏｌ ｓ ２、Ｓｏｌ ｓ ２．０１０１、Ｓｏｌ ｓ ３、Ｓｏｌ ｓ ３．０１０１、Ｓｏｌ ｓ ４）、Ｓｏｌｅａ属種（Ｓｏｌ ｓｏ １、Ｓｏｌ ｓｏ ＴＰＩ）、Ｓｏｌａｎｕｍ属種（Ｓｏｌａ ｔ １、Ｓｏｌａ ｔ １．０１０１、Ｓｏｌａ ｔ ２、Ｓｏｌａ ｔ ２．０１０１、Ｓｏｌａ ｔ ３、Ｓｏｌａ ｔ ３．０１０１、Ｓｏｌａ ｔ ３．０１０２、Ｓｏｌａ ｔ ４、Ｓｏｌａ ｔ ４．０１０１、Ｓｏｌａ ｔ ８、Ｓｏｌａ ｔグルカナーゼ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ属種（Ｓｏｒ ｂ １、Ｓｏｒ ｈ １、Ｓｏｒ ｈ １．０１０１、Ｓｏｒ ｈ １２、Ｓｏｒ ｈ ７）、Ｓｐａｒｕｓ属種（Ｓｐａ ａ １）、Ｓｐｈｙｒｎａ属種（Ｓｐｈ ｔｉ １）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ属種（Ｓｐｉ ｍｘベータフィコシアニン）、Ｓｐｉｎａｃｉａ属種（Ｓｐｉ ｏ ２、Ｓｐｉ ｏ ＲｕＢｉｓＣＯ）、Ｓｑｕｉｌｌａ属種（Ｓｑｕ ａｃ １、Ｓｑｕ ａｃ １．０１０１、Ｓｑｕ ｏ １、Ｓｑｕ ｏ １．０１０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種（Ｓｔａ ａ ＦＢＰ、Ｓｔａ ａ ＳＥＡ、Ｓｔａ ａ ＳＥＢ、Ｓｔａ ａ ＳＥＣ、Ｓｔａ ａ ＳＥＤ、Ｓｔａ ａ ＳＥＥ、Ｓｔａ ａ ＴＳＳＴ）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属種（Ｓｔａ ｃ ３、Ｓｔａ ｃ ３．０１０１、Ｓｔａ ｃセルラーゼ、Ｓｔａ ｃヘモリシン、Ｓｔａ ｃ ＳｃｈＳ３４、Ｓｔａ ｃスタキラーゼＡ）、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ属種（Ｓｔｅ ｂ １、Ｓｔｅ ｃ １、Ｓｔｅ ｖ １）、Ｓｔｏｌｅｐｈｏｒｕｓ属種（Ｓｔｏ ｉ １）、Ｓｔｒｕｔｈｉｏ属種（Ｓｔｒ ｃ １、Ｓｔｒ ｃ ２、Ｓｔｒ ｃ ３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種（Ｓｔｒ ｄｙストレプトキナーゼ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種（Ｓｔｒ ｇプロナーゼ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種（Ｓｔｒ ｐｎ ＰｓｐＣ）、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属種（Ｓｔｒ ｐｕ １８ｋＤ、Ｓｔｒ ｐｕビテロゲニン）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種（Ｓｔｒ ｐｙ ＳＰＥＡ、Ｓｔｒ ｐｙ ＳＰＥＣ、Ｓｔｒ ｐｙストレプトキナーゼ）、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ属種（Ｓｔｒ ｓｔ ４５ｋＤ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種（Ｓｔｒ ｖ ＰＡＴ）、Ｓｔｙｅｌａ属種（Ｓｔｙ ｐ １）、Ｓｕｉｄａｓｉａ属種（Ｓｕｉ ｍ １、Ｓｕｉ ｍ １３、Ｓｕｉ ｍ ２、Ｓｕｉ ｍ ３、Ｓｕｉ ｍ ５、Ｓｕｉ ｍ ５．０１、Ｓｕｉ ｍ ５．０２、Ｓｕｉ ｍ ５．０３、Ｓｕｉ ｍ ６、Ｓｕｉ ｍ ７、Ｓｕｉ ｍ ８、Ｓｕｉ ｍ ９）、Ｓｕｓ属種（Ｓｕｓ ｓ ＡＣＴＨ、Ｓｕｓ ｓ ＡＬＡ、Ｓｕｓ ｓアミラーゼ、Ｓｕｓ ｓ ＢＬＧ、Ｓｕｓ ｓカゼイン、Ｓｕｓ ｓカゼインアルファＳ１、Ｓｕｓ ｓカゼインアルファＳ２、Ｓｕｓ ｓカゼインベータ、Ｓｕｓ ｓカゼインカッパ、Ｓｕｓ ｓゼラチン、Ｓｕｓ ｓ ＨＧ、Ｓｕｓ ｓインスリン、Ｓｕｓ ｓリパーゼ、Ｓｕｓ ｓペプシン、Ｓｕｓ ｓホスビチン、Ｓｕｓ ｓ ＰＲＶＢ、Ｓｕｓ ｓ ＰＳＡ、Ｓｕｓ ｓ ＴＣＴＰ）、Ｓｙｎｔｅｌｏｐｏｄｅｕｍａ属種（Ｓｙｎ ｙ ７、Ｓｙｎ ｙ ７．０１０１）、Ｓｙｒｉｎｇａ属種（Ｓｙｒ ｖ １、Ｓｙｒ ｖ １．０１０１、Ｓｙｒ ｖ １．０１０２、Ｓｙｒ ｖ １．０１０３、Ｓｙｒ ｖ ２、Ｓｙｒ ｖ ３、Ｓｙｒ ｖ ３．０１０１）、Ｔａｂａｎｕｓ属種（Ｔａｂ ｙ １、Ｔａｂ ｙ １．０１０１、Ｔａｂ ｙ ２、Ｔａｂ ｙ ２．０１０１、Ｔａｂ ｙ ５、Ｔａｂ ｙ ５．０１０１）、Ｔａｄｏｒｎａ属種（Ｔａｄ ｒａ １）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属種（Ｔａｌ ｓｔ ２２、Ｔａｌ ｓｔ ３、Ｔａｌ ｓｔ ８）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属種（Ｔａｒ ｏ １８ｋＤ）、Ｔａｘｏｄｉｕｍ属種（Ｔａｘ ｄ ２）、Ｔｅｇｅｎａｒｉａ属種（Ｔｅｇ ｄヘモシアニン）、Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ属種（Ｔｅｌ ｃｉ ３）、Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ属種（Ｔｈａ ｐ １、Ｔｈａ ｐ １．０１０１、Ｔｈａ ｐ ２、Ｔｈａ ｐ ２．０１０１）、Ｔｈｅｒａｇｒａ属種（Ｔｈｅ ｃ １）、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属種（Ｔｈｅ Ｉリパーゼ、Ｔｈｅ ｓｐリパーゼ、Ｔｈｅ ｓｐキシラナーゼ）、Ｔｈｕｎｎｕｓ属種（Ｔｈｕ ａ １、Ｔｈｕ ａ １．０１０１、Ｔｈｕ ａコラーゲン、Ｔｈｕ ａｌ １、Ｔｈｕ ａｔ １、Ｔｈｕ ｏ １、Ｔｈｕ ｏコラーゲン）、Ｔｈｕｊａ属種（Ｔｈｕ ｏｃ ３、Ｔｈｕ ｐ １）、Ｔｈｕｎｎｕｓ属種（Ｔｈｕ ｔ １、Ｔｈｕ ｔｏ １）、Ｔｈｙｒｓｉｔｅｓ属種（Ｔｈｙ ａｔ １）、Ｔｈｙｒｏｐｈｙｇｕｓ属種（Ｔｈｙ ｙ ７、Ｔｈｙ ｙ ７．０１０１）、Ｔｏｄａｒｏｄｅｓ属種（Ｔｏｄ ｐ １、Ｔｏｄ ｐ １．０１０１、Ｔｏｄ ｐ １．０１０２）、Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ属種（Ｔｏｘ ｃ ７、Ｔｏｘ ｃ ７．０１０１）、Ｔｏｘｏｃａｒａ属種（Ｔｏｘ ｃａ ＴＥＳ１２０、Ｔｏｘ ｃａ ＴＥＳ２６、Ｔｏｘ ｃａ ＴＥＳ３０）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属種（Ｔｏｘ ｇ ＨＳＰ７０）、Ｔｒａｃｈｙｐｅｎａｅｕｓ属種（Ｔｒａ ｃ １）、Ｔｒａｃｈｉｎｏｔｕｓ属種（Ｔｒａ ｃａ １）、Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ属種（Ｔｒａ ｊ １、Ｔｒａ ｊゼラチン、Ｔｒａ ｔｒゼラチン）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属種（Ｔｒｉ ａ １、Ｔｒｉ ａ １０ｋＤ、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １２．０１０１、Ｔｒｉ ａ １２．０１０２、Ｔｒｉ ａ １２．０１０３、Ｔｒｉ ａ １２．０１０４、Ｔｒｉ ａ １３、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １４．０１０１、Ｔｒｉ ａ １４．０２０１、Ｔｒｉ ａ １５、Ｔｒｉ ａ １５．０１０１、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １８．０１０１、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ １９．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２、Ｔｒｉ ａ ２１、Ｔｒｉ ａ ２１．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２３ｋｄ、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２５．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２６．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２７．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２８．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ２９．０１０１、Ｔｒｉ ａ ２９．０２０１、Ｔｒｉ ａ ３、Ｔｒｉ ａ ３０、Ｔｒｉ ａ ３０．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３１、Ｔｒｉ ａ ３１．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３２、Ｔｒｉ ａ ３２．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３３、Ｔｒｉ ａ ３３．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３４、Ｔｒｉ ａ ３４．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３５、Ｔｒｉ ａ ３５．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３６、Ｔｒｉ ａ ３６．０１０１、Ｔｒｉ ａ ３７、Ｔｒｉ ａ ３７．０１０１、Ｔｒｉ ａ ４、Ｔｒｉ ａ ４．０１０１、Ｔｒｉ ａ ４．０２０１、Ｔｒｉ ａ ５、Ｔｒｉ ａ ７、Ｔｒｉ ａ ａＡ＿ＳＩ、Ｔｒｉ ａアルファグリアジン、Ｔｒｉ ａ ｂＡ、Ｔｒｉ ａ Ｂｄ３６Ｋ、Ｔｒｉ ａベータグリアジン、Ｔｒｉ ａキチナーゼ、Ｔｒｉ ａ ＣＭ１６、Ｔｒｉ ａ ＤＨ、Ｔｒｉ ａ Ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ、Ｔｒｉ ａガンマグリアジン、Ｔｒｉ ａ Ｇｅｒｍｉｎ、Ｔｒｉ ａグリアジン、Ｔｒｉ ａ ＧＳＴ、Ｔｒｉ ａ ＬＭＷ Ｇｌｕ、Ｔｒｉ ａ ＬＭＷ－ＧＳ Ｂ１６、Ｔｒｉ ａ ＬＭＷ－ＧＳ Ｐ４２、Ｔｒｉ ａ ＬＭＷ－ＧＳ Ｐ７３、Ｔｒｉ ａ ＬＴＰ２、Ｔｒｉ ａオメガ２グリアジン、Ｔｒｉ ａペルオキシダーゼ、Ｔｒｉ ａペルオキシダーゼ １、Ｔｒｉ ａ ＳＰＩ、Ｔｒｉ ａ ＴＬＰ、Ｔｒｉ ａ Ｔｒｉｔｉｎ、Ｔｒｉ ａ ＸＩ）、Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ属種（Ｔｒｉ ａｌプロテイナーゼＫ）、Ｔ
ｒｉｂｏｌｉｕｍ属種（Ｔｒｉ ｃａ １７、Ｔｒｉ ｃａ １７．０１０１、Ｔｒｉ ｃａ ７、Ｔｒｉ ｃａ ７．０１０１）、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ属種（Ｔｒｉ ｃｏ ３、Ｔｒｉ ｃｏ ３．０１０１）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｅｑ ４）、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ属種（Ｔｒｉ ｆｇ １、Ｔｒｉ ｆｇ ２、Ｔｒｉ ｆｇ ３、Ｔｒｉ ｆｇ ４）、Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ属種（Ｔｒｉ ｋ ＲＩＰ）、Ｔｒｉｃｈｉｕｒｕｓ属種（Ｔｒｉ ｌｅ １）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属種（Ｔｒｉ ｍペルオキシダーゼ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｍｅ ２、Ｔｒｉ ｍｅ ４）、Ｔｒｉｓｅｔｕｍ属種（Ｔｒｉ ｐ １、Ｔｒｉ ｐ ５）、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ属種（Ｔｒｉ ｐｓ ３、Ｔｒｉ ｐｓ ３．０１０１）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｒ ２、Ｔｒｉ ｒ ２．０１０１、Ｔｒｉ ｒ ４、Ｔｒｉ ｒ ４．０１０１）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属種（Ｔｒｉ ｒｓセルラーゼ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属種（Ｔｒｉ ｓ １４）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｓｃ ２、Ｔｒｉ ｓｃ ４、Ｔｒｉ ｓｏ ２）、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ属種（Ｔｒｉ ｓｐ ３、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０１、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０２、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０３、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０４、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０５、Ｔｒｉ ｓｐ ３．０１０６）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｔ １、Ｔｒｉ ｔ １．０１０１、Ｔｒｉ ｔ ４、Ｔｒｉ ｔ ４．０１０１）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属種（Ｔｒｉ ｔｄ １４、Ｔｒｉ ｔｄ ａＡ＿ＴＩ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属種（Ｔｒｉ ｖセルラーゼ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種（Ｔｒｉ ｖｅ ４）、Ｔｒｉａｔｏｍａ属種（Ｔｒｉａ ｐ １、Ｔｒｉａ ｐ １．０１０１）、Ｔｒｉｐｌｏｃｈｉｔｏｎ属種（Ｔｒｉｐ ｓ １）、Ｔｕｒｂｏ属種（Ｔｕｒ ｃ １、Ｔｕｒ ｃ ＰＭ）、Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ属種（Ｔｙｒ ｐ １、Ｔｙｒ ｐ １０、Ｔｙｒ ｐ １０．０１０１、Ｔｙｒ ｐ １０．０１０２、Ｔｙｒ ｐ １３、Ｔｙｒ ｐ １３．０１０１、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｔｙｒ ｐ ２．０１０１、Ｔｙｒ ｐ ２４、Ｔｙｒ ｐ ２４．０１０１、Ｔｙｒ ｐ ３、Ｔｙｒ ｐ ３．０１０１、Ｔｙｒ ｐ ４、Ｔｙｒ ｐ ５、Ｔｙｒ ｐ ５．０１、Ｔｙｒ ｐ ５．０２、Ｔｙｒ ｐ ５．０３、Ｔｙｒ ｐ ７、Ｔｙｒ ｐアルファチューブリン）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属種（Ｕｌｏ ａ １、Ｕｌｏ ａｔ １、Ｕｌｏ ｂ １、Ｕｌｏ ｃ １、Ｕｌｏ ｃｏ １、Ｕｌｏ ｃｕ １、Ｕｌｏ ｍｕ １、Ｕｌｏ ｏｂ １、Ｕｌｏ ｓｅ １、Ｕｌｏ ｓｕ １、Ｕｌｏ ｔｕ １）、Ｕｎｃｉａ属種（Ｕｎｃ ｕ １）、Ｕｒｏｐｈｙｃｉｓ属種（Ｕｒｏ ｔｅ １）、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ属種（Ｖａｃ ｍ ３）、Ｖａｒｒｏａ属種（Ｖａｒ ｊ １３ｋＤ）、Ｖｅｎｅｒｕｐｉｓ属種（Ｖｅｎ ｐｈ １、Ｖｅｎ ｐｈ １．０１０１）、Ｖｅｓｐｕｌａ属種（Ｖｅｓ ｆ １、Ｖｅｓ ｆ ２、Ｖｅｓ ｆ ５、Ｖｅｓ ｆ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｇ １、Ｖｅｓ ｇ ２、Ｖｅｓ ｇ ５、Ｖｅｓ ｇ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｍ １、Ｖｅｓ ｍ １．０１０１、Ｖｅｓ ｍ ２、Ｖｅｓ ｍ ２．０１０１、Ｖｅｓ ｍ ５、Ｖｅｓ ｍ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｍ ＭＬＴ、Ｖｅｓ ｐ １、Ｖｅｓ ｐ ２、Ｖｅｓ ｐ ５、Ｖｅｓ ｐ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｓ １、Ｖｅｓ ｓ １．０１０１、Ｖｅｓ ｓ ２、Ｖｅｓ ｓ ５、Ｖｅｓ ｓ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｖ １、Ｖｅｓ ｖ １．０１０１、Ｖｅｓ ｖ ２、Ｖｅｓ ｖ ２．０１０１、Ｖｅｓ ｖ ２．０２０１、Ｖｅｓ ｖ ３、Ｖｅｓ ｖ ３．０１０１、Ｖｅｓ ｖ ５、Ｖｅｓ ｖ ５．０１０１、Ｖｅｓ ｖ ５－Ｐｏｌ ａ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５．０１０１）、Ｖｅｓｐａ属種（Ｖｅｓｐ ｃ １、Ｖｅｓｐ ｃ １．０１０１、Ｖｅｓｐ ｃ ２、Ｖｅｓｐ ｃ ５、Ｖｅｓｐ ｃ ５．０１０１、Ｖｅｓｐ ｃ ５．０１０２、Ｖｅｓｐ ｍ １、Ｖｅｓｐ ｍ １．０１０１、Ｖｅｓｐ ｍ ５、Ｖｅｓｐ ｍ ５．０１０１、Ｖｅｓｐ ｍａ １、Ｖｅｓｐ ｍａ ２、Ｖｅｓｐ ｍａ ５、Ｖｅｓｐ ｍａ ＭＬＴ、Ｖｅｓｐ ｖ ＭＬＴ）、Ｖｉｇｎａ属種（Ｖｉｇ ｒ １、Ｖｉｇ ｒ １．０１０１、Ｖｉｇ ｒ １７ｋＤ、Ｖｉｇ ｒ ５、Ｖｉｇ ｒ ８Ｓグロブリン、Ｖｉｇ ｒアルブミン、Ｖｉｇ ｒベータ－コングリシニン）、Ｖｉｔｉｓ属種（Ｖｉｔ ｖ １、Ｖｉｔ ｖ １．０１０１、Ｖｉｔ ｖ ４、Ｖｉｔ ｖ ５、Ｖｉｔ ｖグルカナーゼ、Ｖｉｔ ｖ ＴＬＰ）、Ｘｉｐｈｉａｓ属種（Ｘｉｐ ｇ １、Ｘｉｐ ｇ １．０１０１、Ｘｉｐ ｇ ２５ｋＤ）、Ｚｅａ属種（Ｚｅａ ｍ １、Ｚｅａ ｍ １．０１０１、Ｚｅａ ｍ １１、Ｚｅａ ｍ １２、Ｚｅａ ｍ １２．０１０１、Ｚｅａ ｍ １２．０１０２、Ｚｅａ ｍ １２．０１０３、Ｚｅａ ｍ １２．０１０４、Ｚｅａ ｍ １２．０１０５、Ｚｅａ ｍ １３、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ １４．０１０１、Ｚｅａ ｍ １４．０１０２、Ｚｅａ ｍ ２、Ｚｅａ ｍ ２０Ｓ、Ｚｅａ ｍ ２２、Ｚｅａ ｍ ２５、Ｚｅａ ｍ ２５．０１０１、Ｚｅａ ｍ ２７ｋＤ Ｚｅｉｎ、Ｚｅａ ｍ ３、Ｚｅａ ｍ ４、Ｚｅａ ｍ ５、Ｚｅａ ｍ ５０ｋＤ Ｚｅｉｎ、Ｚｅａ ｍ ７、Ｚｅａ ｍキチナーゼ、Ｚｅａ ｍ Ｇ１、Ｚｅａ ｍ Ｇ２、Ｚｅａ ｍ ＰＡＯ、Ｚｅａ ｍ Ｚｍ１３）、Ｚｅｕｓ属種（Ｚｅｕ ｆａ １）、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ属種（Ｚｉｚ ｍ １、Ｚｉｚ ｍ １．０１０１）、Ｚｏａｒｃｅｓ属種（Ｚｏａ ａ ＩＳＰ ＩＩＩ）、Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌｕｍ属種（Ｚｙｇ ｆ ２）。
この文脈において、括弧内の用語は、特定の供給源からの特定の好ましいアレルギー性抗原（アレルゲン）を示す。
最も好ましくは、アレルギー性抗原は、好ましくは草の花粉（例えばライムギの花粉）、樹木の花粉（例えばハシバミ、カバノキ、ハンノキ、トネリコの花粉）、花の花粉、ハーブの花粉（例えばヨモギの花粉）、イエダニ（例えばＤｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｐ １、Ｅｕｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｍ １ Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｌｅｐ ｄ ２）、カビ（例えばＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、またはＡｌｔｅｒｎａｒｉａのアレルゲン）、動物（例えばネコのＦｅｌ ｄ１、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ３、またはＦｅｌ ｄ４）、食物（例えば魚（例えばバス、タラ、ヒラメ）、海産物（例えばカニ、ロブスター、エビ）、卵、コムギ、ナッツ（例えばピーナッツ、アーモンド、カシュー、クルミ）、ダイズ、乳汁などのアレルゲン）または昆虫毒（例えばカリバチ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、蚊、またはダニの毒液からのアレルゲン）からなるリストから選択される供給源（例えば植物（例えば草または樹木）、天然産物（例えば乳汁、ナッツなど）、真菌源（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくは細菌源、または動物源もしくは動物毒（例えばネコ、イヌ、ハチ毒など）に由来するのが好ましい。
自己免疫自己抗原
自己免疫自己抗原、すなわち自己免疫疾患に関連する抗原または自己抗原は、次の臓器系のうちの少なくとも１つ以上に影響する自己免疫疾患に関連し得る：循環器、消化器系、内分泌系、排泄系、免疫系、外皮系、筋肉系、神経系、生殖器系、呼吸器系、骨格系、好ましくは心臓血管系、神経内分泌系、筋骨格系または胃腸管系。この中で循環器は、心臓、血液及び血管を含む、身体及び肺から出入りする血液のポンピング及びチャネリングを可能にする臓器系である。消化器系は、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸管、結腸、直腸及び肛門により、食物の消化及び処理を可能にする。内分泌系は、視床下部、下垂体または脳下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺及び副腎などの内分泌腺によって作られるホルモンを使用して体内の情報伝達を可能にする。排泄系は、腎臓、尿管、膀胱、及び尿道を含み、体液バランス、電解質バランス、及び尿の排泄に関与している。免疫系は、免疫系の細胞性成分及び液性成分の輸送を担い得る、組織及び血流、リンパならびにリンパ節及びリンパ管の間のリンパの輸送に関与する構造を含む。免疫系は、病原性因子に対する防御を担い、とりわけ白血球、扁桃、アデノイド、胸腺及び脾臓を含む。外皮系は、皮膚、毛髪及び爪を含む。筋肉系は、骨、軟骨、靱帯及び腱を含む骨格系と共に筋肉の動きを可能にし、構造的支持を提供する。神経系は、情報の収集、伝達及び処理を担い、脳、脊髄及び神経を含む。生殖器系は、卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺及び陰茎などの性器を含む。呼吸器系は、呼吸に使用される臓器である咽頭、喉頭、気管、気管支、肺及び横隔膜を含み、循環系と共に機能する。
自己免疫自己抗原（自己免疫疾患に関連する抗原または自己抗原）は、アジソン病（自己免疫性副腎炎、Ｍｏｒｂｕｓ Ａｄｄｉｓｏｎ）、円形脱毛症、アジソン貧血（Ｍｏｒｂｕｓ Ｂｉｅｒｍｅｒ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、冷式の自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）（寒冷血球凝集素症、冷式自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）（寒冷凝集素症）、（ＣＨＡＤ））、温式の自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）（温式ＡＩＨＡ、温式自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ））、自己免疫性溶血性Ｄｏｎａｔｈ－Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ貧血（発作性寒冷ヘモグロビン尿症）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、粥状硬化症、自己免疫性関節炎、側頭動脈炎（ａｒｔｅｒｉｉｔｉｓ ｔｅｍｐｏｒａｌｉｓ）、高安動脈炎（高安病、大動脈弓疾患）、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｉｔｉｓ）／巨細胞性動脈炎、自己免疫性慢性胃炎、自己免疫性不妊症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、バセドウ病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｂａｓｅｄｏｗ）、ベヒテレフ病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ、ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ ａｎｋｙｌｏｓａｎｓ））、ベーチェット症候群（Ｍｏｒｂｕｓ Ｂｅｈｃｅｔ）、自己免疫性炎症性腸疾患を含む腸疾患（潰瘍性大腸炎（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ、クローン病）を含む）、心筋症、特に自己免疫性心筋症、特発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）、セリアックスプルー皮膚炎（グルテン媒介性腸症）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性多発性関節炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群（皮膚石灰沈着症、レイノー現象、食道の運動障害、肢端硬化症及び毛細血管拡張症を伴う症候群）、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ、潰瘍性大腸炎）、皮膚の自己免疫疾患中の疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、真性糖尿病１型（Ｉ型糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病）、真性糖尿病２型（ＩＩ型糖尿病）、本態性混合型クリオグロブリン血症、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、グッドパスチャー症候群（抗ＧＢＭ媒介性糸球体腎炎）、移植片対宿主病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＭ、多発根神経炎）、血液学的自己免疫疾患、橋本甲状腺炎、血友病、後天性血友病、肝炎、自己免疫性肝炎、特に自己免疫型の慢性肝炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性血小板減少性紫斑病、免疫血小板減少性紫斑病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｗｅｒｌｈｏｆ；ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、不妊症、自己免疫性不妊症、若年性関節リウマチ（Ｍｏｒｂｕｓ Ｓｔｉｌｌ、スチル症候群）、ランバート・イートン症候群、扁平苔癬、硬化性苔癬、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、エリテマトーデス（円盤型）、ライム関節炎（ライム病、ボレリア関節炎）、メニエール病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｍｅｎｉｅｒｅ）；混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症（ＭＳ、播種性脳脊髄炎、シャルコー病）、重症筋無力症（筋無力症、ＭＧ）、筋炎、多発性筋炎、神経自己免疫疾患、神経皮膚炎、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡；結節性多発動脈炎（結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎（汎軟骨炎）、多腺性（自己免疫性）症候群（ＰＧＡ症候群、シュミット症候群）、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変ＰＢＣ、原発性自己免疫性胆管炎）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、乾癬、尋常性乾癬、レイノー現象、ライター症候群（Ｍｏｒｂｕｓ Ｒｅｉｔｅｒ、尿道結合滑膜症候群））、関節リウマチ（ＲＡ、慢性多発性関節炎、関節のリウマチ性疾患、リウマチ熱）、サルコイドーシス（Ｍｏｒｂｕｓ Ｂｏｅｃｋ、Ｂｅｓｎｉｅｒ－Ｂｏｅｃｋ－Ｓｃｈａｕｍａｎｎ病）、スティフマン症候群、硬皮症、強皮症、シェーグレン症候群、交感性眼炎；一過性グルテン不耐性、移植臓器拒絶反応、ぶどう膜炎、自己免疫性ぶどう膜炎、血管炎、白斑（老人性白斑、斑状皮膚）、及びウェグナー病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｗｅｇｎｅｒ、ウェグナー肉芽腫症）から選択される自己免疫疾患に関連する自己抗原から選択される。
自己免疫自己抗原として作用するこれら及び他のタンパク質が治療的であると理解されるのは、これらが、哺乳動物自体（例えばヒト自身）によって発現され、健康な対象では生じない望まれない免疫応答を引き起こす自己抗原をワクチン接種することによって、対象、特に哺乳動物、より具体的にはヒトを処置することを意図しているためである。したがって、自己抗原として作用するようなタンパク質は、典型的には、哺乳動物、特にヒトに由来する。
この文脈において特に好ましいのは、以下から選択される自己免疫自己抗原（自己抗原）である：
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）（いずれも多発性硬化症（ＭＳ）に関連する）、
ＣＤ４４、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、チロシンホスファターゼ様インスリノーマ抗原２（ＩＡ２）、亜鉛輸送体（（ＺｎＴ８）、及び熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）（いずれもＩ型糖尿病に関連する）、
自己免疫性ぶどう膜炎に関連する光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、
アセチルコリン受容体ＡｃｈＲ、及びインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）（いずれも重症筋無力症に関連する）、
リウマチ熱に関連するベータ型溶血連鎖球菌からのＭタンパク質（疑似自己抗原）、
関節炎に関連するマクロファージ遊走阻害因子、
Ｒｏ／Ｌａ ＲＮＰ複合体、アルファフォドリン及びベータフォドリン、島細胞自己抗原、ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ＮｕＭＡ、ＮＯＲ－９０、Ｒｏ６０自己抗原、ならびにｐ２７抗原（いずれもシェーグレン症候群に関連する）、
Ｒｏ６０自己抗原、低密度リポタンパク質、Ｕ－１核内低分子リボヌクレオタンパク質複合体のＳｍ抗原（Ｂ／Ｂ’、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、及びＲＮＰリボヌクレオタンパク質（いずれもエリテマトーデスに関連する）、
ｏｘＬＤＬ、ベータ（２）ＧＰＩ、ＨＳＰ６０／６５、及びｏｘＬＤＬ／ベータ（２）ＧＰＩ（いずれも粥状硬化症に関連する）、
特発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）に関連する心臓ベータ（１）アドレナリン作動性受容体、
筋炎に関連するヒスチジル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨｉｓＲＳ）、
強皮症に関連するトポイソメラーゼＩ。
さらに、他の実施形態では、前記自己免疫自己抗原は、例えばＩＬ－１７、熱ショックタンパク質、及び／または前記自己免疫疾患（例えば本明細書に記載されるいずれかの自己免疫疾患）における自己免疫応答に関与する免疫細胞によって発現される任意のイディオタイプ病原性Ｔ細胞もしくはケモカイン受容体のように、それぞれの自己免疫疾患に関連する。
好ましくは、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の少なくとも１つのコード領域は、配列表（またはそれぞれＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８４３の表１～５もしくは図２０～２４）で開示される核酸配列のいずれか１つ、または前記核酸配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと同一か、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％もしくはさらには９７％の配列同一性を有する核酸配列を、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上含む。
好ましくは、本明細書で定義される少なくとも１つのコード領域を含むｍＲＮＡ配列は、典型的には、約５０～約２００００、または１００～約２００００ヌクレオチド、好ましくは約２５０～約２００００ヌクレオチド、より好ましくは約５００～約１００００、さらにより好ましくは約５００～約５０００の長さを含む。
さらなる実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列は、本明細書で定義されるような人工ｍＲＮＡ配列である。
さらなる実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、修飾型ｍＲＮＡ配列、好ましくは本明細書に記載されるような修飾型ｍＲＮＡ配列である。この文脈において、本明細書で定義されるような修飾は、好ましくは、本発明によるｍＲＮＡ配列の安定化をもたらす。したがって、より好ましくは、本発明は、本明細書で定義されるような少なくとも１つのコード領域を含む安定化ｍＲＮＡ配列を提供する。
一実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、したがって、「安定化ｍＲＮＡ配列」として、つまり、ｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解）に対して本質的に抵抗性があるｍＲＮＡとして提供され得る。そのような安定化は、例えば、本発明のｍＲＮＡの修飾型リン酸骨格によって影響を受け得る。本発明に関連する骨格修飾は、ｍＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学修飾される修飾である。この関連で好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート修飾型リン酸骨格、好ましくは、リン酸骨格に含まれるリン酸酸素のうちの少なくとも１つが硫黄原子で置き換えられたものを含む。安定化ｍＲＮＡには、例えば、非イオン性リン酸アナログ、例えば、荷電されたホスホン酸酸素がアルキル基もしくはアリール基で置き換えられたホスホン酸アルキル及びホスホン酸アリール、または荷電酸素残基がアルキル化形態で存在するホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルなどがさらに含まれ得る。限定を意味するものではないが、そのような骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びホスホロチオエート（例えばシチジン－５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））からなる群からの修飾が含まれる。
以下に特定の修飾を記載する。これらは、本明細書で定義されるようにｍＲＮＡを「安定化」できることが好ましい。
Ｖ．９． 化学修飾
本明細書で使用される「ｍＲＮＡ修飾」という用語は、骨格修飾及び糖修飾または塩基修飾を含む化学修飾を指し得る。
この文脈において、本明細書で定義されるような修飾型ｍＲＮＡ（配列）は、ヌクレオチドアナログ／修飾、例えば骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含み得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関連する塩基修飾は、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈において、ヌクレオチドアナログまたは修飾は、好ましくは、転写及び／または翻訳に適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む修飾型ｍＲＮＡ化合物に組み込まれ得る修飾型のヌクレオシド及びヌクレオチドは、糖部分において修飾されていてもよい。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換され得る。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（－ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（２’ヒドロキシルが、例えばメチレン橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合したもの）；及びアミノ基（－Ｏ－アミノ、ここで、アミノ基、例えばＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）、またはアミノアルコキシを含むがこれに限定されない。
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）を含む。または、アミノ基がリンカーを介して糖に結合していてもよく、このリンカーは、原子Ｃ、Ｎ、及びＯのうちの１つ以上を含む。
糖基は、リボース中の対応する炭素の逆の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含んでいてもよい。したがって、修飾型ｍＲＮＡは、例えばアラビノースを糖として含むヌクレオチドを含み得る。
リン酸骨格は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む修飾型ｍＲＮＡ化合物に組み込まれ得る修飾型のヌクレオシド及びヌクレオチドにおいて、さらに修飾されていてもよい。骨格のリン酸基は、酸素原子のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾型のヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾型リン酸による未修飾型リン酸部分の完全な置き換えを含み得る。修飾型リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリール、及びホスホトリエステルを含むがこれに限定されない。ホスホロジチオエートでは、両方の非結合酸素が硫黄で置き換えられている。リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）での結合酸素の置き換えによって修飾されていてもよい。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む修飾型ｍＲＮＡ化合物に組み込まれ得る修飾型のヌクレオシド及びヌクレオチドは、核酸塩基部分においてさらに修飾されていてもよい。ｍＲＮＡに見られる核酸塩基の例は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルを含むがこれに限定されない。
例えば、本明細書に記載されるヌクレオシド及びヌクレオチドは、主溝面上で化学修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含み得る。
本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ／修飾は塩基修飾から選択され、塩基修飾は、好ましくは、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、２－アミノプリン－リボシド－５’－三リン酸；２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－三リン酸、２－チオシチジン－５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、２’－フルオロチミジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－三リン酸４－チオウリジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－ヨードシチジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ヨードウリジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、６－アザウリジン－５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、７－デアザアデノシン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、８－アザアデノシン－５’－三リン酸、８－アジドアデノシン－５’－三リン酸、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、またはピューロマイシン－５’－三リン酸、キサントシン－５’－三リン酸から選択される。特に、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、及びシュードウリジン－５’－三リン酸からなる塩基修飾型ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のヌクレオチドが優先される。
いくつかの実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンを含む。
他の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンを含む。
他の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾されていてもよく、メチル基またはハロ基によるウラシルのＣ－５の水素の置き換えを含み得る。具体的な実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、または５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジンである。
さらなる具体的な実施形態では、修飾型ｍＲＮＡは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含み得る。
本発明の非常に具体的な実施形態では、ｍＲＮＡ化合物は、上述の塩基修飾を含まない。
さらなる実施形態によれば、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含む修飾型ｍＲＮＡ化合物は、脂質修飾を含み得る。そのような脂質修飾型ｍＲＮＡは、典型的には、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む。本明細書で定義されるそのような脂質修飾型ｍＲＮＡは、典型的には、該ｍＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質とをさらに含む。代替的には、脂質修飾型ｍＲＮＡは、本明細書で定義されるような少なくとも１つのｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質とを含む。第３の代替形態によれば、脂質修飾型ｍＲＮＡは、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ分子と、該ｍＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質とを含み、該ｍＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質も含む。この文脈において、脂質修飾が線状ｍＲＮＡ配列の末端部に存在することが特に好ましい。
別の実施形態によれば、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡ配列の、好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の少なくとも１つのコード領域の、グアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量を改変することによって改変ひいては安定化され得る、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物を含む。
