ES2884727T3

ES2884727T3 - Plaquetas transfectadas por material genético exógeno y micropartículas plaquetarias obtenidas por dichas plaquetas transfectadas, procedimiento de preparación y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2884727T3
Application number: ES14717082T
Authority: ES
Inventors: Paolo Gresele; Marco Malvestiti
Original assignee: Plasfer Srl
Current assignee: Plasfer Srl
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2014-01-30
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2034-01-30
Also published as: PL2951292T3; EP2951292B1; US20220411823A1; WO2014118817A2; HUE055345T2; SI2951292T1; ITRM20130054A1; US20230048730A1; US20150361453A1; DK2951292T3; EP2951292A2; WO2014118817A3; PT2951292T

Abstract

Procedimiento para transfectar plaquetas aisladas de sangre periférica con material genético exógeno, comprendiendo o consistiendo dicho procedimiento en las siguientes etapas: a) añadir una mezcla que comprende o que consiste en material genético y un medio de transfección, comprendiendo dicho medio de transfección alcohol etílico y al menos una poliamina elegida del grupo que consiste en polietilenimina y polilisina, a una suspensión de plaquetas aisladas de sangre periférica suspendidas en un medio de suspensión adecuado; y b) incubar hasta obtener un porcentaje de plaquetas transfectadas aisladas de la sangre periférica igual al menos al 20 %, preferentemente del 50 al 100 %, incluso más preferentemente del 80 al 100 %, de toda la población de plaquetas, interrumpiendo la transfección y aislando las plaquetas.

Description

DESCRIPCIÓN

Plaquetas transfectadas por material genético exógeno y micropartículas plaquetarias obtenidas por dichas plaquetas transfectadas, procedimiento de preparación y usos de las mismas

La presente invención se refiere a las plaquetas transfectadas con material genético exógeno y a las micropartículas derivadas de dichas plaquetas transfectadas, a un procedimiento para su preparación y usos de las mismas.

Más en particular, la invención se refiere a las plaquetas maduras transfectadas con material genético exógeno y a las micropartículas derivadas de dichas plaquetas maduras transfectadas que tienen un alto porcentaje de transfección y que son capaces de transportar el material genético exógeno y de transfectar células aceptoras con dicho material genético y que luego se utilizan, por ejemplo, en terapia génica y celular. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de plaquetas maduras transfectadas con material genético exógeno y micropartículas derivadas de dichas plaquetas maduras transfectadas que permite obtener altos porcentajes de transfección.

Los microARN y sus correspondientes ARNsi sintéticos, son pequeños ARN no codificantes que representan un importante mecanismo de regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional mediante la represión traslacional o la inducción de la decadencia de ARNm específicos.

Se sabe que las terapias basadas en ARNsi siempre requieren procedimientos más eficaces para su transporte en el torrente sanguíneo (Yoo et al, Bio-inspired, bioengineered and biomimetic drug delivery carriers, Nature Review, Vol 10; 2011). Para ello, se han desarrollado procedimientos que utilizan como vehículos bacterias, virus, estructuras sintéticas artificiales (micelas, microsomas, etc.) e incluso células humanas (eritrocitos, macrófagos, linfocitos y células madre).

Algunos ensayos clínicos se han centrado en la administración de ARNsi in vivo a partir de células extraídas del paciente, modificadas con ARNsi y luego reimplantadas o reinfundidas; este procedimiento se ha utilizado, por ejemplo, para la administración de ARNhc transportado por lentivirus para el tratamiento del SIDA, o para aumentar la respuesta inmunitaria contra algunos de los tipos de cáncer más comunes.

Se realizaron más de 30 ensayos clínicos en los que se utilizaron 21 tipos diferentes de ARNsi o ARNhc, y se centraron especialmente en estudios destinados a mejorar el sistema de administración de ARNsi para maximizar la especificidad y, al mismo tiempo, minimizar la toxicidad y la degradación.

Freedman et al. (Blood 2012119; 6288-6295) e Sahler J et al (J Thromb Haemost. 2012 Oct 5) estudiaron los aspectos relativos a la transferencia de material genético o de proteínas desde las partículas similares a las plaquetas, en el primer trabajo, o desde las micropartículas producidas por los megacariocitos, en el segundo trabajo, a otras células (células endoteliales y leucocitos). Dichos autores no transfectan directamente partículas o megacariocitos con el material genético de interés, sino que utilizan un procedimiento para la transfección de megacariocitos ya divulgado en la técnica, es decir, de precursores de plaquetas de la médula ósea. En particular, en el primer artículo la transfección de la línea celular de megacariocitos (Meg-01) es llevada a cabo por los autores mediante el uso de "Nucleofector", un dispositivo para la transfección de cultivos primarios por electroporación. En el segundo artículo, la transfección de líneas celulares de megacariocitos (Meg-01 y Dami) y de megacariocitos recolectados de la médula ósea de ratones C57BL/6 utilizando lentivirus, otro medio de transfección bien conocido.

La presencia de microARN en las plaquetas humanas se divulgó recientemente (Landry et al, Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets, Nat Struct Mol Biol, 2009; 16(9):961-966), pero no la posibilidad de silenciar eficazmente un gen de interés en las plaquetas introduciendo un ARNsi ni la capacidad de transferir ARNsi desde las plaquetas o las micropartículas derivadas de ellas a otras células utilizando las plaquetas como transportadores.

En otro trabajo (Hong et al. Transfection of human platelet with short interfering RNA; Clin Transl Sci. 2011), se describió el intento de lograr un silenciamiento del ARNm de las plaquetas utilizando los procedimientos comunes de transfección celular.

Pero los resultados obtenidos mostraron una baja eficacia de transfección (menos del 9 %) que no permitió obtener un silenciamiento satisfactorio de los ARNm de interés. En particular, el artículo mencionado demuestra que los ARNsi insertados en las plaquetas son capaces de silenciar sólo parcialmente una diana de ARNm presente en la misma plaqueta.

Por lo tanto, los resultados demuestran un silenciamiento que puede no ser considerado de relevancia biológica, como lo demostraron experimentalmente los inventores de la presente invención: en general, de hecho, sólo se obtuvo un 2 % de silenciamiento en toda la población de plaquetas.

Según las pruebas realizadas por los inventores de la presente invención en plaquetas humanas, el silenciamiento puede considerarse suficiente sólo cuando la eficacia de la transfección supera al menos el 20 %. En general, se considera óptima una transfección con una eficacia de al menos el 80 %.

En el artículo mencionado más arriba, se describe el uso de medios capaces de inducir el "suministro mediado por lípidos catiónicos", por ejemplo, la lipofectamina, utilizada para transfectar plaquetas. Un lípido catiónico tiene la característica, típica de los lípidos, de ser no polar/hidrófobo, pero incluso contiene un catión capaz de conferir características de polaridad/hidrofilicidad. La penetración del ARNsi a través de las membranas se consigue gracias a las propiedades físicas y químicas de la lipofectamina descritas anteriormente. Teniendo en cuenta lo anterior, la observación de Hong puede referirse exclusivamente a la transfección obtenida a través de una molécula con esas características físicas y químicas específicas y no a la transfección obtenida con otras moléculas, como por ejemplo, con una mezcla de moléculas de diferente naturaleza con respecto al lípido catiónico.

