KR101692797B1 - 면역 반응성 증가 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체외에서 항원과 접촉되는 면역계의 세포의 면역 반응성을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 세포의 Cbl-b 기능의 감소 또는 억제를 포함하여 상기 항원에 대한 세포의 면역 반응성을 증가시키는 것을 포함한다.

Description

면역 반응성 증가 방법{METHOD FOR INCREASING IMMUNOREACTIVITY}

본 발명은 세포의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.

저렴하고 매우 효과적인 내생 방어 메카니즘을 사용하는 경우, 능동 면역화가 처음으로 가장 위협적인 감염성 질환에 대한 포괄적 싸움을 가능하게 하여 전세계적 근절을 달성할 수도 있었다. 따라서, 각종 징후에 대한 예방적 및 치료적 백신 접종 어프로치를 개발하기 위한 노력이 행해져 왔다. 그러나, 효율적 면역법은 방어 면역이 생기는 면역 반응의 유도를 요구한다. 그러나, 면역 항원의 면역 원성의 결핍은 발생되는 소망 효력의 실패를 야기한다. 몇몇의 현저한 예를 들자면, 말라리아, HIV, 인플루엔자 또는 종양성 질환의 예방 및 치료를 위해 매우 흥미롭고 구체적인 항원 제제가 이미 개발되어 있다. 그러나, 예컨대, 면역 항원의 면역원성 등의 결핍으로 인하여 이들 치료가 성공적이지 않았다. 또한, 광범위하게 사용되는 백신이라도 실질적으로 치료되는 것의 약 80%에 대해서만 방어 면역 반응 역가를 증진하는 B형 간염 백신 등의 면역원성의 결핍의 문제를 야기한다. 면역계의 반응성의 결핍에 대한 주요 원인은 이들 항원이 "이물"인 것으로 인식되지 않는다는 것이다. 포유류에 있어서, 이것은 주로 항원 제시 세포(APC)로 나타내어지는 구조가 내생인지 또는 이물인지를 인식하는 것을 결정하는 T세포이다. 면역 반응을 유도하기 위해서, 본래 서로 독립된 2개의 분리 신호가 필수이다. 이 메카니즘은 상기 면역계의 오버슈팅을 억제해야하만 한다. 첫번째 선행조건은 상기 APC에 의해 제공된 항원도 인식하도록 T세포 리셉터에 대한 것이다. 이것이 들어맞지 않는 경우에는 더 이상의 반응은 일어나지 않는다. 또한, 면역 반응의 유도를 위해서, 항원 구조를 위험으로서 후반에 분류하는 경우, 상기 APC만에 발현된 B7과 T세포 표면상의 CD28 리셉터의 상호 작용을 갖는 것이 전적으로 필수이다. 미미한 면역원성만을 갖는 백신 항원에 의한 백신 접종의 경우, B7과 CD28메일간의 상호 작용을 통한 공자극(co-stimulation)이 일어나는 것이 실패되고, 이것은 그 후에 면역 반응이 일어나지 않고, 대신에 T-세포 레벨에 대한 내성의 발달을 야기한다. 그러나, 공자극의 필요성이 효소 E3-유비퀴틴 리가아제 Cbl-b를 턴 오프(turn off)함으로서 바이패스될 수 있다는 것이 설명된다. 상기 효소는 면역 반응의 조절에 있어서, 중대한 스위치점이다(Chiang et al., J Clin Invest(2007) doi:10.1172/JCI29472). 그러나, Cbl-b의 부재하에 거의 면역되지 않은 투여된 물질이 강한 면역 반응의 유발을 일으킬 수 있다. 또한, Cbl-b 결손 마우스(동형 유전자 넉아웃)는 가시적이고, 그들의 면역 반응은 동계적으로 유발된 종양을 효율적으로 인식할 수 있고, 주로 CD8 +T-세포에 기초한 용해 면역 반응을 강화할 수 있다(Loeser et al., JEM(2007) doi: 10.1084/iem.20061699). 그러나, 기재되어 있는 효소의 완전 제거는 초항원에 의한 면역 후에 증가된 자가 면역력을 생성한다. 따라서, Loeser et al.은 네가티브 조절인자로서 Cbl-b는 T-세포의 면역 반응에 관여한다는 것을 나타낼 수 있다.

또한, 이미 특정 유전자 발현의 감쇠를 위한 siRNA기술이 보다 낮은 효율성의 Cbl-b에 대해서 기재되어 있다. US 2007/0087988에는 Cbl-b 발현을 증가시킴으로써 증가될 수 있는 또는 그 반대(예컨대, Cbl-b siRNA의 억제)의 발현인 HPK1을 조절하는 방법에 관한 것이다.

US 2007/00543355는 Cbl-b 펩티드 및 Cbl-b 관련 프로테인, 특히, POSH 및 Cbl-b-관련 질병의 치료를 위한 이들의 용도를 기재하고 있다.