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のコード領域のＧ／Ｃ含有量は、それぞれの野生型ｍＲＮＡ、すなわち未修飾型ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、改変され、特に増大する。ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれの野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない。本発明のｍＲＮＡ配列のこの修飾は、翻訳されるｍＲＮＡ領域の配列が該ｍＲＮＡの効率的な翻訳に重要であるという事実に基づく。したがって、ｍＲＮＡの組成及び様々なヌクレオチドの配列は重要である。特に、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増大している配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増大している配列よりも安定である。したがって、本発明によれば、ｍＲＮＡのコドンは、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較すると、翻訳されるアミノ酸配列は保持されるが、増大した量のＧ／Ｃヌクレオチドを含むように変化している。幾つかのコドンが全く同一のアミノ酸をコードするという事実（いわゆる遺伝コードの縮重）に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドン使用頻度）。ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、その野生型配列と比較したｍＲＮＡ配列の修飾には、様々な可能性がある。ＧまたはＣヌクレオチドのみを含むコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの改変は必要ない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）及びＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンには、ＡもＵも存在しないため、改変が必要ない。これに対し、Ａ及び／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするがＡ及び／またはＵを含まない他のコドンの置換によって改変され得る。これらの例は次のとおりである：Ｐｒｏのコドンは、ＣＣＵまたはＣＣＡからＣＣＣまたはＣＣＧに改変され得る；Ａｒｇのコドンは、ＣＧＵまたはＣＧＡまたはＡＧＡまたはＡＧＧからＣＧＣまたはＣＧＧに改変され得る；Ａｌａのコドンは、ＧＣＵまたはＧＣＡからＧＣＣまたはＧＣＧに改変され得る；Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＡからＧＧＣまたはＧＧＧに改変され得る。他の場合には、ＡまたはＵヌクレオチドをコドンから排除することはできないが、より低い含有量のＡ及び／またはＵヌクレオチドを含むコドンを使用することによってＡ及びＵの含有量を減少させることが可能である。これらの例は次のとおりである：Ｐｈｅのコドンは、ＵＵＵからＵＵＣに改変され得る；Ｌｅｕのコドンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡからＣＵＣまたはＣＵＧに改変され得る；Ｓｅｒのコドンは、ＵＣＵまたはＵＣＡまたはＡＧＵからＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣに改変され得る；Ｔｙｒのコドンは、ＵＡＵからＵＡＣに改変され得る；Ｃｙｓのコドンは、ＵＧＵからＵＧＣに改変され得る；Ｈｉｓのコドンは、ＣＡＵからＣＡＣに改変され得る；Ｇｉｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変され得る；Ｉｌｅのコドンは、ＡＵＵまたはＡＵＡからＡＵＣに改変され得る；Ｔｈｒのコドンは、ＡＣＵまたはＡＣＡからＡＣＣまたはＡＣＧに改変され得る；Ａｓｎのコドンは、ＡＡＵからＡＡＣに改変され得る；Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変され得る；Ｖａｌのコドンは、ＧＵＵまたはＧＵＡからＧＵＣまたはＧＵＧに改変され得る；Ａｓｐのコドンは、ＧＡＵからＧＡＣに改変され得る；Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変され得る；終止コドンＵＡＡは、ＵＡＧまたはＵＧＡに改変され得る。一方、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）及びＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、配列修飾の可能性はない。上掲の置換は、本発明のｍＲＮＡ配列のＧ／Ｃ含有量をその特定の野生型ｍＲＮＡ（すなわち元の配列）と比較して増大させるように、個別に使用してもよく、すべての考えられる組み合わせで使用してもよい。したがって、例えば、野生型配列で発生するＴｈｒのすべてのコドンをＡＣＣ（またはＡＣＧ）に改変してもよい。しかし、例えば以下のような、上記の置換の可能性の組み合わせを使用することが好ましい：
元の配列（野生型ｍＲＮＡ）におけるＴｈｒをコードするすべてのコドンのＡＣＣ（またはＡＣＧ）への置換、及びＳｅｒを本来コードするすべてのコドンのＵＣＣ（またはＵＣＧもしくはＡＧＣ）への置換；
元の配列におけるＩｌｅをコードするすべてのコドンのＡＵＣへの置換、及び
Ｌｙｓを本来コードするすべてのコドンのＡＡＧへの置換、及び
Ｔｙｒを本来コードするすべてのコドンのＵＡＣへの置換；
元の配列におけるＶａｌをコードするすべてのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、及び
Ｇｌｕを本来コードするすべてのコドンのＧＡＧへの置換、及び
Ａｌａを本来コードするすべてのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、及び
Ａｒｇを本来コードするすべてのコドンのＣＧＣ（またはＣＧＧ）への置換；
元の配列におけるＶａｌをコードするすべてのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、及び
Ｇｌｕを本来コードするすべてのコドンのＧＡＧへの置換、及び
Ａｌａを本来コードするすべてのコドンのＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、及び
Ｇｌｙを本来コードするすべてのコドンのＧＧＣ（またはＧＧＧ）への置換、及び
Ａｓｎを本来コードするすべてのコドンのＡＡＣへの置換；
元の配列におけるＶａｌをコードするすべてのコドンのＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、及び
Ｐｈｅを本来コードするすべてのコドンのＵＵＣへの置換、及び
Ｃｙｓを本来コードするすべてのコドンのＵＧＣへの置換、及び
Ｌｅｕを本来コードするすべてのコドンのＣＵＧ（またはＣＵＣ）への置換、及び
Ｇｉｎを本来コードするすべてのコドンのＣＡＧへの置換、及び
Ｐｒｏを本来コードするすべてのコドンのＣＣＣ（またはＣＣＧ）への置換など。
好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のコード領域のＧ／Ｃ含有量は、本明細書で定義されるような抗原またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増大する。具体的な実施形態によれば、野生型ｍＲＮＡ配列のうち、本明細書で定義されるようなペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする領域、または配列全体における置換可能コドンの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％またはさらには１００％が置換され、それによって前記配列のＧＣ／含有量が増大する。この文脈において、本発明のｍＲＮＡ配列の、好ましくは本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含有量を、野生型配列と比較して最大（すなわち、置換可能コドンの１００％）まで増大させることが特に好ましい。本発明によれば、本発明のｍＲＮＡ配列のさらに好ましい修飾は、細胞におけるｔＲＮＡの異なる発生頻度も翻訳効率を決定するという所見に基づく。したがって、いわゆる「稀なコドン」が本発明のｍＲＮＡ配列に増大した程度で存在する場合、対応する修飾型ｍＲＮＡ配列は、比較的「高頻度」のｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合よりも著しく低い程度で翻訳される。本発明によれば、本発明の修飾型ｍＲＮＡ配列において、本明細書で定義されるようなペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする領域は、細胞内で比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度であり、比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換されるように、野生型ｍＲＮＡ配列の対応する領域と比較して修飾されている。この修飾により、高頻度で発生するｔＲＮＡが利用可能なコドンが挿入されるように、本発明のｍＲＮＡの配列が修飾される。換言すると、本発明によれば、この修飾により、細胞内で比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列のすべてのコドンが、いずれの場合にも、細胞内で比較的高頻度であり、いずれの場合にも比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換され得る。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で発生するか、また、反対にどのｔＲＮＡが比較的稀に発生するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ２００１， １１（６）： ６６０－６６６を参照されたい。最も高頻度で発生するｔＲＮＡを特定のアミノ酸のために使用するコドン、例えば（ヒト）細胞で最も高頻度で発生するｔＲＮＡを使用するＧｌｙコドンが、特に好ましい。本発明によれば、ｍＲＮＡ配列のコード領域によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を修飾することなく、本発明の修飾型ｍＲＮＡ配列における、増大した、特に最大化された、配列内のＧ／Ｃ含有量を、「高頻度」コドンと関係付けることが特に好ましい。この好ましい実施形態は、特に効率的に翻訳され、安定化された（修飾された）本発明のｍＲＮＡ配列の提供を可能にする。上述のような本発明のｍＲＮＡ配列の修飾（Ｇ／Ｃ含有量の増大；ｔＲＮＡの交換）の決定は、ＷＯ０２／０９８４４３（その開示内容は、その全範囲において本発明に含まれる）で説明されているコンピュータプログラムを使用して行うことができる。このコンピュータプログラムを使用すると、細胞内で可能な限り高頻度で発生するｔＲＮＡをコードするコドンの使用と組み合わせて、最大Ｇ／Ｃ含有量がもたらされるように、任意の所望のｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を遺伝コードまたはその縮重性の助けによって修飾することができ、修飾型ｍＲＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは非修飾型配列と比較して修飾されていない。代替的には、Ｇ／Ｃ含有量のみ、またはコドン使用頻度のみを、元の配列と比較して改変することも可能である。Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ ６．０（使用される開発環境：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ６．０とＳｅｒｖｉｃｅｐａｃｋ ３）のソースコードも、ＷＯ０２／０９８４４３に記載されている。本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明のｍＲＮＡ配列のリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量は、そのそれぞれの野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量と比較して増大する。この修飾（リボソーム結合部位周囲のＡ／Ｕ含有量の増大）により、ｍＲＮＡにリボソームが結合する効率が上昇する。リボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列：配列番号２２４３０７または配列番号２２４３０８、ＡＵＧは開始コドンを形成する）へのリボソームの効果的な結合には、ｍＲＮＡの効率的な翻訳という効果がある。本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列は、潜在的に不安定化する配列エレメントに関して修飾されていてもよい。特に、このｍＲＮＡ配列のコード領域及び／または５’及び／または３’非翻訳領域は、不安定化配列エレメントを含まないように、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾されていてもよく、修飾型ｍＲＮＡ配列のコードされるアミノ酸配列は、好ましくは、そのそれぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾されていない。例えば真核生物ｍＲＮＡの配列では、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が発生し、これにシグナルタンパク質が結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの酵素分解を制御することが知られている。したがって、修飾型ｍＲＮＡ配列の（場合により、本明細書で定義されるような少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする領域における）さらなる安定化のために、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較した１つ以上のかかる修飾を行って、そこに不安定化配列エレメントが含まれないまたは実質的に含まれないようにすることができる。本発明によれば、非翻訳領域（３’－ＵＴＲ及び／または５’－ＵＴＲ）に存在するＤＳＥも、そのような修飾によって本発明のｍＲＮＡ配列から排除され得る。そのような不安定化配列は、例えば、多数の不安定なｍＲＮＡの３’－ＵＴＲセクションで発生するＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）である（Ｃａｐｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８６， ８３： １６７０ ｔｏ １６７４）。したがって、本発明のｍＲＮＡ配列は、好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列がそのような不安定化配列を含まないように、それぞれの野生型ｍＲＮＡと比較して修飾されている。このことは、可能なエンドヌクレアーゼによって認識される配列モチーフ、例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲセグメントに含まれる配列ＧＡＡＣＡＡＧ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １９９４， １３： １９６９ ｔｏ １９８０）にも適用される。これらの配列モチーフも、好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列では除去される。
好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ１）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ２）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ３）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ４）」、もしくは「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ５）」で始まる識別番号＜２２３＞を有する、配列表、またはＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８４３（参照により本明細書に組み込まれる）の表１～５の「カラムＣ」もしくは図２０～２４それぞれで開示される、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと同一か、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％もしくはさらには９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
本発明によれば、本発明のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子のｍＲＮＡに含まれるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物のさらなる好ましい修飾は、同じアミノ酸をコードするコドンが典型的には異なる頻度で発生するという所見に基づく。本発明によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含む修飾型ｍＲＮＡ化合物において、本明細書で定義されるようなコード領域は、好ましくは、同じアミノ酸をコードするコドンの頻度が、ヒトコドン使用頻度による該コドンの天然に発生する頻度に対応するように、それぞれの野生型ｍＲＮＡの対応するコード領域と比較して修飾されている。
例えば、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の少なくとも１つのコード領域によってコードされるアミノ酸配列に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、コドン「ＧＣＣ」が０．４０の頻度で使用され、コドン「ＧＣＴ」が０．２８の頻度で使用され、コドン「ＧＣＡ」が０．２２の頻度で使用され、コドン「ＧＣＧ」が０．１０の頻度で使用されるような具合で、野生型コード領域が適応されることが好ましい。
好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、エボラウイルスに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと同一か、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％もしくはさらには９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
上述のように、本発明によれば、細胞内で比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列のすべてのコドンが、細胞内で比較的高頻度であり、いずれの場合にも比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換されることが好ましい。そのような最適化手順は、コドン適応指数（ＣＡＩ）を増大させ、最終的にはＣＡＩを最大化する。本発明の文脈において、ＣＡＩが増大または最大化した配列は、典型的には、「コドン最適化」配列、及び／またはＣＡＩ増大配列、及び／またはＣＡＩ最大化配列と呼ばれる。好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、少なくとも１つのコード領域を含み、コード領域／配列は、本明細書に記載されるようにコドン最適化されている。より好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、または少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は１である。
例えば、本発明によるＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、最も高頻度のヒトコドン「ＧＣＣ」が常に前記アミノ酸のために使用されるような具合で野生型コード配列が適応され、またはアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）については、最も高頻度のヒトコドン「ＴＧＣ」が常に前記アミノ酸のために使用されるような具合で野生型配列が適応されるなどということである。
好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと同一か、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％もしくはさらには９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
別の実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、ｍＲＮＡ配列の、好ましくはｍＲＮＡ配列のコード領域の、シトシン（Ｃ）含有量を改変すること、好ましくは増大させることによって改変され得る。
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のｍＲＮＡ配列のコード領域のＣ含有量は、それぞれの野生型ｍＲＮＡ、すなわち未修飾型ｍＲＮＡのコード領域のＣ含有量と比較して、改変され、好ましくは増大する。本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域によってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれの野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない。
本発明の好ましい実施形態では、修飾型ｍＲＮＡ配列は、理論上可能な最大シトシン含有量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％、もしくは少なくとも９０％、またはさらには最大シトシン含有量が達成されるように修飾される。
さらなる好ましい実施形態では、「シトシン含有量最適化可能」であるターゲットｍＲＮＡ野生型配列のコドンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらには１００％が、野生型配列に存在するものよりも高いシトシン含有量を有するコドンに置き換えられる。
さらなる好ましい実施形態では、野生型コード配列のコドンのいくつかは、細胞内で比較的稀なｔＲＮＡのコドンが、細胞内で比較的高頻度のｔＲＮＡのコドンに交換されるように、さらに修飾されていてもよいが、ただし、置換される比較的高頻度のｔＲＮＡのコドンが、元の野生型コドンの比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬することを条件とする。好ましくは、シトシンを全く含まないコドンだけにコードされるアミノ酸をコードするコドンを除いて、または各々が同じ数のシトシンを含む２つのコドンによってコードされるグルタミン（Ｇｌｎ）を除いて、比較的稀なｔＲＮＡのコドンのすべてが、細胞内で比較的高頻度のｔＲＮＡのコドンに置き換えられる。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、修飾型ターゲットｍＲＮＡは、理論上可能な最大シトシン含有量の少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、またはさらには最大シトシン含有量が、細胞内で比較的高頻度のｔＲＮＡをコードするコドンによって達成されるように修飾され、アミノ酸配列は変化しないままである。
遺伝コードの天然に発生する縮重のため、２つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコードし得る。したがって、２０種中１８種の天然に発生するアミノ酸は、２つ以上のコドンによってコードされ（Ｔｒｙｐ及びＭｅｔは例外である）、例えば、２つのコドンによって（例えばＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、３つのコドンによって（例えばＩｌｅ）、４つのコドンによって（例えばＡ１、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）、または６つのコドンによってコードされる（例えばＬｅｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ）。しかし、同じアミノ酸をコードするすべてのコドンが、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で同じ頻度で用いられるわけではない。各々の生物に応じて、典型的なコドン使用頻度プロファイルが確立されている。
本発明の文脈において使用される「シトシン含有量最適化可能コドン」という用語は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも低いシトシン含有量を呈するコドンを指す。したがって、野生型コドンは、同じアミノ酸をコードし、該コドンより大きな数のシトシンを呈する別のコドンに置き換えることができる場合、シトシン最適化可能（Ｃ最適化可能）とみなされる。このような、野生型コード領域内の特定のＣ最適化コドンによるＣ最適化可能野生型コドンの置換は、その全体的なＣ含有量を増大させ、Ｃエンリッチ修飾型ｍＲＮＡ配列を反映する。好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列、好ましくは本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、すべての潜在的にＣ最適化可能なコドンに対してＣ最適化コドンを含むＣ最大化ｍＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。したがって、理論上置き換え可能なＣ最適化可能コドンの１００％またはすべてが、好ましくは、コード領域の全長にわたってＣ最大化コドンに置き換えられる。
この文脈において、シトシン含有量最適化可能コドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも低い数のシトシンを含むコドンである。
コドンＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＵはすべて、アミノ酸Ａｌａをコードし、同じアミノ酸をコードするコドンＧＣＣと交換することができ、及び／または
ＣｙｓをコードするコドンＵＧＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＧＣと交換することができ、及び／または
ＡｓｐをコードするコドンＧＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＧＡＣと交換することができ、及び／または
ＰｈｅをコードするコドンＵＵＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＵＣと交換することができ、及び／または
ＧｌｙをコードするコドンＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＧＧＣと交換することができ、及び／または
ＨｉｓをコードするコドンＣＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＣＡＣと交換することができ、及び／または
ＩｌｅをコードするコドンＡＵＡ、ＡＵＵはいずれも、コドンＡＵＣと交換することができ、及び／または
ＬｅｕをコードするコドンＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＵＣと交換することができ、及び／または
ＡｓｎをコードするコドンＡＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＡＡＣと交換することができ、及び／または
ＰｒｏをコードするコドンＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＣＣと交換することができ、及び／または
ＡｒｇをコードするコドンＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＧＣと交換することができ、及び／または
ＳｅｒをコードするコドンＡＧＵ、ＡＧＣ、ＵＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＵＣＣと交換することができ、及び／または
ＴｈｒをコードするコドンＡＣＧ、ＡＣＡ、ＡＣＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＡＣＣと交換することができ、及び／または
ＶａｌをコードするコドンＧＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＵはいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＧＵＣと交換することができ、及び／または
ＴｙｒをコードするコドンＵＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＡＣと交換することができる。
上記事例のいずれにおいても、シトシンの数は、交換されるコドンごとに１増える。コード領域のすべての非Ｃ最適化コドン（Ｃ最適化可能コドンに対応する）の交換は、Ｃ最大化コード配列をもたらす。本発明の文脈において、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域内の非Ｃ最適化コドンの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％は、Ｃ最適化コドンに置き換えられる。
いくつかのアミノ酸については、Ｃ最適化コドンに置き換えられるＣ最適化可能コドンのパーセンテージが７０％未満であり、他のアミノ酸については、コード領域のすべてのＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも７０％というＣ最適化の全体的なパーセンテージを満たすように、置き換えられるコドンのパーセンテージが７０％超であることが好ましい場合がある。
好ましくは、本発明のＣ最適化ｍＲＮＡ配列において、あらゆるアミノ酸に対するＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも５０％がＣ最適化コドンに置き換えられ、例えば、任意の修飾型ＣエンリッチｍＲＮＡ配列は、好ましくは、上述のアミノ酸Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＴｙｒのいずれか１つをコードするＣ最適化可能野生型コドンの位置に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％のＣ最適化コドンを含む。
この文脈において、シトシン含有量最適化可能ではないが、少なくとも２つのコドンによってコードされるアミノ酸をコードするコドンが、さらなる選択プロセスなしで使用され得る。しかし、ヒト細胞などの細胞内で比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列のコドンは、細胞内で比較的高頻度のｔＲＮＡをコードするコドンと交換することができ、これらは両方が同じアミノ酸をコードする。したがって、Ｇｌｕをコードする比較的稀なコドンＧＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＧＡＧと交換することができ、及び／または
Ｌｙｓをコードする比較的稀なコドンＡＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＡＡＧと交換することができ、及び／または
Ｇｉｎをコードする比較的稀なコドンＣＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＣＡＧと交換することができる。
この文脈において、各々１つのコドンのみにコードされるアミノ酸Ｍｅｔ（ＡＵＧ）及びＴｒｐ（ＵＧＧ）は、変化しないままである。終止コドンは、シトシン含有量が最適化されないが、比較的稀な終止コドンであるａｍｂｅｒ、ｏｃｈｒｅ（ＵＡＡ、ＵＡＧ）は、比較的高頻度の終止コドンｏｐａｌ（ＵＧＡ）と交換することができる。
上掲の単一置換は、野生型ｍＲＮＡ配列と比較して修飾型ｍＲＮＡ配列のシトシン含有量を最適化するために、個別に使用してもよく、すべての考えられる組み合わせで使用してもよい。
したがって、本明細書で定義されるような少なくとも１つのコード配列は、それぞれの野生型ｍＲＮＡのコード領域と比較して、少なくとも２つ以上のコドンによってアミノ酸がコードされるように変化していてもよく、少なくとも２つ以上のコドンの１つは、１つの追加のシトシンを構成し、そのようなコドンは、１つの追加のシトシンを構成するＣ最適化コドンと交換することができ、アミノ酸は、好ましくは、野生型配列と比較して改変されない。
好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、狂犬病ウイルスの糖タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含み、コード領域が、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと同一か、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％もしくはさらには９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の少なくとも１つのコード領域は、（修飾型）ＲＮＡ配列のいずれか１つまたはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、本明細書で定義されるような少なくとも１つのコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含み、ｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含有量が、対応する野生型ｍＲＮＡの対応するコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して増大している、及び／または
ｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域のＣ含有量が、対応する野生型ｍＲＮＡの対応するコード領域のＣ含有量と比較して増大している、及び／または
ｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域内のコドンが、ヒトコドン使用頻度に適応しており、コドン適応指数（ＣＡＩ）が、好ましくは、ｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域内で増大または最大化しており、
ｍＲＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。
別の本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるような修飾型ｍＲＮＡ配列は、好ましくは本明細書に記載されるようにｍＲＮＡを安定化する、いわゆる「５’－ＣＡＰ構造」の付加によって修飾されていてもよい。５’－ＣＡＰは、成熟型ｍＲＮＡの５’末端を概して「キャップする」実体、典型的には修飾型ヌクレオチド実体である。５’－ＣＡＰは、典型的には、修飾型ヌクレオチドによって、特にグアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’－ＣＡＰは、５’－５’－三リン酸結合を介して５’末端に連結される。５’－ＣＡＰは、メチル化されていてもよく、例えばｍ７ＧｐｐｐＮであり得、ここで、Ｎは、５’－ＣＡＰを有する核酸の５’末端ヌクレオチド、典型的にはｍＲＮＡの５’末端である。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されるｍＲＮＡにおいて天然に発生する５’－ＣＡＰ構造であり、したがって、好ましくは、この文脈における修飾型ｍＲＮＡに含まれる修飾とはみなされない。したがって、本発明の修飾型ｍＲＮＡ配列は、ｍ７ＧｐｐｐＮを５’－ｃａｐとして含み得るが、さらに修飾型ｍＲＮＡ配列は、典型的には、本明細書で定義されるような少なくとも１つのさらなる修飾を含む。
５’－ＣＡＰ構造のさらなる例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－反転ヌクレオチド部分、３’－３’－反転脱塩基部分、３’－２’－反転ヌクレオチド部分、３’－２’－反転脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。これらの修飾型５’－ＣＡＰ構造は、この文脈では少なくとも１つの修飾とみなされる。
特に好ましい修飾型５’－ＣＡＰ構造は、ｃａｐ１（ｍ７Ｇの隣接ヌクレオチドのリボースのメチル化）、ｃａｐ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースＣＡＰアナログ、修飾型ＡＲＣＡ（例えばホスホチオエート修飾型ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンである。したがって、本発明によるＲＮＡは、好ましくは５’－ＣＡＰ構造を含む。
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、３’末端に、典型的には約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約４０～８０個のアデノシンヌクレオチド、またはさらにより好ましくは約５０～７０個のアデノシンヌクレオチドのポリＡ尾部を含み得る。
好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物におけるポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＤＮＡ鋳型から誘導される。代替的には、ポリ（Ａ）配列は、必ずしもＤＮＡ前駆体から転写されることなく、化学合成の一般的な方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで取得することもできる。さらに、ポリ（Ａ）配列、またはポリ（Ａ）尾部は、当技術分野で知られる市販のポリアデニル化キット及び対応するプロトコールを使用した、本発明によるＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によって生成され得る。
代替的には、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、場合により、本明細書で定義されるポリアデニル化シグナルをシグナルとして含み、このシグナルは、ポリアデニル化を（転写された）ＲＮＡに、特定のタンパク質因子（例えば切断及びポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子Ｉ及びＩＩ（ＣＦ Ｉ及びＣＦ ＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によって伝える。この文脈において、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡコンセンサス配列を含むコンセンサスポリアデニル化シグナルが好ましい。特に好ましい態様では、ポリアデニル化シグナルは、次の配列：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡまたはＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡのうちの１つを含む（ここで、ウリジンは通常ＲＮＡに存在し、チミジンは通常ＤＮＡに存在する）。
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、３’末端に、典型的には約１０～２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０～１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約２０～７０個のシトシンヌクレオチド、またはさらにより好ましくは約２０～６０個、またはさらには１０～４０個のシトシンヌクレオチドのポリ（Ｃ）尾部を含み得る。
１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１２５個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約９５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９５個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｄ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
より好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）インフルエンザもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする、少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約９５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９５個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｄ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）インフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードし、好ましくは、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｗｔ）」または「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ１）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ２）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ３）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ４）」、または「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ５）」で始まる識別番号＜２２３＞を有する、配列表で開示される核酸配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約１０５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９７～１０１個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｄ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントまたは３’－ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、ＵＴＲエレメントは、任意の天然に発生する遺伝子の５’－ＵＴＲもしくは３’－ＵＴＲに由来する、または遺伝子の５’－ＵＴＲもしくは３’－ＵＴＲのフラグメント、ホモログもしくはバリアントに由来する、核酸配列を含むかまたはそれからなる。好ましくは、本発明に従って使用される５’－ＵＴＲエレメントまたは３’－ＵＴＲエレメントは、本発明のｍＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域に対して異種である。天然に発生する遺伝子に由来する５’－ＵＴＲエレメントまたは３’－ＵＴＲエレメントが好ましい場合でも、本発明の文脈では、合成的に工学操作されたＵＴＲエレメントも使用できる。
「３’－ＵＴＲエレメント」という用語は、典型的には、３’－ＵＴＲまたは３’－ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる核酸配列を指す。本発明の意味における３’－ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの３’－ＵＴＲを表し得る。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡの、好ましくはｍＲＮＡの３’－ＵＴＲでもよく、またはＲＮＡの３’－ＵＴＲの転写鋳型でもよい。したがって、３’－ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡの３’－ＵＴＲ、好ましくは遺伝子工学操作されたベクター構築物の転写によって得られるｍＲＮＡなどのｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに対応する核酸配列であることが好ましい。好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントは、３’－ＵＴＲの機能を果たすか、または３’－ＵＴＲの機能を果たす配列をコードする。
好ましくは、少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’－ＵＴＲ、または脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる。
好ましくは、本発明のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、増強された半減期を有するｍＲＮＡに関連する（安定なｍＲＮＡをもたらす）遺伝子から誘導可能であり得る３’－ＵＴＲエレメント、例えば以下に定義及び記載される３’－ＵＴＲエレメントを含む。好ましくは、３’－ＵＴＲエレメントは、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする遺伝子または前記遺伝子のホモログ、フラグメントもしくはバリアントの３’－ＵＴＲに由来する核酸配列である。
特に好ましい実施形態では、３’－ＵＴＲエレメントは、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９～１３９０による、アルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子、例えばコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはアルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子、例えばコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアント、またはそのホモログ、フラグメントもしくはバリアントに由来する、核酸配列を含むかまたはそれからなる。特に好ましい実施形態では、３’－ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳動物のアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる。
「［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲに由来する核酸配列」という用語は、好ましくは、［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲ配列またはその一部、例えば、アルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、もしくはコラーゲンアルファ遺伝子、例えばコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはその一部に基づく核酸配列を指す。この用語には、アルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンアルファ遺伝子、例えばコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子などの、遺伝子の３’－ＵＴＲ配列全体、すなわち完全長３’－ＵＴＲ配列に対応する配列、及び遺伝子の３’－ＵＴＲ配列のフラグメントに対応する配列が含まれる。
「［．．．］遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列」という用語は、好ましくは、上述のように、遺伝子の３’－ＵＴＲ配列のバリアント、例えば、アルブミン遺伝子、α－グロビン遺伝子、β－グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、もしくはコラーゲンアルファ遺伝子、例えばコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアント、またはその一部に基づく核酸配列を指す。この用語には、遺伝子の３’－ＵＴＲのバリアントの配列全体、すなわち遺伝子の完全長バリアント３’－ＵＴＲ配列に対応する配列、及び遺伝子のバリアント３’－ＵＴＲ配列のフラグメントに対応する配列が含まれる。この文脈におけるフラグメントは、好ましくは、完全長バリアント３’－ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％に相当する、完全長バリアント３’－ＵＴＲ内のヌクレオチドの連続的区間に対応するヌクレオチドの連続的区間からなる。本発明の意味において、バリアントのこのようなフラグメントは、好ましくは、本明細書に記載されるバリアントの機能的フラグメントである。