Anteriormente se realizaron pruebas de transfección in vitro de progenitores plaquetarios transfectados con material genético de alta eficacia (Ohmori et al. Efficient expression of a transgene in platelets using simian immunodeficiency virus-based vector harboring glycoprotein lba promoter: in vivo model for platelet targeting gene therapy; FASEB 20 2006 Fujimoto et al. Production of functional platelets by differentiated embryonic stem cell in vitro; Blood 2003, 102).). En particular, en el artículo de Fujimoto et al. (Production of functional platelets by differentiated embryonic stem cell in vitro; Blood 2003, 102)), se utilizaron partículas citoplasmáticas similares a las plaquetas producidas artificialmente en el laboratorio a partir de células madre hematopoyéticas, pero no plaquetas humanas. Por lo tanto, las partículas similares a las plaquetas utilizadas en el estudio de Fujimoto et al. no son comparables desde el punto de vista funcional, antigénico y morfológico con las plaquetas circulantes maduras aisladas de la sangre periférica. Además, según Fujimoto et al., los fragmentos de plaquetas se producen a partir de células madre embrionarias, es decir, células que son difíciles de encontrar para un posible uso clínico en pacientes, y el número de plaquetas obtenido con el procedimiento descrito seguramente no sería suficiente para una terapia génica. Este concepto se aclara incluso en una revisión fechada en 2011 (Sun S et al. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art; Transfus Med Rev. 2010 January; 24(1): 33-43) en el que el autor concluye que, según el estado de la técnica, no es posible utilizar fragmentos de plaquetas producidos in vitro para su uso in vivo en humanos: "Sin embargo, el número de plaquetas producidas in vitro por Mk son órdenes de magnitud inferiores a las que se producen in vivo y la calidad de las plaquetas generadas no está clara. La ineficacia actual de este proceso plantea la cuestión de si las citoquinas se administran en el momento, la secuencia y la concentración adecuados, en la combinación correcta y/o si hay citoquinas que aún no se han descubierto."

La no identidad entre los fragmentos de plaquetas de la sangre y las plaquetas maduras se confirma incluso experimentalmente en Gandhi et al. (Gandhi et al., A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells; Blood cell, molecules and disease, 35, 2005) que dice: "Aunque podemos aislar PFs (fragmentos de plaquetas) de las células UT-7/TPO con propiedades de agregación similares a las plaquetas, la microscopía electrónica demuestra que estos fragmentos no tienen la estructura habitual de las plaquetas normales (es decir, gránulos densos y anillo de tubulina circunferencial)". Además, se suele indicar el nombre a través de estas partículas, es decir: "Fragmento de plaqueta o partículas similares a las plaquetas", indica explícitamente una no identidad con las plaquetas maduras circulantes in vivo.

Ohmori et al. (Ohmori et al. Efficient expression of a transgene in platelets using simian immunodeficiency virus-based vector harboring glycoprotein lba promoter: in vivo model for platelet targeting gene therapy; FASEB 202006) sugieren que los progenitores de la médula ósea de las plaquetas, modificados genéticamente, se trasplanten en la médula ósea de los pacientes para generar plaquetas modificadas genéticamente in vivo. Sin embargo, en el estado actual de los conocimientos científicos, el procedimiento descrito en Ohmori et al. implicaría un alto riesgo de complicaciones clínicas y altos costes relacionados con un procedimiento de trasplante de células madre, además, no permite obtener un número suficiente de plaquetas circulantes modificadas genéticamente. Las desventajas de un procedimiento como el descrito en Ohomori et al. se describen explícitamente en Poncz et al. (Poncz M et al. Challenges and promises for the development of donor-independent platelet transfusions; Blood 2013-121/17 3319-3324) en el que se cree que: "La generación de plaquetas in vivo a partir de megacariocitos infundidos es alentadora y puede convertirse en una alternativa a la trombopoyesis ex vivo, pero este enfoque está limitado por el tiempo que se tarda en conseguir un aumento máximo del recuento de plaquetas y por los posibles problemas que plantea la infusión de células enteras, especialmente en pacientes con enfermedad pulmonar real o potencial".

Además, en los procedimientos descritos en Ohmori et al. (Efficient expression of a transgene in platelets using simian immunodeficiency virus-based vector harboring glycoprotein lba promoter: in vivo model for platelet targeting gene therapy; FASEB 202006) y Fujimoto et al. (Production of functional platelets by differentiated embryonic stem cell in vitro; Blood 2003, 102), la transfección de "partículas similares a las plaquetas" se obtiene de forma indirecta. En particular, los precursores celulares de las partículas similares a las plaquetas se transfectan con el material genético de interés. Sin embargo, la producción de las mencionadas partículas transfectadas con material genético se obtiene sólo en una etapa posterior, lo que determina necesariamente una pérdida de la eficacia del grado de transfección obtenido.

En los dos documentos citados anteriormente, una población de plaquetas en la que el porcentaje de plaquetas transfectadas no supere el 20 % del total, como se escribe expresamente en Ohmori et al., "En nuestro sistema, la transducción de células madre hematopoyéticas con un vector lentiviral SIV dio lugar a la expresión del estransgén en “ 20 % de las plaquetas"y en Fujimoto et al. "Pudimos obtener hasta 108 plaquetas en el sobrenadante de cultivo de 104 células ES." se obtiene. Un número de plaquetas de108 es varios órdenes de magnitud inferior al número de plaquetas circulantes en la sangre y, por tanto, es claramente inferior al 20 % del total de plaquetas circulantes.

Por lo tanto, en vista de lo anterior, es bien evidente la necesidad de contar con un nuevo procedimiento de transporte y transfección directa de plaquetas maduras con material genético que supere las desventajas de los procedimientos conocidos.

Los inventores de la presente invención encontraron un nuevo procedimiento para insertar (transfección) material genético extraño, como ARN (ARNsi, ARNhc, ARNec) y en general otro material genético, como, por ejemplo, plásmidos, en las plaquetas de la sangre humana. En particular, se proporciona un procedimiento que parte del aislamiento de plaquetas humanas a partir de la sangre periférica de un donante, pasando por la obtención de plaquetas resuspendidas en un medio de resuspensión, tanto en el caso de que sea el mismo plasma del donante o un tampón de resuspensión, hasta la transfección de las mismas plaquetas con un material genético como un pequeño ARN de interferencia (ARNsi) dirigido contra un ARNm diana específico. El procedimiento de la invención permite la transfección de las plaquetas también con un tipo de material genético diferente al ARNsi (por ejemplo, ARNhc o plásmidos) que puede representar otras vías para obtener el silenciamiento de genes o introducir nuevo material genético con el fin de mejorar la eficacia de las terapias génicas actualmente utilizadas o en estudio o introducir otras nuevas.

Mediante el procedimiento de la presente invención es posible obtener plaquetas o micropartículas de origen plaquetario capaces de contener una concentración de material genético suficiente para silenciar el ARNm de interés dentro de las mismas plaquetas o en otras células con las que entren en contacto las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario. Por lo tanto, las plaquetas o micropartículas de la invención pueden utilizarse ventajosamente en el ámbito médico.

