BRPI0821003B1

BRPI0821003B1 - Método para aumentar a imunorreatividade

Info

Publication number: BRPI0821003B1
Application number: BRPI0821003-9A
Authority: BR
Inventors: Gottfried Baier; Hans Loibner; Manfred Schuster; Günther Lametschwandtner; Dominik Wolf
Original assignee: Medizinische Universität Innsbruck; Apeiron Biologics Ag
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2019-03-26
Also published as: EA018966B1; CN103898051A; ES2665928T3; CN101918544B; DK2220214T3; US8809288B2; JP6175103B2; CA2708343A1; PL2220214T3; JP2011507806A; WO2009073905A3; JP6118491B2; CY1120136T1; EA201000974A1; AU2008336276A1; BRPI0821003A2; HRP20180558T1; US20100260808A1; AU2008336276B2; WO2009073905A2

Abstract

método para aumentar a imunorreatividade a presente invenção refere-se a um método in vitro ou ex vivo para aumentar a imunorreatividade de células do sistema imunológico, que foram postas em contato com um antígeno, sendo que o referido método compreende a redução ou inibição da função de cb1-b das referidas células, aumentando a imunorreatividade das células em relação ao antígeno.

Description

[001] A presente invenção se refere a um processo para modulação da resposta imune de células.

[002] A imunização ativa possibilitou, pela primeira vez, o combate extensivo das doenças infecciosas mais ameaçadoras e, em alguns casos, conseguiu até mesmo sua erradicação mundial, sob uso de um mecanismo de defesa endógeno econômico e altamente eficiente. Portanto, foram e são realizados esforços para desenvolver preparações de vacinação contra diversas indicações profiláticas e terapêuticas. No entanto, uma vacinação eficiente requer uma resposta imune, que leva a uma imunidade protetora. Imunogeneidade insuficiente do antigeno de imunização leva, no entanto, à ausência do efeito desejado. Formulações de antígenos altamente interessante e específicas já foram desenvolvidas para profilaxia, bem como para tratamento de malária, HIV, gripe ou doenças tumorais, para apresentar apenas alguns exemplos proeminentes. No entanto, o sucesso dessas terapias, por exemplo, devido à imunogeneidade insuficiente do antigeno de imunização, não ocorreu. Além disso, mesmo vacinas utilizadas amplamente enfrentam problemas de imunogeneidade insuficiente, tal como a vacina de hepatite B, que apenas para 80% dos tratados também forma efetivamente títulos de resposta imune protetora. A razão fundamental para a ausência da reatividade do sistema imunológico é que esses antígenos não são reconhecidos como estranhos. No mamífero, são sobretudo as células T que decidem se a estrutura apresentada por células apresentadas por antigeno (APCs) é reconhecida como endógena ou como estranha. Para induzir uma resposta imune, são necessários, substancialmente dois sinais separados e separados um do outro. Esse mecanismo deve impedir um excedimento do sistema imunológico. O primeiro pressuposto é que o receptor das células T

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2/26 também reconhece isso pelo antígeno apresentado pela APC. Se esse não for o caso, não ocorre mais nenhuma outra reação. Além disso, para a indução de uma resposta imune, é forçosamente necessária a interação do receptor de CD28 sobre a superfície das células T com B7, que só é expressa sobre a APC quando a mesma classifica a estrutura do antígeno como perigosa. No caso de uma vacinação com um antígeno de vacina só marginalmente imunogênico, a coestimulação através da interação entre B7 e CD28 pode faltar, o que, em consequência, não leva a nenhuma respota imune, mas, mais precisamente, à ocorrência de tolerância no plano das células T. No entanto, pode ser mostrado que a necessidade da coestimulação pode ser contornada por supressão de uma enzima, a E3-ubiquitinligase CB1-b. Essa enzima representa um ponto de ajuste de desvio decisivo no controle da imunorreatividade (Chiang et al., J Clin Invest (2007) doi: 10.1172/JCI29472). Na ausência de Cb1-b, substâncias administradas, mas quase não imunogênicas, podem levar à indução de uma forte resposta imune. Além disso camundongos deficientes em Cb1-b (gene homozigótico knock-out) são aptos viver e seu sistema imunológico está em condições de reconhecer eficientemente tumores induzidos autologamente e formar uma resposta imune lítica contra os mesmos, com base, sobretudo, em células T CD8 (Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699). No entanto, a supressão total, descrita, da enzima também levou a uma autoimunidade aumentada, depois da imunização com superantígenos. Loeser et al, podem mostrar, portanto, que Cb1-b como regulador negtivo é decisivamente responsável pela imunorreatividde de células T.

[003] Tecnologia de siRNA para atenuação da expressão de gene específica também já é descrita para Cb1-b com eficiência menor. O documento US 2007/0087988 se refere a um processo para regulação do HPK1, cuja expressão pode ser aumentada pelo aumento da

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3/26 expressão de Cb1-b e vice-versa (por exemplo, por inibição de siRNA de Cb1-b).

[004] O documento US 2007/0054355 descreve peptídeos de

Cb1-b e proteínas associadas a Cb1-b, particularmente, POSH, e o uso das mesmas para tratamento de doenças associadas a Cb1-b.

[005] O documento WO 2004/078130 A2 se refere a composições para tratamento de doenças associadas a POSH, tais como doenças de vírus, câncer ou distúrbios neurológicos. POSH pode, ser posto à disposição, entre outros, junto com uma pluralidade de proteínas associadas a POSH, entre as quais também Cb1-b.

[006] O documento US 2006/0292119 A1 se refere a processos para aumento da resposta imune de células imunes por inibição de reguladores imunes negativos na célula. Esses reguladores imunes negativos são selecionados de proteínas, que estão em associação com a estabilidade molecular, por exemplo, por ubiquitinação, deubiqutinação e sumoilação, bem como de fatores de transcrição, que induzem a expressão de inibidores de NFKB ou supressores da transcrição de genes-alvo de NFKB.

[007] No entanto não foi descrita nenhuma aplicação de mediadores de Cb1-b apropriada para aplicações clínicas. É, portanto, um objeto da presente invenção por à disposição um processo adequado para a prática, para modulação da imunorreatividade.

[008] A presente invenção se refere, portanto, a um processo in vitro ou ex vivo, para aumento da imunorreatividade de células do sistema imunológico, que foram postas em contato com um antígeno, compreendendo a redução ou inibição da função de Cb1-b dessas células, com o que a imunorreatividade das células contra o antígeno é aumentada.