好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは本明細書で定義されるような、５’－ＣＡＰ構造及び／または少なくとも１つの３’－非翻訳領域エレメント（３’－ＵＴＲエレメント）を含む。より好ましくは、ＲＮＡは、本明細書で定義されるような５’－ＵＴＲエレメントをさらに含む。
１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくはアルファグロビン遺伝子、そのホモログ、フラグメントまたはバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる、３’－ＵＴＲエレメント、
ｄ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約１０５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９７～１０１個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｅ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）好ましくはインフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする、少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくはアルファグロビン遺伝子、そのホモログ、フラグメントまたはバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる、３’－ＵＴＲエレメント、
ｄ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約１０５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９７～１０１個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｅ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＡｍ（Ｃａｐ１）及びｍ７ＧｐｐｐＡ（Ｃａｐ０）、
ｂ）好ましくはインフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントの、少なくとも１つのコード領域、
ｃ）場合により、好ましくはアルファグロビン遺伝子、そのホモログ、フラグメントまたはバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる、３’－ＵＴＲエレメント、
ｄ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約１０５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９７～１０１個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、
ｅ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物は、少なくとも１つの５’－非翻訳領域エレメント（５’－ＵＴＲエレメント）を含む。好ましくは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する、またはＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲのフラグメント、ホモログもしくはバリアントに由来する、核酸配列を含むかまたはそれからなる。
５’－ＵＴＲエレメントは、上記で定義したようなＴＯＰモチーフまたは５’－ＴＯＰを含まないことが特に好ましい。
いくつかの実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する５’－ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その３’末端において、その由来である遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドン（例えばＡ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、または１０位上流に位置するヌクレオチドで終結する。したがって、５’－ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード領域のいかなる部分も含まない。したがって、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列の唯一のタンパク質コード部分が、コード領域によって提供される。
ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列は、好ましくは、真核生物のＴＯＰ遺伝子、好ましくは植物または動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子、さらにより好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳動物のＴＯＰ遺伝子、例えばヒトのＴＯＰ遺伝子に由来する。
例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、好ましくは、核酸配列を含むかまたはそれからなる５’－ＵＴＲエレメントから選択される。
好ましい実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物の５’－ＵＴＲエレメントは、ヌクレオチド位置５（すなわち配列の５位に位置するヌクレオチド）から、開始コドンのすぐ５’側にある（配列の３’末端に位置する）ヌクレオチド位置まで伸びる核酸配列に由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる。
特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲまたはリボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる。例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号６７、１７０、１９３、２４４、２５９、５５４、６５０、６７５、７００、７２１、９１３、１０１６、１０６３、１１２０、１１３８、及び１２８４～１３６０のいずれかによる核酸配列の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列、本明細書に記載されるような対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントを含むかまたはそれからなり、好ましくは５’－ＴＯＰモチーフを欠いている。上述のように、５位から、ＡＴＧのすぐ５’側の（配列の３’末端に位置する）ヌクレオチドまで伸びる配列は、前記配列の５’－ＵＴＲに対応する。
好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲまたはリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲのホモログもしくはバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる。例えば、５’－ＵＴＲエレメントは、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３／１４３７００号（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号６７、２５９、１２８４～１３１８、１３４４、１３４６、１３４８～１３５４、１３５７、１３５８、１４２１及び１４２２のいずれかによる核酸配列の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列、本明細書に記載されるような対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントを含むかまたはそれからなり、好ましくは５’－ＴＯＰモチーフを欠いている。
特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’－ＵＴＲ、またはリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなり、５’－ＵＴＲエレメントは、好ましくは、前記遺伝子の５’－ＴＯＰを含まない。
したがって、特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８または好ましくは対応するＲＮＡ配列と、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％対応する同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列のフラグメントを含むかまたはそれからなり、好ましくは、該フラグメントは、上述のとおり、すなわち完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％などに相当するヌクレオチドの連続的区間である。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチドまたはそれ以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを呈する。好ましくは、該フラグメントは、本明細書に記載される機能的フラグメントである。
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ、またはそのホモログもしくはバリアントから選択される、哺乳動物の、例えばヒトのＴＯＰ遺伝子などの、脊椎動物ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる、５’－ＵＴＲエレメントを含み、好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子のＴＯＰモチーフまたは５’－ＴＯＰを含まず、場合により、５’－ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位または１０位下流に位置するヌクレオチドで始まり、さらに場合により、ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する５’－ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、その由来である遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位または１０位上流に位置するヌクレオチドで終結する。
さらなる特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導性１遺伝子（ＡＩＧ１）、チトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくはＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、またはそのバリアント、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物のアンドロゲン誘導性１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物のチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくは脊椎動物のＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、またはそのバリアント、より好ましくは哺乳動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳動物のヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳動物のアンドロゲン誘導性１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳動物のチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくは哺乳動物のＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、またはそのバリアント、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトのＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体、アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトのアンドロゲン誘導性１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、もしくはヒトのＮ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、またはそのバリアントの５’－ＵＴＲに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは、５’－ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子の５’－ＴＯＰを含まない。
したがって、特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８もしくは配列番号１４１２～１４２０による核酸配列、または対応するＲＮＡ配列と、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８または配列番号１４１２～１４２０による核酸配列と、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列のフラグメントを含むかまたはそれからなり、好ましくは、該フラグメントは、上述のとおり、すなわち完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％などに相当するヌクレオチドの連続的区間である。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチドまたはそれ以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを呈する。好ましくは、該フラグメントは、本明細書に記載される機能的フラグメントである。
したがって、特に好ましい実施形態では、５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号１（５’末端オリゴピリミジントラクトを欠いているＡＴＰ５Ａ１の５’－ＵＴＲ：ＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＡＧ；特許出願第ＷＯ２０１３／１４３７００号の配列番号２２４２８９に対応する）による核酸配列または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号２２４２９０）と、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントは、配列番号２２４２８９による核酸配列またはより好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号２２４２９０）と、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列のフラグメントを含むかまたはそれからなり、好ましくは、該フラグメントは、上述のとおり、すなわち完全長５’－ＵＴＲの少なくとも２０％などに相当するヌクレオチドの連続的区間である。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチドまたはそれ以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを呈する。好ましくは、該フラグメントは、本明細書に記載される機能的フラグメントである。
好ましくは、少なくとも１つの５’－ＵＴＲエレメントと、少なくとも１つの３’－ＵＴＲエレメントとは、相乗的に作用して、上述の少なくとも１つのｍＲＮＡ配列からのタンパク質産生を増大させる。
好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物は、好ましくは５’から３’の方向で、以下を含む：
ａ）５’－ＣＡＰ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ、
ｂ）場合により、好ましくはＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲに由来する核酸配列を含むかまたはそれからなる、より好ましくは、配列番号２２４２８８に示される、配列番号２２４２８７による核酸配列の対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、フラグメントまたはバリアントを含むかまたはそれからなる、５’－ＵＴＲエレメント、
ｃ）好ましくはインフルエンザウイルスもしくは狂犬病ウイルスのタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードし、好ましくは、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｗｔ）」もしくは「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ１）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ２）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ３）」、「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ４）」、もしくは「誘導型及び／または修飾型ＣＤＳ配列（ｏｐｔ５）」で始まる識別番号＜２２３＞を有する、配列表、またはＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８４３（参照により本明細書に組み込まれる）の表１～５の「カラムＢ」もしくは「カラムＣ」もしくは図２０～２４それぞれで開示される核酸配列、配列番号３２０１３～６４０２４、または配列番号６４０２５～２２４０８４のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、少なくとも１つのコード領域、
ｄ）場合により、好ましくは安定なｍＲＮＡをもたらす遺伝子に由来する核酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは核酸配列の対応するＲＮＡ配列またはそのホモログ、フラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなる、３’－ＵＴＲエレメント、
ｅ）場合により、好ましくは約５０～約２５０個のアデノシン、より好ましくは約７５～約１００個のアデノシン、最も好ましくは約８５～約１０５個のアデノシン、ある特定の実施形態では９７～１０１個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列、及び
ｆ）場合により、好ましくは約１０～約１００個のシトシン、より好ましくは約２０～約５０個のシトシン、最も好ましくは約２５～約３５個のアデノシトシン、ある特定の実施形態では３０個のシトシンを含むポリ（Ｃ）配列。
シグナルペプチド
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明によるｍＲＮＡ配列は、さらに、または代替的に、分泌性シグナルペプチドをコードし得る。そのようなシグナルペプチドは、典型的には約１５～３０アミノ酸の長さを呈し、好ましくはコードされるペプチドのＮ末端に位置する配列であるが、これに限定されるものではない。本明細書で定義されるようなシグナルペプチドは、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡ配列によってコードされる抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドを、特定の細胞コンパートメント、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソームコンパートメントに輸送することを可能にする。本明細書で定義されるような分泌性シグナルペプチド配列の例は、古典的または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣ Ｉ分子及びＭＨＣ ＩＩ分子の、例えばＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０２０１のシグナル配列）、本明細書で定義されるようなサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書で定義されるような免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン、カルネキシン、及びさらなる膜関連タンパク質または小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム－リソソームコンパートメントに関連するタンパク質のシグナル配列を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０２０１のシグナル配列が本発明に従って使用され得る。例えば、ＨＬＡ－Ａに由来するシグナルペプチドが、本明細書で定義されるようなコードされる抗原またはそのフラグメントもしくはバリアントの分泌を促進するために使用されることが好ましい。より好ましくは、ＨＬＡ－Ａシグナルペプチドは、本明細書で定義されるようなコードされる抗原またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合している。
ｍＲＮＡの生産
本発明によるｍＲＮＡは、例えば固相ＲＮＡ合成などの合成方法、及びＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応、特に実施例に記載するもののようなｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。
上記のように、本発明によるｍＲＮＡ化合物は、脂質ナノ粒子に封入されているか、またはそれと会合している。
本発明のアジュバント
好適なアジュバントは、さらに、式ＧＩＸｍＧｎ（式中、Ｇは、グアノシン、ウラシル、またはグアノシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、または上述のヌクレオチドのアナログであり、Ｉは、１～４０の整数であり、Ｉ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはそのアナログであり、Ｉ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはそのアナログであり、ｍは整数であり、少なくとも３であり、ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３のとき、少なくとも３つ連続したウラシルまたはウラシルのアナログが発生し、ｎは、１～４０の整数であり、ｎ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはそのアナログである）、または式：（ＮｕＧＩＸｍＧｎＮｖ）ａ（式中、Ｇは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、またはグアノシン（グアニン）もしくはウリジン（ウラシル）のアナログ、好ましくはグアノシン（グアニン）またはそのアナログであり、Ｘは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、またはこれらのヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログ、好ましくはウリジン（ウラシル）またはそのアナログであり、Ｎは、約４～５０個、好ましくは約４～４０個、より好ましくは約４～３０個または４～２０個の核酸の長さを有する核酸配列であり、各Ｎは、独立的に、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、またはこれらのヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログから選択され、ａは、１～２０、好ましくは１～１５、最も好ましくは１～１０の整数であり、Ｉは、１～４０の整数であり、Ｉ＝１のとき、Ｇはグアノシン（グアニン）またはそのアナログであり、Ｉ＞１のとき、これらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％はグアノシン（グアニン）またはそのアナログであり、ｍは整数であり、少なくとも３であり、ｍ＝３のとき、Ｘはウリジン（ウラシル）またはそのアナログであり、ｍ＞３のとき、少なくとも３つの連続したウリジン（ウラシル）またはウリジン（ウラシル）のアナログが発生し、ｎは、１～４０の整数であり、ｎ＝１のとき、Ｇはグアノシン（グアニン）またはそのアナログであり、ｎ＞１のとき、これらのヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％はグアノシン（グアニン）またはそのアナログであり、ｕ、ｖは、互いに独立的に、０～５０の整数であり得、好ましくは、ｕ＝０のとき、ｖ＞１であり、またはｖ＝０のとき、ｕ＞１である）を有する核酸から選択することができ、式（ＮｕＧＩＸｍＧｎＮｖ）ａの核酸分子は、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５０ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、アジュバント効果を有する。特定の実施形態では、本発明のイオン化可能脂質は、アジュバントとして作用することもできる。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば、モンタニドＩＳＡ－５１（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、ＱＳ－２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、オレイン酸、破傷風ヘルパーペプチド（例えばＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）及び／またはＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号３）だがこれに限定されない）、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホサミド、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、レバミソール、アジメゾン、イソプリニソン（ｉｓｏｐｒｉｎｉｓｏｎｅ）、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、ミネラルゲル、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、核酸（例えば可溶性鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡだがこれに限定されない）ジニトロフェノール、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ、例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／またはＴＬＲ９だがこれに限定されない）アゴニスト（リポ多糖（ＬＰＳ）などのエンドトキシン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、及び／またはポリイノシン－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ／ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標）、Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、ＩＭＯ－２０５５、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）、ＱＳ－２１（ソープバークツリーまたはソープバークとしても知られる樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの樹皮から抽出されるサポニン）、レシキモド（ＴＬＲ７／８アゴニスト）を含むがこれに限定されない）、ＣＤＸ－１４０１（ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原に連結した樹状細胞受容体ＤＥＣ－２０５への特異性を有する完全ヒトモノクローナル抗体からなる融合タンパク質）、Ｊｕｖａｒｉｓのカチオン性脂質－ＤＮＡ複合体、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ、ならびにそれらの組み合わせである。一実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５９５に由来する異種性のモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を使用したアジュバントが、動物ワクチン及びヒトワクチン中の異種タンパク質に対するＴｈ－１型免疫応答を誘導するために使用される。例示的なモノホスホリルリピドＡ型アジュバントを以下に示す。

Figure 2023546908000128
他の好適なアジュバントは、さらに、式：ＣＩＸｍＣｎを有する核酸から選択することができ、式中、Ｃは、シトシン、ウラシル、またはシトシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、または上述のヌクレオチドのアナログであり、Ｉは、１～４０の整数であり、Ｉ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはそのアナログであり、Ｉ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはそのアナログであり、ｍは整数であり、少なくとも３であり、ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３のとき、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが発生し、ｎは、１～４０の整数であり、ｎ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはそのアナログである。
この文脈において、ＷＯ２００８／０１４９７９及びＷＯ２００９／０９５２２６の開示内容も参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義されるようなコード領域を含むｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡ化合物を含む、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に基づく、ワクチンを提供する。本発明によるワクチンは、好ましくは、本明細書で定義されるような（医薬）組成物である。
したがって、本発明によるワクチンは、本明細書に記載される（医薬）組成物と同じ成分に基づく。したがって、本明細書で提供される（医薬）組成物の説明が参照され得る。好ましくは、本発明によるワクチンは、本明細書で定義されるような少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を含む少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む。諸実施形態において、ワクチンが、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に封入された２つ以上のｍＲＮＡ配列（例えば本発明による複数のＲＮＡ配列であって、各々が好ましくは異なる抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする複数のＲＮＡ配列）を含む場合、ワクチンは、物理的に別個の形態で提供されてもよく、別個の投与ステップによって投与されてもよい。本発明によるワクチンは、ｍＲＮＡ配列が単一の組成物によって提供される場合は特に、本明細書に記載される（医薬）組成物に対応し得る。しかし、本発明のワクチンは、物理的に分離した状態で提供されてもよい。例えば、諸実施形態において、ワクチンが、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に封入された２つ以上のｍＲＮＡ配列／種を含む場合、これらのＲＮＡ種は、例えば、各々が異なる抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡ種／配列（例えば３つの異なるｍＲＮＡ種／配列）を各々が含み得る、２、３、４、５、または６つの別個の組成物（これらは組み合わされても組み合わされなくてもよい）が提供されるように、提供され得る。また、本発明のワクチンは、各組成物が本明細書で定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、少なくとも２つの異なる組成物の組み合わせでもよい。代替的には、ワクチンは、少なくとも１つのｍＲＮＡ、好ましくは、各々が本明細書で定義される抗原性ペプチドまたはタンパク質のうちの１つをコードする少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のｍＲＮＡの組み合わせとして提供されてもよい。ワクチンは、その使用の前に単一の組成物を提供するように組み合わされてもよく、または、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に封入された抗原性ペプチドもしくはタンパク質のいずれかをコードする異なるｍＲＮＡ配列／種を投与するために２回以上の投与が必要となるように使用されてもよい。ワクチンが、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（典型的には、本明細書で定義される抗原の組み合わせをコードする少なくとも２つのｍＲＮＡ配列を含む）を含む場合、これは、例えば、単回投与（すべてのｍＲＮＡ種／配列を組み合わせる）によって投与されてもよく、少なくとも２回の別個の投与によって投与されてもよい。したがって、別個の実体（１つのｍＲＮＡ種を含む）または組み合わされた実体（２つ以上のｍＲＮＡ種を含む）として提供される、本明細書で定義されるような少なくとも１つの抗原性ペプチドもしくはタンパク質または抗原の任意の組み合わせ（及び場合によりさらなる抗原）をコードするモノシストロン性、バイシストロン性、またはマルチシストロン性のｍＲＮＡの任意の組み合わせが、本発明によるワクチンとして理解される。本発明のワクチンの特に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの抗原、好ましくは、本明細書で定義されるような、全体として本発明の組成物によってコードされる少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の抗原の組み合わせは、別個に投与される個別の（モノシストロン性）ｍＲＮＡとして提供される。
本発明による（医薬）組成物と同様に、ワクチンの実体は、液体形態及びまたは乾燥（例えば凍結乾燥）形態で提供され得る。これらは、さらなる成分、特にその薬学的使用を可能にするさらなる成分を含んでもよい。ワクチンまたは（医薬）組成物は、例えば、薬学的に許容される担体及び／またはさらなる補助物質及び添加剤及び／またはアジュバントをさらに含み得る。
ワクチンまたは（医薬）組成物は、典型的には、脂質ナノ粒子に封入された、及び／またはそれと会合した、本明細書で定義されるような抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントあるいは抗原の組み合わせをコードする、本明細書で定義されるような本発明によるｍＲＮＡ化合物を、安全かつ有効な量で含む。本明細書で使用される場合、「安全かつ有効な量」は、がんまたはがんに関連する疾患もしくは障害の好ましい改変を有意に誘導するのに十分であるｍＲＮＡの量を意味する。しかし同時に、「安全かつ有効な量」は、重篤な副作用を回避するために、つまり、利点とリスクとの合理的な関係を可能にするために十分に少ない。これらの限界の決定は、典型的には、合理的な医学的判断の範囲内にある。本発明のワクチンまたは（医薬）組成物に関して、「安全かつ有効な量」という表現は、好ましくは、過剰または有害な免疫反応は達成されないが、好ましくは、測定可能なレベルを下回るような免疫反応も達成されないような様式で適応免疫系を刺激するのに好適である、ｍＲＮＡの（ひいてはコードされる抗原の）量を意味する。バイシストロン性またはさらにはマルチシストロン性のｍＲＮＡは、等量のモノシストロン性ｍＲＮＡの使用よりも、コードされる抗原（複数可）を有意に高く発現させ得るため、本明細書で定義されるような（医薬）組成物またはワクチンのｍＲＮＡのそのような「安全かつ有効な量」は、さらに、モノシストロン性、バイシストロン性、またはさらにはマルチシストロン性のｍＲＮＡなど、ｍＲＮＡのタイプに依存して選択されてもよい。上記で定義したような（医薬）組成物またはワクチンのｍＲＮＡの「安全かつ有効な量」は、さらに、担当医の知識及び経験の範囲内で、処置される特定の状態、また、処置される患者の年齢及び身体状態、状態の重篤度、処置の期間、付随する療法の性質、使用される特定の薬学的に許容される担体の性質、ならびに同様の要因に関連して異なるものになる。本発明によるワクチンまたは組成物は、本発明に従って、医薬組成物またはワクチンとして、ヒトの医学的目的にも獣医学的目的にも使用され得る。
好ましい実施形態では、本発明による（医薬）組成物、ワクチン、またはパーツのキットの、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥されたｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、投与前に、好都合には水性担体に基づく好適なバッファー、例えば乳酸リンゲル液、リンゲル液、リン酸緩衝液中で再構成される。好ましい実施形態では、本発明の（医薬）組成物、ワクチン、またはパーツのキットには、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ化合物が含まれ、これは、単一種の脂質ナノ粒子として、または各ＬＮＰ種に対して別々に、場合により凍結乾燥形態で（場合により少なくとも１つのさらなる添加剤と共に）提供されてもよく、好ましくは、（モノシストロン性）ｍＲＮＡの各々の個々の投与が可能になるように、使用前に好適なバッファー（例えば乳酸リンゲル液）において別々に再構成される。
本発明によるワクチンまたは（医薬）組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは、本発明のワクチンの液体または非液体基剤を含む。本発明のワクチンが液体形態で提供される場合、担体は水、典型的にはパイロジェンフリー水、等張食塩水、または緩衝液（水溶液）、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などである。特に本発明のワクチンの注射のためには、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、及び場合によりカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含む、水または好ましくはバッファー、より好ましくは水性バッファーを使用してもよい。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び場合によりカリウム塩は、ハロゲン化物、例えば塩化物、ヨウ化物、または臭化物の形態、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、または硫酸塩などの形態で発生し得る。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例は、例えばＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４を含み、任意選択のカリウム塩の例は、例えばＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４を含み、カルシウム塩の例は、例えばＣａＣｌ２）、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２を含む。さらに、先述のカチオンの有機アニオンがバッファーに含まれていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上記で定義した注射目的で好適なバッファーは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２））、及び場合により塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含んでもよく、塩素イオンに加えてさらなるアニオンが存在してもよい。ＣａＣｌ２）は、ＫＣｌのような別の塩に置き換えることもできる。典型的には、注射バッファー中の塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が少なくとも５０ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）が少なくとも３ｍＭ、及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２））が少なくとも０．０１ｍＭの濃度で存在する。注射バッファーは、特定の参照媒体を基準にして高張性、等張性、または低張性でもよく、すなわち、バッファーは、特定の参照媒体を基準にして高い、同じ、または低い塩含有量を有してもよく、好ましくは、浸透圧または他の濃縮効果に起因する細胞の損傷を引き起こさないような先述の塩の濃度が使用され得る。参照媒体は、例えば「ｉｎ ｖｉｖｏ」法では、血液、リンパ、細胞質液、もしくは他の体液などの発生する液体、または例えば、一般的なバッファーもしくは液体など、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」法で参照媒体として使用され得る液体である。そのような一般的なバッファーまたは液体は、当業者には公知である。
しかし、ヒトへの投与に好適な、１つ以上の適合する固体もしくは液体の充填剤、または希釈剤、または封入化合物を使用してもよい。本明細書で使用される「適合する」という用語は、典型的な使用条件下での本発明のワクチンの薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないような様式で、本明細書で定義されるような本発明によるｍＲＮＡと、本発明のワクチンの構成成分を混合できることを意味する。薬学的に許容される担体、充填剤、及び希釈剤は、当然ながら、処置すべきヒトへの投与に好適となるように、純度が十分に高く、毒性が十分に低いものでなければならない。薬学的に許容される担体、充填剤、またはその構成成分として使用され得る化合物のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロース及びスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなど；デキストロース；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど；トラガント末；麦芽；ゼラチン；獣脂；固体流動促進剤、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど；硫酸カルシウム；植物油、例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びカカオ油など；ポリオール、例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなど；アルギン酸である。
薬学的に許容される担体の選択は、原則として、本発明による医薬組成物またはワクチンが投与される様式によって決定される。組成物またはワクチンは、例えば、全身投与または局所投与され得る。全身投与の経路には、一般に、例えば、経皮経路、経口経路、非経口経路（皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内注射及び／または鼻腔内投与経路を含む）が含まれる。局所投与の経路には、一般に、例えば、局部的投与経路が含まれるが、皮内、経皮、皮下、もしくは筋肉内注射、または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内、及び舌下注射も含まれる。より好ましくは、本発明による組成物またはワクチンは、皮内、皮下、または筋肉内経路、好ましくは注射によって投与することができ、注射は無針注射及び／または有針注射でもよい。したがって、組成物／ワクチンは、好ましくは、液体形態または固体形態で製剤される。投与される本発明によるワクチンまたは組成物の好適な量は、定型的な実験により、例えば動物モデルを使用することにより決定され得る。限定を意味するものではないが、そのようなモデルには、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類モデルが含まれる。好ましい注射用単位剤形は、無菌水溶液、生理食塩水、またはその混合物を含む。そのような溶液のｐＨは、約７．４など、生理学的に忍容できるｐＨに調整すべきである。好適な注射用担体としては、ヒドロゲル、徐放または遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲン基質が挙げられる。局部的適用に好適な薬学的に許容される担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどに使用するのに好適なものが挙げられる。本発明の組成物またはワクチンが経口的に投与される場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与に使用できる単位剤形を調製するための薬学的に許容される担体は、先行技術において周知である。その選択は、食味、コスト及び保存可能性など、本発明の目的にとって重要ではない二次的な考慮事項に依存し、当業者によって難なく行われ得る。