La capacidad de las micropartículas producidas a partir de células nucleadas, por ejemplo, micropartículas, microvesículas, exosomas, para transferir material genético a otras células "aceptoras" es bien conocida en la literatura. El procedimiento de la presente invención permite producir micropartículas de origen plaquetario a partir de plaquetas transfectadas con material genético, como ARNsi específico, directamente de plaquetas humanas. Las micropartículas pueden utilizarse como vehículos de material genético, como el ARNsi, para silenciar o manipular genes de interés en la sangre de los glóbulos blancos, en el endotelio o en otras células de órganos y tejidos.

La presente invención encuentra aplicación en varios campos médicos. La transfección de ARNsi específico en las plaquetas permite interferir, por ejemplo, en los mecanismos que regulan la participación directa de las plaquetas en la cardiopatía isquémica, la inflamación, la metástasis, el daño tisular o, en medicina transfusional, promover la conservación hemostática y la eficacia de las plaquetas previniendo la llamada lesión de almacenamiento plaquetario.

Además, la capacidad conocida de las plaquetas de interactuar estrechamente con otras células, entre las que se encuentran las células endoteliales, las células musculares lisas de la pared vascular, varias subpoblaciones de glóbulos blancos y las células cancerosas, garantizan que las moléculas transfectadas en las plaquetas se transfieran a las células mencionadas. La transfección de células aceptoras permite así modular su expresión genética, interfiriendo en condiciones patológicas en las que las plaquetas no están directamente implicadas, como por ejemplo, varios tipos de cáncer, enfermedades debidas a patógenos eucariotas y virales, rechazo post-trasplante.

El procedimiento de la invención permite obtener la transfección de material genético seleccionado por el investigador, tal como el ARNsi, en las plaquetas humanas con alta eficacia. El silenciamiento así obtenido de los ARNm de las plaquetas es estable y dura toda la vida de las plaquetas transfectadas. De hecho, las plaquetas no tienen núcleo y, por tanto, no pueden sintetizar nuevo ARNm. Por lo tanto, las plaquetas transfectadas pueden utilizarse para silenciar genes de interés fisiopatológico en las plaquetas humanas con el fin de bloquear su participación en diversas enfermedades. En particular, se obtuvo un excelente porcentaje de transfección utilizando ARNsi (alrededor del 95 %).

Además, los inventores de la presente invención demostraron que los ARNsi transfectados en las plaquetas se transfieren luego a micropartículas producidas por las mismas plaquetas. Tanto las micropartículas como las plaquetas transfectadas con material genético son capaces de transferir in vivo dicho material a células "aceptoras" y, en particular, a células implicadas en patologías en las que las plaquetas no tienen un papel principal, pudiendo así modular, a través de las micropartículas plaquetarias, o de las plaquetas, patologías no derivadas principalmente de las mismas plaquetas.

La rápida rotación de las plaquetas en la circulación permite además minimizar la permanencia del ARNsi en la sangre tras la liberación hacia las células diana, reduciendo el riesgo de no selectividad de la intervención terapéutica. Los cortos tiempos requeridos para obtener la transfección del procedimiento de la invención permiten además reinfundir las plaquetas transfectadas por vía intravenosa en el mismo sujeto del que fueron recogidas durante una sola sesión, eliminando así el riesgo de aloinmunización y rechazo de las plaquetas transfectadas.

De hecho, la práctica utilizada en medicina transfusional de separar las plaquetas y el plasma (por separado o ambos) de un donante reinfundiendo el mismo con la parte restante de sangre separada (parte corpuscular), directamente en el mismo ciclo de transfusión (plaqueta-plasmaféresis), puede permitir recoger las plaquetas, transfectarlas, resuspenderlas en plasma y reinfundirlas.

Es por tanto un objeto específico de la presente invención una población de plaquetas maduras, preferentemente aisladas de sangre periférica, transfectadas con material genético exógeno y/o micropartículas plaquetarias (es decir, fragmentos de plaquetas) obtenidas a partir de dichas plaquetas maduras transfectadas, en la que el porcentaje de plaquetas maduras transfectadas varía entre el 20 % y el 100 %, preferentemente es superior al 20 %, aún más preferentemente varía entre el 50 % y el 100 % y aún más preferentemente entre el 80 % y el 100 % de toda la población de plaquetas, en la que dichas micropartículas plaquetarias son las que contienen dicho material genético exógeno. El material genético con el que se pueden transfectar las plaquetas puede seleccionarse del grupo formado por ARNsi, ARNhc, ARNec, ADN, plásmidos y, en general, materiales de naturaleza genética.

Por lo tanto, según la presente invención, el material genético exógeno se utiliza para transfectar y modificar genéticamente las plaquetas humanas maduras y/o las micropartículas de plaquetas. Por lo tanto, la invención se refiere al uso de la población de plaquetas maduras transfectadas con material genético exógeno y/o micropartículas de plaquetas según la invención como vector en el transporte de material genético y/o en la transfección de material genético a células aceptoras.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar una población de plaquetas maduras transfectadas con material genético exógeno y/o micropartículas de plaquetas según la invención para el uso en terapia génica o terapia celular. En particular, el gen diana de la terapia génica puede ser un ARN mensajero presente en las mismas plaquetas o en las células aceptantes. Por ejemplo, cuando dicho material genético se selecciona del grupo que consiste en ARNsi, ARNhc, o en dicho ARNsi, ARNhc contenido en plásmidos, la terapia génica consiste en el silenciamiento posttranscripcional de un gen diana que puede pertenecer a las mismas plaquetas o células aceptoras.

El procedimiento de transfección según la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para insertar un ARNsi dirigido contra el ARNm de la Trombospondina-1 (TSP-1) dentro de las plaquetas humanas con el fin de regular la cantidad del mismo ARNm en pacientes con tumores sólidos (La trombospondina-1 derivada de las plaquetas es un regulador negativo crítico y un biomarcador potencial de la angiogénesis. Blood, 2011).

De hecho, se ha observado que este ARNm desempeña un papel importante en la angiogénesis tumoral; la transferencia de un ARNsi anti ARNm para TSP-1 desde las plaquetas, transfectadas con él, a las células tumorales in vivo podría representar una "quimioterapia" selectiva, destinada a evitar las recidivas tumorales después de las intervenciones.

Los ARNsi utilizados en los experimentos descritos a continuación son ARNsi DICER inducidos disponibles comercialmente y vendidos por numerosas empresas del sector. También se conocen numerosas secuencias de ARNsi utilizadas en ensayos clínicos dirigidos contra oncogenes o secuencias características de genomas patógenos (VIH-1). Su transfección efectiva en las plaquetas representa, por tanto, un medio terapéutico innovador y eficaz contra las enfermedades del sistema cardiovascular (aterosclerosis, hipertrofia y fibrosis cardiaca, arritmogénesis cardiaca); las neoplasias (tumores sólidos de distinto origen, leucemias, mielomas); las enfermedades debidas a patógenos eucariotas (micosis, paludismo) o virales (SIDA, hepatitis viral).

Por lo tanto, las plaquetas maduras transfectadas según la presente invención y las micropartículas obtenidas a partir de ellas pueden utilizarse en el tratamiento de las enfermedades mencionadas.