WO 2004/078130 A2는 바이러스 질병, 암 및 신경학적 질환 등의 POSH-관련 질병의 치료용 조성물에 관한 것이다. POSH는 Cbl-b를 포함한 다수의 POSH-관련 프로테인과 함께 사용할 수 있다.

US 2006/0292119 A1은 세포의 네가티브 면역 조절인자의 억제에 의해 면역 세포의 면역 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 네가티브 면역 조절인자는 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화 및 수모화, 또한 NFkB 억제제의 발현을 저해하는 전사 인자 또는 NFkb 타켓 유전자의 전사의 억제제에 의한 분자 안정성과 관련된 프로테인으로부터 선택된다.

그러나, 임상 응용용 Cbl-b 메디에이터의 사용에 관한 기재는 없다. 따라서, 본 발명의 하나의 목표는 실용적 용도에 적합한 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것에 있다.

따라서, 본 발명은 생체외에서 세포의 Cbl-b 기능을 감소 또는 억제하여 항원에 대한 이들 세포의 면역 반응을 증가시키는 것을 포함하는, 항원과 접촉되는 면역계 세포의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 Cbl-b 유전자 및 그것의 유전자 생성물이 종래 기술에 상세하게 기재되어 있다.(UniGene Id. Hs.3144 및 Hs. 381921). Cbl-b 서열은 예컨대, Acc. No. NM_-008279 및 NP_-009112 하에 유전자 은행 데이터베이스에 공개되어 있다. 안티-Cbl-b항체, siRNA 및 안티센스 억제제가 시판되어 있다. 특정 siRNA는 Cbl-b 발현을 감소 또는 억제하는데 적합하고, 따라서 Cbl-b 기능도 혼합 RNA/DNA 뉴클레오티드 및 약 20염기의 길이로 US 21007/0054355 등에 기재되어 있다.

자가 면역 반응의 유도가 생길 수 있는 면역계의 과잉 반응의 리스크를 대응하기 위해서, 예컨대, T-세포의 Cbl-b 기능의 억제/넉아웃(knockout)이 엄격하게 한정된 시간에서만 일어날 수 있다. 따라서, 소정 면역 항원에 대하여 특이적인 면역 반응의 개발을 지지하지만, "통상"의 면역학적 상태를 적당하게 복원시킴으로써 자기 면역 질환을 예방하도록 한정 시간 동안에만 제어된 방식으로 Cbl-b를 감쇠시키기 위한 보조 치료 백신 접종 어프로치가 필수적이다. 따라서, 본 발명에 의하여 상기 면역계의 단리 세포의 특정 선택이 생체외에서 처리된 후 환자에게 되돌아간다. 따라서, 효율적인 생체외 Cb1-감소를 위한 하나의 어프로치는 상기 면역 반응을 증가시키기 위한 선행조건이다.

바람직하게는 상기 Cbl-b 기능은 Cbl-b의 발현을 감소 또는 억제함으로써 감소 또는 억제된다. 감소 또는 억제란, 기능의 억제를 완료하기 위해 미변경 자연 기능 상승과 비교하여 Cbl-b의 기능(및/또는 발현)의 감소를 말한다. 바람직하게는 상기 기능(및/또는 발현)은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 감소된다.

바람직한 실시형태에 있어서, Cbl-b의 기능이 일시적으로 감소 또는 억제되는 것이 바람직하다. 즉, 상기 기능은 상술된 바와 같이 일시적으로만 감소된 후 이어서 Cbl-b siRNA 등의 억제제의 소비 또는 분해에 의해 또는 네오제네시스나 비-Cbl-b-손상 세포 등에 의해 회복될 수 있다(생체내). 또한, 면역 세포의 Cbl-b의 일시적 감소는 예컨대, 치료의 성공이 달성될 때까지 반복적으로 이루어질 수 있다.

Cbl-b의 발현은 Cbl-b의 안티센스 RAN 또는 siRNA를 사용함으로써 감소 또는 억제하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 타겟 (Cbl-b)mRNA 서열의 일부와 상보하는 짧은 DNA 및/또는 RNA서열이 사용되어 이들을 하이브리다이징하고 비활성화시킨다. 이들 서열의 길이는 적어도 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 또는 200염기에서 완전 타겟 서열이하가 바람직하고, 2502, 2000, 1500, 1000, 500 또는 300염기 이하가 바람직하다. SEQ ID no. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및/또는 8의 서열이 바람직하게 사용된다.