本発明のワクチンまたは組成物は、免疫原性をさらに増大させるために、１つ以上の補助物質をさらに含むことができる。本発明の組成物に含まれるｍＲＮＡと、場合により上述のように本発明のワクチンまたは組成物と合剤にできる（または別々に製剤できる）補助物質との相乗作用が、それによって達成されることが好ましい。補助物質の様々なタイプに応じて、様々な機序がこれに関する役割を果たし得る。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖、ＴＮＦ－アルファまたはＣＤ４０リガンドは、好適な補助物質の第１のクラスを形成する。一般に、「危険信号」のように免疫系に影響を与える任意の薬剤（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）、または本発明による免疫刺激性アジュバントによって生成される免疫応答がターゲティングされた様式で増強する及び／または影響を受けることを可能にするＧＭ－ＣＦＳなどのサイトカインを、補助物質として使用することが可能である。特に好ましい補助物質は、コードされる少なくとも１つの抗原による適応免疫応答の誘導に加えて自然免疫応答を促進する、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインなどのサイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＮＦ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－ベータまたはＴＮＦ－アルファ、成長因子、例えばｈＧＨである。好ましくは、そのような免疫原性を増大させる薬剤または化合物は、別々に提供され（本発明のワクチンまたは組成物と合剤にされず）、個別に投与される。
本発明のワクチンまたは組成物に含まれ得るさらなる添加剤は、例えばＴｗｅｅｎなどの乳化剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤、着色剤、食味付与剤、薬学的担体、錠剤形成剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤である。
本発明のワクチンまたは組成物は、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０への（リガンドとしての）その結合親和性から、またはマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２もしくはＴＬＲ１３への（リガンドとしての）その結合親和性から免疫刺激性であることが知られている、任意のさらなる化合物をさらに含んでもよい。
この文脈において本発明のワクチンまたは組成物に添加できる別のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ－ＲＮＡまたはＣｐＧ－ＤＮＡであり得る。ＣｐＧ－ＲＮＡまたはＣｐＧ－ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＲＮＡ）、または二本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｄｓＣｐＧ－ＲＮＡ）であり得る。ＣｐＧ核酸は、好ましくはＣｐＧ－ＲＮＡの形態、より好ましくは一本鎖ＣｐＧ－ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ－ＲＮＡ）の形態にある。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１つ以上の（分裂促進的）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（複数可）（ＣｐＧモチーフ（複数可））を含む。第１の好ましい代替形態によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、つまりＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に場合により含まれているさらなるシトシンまたはグアニンはすべて、メチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。しかし、さらなる好ましい代替形態によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化された形態で存在してもよい。
別の本発明の態様によれば、本発明は、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ化合物と、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）による少なくとも１つの脂質とを備えるキット、特にパーツのキットも提供する。さらなる実施形態では、キットは、上記で定義した脂質ナノ粒子または上記で定義した脂質ナノ粒子を含む（医薬）組成物、及び／または本発明によるワクチン、場合により、可溶化のための液体ビヒクル、ならびに場合により、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物及び／またはワクチンの投与及び投与量についての情報を含む技術的説明書を備える。技術的説明書は、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物及び／またはワクチンの投与及び投与量に関する情報を含み得る。そのようなキット、好ましくはパーツのキットは、例えば、上述の用途または使用のいずれか、好ましくは、インフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害の処置または予防のための、本発明による脂質ナノ粒子の使用（本発明の医薬、好ましくはワクチンの調製のため）に適用され得る。キットは、インフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害の処置または予防のための、本明細書で定義されるような脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの使用（本発明のワクチンの調製のため）に適用されてもよく、脂質ナノ粒子、組成物及び／またはワクチンは、上記で定義したような哺乳動物における免疫応答を誘導または増強することが可能であり得る。そのようなキットはさらに、上記で定義したような哺乳動物における免疫応答を調節、好ましくは誘発、例えば誘導または増強するための、また好ましくは、インフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害の処置または予防をサポートするための、本明細書で定義されるような脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの使用（本発明のワクチンの調製のため）に適用されてもよい。キットの特殊な形態として、パーツのキットは、本明細書に記載される、１つ以上の同一のもしくは異なる組成物、及び／または１つ以上の同一のもしくは異なるワクチンを、キットの異なるパーツに含み得る。パーツのキットは、本発明による、ある（例えば１つの）組成物、ある（例えば１つの）ワクチン、及び／またはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を、キットの異なるパーツに含んでもよく、例えば、キットの各パーツは、好ましくは異なる抗原をコードする、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む。好ましくは、キットまたはパーツのキットは、本発明によるｍＲＮＡを可溶化するためのビヒクルをパーツとして含み、ビヒクルは場合により乳酸リンゲル液である。上記キットのいずれも、上記で定義したような処置または予防に使用することができる。
この態様の別の実施形態では、本発明によるキットは、少なくとも１つのアジュバントをさらに含み得る。さらなる実施形態では、本発明によるキットは、少なくとも１つのさらなる薬学的活性成分、好ましくはがんまたは関連障害の処置及び／または予防に好適な治療用化合物をさらに含み得る。さらに、別の実施形態では、キットは、針、アプリケータ、パッチ、注射デバイスを含め、本発明による組成物またはワクチンの投与に必要または好適なパーツ及び／またはデバイスをさらに含み得る。
さらなる態様では、本発明は、医薬としてのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子または医薬組成物の使用に関する。代替的な実施形態では、本発明は、医薬の製造における医薬組成物またはｍＲＮＡを含む脂質の使用に関する。特に、前記医薬は、それを必要とする対象において免疫応答を治療的または予防的に生じさせるためのものである。
好ましい実施形態では、医薬は、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはそれに関連する自己免疫疾患もしくは障害の防止または処置のためのものである。
特に、医薬は、対象、好ましくは脊椎動物の処置のためのものである。好ましい実施形態では、対象は哺乳動物であり、好ましくは、ヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、マウス、ハムスターなどの齧歯類、ウサギ、及び特にヒトを含む群から選択される。
特に好ましい実施形態では、医薬は、ワクチン、好ましくは腫瘍ワクチン、インフルエンザワクチン、または狂犬病ワクチンである。具体的な実施形態では、医薬は、狂犬病の処置に使用される狂犬病ワクチンである。
医薬は、任意の好適な方法で投与され得る。好ましくは、医薬は、非経口投与、特に注射のためのものである。
本発明はさらに、免疫応答の誘発または増強を、それを必要とする対象において行う方法であって、上記で定義した脂質ナノ粒子または上記で定義した医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはそれに関連する自己免疫疾患もしくは障害の防止または処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、上記で定義した脂質ナノ粒子または上記で定義した医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
本発明の一態様によれば、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンは、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはそれに関連する自己免疫疾患もしくは障害の処置または予防のために、本発明に従って（医薬の調製のために）使用され得る。この文脈において特に好ましいのは、インフルエンザウイルス感染症または狂犬病ウイルス感染症の処置または予防である。
さらに、本発明には、好ましくは本明細書で定義されるような、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはそれに関連する自己免疫疾患もしくは障害を処置または防止する方法であって、それを必要とする対象に、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンの薬学的有効量を投与することによる方法も含まれる。そのような方法は、典型的には、本発明のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンを調製する任意選択の第１のステップと、それを必要とする患者／対象に（薬学的有効量の）前記組成物またはワクチンを投与することを含む第２のステップとを含む。それを必要とする対象は、典型的には哺乳動物である。本発明の文脈において、哺乳動物は、好ましくは、例えばヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、マウス、ハムスターなどの齧歯類、ウサギ、及び特にヒトを含む群から選択されるが、これに限定されるものではない。本発明のいくつかの実施形態では、対象はトリ、好ましくはニワトリである。
この文脈において、本発明には、好ましくは、インフルエンザウイルス感染症もしくは狂犬病ウイルス感染症またはそれに関連する障害を処置または防止する方法が含まれる。
本発明は、好ましくは、哺乳動物における免疫応答を誘発するための、好ましくは、がんもしくは腫瘍疾患、感染性疾患、アレルギー、またはそれに関連する自己免疫疾患もしくは障害、好ましくはインフルエンザウイルス感染症もしくは狂犬病ウイルス感染症または本明細書で定義されるような関連する状態の処置または予防のための、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンの使用にも関する。
本発明はさらに、本明細書で定義されるような哺乳動物における免疫応答を調節、好ましくは誘導または増強するための、より好ましくは、インフルエンザウイルス感染症、またはそれに関連する疾患もしくは障害を防止及び／または処置するための、本明細書で定義されるような本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンの使用を含む。この文脈において、インフルエンザウイルス感染症の処置または予防のサポートは、ノイラミニダーゼ阻害因子（例えばオセルタミビル及びザナミビル）及びＭ２タンパク質阻害因子（例えばアダマンタン誘導体）などの抗ウイルス薬を用いる療法のような従来のインフルエンザ療法と、本明細書で定義されるようなＲＮＡまたは医薬組成物を使用する療法との任意の組み合わせであり得る。インフルエンザウイルス感染症の処置または予防のサポートは、本明細書で定義される他の実施形態のいずれかでも想定され得る。したがって、任意の他の手法、好ましくは上記の治療手法のうちの１つ以上との併用療法における、特に抗ウイルス薬との組み合わせにおける、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、（医薬）組成物またはワクチンのあらゆる使用が、本発明の範囲内にある。
投与の際は、好ましくは、本明細書で定義されるような投与経路のいずれかが使用され得る。特に、本発明によるｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子によってコードされる抗原に基づいて適応免疫応答を誘導または増強することにより、本明細書で定義されるようなインフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害を処置または防止するのに好適な投与経路が使用される。本発明による組成物及び／またはワクチンの投与は、別のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、または異なる抗原もしくは抗原の組み合わせをコードするｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の組み合わせをさらに含み得る、本明細書で定義されるような別の組成物及び／またはワクチンを投与する前に、それと並行して、及び／またはその後に行われてもよく、ここで、本発明によるｍＲＮＡ配列によってコードされる各抗原は、好ましくは、インフルエンザウイルス感染症及びそれに関連する疾患または障害の処置または予防に好適である。この文脈において、本明細書で定義されるような処置は、インフルエンザウイルス感染症に関連する疾患及びそれに関連する疾患または障害の調節も含み得る。
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、本発明による（医薬）組成物またはワクチンは、注射によって投与される。当技術分野で知られている任意の好適な注射技術を用いることができる。好ましくは、本発明の組成物は、注射によって、好ましくは無針注射によって、例えばジェット注射によって投与される。
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはそれ以上含み、その各々は、好ましくは別々に、好ましくは無針注射によって注射される。代替的には、本発明の組成物は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはそれ以上のｍＲＮＡを含み、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはそれ以上のｍＲＮＡは、好ましくは本明細書で定義されるような注射によって、混合物として投与される。
さらなる態様では、本発明は、抗原または抗原の組み合わせに対して対象を免疫する方法に関する。
本明細書で定義されるような抗原または少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、もしくはそれ以上の抗原の組み合わせに対して対象を免疫するための免疫プロトコールは、典型的には、本発明による（医薬）組成物またはワクチンの単一用量または単一投与量の連続を含む。本明細書で使用される場合、単一投与量とは、最初／第１の用量、第２の用量、またはそれ以降のあらゆる用量（これらは好ましくは、免疫反応を「ブーストする」ために投与される）をそれぞれ指す。この文脈において、各々の単一投与量は、好ましくは、本明細書で定義されるような同じ抗原または抗原の同じ組み合わせの投与を含み、２つの単一投与量の投与間の間隔は、少なくとも１日、好ましくは２、３、４、５、６または７日から、少なくとも１週間、好ましくは２、３、４、５、６、７または８週間まで様々であり得る。単一投与量間の間隔は、免疫プロトコールの過程において一定であっても変化してもよく、例えばこの間隔は、プロトコールの始めには短く、終わりに近づくにつれて長くなってもよい。単一投与量の総数及び単一投与量間の間隔に応じて、免疫プロトコールは、好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは数週間（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２週間）、さらにより好ましくは数ヶ月（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４ヶ月）にわたる期間に及んでもよい。各々の単一投与量は、好ましくは、本明細書で定義されるような抗原、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、もしくはそれ以上の抗原の組み合わせの投与を包含し、したがって、少なくとも１回、好ましくは１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回の注射を要し得る。場合によっては、本発明による組成物またはワクチンは、単一投与量として、典型的には１回の注射で投与される。本発明によるワクチンが、本明細書で定義されるような異なる抗原をコードする別個のｍＲＮＡ製剤を含む場合、単一投与量の投与中に行われる注射の最小数は、ワクチンの別個の成分の数に対応する。ある特定の実施形態では、単一投与量の投与は、ワクチンの各成分（例えば、本明細書で定義されるような１つの抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む特定のｍＲＮＡ製剤など）のために２回以上の注射を包含し得る。例えば、ワクチンの個別の成分の総量を複数の部分に分けて異なる体部位に注射するため、２回以上の注射を要する場合がある。より具体的な例では、４つの別個のｍＲＮＡ製剤を含み、その各々が２つの異なる体部位に投与されるワクチンの単一投与量は、８回の注射を含む。典型的には、単一投与量は、ワクチンの全成分を投与するために必要なすべての注射を含み、単一の成分は、上記で概説したように、２回以上の注射に関与し得る。本発明によるワクチンの単一投与量の投与が２回以上の注射を包含する場合、注射は、本質的に同時に、または並行して、すなわち、典型的には医師が単回注射ステップを行うのに必要とする時間枠内で時間をずらした様式で、順々に行われる。したがって、単一投与量の投与は、好ましくは数分間、例えば２、３、４、５、１０、１５、３０または６０分間に及ぶ。
本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、本発明による（医薬）組成物またはワクチンの投与は、時間をずらした処置において行われ得る。時間をずらした処置は、例えば、インフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害の従来療法の前に、それと並行して、及び／またはその後に、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンを投与すること、例えば、インフルエンザウイルス感染症またはそれに関連する疾患もしくは障害の処置または予防に好適な療法または治療薬の投与の前に、それと並行して、及び／またはその後に、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、組成物またはワクチンを投与することによるものであり得る。そのような時間をずらした処置は、例えば、キット、好ましくは本明細書で定義されるようなパーツのキットを使用して行われ得る。
時間をずらした処置は、さらに、または代替的に、好ましくは組成物またはワクチンの一部を形成する、本明細書で定義されるような抗原性ペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするｍＲＮＡが、上記で定義したような、好ましくは同じ本発明の組成物またはワクチンの一部を形成する、別のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と並行して、その前に、またはその後に投与されるような形態における、本明細書で定義されるようなｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子、本発明による（医薬）組成物またはワクチンの投与も含み得る。好ましくは、投与（ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子のすべての投与）は、１時間以内、より好ましくは３０分以内、さらにより好ましくは１５、１０、５、４、３、もしくは２分以内、またはさらには１分以内に行われる。そのような時間をずらした処置は、例えば、キット、好ましくは本明細書で定義されるようなパーツのキットを使用して行われ得る。
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物またはワクチンは繰り返し投与され、各投与は、好ましくは、本発明の組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の個別の投与を含む。投与の各時点で、少なくとも１つのｍＲＮＡは、２回以上（例えば２回または３回）投与され得る。本発明の特に好ましい実施形態では、上記で定義したｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のｍＲＮＡ配列（本明細書で定義されるような抗原のうちの特定の１つを各々がコードするｍＲＮＡ配列）であって、同じまたは異なる脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ化合物の一部であるｍＲＮＡ配列が、各時点で投与され、各ｍＲＮＡは、四肢に分配された注射によって２回投与される。
本発明のイオン化可能脂質の追加の用途
遺伝子編集
本発明は、遺伝子発現の改変、ゲノム操作、及び遺伝性障害における遺伝子の関与のための、核酸、好ましくはＲＮＡ、より好ましくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及び工学操作されたＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベースの組成物を送達するための組成物及び方法も包含する。突然変異の影響を修正するまたは低減させることが有用であることが分かっている。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムは、Ｃａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（このガイドＲＮＡは、システムのＤＮＡターゲティング特異性を提供する）を含み、１つ以上の本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰを使用して送達される。
特に、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのＤＮＡ配列ターゲティング機能を追加の活性と統合することにより、遺伝子発現及び／またはエピジェネティックな状況の改変を可能にするＣａｓ９融合タンパク質を記載する。このシステムはまた、ゲノム操作及び遺伝子突然変異の影響を修正または軽減するために使用され得る。
本開示は、１つ以上の本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰを含む、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベースのシステム及び１つ以上の内因性遺伝子をターゲティングする多種多様なｇＲＮＡを送達するための、ある特定の組成物及び方法も提供する。単一のプロモーターをターゲティングする多種多様なｓｇＲＮＡのコトランスフェクションにより相乗的な活性化が可能になるが、多種多様なプラスミドのコトランスフェクションは、発現レベルをもたらすコピー数の差異によって各細胞で異なり得る。さらに、トランスフェクション後の遺伝子活性化は、プラスミドＤＮＡが経時的に希釈されるため、一過性である。さらに、多くの細胞型は容易にトランスフェクトされず、一過性の遺伝子発現は、治療効果を誘発するのに不十分であり得る。
本発明のイオン化可能脂質を１つ以上含むこのＬＮＰ組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９依存性遺伝子制御の規模及びタイミングの両方をコントロールすることができる。さらに、本発明のイオン化可能脂質を１つ以上含むＬＮＰ組成物は、初代細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの治療的使用を容易にする強力かつ持続的な遺伝子発現レベルをもたらす。最後に、本発明のイオン化可能脂質を１つ以上含むＬＮＰ組成物は、多種多様な遺伝子を同時に編集するために（例えば、幾つかの癌遺伝子を同時にノックアウトするために）使用することができる。
本発明はさらに、細胞における突然変異型遺伝子を修正する方法を対象とする。この方法は、ＤＮＡターゲティングシステムを含む細胞に、単離ポリヌクレオチド及び本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰを投与するステップを含む。突然変異遺伝子の修正は、相同組換え修復を含み得る。この方法は、細胞にドナーＤＮＡを投与するステップをさらに含み得る。突然変異遺伝子は、未成熟終止コドン、及び切断型遺伝子産物をもたらすフレームシフト突然変異を含み得る。突然変異遺伝子の修飾は、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合を含み得る。突然変異遺伝子の修飾は、未成熟終止コドンの欠失、スプライスアクセプター部位の破壊、１つ以上のエキソンの欠失、またはスプライスドナー配列の破壊を含み得る。１つ以上のエキソンの欠失は、リーディングフレームの修正をもたらし得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、突然変異型ジストロフィン遺伝子を保有する、処置を必要とする対象を処置する方法を対象とする。この方法は、ＤＮＡターゲティングシステム、単離ポリヌクレオチド、またはベクターを対象に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、対象動物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している場合がある。
本発明は、細胞における突然変異型ジストロフィン遺伝子を修正する方法を対象とする。この方法は、突然変異型ジストロフィン遺伝子を含む細胞に、ＤＮＡターゲティングシステム、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を投与するステップを含む。突然変異型ジストロフィン遺伝子は、未熟終止コドン、遺伝的欠陥によって破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、または異常なスプライスドナー部位、ターゲット領域が未熟終止コドンである場合は破壊を含み得る。特定のリーディングフレームの上流または下流に位置する、異所性スプライスアクセプター部位または異所性スプライスドナー部位。突然変異型ジストロフィン遺伝子の修飾は、相同組換え修復を含み得る。この方法は、細胞にドナーＤＮＡを投与するステップをさらに含み得る。突然変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、及び切断型遺伝子産物をもたらすフレームシフト突然変異を含み得る。突然変異型ジストロフィン遺伝子の修飾は、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合を含み得る。突然変異型ジストロフィン遺伝子の修飾は、未成熟終止コドンの欠失、破壊されたリーディングフレームの修飾、またはスプライスアクセプター部位の破壊もしくはスプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調節を含み得る。突然変異型ジストロフィン遺伝子の修飾は、エキソン４５～５５またはエキソン５１の欠失を含み得る。
本発明は、融合タンパク質、ＤＮＡターゲティングシステム、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を備えるキットを対象とする。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を調節する方法を対象とする。この方法は、ＤＮＡターゲティングシステムをコードするポリヌクレオチドに細胞を接触させることを含む。ＤＮＡターゲティングシステムは、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰに含まれた融合タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。
ＤＮＡターゲティングシステムは、１～１０個の異なるｇＲＮＡを含み得る。異なるｇＲＮＡは、ターゲット遺伝子内の異なる領域に結合することができる。ターゲット領域は、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されていてもよい。ターゲット領域は、約１５～約７００塩基対によって分離されていてもよい。異なるｇＲＮＡの各々は、少なくとも１つの異なるターゲット遺伝子と結合することができる。異なるターゲット遺伝子は、同じ染色体上に位置していてもよい。異なるターゲット遺伝子は、異なる染色体上に位置していてもよい。少なくとも１つのターゲット領域は、非オープンクロマチン領域、オープンクロマチン領域、ターゲット遺伝子プロモーター領域、ターゲット遺伝子エンハンサー領域、ターゲット遺伝子転写領域、またはターゲット遺伝子の転写開始部位の上流の領域にあってもよい。少なくとも１つのターゲット領域は、ターゲット遺伝子の転写開始部位から約１～約１０００塩基対上流に位置していてもよい。少なくとも１つのターゲット領域は、ターゲット遺伝子の転写開始部位から約１～約６００塩基対上流に位置していてもよい。遺伝子発現は誘導され得る。ＤＮＡターゲティングシステムは、２個の異なるｇＲＮＡ、３個の異なるｇＲＮＡ、４個の異なるｇＲＮＡ、５個の異なるｇＲＮＡ、６個の異なるｇＲＮＡ、７個の異なるｇＲＮＡ、８個の異なるｇＲＮＡ、９個の異なるｇＲＮＡ、または１０個の異なるｇＲＮＡからなる。含まれ得る。少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＮＡＮＯＧ、ＶＥＧＦＡ、ＴＥＲＴ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＮ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２及びＭＹＯＤ１からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域をターゲティングし得る。少なくとも１つのターゲット領域は、ターゲット遺伝子のイントロン内またはエキソン内にあってもよい。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導する組成物を対象とする。この組成物は、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰに含まれた融合タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導する組成物を対象とする。この組成物は、融合タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む。少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＮＡＮＯＧ、ＶＥＧＦＡ、ＴＥＲＴ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＮ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２及びＭＹＯＤ１からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域をターゲティングし得る。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導する上記組成物を含む細胞を対象とする。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導するための組成物、または細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導するための組成物を含む細胞を含むキットを対象とする。
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導するためのキットを対象とする。このキットは、細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導するための組成物、または細胞における哺乳動物遺伝子発現を誘導するための組成物を含む細胞を備える。
タンパク質補充療法
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物及びキットは、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質補充療法のための方法に使用するために調整され得る。いくつかの例では、目的のタンパク質をコードする合成修飾型ＲＮＡが、タンパク質発現が望ましい種々の異なる疾患の処置方法において、ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現のために組織及び／または臓器に送達され得る。いくつかの例では、疾患は、本明細書で開示されるような機能喪失型疾患、例えば、限定されるものではないが、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ならびに、特定のタンパク質のタンパク質発現のレベルが不十分である、及び／または遺伝子発現が非機能的タンパク質をもたらす、他の疾患であり得る。
さらに、本明細書で開示されるようなｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現のために本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰを使用して合成修飾型ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達を行う方法は、全臓器及び全身の病態生理を研究するために使用され得る動物モデルプラットフォームを作成するために使用することができる。いくつかの例では、本明細書で開示される方法は、ヒト患者において臨床使用するための治療薬の試験及び／または開発のための、霊長類及びブタモデルなどの小型及び大型の両方の動物モデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏ系を提供する。
いくつかの例では、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰに含まれた合成修飾型ＲＮＡを使用するｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現のための、本明細書で開示される方法ならびに組成物及びキットは、疾患または障害の発生及び処置のためのものであり得る。いくつかの例では、疾患または障害は、特定のタンパク質の不十分な発現または機能不良型のタンパク質の発現の結果である遺伝性及び／または後天性障害である。いくつかの例では、疾患または障害は、後天性障害、例えば、本明細書で開示される循環器疾患または障害である。
別の例では、本発明のイオン化可能脂質を含むＬＮＰに含まれた合成修飾型ＲＮＡを使用するｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現のための、本明細書で開示される方法ならびに組成物及びキットは、再生医療ストラテジーに使用することもできる。例えば、いくつかの例では、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡを含む組成物は、目的の細胞集団も含み得る。別の言い方をすれば、いくつかの例では、本開示は、少なくとも１つの合成修飾型ＲＮＡと目的の細胞集団との組み合わせを対象に投与することを含む、再生細胞療法のための方法を提供する。いくつかの例では、細胞集団は幹細胞集団であり、いくつかの例では、幹細胞集団は心臓前駆体細胞または心臓前駆細胞の集団である。いくつかの例では、幹細胞は、Ｉｓｌ１＋幹細胞集団であるか、または血管前駆細胞集団である。そのような細胞集団は、当技術分野で周知であり、国際特許出願第ＷＯ／２００８／０５４８１９号、同第ＷＯ２０１０／１４４６７８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８５６号、ならびに米国特許出願第２０１０／０１６６７１４号、ＵＳ２０１１／００３３４３０、ＵＳ２０１０／０２１７１３及びＵＳ２０１１／０００３３２７（これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている細胞集団を含むがこれに限定されない。
細胞プログラミング及び細胞療法
本発明が包含する別の実施形態では、本明細書で開示される発明は、ＧＶＨ毒性を伴わずにヒトの宿主免疫系を刺激するための同種異系細胞療法に関し、それにより、前記同種異系細胞はその後、宿主免疫系によって拒絶される。
本明細書で開示される発明はまた、レシピエントとのＨＬＡマッチに関係なく同種異系細胞が選択される、または意図される患者集団とのＨＬＡハプロタイプの最大のミスマッチを可能にすることによって、最大の同種異系の可能性、及び生成物に対するその後の宿主免疫応答を確実にするような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、同種異系細胞が、以前に同種異系ＢＭＴを受けていない患者に注入された場合、腫瘍に対する効果的な宿主免疫応答を刺激することができるような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、同種異系細胞が、免疫抑制性のコンディショニングレジメンに供されていない患者に注入された場合、腫瘍に対する効果的な宿主免疫応答を刺激することができるような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、同種異系細胞療法が、宿主における炎症性「１型」モノカイン及びリンホカインの産生を刺激することによって患者の免疫応答を刺激するような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、同種異系細胞療法が、宿主の自然免疫及び／またはＴｈ１適応免疫の成分を活性化することによって患者の免疫応答を刺激するような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、同種異系細胞療法が、腫瘍の免疫原性を増強するサイトカインの産生を刺激するような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、腫瘍関連抗原が宿主の１型適応免疫を刺激するために利用可能となるように、同種異系細胞が腫瘍を直接殺傷するような、上述の生成物に関する。
本明細書で開示される発明はまた、生成物に含まれる同種異系Ｔ細胞が、増強された活性化の状態にあるような、上述の生成物を生成する方法に関する。
本明細書で開示される発明はまた、無関係のドナーから単核細胞を収集し、単核細胞集団内のＴ細胞を活性化し、常在疾患に対する効果的な免疫応答を媒介するように宿主免疫系を刺激しながら、活性化されたＴ細胞が宿主免疫系によって拒絶されるような宿主免疫系を有する宿主に、活性化されたＴ細胞を投与することにより、宿主免疫系を刺激する方法に関する。宿主は、血液学的悪性腫瘍、固形腫瘍、転移した固形腫瘍、またはウイルス感染症などの常在疾患を有し得る。ドナーは、宿主との組織適合性に関係なく選択され、最大の組織適合性ミスマッチが好ましい。宿主はまた、好ましくは、以前に骨髄移植を受けていないべきであり、好ましくは、同種異系ドナー細胞注入物の生着を可能にするように設計された、いかなる免疫抑制性の化学療法及び／または放射線コンディショニングレジメンも受けていないべきである。
この方法はさらに、Ｔ細胞が好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大半がｅｘ－ｖｉｖｏ活性化後にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉナイーブ細胞からＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏ記憶細胞に分化することを含み、かかる細胞は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファなどの１型サイトカインを産生し、ＩＬ－４、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－ベータなどの２型サイトカインを産生しない。
本明細書で開示される発明はまた、ｅｘ－ｖｉｖｏ活性化後にＣＤ４０Ｌ及び／またはＴＲＡＩＬを細胞表面上に発現するようなＣＤ４＋Ｔ細胞も含む。好ましくは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の細胞表面に適用された抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂの架橋によって活性化される。好ましくは、前記Ｔ細胞の表面に適用された抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂは、前記ｍＡｂに対して反応性のある薬剤で被覆された生分解性ミクロスフェアとの会合によって架橋される。
本明細書で開示される発明には、Ｔ細胞の９０％超が宿主免疫系との接触の直前及び接触時に活性化状態にある場合も含まれ、好ましい実施形態では、Ｔ細胞の９５％超が宿主への投与時及び宿主との接触の直前に活性化されている。
この方法には、Ｔ細胞が宿主への注入前の少なくとも６日間にわたって活性化刺激に絶えず曝露されている場合も含まれる。Ｔ細胞は、好ましくは、細胞間の接触を最大化するために少なくとも１０７細胞／ｍｌの細胞密度で維持されている間に活性化される。そのような細胞間の接触は、同種異系Ｔ細胞の活性化の状態を増強する機能を果たす。
別の実施形態では、この方法には、Ｔ細胞が、同種異系Ｔ細胞の表面に適用された抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂと共に投与され、ｍＡｂが、ｍＡｂに対して反応性のある薬剤で被覆された生分解性ミクロスフェアとの会合及びその封入によって架橋される場合が含まれる。
この方法には、Ｔ細胞の投与が１型サイトカインの産生を刺激し、かかるサイトカインが、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、及びＴＮＦ－ベータのうちの少なくとも１つを含む場合も含まれる。そのようなサイトカインは、宿主の自然免疫機能を含む免疫を刺激する。この方法には、活性化されたＴ細胞の投与が、宿主の樹状細胞及び／またはマクロファージ細胞を活性化する場合も含まれる。
本発明には、活性化された同種異系Ｔ細胞の投与、及び活性化されたＴ細胞のその後の拒絶が、宿主の常在疾患に対する免疫応答を刺激する場合も含まれる。
本発明は、ｅｘ－ｖｉｖｏで活性化された同種異系Ｔ細胞が製剤及び宿主への投与前に凍結保存される方法も含む。
本発明は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂに対して反応性のある薬剤で被覆された生分解性ミクロスフェアで架橋された前記ｍＡｂで標識された同種異系Ｔ細胞の組成物も含む。標識された同種異系Ｔ細胞及び会合した生分解性ミクロスフェアは、静脈内注入に好適な媒体に懸濁されている。そのようなＴ細胞及び会合した生分解性ミクロスフェアは、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、好ましくは可撓性容器またはシリンジ内に懸濁されている。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で標識されたＴ細胞も、製剤及び投与前に凍結保存され得る。
本発明には、有毒な移植片対宿主（ＧＶＨ）応答を誘発することなく、腫瘍保有宿主の免疫系と接触すると、宿主対腫瘍（ＨＶＴ）及び宿主対移植片（ＨＶＧ）応答を誘発する、同種異系細胞物質も含まれる。同種異系細胞物質は、ｅｘ－ｖｉｖｏで活性化されたＴ細胞を含み、前記活性化されたＴ細胞は、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
本発明には、腫瘍保有宿主に投与すると腫瘍のアポトーシスを引き起こす同種異系細胞物質も含まれる。同種異系細胞物質は、活性化された同種異系Ｔ細胞を含み、かかるＴ細胞は、好ましくはＣＤ４＋細胞である。そのようなＣＤ４＋細胞は、ＦａｓＬ及び／またはＴＲＡＩＬを細胞表面上に、好ましくは高い密度で発現するべきである。そのような活性化されたＴ細胞は、好ましくは、ｅｘ－ｖｉｖｏ活性化後にＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６３Ｌｌｏを発現する記憶細胞に分化する。そのような同種異系Ｔ細胞は、次のサイトカイン：ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－ガンマ、及びＴＮＦ－アルファのうちの１つ以上を発現し、宿主に投与すると表面ＦａｓＬ及び／またはＴＲＡＩＬを発現するべきである。
本発明には、少なくとも一部がＴ細胞である同種異系細胞の集団を処置有効量で含む組成物も含まれ、前記Ｔ細胞は、活性化有効量の１つ以上のモノクローナル抗体またはその一部、及び架橋有効量のモノクローナル抗体反応性薬剤で標識されている。かかる組成物のＴ細胞は、好ましくは、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂで標識されている。ｍＡｂに対して反応性のある薬剤は、好ましくは、生分解性ミクロスフェア上に被覆されている。同種異系Ｔ細胞及び会合した生分解性ミクロスフェアは、静脈内注入に好適な媒体に懸濁されている。そのような標識されたＴ細胞及び会合した架橋生分解性ミクロスフェアは、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、可撓性容器またはシリンジ内に懸濁されている。組成物は、注入前に凍結保存されてもよい。