En cuanto a los ARNhc o los plásmidos, los usos son similares, claramente con la ventaja de que se pueden obtener silenciamientos de mayor duración que los que se pueden obtener con los ARNi.

Dependiendo del tipo de patología y sobre todo de las características genéticas de la enfermedad, se introducirán ARNsi con diferentes secuencias dentro de las plaquetas para silenciar ARNms que, si se traducen, son fundamentales para la evolución y desarrollo de la patología.

En la tabla 1 se enumeran una serie de ARNsi utilizables contra oncogenes comunes y transfectables en plaquetas maduras según la presente invención (Silenciamiento de genes de ARNsi y miARN Humana Press). En la tabla 1, columna derecha, se indican las secuencias de ARNsi que muestran ambas cadenas de ARN (la secuencia superior representa el ARNm y la inferior el ARNsi dirigido contra el ARNm); en la columna izquierda, se muestran los nombres de los genes contra los que se dirige el ARNsi; en caso de "mutación puntual" también se especifica la mutación expresada como cambio de aminoácido único. Las categorías en las que se divide la tabla están referidas al tipo de oncogén: "mutación puntual", es decir, las mutaciones puntuales más comunes que determinan la conversión de ese determinado protooncogén en oncogén, y "gen de fusión" donde el oncogén se genera por translocación.

Tabla 1

continuación

Basándose en lo anterior, la presente invención también se refiere a las plaquetas transfectadas con el ARNsi enumerado en la tabla 1, a las micropartículas obtenidas a partir de ellas y a los usos relacionados con el tratamiento de enfermedades relacionadas con los genes enumerados.

Es otro objeto de la presente invención, un procedimiento para la transfección de plaquetas con material genético exógeno, comprendiendo o consistiendo dicho procedimiento en las siguientes etapas:

a) añadir una mezcla que comprende o que consiste en material genético y un medio de transfección, comprendiendo dicho medio de transfección alcohol etílico y al menos una poliamina seleccionada entre la polietilenimina y la polilisina a una suspensión de plaquetas maduras aisladas suspendidas en un medio de suspensión adecuado, tal como el plasma; y

b) incubar hasta obtener un porcentaje de plaquetas transfectadas igual al menos al 20 %, preferentemente del 50 al 100 %, incluso más preferentemente del 80 al 100 %, de toda la población de plaquetas, interrumpiendo la transfección y aislando las plaquetas maduras transfectadas. Los procedimientos para determinar el porcentaje de transfección son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear la citofluorometría utilizando sondas fluorescentes, o la PCR en tiempo real. Los tiempos de incubación pueden ir de 1 minuto a 24 horas, generalmente van de 1 minuto a 3 horas, preferentemente de 5 minutos a 30 minutos, incluso más preferentemente de 5 a 10 minutos.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de micropartículas de plaquetas derivadas de plaquetas maduras transfectadas con material genético exógeno, comprendiendo o consistiendo dicho procedimiento en las siguientes etapas a) añadir una mezcla que comprende o consiste en material genético y un medio de transfección, comprendiendo dicho medio de transfección alcohol etílico y al menos una poliamina seleccionada de entre la polietilenimina y la polilisina a plaquetas maduras aisladas suspendidas en un medio de suspensión adecuado, tal como el plasma; y b) incubar, posiblemente estimulando la activación de las plaquetas, hasta obtener micropartículas, interrumpiendo la transfección y aislando las micropartículas o una mezcla de plaquetas y micropartículas. Los procedimientos para determinar la formación de micropartículas son bien conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, su formación puede verificarse mediante citometría de flujo con técnicas estándar.

La estimulación de la activación plaquetaria tiene por objeto inducir una mayor producción de micropartículas y puede realizarse, por ejemplo, añadiendo trombina a una concentración final de 1 unidad/mililitro o utilizando colágeno, TRAP, ácido araquidónico y/u otros estímulos, bien conocidos por los expertos en la técnica.

Como se ha mencionado anteriormente, el material genético se selecciona del grupo que consiste en ARNsi, ARNhc, ARNec, ADN, plásmidos y otros materiales de naturaleza genética. Es aconsejable que el material genético a transfectar se utilice a una concentración entre 20-200 nM, al igual que la utilizada para cualquier transfección celular.

La transfección se lleva a cabo de manera óptima utilizando una mezcla que comprende o consiste en alcohol etílico y al menos una poliamina seleccionada entre la polietilenimina y la polilisina. Además de estos componentes, pueden añadirse lípidos o extractos de fosfolípidos plaquetarios. La eficacia de la transfección depende principalmente de las poliaminas, mientras que los extractos de fosfolípidos de las plaquetas parecen tener un efecto moderado que mejora la transfección y mitiga los efectos citotóxicos de la mezcla de transfección. La concentración de alcohol etílico puede variar entre el 0,5 % y el 3,5 %, preferentemente entre el 2 y el 3 %, incluso más preferentemente el 3 %. La eficacia de la transfección, al igual que la concentración de alcohol en el medio, es dependiente de la dosis, alcanzando la máxima eficacia al 3 %. La cantidad de la solución de polilisina o polietilenimina diluida con agua al 0,1 % puede variar entre 1 y 150 pl, preferentemente entre 1 y 140 pl, incluso más preferentemente 3 pl.

La concentración de lípidos puede variar de 10 a 20 pl, preferentemente de 12 a 16 pl, incluso más preferentemente 15,6 pl.

La transfección óptima se obtuvo con una cantidad de 3 pl de una solución de polietilenimina diluida con agua al 0,1 % añadida a la mezcla de reacción y 15,6 microlitros de extractos de fosfolípidos de plaquetas (Reactivo de Extracto de Plaquetas).

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un medio de transfección de plaquetas maduras con material genético exógeno, en el que dicho medio de transfección comprende o consiste en alcohol etílico y al menos una poliamina seleccionada entre la polietilenimina y la polilisina, y posiblemente, lípidos o extractos de fosfolípidos.

Utilizando un reactivo comercial denominado Ribojuice (Merck), que comprende alcohol etílico y al menos una poliamina, se obtiene un rendimiento de transfección comparable al obtenido con el medio de transfección de la presente invención.

La concentración de plaquetas maduras en la suspensión de la etapa a) puede ser preferentemente superior a 20.000 plaquetas por microlitro e inferior a 2 millones, preferentemente de 200.000 a 1.000.000 por microlitro, incluso más preferentemente de 250.000 a 350.000, incluso más preferentemente de 300.000 por microlitro. Los medios de suspensión de plaquetas utilizados durante los ensayos experimentales fueron RPMI 1640 e IMDM y ambos demostraron ser igualmente eficaces.

Los tiempos de incubación utilizables para la transfección de plaquetas van de 5 minutos a 1 hora; sin embargo, se prefiere utilizar tiempos cortos (por ejemplo, 5 minutos) para reducir los efectos citotóxicos del reactivo de transfección en las plaquetas. En cambio, los tiempos de transfección de plaquetas con producción de micropartículas varían entre 24 y 48 horas de incubación.