Cbl-b의 기능과 동일하게 예컨대 Cbl-b 길항제, 억제제, 특히, 압타머 또는 인트라머를 사용함으로써 복수의 다른 공지의 성분에 의해 감소 또는 억제될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라서 Cbl-b의 효과 및/또는 기능을 억제하는 임의의 길항제 또는 억제제가 사용되어 세포의 면역 반응을 증가시킨다. 바람직하게는 면역계의 세포의 면역 반응에 있어서, 생체외 또는 생체내에서라도 본 발명의 개선을 위해, 길항제 또는 억제제가 의약품을 제조하는데 사용된다. 이것은 억제된 또는 비효율적 면역계의 질환, 특히 암의 치료 및 생체외 또는 생체내에서의 면역계의 세포와 접촉할 수 있는 (백신화)항원에 대한 면역 반응에 있어서의 증가를 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 세포의 c-Cbl 기능의 감소 또는 억제를 포함한 면역계의 세포의 면역 반응을 감소시키는 방법에 관한 것이어서 항원에 대한 세포의 면역 반응이 바람직하게는 일시적인 감소 또는 억제에 의해, 특히 c-Cbl 안티센스 RNA 또는 siRNA를 사용하여 감소된다. 상기 면역 반응을 증가시키기 위해서, c-Cbl과 Cbl-b가 함께 연대적으로 감쇠될 필요는 전혀 없다. 실시예에 나타낸 바와 같이, Cbl-b의 억제에 의해 달성된 효과에 있어서, 그 대신 c-Cbl 감쇠는 반전을 산출한다. 따라서, Cbl-b 및 c-Cbl은 길항 작용을 갖는다. 또한, c-Cbl은 감쇠가 증가된 면역 내성을 야기하는 T세포 반응성의 미세 조절에 있어서, 이전에 알려지지 않았던 기능을 행한다. 따라서, 상기 c-Cbl 기능의 감소 또는 억제는 면역 억제에 적합하고, 따라서, 염증 또는 알레르기 등에 이들의 사용을 가능하게 한다. 감쇠의 정도와 방향은 Cbl-b 및/또는 c-Cbl(여기서, Cbl-b과 유사)의 감소 또는 억제량에 따르고, 두개의 인자는 조합하여 그들의 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 면역 반응을 증가시키기 위해, Cbl-b의 감소가 c-Cbl의 감소 보다 크고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. c-Cbl 안티센스 또는 siRNA는 Cbl-b에 대해서 상술한 바와 같은 동일한 서열 라인을 가질 수 있다. SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및/또는 16의 서열이 바람직하게 사용된다.

특정 실시형태에 있어서, 특히, 항원을 취하여 있고, 바람직하게는 항원 단편이 존재하고, 또는 더욱 바람직하게는 HLA의 배경에서 항원 단편을 인지함으로써 활성화되는 세포가 특히 사용된다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따라서 사용되는 세포는 항원 제시 세포, PBMC(peripheral blood mononuclear cells; 말초 혈액 단핵 세포), T-림프구 B-림프구, 단핵 세포, 매크로파지 및/또는 수지상 세포, 특히, T-림프구, CD8+ T-림프구, CD4+ T-림프구, 특히, Th1, Th2, Th17, Tregs(규제 T-세포) 또는 CTL(세포독성 T-세포), NK 세포 또는 NKT 세포이다. 동일하게, 일반적으로 CD3/CD19-네가티브 림프구를 사용할 수도 있다. NK세포는 그것의 특히 바람직한 군을 형성한다. 바람직하게는 상기 항원은 세포에 의해 흡수되고, 이들은 바람직하게는 항원 단편을 제시한다. 특히 바람직하게는 치료를 위해 PBMC와 T-세포가 조합되어 특별히 강한 항원 특이 반응을 유발한다. 다른 실시형태에 있어서, 특히, 면역 반응의 일반적 증가를 위해(예컨대, 면역 불충분성을 처리하기 위해), 각종 T-세포 단독으로 광범위한 효과를 달성하는데 충분하다. 본 발명에 따른 증가된 면역 반응이 이들 세포, 특히, CD8 또는 CD4 세포 및 NK 및/또는 NKT세포에 의해 조정되는 것이 바람직하다.

바람직하게는 일렉트로포레이션이 Cbl-b siRNA 또는 넉아웃 Cbl-b 구조체 등의 Cbl-b 억제제로 세포, 특히, T-세포 또는 NK 세포의 트랜스펙션을 위해 사용된다. 트랜스펙션, 즉, Cbl-b의 억제를 야기하는 임의의 배지가 상기 목적에 적합하다. Optimem(Gibco, #31985-047)은 하나의 이러한 배지의 예이다.

또한, 상기 세포는 처리, 즉, 면역 자극 기질, 예컨대, 다른 면역 자극 리셉터(TLR, 톨형 리셉터 등)의 리간드 또는 면역 자극 사이토카인 또는 표면 분자에 대한 항체, 바람직하게는 CD3 및/또는 CD28로 자극되어 상기 세포에 의해 면역 반응을 촉진해도 좋다.

또한, Cbl-b의 억제는 수지상 세포에 의해 지지된 백신 접종, 바람직하게는 항종양 백신 접종의 일부로서 사용될 수 있다.

대체 및/첨가에 있어서, 본 발명의 목적을 위해 공배양을 사용하는 것도 가능하기 때문에, 상기 세포는 환자로부터 얻어지고, 바람직하게는 종양(세포) 항원이 하중된 수지상 세포에 의해 Cbl-b-억제 세포의 생체외 공배양을 억제한다.