[009] O gene Cb1-b, bem como os produtos genéticos do mesmo estão descritos detalhadamente no estado da técnica (UniGene Id. Hs

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3144 e Hs.381921). Sequências de Cb1-b estão publicadas, por exemplo, no banco de dados GenBank sob o No. Acc. NM 008279 e NP 009112. Anticorpos de anti-CB1-b, siRNAs e inibidores de antissenso são obteníveis comercialmente. Determinados SrRNAs, apropriados para redução ou inibição da expressão de Cb1-b, e, com isso, também da função de Cb1-b, estão descritos no documento US 2007/0054355 com nucleotideos mistos de RNA/DNA e um comprimento de cerca de 20 bases.

[0010] Para enfrentar o risco de uma reação excessiva do sistema imunológico, que pode levar à indução, por exemplo, de autoimunorreatividade, a inibição/supressão de funções de Cb-1 em células T só pode dar-se em um período estritamente definido temporalmente. Portanto, para uma execução de vacinação terapeuticamente adjuvante é essencial atenuar controladamente Cb1-1 somente por um período limitado, para apoiar a formação de uma resposta imune específica para o antígeno de imunização, mas prevenir uma doença autoimune por restauração a tempo do estado normal imunológico. Portando, de acordo com a invenção apenas uma determinação seleção de células isoladas do sistema imunológico é tratada in vitro ou ex vivo e reconduzido a um paciente. Um ponto de partida de uma atenuação de Cb1b in vitro ou ex vivo eficiente é, portanto, o pressuposto para o aumento da imunorreatividde.

[0011] De preferência, a função de Cb1-b é reduzida ou inibida por redução ou inibição da expressão de Cb1-b. Os termos redução ou inibição referem-se à diminuição da função (ou da expressão) de Cb1b, em comparação com a função natural, não alterada, até a inibição completa da função. De preferência, a função (ou expressão) é reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%.

[0012] A redução ou inibição da função de Cb1-b dá-se em modalidade preferidas de modo transitório. Isto é, a função só é reduzida

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5/26 temporariamente, tal como indicado acima, e em seguida a isso, pode recuperar-se novamente, por exemplo, por consumo ou decomposição de inibidores, tais como, por exemplo, siRNA de Cb1-b, ou por formação nova ou células não prejudicadas por Cb1-b (in vivo). A redução transitória de Cb1-b em células imunes também pode dar-se, nesse caso, de modo repetitivo, por exemplo, até ter sido obtido um sucesso terapêutico.

[0013] De preferência, a expressão de Cb1-b é reduzida ou inibida pelo uso de RNA ou siRNA antissenso de Cb1-b. Para esse fim, são usadas sequências de DNA e/ou RNA curtas, complementarmente a uma parte da sequência de mRNA de alvo (CB-1b), de modo que, com isso, as mesmas se hibridizam e se inativam. O comprimento dessas sequências é, de preferência, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ou 200 bases até a sequência-alvo completa, de preferência, até 2502, 2000, 1500, 1000, 500 ou 300 bases. De preferência, são usadas as sequências do SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e/ou 8.

[0014] A função de CB1-b pode ser igualmente reduzida ou inibida por uma pluralidade de outros componentes conhecidos, tal como, por exemplo, pelo uso de antagonistas, inibidores de CB1-b, particularmente, aptâmeros ou intrâmeros. Quaisquer antagonistas ou inibidores, que podem inibir a ação ou a função de Cb1-b, podem ser usados de acordo com a invenção para aumentar a imunorreatividade das células. De preferência, são usados antagonistas ou inibidores para produção de um agente farmacêutico, para o aumento in vitro, ex vivo, mas também in vivo de acordo com a invenção da imunorreatividade de células do sistema imunológico. São possibilitados tratamentos de doenças com sistema imunológico suprimido ou ineficiente, particularmente, câncer, bem como o aumento da resposta imune contra antígenos(de vacina), que podem ser postos em contato com as células

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6/26 do sistema imunológico in vivo ou ex vivo.

[0015] A presente invenção se refere igualmente a um processo para redução da imunorreatividade de células do sistema imunológico, que compreende a redução ou inibição da função de c-Cb1 das células, com o que a imunorreatividade das células contra o antígeno é reduzida, de preferência, por redução ou inibição transitória, particularmente, por uso de RNA ou siRNA antissenso de c-Cb1. Para aumento da imunorreatividade, não é forçosamente necessário atenuar c-Cb1 em conjunto com Cb1-b. Tal como mostrado nos exemplos, a atenuação de c-Cb1 produz, pelo contrário, uma inversão dos efeitos provocados pela inibição de Cb1-b. Cb1-b e c-Cb1 tem, portanto, funções antagonísticas. C-Cb1 realiza, ainda, uma função, até agora ainda desconhecida, na regulagem fina da reatividade da célula T, sendo que a atenuação da mesma leva a uma imunotolerância aumentada. Portanto, a redução ou inibição da função de c-Cb1 é apropriada para a imunossupressão e possibilita, portanto, o uso da mesma, por exemplo, em inflamações e alergias. Como a extensão e a direção da atenuação depende da dose da redução ou inibição de Cb1-b ou cCb1 (analogamente a Cb1-b, tal como descrito no presente), os dois fatores podem ser reduzidos, em combinação, em sua função. Para aumento da imunorreatividade, predomina a redução de Cb1-b sobre a redução de c-Cb1 e, inversamente à redução. Antissenso de C-Cb1 ou siRNA pode apresentar as mesmas linhas de sequência, tais como descritas acima para Cb1-b. De preferência, são usadas as sequências de SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e/ou 16.

[0016] Especialmente, em modalidades especiais, são usadas células, que absorveram o antígeno e, de preferência, apresentam um fragmento de antígeno ou reconhecem melhor um fragmento de antígeno no contexto de HLA e, com isso são ativadas.