El procedimiento según la presente invención garantiza una alta eficacia de la transfección de ARNsi en plaquetas humanas maduras y también una alta capacidad de las micropartículas derivadas de las plaquetas y transfectadas con ARNsi de transferir ARNsi de interés a otras células, in vitro e in vivo.

La presente invención se describirá ahora, con fines ilustrativos pero no limitativos, según sus realizaciones preferidas, con especial referencia a las figuras de los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra: A. Análisis por citometría de flujo de la población de plaquetas tras la transfección obtenida por el proceso descrito en el ejemplo 1. El uso de dispersiones en una escala logarítmica permite ver la población de plaquetas en función de la morfología. B. Análisis por citometría de flujo del porcentaje de plaquetas positivas al ARNsi marcado con fluorescencia. C. Comparación por citometría de flujo entre las plaquetas no transfectadas (curva izquierda) y las transfectadas (curva derecha). El desplazamiento hacia valores de abscisa más altos, correspondientes a una mayor fluorescencia, permite definir el porcentaje de plaquetas positivas al ARNsi marcado. FS - dispersión hacia delante; SS - dispersión lateral; Fl2 - banda de emisión del fluoróforo del ARNsi.

La figura 2 muestra los porcentajes de plaquetas positivas al ARNsi fluorescente en relación con los tiempos de incubación con el medio de transfección.

La figura 3 muestra el porcentaje de expresión del ARNm del gen HPRT1 en las plaquetas lavadas y coincubadas con ARNsi frente al ARNm de HPRT1 medido por PCR semicuantitativa.

La figura 4 muestra la comparación de la PCR semicuantitativa después de la transfección realizada con ARNsi dirigido contra HPRT1 entre el gen diana y un gen de control (B2M). En la figura A, se realizó el análisis de PCR amplificando el gen HPRT1, en la figura B con el gen B2M (p-2 Microglobulina). Escala L; plaquetas lavadas P; plaquetas lavadas P1 coincubadas con ARNsi; plaquetas P2 transfectadas con ARNsi.

La figura 5 muestra los resultados del análisis por citometría de flujo de las micropartículas producidas tras 24 horas de incubación de las plaquetas lavadas con el medio de transfección añadido con ARNsi marcado con fluorescencia.

La figura A muestra la región morfológica en la que se encuentran las micropartículas previamente fijadas con esferas de tamaños adecuados (Megamix Beads). I: 0.5 pm; J: 0.9 pm; G: I+J. En la figura B se subraya la presencia de CD61 en las micropartículas (en la abscisa-Fl1 Log) para mostrar el origen plaquetario de las micropartículas y la presencia de ARNsi marcado con fluorescencia (en la ordenada-Fl2).

La figura 6 muestra los resultados del análisis por citometría de flujo de las células endoteliales (HUVEC) coincubadas con micropartículas de origen plaquetario durante 6 horas; las micropartículas plaquetarias se prepararon a partir de una suspensión de plaquetas en un medio de transfección añadido con A r Nsí marcado con fluorescencia, que, tras 24 horas, se ultracentrifugó durante 1 hora para permitir el aislamiento y la resuspensión de las micropartículas en RPMI 1640. El 38 % de las células endoteliales resulta positivo para el ARNsi previamente transfectado en las plaquetas.

La figura 7 muestra los resultados del análisis por citometría de flujo de los leucocitos murinos obtenidos de ratones NOS/SCID 24 h después del inóculo de plaquetas humanas transfectadas con ARNsi fluorescente. Imagen A: leucocitos de control, el ratón fue inoculado con plaquetas humanas no transfectadas; en el gráfico de la izquierda la muestra no fue incubada con el anticuerpo antiCD45; a la derecha la muestra fue incubada con el anticuerpo antiCD45; 2,08 % de positividad. ImagenB: leucocitos transfectados, el ratón fue inoculado con plaquetas humanas transfectadas con ARNsi fluorescente; en el gráfico de la izquierda la muestra no fue incubada con el anticuerpo antiCD45; a la derecha la muestra fue incubada con el anticuerpo antiCD45; 7,83 % de positividad. Imagen C: leucocitos obtenidos del ratón tras la inyección in vivo de agentes activadores de plaquetas. El ratón fue inoculado con plaquetas humanas transfectadas con ARNsi fluorescente y estimulado, una hora después del inóculo, mediante la inyección de 0,1 ml de una solución que contenía 150 pg/ml de Colágeno y 0,9 pg/ml di epinefrina; en el gráfico de la izquierda la muestra no fue incubada con el anticuerpo antiCD45; a la derecha la muestra fue incubada con el anticuerpo antiCD45; 13,81 % de positividad.

La figura 8 muestra: Imagen A: control realizado con plaquetas no transfectadas; Imagen B: plaquetas transfectadas con el plásmido Pmáx (Lonza), el 10,6 % resultó positivo y por tanto expresa una GFP activa.

La figura 9 muestra la comparación en citometría de flujo entre las plaquetas no transfectadas (curva de la izquierda) con las plaquetas transfectadas (curva de la derecha) según el ejemplo 4. El desplazamiento hacia valores de abscisa más altos, correspondientes a una mayor fluorescencia, permite definir el porcentaje de plaquetas positivas al ARNsi marcado. FS - dispersión hacia delante; SS - dispersión lateral; Fl2 - banda de emisión del fluoróforo del ARNsi.

La figura 10 muestra la comparación en citometría de flujo entre las plaquetas no transfectadas (curva de la izquierda) con las plaquetas transfectadas (curva de la derecha) según el ejemplo 5. El desplazamiento hacia valores de abscisa más altos, correspondientes a una mayor fluorescencia, permite definir el porcentaje de plaquetas positivas al ARNsi marcado. FS - dispersión hacia delante; SS - dispersión lateral; Fl2 - banda de emisión del fluoróforo del ARNsi.

EJEMPLO 1: Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas y evaluación del porcentaje de transfección

Materiales y procedimientos

Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas

Se extrajo sangre periférica venosa y se recolectó en tubos que contenían 3,8 % de citrato de sodio como anticoagulante (1:9 citrato-sangre v/v).

1 La muestra se centrifugó a 120 g durante 10 minutos para obtener PRP (plasma rico en plaquetas).

2 Proceder al aislamiento de las plaquetas plasmáticas por procedimientos comunes (lavado de plaquetas o filtración en gel).

3 Las plaquetas así aisladas, se resuspendieron en RPMI 1640 adicionado con antibióticos (100 U de Penicilina y 100 U de Estreptomicina) o en el mismo plasma del donante, a una concentración comprendida entre 2x1012345 y 1x106 por microlitro, siendo el límite inferior de dicha concentración 130.000 plaquetas/microlitro, y se transfirieron tasas de un mililitro a placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 %.

4 A continuación se prepara el medio de transfección, introduciendo en un tubo 32 microlitros de Ribojuice (Merck-Millipore) y 168 microlitros de RPMI 1640 para conseguir, en ambos casos, la cantidad total de 200 microlitros.

5 Tras esperar 5 minutos, se añadió el ARNsi de interés a la mezcla mencionada hasta la concentración máxima de 200 nM y, tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se transfirió la solución al pocillo en el que se había colocado previamente 1 ml de suspensión de plaquetas.