여기서, "백신 접종"이란, 절대적 의미-즉, 임상계에 의해 완전한 예방을 유도하는 면역원의 투여로 이해되는 것이 아니라, 면역계에 의해 예방을 증가시키기거나 및/또는 면역계, 특히, 백신 항원에 대한 그들의 세포를 활성화시키기 위한 면역학적 투여이다.

하나의 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 환자에 있어서, 항원에 대한 면역 반응성을 증가시키거나 및/또는 환자의 면역계의 세포의 단리, Cbl-b 억제제 또는 길항제를 사용하여 환자에게 상기 세포를 재이식함으로써 상기 면역 반응성의 생체외 증가를 포함한 면역 반응성 자체를 증가시키기 위한 약제 조성물 제조용 Cbl-b 억제제 또는 길항제의 용도에 관한 것이고, 여기서, 상기 면역 반응성은 상기 세포의 Cbl-b 기능의 감소 또는 억제에 의해 증가된다.

바람직하게는 제한 시간 동안, 항원의 투여인 백신 접종과 동시에 면역 반응성의 증가의 이식은 순환 T-세포의 작은 부분에 있어서 Cbl-b 발현을 감소시킴으로써 유도될 수 있다. PBMC(말초 단핵 혈액 세포)는 골수로부터 혈액 세포 및/또는 전혈(whole blood)로부터, 및 이상적으로는 수일 전에, 예컨데 5일 전에 면역력이 생긴 환자의 종양 조직 자체(TIL)로부터 얻어지고, Cbl-b-특이 siRNA 감쇠 배치로 생체외에서 처리될 수 있다. 상기 방법은 매우 신속하게 행해진다. 이상적 경우에 있어서, 상기 세포 조제는 제거되어 단지 수분 후에 다시 환자에게 투여될 수 있다. 필요에 따라서, 상기 세포는 상기 세포가 재이식되기 전에 각각의 세포에 적당한 생체외 자극 프로토콜에 의해 증대 또는 증식될 수 있다. 환자의 T-세포 집단의 몇%만을 나타내는 생체외에서 활성된 T-세포는 수용 유기체에서 순환하면서 림프절에서의 항원 제시 세포를 조우하고, 여기서, 이들 항원 제시 세포는 이미 발생되고, 거기에 이동된 면역법으로 인하여 항원을 취한다. 생체외에서 처리된 T-세포는 공자극 시그널을 요구하지 않으므로, 이들은 세포 단계 및 체액 단계 모두에 대한 면역 반응의 유발에 체계적으로 기여하는 면역 항원의 인지 후에 즉시 증식하여 사이토카인을 분비한다. 상기 배치에 의해, 매우 약한 면역원 항원이라도 장기 지속 면역 반응의 확립을 이룰 수 있다. 동일하게, 암환자의 자기 종양의 거절이 이 방법으로 유도될 수 있다. 여기서, Cbl-b 길항제는 면역 반응성을 증가시키고, 여기서, 이것은 독립적으로 및/또는 종양 항원 특이 항체 등의 수동 면역법과 부수하는 화학 요법/방사선 치료와 조합하여 사용된다.

따라서, 상기 방법은 선천성 또는 후천성 면역 결핍, 특히, AIDS, 다발성 골육종, 만성 림프성 백혈병, 약물성 면역 억제 또는 암을 치료하는데 사용되고, 경우에 따라서는 질환 특이 항원의 선택을 위해 사용된다. 특히, 고형암을 포함한 암의 치료에 바람직하다.

치료의 성공률을 증가시키기 위해, 암의 치료가 다른 항암 치료, 특히, 화학 요법, 방사선 치료, 치료의 생물학적 또는 수지상 세포 지지(종양) 백신 접종의 투여와 병용되어 행해진다. Cbl-b의 억제는 수지상 세포 지지 백신 접종, 바람직하게는 항종양 백신 접종의 일부로서 사용될 수 있다. 대체 및/또는 첨가에 있어서, 바람직하게는 종양(세포) 항원으로 하중되어 있는 환자로부터 얻어진 수지상 세포로 Cbl-b-억제 세포의 생체외 공배양도 가능하고, 또한, 본 발명의 목적을 위한 공배양의 사용이 가능하다.

면역 반응성의 생체외 증가는 상술한 바와 같은 치료 방법으로 행해질 수 있고, 경우에 따라서 상기 세포는 세포의 제거 전후에 노출된다.

또한, 취해진 기질이 활성 T-세포로 제시되는 면역 항원을 제시하는 시간적 서열, 항원 제시 세포에 의한 그들의 흡수 및 국소 림프주로의 이들 세포의 더욱 이동은 치료상의 이식에 있어서도 중요한다. 따라서, 환자는 항원을 접종하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 세포의 단리 전, 특히 바람직하게는 세포의 단리 전 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5일 및/또는 20, 16, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1주일이내로 접종한다. 또한, 생체외에서의 항원에 의한 세포의 처리 또는 잇따른 백신 접종도 가능하다.