[0017] Em modalidades preferidas, as células a ser usadas de

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7/26 acordo com a invenção são células que apresentam antígeno, PBMCs (Peripheral Mononuclear Cells - Células Mononucleares Periféricas), linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos e/ou células dendríticas, particularmente, linfócitos T, linfócitos CD8+ T, linfócitos CD4+ T, particularmente, Th1, Th2, Th17, tregs (regulatory T cells) ou CE]TL (células T citotóxicas), células NK ou células NKT. Do mesmo modo, é possível, em geral, o uso de linfócitos negativos de CD3/CD19. Células NK formam um grupo particularmente preferido dos mesmos. De preferência, o antígeno foi absorvido pelas células e as mesmas apresentam, de preferência, um fragmento de antígeno. De modo particularmente preferido, PBMCs e células T são tratadas em combinação, para provocar uma reação específica ao antígeno particularmente forte. Em outras modalidades, particularmente, para o aumento geral da imunorreatividade (por exemplo, para tratamento de uma imunodeficiência) diversas células T, sozinhas, são suficientes para obter um efeito amplo. A imunorreatividade aumentada de acordo com a invenção é intermediada, de preferência, por essas células, particularmente, células CD8 ou CD4, jbem como Nk ou NKT.

[0018] Para transfecção das células, particularmente das células T, ou das células NK, com um inibidor de Cb1-b, tal como siRNA de Cb1-b ou um construto de knock-out Cb1-b, é usada, de preferência, a eletroporação. Para esse fim, podem ser usados quaisquer médios, que levam a uma transfecção, portanto são apropriados para a inibição de Cb1-b. Um desses meios é, por exemplo, Optimem (Gibco #31985047).

[0019] Adicionalmente, as células ainda podem ser tratadas ou estimuladas com substâncias imunoestimulantes, por exemplo, uma citocina imunoestimulante ou ligantes de outros receptores imunoestimulantes (tais como TLRs, toll like receptor) ou anticorpos contra moléculas superficiais, de preferência, CD3 e/ou CD28, para promover

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8/26 uma imunorreação pelas células.

[0020] Igualmente, pode ser usada a inibição de Cb1-b no contexto de uma vacinação assistida por células dendríticas, de preferência, uma vacinação antitumor.

[0021] Alternativamente ou adicionalmente, também é possível a cocultura in vitro de células inibidas para Cb1-b com células dendríticas obtidas do paciente, que, de preferência, foram carregadas com antígeno de (células) tumorais, bem como o uso da co-cultura para os fins de acordo com a invenção.

[0022] Vacinação, tal como usado no presente, não deve ser entendido nos sentido absoluto - portanto, de uma administração de um imunógeno, que leva a uma proteção absoluta pelo sistema imune, mas como administração imunológica para aumentar a proteção do sistema imune ou ativar o sistema imune, particularmente, as células do mesmo contra o antígeno da vacina.

[0023] Em um aspecto especial, a presente invenção se refere ao uso de inibidores ou antagonistas de Cb1-b, para produção de uma composição farmacêutica para aumento da imunorreatividade contra um antígeno em um paciente ou o aumento da imunorreatividade em si, que compreende a isolação de células do sistema imune de um paciente, aumento in vitro ou ex vivo a imunorreatividade das células pelo uso dos inibidores ou antagonistas de Cb1-b, e reimplante das células no paciente, sendo que por uma redução ou a inibição da função de Cb1-b das células a imunorreatividade é aumentada.

[0024] Uma realização do aumento da imunorreatividade, de preferência, limitada temporalmente, em acompanhamento a uma vacinação, a administração do antígeno, pode ser provocada por uma redução da expressão de Cb1-b em uma parte pequena das células T circulantes. Para esse fim, podem ser obtidas PBMCs (células de sangue mononucleares, periféricas) de sangue integral ou células de sangue

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9/26 da medula e do próprio tecido tumoral (TILs) do paciente, que, no caso ideal, foi imunizado alguns dias antes, por exemplo, 5 dias, e tratadas in vitro ou ex vivo com uma preparação de atenuação de siRNA específica para Cb1-b. Esse processo ocorre muito rapidamente. No caso ideal, essa preparação de células pode ser novamente administrada ao paciente poucos minutos depois da retirada das mesmas. Opcionalmente, as células podem ser multiplicadas ou expandidas pelos protocolos de estimulação ex vivo, apropriados para as respectivas células, antes que as células sejam reimplantadas. As células T ativadas in vitro, que só representam um pequeno percentual da população de células T do paciente, na circulação das mesmas no organismo do paciente, encontram na glândula linfática as células que apresentam antígeno e que, devido à imunização já realizada, absorveram antígenos e migraram para lá. Uma vez que as células T tratadas in vitro não necessitam de um sinal de coestimulação, as mesmas proliferam imediatamente depois do reconhecimento do antígeno de imunização e despejam citocinas, que contribuem sistemicamente para a indução de uma resposta imune tanto no plano celular como também no plano humoral. Com esse ponto de partida, mesmo antígenos fracamente imunógenos levam ao estabelecimento de uma proteção de vacina duradoura. Do mesmo modo pode ser introduzida, com isso, uma rejeição de tumores autólogos em pacientes com câncer. Um antagonista de Cb1-b aumenta, nesse caso, a imunorreatividde, sendo que o mesmo é usado em um tratamento por quimio-/radioterapia sozinho ou concomitante de doenças oncológicas, ou em combinação com imunizações passivas, tais como anticorpos específicos para o antígeno do tumor.

[0025] Esse processo é apropriado, portanto, para uso no tratamento de uma imunodeficiência congênita ou adquirida, particularmente AIDS, mieloma múltiplo, leucemia linfática crônica, imunossupres

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10/26 são induzida por fármaco ou de uma doença de câncer, opcionalmente, sob seleção de antígenos específicos para a doença. Nesse caso, é particularmente preferido o tratamento de uma doença de câncer, que forma tumores sólidos.

[0026] Para aumentar as chances de sucesso de uma terapia, o tratamento de uma doença de câncer dá-se, de preferência, em combinação com uma outra terapia antitumoral, particularmente, uma quimioterapia, radioterapia, administração de um agente biológico ou vacinação (contra tumor) apoiada por células dendríticas. A inibição de cb1-b pode ser usada no âmbito de uma vacinação apoiada por células dendríticas, de preferência, uma vacinação antitumor. Alternativamente ou adicionalmente, também é possível a co-cultura in vitro de células com cb1-b inibido com células dendríticas obtidas do paciente, que foram, de preferência, carregadas com antígeno de (células) de tumor, bem como o uso da co-cultura para os fins de acordo com a invenção.

[0027] O aumento in vitro ou ex vivo da imunorreatividade pode ser realizado no processo terapêutico, tal como descrito acima, sendo que a exposição das células em relação a um antígeno já pode dar-se antes da retirada das células ou depois.