6 Tras 5 minutos de incubación a 37 °C, se interrumpió la transfección: por centrifugación de las plaquetas (a 3.000 g durante 10 minutos en presencia de PGI20,2 microM y, a continuación, resuspendiéndolas en 3 ml del medio de cultivo RPMI 1640) o diluyendo el medio de transfección con el medio de cultivo RPMI 1640 hasta conseguir una cantidad total de 7 mililitros.

7 Dentro de las 2 horas siguientes a la interrupción de la reacción de transfección, es posible señalar (por PCR o rt-PCR) la degradación del ARNm de interés, una diana específica del ARNsi previamente insertado en las plaquetas.

En cambio, para obtener micropartículas plaquetarias que contengan el ARNsi previamente transfectado en las plaquetas, es necesario realizar las operaciones descritas anteriormente hasta el punto 5 y luego continuar como sigue:

1. Incubar la suspensión de plaquetas a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 % junto con el medio de transfección durante 24/48 h. O bien estimularlas con 2,5 mM de CaCh, 20 pg/ml de Colágeno y 1 U/ml de Trombina durante 30 minutos a 37 °C y detener el estímulo con 2,5 mM de EDTA.

2. Centrifugar las plaquetas a 3.000 g durante 10 minutos.

3. Recuperar el sobrenadante y volver a centrifugarlo a 12.000 g durante 10 minutos para eliminar los posibles restos de plaquetas.

4. Centrifugar el sobrenadante a 160.000 g durante 1 hora a 4 °C.

5. Eliminar el sobrenadante y resuspender la pella de micropartículas en 1 mililitro de RPMI 1640 (verificando la concentración de micropartículas con un citómetro de flujo).

La composición del medio RPMI 1640 es (gramos/litro): la lista de componentes expresada en gramos/litro

L-Arginina 0,2

L-Asparagina 0,05

Ácido L-aspártico 0,02

L-Cistina-2HCl 0,0652

Ácido L-Glutámico 0,02

L-Glutamina 0,3

Glicina 0,01

L-Histidina 0,015

Hidroxi-L-Prolina 0,02

L-Isoleucina 0,05

L-Leucina 0,05

L-Lisina-HCl 0,04

L-Metionina 0,015

L-Fenilalanina 0,015

L-Prolina 0,02

L-Serina 0,03

L-Treonina 0,02

L-Triptófano 0,005

L-Tirosina-2Na-2H2O 0,02883

L-Valina 0,02

Biotina 0,0002

Cloruro de colina 0,003

Ácido fólico 0,001

myo-Inositol 0,035

Niacinamida 0,001

Ácido D-Pantoténico Hemicalcio 0,00025

PABA 0,001

Piridoxina-HCl 0,001

Riboflavina 0,0002

Tiamina-HCl 0,001

Vitamina B120,000005

Nitrato de calcio-4 H2O 0,1

Sulfato de magnesio 0,04884

Cloruro de potasio 0,4

Cloruro de sodio 6,0

Fosfato sódico dibásico 0,8

D-Glucosa 2.0

Glutatión, reducido 0,001

Rojo fenol-Na 0,0053

Detección de plaquetas y micropartículas por citometría de flujo (Figura 1 y 5).

Para la detección de micropartículas por citometría de flujo, la puerta dimensional correspondiente a las micropartículas se fijó calibrando el instrumento mediante Megamix (American Diagnostic), una mezcla de microesferas de 3 tamaños diferentes (0,5; 0,9 y 3 micrones).

Las micropartículas preparadas como se indica en los materiales y procedimientos, se marcaron incubándolas durante 30 minutos con el anticuerpo fluorescente anti-CD61 (Beckman Coulter), antígeno de localización exclusivamente plaquetaria.

Las plaquetas se analizaron fijando la puerta morfológica con un control sin transfección preparado como se describe en los materiales y procedimientos, y utilizando un anticuerpo fluorescente anti-CD61 (Beckman Coulter)-fitc y detectando la fluorescencia emitida por el control de transfección del ARNsi TYE 563 DS (IDT).

Todos los ensayos se realizaron con el citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter).

RT-PCR plaquetas transfectadas con ARNsi (Fig. 4)

Las plaquetas transfectadas se prepararon como se especifica en los materiales y procedimientos, del punto 1 al punto 7, utilizando un ARNsi dirigido contra HPRT1 a la concentración de 200nM.

El control se obtuvo lavando las plaquetas según el procedimiento descrito anteriormente y bloqueando la preparación en el punto 3 e insertando en el medio 200 nM de ARNsi dirigido contra HPRT1.

La RT-PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: el ARN total se extrajo de las preparaciones de plaquetas utilizando TRIzol (Invitrogen) según el procedimiento de extracción con cloroformo/isopropanol.

El ARN total se transcribió de forma inversa utilizando iScript (Biorad) según las instrucciones del fabricante.

La PCR se llevó a cabo utilizando los siguientes cebadores: HPRT (directo: TGAGGATTTGGAAAGGGTGT (SEQ ID NO: 47) inverso: TGTAATCCAGCAGGTCAGCA(SEQ ID NO: 48)); Microglobulina Beta 2 (directo: TGACTTTGTCACAGCCCAAGATAG (SEQ ID NO: 49) inverso: CTCTAAGTTGCCACCCCTCCTAG(SEQ ID NO: 50)).

Detección de células endoteliales (HUVEC) por citometría de flujo (figura 6)

Las células endoteliales HUVEC (Lonza) se cultivaron en el medio EBM2 Bullet Kit (Lonza) en placas de 12 pocilios hasta alcanzar aproximadamente el 75 % de confluencia.

Las micropartículas de origen plaquetario obtenidas como se ha descrito anteriormente, tras 48 horas de incubación de las plaquetas, se resuspendieron en 1 ml de medio RPMI 1640 y se añadieron al cultivo de células endoteliales.

Después de 6 horas de coincubación, se eliminó el sobrenadante, se lavaron las células endoteliales durante dos veces en PBS y luego se retiraron de las platinas mediante una tripsinización suave, resuspendiéndose en 1 ml de PBS para el análisis de citometría de flujo.

La puerta morfológica se estableció utilizando células HUVEC del control no preincubadas con micropartículas.

Se detectó la fluorescencia emitida por el ARNsi TYE 563 DS Transfection Control (IDT).

Resultados

Se insertó ARNsi mezclado fluorescente (Integrated DNA Techonologies) en plaquetas humanas lavadas (3,5x105) según el procedimiento descrito anteriormente, para verificar la eficacia de la transfección.

Mediante pruebas de citometría de flujo, se demostró una alta eficacia de transfección (Figura 1). En particular, se demostró que después de 1h de incubación, se alcanza casi un porcentaje óptimo de eficacia de transfección (alrededor del 97 % de eficacia) (Figura 2).

También se consigue una alta eficacia de transfección (> 95 %) incubando las plaquetas sólo durante 30 minutos, reduciendo así el estrés celular inducido por la transfección.

se realizaron pruebas de silenciamiento del ARNm de las plaquetas, evaluando la degradación del ARNm del gen HPRT1 (Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa) en plaquetas lavadas (3x105) y transfectadas con 200 nM de ARNsi dirigido contra HPRT1 (IDT de control positivo Hp Rt -S1).