또한, 바람직하게는 환자 자신으로부터 유래된 항원 제시 세포를 사용하는 것도 가능하고, 상응하는 항원과 접촉되고, 이어서 Cbl-b 억제 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 투여 전후에 함께 또는 바로 특이 면역 반응성의 증가를 위해 기여할 수 있다.

바람직하게는 상기 세포는 임의의 항원에 대해 특이적이고, 또한, 임의의 항원을 포함하는 세포는 항원의 특이성 또는 존재를 위해 선택되고, 여기서, 선택된 세포의 면역 반응성이 증가된다. 면역증가 특이성에 의한 지닌 임의의 항원 및/또는 세포의 선택을 통하여, 타겟 방식에 있어서, 환자의 임의의 타겟에 대해 면역 반응이 지시될 수 있다. 이러한 타겟은 특히, 종양(적어도 하나 이상의 종양 항원의 선택을 통하여) 또는 병원체일 수 있다.

상기 트랜스펙션 배치에서의 상보 siRNA가 이미 세포의 분리와 동시에 동일한 살균 디스포저블 튜브(disposable tube)에 위치된다. 따라서, 다른 실시형태에 있어서, 바람직하게는 본 발명은 특히, 항원에 대한 면역계의 세포의 면역 반응성을 증가시키기 위해 Cbl-b 억제제를 포함한 디스포저블 튜브 등의 살균 컨테이너에 관한 것이다.

동일하게, 본 발명은 특히, 본 발명에 따른 방법에 의해 항원에 대한 면역계의 세포의 면역 반응성을 증가시키기 위해 컨테이너, 특히 면역계의 세포 및 siRNA 등의 Cbl-b 억제제를 유지하는 디스포저블 튜브를 포함하는 키트를 제안한다.

또한, 상기 컨테이너 및/또는 키트는 면역 자극 기질, 바람직하게는 사이토카인 또는 다른 리셉터의 리간드(예컨대, TLF) 또는 표면 분자에 대한 항체, 바람직하게는 CD3 및/또는 CD28을 포함하여 상기 자극을 더욱 향상시킬 수 있다. 동일하게, 상기 키트 또는 컨테이너는 안정화 성분, 배지 또는 버퍼(상기 세포의 안정화를 위해), 트랜스펙션 또는 뉴클레오펙션 용액, 바람직하게는 RPMI 또는 Optimem 등의 세포 배지를 포함할 수도 있다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예로 설명되고, 이들로 한정되는 것은 아니다.

도 1은 공자극에 의한 T-세포 활성(a) 또는 일반적으로 활성(b)을 야기하지 않는 T-세포 리셉터(c)의 단일 자극에 의한 Cbl-b 발현의 감쇠의 경우에서의 T-세포 활성의 단순 개략도를 나타낸다.
도 2는 Cbl-b 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. CD8+ 세포는 Cbl-b-siRNA로 트랜스펙션된 인간 PBMC로부터 단리되고, 배양이 유지되고, 안티-CD3 자극 후에 또는 안티-CD3 및 안티-CD28 자극 후에 자극이 없는 대조군과 비교되었다. Fyn은 하중 조절(대조군)로서 사용되었다.
도 3은 siRNA 처리 2일 후 인간 CD8+ 세포의 IFN-γ 분비를 나타낸다. 상기 IFN-γ농도는 자극 없이(배지)(왼쪽) 및 CD3-특이 공자극(중앙) 후에 또는 CD3 및 CD28-특이 공자극(오른쪽)의 CD8+ T-세포의 상청액에서 측정되었다. 비특이 siRNA(첫번재 바), Cb-b-특이 siRNA(두번째 바), c-Cbl-특이 siRNA(세번째 바) 및 Cbl-b-특이와 c-Cbl-특이 siRNA(4번째 바)에 의해 트랜스펙션된 2일령(two-day-old) 세포 집단이 비교되었다.
도 4는 siRNA 처리 20일 후의 인간 CD8+ 세포의 IL-2 분비를 나타낸다. 자극 없이(배지)(오른쪽) 및 CD3-특이 자극 후(중앙) 또는 CD3- 및 CD28-특이 공자극 후(오른쪽) CD8+ T-세포의 상청액에서의 IL-2 농도가 측정되었다. 비특이 siRNA(첫번째 바), Cbl-b-특이 siRNA(두번째 바), c-Cbl-특이 siRNA(세번째 바) 및 Cbl-b-특이 및 c-Cbl-특이 siRNA(네번째 바)에 의해 트랜스펙션된 2일령 세포 집단이 비교되었다.
도 5는 면역 반응성을 증가시키기 위한 생체외 Cbl-b 감쇠 배치의 시간적 서열을 나타낸다.
도 6은 PBMC로부터 단리된 인간 T세포에 의한 siRNA(A) 흡수 및 CD8-세포 결손 PBMC에 의한 siRNA 흡수(B)를 나타낸다.
도 7은 RNAi 후의 Cbl-b mRNA 발현(A) 및 웨스턴 블롯에서의 RNAi 후에 생성된 Cbl-b 프로테인의 양(B)을 나타낸다.
도 8은 Cbl-b 억제 후의 IFN-γ, TNF-α, IL-2 생성을 나타낸다.
도 9는 시간 프로파일로서 Cbl-b 억제 후의 IFN-γ생성을 나타낸다.
도 10은 CD107a + CD69(A), CD107a, CD3, CD40L, ICAM(B) 마커 발현에 의해 측정된 T-세포 반응성의 증가를 나타낸다.
도 11A는 치료용 CD8 세포에서의 Cbl-b 억제의 유무에 있어서 치료 후의 마우스에서의 종양 성장을 나타내고; B는 치료 후의 EG7ova 종양을 지닌 마우스의 사망률을 나타낸다.