[0028] A sequência temporal do oferecimento dos antígenos de imunização, sua absorção por células que apresentam antígeno e, ainda, a migração dessas células para o gânglio linfático local, onde as substâncias absorvidas de células T tornadas reativas são apresentadas, é adicionalmente significativo na execução terapêutica. Portanto, o paciente é, de preferência, vacinado ainda antes da isolação das células, de modo particularmente preferido, antes de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 dias e/ou, no máximo, no máximo, 20, 16, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,ou 1 (semana(s) antes da isolação das células. Alternativamente, também é possível uma vacinação ou um tratamento das células in

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11/26 vitro ou ex vivo subsequente com um antígeno.

[0029] Adicionalmente, é possível um uso de células que apresentam antígeno, que, de preferência, se originam do próprio paciente e podem ser postos em contato com antígeno correspondente e, depois, simultaneamente, ou pouco antes ou depois da administração de células imunes inibidas para cb1-b, de preferência, células T, contribuem para o aumento da imunorreatividade específica.

[0030] De preferência, as células são selecionadas especificamente para um determinado antígeno ou células, que compreendem um determinado antígeno, são selecionadas para a especificidade ou presença do antígeno, sendo que a imunorreatividade das células selecionadas é aumentada. Pela seleção de um determinado antígeno ou das células com especificidade para aumento de imunidade para as mesmas, uma imunorreação pode ser dirigida de modo controlado contra um determinado alvo no paciente. Esse alvo é, particularmente, um tumor (pela seleção de pelo menos um ou mais antígenos de tumor) ou um patógeno.

[0031] É vantajoso que, paralelamente à separação das células, já seja carregada no mesmo tubo descartável estéril o siRNA correspondente na preparação de transfecção. Portanto, em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um recipiente estéril, tal como um tubo descartável, que compreende um inibidor de Cb1-b, para aumento da imunorreatividade de células do sistema imune contra um antígeno.

[0032] Do mesmo modo, a presente invenção prevê um kit, que compreende um recipiente, particularmente, um tubo descartável para recepção das células do sistema imune, bem como um inibidor de Cb1-b, tal como siRNA, particularmente, para aumento da imunorreatividade de células do sistema imune contra um antígeno de acordo com o processo de acordo com a invenção.

[0033] O recipiente ou o kit também pode compreender substân

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12/26 cias imunoestimultantes, de preferência, citocina(s) ou ligantes de outros receptores (por exemplo, TLRs) ou anticorpos contra moléculas superficiais, de preferência, CD3 e/ou CD28, para ainda intensificar adicionalmente a estimulação. Do mesmo modo, o kit ou o recipiente ainda podem compreender componentes, meio ou tampões de estabilização (para estabilização das células), soluções de transfecção ou nucleofecção, de preferência, meios de células, tais como RFMI ou Optimem.

[0034] A presente invenção é ilustrada pelas figuras e exemplos seguintes, sem estar limitada aos mesmos.

[0035] Nas figuras mostram:

[0036] Figura 1uma representação esquemática, simplificada da ativação de células T por coestimulação (a) ou, no caso da atenuação da expressão de Cb1-b, por estimulação apenas do receptor de célula T (c), que normalmente não leva à ativação (b);

[0037] Figura 2 uma análise de Western-Blot da expressão de Cb1-b. Células CD8' foram isoladas de PBMC humano, transfectadas com Cb1-b-siRNA, mantidas em cultura e compradas com um grupo de controle sem estimulação, depois de estimulação de anti-CD3 ou depois de estimulação de anti-CD3 e anti-CD28. Como controle de carga foi usado Fyn;

[0038] Figura 3 a secreção de IFN-gama de células CD8' humanas, 2 dias depois do tratamento com siRNA. A concentração de IFNgama foi medida em sobras de células T-CD8', sem estimulação (meio) (à esquerda) e depois de estimulação específica para CD3 (centro) ou depois de co-estimulação específica para CD3 e CD28 (à direita). A cada 2 dias foram comparadas, em cada caso, todas as populações de células, que foram transfectadas com siRNA não específico (1a. coluna), específico para Cb1-b (2a. coluna), especifico para cCB1 (3a. coluna) e específico para CB1-b e c-Cb-1 (4a. coluna);

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13/26 [0039] Figura 4 a secreção de IL2 de células CD8' humanas, 20 dias depois do tratamento com siRNA. A concentração de IL2 foi medida em sobras de células T-CD8', sem estimulação (meio) (à esquerda) e depois de estimulação específica para CD3 (centro) ou depois de co-estimulação específica para CD3 e CD28 (à direita). A cada 2 dias foram comparadas, em cada caso, todas as populações de células, que foram transfectadas com siRNA não específico (1a. coluna), específico para Cb1-b (2a. coluna), especifico para c-CB1 (3a. coluna) e específico para CB1-b e c-Cb-1 (4a. coluna); e [0040] Figura 5 a sequência temporal da execução de atenuação de Cb1-b in vitro, para aumento da imunorreatividade;

[0041] Figura 6 a absorção de siRNA por células T humanas, isoladas de PBMCs (A), a absorção de siRNA por PBMCs com baixa concentração de células CD8 (B);

[0042] Figura 7 a expressão de mRNA de CB1-b, depois de RNAi (A) e quantidade de proteína de Cb1-b produzida, depois de RNAi, em um Western Blot (B);

[0043] Figura 8 a produção de IFN-gama, TNF-alfa, il-2, depois da inibição de Cb1-b;

[0044] Figura 9 a produção de IFN-gama, depois da inibição de Cb1-b como perfil de tempo;

[0045] Figura 10 o aumento da reatividade das células T, medido por expressão dos marcadores CD107a+CD69 (A), CD107a, CD3, CD40L, ICAM (b);

[0046] Figura 11 A: crescimento do tumor em camundongos, depois da terapia, com/sem supressão de Cb1-b em células CD8 terapêuticas; B: mortalidade de camundongos com tumores deEG7ova, depois da terapia.

EXEMPLOS:

Exemplo 1: Sequências

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14/26 [0047] As seguintes sequências de siRNA foram usadas para inibição de Cb1-b, sozinhas ou em combinação:

1. Sequência senso: G.A.A.C.A.U.C.A.C.A.G.G.A.C.U.A.U.G.A.U.U (SEQ ID

No. 1)

Sequência antissenso: S^P.U.C.A.U.A.G.U.C.C.U.G.U.G.A.U.G.U.U.C.U.U (SEQ ID No. 2)

2. Sequência senso: G.U.A.C.U.G.G.U.C.C.G.U.U.A.G.C.A.A.A.U.U (SEQ ID

No. 3)

Sequência antissenso: 5'-P.U.U.G.C.U.A.A.C.G.G.A.C.C.A.G.U.A.C.U.U (SEQ ID No. 4)

3. Sequência senso: G.G.U.C.G.A.A.U.U.U.U.G.G.G.U.A.U.U.A.U.U (SEQ ID

No. 5)

Sequência antissenso: 5'-Ρ.υ.Α.Α.υ.ΑΌ.Ο.Ο.Α.Α.Α.Α.υ.υ.ΟΌ.ΑΌ.Ο.υ.υ.