El silenciamiento del ARNm se verificó mediante PCR semicuantitativa.

Se obtuvo una eficacia de silenciamiento del ARNm de interés igual al 94 % (Figura 3 e 4). Además, se indujo a las plaquetas humanas lavadas a producir micropartículas por el procedimiento anteriormente descrito y se evaluó por citometría de flujo si el ARNsi fluorescente, previamente transfectado en las mismas plaquetas, se transfiere a las micropartículas producidas (Figura 5). De hecho, se demostró que el 96 % de las micropartículas contiene el ARNsi previamente transfectado (Figura 5). Se incubaron células endoteliales humanas en cultivo (HUVEC) con micropartículas derivadas de plaquetas transfectadas con ARNsi verificando que el ARNsi fluorescente, derivado de las plaquetas de las que se produjeron, se transfiere a cerca del 38 % de las células HUVEC (Figura 6).

EJEMPLO 2: Estudio sobre losleucocitos de ratones NOD/SCID tras el inóculo intravenoso de plaquetas humanas transfectadas con ARNsi fluorescente y evaluación de la capacidad de silenciamiento de las plaquetas o micropartículas transfectadas con ARNsi

Los ratones NOD/SCID inmunodeficientes, por lo tanto incapaces de reaccionar inmunológicamente a la infusión de plaquetas humanas, fueron inoculados por inyección intravenosa, con 200 pl de una suspensión de 5x108 plaquetas humanas transfectadas según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 con ARNsi fluorescente.

24 horas después del inóculo, los ratones fueron sacrificados y se realizó un muestreo cardíaco de sangre completa.

La sangre completa de ratón se coincubó durante 30 minutos con el anticuerpo murino anti-CD45 (BD Pharmingen).

Se detectó la fluorescencia emitida por el Control de Transfección del ARNsi TYE 563 DS (IDT) en leucocitos de ratón marcados con anticuerpos anti-CD45 (BD Pharmingen) tras 30 minutos de incubación.

Todas las pruebas se realizaron con el citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter). Los resultados experimentales in vivo, con el animal de experimentación, que muestran la persistencia en el torrente sanguíneo de las plaquetas "transfectadas" con ARNsi y la transferencia de éstas a los leucocitos murinos se muestran en la Figura 7.

EJEMPLO 3: Detección de GFPen plaquetas humanas transfectadas por citometría de flujo (Figura 8).

Se insertó un total de 1 pg de plásmido que contenía la secuencia de GFP (Pmáx, Lonza) en las plaquetas humanas utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1, sustituyendo el plásmido por ARNsi en el procedimiento descrito anteriormente.

Después, se analizaron las plaquetas fijando la puerta morfológica con una suspensión de plaquetas de control sin transfección preparada como se describe en los materiales y procedimientos, y detectando la fluorescencia emitida por la GFP producida por el plásmido Pmáx (emisión máxima de 509 nm). Todas las pruebas se realizaron con el instrumento FC500 (Beckman Coulter). Mediante citometría de flujo se observó que la transfección de plaquetas humanas con el plásmido recombinante que contenía la secuencia para la GFP (proteína verde fluorescente) provocaba su traducción y, por tanto, la expresión del producto plasmídico (Figura 8).

EJEMPLO 4: Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas y evaluación del porcentaje de transfección

Materiales y procedimientos

Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas

1. La muestra se centrifugó a 120 g durante 10 minutos para obtener PRP (plasma rico en plaquetas).

2. Proceder al aislamiento de las plaquetas plasmáticas por procedimientos comunes (lavado de plaquetas o filtración en gel).

3. Las plaquetas así aisladas se resuspendieron en RPMI 1640 adicionado con antibióticos (100 U de Penicilina y 100 U de Estreptomicina) o en el mismo plasma del donante, a una concentración comprendida entre 2x105 y 1x10678910por microlitro, siendo el límite inferior de dicha concentración 130.000 plaquetas/microlitro, y se transfirieron dosis de un mililitro a una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 %.

4. A continuación, se prepara el medio de transfección, introduciendo en un tubo 32,4 microlitros de alcohol etílico absoluto, 3 microlitros de una solución de polietilenimina (0,1 % en agua) y 164,6 microlitros de medio RPMI 1640.

5. Tras esperar 5 minutos, se añadió el ARNsi de interés a la mezcla mencionada hasta la concentración máxima de 200 nM y, tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se transfirió la solución al pocillo en el que se había colocado previamente 1 ml de suspensión de plaquetas.

6. Tras 5 minutos de incubación a 37 °C, se interrumpió la transfección: por centrifugación de las plaquetas (a 3.000 g durante 10 minutos en presencia de PGI20,2 microM y, a continuación, resuspendiéndolas en 3 ml del medio de cultivo RPMI 1640) o diluyendo el medio de transfección con el medio de cultivo RPMI 1640 hasta conseguir una cantidad total de 7 mililitros.

7. Dentro de las 2 horas siguientes a la interrupción de la reacción de transfección, es posible señalar (por PCR o rt-PCR) la degradación del ARNm de interés, una diana específica del ARNsi previamente insertado, en las plaquetas.

6. Incubar la suspensión de plaquetas a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 % junto con el medio de transfección durante 24/48 h. O bien estimularlas con 2,5 mM de CaCh, 20 pg/ml de Colágeno y 1 U/ml de trombina durante 30 minutos a 37 °C y bloquear el estímulo con 2,5 mM de EDTA.

7. Centrifugar las plaquetas a 3.000 g durante 10 minutos.

8. Recuperar el sobrenadante y volver a centrifugarlo a 12.000 g durante 10 minutos para eliminar los posibles restos de plaquetas.

9. Centrifugar el sobrenadante a 160.000 g durante 1 hora a 4 °C.

10. Eliminar el sobrenadante y resuspender la pella de micropartículas en 1 mililitro de RPM11640 (verificando la concentración de micropartículas con un citómetro de flujo).

La composición del medio RPMI 1640 es (gramos/litro): la lista de componentes expresados en gramos/litro

L-Arginina 0,2

L-Asparagina 0,05

Ácido L-aspártico 0,02

L-Cistina-2HCl 0,0652

Ácido L-Glutámico 0,02

L-Glutamina 0,3

Glicina 0,01

L-Histidina 0,015

Hidroxi-L-Prolina 0,02

L-Isoleucina 0,05

L-Leucina 0,05

L-Lisina-HCl 0,04

L-Metionina 0,015

L-Fenilalanina 0,015

L-Prolina 0,02

L-Serina 0,03

L-Treonina 0,02

L-Triptófano 0,005

L-Tirosina-2Na-2H2O 0,02883

L-Valina 0,02

Biotina 0,0002

Cloruro de colina 0,003

Ácido fólico 0,001

myo-Inositol 0,035

Niacinamida 0,001

Ácido D-Pantoténico Hemicalcio 0,00025

PABA 0,001

Piridoxina-HCl 0,001

Riboflavina 0,0002

Tiamina-HCl 0,001

Vitamina B120,000005

Nitrato de calcio-4 H2O 0,1

Sulfato de magnesio 0,04884

Cloruro de potasio 0,4

Cloruro de sodio 6,0

Fosfato sódico dibásico 0,8

D-Glucosa 2.0

Glutatión, reducido 0,001

Rojo fenol-Na 0,0053

Detección de plaquetas por citometría de flujo (Figura 9).