실시예 1: 서열

하기 siRNA 서열은 Cbl-b의 억제를 위해 단독으로 또는 조합으로 사용되었다.

1.센스 서열:

G.A.A.C.A.U.C.A.C.A.G.G.A.C.U.A.U.G.A.U.U (SEQ ID No.1)

안티센스 서열:

5'-P.U.C.A.U.A.G.U.C.C.U.G.U.G.A.U.G.U.U.C.U.U (SEQ ID No.2)

2.센스 서열:

G.U.A.C.U.G.G.U.C.C.G.U.U.A.G.C.A.A.A.U.U (SEQ ID No.3)

안티센스 서열:

5'-P.U.U.G.C.U.A.A.C.G.G.A.C.C.A.G.U.A.C.U.U (SEQ ID No.4)

3.센스 서열:

G.G.U.C.G.A.A.U.U.U.U.G.G.G.U.A.U.U.A.U.U (SEQ ID No.5)

안티센스 서열:

5'-P.U.A.A.U.A.C.C.C.A.A.A.A.U.U.C.G.A.C.C.U.U (SEQ ID No.6)

4.센스 서열:

U.A.U.C.A.G.C.A.U.U.U.A.C.G.A.C.U.U.A.U.U (SEQ ID No.7)

안티센스 서열:

5'-P.U.A.A.G.U.C.G.U.A.A.A.U.G.C.U.G.A.U.A.U.U (SEQ ID No.8)

이하 siRNA-서열은 단독으로 또는 조합으로 사용되어 c-Cbl을 억제하였다:

1.센스 서열

A.A.U.C.A.A.C.U.C.U.G.A.A.C.G.G.A.A.A.U.U (SEQ ID No.9)

안티센스 서열

5'-P.U.U.U.C.C.G.U.U.C.A.G.A.G.U.U.G.A.U.U.U.U (SEQ ID No.10)

2.센스 서열

G.A.C.A.A.U.C.C.C.U.C.A.C.A.A.U.A.A.A.U.U (SEQ ID No.11)

안티센스 서열

5'-P.U.U.U.A.U.U.G.U.G.A.G.G.G.A.U.U.G.U.C.U.U (SEQ ID No.12)

3.센스 서열

U.A.G.C.C.C.A.C.C.U.U.A.U.A.U.C.U.U.A.U.U (SEQ ID No.13)

안티센스 서열

5'-P.U.A.A.G.A.U.A.U.A.A.G.G.U.G.G.G.C.U.A.U.U (SEQ ID No.14)

4.센스 서열

G.G.A.G.A.C.A.C.A.U.U.U.C.G.G.A.U.U.A.U.U (SEQ ID No.15)

안티센스 서열

5'-P.U.A.A.U.C.C.G.A.A.A.U.G.U.G.U.C.U.C.C.U.U (SEQ ID No.16)

실시예 2: Cbl-b 발현의 일시적 감소

본 실시예에 있어서, 생체외 T-세포의 면역 반응성이 영향받을 수 있는 것을 나타낸다.

CPT 튜브(베큐네이터(Vacutainer))를 사용함으로서 도너로부터 전혈이 취해졌고, 상기 PBMC는 원심분리로 분리되었다. 다른 단계에 있어서, 이 조제로부터 CD8+ 세포가 농축되었다. 이것은 Amaxa 트렌스펙션 장치(실시예 3에서 상세된 프로토콜)를 사용한 Cbl-b-특이 siRNA에 의해 트랜스펙션되었고, 더 배양되었다. 대조군으로서 비특이 siRNA에 의한 이상적 배치는 Cbl-b-특이 siRNA에 의해 이상적 프로토콜을 사용하여 트랜스펙션되었고, 더 배양되었다. Cbl-b 및 c-Cbl의 기능의 잠재적 오버랩이 가정되기 때문에, 2개의 다른 배치는 c-Cbl-특이 siRNA 및 c-Cbl-특이와 Cbl-b-특이 siRNA의 조합으로 처리되었다. 모든 배치는 2일 동안 배양되었다. 트랜스펙션이 Cbl-b 발현의 소망의 감소를 야기한다는 사실이 잇따른 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명되었다. Cbl-b 발현을 유도하기 위해서, 상기 배양은 CD3으로 자극되었고, 또한 CD3-특이 및 CD28-특이 항체로 다른 배치에서 자극되었다. 모든 실험에 있어서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 트랜스펙션된 조제에서의 Cbl-b 발현은 대조군 트랜스펙션의 강도의 5% 미만으로 억제되었다. 그 결과, 상기 siRNA의 안정성 및 발현의 효율적 억제가 한정된 기간이었고, 다른 세포로 이동하지 않았기 때문에 분리된 배치는 Cbl-b 발현의 일시적 감소이고, 이것은 상기 Cbl-b siRNA의 존재로 강하게 결속된다.