(SEQ ID No. 6)

4. Sequência senso: U.A.U.C.A.G.C.A.U.U.U.A.C.G.A.C.U.U.A.U.U (SEQ ID

No. 7)

Sequência antissenso:

5'-P.U.A.A.G.U.C.G.U.A.A.A.U.G.C.U.G.A.U.A.U.U (SEQ ID No. 8)

As seguintes sequências de siRNA foram usadas para inibição de c-Cb1, sozinhas ou em combinação:

1. Sequência senso:

A.A.U.C.A.A.C.U.C.U.G.A.A.C.G.G.A.A.A.U.U (SEQ ID

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No. 9)

Sequência antissenso

5'-P.U.U.U.C.C.G.U.U.C.A.G.A.G.U.U.G.A.U.U.U.U (SEQ ID No. 10)

2. Sequência senso: G.A.C.A.A.U.C.C.C.U.C.A.C.A.A.U.A.A.A.U.U (SEQ ID

No. 11)

Sequência antissenso:

5'-P.U.U.U.A.U.U.G.U.G.A.G.G.G.A.U.U.G.U.C.U.U (SEQ ID No. 12)

3. Sequência senso: U.A.G.C.C.C.A.C.C.U.U.A.U.A.U.C.U.U.A.U.U (SEQ ID

No. 13)

Sequência antissenso:

5'-P.U.A.A.G.A.U.A.U.A.A.G.G.U.G.G.G.C.U.A.U.U (SEQ ID No. 14)

4. Sequência senso: G.G.A.G.A.C.A.C.A.U.U.U.C.G.G.A.U.U.A.U.U (SEQ ID

No. 15)

Sequência antissenso: S^P.U.A.A.U.C.C.G.A.A.A.U.G.U.G.U.C.U.C.C.U.U (SEQ ID

No. 16)

Exemplo 2: Redução transitória da expressão de CB1b1-b [0048] Nesse exemplo é mostrado que a imunorreatividade de células T pode ser influenciada ex vivo.

[0049] Por meio de tubos de CPT (vacutainer), foi tirado sangue de um doador e PBMCs foram separados do mesmo por centrifugação. Dessa preparação foram enriquecidas em outro passo células CD8'. As mesmas foram transfectadas por meio de um siRNA específico para Cb1-b, sob uso de um aparelho de transfecção Amaxa (protocolo

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16/26 detalhado no exemplo 3) e cultivadas adicionalmente. Como controle a preparação idêntica foi transfectada com um siRNA não específico, sob uso do protocolo idêntico. Depois de ter sido presumida uma coincidência potencial da função de Cb1-b e c-Cb1, duas outras preparações foram tratadas por meio de siRNA específico para c-Cb1, bem um siRNA específico para uma combinação de c-Cb1 e Cb1-b. Todas as preparações foram levados à cultura por 2 dias. O fato de que a transfecção levou à atenuação desejada da expressão de Cb1-b foi mostrado por uma análise de Western-Blot subsequente. Para induzir a expressão de Cb1-b, as culturas foram estimuladas com CD3 e, em outra preparação, com anticorpos específicos para CD3 e CD28. A expressão de Cb1-b na preparação transfectada foi rebaixada em todos os testes para abaixo de 5% da intensidade de uma transfecção de controle, tal como é visível na figura Uma vez que a estabilidade do siRNA e, consequentemente, uma supressão de expressão eficiente é de duração limitada e não é transmitida a outras células, no caso da preparação selecionada trata-se de uma atenuação transitória da expressão de Cb-1, que está ligada estritamente à presença do siRNA de Cb1-b.

Exemplo 3: Protocolo de transfecção

Nucleofeccão com siRNAs em células T humanas [0050] A nucleofecção é realizada juntamente com outro funcionário do laboratório. Uma pessoa assume o trabalho de pipetar oligos de siRNa e um outro funcionário transfere as amostras para um meio nutriente. Isso acelera significativamente o protocolo.

[0051] 1. Produzir o meio para a RPMI das células (+pen/strep., +L-glut, +10% de FCS).

[0052] 2. Pipetar o meio nutriente em pelo menos tubos de Falcon/construto de 50 ml (um para coletar as células nucleofectadas e um para o meio de lavagem das cubetas), 1 ml/l de amostra de nucleoPetição 870180139534, de 09/10/2018, pág. 25/72

17/26 fecção em cada tubo. Levar os tubos a 37°C.

[0053] 3. Marcar os tubos de Eppendorf para cada amostra de nucleofecção.

[0054] 4. Centrifugar as células nucleofectadas (410 g) por 7 min e remover a sobra. Adicionr Optimem (Gibco, #31985-047), [0055] 5. de modo que a densidade das células perfaça 40 x

10⁶/ml. Pipetar 100 μΙ (= 4 x 10⁶ células) em cada tubo de Eppendorf.

[0056] 6. Adicionar 1,5 - 2,5 μπι de oligo de SiRNA nos tubos de

Eppendorf, que contém as células, logo antes da nucleofecção. Misturar por pipetação e transferir a solução à cubeta (evitar bolhas de ar). Bater a cubeta contra a mesa para remover as bolhas.

[0057] 7. Fechar a tampa e colocar a cubeta no dispositivo de transfecção Amaxa (eletroporador). (Programar U-14 e não V-24 como a melhor opção com a solução de nucleofecção Optimem). Apertar o botão x e remover a cubeta depois do sinal de OK. (Apertar o botão x mais uma vez antes da eletroporação seguinte).

[0058] 8. Adicionar imediatamente 500 μΙ de RPMI (37°C) à cubeta de nucleofecção e misturar cuidadosamente por pipetação com a pipeta de Pasteur. Transferir as células para o tubo de Falcon coletor. Lavar a cubeta uma vez com 500 μΙ de RPMI preaquecido e transferir o restante das células para o tubo de Falcon coletor.

[0059] 9. Repetir os passos 5-7 com cada amostra.