好ましい実施形態では、本発明で使用される同種異系細胞は、ｅｘ－ｖｉｖｏで活性化された、精製されたＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞、より好ましくは、エフェクター細胞または記憶細胞に分化し、高レベルの１型サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファを産生し、また、好ましくは高い密度で、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬなどのエフェクター分子を細胞表面に発現する、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
別の好ましい実施形態では、注入用の同種異系Ｔ細胞は、細胞をＴ細胞活性化剤と絶えず接触させて高い細胞密度（１０７細胞／ｍｌ以上）で維持する方法によってｅｘ－ｖｉｖｏで処理される。
別の好ましい実施形態では、注入用の同種異系Ｔ細胞は、採取から注入までＴ細胞の活性化状態を維持するための手段として活性化剤を含む、注入に好適な媒体中で製剤される。
別の好ましい実施形態では、注入された同種異系Ｔ細胞の９０％超、または好ましくは９５％超が、患者への注入時に、依然として増強された活性化の状態にある。
ＶＩ． 本発明の実施例
実施例１：新規のイオン化可能脂質は、２００ｎｇ／ウェルのＩｎ Ｖｉｔｒｏ用量で高い送達効率を有する（ＴＲＡＮＳ－１４研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とし（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）、段階希釈で２７．７４ｍＭにした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、１ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ５０～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図７に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図８に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用（Ｇｅｎｅｒａｌ－Ｐｕｒｐｏｓｅ）モデルを使用して分析した。結果を図９に示す。
Ｄ：Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生死判定試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクト細胞を、温めておいたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と共に、１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）。結果を図１０に示す。
実施例２：例示的なイオン化可能脂質は、２００ｎｇ／ウェルのＩｎ Ｖｉｔｒｏ用量で高い送達効率を有する（ＴＲＡＮＳ－１６研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とし（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）、段階希釈で２７．７４ｍＭにした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、１ｍｇ／ｍＬの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ５０～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図１１に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図１２に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図１３に示す。
実施例３：例示的なイオン化可能脂質は、２００ｎｇ／ウェルのＩｎ Ｖｉｔｒｏ用量で高い送達効率を有する（ＴＲＡＮＳ－１８研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図１４に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図１５に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図１６に示す。
Ｄ：Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ生死判定試薬に基づく毒性アッセイ。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクト細胞を、温めておいたＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ ＨＳ試薬（１０％ｖ／ｖ）と共に、１５分間３７℃でインキュベートする。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ５４０／Ｅｍ５９０）。結果を図１７に示す。
実施例４：例示的なイオン化可能脂質は、１００～２００ｎｇ／ウェルのＩｎ Ｖｉｔｒｏ用量で高い送達効率を有する（ＴＲＡＮＳ－２２研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ５０～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図１８に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図１９に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図２０に示す。
実施例５：例示的なイオン化可能脂質は、１００～２００ｎｇ／ウェルのＩｎ Ｖｉｔｒｏ用量及び２．５μｇのＩｎ Ｖｉｖｏ用量で高い送達効率を有する（ＩｎＶｉｖｏ－１研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。２４μｌの脂質ミックス及び４８μｌのｍＲＮＡ溶液を設定５で混合し、７２μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに１４４μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ５０～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。第１世代ＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、先行技術のＬＮＰに使用されている標準参照脂質であるＭＣ３と同様の効率を有していた。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図２１に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図２２に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図２３に示す。
Ｄ：注射４時間後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＲＮＡ ＦｌｕｃのＩｎ ｖｉｖｏ翻訳。透析したＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰ及びＭＣ３ ＬＮＰを、血管内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）の３つの投与経路を介して注射した。２．５μｇのＦｌｕｃ ｍＲＮＡ含有ＬＮＰを含む５０μＬ総量を注射した（ＭＣ３ ＩＤについては２×２５μＬｌ）。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２／Ｃ２－ＰｉｐＺ ＬＮＰは、注射４時間後の発現をＩＭ注射部位に局在化させ、輝度の関心領域（ＲＯＩ）分析によると、ＭＣ３のレベルの約５０％でルシフェラーゼを発現する。筋肉に局在化したＤＬ－ＡＤＤＥの発現とは異なり、ＭＣ３及び他の公開されている脂質は、ＩＭ注射の４時間後の肝臓における発現の急速な拡散をもたらす。ＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰのＩＭ局在発現は、生理学的ｐＨでＭＣ３及び他の公開されているＬＮＰが負電荷をもつのに対してわずかな正電荷をもつことに起因すると考えられ、免疫原性を増加させ、反応原性を低減させると共に全身の有害事象を低減させ得る。注目すべきことに、ＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰは、ＩＶ注射した場合にも肝臓で発現しない。以下の２種のＬＮＰ（ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２／Ｃ２－ＰＹＲ、ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２／Ｃ２－ＰＩＰＺ）は、以下の実施例９でさらに示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を発現するｍＲＮＡを使用した免疫原性試験に進めるためのｇｏ／ｎｏ－ｇｏ基準を満たした。結果を図２４に示す。
実施例６：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでは、例示的なＤＬ－ＡＤＤＥイオン化可能脂質は１００～２００ｎｇ／ウェルの用量で高い送達効率を有し、ＢＯＤ－ＡＤＤＥイオン化可能脂質は２５～２００ｎｇで効力がある（ＴＲＡＮＳ－３０研究）
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とし（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）、段階希釈で２７．７４ｍＭにした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ２５～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図２５に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図２６に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図２７に示す。
実施例７：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでは、例示的なＤＬ－ＡＤＤＥイオン化可能脂質は１００～２００ｎｇ／ウェルの用量で高い送達効率を有し、ＢＯＤ－ＡＤＤＥイオン化可能脂質は２５～２００ｎｇで効力がある（ＴＲＡＮＳ－３１研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とし（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）、段階希釈で２７．７４ｍＭにした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．５６ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ２５～２００ｎｇ用量で１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。第１世代ＤＬ－ＡＤＤＥ ＬＮＰは、ｍＲＮＡ ＬＮＰの文献で使用されている標準参照脂質であるＭＣ３及びＫＣ２と同様の効率を有していた。
Ａ：ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図２８に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図２９に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図３０に示す。
実施例８：高速マイクロ流体混合のための５０ｍＭの新規のイオン化可能脂質及び１ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡは、明確なコロイドのイオン化特性（ＬＮＰ－１９研究）、高いｉｎ ｖｉｔｒｏ送達効率（Ｔｒａｎｓ ３１研究）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原の送達時の高い免疫原性（Ｉｎ Ｖｉｖｏ ２研究）を示す。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）、及び２０１９－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ Ｓ－２Ｐ（Ｃｏｖｉｄ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、≧３ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。ＡＤＤＥ脂質をＫＣ２及びＭＣ３のような標準脂質と比較した。図３１～３３。
例示的なＡＤＤＥイオン化可能脂質。イオン化可能脂質についてはＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａから、イオン化可能脂質を含むＬＮＰについてはゼータ電位及びＴＮＳによって、ｐＫａを得た。ＬＮＰの等電点ｐＩはゼータ電位から得た。ＬＮＰの直径はＤＬＳからの数平均である。ＬＮＰ当たりの平均ｍＲＮＡコピーは、分子容モデル及びＤＬＳ直径を使用して計算され、ＬＮＰ体積に比例する。
Figure 2023546908000129
Ａ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図３４に示す。
Ｂ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図３５に示す。
Ｃ：ＬＮＰの電荷、ｐＫａ及びｐＩのためのゼータ電位。７５ｍＭのＴＮＳバッファー（各々１０ｍＭのグリシルグリシン、酢酸、イミダゾール、２０ｍＭのホウ酸、２５ｍＭのＮａＣｌ）にＬＮＰを希釈して、８００ｕｌのＴＮＳバッファーに０．８ｍｇの総ｍＲＮＡを含むようにし、これをＦｏｌｄｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｅｔａ Ｃｅｌｌ（ＤＴＳ１０７０）に移し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）において、動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを、電気泳動光散乱（ＥＬＳ）によって電気泳動移動度を測定した。ゼータ電位は、ｐＨ範囲３～１０にかけて０．５の間隔で分散したｐＫａをもつ４種のバッファーを含む溶液中、オーム加熱を制限するようにコントロールされた電圧の条件下で測定される。ＬＮＰのｐＫａは、ゼータ電位データにＨｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式を当てはめることによって計算される。ＬＮＰのｐＩは、ゼータ電位をゼロに補間することによって求められる。ヘンリー関数及びＬＮＰの電荷を計算するためには、動電学的モデルを使用する。結果を図３６に示す。
Ｄ：ＬＮＰ ｐＫａのためのＴＮＳアッセイ。ＴＮＳ／イオン化可能の比を０．０８に保つため、７５ｍＭのＴＮＳバッファー（各々１０ｍＭのグリシルグリシン、酢酸、イミダゾール、２０ｍＭのホウ酸、２５ｍＭのＮａＣｌ）中で７５ｕＭのイオン化可能脂質及び６ｕＭのＴＮＳの最終濃度を保つように、ＬＮＰを希釈した。蛍光ＴＮＳは、ｐＨ範囲３～１０にかけて０．５の間隔で分散したｐＫａをもつ４種のバッファーを含む溶液中で測定される。ＬＮＰのｐＫａは、低いｐＨで強度が高く、高いｐＨで強度が低い、アニオン性色素ＴＮＳの蛍光増強のｐＨ依存性を使用して測定した。ＬＮＰのｐＫａは、ＴＮＳアッセイからの蛍光データにＨｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式を当てはめることによって計算される。結果を図３７に示す。
実施例９：例示的なイオン化可能脂質は、Ｉｎ Ｖｉｖｏで高い送達効率を有する（ＩｎＶｉｖｏ－４研究）。
概要：イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２５／５／１９．２５／０．７５ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、４ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。２４μｌの脂質ミックス及び４８μｌのｍＲＮＡ溶液を設定５で混合し、７２μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに１４４μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。筋肉内投与で５０ｕｌ中５ｕｇの封入ｍＲＮＡを注射するためにＬＮＰを濃縮した。
Ａ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図３８に示す。
Ｂ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図３９に示す。
Ｃ：ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。５ｕｇの封入ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間及び２４時間における生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。結果を図４０Ａ～４０Ｈに示す。
Ｄ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的結合抗体力価。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、第０週及び第３週に、３つの異なるＬＮＰ、ＭＣ３／ＤＬ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ２－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ／ＢＯＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺ中で０．１μｇ及び１μｇ用量のＳ－２Ｐ ｍＲＮＡコード免疫原で免疫した。血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的ＩｇＧを、プライムの３週間後及びブーストの５週間後にＥＬＩＳＡによって評価した。ＭＣ３及びＢＯＤ－ＡＤＤＥ－Ｃ２Ｃ４－４Ｍｅ－ＰｉｐＺについてはプライム後に用量依存的で高い結合抗体力価が見られた。これらの若齢動物では、ブースト後にすべてのＬＮＰで高い力価が見られた。
実施例１０：モル比の調整によるｉｎ ＶｉｔｒｏのＬＮＰ送達効率のさらなる最適化。（ＴＲＡＮＳ－３６）
概要：イオン化可能ＢＯＤＤ－Ｃ２Ｃ４－ＰｉｐＺ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～７０：８～１４：２９～４９：１～２ｍｏｌ％）からなる５０～５２ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０～５２ｍＭの総脂質濃度を達成した。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、４．６ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図４１に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図４２に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図４３に示す。
実施例１１：高速マイクロ流体混合のための５０ｍＭの総脂質濃度及び１ｍｇ／ｍｌからのｍＲＮＡで混合したイオン化可能脂質のスクリーニングは、ｉｎ ＶｉｔｒｏのＬＮＰ送達効率を上昇させる（ＴＲＡＮＳ－４０）
概要：幾つかのイオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる５０ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて５０ｍＭの総脂質濃度とした（それぞれ２４／６．５／１８．５／１ｍＭ）。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図４４に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図４５に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図４６に示す。
実施例１２：４Ｃ及び室温の液体形式における例示的なイオン化可能脂質製剤の安定性（ＴＲＡＮＳ－４２）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）からなる約７５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７５ｍＭの総脂質濃度とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ホタルルシフェラーゼアッセイを使用したｉｎｖｉｔｒｏ効力に基づく安定性アッセイ。細胞を０日目、２日目、４日目、７日目、１４日目、及び２８日目にトランスフェクトした。各日についてホタルアッセイを行い、記録した。結果を図４７に示す。
Ｂ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（ＤＬＳ）及びＬＮＰ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。ＬＮＰを０日目、２日目、４日目、７日目、１４日目、及び２８日目にアッセイし、記録した。結果を図４８に示す。
実施例１３：高速マイクロ流体混合のための０．２５ｍｇ／ｍｌの低混合濃度及び１．５ｍｇ／ｍｌの高混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高い送達効率及び効力を示す（ＴＲＡＮＳ－４３）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる１２．５～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７５ｍＭの総脂質濃度とし、次いで段階希釈を行って１２．５ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部（配列番号４）を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２５～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図４９に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図５０に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図５１に示す。
実施例１４：Ｍｏｄｅｒｎａバッファーは、ＰＢＳよりも良好にイオン化可能脂質製剤を凍結させるのに役立ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同じ送達効率及び効力を示す（ＴＲＡＮＳ－４５）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（５０～４７：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）からなる１２．３３～７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度とし、次いで段階希釈を行って１２．３３ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、６．３ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２５～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。ＬＮＰを分割し、半分をＭｏｄｅｒｎａ凍結バッファー（８７ｍｇ／ｍＬ（２５４ｍＭ）のスクロース及び１０．７ｍＭの酢酸ナトリウムを含むｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー）（Ｍｏｄｅｒｎａプロトコールの４７頁）で６時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるように各セットのＬＮＰ（新鮮ＰＢＳ、新鮮Ｍｏｄｅｒｎａ、凍結ＰＢＳ、凍結Ｍｏｄｅｒｎａ）を希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図５２に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図５３に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図５４に示す。
実施例１５：高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺは、ｉｎ ｖｉｖｏで、標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び効力を示す（ＩｎＶｉｖｏ－７）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）からなる１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７５ｍＭの総脂質濃度とし、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図５５に示す。
Ｂ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図５６に示す。
Ｃ：ＩＭ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。０．５～５ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間及び２４時間における生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。結果を図５７Ａ～５７Ｉに示す。
実施例１６：１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺは、ｉｎ ｖｉｖｏでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原を送達する際、標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおける参照脂質ＭＣ３に対して高い送達効率及び免疫原性効力を示す（ＩｎＶｉｖｏ－８）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）からなる１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７５ｍＭの総脂質濃度とし、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化された２０１９－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ Ｓ－２Ｐ（Ｃｏｖｉｄ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性エンドポイントＥＬＩＳＡ抗ＲＢＤ力価。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ブースト前及びブースト後（３週間後）を以下に示す。結果を図５８Ａ～５８Ｂに示す。
Ｂ：偽中和アッセイのＩｎ ｖｉｖｏ免疫原性ＦＲＮＴ５０力価。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。ブースト前及びブースト後（３週間後）を以下に示す。結果を図５９に示す。
実施例１７：高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤ＢＯＤＤ Ｃ２Ｃ４ ＰｉｐＺを使用したマウスチャレンジは、ｉｎ ｖｉｖｏでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原を送達する際、標準的な混合濃度０．２ｍｇ／ｍｌにおいて０．５ｕｇで１００％の保護をもたらす標準的脂質ＭＣ３と比べて、０．２５ｕｇ用量で１００％の保護をもたらす高い送達効率及び免疫原性効力を示す（ＩｎＶｉｖｏ－９）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７～５０：１０～１３：３７～３８．５：１．５～２ｍｏｌ％）からなる１０～７５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７５ｍＭの総脂質濃度とし、次いで段階希釈を行って１０ｍＭに到達させた。コドン最適化された２０１９－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ Ｓ－２Ｐ（Ｃｏｖｉｄ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５～２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ウイルスチャレンジからのＩｎ ｖｉｖｏ保護－チャレンジモデルにおける生存割合、体重及び体温。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、ブースト前及びブースト後（５週間後）に筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。使用したチャレンジは５×１０４ＰＦＵのイタリア株であった。結果を図６０Ａ～６０Ｂに示す。
Ｂ：チャレンジモデルにおけるＩｎ ｖｉｖｏ体重及び体温。０．１、０．２５、０．５、１ｕｇの総ｍＲＮＡを、ブースト前及びブースト後（５週間後）に筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。使用したチャレンジは５×１０４ＰＦＵのイタリア株であった。結果を図６１Ａ～６１Ｄに示す。
実施例１８：高速マイクロ流体混合のための１．５ｍｇ／ｍｌの高ｍＲＮＡ混合濃度における例示的なイオン化可能脂質製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで標準的脂質ＭＣ３よりも高い送達効率及び効力を示す（ＩｎＶｉｖｏ－１０）
概要：幾つかのイオン化可能／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図６２に示す。
Ｂ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図６３に示す。
Ｃ：ＩＭ及びＩＶ投与におけるＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射及び静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間及び２４時間におけるルシフェラーゼ発現を生動物イメージングによってモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。結果を図６４Ａ～６４Ｊに示す。
実施例１９：高速マイクロ流体混合において、脂質の濃度を１０．２ｍＭから７７ｍＭに上昇させ、ｍＲＮＡの濃度を０．２ｍｇ／ｍｌから１．５ｍｇ／ｍｌに上昇させると、ｉｎ ＶｉｔｒｏのＬＮＰ送達効率が上昇する。（ＴＲＡＮＳ－４９）
概要：幾つかのイオン化可能脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる１０．２～７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度を得て、次いで段階希釈を行って１０．２ｍＭに到達させた。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．２～１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図６５及び図６６に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図６７に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図６８に示す。
実施例２０：高速マイクロ流体混合において、脂質の濃度を７７ｍＭに上昇させ、ｍＲＮＡの濃度を１．５ｍｇ／ｍｌに上昇させることは、ｉｎ ＶｉｔｒｏでＬＮＰ送達効率を示す。（ＴＲＡＮＳ－５２）
概要：幾つかのイオン化可能脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度を得た。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図６９に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図７０に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．０２ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃の１×ＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図７１に示す。
実施例２１：高速マイクロ流体混合のための脂質の総濃度約２５ｍＭ及びｍＲＮＡ ０．５ｍｇ／ｍｌでアセンブルされた例示的な脂質は、ｉｎ ＶｉｔｒｏでＬＮＰ送達効率を示す。（ＴＲＡＮＳ－５９）
概要：幾つかのイオン化可能脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる約２５ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、脂質の各々をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて約２５ｍＭの総脂質濃度とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において０．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して４×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ． ｍＲＮＡ送達効率のためのホタルルシフェラーゼアッセイ。２４時間のトランスフェクション後、ホタルルシフェラーゼアッセイの前に、トランスフェクト細胞を室温に３０分間馴化させた。Ｑｕａｎｔｉｌｕｍ組換えルシフェラーゼの標準曲線を１０％ＥＭＥＭ中の５倍段階希釈で作成した。３．９×１０－５ｍｇ／ｍｌから４．８８×１０－３ｍｇ／ｍｌの範囲からの各標準点の５０ｕｌをマイクロプレートに酵素活性の陽性対照として含め（データは示していない）、１０７ＲＬＵ／ｍｇ／ｍｌの線形性を維持した。予め室温に少なくとも４時間馴化させたＯＮＥ－Ｇｌｏ基質を、トランスフェクトしていないウェル、トランスフェクトしたウェル、及びＱｕａｎｔｉｌｕｍウェルの各々に１：１の比で加えた。アッセイプレートを３分間暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、発光を読み取った。結果を図７２に示す。
Ｂ：ｍＲＮＡ封入効率のためのＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ。１×ＴＥバッファー及びＴｒｉｔｏｎバッファー（１×ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖ）をＬＮＰごとに二連で黒色マイクロプレートに加えた。ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、各ＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及び１×ＴＥバッファーを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎバッファーを含む、２つの標準曲線を含めた。これらの標準曲線の各々を使用して、ＴＥバッファーまたはＴｒｉｔｏｎバッファーの各々におけるｍＲＮＡ濃度を計算した。２つの標準曲線を使用するこの手法は、単一の標準曲線と比較すると、封入効率及びｍＲＮＡ濃度を計算する精度が高い。標準物質は、希釈したＬＮＰをプレートに加えた後にマイクロプレートに含めた。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。結果を図７３に示す。
Ｃ：ＬＮＰサイズのための動的光散乱（赤い点は右のｙ軸のＰＤＩである）。透析したＬＮＰをスクロースバッファーｐＨ７．５で６．２５ｎｇ／ｕｌに希釈し、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、１．１ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃のスクロース中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５の定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。結果を図７４に示す。
実施例２２：高速マイクロ流体混合のための総脂質濃度７７ｍＭ及びｍＲＮＡ濃度１．５ｍｇ／ｍｌでのＬＮＰのアセンブリは、ｉｎ ＶｉｖｏでＬＮＰ送達効率を示す。（ＩｎＶｉｖｏ－１１）
概要：幾つかのイオン化可能脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、デュアル脂質ストック（イオン化可能／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰを１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して６×１時間透析した。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ＩＭ投与における注射部位のＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間における注射部位の生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。結果を図７５及び図７６に示す。
Ｂ：ＩＭ投与におけるＥｘ Ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間における生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。Ｅｘ Ｖｉｖｏでは、臓器を抽出し、Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージング直後にイメージングした。結果を図７７及び図７８に示す。
実施例２３：高速マイクロ流体混合のための総脂質濃度７７ｍＭ及びｍＲＮＡ濃度１．５ｍｇ／ｍｌでのＬＮＰのアセンブリは、ｉｎ ＶｉｖｏでＬＮＰ送達効率を示す。（ＩｎＶｉｖｏ－１３）
概要：幾つかのイオン化可能脂質及びＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（４７：１３：３７：２ｍｏｌ％）からなる７７ｍＭの総脂質濃度を使用して、ＬＮＰを製剤した。透明な溶液が観察されるまで、デュアル脂質ストック（イオン化可能／コレステロール、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧ）をエタノールに可溶化した。４種の脂質を合わせて７７ｍＭの総脂質濃度とした。コドン最適化されたホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）配列を、同時転写キャッピングのためにｍＲＮＡプラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、セルロース精製にかけてｄｓＲＮＡを除去した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達させた。ＮＰ比を４で一定に保ちながら、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡストックを高濃度の溶液から低濃度への段階希釈で希釈して、１５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４において１．５ｍｇ／ｍｌに到達させた後、マイクロ流体混合技術を使用して製剤中の高い再現性を可能にするＳｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で混合した。１６μｌの脂質ミックス及び３２μｌのｍＲＮＡ溶液を設定３で混合し、４８μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。次いで、形成されたＬＮＰＳをさらに９６μｌの１×ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した。次いで、ＬＮＰをスクロースバッファーｐＨ７．５に対して６×１時間透析した。凍結したＬＮＰをＩｎ Ｖｉｖｏ注射のために－８０℃に保った。次いで、３２ｕｌに２５～２００ｎｇが含まれるようにＬＮＰを希釈し、同じ用量だがマイクロ流体ミキサーにおいて異なる濃度で製造したもので１２０００個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
Ａ：ＩＭ投与における注射部位のＩｎ ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間における生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。結果を図７９及び図８０に示す。
Ｂ：ＩＭ投与におけるＥｘ Ｖｉｖｏホタルルシフェラーゼ発現。１ｕｇの総ｍＲＮＡを筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射でマウスに注射した。注射４時間後にルシフェリンを腹腔内投与し、４時間における生動物イメージングによってルシフェラーゼ発現をモニターした。ＩＶＩＳシステムを使用してＲＯＩを計算した。Ｅｘ Ｖｉｖｏでは、臓器を抽出し、Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージング直後にイメージングした。結果を図８１、図８２、及び図８３に示す。
実施例２４：Ｃ２４イオン化可能脂質の三価頭部基は、エンドソームｐＨ範囲内のプロトン化を強化する分子及びＬＮＰイオン化特性を示す
我々のイオン化可能脂質設計空間の最初のスクリーニングには、５０，０００を超える潜在的なイオン化可能脂質候補のために組み合わされる、１００個を超える頭部基、１０個のリンカー、及び５０個のアルキル尾部が含まれた。我々は、この設計空間をサンプリングした約５００個の候補の水相ｐＫａを計算し、幾つかの頭部基を選択して、現在のＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンにおけるイオン化可能脂質のための５つを超える反応及び７つの触媒に対して２つの反応及び１つの触媒のみを用いる合成手順を使用する、アクリレートを有するアルキル尾部を用いる合成を行った。反応スキームの単純性により、コストを推定１０分の１に削減して世界的なワクチン接種キャンペーンを促進し得る、精製ステップの大幅な削減、合成時間の大幅な短縮、及び８０％超の収率がもたらされた。３０を超える候補イオン化可能脂質をまず合成し、物理化学的に、かつある特定の生物学的性能の指標について解析した結果、本研究においてさらに調査するためにＣ２４（図８４ａ）が選択された。Ｃ２４は三価の４－メチル－１－ピペラジンブタンアミン頭部基を有し、理論上の水相ｐＫａは４～８の範囲であり、そのうちの２つは予測値が近かった（７．７及び７．８）。我々は水溶性アナログ（Ｃ２４－ＷＳＡ）を合成し、確立されている１Ｈ ＮＭＲ法２０を使用して各窒素のｐＫａを測定して、理論上のｐＫａが０．４単位以内であることを確認した（図８４ｂ）。理想的なＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ挙動からわずかに伸展した逸脱が、ほぼ同時にプロトン化するわずかに低いｐＫａ（図８４ｂ中の７．５）を有する窒素原子との相互作用と一致して、末端窒素（ｐＫａ ８．１、図８４ｂ中の赤）について観察された。この観察は、これら２つの部位間のプロトン配位、及び初期プロトン化段階中の配位結合の形成の可能性も示す。水溶性ＭＣ３アナログのＮＭＲ分析は、９．４の予測値（図８４ａ）とよく似た９．５のｐＫａ（図８４ｃ）を示した。我々が最近記述したような、表面電荷を測定するＴＮＳ色素結合アッセイと、ＬＮＰの正味電荷を測定する電気泳動移動度によるゼータ電位とを使用して、Ｃ２４及びＭＣ３を用いて作製したＬＮＰのプロトン化を評価した。ＴＮＳ色素結合アッセイは、Ｃ２４のｐＫａ（６．７７）がＭＣ３（６．５５）よりも高く、ｐＨが７．４から６に低下する際の表面プロトン化の増大がより大きいことを示し（図８４ｆ中の４５１７対２５５９のＲＦＵ）、Ｃ２４のエンドソームｐＨ範囲内の表面プロトン化がＭＣ３に対して大きいことを示している。ＴＮＳ色素結合アッセイにおいて、エンドソームプロトン化を計算する際のｐＨの下限は６とした。これは、このｐＨ未満では表面電荷に変化がないためである。電気泳動移動度の測定は、ＴＮＳ色素結合アッセイとは異なり、ＬＮＰの正味電荷を測定し、ｐＨ３まで上昇するゼータ電位に反映されるＬＮＰ正味電荷のより広範な変化を示す（図８４ｅ）。ＭＣ３は、ＬＮＰ内で近接している数千のジメチルアミンＭＣ３頭部基のような密接に相互作用するイオン化可能部位のイオン化状態依存性ｐＫａを説明するため、本来は高分子電解質３４のために提唱された拡張型Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈモデルに酷似した挙動を示した。拡張型Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ分析は、ＭＣ３ ＬＮＰの５．３３のゼータ電位ｐＫａ及び５．５７のｐＩを示した（図８４ｆ）。Ｃ２４ ＬＮＰのイオン化挙動はさらに複雑であり、８．１及び７．５の水相ｐＫａ（図８４ｂ）では、頭部基における３つの窒素のうちの２つの同時プロトン化に対応するｐＨ７．４からｐＨ６にかけて急速に上昇するゼータ電位が起こり、それ未満では、３．７のｐＫａで中央の窒素の寄与と共にゼータ電位が上昇し続けた（図８４ｂ）。Ｃ２４のこのマルチプロトン性イオン化挙動は、５．２１のゼータ電位ｐＫａ及び６．１２のｐＩ（図８４ｆ）をもたらした拡張型Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈモデル（図８４ｅの赤い実線に対する破線）によって良好に表現されなかった。エンドソームがリソソームと融合すると考えられるｐＨ７．４からｐＨ４．５にかけてのゼータ電位上昇の計算は、Ｃ２４ ＬＮＰのほうがＭＣ３ ＬＮＰよりも高く（図８４ｆ中の２５．１ｍＶ対１４．３ｍＶ）、これはやはり、エンドソームｐＨ範囲内のＣ２４のプロトン化レベルがＭＣ３に対して高いことを示している。まとめると、上記の分析は、モノプロトン性対マルチプロトン性の頭部基における分子プロトン化事象を、凝縮されたＬＮＰ環境におけるそれらのプロトン化と関連付け、エンドソームｐＨ範囲内のＣ２４ ＬＮＰのプロトン化におけるＭＣ３に対しておよそ２倍の増大を示している。