실시예 3: 트랜스펙션 프로토콜

인간 T-세포에서의 siRNA에 의한 뉴클레오펙션

뉴클레오펙션은 다른 랩 어시스턴트와 함께 연구됨으로써 행해진다. 한 사람은 상기 siRNA 올리고의 피페팅을 행하고, 다른 사람은 배양 배지로 시료를 운반한다. 이것은 현저하게 상기 절차를 촉진한다.

1. 세포 RPMI에 대한 배지를 제조한다(+pen/strep., +L-glut, +10% FCS).

2. 적어도 2개의 50mL 팔콘(Falcon) 튜브/컨스트럭트(contruct)(뉴클레오펙션된 세포를 수집하기 위한 것과 세포 세정 배지를 위한 것)로 배양 배지를 피페팅하고, 각각의 튜브로 1mL/L 뉴클레오펙션 시료를 피페팅한다. 상기 튜브를 37℃로 유지한다.

3. 각각의 뉴클레오펙션 시료에 대한 에펜도르프(Eppendorf) 튜브를 표시한다.

4. 상기 뉴클레오펙션 세포(410g)를 7분 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거한다. Optimem(Gibco, #31985-047)을 가한다.

5. 상기 세포 농도가 40×10⁶m/L가 되게 한다. 각각의 에펜도르프 튜브로 100μL(=4×10⁶세포)를 피페팅한다.

6. 뉴클레오펙션 직전에 세포를 함유하는 에펜도르프 튜브로 1.5-2.5μM siRNA-올리고를 가한다. 피페팅에 의해 혼합하고, 상기 세포로 상기 용액을 이동시킨다(기포 억제). 상기 테이블에 대해 세포를 태핑하여 기포를 제거한다.

7. 상기 Amaxa 트랜스펙션 장치(일렉트로포레이터)에서, 커버를 닫고 상기 세포를 위치시킨다(Optimem 뉴클레오펙터 용액을 사용한 최적 옵션으로서 프로그램 U-14이고 V-24가 아님.). x-버튼을 누르고, OK 시그널 후에 세포를 제거한다(다음 일렉트로포레이션 전에 다시 x-버튼을 누른다).

8. 즉시 상기 뉴클레오펙션 세포에 500μL RPMI(37℃)를 가하고, 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 사용하여 피페팅하여 주의하여 혼합한다. 상기 세포를 상기 수집 팔콘 튜브로 이동시킨다. 500μL 예비 가열된 RPMI로 상기 세포를 한번 세정하고, 상기 세포의 리마인더를 상기 수집 팔콘 튜브로 이동시킨다.

9. 각각에 샘플로 단계 5~7을 반복한다.

10. 모든 시료가 뉴클레오펙션될 때까지 상기 팔콘 튜브를 인큐베이터에 위치시킨다.

11. 상기 4ml의 세포 서스펜션을 6-웰 플레이트 웰(=2개 시료)로 피페팅하고, 상기 플레이트를 인큐베이터에 위치시킨다.

12. 다음 날, 상술한 바와 같이 행해진 뉴클레오펙션 24시간 후에 상기 세포를 수집하고, 이들을 카운팅하여 배양을 개시한다. RNA의 단리를 위한 세포의 부분 표면을 취하여 상기 타겟 유전자가 활성화시에 억제되었는지 여부를 체킹한다. 상기 프로테인 시료는 상기 프로테인 발현 동력학을 기초로 취해진다.

실시예 4: 뉴클레오펙션 효율성

상술한 바와 같이 인간 말초 혈액으로부터 CD8+가 단리되었다. 네가티브 선택은 비즈를 이용하여 행해졌다.

결과(Amaxa 비교):

집단의 순도: 97% CD8+(FACS)

장치	3.5시간 후의 생존력 트리판-블루 네가티브(%)	24시간 후의 생존력 트리판-블루 네가티브(%)	효율성 FAC에서의 SiGlo pos(%)
Amaxa V-24	94	93	96
미처리	100	99	0

Optimem에 의한 실험:

뉴클레오펙션	프로그램	이후의 세포	3.5시간 후의 생존력 트리판-블루 네가티브(%)	24시간 후의 생존력 트리판-블루 네가티브(%)	효율성 FAC에서의 SiGlo pos(%)
뉴클레오펙터 용액	V-24	hTC	99	92	96
Optimem	V-24	RMPI	92	67	96
Optimem	U-14	RMPI	95	92	96

이와 같이, Cbl-b의 명확하게 감소된 발현이 프로테인 화학에서 검출되었다.