Las plaquetas se analizaron estableciendo la puerta morfológica con un control sin transfección preparado como se describe en los materiales y procedimientos del ejemplo 4, utilizando un anticuerpo fluorescente anti-CD61 (Beckman Coulter)-fitc y detectando la fluorescencia emitida por el control de transfección del ARNsi TYE 563 DS (IDT).

EJEMPLO 5: Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas y evaluación del porcentaje de transfección

Materiales y procedimientos

Procedimiento de transfección de plaquetas o micropartículas

2. Se procede al aislamiento de las plaquetas plasmáticas por los procedimientos habituales (lavado de plaquetas o filtración en gel).

3. Las plaquetas así aisladas se resuspendieron en RPMI 1640 adicionado con antibióticos (100 U de Penicilina y 100 U de Estreptomicina) o en el mismo plasma del donante, a una concentración comprendida entre 2x105 y 1x106 por microlitro, siendo el límite inferior de dicha concentración 130.000 plaquetas/microlitro, y se transfirieron tasas de un mililitro a una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 %.

4. A continuación, se prepara el medio de transfección, introduciendo 32,4 microlitros de alcohol etílico absoluto, 120 microlitros de una solución de polilisina (0,1 % en agua) y 47,6 microlitros de medio RPMI 1640.

5. Tras esperar 5 minutos, se añadió a la mezcla mencionada el ARNsi de interés hasta la concentración máxima de 200 nM y, tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se transfirió la solución al pocillo en el que se había colocado previamente 1 ml de suspensión de plaquetas.

11. Incubar la suspensión de plaquetas a 37 °C en atmósfera controlada de CO²al 5 % junto con el medio de transfección durante 24/48 h. O alternativamente estimularlas con 2,5 mM de CaCh, 20 pg/ml de Colágeno y 1 U/ml de trombina durante 30 minutos a 37 °C y bloquear el estímulo con 2,5 mM de EDTA.

12. Centrifugar las plaquetas a 3.000 g durante 10 minutos.

13. Recuperar el sobrenadante y volver a centrifugarlo a 12.000 g durante 10 minutos para eliminar los posibles restos de plaquetas.

14. Centrifugar el sobrenadante a 160.000 g durante 1 hora a 4 °C.

15. Eliminar el sobrenadante y resuspender la pella de micropartículas en 1 mililitro de RPM11640 (verificando la concentración de micropartículas con un citómetro de flujo).

L-Arginina 0,2

L-Asparagina 0,05

Ácido L-aspártico 0,02

L-Cistina-2HCl 0,0652

Ácido L-Glutámico 0,02

L-Glutamina 0,3

Glicina 0,01

L-Histidina 0,015

Hidroxi-L-Prolina 0,02

L-Isoleucina 0,05

L-Leucina 0,05

L-Lisina-HCl 0,04

L-Metionina 0,015

L-Fenilalanina 0,015

L-Prolina 0,02

L-Serina 0,03

L-Treonina 0,02

L-Triptófano 0,005

L-Tirosina-2Na-2H2O 0,02883

L-Valina 0,02

Biotina 0,0002

Cloruro de colina 0,003

Ácido fólico 0,001

myo-Inositol 0,035

Niacinamida 0,001

Ácido D-Pantoténico Hemicalcio 0,00025

PABA 0,001

Piridoxina-HCl 0,001

Riboflavina 0,0002

Tiamina-HCl 0,001

Vitamina B120,000005

Nitrato de calcio-4 H2O 0,1

Sulfato de magnesio 0,04884

Cloruro de potasio 0,4

Cloruro de sodio 6,0

Fosfato sódico dibásico 0,8

D-Glucosa 2.0

Glutatión, reducido 0,001

Rojo fenol-Na 0,0053

Detección de plaquetas por citometría de flujo (Figura 10).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para transfectar plaquetas aisladas de sangre periférica con material genético exógeno, comprendiendo o consistiendo dicho procedimiento en las siguientes etapas:

a) añadir una mezcla que comprende o que consiste en material genético y un medio de transfección, comprendiendo dicho medio de transfección alcohol etílico y al menos una poliamina elegida del grupo que consiste en polietilenimina y polilisina, a una suspensión de plaquetas aisladas de sangre periférica suspendidas en un medio de suspensión adecuado; y

b) incubar hasta obtener un porcentaje de plaquetas transfectadas aisladas de la sangre periférica igual al menos al 20 %, preferentemente del 50 al 100 %, incluso más preferentemente del 80 al 100 %, de toda la población de plaquetas, interrumpiendo la transfección y aislando las plaquetas.

2. Procedimiento para la preparación de micropartículas plaquetarias derivadas de plaquetas aisladas de sangre periférica transfectadas con material genético exógeno, comprendiendo o consistiendo dicho procedimiento en las siguientes etapas a) añadir una mezcla que comprende o consiste en material genético y un medio de transfección, comprendiendo dicho medio de transfección alcohol etílico y al menos una poliamina elegida del grupo que consiste en polietilenimina y polilisina, a una suspensión de plaquetas maduras aisladas suspendidas en un medio de suspensión adecuado; y b) incubar, posiblemente estimulando la activación de las plaquetas, hasta obtener micropartículas, interrumpiendo la transfección y aislando las micropartículas.

3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la concentración de plaquetas aisladas de la sangre periférica en suspensión de la etapa a) varía entre 20.000 plaquetas por microlitro y 2 millones, preferentemente entre 200.000 y 1.000.000 por microlitro, incluso más preferentemente entre 250.000 y 350.000, incluso más preferentemente 300.000 por microlitro.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el material genético se selecciona del grupo que consiste en ARNsi, ARNhc, ARNec, ADN, plásmidos.

5. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o una población de micropartículas plaquetarias obtenidas a partir de dicha población de plaquetas, cuyas plaquetas han sido transfectadas con material genético exógeno, y en la que del 50 % al 100 %, incluso más preferentemente del 80 % al 100 % de las plaquetas son plaquetas transfectadas; y en la que dicha población de plaquetas y dicha población de micropartículas plaquetarias se obtienen por el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o población de micropartículas plaquetarias obtenidas a partir de dicha población de plaquetas de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho material genético se selecciona del grupo que consiste en ARNsi, ARNhc, ARNec, ADN, plásmidos.

7. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o la población de micropartículas plaquetarias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, para su uso en terapia como vector en el transporte y transfección de material genético a células aceptoras.

8. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o la población de micropartículas plaquetarias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, para su uso en terapia génica o terapia celular.

9. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o la población de micropartículas plaquetarias de acuerdo con la reivindicación 8, para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el gen diana de la terapia génica es un gen de las mismas plaquetas o de las células aceptoras.

10. Población de plaquetas aisladas de sangre periférica y/o población de micropartículas plaquetarias de acuerdo con la reivindicación 8, para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en la que cuando dicho material genético se selecciona del grupo que consiste en ARNsi, ARNhc, o en dicho ARNsi y ARNhc contenido en plásmidos, la terapia génica consiste en el silenciamiento post-transcripcional de un gen diana.