[0060] 10. Colocar os Falcons na incubadora, até que todas as amostras estejam transfectadas.

[0061] 11. Pipetar 4 ml da suspensão de células em cavidades de placas de 6 cavidades: (= 2 amostras) e colocar as placas na incubadora.

[0062] 12. Coletar as células no dia seguinte, contar as mesmas e iniciar a cultura 24 horas depois da nucleofecção realizada tal como descrito cima. Tirar uma alíquota das células para isolação de RNA,

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18/26 para verificar que o gene de alvo esteja regulado para baixo no momento da ativação. As amostras de proteína são tiradas na base da cinética da expressão de proteínas.

Exemplo 4: Eficiência da nucleofeccão [0063] CD8' foi isolado tal como descrito acima de sangue periférico humano. A seleção neg. dá-se através de beads.

Resultado (Comparação Amaxa) [0064] Pureza da população: 97% de CD8' (FACS)

Aparelho	Viabilidade depois de 3,5 h negativo triptano azul (%)	Viabilidade depois de 24 h negativo triptano azul (%)	Eficiência sigGIo pos no FACS (%)
Amaxa V- 24	94	93	96
Não tratado	100	99	0

Teste com Optimem:

Nucleofecção em	Programa	Células depois em	Viabilidade depois de 3,5 h negativo triptano azul (%)	Viabilidade depois de 24 h negativo triptano azul (%)	Eficiência sigGIo pos no FACS (%)
Solução de nucleofecção	V-24	hTC	99	92	96
Optimem	V-24	RPMI	92	67	96
Optimem	U-14	RPMI	95	92	96

[0065] Pela química de proteínas foi comprovada, desse modo, uma expressão nitidamente diminuída de Cb1-b.

Exemplo 5: Aumento transitório da reatividade de células T - Medição de IFN-gama [0066] Foi mostrado, desse modo, que a expressão de Cb1-b em células CD8' humanas pode ser suprimida com pelo menos 95% de

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19/26 eficiência. Como outra consequência é mostra-se agora, que a reatividade da população de células T pode ser igualmente aumentada. Para garantir que o efeito desejado seja exclusivamente específico para

Cb1-b e não pode ser desviado por c-Cb1, no caso da atenuação da expressão de Cb1-b, em outra preparação também foi atenuado c-Cb- e em uma terceira, c-Cb1 e Cb1-b.Todas essas culturas de células CD8' foram mantidos em cultura por dois dias e estimuladas, por um lado, por meio de CD3 e, ainda, por meio de CD3 e CD28, e comparadas com um grupo não estimulado. Normalmente, células T necessitam dessa coestimulação de CD3 e CD28 para proliferar, o que pode ser facilmente comprovado por um vazamento de citocinas inflamatórias nas sobras das culturas.Para detectar essa ativação das células T, foram medidos títulos de IFN-gama nas sobras. Uma representação gráfica da influência da atenuação da expressão por tratamento com siRNA sobre a reatividade das células T está reproduzida na Figura 3.

dias depois da transfecção, todas as culturas de células CD8', que foram transfectadas com siRNA específico para Cb1-b e/ou c-Cb1, foram estimuladas tal como descrito e comparadas com um grupo de controle, que foi transfectado com um siRNA não específico. Células não estimuladas mostraram, em princípio, nenhuma expressão de IFNgama. Depois da estimulação exclusiva com CD3, todas as culturas mostraram uma reatividade aumentada, de modo que pelo menos 500 pg/ml de IFN-gama puderam ser comprovados nas sobras. Nesse caso, para o siRNA específico para c-Cb1 e células transfectadas não especificamente eram muito parecidos (baixos). Apenas células transfectadas com siRNA específico para Cb1-b mostraram uma reatividade nitidamente mais alta, que estava associada a um título de IFN-gama de cerca de 3 ng/ml. A reatividade da preparação de células cotransfectadas com siRNA específico para c-Cb1 e Cb1-b era, no entanto, menor do que depois do tratamento com siRNA específico para Cb1-b

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20/26 e só atingiu 1,2 ng/ml. Uma coestimulação específica para CD3 e CD28 produziu, tal como esperado, em todos os casos, sinais nitidamente mais altos do que a estimulação específica só para CD3. A preparação de controle, que foi tratada com siRNA não específico, produzir títulos de IFN-gama em uma altura de 1,2 ng/ml, enquanto a cultura tratada por meio de siRNA específico para Cb1-b apresentou uma concentração de IFN-gama de 3,8 ng/ml. Foi digno de nota que a cultura coatenuada especificamente para Cb1-b e c-Cb1 apresentou títulos na altura de 1,7 ng/ml, que, portanto, eram nitidamente menores do que os no grupo atenuado com Cb1-b. Também foi inesperado que a população de células que foi tratada com siRNA específico para cCb1, apresentasse uma reatividade acentuadamente menor e só 500 pg/ml de IFN-gama foram medidos nas sobras. Essa concentração é nitidamente menor do que a do grupo de controle coestimulado, tratado não especificamente e comparáveis com valores do grupo de controle só estimulado com anti-CD3. Com isso, contrariamente ao sistema murino, está excluída experimental mente uma redundância de Cb1-b e c-Cb1 em células T CD8' humanas e uma preparação terapêutica só é apropriada através de Cb1-b (e o upstream-regulator [regulador a montante] do mesmo), mas não por meio de combinações de Cb1-b/c-Cb1, para aumento da imunorreatividade. A inibição de cCb1 possibilita, no entanto, uma imunossupressão para outras aplicações, tal como, por exemplo, o tratamento de inflamação ou alergias.

[0067] Esse ponto de partida terapêutico, concebido ou como soloterapia ou associado a uma vacinação, está, ainda, em condições de reconhecer células tumorais disseminadas também na periferia e por formação de uma resposta imune e combater as mesmas de modo eficaz. Usado imediatamente depois do diagnóstico de uma doença de câncer, desse modo também é impedida uma disseminação de um tumor primário.