サイズの解析が示すところによれば、Ｃ２４ ＬＮＰはＭＣ３よりわずかに大きく（図８５ａの直径８０ｎｍ対６４ｎｍ）、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ色素結合のために接近不可能なｍＲＮＡの割合がわずかに低い（図８５ｂの６８％対７９％）。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎが接近不可能なｍＲＮＡの割合は、しばしば封入効率と呼ばれるが、接近可能な部分は、ゲルベースのアッセイで移動しない場合があるため、ｍＲＮＡの遊離画分ではないことが現在知られている。我々は、我々が最近公開したＬＮＰの分子容モデルを使用して、各ＬＮＰ中のｍＲＮＡをコードするホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）のコピー数を推定し、ＭＣ３ ＬＮＰでは４．５コピー、Ｃ２４ ＬＮＰではサイズが大きいため平均して６であることを見出した（図２ｃ）。ＣｙｒｏＴＥＭ分析は、ＤＬＳ測定と一致したＣ２４ ＬＮＰのより大きなサイズを示し、両ＬＮＰが、周辺二重層と、内部の高電子密度不定形コアとを示す、同様の構造を有していた（図８５ｄ、ｅ）。
実施例２５：筋肉内注射時のＣ２４ ＬＮＰのルシフェラーゼ発現はＭＣ３ ＬＮＰの４倍高く、肝臓内でＭＣ３の６分の１のオフターゲット発現を示す
５μｇのｍＲＮＡという比較的高い用量でマウスにＬＮＰを筋肉内（ＩＭ）投与した後のｍＲＮＡ ＦＬｕｃをコードするレポーターのＩｎ ｖｉｖｏ 発現は、４時間及び２４時間の注射部位において２倍高いＣ２４の発現を示した（図８６ａ及び８６ｂ）。全身体内分布及び肝臓におけるオフターゲット発現は、ＭＣ３で高かった（図８６）。これに対し、この高用量におけるＣ２４は、全身体内分布を事実上消失させ、肝臓におけるオフターゲット発現はＭＣ３と比較して６分の１に低減した（図８６Ｃ）。ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンに関連する全身の反応原性及び有害事象は、全身体内分布ならびに注射部位及び流入領域リンパ節以外の部位におけるオフターゲット発現と関係し得るため、これは重要な所見である。ここでＭＣ３について見られる高いオフターゲット発現は、ＭＣ３に関する以前の所見と一致しており、官庁届出書類は、現在の緊急認可されたＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンの齧歯類モデルでもこれが発生することを示唆している。負電荷の低いＬＮＰはＩＭ投与するとより局所に抑えられるということを我々は以前に見出したため、Ｃ２４ ＬＮＰの全身体内分布を著しく制限する機序は、中性に近いｐＨでの表面電荷及び正味電荷の急速な増大（図８６ｄ及び８６ｅ）に関連している可能性がある。マウスにおけるワクチン接種用量をよりよく表す、より低い０．５μｇ用量でのＦｌｕｃコードｍＲＮＡ－ＬＮＰのＩＭ投与は、Ｃ２４が注射部位においてＭＣ３の４倍高く発現することを示した（図８６ｄ及び８６ｅ）。この１０分の１の用量では、肝臓部位におけるシグナル対ノイズが低いため、ＩＶＩＳによってオフターゲット発現を検出できなかった。マウスの連日のイメージングは、発現の初期バーストが４８時間続き、５日間で徐々にベースラインまで低下したことを示した（図８６ｆ）。
実施例２６：ｍＲＮＡにコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する免疫原性は、元の武漢株及び２つの顕著なバリアントに対して、ＭＣ３ ＬＮＰよりもＣ２４ ＬＮＰについて高い結合力価及び１０倍高い偽中和力価を示す
現在の緊急認可されたＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチン中にあるジプロリン安定化膜結合スパイクタンパク質免疫原（Ｓ２Ｐ）をコードするヌクレオシド修飾型ｍＲＮＡを用い、ＬＮＰをアセンブルした。我々は、プライムとブーストとの間を３週間あけた０．１μｇ～１μｇの範囲の用量での２回の免疫のＩＭ投与によるＢａｌｂ／ｃマウスにおける免疫原性研究、及びスパイクタンパク質の受容体結合ドメインに対する結合抗体の血清分析、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する中和アッセイを行った。遷移希釈度でのＥＬＩＳＡ結合アッセイの光学密度は、結合抗体がすべての用量でＭＣ３よりもＣ２４ ＬＮＰに対して著しく高かったことを示した（図８７ａ及び８７ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する中和アッセイは、Ｃ２４ ＬＮＰがすべての用量でブースト後にＭＣ３の約１０倍の著しく増大した中和力価を有することを示した（図８７Ｃ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスで行われた、ＭｏｄｅｒｎａのＳＭ－１０２ ＬＮＰに同一のｍＲＮＡコード免疫原を用いる（他のｍＲＮＡ構造は異なる）よく似たアッセイは、ＭＣ３（１μｇで１，０００）と同様の力価を示し、Ｃ２４ ＬＮＰもＳＭ－１０２ ＬＮＰより高い効力を有し得ることを示唆している。Ｃ２４ ＬＮＰで送達された１μｇ用量も、ＭＣ３が中和をもたらさなかった単一用量（図８７ｃのプライム）の後に中和を誘導することができた。最後に、最も高い１μｇの用量をワクチン接種した動物の血清は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つのバリアントを中和することができ、試験されたバリアントに対して、Ｃ２４の力価がＭＣ３の力価よりも高かったことが見出された（図８７ｄ）。
実施例２７：Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおける致死量チャレンジは、ヌクレオシド修飾型Ｓ２Ｐ ｍＲＮＡの０．２５μｇという低いプライム／ブースト用量でのＣ２４ ＬＮＰによる完全な保護、及び０．５μｇ用量での肺感染の完全な消失を示す
Ｓ２Ｐ免疫原を含むｍＲＮＡ－ＬＮＰのワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による致死性感染からの保護について、ヒトＡＣＥ２受容体を保有するＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて調査した。Ｓ２Ｐ免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを、０．１～１μｇの範囲のｍＲＮＡ用量レベルで２回、各回で一群５匹の動物に投与し、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のイタリア株（分離株Ｉｔａｌｙ－ＩＮＭＩ１）の致死性鼻腔内用量でチャレンジした。各群で５匹中２匹の動物を５日目に屠殺して肺内のウイルス力価を評価し、残りの３匹は安楽死基準を満たすまで追跡した。我々は、０．５μｇ用量で保護が発生したＭＣ３に対して、Ｃ２４ ｍＲＮＡ ＬＮＰは０．２５μｇでマウスを完全に保護し、３匹中１匹の動物は０．１μｇでも生存したことを見出した（図８８ａ）。プラークアッセイでの中和力価は、Ｃ２４ ＬＮＰが、プライム及びブーストの両方の後で、１μｇ用量のＭＣ３の力価と均等な力価を０．２５μｇで達成したことを示した（図８８ｂ及び８８ｃ）。感染５日後に検査した肺ウイルス力価により、Ｃ２４ ｍＲＮＡ ＬＮＰは０．５μｇ用量で肺感染を全面的にブロックし、ＭＣ３は最も高い１μｇ用量でも感染を全面的にブロックしなかったことが見出された。まとめると、これらの結果は、Ｃ２４ ＬＮＰがＭＣ３の約４分の１の用量で感染からの保護を達成することを示している。我々の研究で２回適用した０．２５μｇの保護用量は、スパイクタンパク質の自己複製ｍＲＮＡを含むＬＮＰ３８に見られる単一有効量（１５μｇ）の６０分の１であり、同じく自己複製ｍＲＮＡを含む異なるＬＮＰで見られる別の単一用量の１０分の１である。こうした自己複製ｍＲＮＡを用いる後者の研究は単一用量であるが、ヒトでは必要用量が大幅に高く、容認できない反応原性を生成すると予想されるレベルである。我々の研究に最も類似している研究は、ＭｏｄｅｒｎａのＳＭ－１０２ ＬＮＰ中のＳ２Ｐ免疫原を使用したプライム／ブーストヌクレオシド修飾手法であるが、この手法において、ＳＭ－１０２ ＬＮＰ中の１μｇもの用量のＳ２Ｐ免疫原は、ＰＢＳ対照と比較すると肺感染を低減させたとはいえ、肺感染をブロックすることはできなかった。したがって、マウスにおける肺感染をブロックするＳＭ－１０２ ＬＮＰの効力は、我々の研究におけるＭＣ３の効力と同様と思われ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対するＳＭ－１０２及びＭＣ３の中和力価（いずれも約１，０００、図８７ｃ）について我々が見出した同様の効力によって裏付けられる。まとめると、これらの結果は、Ｃ２４ ＬＮＰ系がマウスモデルにおいてＭＣ３及びＳＭ－１０２ ＬＮＰの効力を超えることを示唆している。多くの場合、マウスモデルから非ヒト霊長類及びヒトへの翻訳は予測不可能であるため、Ｃ２４ ｍＲＮＡ ＬＮＰワクチンをさらに評価するには、より大きな動物モデル及び臨床試験における結果が必要である。
実施例２８：Ｃ２４ ＬＮＰの注射部位炎症はＭＣ３ ＬＮＰよりも軽度である
ＭＣ３ ｍＲＮＡ ＬＮＰの注射部位炎症は、ＩＭ投与２４時間後に、注射肢の肉眼で見える腫脹及び高レベルの硬直によって視覚的に明らかであった。５μｇ用量で注射したＣ２４ ｍＲＮＡ ＬＮＰの注射部位炎症は、ＭＣ３ ＬＮＰ注射部位の腫脹と比べると肉眼的に低度であった。したがって我々は、標準的な組織学的分析のために注射肢を固定し、処理した（パラフィン及びＨ＆Ｅ染色）。注射されたｍＲＮＡ ＬＮＰの５０μＬのデポーは、筋組織内にはなく、むしろ内側腓腹筋と外側腓腹筋との間の顔面に主に堆積し（図８９ａ、８９ｄ、及び８９ｇのＩＳ）、これらの部位の脂肪組織から区別することが困難であることが見出された。このＬＮＰデポーの非筋肉内部位は、約２ｍｍの厚さの内側腓腹筋を通過する標準的な３ｍｍの注射深度によるものであった。内側腓腹筋の体積はほんの約１５０μＬであるため（４１）、標準的な５０μＬのＬＮＰ量は、注射深度を低減させたとしても筋肉内部に収容される可能性は低い。Ｃ２４の組織像をＭＣ３と比較すると、ＭＣ３でより高いレベルの炎症が観察され、例えば滑膜は、ＭＣ３では多細胞性で肥厚していたのに対し、Ｃ２４では正常な外観であった（図８９ｅ、８９ｆと８９ｂ、８９ｃの対比）。Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰの両方について、投与２４時間後には、注射部位における白血球及び脈管構造の浸潤に加えて、対照の非注射肢には存在しなかった混合細胞型のリンパ系構造の存在が観察された（図８９ａ、ｇ、ｉ）。これらの急速に（２４時間で）形成するリンパ系構造は、マウスの免疫応答において重要な役割を果たす可能性があり、さらなる解析が行われている。
実施例２９：４℃でのＬＮＰの保存は、Ｃ２４ ＬＮＰが少なくとも１９日間安定であることを示すが、より高い温度での保存は、生物活性の喪失、及びｍＲＮＡ切断のホスホジエステルエステル交換反応機序と一致するｍＲＮＡ切断を誘導する
ｍＲＮＡ ＬＮＰは一般的に凍結保存を必要とし、緊急認可されたＬＮＰの使用説明によれば最長３０日間冷蔵温度で保存することができる。最近の報告は、ｍＲＮＡ ＬＮＰの保存中の不安定性に寄与する機序に関する情報がほぼ全くないことを浮き彫りにしているが、欧州の官庁届出書類は、不安定性が温度に依存し、ｍＲＮＡ完全性の喪失ならびにＬＮＰサイズの変化及び不純物の生成を伴うと記述している。したがって我々は、Ｃ２４及びＭＣ３のＦＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰを、４℃または室温（ＲＴ≒２２℃）の２つの温度のうちの１つで２週間にわたってＰＢＳ中に保存し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのルシフェラーゼ発現によって生物活性を試験した。我々は、Ｃ２４及びＭＣ３の両ＬＮＰの生物活性が、４℃での保存時には２週間安定であったが（異なる日に播種した細胞に対して行ったこの生物活性アッセイの高いばらつきの範囲内で）、室温での保存時には２０～４０％低下したことを見出した（図９０ａ）。いずれの保存温度でも、２週間にわたってＬＮＰサイズまたはＲｉｂｏｇｒｅｅｎの接近可能性の変化は見られなかった（図９０ｂ及び９０ｃ）。我々は、塩基触媒によるホスホジエステルエステル交換及びｍＲＮＡ骨格の切断の温度依存性及びｐＨ依存性を特徴付けるデータから導出されたモデルを使用して、２，０６１ヌクレオチド長のＦＬｕｃの経時的なｍＲＮＡ完全性の喪失を計算した。このモデルは、４℃で２，３００日、２２℃（ＲＴ）で１２５日、３７℃で１１日の半減期を予測した（すべてｐＨ７．４）（図９０ｄ）。これにより、ｍＲＮＡ骨格の切断は、温度に非常に敏感であると予想され、これらの傾向は、遊離ｍＲＮＡに関する以前の所見と質的に一致している。我々は次に、追加のｍＲＮＡ ＬＮＰをＰＢＳ中に４℃及び２２℃（ＲＴ）で、ならびに分解を加速させるために３７℃で保存し、ｍＲＮＡをクロロホルム／メタノール中に抽出して、マイクロ流体電気泳動デバイスでｍＲＮＡ完全性を分析した。我々は、ｍＲＮＡ完全性が４℃での保存時には少なくとも１９日間維持されるのに対し、より高い温度はｍＲＮＡ切断をもたらし得ることを見出した（図９０ｅ）。ＦＬｕｃ ｍＲＮＡピークに対応する曲線下面積（ＡＵＣ）によって推定したｍＲＮＡ完全性は、Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを合わせた０日目の値に対して正規化した。サンプル数が小さ過ぎて統計分析は不可能であったが、Ｃ２４ ＬＮＰは、より高い温度においてＭＣ３ ＬＮＰよりも高いレベルのｍＲＮＡ完全性を維持すると見受けられた（図９０ｆ）。より高い温度におけるｍＲＮＡ切断の増大は、ｍＲＮＡ切断の塩基媒介性ホスホジエステルエステル交換反応機序のモデルと一致するが（４２）（図９０ｄ）、ＬＮＰの環境、及びＬＮＰ中のイオン化可能脂質の具体的な構造への依存性を呈し得る。ＬＮＰの環境は、例えば、プロトン分配現象によってｍＲＮＡ分解を加速させる可能性があり、我々は、プロトン分配現象が、ＬＮＰ中に対する水性媒体中のイオン化可能脂質のｐＫａの差異の原因であることを見出した。すなわち、脂質環境のプロトン溶媒和エネルギーが高いと、プロトンが排除され、ＬＮＰ中のｐＨが外部水相と比較して上昇し、これにより、塩基触媒によるホスホジエステルエステル交換及びｍＲＮＡ骨格の切断のモデルのｐＨ依存性によって予測されるように、塩基媒介性ｍＲＮＡ切断が加速する可能性がある。
実施例３０
材料及び方法
材料
ＤＭＧ－ＰＥＧ（分子量（ＭＷ）２０００Ｄａ）（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）は、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａから購入した。コレステロールは、Ｃｏｍｂｉ Ｂｌｏｃｋｓから購入した。１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。４－メチル－１－ピペラジンブタンアミンは、Ｅｎａｍｉｎｅから購入した。塩化アクリロイル、トリメチルシリルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２－オクチル－１－ドデカノールは、ＢＯＣ ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。第三級ブチルアルコール及びネオペンチルアルコールは、ｃｏｍｂｉ－ｂｌｏｃｋｓから購入した。別段の記載がない限り、反応はすべて周囲空気雰囲気下で行った。市販の試薬はすべて、別段の記載がない限り、さらなる精製を行わずに使用した。ビス（２－オクチルドデシル）３，３’－（（４－（４－メチルピペラジン－１－イル）ブチル）アザンジイル）ジプロピオネート（Ｃ２４）、ならびにＣ２４及びＭＣ３の水溶性アナログは、後述のように合成及び精製した。Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（商標）と適合するマイクロ流体カートリッジは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ＝５．５は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ ０．５ｍｌ（分画分子量（ＭＷＣＯ）１０ＫＤａ）、２０×ＴＥバッファー、ＲＮＡｓｅフリー及びＱｕａｎｔｉ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び６－（ｐ－トルイジノ）－２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（ＴＮＳ）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）配列をｍＲＮＡ産生プラスミド（３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲが最適化され、１０１ポリＡ尾部を含む）にクローニングし、Ｎ１－メチルシュードウリジン修飾型ヌクレオシドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、Ｃｌｅａｎ Ｃａｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｒｉＬｉｎｋ）を使用して同時転写キャッピングを行い、セルロース精製（４５）にかけてｄｓＲＮＡを除去した。融合前のジプロリン安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ２Ｐ）配列をコドン最適化し、上述のように生成した。精製されたｍＲＮＡをエタノール沈殿にかけ、洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、クオリティコントロール（電気泳動、ドットブロット、及びヒトＤＣへのトランスフェクション）に供した。Ｄ－ルシフェリン（ナトリウム塩）は、ＲＥＧＩＳ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＮＣから購入した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣから購入した。
イオン化可能脂質及びイオン化可能脂質アナログの合成
溶媒は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｏｍｂｉ ｂｌｏｃｋｓ、Ｏａｋｗｏｏｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＶＷＲ及びＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入した。無水塩化メチレン（ＤＣＭ）、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び無水ＤＭＦは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｏｐｔ．ＫＭｎＯ４ガラスベースのシリカプレート、Ｆ２５４薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣ）を使用して反応をモニターし、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅから購入したシリカゲルクロマトグラフィー（ＴＬＧ－Ｒ１００１４ＢＫ－３２３）を使用してカラム精製を行った。ＮＭＲスペクトルは、ｄ－溶媒としてのＣＤＣｌ３、Ｄ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び内部標準（１Ｈ ＮＭＲについてはδ７．２６、１３Ｃ ＮＭＲについてはδ７７．００）を使用し、Ｂｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ分光計で記録した。１Ｍ ＮａＯＨ及び１Ｍ ＨＣｌの溶液は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。４つの内部ＮＭＲ標準であるピペラジン、イミダゾール、クロロ酢酸、及び酢酸は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ｉｎ ｓｉｔｕ ＮＭＲ ｐＨ測定のために選択的に使用した。
Ｃ２４イオン化可能脂質及び水溶性アナログ
Figure 2023546908000130
 ２－オクチルドデシルアクリレート２（２）（３．４ｍｍｏｌ、１．２ｇ、１．４８ｍｌ）を、オーブンで乾燥させた５ｍｌのｂｉｏｔａｇｅマイクロウェーブバイアルに加え、４－メチル－１－ピペラジンブタンアミン（１）（１．３１ｍｍｏｌ；０．２２４ｇ）を滴加した（４６）。無溶媒条件を維持し、密封したマイクロウェーブバイアルを２～３日間９０℃で攪拌した。１が完全に消費されるまで、反応の進行をＴＬＣによってモニターした（クロロホルム／メタノール９：１ｖ／ｖは、ヨウ素染色及びリンモリブデン酸染色で可視化できる）。０～５％のメタノールを含むクロロホルムで溶出するシリカゲルカラムで粗生成物を精製した。カラム画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析し、純粋な生成物（Ｒｆ＝０．３）を含む画分を濃縮して、生成物（ビス（２－オクチルドデシル）３，３’－（（４－（４－メチルピペラジン－１－イル）ブチル）アザンジイル）ジプロピオネート）を黄色の油状物（３）として得た。（０．７７ｇ， ７２％収率）． １Ｈ－ＮＭＲ ： （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７．２６ ｐｐｍ）： δ ３．９５ （ｄ， ６．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．７６ （ｔ， ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．４９－２．４０ （ｍ， １２Ｈ）， ２．３４ （ｔ， ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ）， １．６０ （ｓ， ｂｒ， ２Ｈ）， １．４４－１．４３５ （ｍ， ４Ｈ）， １．２５ （ｍ， ６４Ｈ）， ０．８７（ｔ， ６．８ Ｈｚ， １２Ｈ） ． １３Ｃ ＮＭＲ： （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７７．０ ｐｐｍ）： δ １７２．８（Ｃ）， ６７．２（ＣＨ２）， ５８．５（ＣＨ２）， ５５．１（ＣＨ２）， ５３．６（ＣＨ２）， ５３．２（ＣＨ２）， ４９．２（ＣＨ２）， ４６．０（ＣＨ３）， ３７．３（ＣＨ）， ３２．６（ＣＨ２）， ３１．９４（ＣＨ２）， ３１．９２（ＣＨ２）， ３１．２（ＣＨ２）， ３０．０（ＣＨ２）， ２９．７（ＣＨ２）， ２９．６７（ＣＨ２）， ２９．６０（ＣＨ２）， ２９．３８（ＣＨ２）， ２９．３５（ＣＨ２）， ２６．７（ＣＨ２）， ２５．２（ＣＨ２）， ２４．７（ＣＨ２）， ２２．７（ＣＨ３）．
Ｃ２４－水溶性アナログ
Figure 2023546908000131
 ４－（４－メチルピペラジン－１－イル）ブタン－１－アミン（１）（１．１６ｍｍｏｌ、０．２ｇ）及びｔｅｒｔ－ブチルアクリレート４６（４）（３．１３ｍｍｏｌ、０．４０ｇ）の混合物を、オーブンで乾燥させた５ｍｌのｂｉｏｔａｇｅマイクロウェーブバイアルに加え、無溶媒条件を維持した（４６）。密封したマイクロウェーブバイアルを２～３日間９０℃で攪拌した。１が完全に消費されるまで、反応の進行をＴＬＣによってモニターした（クロロホルム／メタノール９：１ｖ／ｖは、ヨウ素染色及びリンモリブデン酸染色で可視化できる）。０～５％のメタノールを含むクロロホルムで溶出するシリカゲルカラムで粗生成物を精製した。カラム画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析し、純粋な生成物（Ｒｆ＝０．３４）を含む画分を濃縮して、生成物を黄色の油状物（５）として得た。（０．３０ｇ， ５３％収率）． １Ｈ－ＮＭＲ ： （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７．２６ ｐｐｍ）： δ ２．６７ （ｔ， ７．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．４４－２．４２ （ｍ， ９Ｈ）， ２．３７－２．２７ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）， １．８４－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．４４－１．３９ （ｍ， ２２Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ： （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７７．０ ｐｐｍ）： δ １７２．０ （Ｃ）， ８０．１ （Ｃ）， ５８．３ （ＣＨ２）， ５４．９ （２ × ＣＨ２）， ５３．５ （ＣＨ２）， ５２．９ （２ × ＣＨ２）， ４９．２ （２ × ＣＨ２）， ４５．８ （ＣＨ３）， ３３．６ （２ × ＣＨ３）， ２８．０ （９ × ＣＨ３）， ２５．２ （ＣＨ２）， ２４．５ （ＣＨ２）．
ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ水溶性アナログ
Figure 2023546908000132
 ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ水溶性アナログは、以前の文献による報告に従って合成した。４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（６）（５９．７ｍｍｏｌ、１．０ｇ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（７．１６ｍｍｏｌ、０．６３ｇ）、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（１．４９ｍｍｏｌ、０．１８ｇ）、トリエチルアミン（４２．０ｍｍｏｌ、４．２５ｇ、５．８３ｍＬ）、及びＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）の混合物を、２５０ｍＬの２口丸底フラスコに入れた。反応物を２０分間室温で攪拌し、ネオペンチルアルコール（７）（７．１６ｍｍｏｌ、０．７８ｍＬ）を滴加し、反応物を一晩攪拌した。６が完全に消費されるまで、反応の進行をＴＬＣによってモニターし（クロロホルム／メタノール９：１ｖ／ｖは、ヨウ素染色で可視化できる）、溶媒ＣＨ２Ｃｌ２を回転蒸発によって除去した。この混合物を１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、１５０ｍＬの水及び１５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。０～１％のメタノールを含むクロロホルムで溶出するシリカゲルカラムで粗生成物を精製した。カラム画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析し、純粋な生成物（Ｒｆ＝０．４）を含む画分を濃縮して、生成物を黄色の油状物（８）として得た。（０．５８ｇ， ４８％収率）． １Ｈ－ＮＭＲ ： （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７．２６ ｐｐｍ）： δ ２．３６ （ｔ， ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３１ （ｔ， ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ６Ｈ， ２×ＮＣＨ３）， １．８４－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８６ （ｓ， ９Ｈ， ２×ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ： （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３， 標準としてδ ＝ ７７．０ ｐｐｍ）： δ １７３．６ （Ｃ）， ７３．６ （ＣＨ２）， ５８．８ （ＣＨ２）， ４５．３ （２ × ＣＨ３）， ３２．１ （ＣＨ２）， ３１．２ （Ｃ）， ２６．４ （９ × ＣＨ３）， ２２．９ （２ × ＣＨ２）．
水溶性イオン化可能脂質アナログのｐＫａのＮＭＲ測定。
公開されている方法５、６に従い、プロトンＮＭＲ化学シフトのｐＨ依存性を使用して、イオン化可能脂質水溶性アナログ（ＷＳＡ）のｐＫａを測定した。ピペラジン、イミダゾール、２－クロロ酢酸、及び酢酸の化学シフトを内部ｐＨ指標として使用した。９５％Ｈ２Ｏ－５％Ｄ２Ｏ中で１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのピペラジン、２ｍＭのイミダゾール、及び５ｍＭの水溶性イオン化可能脂質アナログを用い、ＭＣ３－ＷＳＡの溶液を調製した。９５％Ｈ２Ｏ－５％Ｄ２Ｏ中で１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのピペラジン、２ｍＭのイミダゾール、０．２ｍＭのＤＳＳ、及び５ｍＭの水溶性イオン化可能脂質アナログを用い、Ｃ２４－ＷＳＡのカルボン酸エステルの末端（Ｎ１）及びβ位のアザアミン（Ｎ２）の溶液を調製した。９５％Ｈ２Ｏ－５％Ｄ２Ｏ中で１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのクロロ酢酸、２ｍＭの酢酸、０．２ｍＭのＤＳＳ、及び５ｍＭの水溶性イオン化可能脂質アナログを用い、Ｃ２４－ＷＳＡの内部アミン（Ｎ３）の溶液を調製した。溶液を体積で二等分し、一方は０．１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨ下限まで滴定し、他方は０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨ上限まで滴定した（ここで、ｐＨの下限及び上限は、所望のｐＨ範囲の両端である）。これら２つの溶液を異なる割合で混合することにより、中間のｐＨ値を得た。ＮＭＲ測定をＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ分光計で行い、ｐＨ下限から上限までの範囲にわたる約２４のｐＨ値の各々で１Ｈスペクトルを取得した。ＭＣ３のピークはＤ２Ｏ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、標準としてδ＝４．７９ｐｐｍ）に合わせ、Ｃ２４のピークはＤＳＳ（４００ＭＨｚ、ＤＳＳ、標準としてδ＝０．００ｐｐｍ）に合わせた。次いで、ピペラジン、イミダゾール、２－クロロ酢酸、及び酢酸からの化学シフトを使用して、公開されている方法５、６に従って各溶液のｐＨを計算し、イオン化可能脂質水溶性アナログ頭部基の各窒素に隣接するプロトンの化学シフトをＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式に当てはめて、各窒素のｐＫａを求めた。スペクトルは補足図２にある。
ｐＫａの理論計算
ＮＭＲ、ゼータ電位及びＴＮＳアッセイから実験的に決定されたｐＫａ値を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）ソフトウェアを使用して理論的に計算された値に対して比較した。ＡＣＤ／ｐＫａデータベースは、２つの手法を使用し、分子の構成成分フラグメントに基づいて、水性環境における分子全体のｐＫａ値をアルゴリズムによって推定する。Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムは、各々がシグマ定数の変動を伴う幾つかの式によって特徴付けられる、ほとんどのイオン化可能な官能基をカバーするようにパラメータ化されたＨａｍｍｅｔｔ型の式のデータベースを用いる。Ｇａｌａｓアルゴリズムは、反応中心及び近傍のイオン化中心の周囲に基づいて、仮想上の無電荷状態において可能なすべてのイオン化中心についてのｐＫａミクロ定数を推定し、ｐＫａマクロ定数が得られるミクロ定数を生成する。この研究では、Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムの計算を使用した。
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の調製
イオン化可能脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を、ＭＣ３については５０／１０／３８．５／１．５、Ｃ２４については４８／１３／３７／２の％モル比で使用して、エタノール中で脂質を調製し、水性バッファー中でｍＲＮＡを調製することにより、ｍＲＮＡ搭載ＬＮＰを製剤した。これら２つの溶液を、Ｓｐａｒｋ ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（商標）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）において、ｍＲＮＡ骨格上のリン酸に対するイオン化可能脂質のモル比が４となる体積及び濃度で混合し、ＰＢＳ ｐＨ７．４に排出した。ＭＣ３ ＬＮＰは、既報の標準的手順を使用して調製し、Ｃ２４ ＬＮＰアセンブリは、この特定の製剤のためにいくつかのパラメータを最適化した。得られた混合物を１：１でＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ（分画分子量１０ｋＤａ）を使用して、６時間にわたり、６回のバッファー交換の後にｐＨ７．３～７．４に達するように、ＰＢＳに対して透析した。
ＲｉｂｏｇｒｅｅｎのｍＲＮＡ接近不可能性のアッセイ
Ｔｒｉｓ（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）／ＥＤＴＡ（１ｍＭ）（ＴＥ）及びＴｒｉｔｏｎ／ＴＥ（ＴＥバッファー中２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ）を黒色マイクロプレートに二連で加えた。ＬＮＰ中の総ｍＲＮＡをＴＥ中で約４ｎｇ／μＬに希釈し、各ＴＥ及びＴＥ／Ｔｒｉｔｏｎウェルに１：１の体積比で加えた。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイには、一方はｍＲＮＡ及びＴＥを含み、他方はｍＲＮＡ及びＴｒｉｔｏｎ／ＴＥを含む、２つの標準曲線を含めた。各標準曲線を使用して、それぞれのバッファーにおけるＲｉｂｏｇｒｅｅｎのｍＲＮＡ接近可能性を計算した。ＲｉｂｏｇｒｅｅｎはＴｒｉｔｏｎ／ＴＥにおいてＴＥよりも高いバックグラウンド蛍光を有するため、接近不可能性を５～１０％過剰評価し得るＴｒｉｔｏｎ／ＴＥにおける単一の標準曲線と比較して、２つの標準曲線を使用するこの手法が必要である。マイクロプレートを３７℃で１０分間インキュベートして、ＴｒｉｔｏｎでＬＮＰを抽出した。ＤＭＳＯ中のＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬をＴＥバッファーで１：１００に希釈し、各ウェルに１：１の体積比で加えた。マイクロプレートをＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）に直ちに導入して、蛍光を読み取った（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５２８）。
ＴＮＳアッセイ
ＴＮＳアッセイを使用してＬＮＰのｐＫａを決定した。ＴＮＳ試薬をＤＭＳＯ中で３００μＭのストック溶液として調製した。２０ｍＭホウ酸、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭグリシルグリシン、２５ｍＭ ＮａＣｌを含む総量約１０３μＬの緩衝液中、イオン化可能脂質が２４μＭ、ＴＮＳが６．３μＭとなるようにＬＮＰを希釈し、ｐＨの範囲は３～１０とした。Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、蛍光を読み取った（Ｅｘ３２１／Ｅｍ４４５）。ＴＮＳ添加後に各ウェルでｐＨを測定した。Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、蛍光データをＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式ＲＦＵ＝ＲＦＵ＿ｍａｘ－（（ＲＦＵ＿ｍａｘ－ＲＦＵ＿ｍｉｎ））／（（１＋１０＾（ｐＫａ－ｐＨ）））に当てはめて、ｐＫａを求めた。
動的光散乱及び電気泳動移動度を使用した、ｍＲＮＡ ＬＮＰサイズ、ゼータ電位（ＺＰ）、ＺＰ ｐＫａ及びｐＩ、ｍＲＮＡコピー数。
ＬＮＰをＰＢＳ ｐＨ＝７．４で希釈して総ｍＲＮＡを６．２５ｎｇ／μＬとし、石英キュベット（ＺＥＮ２１１２）に移し、０．８８８ｃＰの粘度及び１．３３５のＲＩを有する２５℃のＰＢＳ中、１．４５の粒子ＲＩ及び０．００１の吸光度を使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズを測定した。測定は、二連で３０秒間２５℃に予め平衡された１７３°の後方散乱検出角度を使用して行い、測定間で遅滞なく、各々５回実行し、実行時間は１０秒とした。各測定は、自動減衰選択を用い、石英キュベット内で４．６５ｍｍの定位置であった。データは、通常の分解能で汎用モデルを使用して分析した。直径は、ゼータ平均と比べて電子顕微鏡で見られる物理的サイズにより密接に対応する数平均として報告される。既報の分子容モデルを使用し、数平均直径を使用してＬＮＰ中のｍＲＮＡコピー数を推定し、ＬＮＰ体積を計算した。上述の同じ材料及び分散剤パラメータならびにＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデルを使用したＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）での電気泳動光散乱（ＥＬＳ）によるゼータ電位の測定のために、３～１０の範囲のｐＨで上述のＴＮＳバッファーにＬＮＰを希釈した。測定の都度、電圧を自動的に設定すると発生するオーム加熱を回避するために、電圧を８０ボルトに手動で設定した。光子数の自動減衰選択を行う使い捨ての折り畳み式キャピラリーキュベットでの測定を三連で各々２０回行い、反復試験ごとに３０秒遅延させた。Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａを使用して、拡張型のＨｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式
Ψ＝Ψ＿ｍａｘ－（（Ψ＿ｍａｘ－Ψ＿ｍｉｎ））／（（１＋１０＾（（（ｐＫａ－ｐＨ））／ｎ）））
に対するデータにゼータ電位データを当てはめて、ｐＫａ、ｎ、ならびに低ｐＨ及び高ｐＨのゼータ電位限界Ψ＿ｍａｘ及びΨ＿ｍｉｎをそれぞれ求めた。ＬＮＰのｐＫａは高分子電解質と同様にイオン化状態依存的であるため、ここでは拡張型モデルが使用される。ＴＮＳ色素結合はＬＮＰ表面電荷のみを検出するため、ＴＮＳデータには拡張型モデルが必要なかった。等電点ｐＩは、ゼータ電位をゼロに補間することによって求められるｐＨであった。
クライオ電子顕微鏡法
Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶシステムを使用して電子顕微鏡用のグリッドをプランジ凍結した。チャンバは２５℃及び湿度１００％に設定した。ＬＮＰ（３μＬ）をグリッド（レース状炭素担体上の超薄カーボンフィルム、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ＃０１８２４Ｇ）に適用し、１分間インキュベートし、２５のブロット力で２回、各回３秒間ブロットした後、液体エタンにプランジした。Ｆａｌｃｏｎ ３ＥＣ検出器を備えた２００ｋＶのＴａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、データ収集のためにＥＰＵを使用して、グリッドをイメージングした。公称倍率は４５，０００倍であり、較正ピクセルサイズは０．２２３ｎｍであった。６０ｅ／Å２の総線量で５秒の露出、及びＭｏｔｉｏｎｃｏｒ２５２を使用して運動補正した６６のフラクションを使用して、積分モードで画像を取得した。
ＦＬｕｃ ｍＲＮＡを含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰの筋肉内投与後のルシフェラーゼ発現についてのＩｎ ｖｉｖｏ生動物イメージング。
研究者らは、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌによる「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」を順守した。マウス研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ＵＰｅｎｎ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコールの下で実施した。動物はすべて、地域、州、及び連邦政府の方針に従い、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）認証施設に収容してケアした。８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓから購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａで実験前に７日間順化させた。３／１０ｃｍ３ ２９Ｇインスリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、マウスに５μｇまたは０．５μｇのＦＬｕｃ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを注射した。ｍＲＮＡ－ＬＮＰはＰＢＳで希釈し、腓腹筋に注射した（注射量５０μＬ）。注射４時間後、マウスを酸素中２％のイソフルオランで麻酔し、２５０μＬのＤ－ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射の１０分後にイメージングした。ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生物発光イメージングを行った。２４時間でイメージングを繰り返し、動物を安楽死させた。寿命実験では動物を５日間にわたり毎日イメージングした。投与２４時間後に肢固定も行い、注射部位を中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで処理し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
ヌクレオシド修飾型Ｓ２Ｐ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰのＢａｌｂ／ｃマウスにおける免疫原性。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒｓ）に、内側腓腹筋への注射量５０μｌ中、０．１、０．２５、０．５、１．０μｇのヌクレオシド修飾型ｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを投与した（ＬＮＰごと、用量ごとにＮ＝５匹）。２回の注射の間に３週間おき、１回目の注射の１日前（予備採血）、２回目の注射の前（プライム）、及び２回目の注射の２週間後（ブースト）に後眼窩経路を介して血液を収集した。室温で３０分間のインキュベーション期間後に血清を血液から分離し、サンプルを１０，０００ｇで５分間、非冷蔵Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｅｎｆｉｅｌｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）で遠心分離した。分離した血清を使用時まで－２０℃で保存した。エンドポイント酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して総抗体力価を決定した。簡潔に述べると、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌ（商標）Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェル透明ポリスチレンマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌの精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（カタログ番号Ｚ０３５０１）で一晩被覆し、洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で１回洗浄し、ＰＢＳ中２％ｗ／ｖのＢＳＡを使用して室温で２時間ブロッキングした。次いでプレートを３回洗浄し、マウス血清を１：２７，０００（プライム血清）及び１：５４，０００（ブースト血清）でブロッキング液に加え、２時間室温でインキュベートし、３回洗浄した後、ブロッキングバッファー中の（ＨＲＰ）共役抗マウス二次抗体（１：１００００）と共に１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、その後、ウェル当たり１００μｌのＫＰＬ ＴＭＢ基質を８分間加えた。２Ｎ硫酸を使用して反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）１９０マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。中和能力を決定するために、ＶＳＶΔＧ－ＲＦＰ偽型ウイルス（５０～２００フォーカス形成単位／ウェル）を、２倍段階希釈した血清サンプルと共にインキュベートし、ウイルス－抗体混合物をＶｅｒｏＥ６ ＴＭＰＲＳＳ２細胞に加える前に３７℃で１時間インキュベートした。感染２０時間後、細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、Ｓ６ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ，Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＯＨ）での可視化を行った。感染した個々のフォーカスを計数し、抗体を含まない対照ウェルと値を比較した。フォーカス減少中和力価５０％（ＦＲＮＴ５０）は、マウス血清の非存在下で偽型ウイルスに感染した対照細胞に対してフォーカス数が少なくとも５０％低減する最大の血清希釈度として測定した。各サンプルのＦＲＮＴ５０力価は、別々の日に行った２つの技術的反復試験で測定した。
ヌクレオシド修飾型Ｓ２Ｐ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰでの免疫による、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２致死量チャレンジからの保護
雌のＢ６；ＳＪＬ－Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ（ｈＡＣＥ２）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに、内側腓腹筋への注射量５０μｌ中、０．１、０．２５、０．５、１．０μｇのヌクレオシド修飾型ｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原を含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを投与した（ＬＮＰごと、用量ごとにＮ＝５匹）。マウスにｍＲＮＡ ＬＮＰのプライム及びブースト注射を与え、２回の注射の間に６週間おいた。１回目の注射の前（予備採血）、２回目の注射の前（プライム）、及び２回目の注射の２週間後（ブースト）に、下顎採血によって血液を収集した。中和抗体をプラーク減少中和力価アッセイ（ＰＲＮＴ）（後述）によって評価した。６０～７５％コンフルエンシーでＶｅｒｏ細胞を播種した細胞培養フラスコにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を行った。細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イタリア分離株－ＩＮＭＩ１（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に感染させた。感染を４８～７２時間行った後、上清を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって評価した。２回目の免疫の２週間後のマウスを、５×１０５ｐｆｕの用量での鼻腔内投与によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジし、死亡または安楽死基準を満たすまで追跡した。体重及び体温は毎日記録した。各群で５匹中２匹のマウスをチャレンジ後５日目に屠殺して、プラークアッセイによって肺ウイルス力価を評価した。肺組織をホモジナイズし、スピンダウンした。プラークアッセイによるウイルス量の評価のために上清を回収した。残り３匹のマウスは、疾病及び死亡の徴候について毎日モニターした。生存マウスについては体重及び体温の測定値も研究終了まで毎日記録した。
ＰＲＮＴ５０アッセイでは、マウス血清をＤＭＥＭ（５％ＦＢＥ、１％Ｌ－グルタミン酸及び２０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び２０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったもの）で１：１０に希釈した。次いで、１：１０希釈物から２倍段階希釈物を調製し、１００ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、血清／ウイルス混合物を１２ウェルプレート形式でＶｅｒｏ細胞のコンフルエント層上に重層し、５％ＣＯ２で３７℃のインキュベータにおいて１時間インキュベートした。次いで、播種後のウェルに、イーグル最小必須培地（フェノールレッド不含、５％ＦＢＥ、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＶＷＲ、４５０００－７１０、Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び２０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったもの）と０．６％アガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１６５００１００）との１：１混合物を重層し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次いで細胞を１０％ホルムアルデヒド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、Ｆ７９ｐ－４）で１時間固定した。培地を除去し、細胞をｄｉＨ２Ｏで洗浄し、１％クリスタルバイオレット（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、Ｃ５８１－２５）及び２０％エタノール溶液（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＢＰ２８１８－４）で染色した。プラークを計数し、ｐｆｕ／希釈としてプロットした。
プラークアッセイでは、Ｖｅｒｏ細胞（ＷＴ Ｖｅｒｏｓ、ＡＴＣＣ）をウェル当たり２×１０５細胞の密度で１２ウェルプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。組織ホモジネートからの上清を１０－６まで段階的に希釈し、細胞に１時間重層した（３７℃、５％ＣＯ２Ｏ）。次いで、細胞に、イーグル最小必須培地（フェノールレッド不含、５％ＦＢＥ、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＶＷＲ、４５０００－７１０、Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び２０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったもの）を０．６％アガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１６５００１００）と共に重層し、４８時間インキュベートした。次いで細胞を１０％ホルムアルデヒド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、Ｆ７９ｐ－４）で１時間固定した。培地を除去し、細胞をｄｉＨ２Ｏで洗浄し、１％クリスタルバイオレット（ＦｉｓｈｅＳｃｉ、Ｃ５８１－２５）及び２０％エタノール溶液（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＢＰ２８１８－４）で染色した。プラークを手動で計数した。データセットは、１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）を表す。
ｍＲＮＡ ＬＮＰの保存／安定性研究
ＦＬｕｃ ｍＲＮＡを含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを４℃または室温（ＲＴ≒２２℃）でＰＢＳ中に保存した。これらを、保存の０日目、２日目、４日目、７日目、１４日目に、上述のＤＬＳによるサイズ、上述のｍＲＮＡ封入、ならびにＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションを介した生物活性及びルシフェラーゼ発現の評価のためにアッセイした。生物活性については、トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３細胞を１００μＬのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）中でウェル当たり１２×１０３細胞の密度で白色９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。８μＬに２５ｎｇのｍＲＮＡ ＦＬｕｃが含まれるようにＦＬｕｃ ｍＲＮＡ搭載ＬＮＰを希釈し、播種の２４時間前に三重反復試験を使用して、この用量でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。さらに２４時間のトランスフェクション後、１００μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ基質をウェルに直接加えて、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ルミノメータープレートリーダーでの発光に基づくルシフェラーゼ発現を検出した。ＦＬｕｃ ｍＲＮＡを含む追加のＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを、ＰＢＳ中で１９日間、４℃、ＲＴ、及び３７℃で保存した。クロロホルム／メタノールを使用してＦＬｕｃ ｍＲＮＡをＬＮＰから抽出し、製造元の説明に従った２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でのマイクロ流体電気泳動によってｍＲＮＡ完全性を分析した。ｍＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって数量化し、次いで１ｎｇ／ｕｌに希釈して、各サンプルの１ｎｇのｍＲＮＡをＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒにロードした。％ｍＲＮＡ完全性は、ｍＲＮＡ ＦＬｕｃの主ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を積分し、Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを合わせた０日目の平均値に対して正規化することによって計算した。
統計及び再現性
ＪＭＰ Ｐｒｏ １５．１．０ソフトウェアの線形最小二乗多変量モデルを使用して、図８４及び８６の群間の比較を行った。Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＩＶＩＳイメージングデータについては、４及び２０／２４時間の時点を反復測定とみなした。Ｌｏｇ１０変換をＦＲＮＴ５０及びウイルス力価に適用した。線形回帰モデルを使用して、図８７ａ～８７ｃ、８８ｄ、及び８ｈの用量に調整したＬＮＰ別に、ＯＤならびに変換されたＦＲＮＴ５０及びウイルス力価を比較した。ＬＮＰを予測因子として用いる調整なしの線形回帰を使用して、図８７ｄの偽型ウイルスの中和を比較した。ＰＢＳを除き、ＬＮＰ別に、フィッシャーの正確確率検定を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の致死量チャレンジ後に死亡したマウスの割合を比較した（図８８ａ）。固定効果としての用量、希釈度、及びＬＮＰ、ならびにマウスの変量切片を用いる線形混合効果モデルにより、ウイルスの検出率に対するＬＮＰの効果を評価した（図８８ｂ、ｃ、ｆ、ｇ）。線形回帰及び混合効果モデルはＲバージョン３．６．３で実行した。
実施例３１－図８４
マルチプロトン性Ｃ２４イオン化可能脂質は、ＬＮＰにおける多段階プロトン化、及びＭＣ３ ＬＮＰよりも高度なエンドソームｐＨ範囲内のプロトン化をもたらす。ａ）理論上のｐＫａを示すＣ２４及びＭＣ３ならびにそれらの水溶性アナログの構造。Ｃ２４イオン化可能脂質（分子量８７６．４９）は、非対称の分岐状Ｃ８～Ｃ１０（ビス２－オクチルドデシル）アルキル尾部に各々結合した２つの高速分解性エステル結合を有する。Ｃ２４の頭部基は三価であり、ＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａ Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムを使用して計算された７．８、４．１及び７．７の理論上のｐＫａを有する。ＭＣ３（分子量６４２．１１）は、ジリノール酸尾部及び一価頭部基に結合した１つの低速分解性エステルを有し、理論上のｐＫａは９．４である。ｂ）Ｃ２４イオン化可能脂質中の各窒素のｐＫａは、挿入図中の水溶性アナログを使用した各窒素に隣接するプロトンの１Ｈ ＮＭＲ化学シフトのｐＨ依存性を使用して測定した。ｐＨに対する化学シフトをＨｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式に当てはめると、各窒素のｐＫａが求められ、これらは、８４（ａ）に示されるＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａ Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムによって予測されたｐＫａの０．４単位以内と同様である。末端窒素（赤）の滴定の伸展した見た目は、そのプロトン化形態と、同時にプロトン化するリンカーに最も近い窒素（青）との相互作用が、これら２つの窒素原子を配位させる可能性を示唆している。ｃ）ＭＣ３のジメチルアミン窒素のｐＫａは、ジメチルアミンプロトンの１Ｈ ＮＭＲ化学シフトのｐＨ依存性を使用し、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式に当てはめることによって測定した。測定された９．５のｐＫａは、（ａ）に示されるＡＣＤＬａｂｓ Ｐｅｒｃｅｐｔａ Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムによって予測された値９．４と合致した。ｄ）Ｃ２４及びＭＣ３について、ＴＮＳ色素結合アッセイを用いてＬＮＰのｐＫａを測定した。ＴＮＳのｐＫａは表面電荷を測定するものであり、ｐＨ≒６未満のプロトン化を反映できない。Ｃ２４及びＭＣ３のアッセイで等量のイオン化可能脂質を使用したため、ｐＨ７未満でより高いＣ２４のＲＦＵは、エンドソームｐＨ範囲内のＣ２４ ＬＮＰの表面プロトン化のレベルがより高いことを示し、ｐＨ６及び６．５でのＣ２４のＲＦＵをＭＣ３と比較するｔ検定は、有意差ｐ＜０．０５（＊）（Ｎ＝３の平均±ＳＤ）を示した。ｅ）電気泳動移動度を使用して正味のＬＮＰ電荷及びイオン化を測定し、ｐＨ範囲３～１０におけるゼータ電位を求めた。電気泳動移動度はＬＮＰの正味電荷に依存し、エンドソームがリソソームと融合するときの４．５までのエンドソームｐＨ値を含むｐＨ範囲全体でプロトン化を検出できる。モノプロトン性ＭＣ３イオン化可能脂質については、ゼータ電位は、ＬＮＰ内で近接している数千の強く相互作用するＭＣ３分子を含む多価ＬＮＰのｐＫａのイオン化状態依存性を捉えることから、本来は高分子電解質のために開発された拡張型のＨｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式（実線）に当てはまる。各Ｃ２４は、ｂに示される異なるｐＫａをもつ３つの窒素を有するため、Ｃ２４については、ゼータ電位が拡張型Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈモデルに十分に正確に当てはまらない（点線対赤の実線）。周辺の２つの窒素がより高いｐＨ値でプロトン化するのに対し、内部の中央の窒素は、４．５未満のｐＨ値において急勾配で上昇するゼータ電位を生じる。Ｃ２４ ＬＮＰは、ｐＨがエンドソームｐＨ範囲内で低下するにつれて急速に上昇する、中性ｐＨでは負寄りのゼータ電位を生じ、、このことは、ＭＣ３よりもＣ２４のエンドソームプロトン化が高度であることを示しており、ｐＨ７．４でのＣ２４のＺＰ（ｍＶ）をＭＣ３と比較するｔ検定は、有意差ｐ＜０．００１（＊）（Ｎ＝３の平均±ＳＤ）を示した。ｆ）水溶性アナログのＮＭＲによる測定値と比較した、ＡＣＤ Ｐｅｒｃｅｐｔａ Ｃｌａｓｓｉｃアルゴリズムから予測されたｐＫａ、ならびに、ＴＮＳ ｐＫａ、ゼータ電位（ＺＰ）ｐＫａ、ＺＰ等電点ｐＩ、ｐＨ７．４から６にかけてのＴＮＳ ＲＦＵの増大、及びｐＨ７．４から４．５にかけてのゼータ電位の上昇。ＮＭＲ ｐＫａは理論上予測されたｐＫａと合致し、ＴＮＳ及びゼータ電位の両方によって測定されたＬＮＰ ｐＫａよりも有意に高い。我々は最近、こうした分子及びコロイドのｐＫａ間の差異は、ＬＮＰの脂質相と水性媒体２０との間のプロトン分配に主に起因するものとして説明した。Ｃ２４に関するｐＨ７．４から６にかけてのＴＮＳ ＲＦＵの増大、及びｐＨ７．４から４．５にかけてのゼータ電位の上昇は、ＭＣ３のほぼ２倍であり、表面ＬＮＰプロトン化（ＴＮＳ）及び正味ＬＮＰ電荷（ＺＰ）の両方が、エンドソームｐＨ範囲内ではＭＣ３よりもＣ２４について大きく増大することを示している。
実施例３２－図８５
Ｃ２４及びＭＣ３脂質ナノ粒子の構造特性。ａ）ＤＬＳ数平均サイズは、Ｃ２４ ＬＮＰがＭＣ３ ＬＮＰよりもわずかに大きく、低い多分散指数を有することを示した。ｂ）Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイは、ＭＣ３と比べてＣ２４ではＲｉｂｏｇｒｅｅｎが接近不可能なｍＲＮＡのレベルがわずかに低いことを示した。我々は、トリトンあり及びなしの２つの標準曲線を使用してこのアッセイを行った。トリトンありの１つの標準曲線のみを使用した場合（これまでの大抵の公表文献のように）、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎが接近不可能なｍＲＮＡは、黄色の斜線入り部分に示されるように約８％増大する。このアッセイは、多くの場合、封入効率（％）と、ここで示されるＲｉｂｏｇｒｅｅｎが接近不可能なｍＲＮＡの割合（％）との対比と解釈される。後者がより正確であるが、その理由は、ｍＲＮＡの色素接近可能性は、ｍＲＮＡが遊離しており封入されていないことを示すものではないことが示されているからである。しかしこれは、ＬＮＰの異なる充填及び内部構造を反映する可能性がある。ｃ）ｍＲＮＡコピー数は、以前に公表された分子容モデル及び各ＬＮＰの数加重平均直径を使用して計算した。我々は、Ｃ２４イオン化可能脂質の分子容が、ＭＣ３の１．２９ｎｍ３に対して、その分子量に比例する１．７６ｎｍ３であると推定した。ｄ）ＭＣ３及びＣ２４（Ｅ）のＣｒｙｏＴＥＭは、ＤＬＳ数平均サイズと一致するサイズを示した。両ＬＮＰが、既報のように、このゾーンにおけるＤＳＰＣ局在化と一致する周辺二重層を有する。
実施例３３－図８６
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける筋肉内（ＩＭ）投与後のルシフェラーゼ発現は、Ｃ２４ ＬＮＰを用いた場合、ＭＣ３よりも有意に高いオンターゲットｍＲＮＡ発現及び低いオフターゲットｍＲＮＡ発現を示す。ａ）５μｇ用量のＦＬｕｃを含むＬＮＰのＩＭ投与の４時間後及び２４時間後のＩｎ ｖｉｖｏイメージングは、Ｃ２４を使用して送達されたＦｌｕｃの筋肉内発現（緑のＲＯＩ）が、ＭＣ３と比較して高いことを示し、また、肝臓内のオフターゲット発現（赤のＲＯＩ）をもたらすＭＣ３の著しい全身分布を示した。ｂ）この高い５μｇ用量において、Ｃ２４は、ＬＮＰ（ＭＣ３／Ｃ２４）及び時間（４時間／２４時間）の関数としての光子束の多変量分析におけるＬＮＰの効果についてｐ＝０．００７４で、ＭＣ３よりも有意に高い筋肉内発現を有する。ｃ）Ｃ２４のＩＭ投与後の肝臓におけるオフターゲットＦｌｕｃ発現は、ＬＮＰを比較するｔ検定においてｐ＝０．０５１で、ＭＣ３の６分の１である。ｄ）ワクチン接種をよりよく表す低用量（０．５μｇ）を投与したとき、４時間時点での筋肉内のＦＬｕｃは、ＬＮＰ（ＭＣ３／Ｃ２４）及び時間（４時間／２４時間）の関数としての流束の多変量分析におけるＬＮＰの効果についてｐ＝０．００３４（ｅ）で、Ｃ２４がＭＣ３より約４倍高い。ｆ）５μｇ用量をＩＭ投与した場合のルシフェラーゼ発現の持続時間を５日間追跡したところ、最初の２日間で急速な減少が示された後に発現がゆっくりと低下した。
実施例３４－図８７
Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた免疫原性研究において、Ｃ２４ ＬＮＰは、ＭＣ３ ＬＮＰよりも１０倍高い結合及び偽中和抗体力価を生じる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のジプロリン安定化膜結合スパイクタンパク質（Ｓ２Ｐ）をコードするヌクレオシド修飾型ｍＲＮＡを含むＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを、０．１～１μｇの範囲の４用量でＢａｌｂ／ｃマウスに投与した。ａ）ブーストの２週間後に収集した血清における、０．１μｇ及び０．２５μｇの低用量のｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原についてのＳ２Ｐ結合抗体アッセイでの、２７，０００の遷移希釈度におけるＥＬＩＳＡ光学密度。ＬＮＰ及び用量を予測因子として含む線形回帰モデル分析は、Ｃ２４結合抗体のＯＤがＭＣ３よりも有意に高いことを示した（ｐ＝０．０００５）。平均±ＳＥＭ。ｂ）ブーストの２週間後に収集した血清における、より高い０．５μｇ及び１．０μｇの用量のｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原についてのＳ２Ｐ結合抗体アッセイでの、５４，０００の遷移希釈度におけるＥＬＩＳＡ光学密度。ＬＮＰ及び用量を予測因子として含む線形回帰モデル分析は、Ｃ２４結合抗体のＯＤがＭＣ３よりも有意に高いことを示した（ｐ＝０．０１）。平均±ＳＥＭ。ｃ）Ｃ２４ ＬＮＰは、１μｇ用量のプライム注射１回の３週間後にＶＳＶΔＧ－ＲＦＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する検出可能なＦＲＮＴ５０力価を生じたが、ＭＣ３ ＬＮＰはそうではなかった（左のプライムのパネル）。ブーストの２週間後（右のブーストのパネル）、０．２５～１μｇ用量のＣ２４ ＬＮＰは、同じ用量のＭＣ３ ＬＮＰよりも約１０倍高いＦＲＮＴ５０力価を示した。用量及びＬＮＰを予測因子として含む対数変換されたＦＲＮＴ５０力価の線形回帰モデル分析は、Ｃ２４のＦＲＮＴ５０力価が、プライム（ｐ＝０．００００２）でもブースト（ｐ＝０．０１１）でも、ＭＣ３よりも有意に高いことを示した。平均±ＳＥＭ。ｄ）統計分析では有意差が見られなかったが、バリアントＤ６１４Ｇ及びＺＡを表す偽型ウイルスバリアントの中和は、Ｃ２４のＦＲＮＴ５０力価がＭＣ３ ＬＮＰよりも高いことを示唆した。平均±ＳＥＭ。
実施例３５－図８８
Ｃ２４ ＬＮＰは、Ｓ２Ｐ免疫原の低用量での致死性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する防御能があり、肺感染を完全に消失させる。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウス（０日目のＮ＝５から、各群で２匹を５日目に肺ウイルス力価の評価のために除いたため、各群でＮ＝３）において、０．２５μｇのｍＲＮＡコードＳ２Ｐ免疫原を含むＣ２４ ＬＮＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の致死量チャレンジに対して全面的に防御能があったが（ａ）、ＭＣ３ ＬＮＰは、より高い０．５μｇ用量で防御能があった（ｅ）。Ｃ２４群の３匹中１匹は、非常に低い用量の０．１μｇでも生存した。統計分析は、用量当たりの動物数が少ないため（ｎ＝３）、有意差を示さなかった。ＰＲＮＴ（各群Ｎ＝５）によるプラークアッセイでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和が示すところによれば、プライム後、Ｃ２４ ＬＮＰは、０．２５μｇ用量で中和活性を有したが（ｂ）、ＭＣ３は、１μｇ用量でのみ中和活性を有した（ｆ）。ＬＮＰ、用量、及び希釈度を予測因子として含む線形混合効果モデル分析は、Ｃ２４がウイルス検出率（％）をＭＣ３よりも有意に低減させることを示した（ｂ対ｆでｐ＝０．０２１）。Ｃ２４は、試験した希釈度では、ブースト後に０．２５μｇの用量で１００％の中和活性を有したが（ｃ）、ＭＣ３は、１μｇでのみ中和活性を有した（ｇ）。ＬＮＰ、用量、及び希釈度を予測因子として含む線形混合効果モデル分析は、Ｃ２４がウイルス検出率（％）をＭＣ３よりも有意に低減させることを示した（ｃ対ｇでｐ＜０．００００１）。プラークアッセイ（Ｎ＝２）における感染後５日目の肺ウイルス力価の評価によれば、Ｃ２４ ＬＮＰは、０．５μｇ用量で肺感染を完全に消失させたが（ｄ）、ＭＣ３ ＬＮＰは、試験した用量で最も高い１μｇでも肺感染を全面的に消失させることはできなかったことが見出された（ｈ）。ＬＮＰ及び用量を予測因子として含む対数変換されたウイルス力価の線形回帰モデル分析は、Ｃ２４がＭＣ３よりも有意に肺ウイルス力価を低減させることを示した（ｐ＝０．００００８）。ｂ、ｃ、ｆ、ｇでは、明確にするために、１つの用量に対してのみＳＥＭを示している。チャレンジ後の体重及び体温の記録は補足図３にある。平均±ＳＥＭ。
実施例３６－図８９
Ｃ２４の局所注射部位の炎症はＭＣ３ ｍＲＮＡ ＬＮＰよりも低度である。Ｃ２４ ＬＮＰ（ａ～ｃ）は、注射２４時間後にＭＣ３ ＬＮＰ（ｄ～ｉ）よりも低度の注射部位の炎症を誘発し、これは、Ｃ２４について肉眼で観察されたＭＣ３よりも低レベルの腫脹の目視及び触診による評価と一致していた。５μｇのｍＲＮＡ及び約６５μｇの総脂質を含む５０μｌの内側腓腹筋（ＭＧ）への注射は、ａ、ｄ及びｇにおいて、内側腓腹筋と外側腓腹筋（ＬＧ）との間の注射部位（ＩＳ）に主に見られた。脂質は局所脂肪組織との区別が困難であった。ＭＣ３は、肢全体の強い炎症応答を誘発し、滑膜組織（ｅ、ｆ）の肉眼的に明らかな腫脹及び組織学的に観察された炎症を誘導したが、これはＣ２４注射肢（ｂ、ｃ）には存在しなかった。注射部位の炎症応答は、好中球及び血管（ｈ）の浸潤を伴い、注射部位で混合細胞型リンパ系構造（ｉ）を生成したが、これらは非注射対照では観察されなかった。これらの応答は、ＭＣ３及びＣ２４の各々で一群３匹を代表するものである。染色はヘマトキシリン及びエオシンである。
実施例３７－図９０
Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰの生物活性及びｍＲＮＡ完全性は、２週間にわたり、４℃では安定であるが、より高い温度では低下する。ａ）生物活性は、０日目、２日目、４日目、７日目、及び１４日目に、１２，０００個の細胞を含むウェル当たり２５ｎｇにおけるＨＥＫ ２９３細胞でのルシフェラーゼ発現によって測定した。生物活性は、２週間にわたり、４℃でＰＢＳ中に保存したＣ２４及びＭＣ３ ＬＮＰの両方で安定であったが、室温（ＲＴ）で保存した場合には約２０～４０％低下した。ｂ）ＤＬＳによるＬＮＰサイズにも、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎが接近不可能なｍＲＮＡの割合（％）（ｃ）にも、検出可能な変化はなかった。ｄ）Ｌｉ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ １９９９の式「ｅ」におけるモデルを使用したｍＲＮＡ完全性（％未切断）の理論計算は、ｐＨ７．４での遊離ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ半減期が４℃では２，３００日、ＲＴでは１２５日、３７℃では１１日であることを示唆する。ｅ）０日目の生成直後、ならびに４℃、ＲＴ及び３７℃でＰＢＳ中に１９日間保存した後に、クロロホルム／メタノールを使用してＬＮＰからｍＲＮＡを抽出し、マイクロ流体電気泳動によって分析した。４℃で１９日おいた後には（０日目と比較した場合）、検出可能な分解は見られなかったが、より高い温度（ＲＴ及び３７℃）で保存した場合、ｍＲＮＡ切断量の増大がもたらされ、これは、（ｄ）のモデルによって予測された、より高い温度におけるより高度の分解と質的に一致していた。各条件で測定した３つのＬＮＰのうち、最も分解が少なかった例を（ｅ）に示している。２０秒未満のピークは標準物質であり、ｍＲＮＡ Ｆｌｕｃの主ピークを超えた４０秒付近のピークは、ｍＲＮＡ４５を精製するために使用されるセルロース法を使用した排除に適さない、鋳型なしの伸長の産物である。ｍＲＮＡ完全性は、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡピークに対応する曲線下面積（ＡＵＣ）によって推定し、Ｃ２４及びＭＣ３ ＬＮＰを合わせた０日目の平均値に対して正規化した。ｆ）ｍＲＮＡ完全性は、４℃では少なくとも１９日間安定であり、より高い温度では低下したが、Ｃ２４ではＭＣ３ほど低下しなかった。Ｎ＝３、ただし、いくつかのサンプルのトレースに数量化を妨げる技術的異常があったため、一部はＮ＝２。
実施例３８
ＬＮＰイオン化、及びエンドソーム膜を破壊しｍＲＮＡを放出するイオン化可能脂質の能力を予測するために、イオン化可能脂質構造を使用するモデルを開発することによる、合理的設計手法。
マイクロ流体ミキサーまたはより規模の大きなＴ字ミキサーを使用して、エタノール中の４種の脂質を低ｐＨバッファー中のｍＲＮＡと高速で混合する自己アセンブリプロセスにより、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを製造する。ｍＲＮＡ ＬＮＰの形成は、プロトン化されたカチオン性イオン化可能脂質とアニオン性ｍＲＮＡリン酸骨格との静電結合の後に、脂質が水相から解離して、親水性ＰＥＧ界面によって安定化されるナノ粒子を形成することによって起こる。脂質及びｍＲＮＡの絶対濃度及び相対濃度、バッファーのタイプ、その濃度及びｐＨ、有機相の水相に対する比、ならびに流量を含め、多くの要素が製造プロセスにおいて変化し得る。我々は、相対濃度を変化させずに、脂質及びｍＲＮＡの絶対濃度を一緒に上昇させると、得られるｍＲＮＡ ＬＮＰの送達効率が、典型的には４倍増大し得ることを発見した（図９２）。すべての特許文献及び科学文献は、０．２５ｍｇ／ｍｌに近いｍＲＮＡ濃度に対応する、１２．５ｍＭに近い総脂質の混合濃度を使用する。我々は、これらの混合濃度を例えば６倍上昇させて、総脂質を７５ｍＭ、ｍＲＮＡを１．５ｍｇ／ｍｌとし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで同一の用量において送達効率を４倍ブーストさせる方法を見出した（図９２）。我々は、ｐＨ７．４から５にかけてのゼータ電位の上昇を測定することにより、これらのより効力のあるＬＮＰが、標準条件下でアセンブルしたものと比較して２倍のゼータ電位上昇を呈することを見出した（図９２Ｃ）。この結果は、効力の改善が、ＬＮＰ中のプロトン化されていないイオン化可能脂質のレベルが上がることでエンドソームプロトン化が増大することに部分的に起因することを示唆している。より最近の革新において、我々は、バッファーフリー環境でｍＲＮＡ ＬＮＰのアセンブリを行った。混合時にイオン化可能脂質をプロトン化するためにｍＲＮＡ溶液中に低ｐＨバッファーを使用するのではなく、バッファーフリー水中でｍＲＮＡと混合する前の脂質ミックスにＨＣｌを加えることにより、イオン化可能脂質を前プロトン化（ｐｒｅｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）した。ＴＬＣ－ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲにより、脂質の分解が起こらなかったことを確認した。３つの窒素を有するＣ２４イオン化可能脂質を使用し、イオン化可能脂質当たり０．２５のプロトンを加えることにより、４つの脂質ごとに平均で１つの窒素をプロトン化して、プロトン化された窒素がｍＲＮＡのリン酸と１：１の比になるようにした（ＮＰ比は４であった）。我々のバッファーフリーアセンブリ法は、ＩＭ及びＩＶ投与の両方において、いずれも高い脂質及びｍＲＮＡの混合濃度を使用して、バッファーを使用した場合と比較してさらに高い、ＩＶＩＳによれば３倍のｉｎ ｖｉｖｏ効力をもたらした。したがって、バッファーフリーで、脂質／ｍＲＮＡの絶対濃度が高いアセンブリ方法は、低濃度及び低ｐＨバッファーを使用する現在の製造方法よりも１０倍強力なＬＮＰを作り出すことができ、しかも最終的な製剤の組成を変化させない。前プロトン化法は、本質的に高速かつ不均質なプロセスである脂質の接触及びプロトン化を行うために対流及び拡散を必要とするバッファーよりも正確に、特定のレベルのイオン化可能脂質プロトン化をターゲティングする。高効力のＬＮＰを得るためのこれらの独自開発の製造革新は、あらゆる製造規模で、またマイクロ流体及びＴ字混合の両方の幾何学で、容易に実施されると期待される。我々は、送達効率をさらに上昇させて、用量及び毒性を著しく低減させるとともにｍＲＮＡ ＬＮＰの供給を強化するために、製造プロセスパラメータに対するＬＮＰ効力の依存性を予測的にモデル化することを目指す。
ｍＲＮＡ ＬＮＰの分布、ターゲティング、及び発現は、ＬＮＰ電荷及びリガンド共役に依存する
ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、それらのイオン化特性に関係し得る体内分布及び発現パターンを示す。ＬＮＰの表面上の細胞ターゲティングリガンドはまた、細胞特異的取り込みを増大させることができる。ＩＶ投与では、正に荷電されたＬＮＰが肺をターゲティングし、中性に近いＬＮＰが肝臓をターゲティングし、負に荷電されたＬＮＰが脾臓をターゲティングすることが示されている。これらの研究におけるＬＮＰの電荷は、正に荷電されたイオン化可能／カチオン性脂質と負に荷電されたｍＲＮＡとの比を変化させること、またはこの比を一定に保ち、第５のアニオン性もしくはカチオン性脂質を加えてＬＮＰ電荷を調整することによってコントロールされた。電荷によるターゲティングの背景にある１つの機序は、肝細胞内のＬＤＬ受容体によって認識されるＡｐｏＥなどの血清タンパク質の電荷依存性結合である。肝臓指向性のあるＭＣ３ ＬＮＰなどは、ＡｐｏＥ結合を促進するわずかに負の電荷を有する。これに対し、ＬＮＰの強い負電荷または正電荷は、ＡｐｏＥ結合を妨げ、それによって肝臓ターゲティングを妨げる。負のＬＮＰによる脾臓ターゲティングの場合、脾臓マクロファージ及び樹状細胞がホスファチジルセリンを認識してアポトーシス細胞及び老化赤血球を貪食するため、別の機序が働いている可能性がある。したがって、ホスファチジルセリンのアナログまたは他の負の脂質でＬＮＰを被覆すると、脾臓送達が増強される。５．７の低いｐＫａをもつＬＮＰを生成するイオン化可能脂質は、ＬＮＰを負にすることにもなり、脾臓をターゲティングし、脾臓のＢリンパ球、マクロファージ及び好中球でｍＲＮＡを発現することが示された。サイズも脾臓ターゲティングに関与することが言及されており、おそらく、動脈血を実質細胞に送達する脾類洞における細孔のサイズ（２００～５００ｎｍ）がより大きいことから、より大きなサイズが脾臓に分布し得る。
臓器内の細胞特異的ターゲティングも、ＬＮＰ電荷を調整することによって達成され得る。６．４に近いｐＫａを有するＭＣ３及びＡｃｕｉｔａｓのＬＮＰは、ＡｐｏＥ媒介性ターゲティングを呈し、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、造血細胞、及びＫｕｐｆｆｅｒ細胞におけるいくらかの低発現を伴う、主に肝細胞における発現をもたらす。しかし、より高いｐＫａをもつ第２のイオン化可能脂質を加えて、肝細胞ターゲティングのための６．４に対してＬＳＥＣターゲティングのためのｐＫａ７．１５をもつＬＮＰを生成することにより、細胞ターゲティングが肝細胞からＬＳＥＣにシフトする可能性がある。ｍＲＮＡ－ＬＮＰをワクチンのために筋肉内に注射すると、単球及び樹状細胞、筋細胞、ならびに脂肪細胞を含む多くの細胞型がｍＲＮＡを発現する。我々のグループは、ＩＭ投与におけるＬＮＰ電荷が体内分布に影響を与え、ＭＣ３ ＬＮＰが脈管構造に分布して肝臓で発現するのに対し、より高いｐＫａをもつ負電荷の低いＬＮＰは注射部位及び流入領域リンパ節に留まることを初めて示した。細胞特異的ターゲティングの目標は、リガンドをＬＮＰに共役することでも追求されている。例えば、肺内皮細胞は、血管細胞接着分子ＰＥＣＡＭ－１２１に対する抗体でターゲティングされ、脾臓ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４受容体に対する抗体でターゲティングされた。短いペプチドもＬＮＰターゲティングのために使用されており、例えば、インフルエンザ由来のＧＡＬＡペプチドは、肺内皮をターゲティングし、神経接着分子（ＮＣＡＭ）の１４アミノ酸ペプチドは、骨格筋のターゲティングを可能にした。この提唱の第３の目標は、特定のイオン化／電荷特性、ならびにＬＮＰ表面上のリガンドの特定の密度及び親和性／アビディティを有するＬＮＰを設計し製造することに基づいて、臓器特異的及び細胞特異的なターゲティングを予測するためのモデルを開発することである。
予測モデルは、必要な発現効率、臓器及び細胞のターゲティング、低い毒性／反応原性、ならびにワクチンの場合には適切なアジュバント性及び免疫原性を有するｍＲＮＡ ＬＮＰを製造するために設計される。以下のＡに記載する、我々の最新のイオン化可能脂質のライブラリを使用して、セクションＢは、効率、ターゲティング、毒性、及び免疫原性を決定することが知られている、電荷、エンドソームプロトン化、リガンド密度／親和性などのＬＮＰ特徴を予測するために、ＬＮＰの製剤及び製造パラメータを使用するモデルを開発するように設計されている。セクションＣでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、特定の細胞型への送達及び反応原性／毒性応答を解析する。セクションＤでは、これらのＬＮＰ特徴を、実験的に決定された効率、ターゲティング、毒性及び免疫原性と関連付けるための動物実験を行う。セクションＥでは、統計モデルを使用して複数のレベルで収集されたパラメータデータを関連付けるための機械学習及びマルチレベル機能シミュレーションモジュールの使用について説明する。これらの結果は、性能向上のためのイオン化可能脂質の設計及び製造プロセスを提唱するためのフィードバックを提供する。先行技術と比較して我々の手法が決定的に異なる点は、化学構造、製剤、及び製造に性能を直接関係付けようと試みるのではなく、ＬＮＰの性能を決定することが知られている特徴の精確な測定及びモデル化である。１つの例外は、主にイオン化可能脂質の構造に依存することが知られている分解性についてである。
Ａ）イオン化可能脂質の合成。高い送達効率を有するｍＲＮＡ ＬＮＰを作り出すための上述の手法を使用して、イオン化可能脂質ライブラリを設計した。我々は、イオン化可能脂質の分解性、合成経路の複雑性及びコストを考慮し、立体異性混合物の形成を回避する。我々の最新のイオン化可能脂質は、現在認可されているワクチン中のイオン化可能脂質よりも少ない合成ステップを必要とし、取得コストは１０分の１である。１００を超える合成イオン化可能脂質を有する我々の最新のライブラリについて、後述する分析及びモデル開発を行う。我々の合成産物は、同一性及び純度について、ＮＭＲ分光法、ＦＴＩＲ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、及び燃焼分析を使用して十分に解析されている。
Ｂ）脂質構造、製剤及び製造プロセスパラメータから、ＬＮＰ電荷、エンドソームプロトン化、サイズ、膜破壊能力及びＲＮＡ放出能力、共役脂質密度及び結合親和性を予測するモデルの開発。この提唱において解析及びモデル化を行う、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ－ＬＮＰ発現及びターゲティングの決定因子は、ＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、エンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）、サイズ（ＤＬＮＰ）、イオン化可能脂質膜破壊能力（ＭＤＩＬ）、イオン化可能脂質ＲＮＡ放出能力（ＲＲＩＬ）、ターゲティングリガンド密度（ρＬ）及び結合親和性（ＫＬ）（図９３）である。これらのパラメータは、イオン化可能脂質のイオン化及び構造特性、ならびに製剤パラメータ（脂質のタイプ及びモル比）、製造プロセス（濃度、バッファー、ｐＨ、溶媒比、流量）、及びリガンド共役によって決定される。我々は、イオン化可能脂質特性、製剤パラメータ、及び製造プロセスパラメータから、ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ、ＲＲＩＬ、ρＬ及びＫＬを予測するために、幾つかのモデルを開発する。次に、性能のこれらの一次決定因子（ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ、ＲＲＩＬ、ρＬ、ＫＬ）を、イオン化可能脂質イオン化／構造的パラメータ（ｐＫａ、構造記述子）、製剤パラメータ（第５の脂質の構造／添加法／モル分率、ＰＥＧ脂質構造／添加法／モル分率、共役脂質の構造／添加法／モル分率）、及び製造プロセスパラメータ（脂質／ｍＲＮＡ濃度、バッファータイプ／濃度）と併せて使用して、ｉｎ ｖｉｖｏのｍＲＮＡ分布ならびに特定の臓器及び細胞型における発現レベルと相関付け、それらを予測するとともに、毒性、ならびにワクチンの反応原性及び免疫原性を予測する。
Ｂ１）イオン化可能脂質構造及びイオン化特性からのＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、及びエンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）の予測。初めに、このモデルは、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ－２０００、及び２，０６９塩基のＦＬｕｃ ｍＲＮＡと併せて、ＢＯＤＤ ＰｉｐＺファミリーのメンバー（図９４）を初めに使用して、イオン化可能脂質のみを変更する、固定製剤及び製造プロセスのためのものである。我々は、ある範囲の分子ｐＫａマクロ定数をもたらすように、異なる炭素スペーサーを使用してＢＯＤＤ ＰｉｐＺファミリーの１２のメンバーを合成した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションは、予測どおりに改変されたこれらのマクロ定数の結果として、用量－応答の系統的なパターンを示した。ＢＯＤＤ ＰｉｐＺファミリーメンバーの分子イオン化定数の系統的変化は、得られるＬＮＰのｐＫａ及びｐＩを約２単位の範囲にわたって変化させ、ｉｎ ｖｉｖｏ効率及びターゲティングに劇的な影響を及ぼすと予想される。我々は、計算されたイオン化可能脂質の分子イオン化定数、ならびにＮＭＲによって測定された分子イオン化定数４及び構造記述子（極性原子の数及びタイプ、頭部基の２Ｄトポロジー記述子）を、測定されたｐＨ依存性ＬＮＰ正味電荷（ゼータ電位によるＮＣＬＮＰ）及び表面電荷（ＴＮＳ及び他の表面指示薬によるＳＣＬＮＰ）と関連付け、ＥＰＬＮＰ＝ＮＣＬＮＰ（ｐＨ５）－ＮＣＬＮＰ（ｐＨ７．４）を導出する。ｐＨ依存性（ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ）を測定する我々の方法は公表されている。モデルの一般形態は以下のとおりである：
（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ）＝ｆ（イオン化可能脂質イオン化／構造的パラメータ，ｐＨ）
ここで、ｐＨ依存性は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ（ＨＨ）及びその拡張版に従い、イオン化パラメータは、脂質／水プロトン溶媒和エネルギー差及びイオン化状態依存性を組み込む。このモデルは、イオン化可能脂質の分子イオン化及び構造に基づいて、発現効率及びターゲティングに影響を及ぼすことが知られているＬＮＰ電荷及びプロトン化特性を予測し、設計する。
Ｂ２）熱安定性の解析及びモデル化。我々の最近のｍＲＮＡ ＬＮＰ安定性研究は、ｍＲＮＡ完全性の喪失が保存中の不安定性の主な機序であると記述した、Ｐｆｉｚｅｒ及びＭｏｄｅｒｎａワクチンに関する欧州医薬品庁の公開審査報告書における所見を裏付けた。ＭＣ３と、我々の第１世代Ｃ２４ ｍＲＮＡ ＬＮＰとを保存したところ、これらが４℃で３週間にわたって安定であることが分かった。より高い温度での分解の加速は、我々のＣ２４ ＬＮＰにおけるｍＲＮＡ完全性の喪失が、ＭＣ３ ＬＮＰの完全性の完全な喪失と比較してごくわずかであることを示した。この差はおそらく、ＬＮＰ内の各脂質のｐＫａの差（ＭＣ３は９．４であり、Ｃ２４は８．１である）によるものである。より低いＣ２４のｐＫａは、Ｃ２４ ＬＮＰ中でＭＣ３と比較して低いｐＨを生じさせ、塩基媒介性ｍＲＮＡ切断の動態を緩徐化し得る。このセクションでは、ｐＨ及び温度の依存性を含むｍＲＮＡ安定性の現在のモデルから始め、ある範囲の温度及びｐＨ条件での遊離ｍＲＮＡ及びＬＮＰ中のｍＲＮＡの安定性分析と予測を比較する。フラグメント分析のためにクロロホルム／メタノールを使用してＬＮＰ中のｍＲＮＡを抽出する。脂質安定性も測定する。異なるｐＫａマクロ定数を有する様々なイオン化可能脂質をＬＮＰ中に配合して、ｍＲＮＡ分解動態に対するこのパラメータならびに温度及びｐＨの役割を評価する。次の形態のモデルを確立する：
（ｍＲＮＡ分解）＝ｆ（温度，ｐＨ，イオン化可能脂質イオン化／構造的パラメータ）
このモデルは、製造及び分布における重要な特徴であるｍＲＮＡ安定性の予測的設計を可能にする。
Ｂ３）ＬＮＰ製剤パラメータからのＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、エンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）、サイズ（ＤＬＮＰ）、イオン化可能脂質膜破壊能力（ＭＤＩＬ）及びＲＮＡ放出能力（ＲＲＩＬ）の予測。このモデルは、初めは固定ＮＰ比（４）及びＣ２４などのイオン化可能脂質のためのものであり、脂質成分／比をｐＨ依存性ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ及びＲＲＩＬと関連付ける。脂質成分については、Ｃ２４、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ－２０００を初めに使用し、Ｃｈｅｎｇに従って負または正に荷電された第５の脂質を加える。我々は、ｍＲＮＡと混合する前に脂質に負の１８－１ＰＡを加えることにより、ルシフェラーゼレポーターのＩＶ投与の際に、脾臓発現の２～３倍の増大を伴って、肝臓発現が大きく低減することを見出した（図９６）。これらの効果は、１８－１ＰＡが負に荷電されたＬＮＰを作り出すことに起因すると考えられるが、これまで、これらのＬＮＰの表面電荷または正味電荷の測定は行われていない。我々は、これらの測定を行って、このシミュレーションモジュールを開発することを提唱する。１８－０ＰＡ、１８－１ＰＡ、１８－２ＰＡなど、幾つかの負の脂質を使用する。ここで、二重結合を２から０に低減させると、脂質がＬＮＰの表面寄りに移動してＬＮＰ内部から離れると予想される。また、混合前のエタノール中の他の４種の脂質に１８ＰＡを加えるのではなく、ＬＮＰ表面への１８ＰＡの挿入を促進する混合型の水性／有機／電解質溶媒中で、混合後希釈ウェルにおいてＬＮＰをインキュベートすることにより、ＬＮＰ表面上に直接１８ＰＡを配置する。ＤＯＴＭＡ及びＤＯＴＡＰなどの正に荷電された脂質を第５の脂質として使用して、肺への分布を推進する。また、正または負に荷電されたＰＥＧ脂質も使用する。ＰＥＧアルキル尾部の長さの変更は、ＰＥＧ鎖自体の長さと同じく、シェディング及び細胞取り込みに強く影響するため、これを行う。最後に、より効果的にＴ細胞をトランスフェクトするために、ＰＥＧ－ＤＭＧ－２０００の代わりにアナログも用いる。ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ、ＲＲＩＬを上述のように測定し、これを次の一般形態によって第５の脂質及びＰＥＧ脂質構造／添加法／モル分率と関連付ける：
（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ）＝ｆ
（第５の脂質の構造／添加法／モル分率，ＰＥＧ脂質構造／添加法／モル分率，ｐＨ）
このモデルは、電荷、サイズ、膜不安定化及びＲＮＡ放出パラメータを、ＬＮＰ中の第５の脂質及びＰＥＧ脂質のタイプならびにそれらの割合及び添加法と関連付けることにより、ＬＮＰターゲティング及び発現の予測を可能にする。第２段階では、ＬＮＰ電荷も改変させるイオン化可能脂質の設計を行う。