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Exemplo 6: Aumento transitório da reatividade das células T - Medição de IL2 [0068] Um quadro muito semelhante resultou da medição das concentrações de IL2 nas mesmas sobras, tal como pode ser deduzido da Figura 4. Sem estimulação, não houve nenhuma resposta mensurável, enquanto um tratamento específico de anti-CD3 levou a um sinal nítido, mensurável, em todos os grupos. Desse modo, foram medidos >200 pg/ml no grupo atenuado de Cb1-b. A concentração de IL2 na população coatenuada de Cb1-b e c-Cb1 foi, por sua vez, nitidamente mais baixa e perfaz <100 pg/ml. A coestimulação específica para antiCD3 e anti-CD28 produziu, novamente, sinais mais altos. Em todos os grupos, independentemente do tratamento com siRNA, foram medidas concentrações de IL2 de >800 pg/ml. O grupo de controle produziu títulos muito similares aos de Cb1-b atenuado, de 1,3 ou 1,4 ng/ml. Interessantemente, as concentrações de IL2, depois da atenuação específica para c-Cb1, foram nitidamente menores e perfizeram apenas 800 pg/ml, independentemente do fato de que foram usados apenas cCB1 exclusivamente ou c-Cb1 junto com Cb-b na preparação.

Exemplo 7: Aumento transitório da imunorreatividade [0069] Pelo tratamento in vitro ou ex vivo, a reatividade das células T é aumentada eficientemente, de modo que por exclusiva estimulação do receptor de célula T é possível iniciar a proliferação das células T. Esse é um pressuposto essencial para a execução terapêutica descrita. Devido ao uso da tecnologia de RNAi, essa atenuação é de natureza transitória.

[0070] Essa utilização dessas células modificadas serve para o aumento da imunogeneidade de vacinas, bem como para o aumento geral da reatividade do sistema imunológico. De um paciente é retirado sangue integral cinco dias depois de uma imunização básica em tubos de CPT. Depois de 20 minutos, são isolados do mesmo por centrifuga

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22/26 ção PBMCs. As preparações de células são transfectadas com siRNAs específicos para Cb1-be imediatamente depois reimplantadas no paciente. No dia 10, novamente é retirado sangue integral e do mesmo é obtido um soro. No mesmo são medidos títulos de citocina próinflamatória e comparados com o grupo de controle. Também é analisada a natureza da resposta imune no que se refere à orientação celular de uma resposta imune guiada por Th1 (títulos de IFN-gama, IL2 e 1112 aumentados) ou uma tendência humoral de uma resposta imune orientada por Th2 (títulos de IL4, IL5 e IL10 aumentados). Caso necessário, são realizadas outras imunizações de reforço no intervalo de 14 dias, com ou sem tratamento com PBMC (Figura 5).

Exemplo 8: Nucleofeccão de células T de CD4 e células B de CD19 [0071] PBMCs foram isolados tal como descrito acima e transfectados sob as mesmas condições como no exemplo 3 (U14). O oligo usado para transfecção (siGLO Red) foi usado em uma concentração de 2 μΜ e a absorção específica foi comprovada por meio de FACS, a diferenciação de CD4 e CD8 foi realizada por tingimento duplo simultâneo com FITC de CD4 e CD3-APC (Figura 6A).

[0072] PBMCs foram preparados tal como descrito acima e suas células de CD8 foram isoladas. As células negativas para CD8 restantes foram depois novamente transfectadas com siGLO Red, tal como acima (no entanto, com uma concentração de oligo de 3,3 μΜ). A absorção específica foi comprovada por meio de FACS por tingimento duplo simultâneo com FITC de CD3 e APC de CD19 (Figura 6B). Interessantemente, nesse teste também foi observado que na fração dos linfócitos negativos para CD3/CD19 - que consiste, principalmente, nas células NK - igualmente ocorreu uma absorção eficiente do oligo usado.

[0073] Esse exemplo mostra, portanto, que também outras células imunes podem ser transfectadas de modo altamente eficiente, sob as

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23/26 mesmas condições de transfecção como as células de CDS.

Exemplo 9: Redução transitória da expressão de Cb1-b em células de CD4 humanas no plano de mRNA e proteínas [0074] Células de CD4 foram isoladas de PBMCs por depleção de células de CD8 e cultivadas por meio de estimulação dePHA/antiCD3/28. Depois de 2 semanas, essas células de CD4 foram transfectadas por meio de um siRNA específico para Cb1-b, sob uso do protocolo de transfecção de Amaxa (veja exemplo 3 e 8). Como controle, a mesma preparação foi transfectada com um siRNA não específico, sob uso do protocolo idêntico. Depois da transfecção, as células foram cultivadas com IL-2 (5 ng/ml) por mais um dia e no dia seguinte estimuladas com anticorpos de anti-CD3/28.

[0075] A expressão de mRNA de Cb1-b na preparação transfectada nas células de CD4 estimuladas por 24 h foi diminuída em cerca de 85%, em comparação com a transfecção de controle (Figura 7A).

[0076] A forte redução do mRNA de Cb1-b estava correlacionada, nesse caso, a uma redução comparativamente forte da quantidade de proteína de Cb1-b, tal como foi comprovado no Western Blot (Figura 7B).

Exemplo 10: Aumento da reatividade das células T de CD4 - Medição de citocinas com atividade anti-tumoral [0077] Uma das principais tarefas das células de CD4 nas respostas imunes intermediadas nas células T é a produção de citocinas inflamatórias. Como particularmente importantes para a atividade antitumoral são citadas na literatura as citocinas IL-2, IFN-γβ TNF-a.

[0078] A expressão dessas três citocinas foi, portanto, determinada por meio de ELISA. No momento 24 horas depois da estimulação de anti-CD3/28, essas três citocinas estavam significativamente aumentadas nas células CD4 T humanas de Cb1-b silenciadas(figura 8). Exemplo 11: Evolução transitória do aumento da reatividade de células

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T de CD4 por produção multiplicada de citocinas com atividade antitumoral [0079] Para obter uma atividade antitumoral eficiente de células T de Cb1-b silenciadas é importante que a produção de citocina multiplicada seja mantida também por um determinado período depois da estimulação das células T. No entanto, esse período também deve ser limitado, para minimizar o risco de um estabelecimento permanente de autoimunidade indesejável contra tecido não maligno do paciente.

[0080] Portanto, também foi analisada a produção de IFN-γ em diversos momentos por meio de staining intracelular no FACS. A representação da Figura 9 mostra claramente que o forte aumento da produção de IFN-γ persistiu por pelo menos 48 horas, enquanto 6 dias depois da estimulação ela caiu novamente de volta para um valor comparável ao do controle.

Exemplo 12: Aumento da reatividade das células T - expressão aumentada de moléculas superficiais com propriedades funcionais ou função de marcação de estimulação [0081] A respectiva determinação da produção de citocina como marcador para o silenciamento funcionalmente eficiente de Cb1-b em células T humanas é tecnicamente mais complexo e, portanto, tendencialmente, não pode ser realizada de modo tão próximo em tempo. Portanto, também foi determinada a expressão de marcadores superficiais funcionalmente importantes por meio de FACS.