Ｂ４）ＬＮＰ製造プロセスパラメータからのＬＮＰ正味電荷（ＮＣＬＮＰ）、表面電荷（ＳＣＬＮＰ）、エンドソームプロトン化（ＥＰＬＮＰ）、サイズ（ＤＬＮＰ）、イオン化可能脂質膜破壊能力（ＭＤＩＬ）及びＲＮＡ放出能力（ＲＲＩＬ）の予測。このモデルは、標準的モル比のＣ２４／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ－２０００及び２，０６９ヌクレオチドＦＬｕｃ ｍＲＮＡとのＮＰ比４から開始する、限られた数（約５）の固定製剤及びイオン化可能脂質を使用する実験に基づく。我々は、ｍＲＮＡ ＬＮＰの効力を増大させる２つの新規ＬＮＰアセンブリ方法を発見した。序論で上述したように、両方の方法が、混合前に上昇した濃度の脂質及びｍＲＮＡを必要とする。より最近発見された第２の方法は、ｍＲＮＡ溶液からバッファーを除去し、エタノール中のイオン化可能脂質へのコントロールされたＨＣｌの添加によってイオン化可能脂質を直接プロトン化し、上記に示したように、既に効力のほぼ１０倍の増大をもたらすことができる。バッファー含有法でのゼータ電位を測定したところ、負寄りの高ｐＨプラトーと、その結果として、エンドソームプロトン化を表すｐＨ低下（７→５）中のゼータ電位のさらなる上昇とが見られた。このバッファー含有法はＤＬＮＰを約２０ｎｍ増大させたが、さらに高い効力のバッファーフリー法はＤＬＮＰを変化させない。これらのプロセス変化についてＭＤＩＬ及びＲＲＩＬに関するデータはなく、ＣｒｙｏＴＥＭからの超構造情報はごくわずかしかない。ここで我々は、Ｃ２４ ＬＮＰを使用し、ある範囲の脂質／ｍＲＮＡ濃度、バッファー濃度、及びバッファーの非存在下でのイオン化可能脂質プロトン化のレベルを使用してそれをアセンブルすることで、これらの新規のＬＮＰアセンブリ及び製造プロセスの解析を完了することを提唱する。ＮＣＬＮＰ、ＳＣＬＮＰ、ＥＰＬＮＰ、ＤＬＮＰ、ＭＤＩＬ、ＲＲＩＬを測定するとともに、ＣｒｙｏＴＥＭイメージングならびにＳＡＸＳ（小角ｘ線散乱）及びＳＡＮＳ（小角中性子散乱）を使用した散乱法から超構造情報を取得する。我々は、変性脂質を使用して脂質成分の分布に関する具体的な情報を取得するコントラスト変調ＳＡＮＳを含む、これらの超構造法を確立しており、これらの超構造データからパラメータ／記述子を定義して、アセンブリプロセスパラメータと関連付ける。これらの異なるアセンブリ条件でＣ２４ ＬＮＰを解析したら、さらなる目的のＬＮＰを解析する。特定のＬＮＰについては、以下の一般形態でモデルを取得する：
（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，超構造的パラメータ）＝ｆ（脂質／ｍＲＮＡ濃度，バッファータイプ／濃度，バッファーなしのプロトン化レベル，ｐＨ）
このモデルは、脂質／ｍＲＮＡ／バッファー濃度、及びバッファーフリー環境におけるイオン化可能脂質のプロトン化のレベルを変化させるアセンブリ及び製造条件から、電荷、サイズ、膜不安定化、ＲＮＡ放出、及び超構造的パラメータを予測することを可能にする。
Ｂ５）ｍＲＮＡ ＬＮＰの連続体力学及び分子動力学モデル。このモジュールの目的は、ＬＮＰ効力に関連するｍＲＮＡ ＬＮＰ構造及び特性を生じさせる混合及びアセンブリプロセスについての知見を提供することである。拡散式及び化学反応式と組み合わせた連続流体力学を使用して、マイクロ流体及びＴ字混合の幾何学をモデル化する。エタノール及び水性ニュートン流体は、２つの溶媒の混合の幾何学ならびに流量及び比に依存する様式で混合する。混合された溶媒エタノール／水は、非理想性のために一方の溶媒単独よりも約３倍高い粘度を有し、これが考慮される。ｍＲＮＡ、脂質成分、及びバッファーは、濃度依存性を有する、文献から得られた拡散定数をもつ連続溶質として扱われる。ｐＨに依存して荷電され得る溶質（バッファー、イオン化可能脂質）及び恒久的に荷電したｍＲＮＡは、局所的な正味の電気的中性ならびに適切なｐＫａをもつバッファー及びイオン化可能脂質のＨＨ式に従う。初期シミュレーションによって２つの流体の流動及び混合パターンを決定し、拡散及び電気的中性ならびにＨＨ式を考慮して、ｍＲＮＡ、４つの脂質、イオン化可能脂質プロトン化及びｐＨの空間的集中を計算する。混合中のＬＮＰアセンブリは、脂質不溶性を生じさせる、脂質及びｍＲＮＡの濃度、及びイオン化可能脂質のプロトン化、ならびに増大した局所的含水量の閾値により、すなわち、これらの特徴の４つすべてが同じ位置で発生した場合に、核形成すると予想される。最終的なＬＮＰ効力に影響を及ぼすことが分かっている、脂質、ｍＲＮＡ及びバッファー濃度の異なる値について、シミュレーションを実行する。脂質、ｍＲＮＡ、イオン化可能脂質プロトン化、局所的含水量、及びｐＨの空間的集中を、高効力アセンブリ条件と低効力アセンブリ条件とで比較する。低濃度混合では、マイクロ流体チャネルに空のリポソーム及びＲＮＡ含有構造の混合集団が観察されたが、高濃度では、これらの構造は融合しているように見える（図９７Ｃ）。我々の仮説によれば、これらの特徴は、混合中の脂質、ｍＲＮＡ、プロトン化されたイオン化可能脂質、及び局所的含水量の空間的重複の程度によって説明できる。我々は、バッファーを除去し、所定のイオン化可能脂質プロトン化を用いるシミュレーションを実行して、第２の高効力アセンブリ法をモデル化する。ある範囲のｍＲＮＡ ＬＮＰ効力をもたらす条件を用い、マイクロ流体及びＴ字混合の両方の幾何学について調査する。計算される重要なパラメータは以下のとおりである。
ＦＮＭＬ、臨界閾値を超えるイオン化可能脂質プロトン化及び含水量（それぞれ初期＞２５％及び＞５０％）と併せた高い脂質及びｍＲＮＡの濃度の重複によって特徴付けられるｍＲＮＡ－ＬＮＰ核形成事象の頻度。
ＰＮＩＬ、ＦＮＭＬ事象と関連する核形成時のプロトン化のレベル（２５～１００％の範囲内）。
ＦＮＬ、高いｍＲＮＡ濃度または臨界閾値未満（＜２５％）に留まるイオン化可能脂質プロトン化のいずれかの欠如によって特徴付けられる空のＬＮＰの核形成事象の頻度。
我々の考えによれば、ＦＮＭＬが高ければＬＮＰの効力が高くなり、ＦＮＬが高ければＬＮＰの効力が低くなる。また、我々の仮説によれば、ＰＮＩＬは、プロトン化されたイオン化可能脂質がｍＲＮＡとイオン的に複合体化するためには臨界閾値（すなわち２５％）超である必要があるが、我々のゼータ電位測定が示すように、プロトン化されていないイオン化可能脂質がエンドソーム内でプロトン化するために複合体内にあるようにするには、上限閾値（すなわち７５％）未満である必要がある。ここで注意すべきなのは、ＬＮＰが透析またはＴＦＦによってｐＨ７．４まで中和されたとしても、アニオン性ｍＲＮＡリン酸骨格に結合したプロトン化されたイオン化可能脂質のｐＫａは、静電気のため、未結合のプロトン化されたイオン化可能脂質に対して２ポイントほど上方にシフトし得るという点である。これは、結合時にプロトン化を維持することを強く優先するため、追加のプロトン化されていない未結合のイオン化可能脂質がＬＮＰ内に存在することが、エンドソーム放出のために必要となる。我々は、層流マイクロ流体及び乱流Ｔ字混合の両方の幾何学、ならびに異なる流量及び溶媒比について、以下の形態の一般的関係を導出する：
（ＦＮＭＬ，ＰＮＩＬ ＦＮＬ）＝ｆ（ｍＲＮＡ／脂質濃度，バッファー濃度，バッファーなしの前プロトン化レベル）
このモジュールの第２の補足的態様として、分子動力学シミュレーションを使用して、高濃度対低濃度の脂質／ｍＲＮＡ、ならびに上記の連続体シミュレーションから得られる異なるレベルのイオン化可能脂質プロトン化及びバッファー濃度を用い、ＬＮＰ効力に影響を与えることが知られている条件下で、局所分子イオン化可能脂質／ｍＲＮＡ結合及びＬＮＰアセンブリをモデル化する。ここで、我々の考えによれば、高レベルのイオン化可能脂質プロトン化と合わせた、低い脂質／ｍＲＮＡの濃度によって、高度にプロトン化されたイオン化可能脂質がｍＲＮＡ骨格を覆い、余剰のプロトン化されたイオン化可能脂質がこれらの構造の周りに凝集した、均質なアセンブリがもたらされる。より高い濃度では、ｍＲＮＡ骨格の内部部分はプロトン化されたイオン化可能脂質に結合しておらず、外部ｍＲＮＡドメインはプロトン化されたイオン化可能脂質に結合しており、余剰のプロトン化されていないイオン化可能脂質がこれらの構造を包囲している、より粗い構造が観察され得る。我々は、二重層及び細胞質ゾル条件と相互作用する後者の構造をモデル化して、これらが細胞内でより容易に放出されるかどうかを決定する。結合時のｐＫａシフトを明確にモデル化して、重要な可能性があるこの特徴の重要性を評価する。高効力アセンブリの第２の方法をモデル化するために、高濃度及び低濃度の両方の体制で、バッファーを除去し、様々なレベルにイオン化可能脂質を前プロトン化して、その結果生じる、イオン化可能脂質のプロトン化されたフラクション及びプロトン化されていないフラクションの構造及び分布を観察する。
我々の考えによれば、１）高濃度混合は、ｍＲＮＡがより容易に放出される、より粗いイオン凝集体を生成することができ、２）イオン化可能脂質の前プロトン化のレベルがより低い場合、エンドソーム放出に関与できるプロトン化されていない種が、バッファーに依存しない規定レベルで存在するため、より効力が高い。このセクションのモデルは、高効力ｍＲＮＡ ＬＮＰをもたらす製造プロセスパラメータについての理解を提供するであろう。
Ｂ６）リガンドターゲティングＬＮＰのｃＧＭＰに準拠した生産ならびにリガンド密度ρＬ及び結合親和性の測定。現在のリガンド共役ＬＮＰは、細胞特異的ターゲティングを少なくとも１０倍増大させるが、コントロール及びｃＧＭＰ製造基準準拠が困難な生産方法（ＬＮＰへの直接的な化学共役または後挿入）という難点を有する。肝臓のような臓器における高レベルの非特異的発現が残り、これも解決が難しい。ここで我々は、リガンド保有ＬＮＰを生産し、リガンド密度（ρＬ）及びターゲットへの結合親和性（ＫＤＬ）を数量化し、ＬＮＰ電荷をコントロールすることによってオフターゲット発現を低減させるための、ｃＧＭＰに準拠した自己アセンブリ法の開発を提唱する。ＬＮＰへの共役に成功したＣＤ４ Ｔ細胞ターゲティング抗体から始め、ＰＥＧ部分に部位特異的に連結することができるｓｃＦｖ抗ＣＤ４タンパク質を使用する。ミセル後挿入法を用いるのではなく、抗マウスＣＤ４ ｓｃＦｖを単量体ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－マレミドに直接的に化学共役し、ＬＮＰのマイクロ流体混合後の希釈ウェルにおける配置及びＬＮＰ表面への組み込みのために単量体状態を維持する有機／水性／電解質溶媒条件を特定する。我々は既に、マイクロ流体チャネルで生成されるＬＮＰの構造を維持するように、または典型的に発生するＬＮＰ融合を誘導するように、有機／水性／電解質溶媒条件を改変した。したがって、ＬＮＰ安定性のコントロール及びＬＮＰ表面への共役脂質の組み込みのコントロールが可能な、希釈ウェルにおける複数の有機／水性／電解質溶媒条件のスクリーニング研究を行うことが可能になる。得られるＬＮＰを遠心濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ）によって未結合ｓｃＦｖから分離し、ＬＮＰ含有濃縮物及び濾液中のタンパク質含有量を測定して、ＬＮＰと会合したリガンドの量を評価する。この結合リガンド量を、ナノ粒子追跡によって得られる粒子数、及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって得られるｍＲＮＡ含有量に対して正規化して、ＬＮＰ当たりのｓｃＦｖの数としてのリガンド密度ρＬの内容、及び代替的にｓｃＦｖのｍＲＮＡに対する質量比またはモル比を求める。ＣＤ４リガンドとの抗ＣＤ４共役ＬＮＰの結合親和性であるＫＤＬは、我々の研究室で以前に開発された方法を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び等温滴定熱量測定（ＩＴＣ４４）を使用して測定される。こうしたリガンド密度及び結合親和性の定量的評価に加えて、インキュベーション及びリガンドへのＣＤ４の結合によるコントラスト増強を用いるネガティブ染色、ならびに金標識抗体免疫染色の両方を使用してｓｃＦｖ分布を可視化するために、ＣｒｙｏＴＥＭ（ＤＴＥＭＬ）によってリガンド分布をイメージングする。生産方法を選択したら、溶媒条件及び希釈ウェル内の共役脂質濃度を改変することにより、ある範囲のリガンド密度及び親和性／アビディティをもたらす。次いで、細胞及び動物試験用の最終的なＬＮＰを、正味電荷及び表面電荷について解析する。後の段階では、電荷媒介性ターゲティングをリガンド媒介性ターゲティングと組み合わせて協調させるために、上記Ｂ１及びＢ４の方法を使用してリガンド共役ＬＮＰの電荷を改変する。例えば、電荷の調整は、脾臓Ｔ細胞をターゲティングするＬＮＰの肝臓におけるオフターゲット発現をなくす見込みがある（図９６）。この公開されているＣＤ４ターゲティングＬＮＰのｃＧＭＰ生産での使用、及び肝臓発現の消失が、この手法の最初の概念実証になる。第２の概念実証は、神経接着分子（ＮＣＡＭ）のペプチドリガンドを提示して骨格筋をターゲティングするためにこれらの方法を適用することである。ここで、より小さいタンパク質成分は、ＬＮＰ表面におけるその組み込みに必要な有機／水性／電解質溶媒条件を著しく改変する。プロトタイプＣ２４ ＬＮＰ及び抗ＣＤ４ ＰＥＧ脂質についてこのモジュールの初期段階で導出される具体的なモデルの成果は、次の一般形態によって表される：
（ρＬ，ＫＤＬ，ＤＴＥＭＬ）＝ｆ（有機／水性／電解質溶媒条件，リガンドタイプ／濃度）
このセクションで導出される方法及びモデルは、特徴付けられたリガンド密度及び親和性と共に様々なリガンドタイプ（抗体、ペプチド）を提示するＬＮＰの製造のコントロールを可能にする。
Ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏの送達効率、毒性、及び反応原性の評価。
Ｃ１）送達効率のＩｎ ｖｉｔｒｏ評価。ルシフェラーゼレポーターを使用したｍＲＮＡ ＬＮＰトランスフェクションの方法を、容易にトランスフェクト可能な細胞（ＨＥＫ２９３）、浮遊細胞（ＣＨＯ）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、筋細胞（Ｃ２１２）、マクロファージ（ＲＡＷ）、肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ならびにＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及び初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を表す細胞型に対して行う。代謝毒性をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって評価する。ここで確立される関係は次のとおりである：
細胞（ｊ）内の（効率，毒性）＝ｆ（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，ρＬ，ＫＤＬ，用量）
Ｃ２）毒性及び反応原性のＩｎ ｖｉｔｒｏ予測因子。自然免疫反応原性をＬＮＰの構造及びｍＲＮＡ ＬＮＰの製法と関連付けるため、自然免疫活性化の無細胞アッセイ及び細胞ベースのアッセイでハイスループットスクリーニングを行う。血漿中の補体及びＦＸＩＩａの活性化は、ＬＮＰが誘導する急性アナフィラキシー様反応の潜在的な推進力であると考えられている。補体活性化は、ヒトのクエン酸添加血漿をＬＮＰに曝露した後に、Ｃ３チモーゲンのＣ３ｂへの変換のウエスタンブロット分析を行うことによって測定される。ＬＮＰが血漿と接触した後にアニオン性ＲＮＡ表面が露出すれば、これは、アナフィラキシーに関係する血管拡張因子であるブラジキニンを生成する第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）活性化につながる可能性がある。接触経路の開始ステップとして、ＦＸＩＩ活性化には、凝固障害のリスクを高め得るトロンビンの生成が続く。ＲＮＡ ＬＮＰによるＦＸＩＩ活性化は、アニオン性表面が、カルシウムの添加後にさもなければ凝固できない微粒子除去済みの血漿のバースト凝固を誘導し得る、我々の研究室で開発されたトロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）アッセイを使用して測定される。細胞ベースの反応は、肺（約ｐＨ７．４）及び血管外空間（約ｐＨ６．７）で見られるｐＨレベルにおける漸増するＬＮＰ投与量による赤血球の溶血及び浸透圧脆弱性を含む。我々は既に、ｅＧＦＰをコードするＬＮＰをヒトのヘパリン添加血と共に４時間３７℃でインキュベートすることにより、ＬＮＰが末梢血白血球において自然免疫活性化を誘導する可能性を評価し、次いで反応原性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－８）の生成を測定した。未改変のヒト全血を用いる新規の培養血餅アッセイでもＬＮＰを試験しており、ここでＣ２４ ＬＮＰは、ＭＣ３ ＬＮＰよりも低い反応原性を有していた。培養された血餅細胞は２４時間後にｅＧＦＰを発現したが、ヘパリン添加血ではｅＧＦＰ発現が見られず、このことは、我々の新規の培養血餅アッセイが、ＬＮＰ製剤の毒性及び発現のスクリーニングのために優れていることを示唆している。ＬＮＰをスパイクした培養血餅のＲＮＡｓｅｑにより、ＬＮＰ ｍＲＮＡ発現が、良好な適応免疫応答に先行する特異的自然免疫応答に関連しているという仮説を試験することが可能になる。ここで確立される関係の一般形態は次のとおりである：
（ＦＸＩＩ活性化，補体活性化，炎症性／抗原提示サイトカイン）＝ｆ（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，ρＬ，ＫＤＬ，イオン化可能脂質記述子，用量，ｐＨ）
このモデルは、ＬＮＰの特徴に基づいて毒性及び反応原性応答を予測する。
Ｄ）齧歯類及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおける送達効率、ターゲティング、及び毒性／反応原性の評価。上記の予測モデルを使用して設計されたｍＲＮＡ ＬＮＰを、マウス、ラット、及びＮＨＰモデルにおいて、臓器特異的及び細胞特異的な送達効率、ならびに毒性について解析する。
Ｄ１）発現及びターゲティングのマウスモデル評価。マウスへのＩＶ投与では、Ａｉ６ ＲＣＬ－ＺｓＧｒｅｅｎ１トランスジェニックマウスにおいて、ｍＲＮＡにコードされた３つのレポーター：ルシフェラーゼ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣｒｅリコンビナーゼレポーターを使用して、肝臓、肺、脾臓、リンパ節、心臓、骨髄、骨格筋、眼、脳、精巣及び卵巣へのｍＲＮＡ発現、ならびに発現と無関係の体内分布を評価する。ルシフェラーゼレポーターについてはＥｘ ｖｉｖｏ ＩＶＩＳイメージングを使用し、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣｒｅで活性化されたＺｓＧｒｅｅｎについては組織診断及びフローサイトメトリーを使用する。投与後の最初の７２時間以内に、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣｒｅレポーターを受けた動物の臓器をホモジナイズし、既報のようにフローサイトメトリーのために細胞を酵素で遊離させる。Ｃｒｅ－ＲがＡｉ６モデルで発現されると、細胞は恒久的に緑色であるが、いくらかの不均質性のある細胞型に依存し得るレベルであるため、これら２つのレポーターは相補的である。ｍＣｈｅｒｒｙ発現は一過性であるが、ｍＲＮＡ翻訳の強度を示し得る。
以下の臓器特異的ターゲティングの５つの尺度を導出する：
臓器（ｉ）ＩＶＩＳ発現＝４時間における積分された臓器ＩＶＩＳシグナル（光子／秒）
臓器（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙＦ発現＝臓器ごとの積算された細胞ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度（Ｆｌｕｏ／臓器）
臓器（ｉ）ＺｓＧｒｅｅｎＦ発現＝臓器ごとの積算された細胞ＺｓＧｒｅｅｎ蛍光強度（Ｆｌｕｏ／臓器）
臓器（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙＣ発現＝臓器ごとの積算されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞（Ｆｌｕｏ／臓器）
臓器（ｉ）ＺｓＧｒｅｅｎＣ発現＝臓器ごとの積算されたＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞（Ｆｌｕｏ／臓器）
フローサイトメトリーでは、間質細胞、血液細胞、抗原提示細胞、及び臓器特異的細胞型の特異的マーカーが、細胞型ごとにｍＣｈｅｒｒｙ及びＺｓＧｒｅｅｎの発現を示し、次の指標を提供する：
臓器（ｉ）中の細胞（ｊ）のｍＣｈｅｒｒｙＦ発現＝積算されたｍＣｈ蛍光強度（ｊ）細胞／総強度
臓器（ｉ）中の細胞（ｊ）のＺｓＧｒｅｅｎＦ発現＝積算されたＺｓＧ蛍光強度（ｊ）細胞／総強度
臓器（ｉ）中の細胞（ｊ）のｍＣｈｅｒｒｙＣ発現＝積算されたｍＣｈ陽性（ｊ）細胞／総陽性細胞
臓器（ｉ）中の細胞（ｊ）のＺｓＧｒｅｅｎＣ発現＝積算されたＺｓＧ陽性（ｊ）細胞／総陽性細胞
ＩＶ投与では、細胞特異的発現が初めは脾臓及び肝臓に限定されるが、すべての解剖臓器についてＩＶＩＳ指標が取得される。肝臓単細胞懸濁液では、マーカー：（ＡＳＧＲ１、ＣＤ１６／ＣＤ３２、ＣＤ３１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０９、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＥＳＡＭ、Ｌｙ－６ｇ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３ｅ、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ、Ｔｉｍ－４、ＣＤ２０６、Ｆ４／８０、ＣＤ２４、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ）を使用して肝細胞、類洞内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、好中球及び樹状細胞を示すために細胞表面マーカーが使用される。脾臓単細胞懸濁液では、細胞表面マーカーは、マーカー：（Ｂ２２０、ＣＣＲ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１６９、ＣＤ２０６、Ｍａｃ２、Ｍａｃ３、ＭｅｒＴＫ、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ、ＣＤ２４、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ）を使用してＴリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、樹状細胞を示す。組織診断では、定量的組織形態計測画像分析を使用して、陽性発現を示す細胞型ごとの面積率（％）として細胞型特異的発現を評価する。発現と無関係の体内分布を評価するためには、臓器ホモジネートに対して分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイを使用する。追加の臓器も処理前に灌流して間質内のＬＮＰを除去し、次いで臓器の単細胞懸濁液についてｂＤＮＡでアッセイし、懸濁液中のｂＤＮＡ及び発現を測定する。上記の臓器特異的及び細胞特異的な発現及び分布のデータを、先述のセクションで解析されたＬＮＰパラメータと、次のタイプの一般化モデルによって関連付ける：
臓器（ｉ）発現／分布＝ｆ（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，ρＬ，ＫＤＬ，用量）
細胞（ｊ）臓器（ｉ）発現／分布＝ｆ（ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，ρＬ，ＫＤＬ，用量）
我々は、発現及びターゲティングを推進することが知られているＬＮＰの特徴が上記式の右辺にあるため、上記の関係は一般化可能であり、ＬＮＰ設計における指針になると予想する。また、マルチレベルモデルの第２段階では、このデータセットを十分に活用するために、イオン化可能脂質構造記述子、製剤及び製造パラメータとの潜在的な関係を探究する。大きな作成空間及び製造の改変と組み合わせた、我々の非常に多様なイオン化可能脂質ライブラリは、ターゲティングを劇的に変化させる能力を提供するであろう。図９４のイオン化可能脂質ファミリーに関する初期の所見を使用してベースラインを設定し、次に他のライブラリファミリー及び候補をサンプリングして、設計空間のターゲティングを策定する。これらの結果は、さらなるイオン化可能脂質の設計及び製剤／製造の変更における指針となるであろう。
マウスへのＩＭ投与では、上述の同じ評価を使用するが、さらに、注射部位及び流入領域リンパ節のｅｘ ｖｉｖｏ ＩＶＩＳイメージングを追加する。注射部位及び流入領域リンパ節を、上記のように、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＺｓＧｒｅｅｎの発現についてフローサイトメトリーで分析し、脾臓細胞について上掲したマーカーを使用することで、好中球、単球、好酸球、好塩基球、マスト細胞及び樹状細胞を識別する。注射部位の組織学的分析は、ＩＶ投与について上述のとおりであり、筋細胞及び脂肪細胞を具体的に含む。このセクションの成果は、これらの性能パラメータに強く影響することが予想されるが、これまでにターゲティング及び発現と関連付けられたことがないＬＮＰ特徴に対して、臓器及び細胞特異的なターゲティング及び発現を予測する。その結果は、これらの依存関係を明らかにし、ｍＲＮＡ ＬＮＰのターゲティングされた発現をさらに改善する新たなイオン化可能脂質、製剤及び製造プロセスを設計する際の指針を提供するはずである。
Ｄ２）毒性及び反応原性のマウスモデル評価。ｉｎ ｖｉｖｏヒドロラーゼによって切断され、尿及び糞便中に排出されるのに十分に小さく十分な親水性があるフラグメントを生成する分解性エステルをイオン化可能脂質に組み込むことにより、ＬＮＰの毒性を低減させた。ＭＣ３中の緩徐に分解する単一の第二級エステルは、非常に緩徐な排除時間及び組織に蓄積する強い傾向をもつジリノール酸を生成する。追加の分解性エステルをアルキル尾部に組み込むと、分解が加速した。急速に分解される第一級エステルをＭｏｄｅｒｎａのイオン化可能脂質の分岐鎖に組み込んだ場合にも、ＩＶ投与（６１）後の齧歯類において、ＭＣ３よりも大幅に速い分解が生じ、全身毒性が低減し、さらに、ＩＭ投与後の注射部位炎症も低減した。ＭＣ３よりも低い毒性を生じた複数の第一級エステルを含む別のイオン化可能脂質を比較した別のグループからも同様の所見が報告された。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ分解の速度は、毒性及び反応原性の決定において重要な因子である。我々の最新のイオン化可能脂質ライブラリには、様々な予測可能なサイズをもつフラグメントを生成する０～６つの分解性エステルを含む構造を有する、１００を超える独自開発の合成化合物が含まれている。これらの分解性特徴を記述する化学記述子は、毒性及び分解性のｉｎ ｖｉｖｏ測定値と関連付けられる。抽出された組織のホモジネートに適用される、公開されているＬＣ－ＭＳ法を使用して、分解性をｉｎ ｖｉｖｏで測定する。血清中の全身性サイトカインならびに血液及び肝臓／脾臓病理組織におけるＡＬＴ及びＡＳＴレベルを測定する確立された方法を使用して、毒性を評価する。ＩＭ投与では、注射部位及び流入領域リンパ節の組織ホモジネート中の炎症促進性サイトカインも評価して、毒性及びＡＰＣ活性化と相関付ける。組織学的分析には、注射部位及び流入領域リンパ節における炎症応答に関与する細胞型を特定するための免疫染色が含まれる。これらの結果から、次の関係を確立することができる：
（分解性，炎症／ＡＰＣ活性化）＝ｆ（イオン化可能脂質記述子，ＬＮＰ記述子，用量）
Ｄ３）免疫原性及びアジュバント性のマウスモデル評価。ｍＲＮＡワクチンに使用されるＬＮＰは、高い送達効率を提供することに加えて、流入領域リンパ節における抗原特異的濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞及び胚中心Ｂ（ＧＣ Ｂ）細胞の数を増やすアジュバントとして作用する必要がある。このＬＮＰ特異的アジュバント活性は、免疫グロブリンのクラススイッチ、親和性成熟、ならびに長期のＢ細胞記憶及び形質細胞（６４）の発達を推進するのに役立つ。これらの効果はイオン化可能脂質に依存することが知られているため、流入領域リンパ節及び脾臓における抗原特異的Ｔｆｈ及びＧＣ Ｂ細胞の応答を測定し、これらをイオン化可能脂質の構造的特徴と関連付ける。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最新のｍＲＮＡコードヌクレオシド修飾型免疫原であるジプロリン安定化スパイクタンパク質（Ｓ２Ｐ）を使用して、免疫原性を評価する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルスに対する結合力価及び中和力価を、最近発表されたように（５）、０．１～１μｇの低用量でのプライム及びブースト後のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて測定する。ここで決定される関係は次のとおりである：
（力価，Ｔｆｈ，ＧＣ Ｂ）＝ｆ（イオン化可能脂質記述子，ＮＣＬＮＰ，ＳＣＬＮＰ，ＥＰＬＮＰ，ＤＬＮＰ，ＭＤＩＬ，ＲＲＩＬ，ρＬ，ＫＤＬ，用量）
注射部位及び流入領域リンパ節における細胞応答及びサイトカイン応答の上記分析を空間的トランスクリプトミクスで補う。トランスクリプトームプロファイルは、免疫活性化、脂質代謝、及び毒性を示し、特定のイオン化可能脂質の特徴によって誘導される分子事象の動態を表現する。
Ｄ４）発現、ターゲティング、毒性、反応原性、免疫原性のラット及び非ヒト霊長類モデル評価。ラット及び非ヒト霊長類における研究はヒト研究のための必要条件であり、種依存性を明らかにし得るため、上記の比較的ハイスループットのマウスモデルを、ラット及び非ヒト霊長類で行われる厳選された研究でフォローアップする。非ヒト霊長類は齧歯類モデルとの明確な差異を示すことが多く、ラットにおけるＬＮＰターゲティングの事例報告は、ラットがマウスよりも非ヒト霊長類に近いものを表し得ることを示唆している。したがって我々は、このプロジェクトの２年目に、ターゲティングに関する厳選されたラット研究を上述と同様に行う。３年目には、その時点までに得られたデータ全体に基づいて、限られた数の非ヒト霊長類研究を行う。
Ｅ）予測モデルの開発。上記セクションＢに記載したように、性能に強く影響することが現在予想されているＬＮＰ特徴と、セクションＣ及びＤで測定されたｍＲＮＡ ＬＮＰ性能を関連付ける予測モデルを開発するために、上記の研究で生成されたデータセットを使用する。これらのＬＮＰ特徴は、化学構造、製剤パラメータ、及び製造プロセスに依存しており、重層的な相互依存するモデルのセット、及びこれらのモデルを開発するために使用される基礎的データを作成する。したがって我々は、潜在的な関係を理解するために、複数のレベルで収集され、統計的かつ機構的に（上記で開発されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して）モデル化されるパラメータデータを関連付ける、機械学習、知識ネットワーク、及びマルチレベル機能シミュレーションモジュールを開発する。分子、製剤、及び製造のパラメータを使用して、性能に影響することが知られているＬＮＰ特徴を予測し、これらのＬＮＰ特徴を使用して、動物モデルにおける発現、ターゲティング、及び毒性などの性能を予測する。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験から生成されたデータによって誘導され、チューニングされる。これらの予測モデルは、異なるドメイン（分子、製剤、製造、ＬＮＰ、性能）から適切な変数を特定するのに役立つ最先端の機械学習アルゴリズムを使用して訓練される。予測性能及び個々の変数の重要性は、交差検証ストラテジーに基づいて厳密に評価される。
前述の詳細な説明及び付随する実施例は、例示であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ決定される本発明の範囲に対する制限と解釈されてはならない。
当業者には、開示された実施形態に対する様々な変更及び修正が明らかとなるであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法を含むがこれに限定されない、そのような改変及び修正は、本発明の趣旨及び範囲の中にあることが意図されている。
本明細書に引用されているすべての特許、出願、または非特許文献及び参照配列情報などの他の参照文献に関しては、あらゆる目的のために、また、示されている提議について、それらの全体が参照により組み込まれることを理解されたい。参照により組み込まれている文書と本願との間に何らかの矛盾がある場合には、本願が優先する。本願において開示される参照遺伝子配列に関連するすべての情報、例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的アノテーション、対立遺伝子バリアント、及び参照ｍＲＮＡ（例えば、エキソン境界または応答エレメントを含む）及びタンパク質配列（保存ドメイン構造など）を含むＧｅｎｅＩＤまたはアクセッション番号（典型的にはＮＣＢＩアクセッション番号を参照する）など、ならびに化学の参照文献（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ｃｏｍｐｏｕｎｄ、ＰｕｂＣｈｅｍ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ、またはＰｕｂＣｈｅｍ Ｂｉｏａｓｓａｙエントリー（構造及びアッセイなどのような、その中のアノテーションを含む））は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願で使用される見出しは、便宜上のものに過ぎず、本願の解釈には影響を及ぼさない。
本発明によって提供される各態様の好ましい特徴は、本発明の他のすべての態様に準用可能であり、限定されることなく、従属請求項によって例示され、実施例を含む本発明の特定の実施形態及び態様の個々の特徴（例えば、数値範囲及び例示的な実施形態を含む要素）の組み合わせ及び並べ換えも包含する。例えば、実施例で例示される特定の実験パラメータは、本発明から逸脱することなく、断片的に、特許請求される発明での使用に適合させることができる。例えば、開示されている物質に関しては、これらの化合物を個別及び集合的に様々に組み合わせたもの及び並べ換えたものの各々の具体的言及が明示的に開示されていなくとも、その各々が具体的に想定され、本明細書で説明される。したがって、あるクラスの要素Ａ、Ｂ、及びＣ、ならびにあるクラスの要素Ｄ、Ｅ、及びＦが開示されており、要素Ａ～Ｄの組み合わせの一例が開示されている場合には、各々が個別に示されていなくとも、各々が個別及び集合的に想定されている。したがって、この例では、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、ならびにＡ～Ｄの組み合わせの例の開示から、Ａ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ、及びＣ～Ｆの各組み合わせが具体的に想定され、開示されているとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に想定され、開示されている。したがって、例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、ならびにＡ～Ｄの組み合わせの例の開示から、Ａ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、及びＣ～Ｅのサブグループが具体的に想定され、開示されているとみなされるべきである。この概念は、組成物の要素と、組成物を作製または使用する方法のステップとを含め、本願のすべての態様に適用される。
本発明の前述の態様は、本明細書の教示に従って当業者に認識されるように、任意に組み合わせたまたは並べ替えた形態が先行技術に対して新規かつ非自明である限り、そうした形態で特許請求することができ、したがって、ある要素が当業者に公知の１つ以上の参照文献に記載されている限り、これらは、とりわけ特徴または特徴の組み合わせの否定的な但し書きまたは注意書きによって、特許請求される発明から除外され得る。

Claims (19)

  1. 式Ｖの化合物：
    Figure 2023546908000133
     ［式中、各Ｒ１及び各Ｒ２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成してもよく、
    各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３、及びＲ１４は、－Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
    各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１５、及びＲ１６は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
    ｗ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、
    各Ｑは、独立的に、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ１、Ｓから選択される原子、またはジスルフィド結合であり、
    ｍの各々は、０～２０の整数であり、
    Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される］。
  2. 式ＩＩＩの化合物：
    Figure 2023546908000134
     ［式中、各Ｒ１’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１１、及びＲ１２は、Ｈ、場合により置換されているＣ１－Ｃ１２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ１２アルキニル、場合により置換されているＣ３－Ｃ６シクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６ヘテロシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アルキルシクロアルキル、場合により置換されているＣ４－Ｃ６アリール、場合により置換されているＣ３－Ｃ６ヘテロアリール、場合により置換されているＣ４－Ｃ８アリールオキシ、場合により置換されているＣ７－Ｃ１０アリールアルキル、場合により置換されているＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールアルキル基、場合により置換されているアミンからなる群から独立的に選択されるか、またはＲ１及びＲ２は共に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環を形成してもよく、ここで、ＱがＳまたはＯである場合、前記ＳまたはＯに結合している前記Ｒ１は電子対であり、
    各Ｒ３及びＲ４は、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
    各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、フェニル、ベンジル、場合により置換されているＣ１－Ｃ２２アルキル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルケニル、場合により置換されているＣ２－Ｃ２２アルキニルからなる群から独立的に選択され、
    ｘ、ｙ、及びｚの各々は、独立的に、０～１０の整数であり、
    Ｇ及びＱは各々独立的に、ＣＨ、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される原子であり、
    ｍ及びｎの各々は、０～２０の整数であり、
    Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｍ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＳＯ３－、－ＮＳＯ２－、－ＳＯ２Ｎ－、－ＮＨ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－Ｎ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）２、－ＮＨ（（Ｃ６）アリール）、－Ｎ（（Ｃ６）アリール）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＣＯ（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ（（Ｃ６）アリール）、－ＣＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、－ＣＯ２（（Ｃ６）アリール）、－ＳＯ２（（Ｃ１－Ｃ８）アルキル）、及び－ＳＯ２（（Ｃ６）アリール）からなる群から独立的に選択される］。
  3. 次の構造：
    Figure 2023546908000135
     を有する、請求項１に記載の化合物。
  4. 次の構造：
    Figure 2023546908000136
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  5. 次の構造：
    Figure 2023546908000137
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  6. 次の構造：
    Figure 2023546908000138
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  7. 次の構造：
    Figure 2023546908000139
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  8. 次の構造：
    Figure 2023546908000140
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  9. 次の構造：
    Figure 2023546908000141
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  10. 次の構造：
    Figure 2023546908000142
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  11. 次の構造：
    Figure 2023546908000143
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  12. 次の構造：
    Figure 2023546908000144
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  13. 次の構造：
    Figure 2023546908000145
     を有する、請求項２に記載の化合物。
  14. 脂質ナノ粒子であって、
    ｉ）請求項１に記載の化合物と、
    ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
    ｉｉｉ）ステロイドと、
    ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
    ｖ）前記脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤もしくは予防剤またはその薬学的に許容される塩と
    を含む、前記脂質ナノ粒子。
  15. 脂質ナノ粒子であって、
    ｉ）請求項２に記載の化合物と、
    ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
    ｉｉｉ）ステロイドと、
    ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
    ｖ）前記脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤もしくは予防剤またはその薬学的に許容される塩と
    を含む、前記脂質ナノ粒子。
  16. 対象に核酸を送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、前記脂質ナノ粒子が、
    ｉ）請求項１に記載の化合物と、
    ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
    ｉｉｉ）ステロイドと、
    ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
    ｖ）前記脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、核酸またはその薬学的に許容される塩と
    を含む、前記方法。
  17. 対象に核酸を送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、前記脂質ナノ粒子が、
    ｉ）請求項２に記載の化合物と、
    ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
    ｉｉｉ）ステロイドと、
    ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
    ｖ）前記脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、核酸またはその薬学的に許容される塩と
    を含む、前記方法。
  18. 治療用タンパク質、ワクチン、遺伝子編集ＲＮＡを含む治療剤を対象に送達する方法であって、前記対象に脂質ナノ粒子を投与することを含み、前記脂質ナノ粒子が、
    ｉ）請求項１に記載の化合物と、
    ｉｉ）第２の脂質、例えば、中性脂質または双性イオン性脂質と、
    ｉｉｉ）ステロイドと、
    ｉｖ）ポリマー共役脂質と、
    ｖ）前記脂質ナノ粒子に封入された、またはそれと会合した、治療剤またはその薬学的に許容される塩と
    を含む、前記方法。
  19. 治療剤または予防剤を含む細胞または組織への脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のｉｎ ｖｉｖｏ標的送達の方法であって、
    １．）イオン化可能脂質の分子ｐＫａを予測し、前記イオン化可能脂質を合成し、ＮＭＲなどの分析法でｐＫａを測定することと、
    ２．）ＴＮＳ及びゼータ電位を含む分析法を使用してＬＮＰ ｐＫａを測定することと、
    ３．）ルシフェラーゼ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃｒｅレポーターからなる群から選択されるレポーター遺伝子を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞及び臓器のターゲティングを評価することと、
    ４．）イオン化可能脂質の構造を調整して、細胞または組織のターゲティングに最適な分子ｐＫａを見出すことと、
    ５．）所望の前記細胞または組織のターゲティングに関連する所望の前記ｐＫａを有する頭部基、スペーサー基、及び尾部基を選択することと、
    ６．）最適な細胞及び組織のターゲティングが達成されるまでステップ１～４を繰り返すことと
    を含む、前記方法。
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