[0082] CD107a está definido na literatura como marcador superficial para a atividade secretória de células T citotóxicas, e foi determinado, portanto, em células T de CD8 de Cb1-suprimido depois de 24 horas de estimulação de anti-CD3/28. As células T transfectadas com siRNA de Cb1-b mostram, nesse caso, uma atividade secretória substancialmente aumentada (figura 10A).

[0083] Como a molécula de CD107a participa do transporte vesiPetição 870180139534, de 09/10/2018, pág. 33/72

25/26 cular em células T, também pode ser usada, em princípio, como marcador para a atividade secretória de células T de CD4. A figura 10B mostra que a expressão de CD107a também era significativa em células transfectadas com siRNA de Cb1-b em relação a células de controle, de resto, tratadas de modo igual.

[0084] Duas outras moléculas superficiais, que podem ser induzidas por estimulação das células T, são CD40L e ICAM. As duas moléculas são de importância funcional, CD40 L, sobretudo, para a interação com células que apresentam antígeno e para a estimulação/proliferação de células B, ICAM para a interação com células que apresentam antígeno e migração do sistema vascular para o tecido (maligno). A figura 10B mostra que em células T de CD4 humanas, transfectadas com siRNA de Cb1-b, a expressão dessas duas moléculas superficiais estava significativamente aumentada.

[0085] Um dos mecanismos descritos, responsável pelo aumento da reatividade das células T, é a atenuação menos fortemente acentuada de receptores de CD3, que se encontram na superfície d célula. A Figura 10B mostra que também em células T de CD4 humanas, transfectadas com siRNA de Cb1-b, a quantidade de receptores de CD3 ainda encontrada sobre a superfície das células estava nitidamente aumentada.

[0086] Interessantemente, também a expressão na superfície das células do marcador clássico de ativação das células T, CD69, estava aumentada, enquanto a expressão de CD25 permaneceu inalterada. Isso pode ser de importância funcional especial, pois embora CD25 também esteja definido como marcador de estimulação, sua função está associada, especialmente, com a existência e sobrevivência das chamadas células reguladoras T.

[0087] No total, a figura 10 mostra, portanto, que outras moléculas funcionalmente significativas ou apropriadas como marcadores de su

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26/26 perfície, por transfecção com siRNA de Cb1-b, podem ser comparadas em quantidades nitidamente mais altas sobre a superfície das células. Exemplo 13: A transferência conjunta de células T deficientes em Cb1b e células dendríticas é um processo de terapia eficiente em um modelo de tumor in vivo.

[0088] Em camundongos do tipo selvagem foi induzido um tumor por injeção subcutânea de 0,1 milhão de células de EG7ova. No dia 5 e 6 foram então injetadas células T de CD8 e células dendríticas e o efeito dessa terapia celular adotiva foi acompanhado constantemente por medição do crescimento do tumor. A Figura 11 mostra que o crescimento do tumor pode ser suprimido pela transferência de células T deficientes em Cb1-b, de modo substancialmente mais forte e duradouro do que por células T do tipo selvagem.

[0089] A Figura 11B mostra, além disso, que a terapia com células T deficiente em Cb1-b pode garantir uma sobrevivência de longo prazo de uma parte significativa dos camundongos tratados, até o final do período de observação de 80 dias. Contrariamente a isso, o tratamento com células T do tipo selvagem só levou a um prolongamento insignificante da vida, em comparação com o grupo de controle. A Figura 11B mostra, portanto, que uma terapia com células T deficientes em Cb1-b ou com Cb1-b inibido tem uma vantagem significativa em relação a uma terapia com células T normais.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método in vitro ou ex vivo para aumentar a imunorreatividade de células do sistema imunológico, que foram postas em contato com um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende uma redução ou inibição da expressão de Cb1-b pelo uso de uma sequência curta de DNA e/ou RNA, complementar a uma porção da sequência Cb1-b-mRNA, com o que a imunorreatividade das células contra o antígeno é aumentada, e sendo que as células compreende células apresentando antígenos, Células Mononucleares Periféricas (PBMCs), limfócitos T, limfócitos B, monócitos, macrófagos, células NK, células NKT e/ou células dendríticas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência curta de DNA e/ou RNA, complementar a uma porção da sequência Cb1-b-mRNA alvo é RNA ou siRNA antissenso de Cb1-b.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os linfócitos T são linfócitos T CD8+ ou CD4+.
4. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células são tratadas com uma substância estimuladora de imunidade.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a substância estimuladora de imunidade é uma citocina.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a substância estimuladora de imunidade é um anticorpo para uma molécula de superfície.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a molécula de superfície é CD3 e/ou CD28.
8. Uso de uma sequência curta de DNA e/ou RNA, complementar a uma porção da sequência Cb1-b-mRNA, caracterizado

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2/3 pelo fato de que é para produção de uma composição farmacêutica para aumentar a imunorreatividade contra um antígeno em um paciente ou em células imunológicas de um paciente.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para tratamento de uma imunodeficiência congênita ou adquirida.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a imunodeficiência congênita ou adquirida é AIDS, mieloma múltiplo, leucemia linfática crônica, imunossupressão induzida por fármaco ou um câncer.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer forma tumores sólidos.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica para tratamento de um câncer é empregada em combinação com uma outra terapia antitumoral.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a outra terapia antitumoral é quimioterapia, radioterapia, ou administração de uma vacinação biológica ou reforçada por células dendríticas.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a vacinação biológica ou reforçada por células dendríticas é uma vacinação antitumoral.
15. Recipiente, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência curta de DNA e/ou RNA, complementar a uma porção da sequência Cb1-b-mRNA, para aumentar a imunorreatividade de células do sistema imunológico contra um antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou para um uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 14.
16. Kit para realização de um método, como definido em

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3/3 qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uso, como definido nas reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente para recepção de células, e uma sequência curta de DNA e/ou RNA, complementar a uma porção da sequência Cb1-b-mRNA.
17. Kit, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um meio de células e/ou um tampão de transfecção.
18. Kit, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma substância imunoestimuladora.
19. Kit, de acordco com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a substância imunoestimuladora é uma citocina.
20. Kit, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a substância imunoestimuladora é um anticorpo para uma molécula de superfície.
21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a substância imunoestimuladora é CD3 e/ou CD28.