실시예 5: T-세포 반응성의 일시적 증가 - IFN-γ의 측정

이와 같이 인간 CD8+ 세포에서의 Cb1-발현은 적어도 95% 효율성으로 억제될 수 있다는 것이 설명되었다. 다른 결과로서, 현재, 상기 T-세포 집단의 반응성이 증가할 수도 있다는 것이 증명된다. 소망의 효과가 독립적으로 Cbl-b-특이이고, c-Cbl에 의해 Cbl-b 발현의 감쇠의 경우에 바이패스될 수 없고, 다른 어프로치에 있어서, 또한, c-Cbl이 감쇠되었고, 세번째 배치에서 c-Cbl 및 Cbl-b가 감쇠되었음이 분명하다. 이들 모두 CD8+세포 배양이 모두 2일 동안 배양되었고, CD3, 또한 CD3와 CD28에 의해 자극되었고, 비자극 군과 비교되었다. 통상적으로는 T-세포는 상기 CD3와 CD28의 공자극을 요구하여 급증하고, 이것은 상기 배양의 상청액에서 염증성 사이토카인의 분비에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 상기 T-세포 활성화를 검출하기 위해서, 상기 상청액에서의 IFN-γ역가가 측정되었다. 상기 T-세포 반응에 대한 siRNA 처리에 의한 발현 감쇠의 영향의 그래프 플롯이 도 3에 나타내어진다. 트랜스펙션 2일 후, 모든 CD8+ 세포 배양은 Cbl-b 및/또는 c-Cbl-특이성 siRNA로 트랜스펙션되었고, 상술한 바와 같이 자극되었으며 비특이 siRNA로 트랜스펙션된 대조군과 비교되었다. 본질적으로 비자극 세포는 IFN-γ발현을 갖지 않는다. 단독의 CD3 자극 후에, 모든 배양은 증가된 반응성을 가져 적어도 500pg/mL IFN-γ가 상기 상청액에서 검출될 수 있었다. c-Cbl 특이 siRNA 및 비특이적으로 트랜스펙션된 세포에 대한 시그널은 매우 유사하였다(낮음). Cbl-b-특이 siRNA로 트랜스펙션된 세포만이 매우 높은 반응성을 가지고, 이것은 약 3ng/mL의 IFN-γ역가와 관련되었다. 그러나, c-Cbl- 및 Cbl-b-특이 siRNA에 의해 공트랜스펙션된 세포 조제의 반응성은 1.2ng/mL만을 도달하는, Cbl-b-특이 siRNA 처리 후의 것보다 낮았다. 모든 경우에 있어서, 기대된 바와 같이 CD3- 및 CD28-특이 공자극은 CD3-특이성 자극 보다 확실하게 높은 시그널이 얻어졌다. 비특이 siRNA로 처리된 대조 조제는 1.2ng/mL의 양으로 IFN-γ역가를 얻는 반면에 Cbl-b-특이 siRNA로 처리된 배양은 3.8ng/mL의 IFN-γ농도를 가졌다. 상기 Cbl-b 및 c-Cbl-특이 공감쇠 배양은 1.7ng/mL의 역가를 가졌고, 이것은 상기 Cbl-b-감쇠군의 것보다 매우 낮다는 것이 주목할만 하였다. 또한, c-Cbl-특이 siRNA로 처리된 세포 집단이 현저하게 낮은 반응성을 갖고, 상청액에서 500pg/mL IFN-γ만이 측정된다는 것이 예기치 않았다. 이 농도는 비특이적으로 처리된 공자극 대조군의 것 보다 현저하게 낮고, 안티-CD3에 의해서만 자극된 대조군의 값과 비교할만하다. 따라서, 쥐과와 대조적으로, 인간 CD8+ T-세포에서의 Cbl-b 및 c-Cbl의 용장성이 실험적으로 배제되었고, Cbl-b(그것의 상류 조절자)에 의해서이고, Cbl-b/c-Cbl 조합에는 의하지 않는 치료 어프로치가 면역 반응성을 증가시키는데 적절하다. 그러나, c-Cbl의 억제는 염증 또는 알레르기의 치료 등의 다른 용도를 위한 면역 억제를 한다.

또한, 단일제 치료 또는 백신 접종과의 조합 중 어느 하나로 설계된 수반 치료 어프로치는 말초에 있어서, 퍼진 종향 세포를 인식하고, 면역 반응을 강화함으로써 장기간 이들과 대항할 수 있다. 암이 진단된 직후에 사용되면, 1차 종양의 퍼짐이 이와 같이 억제된다.

실시예 6: T-세포 반응성의 일시적 증가 - IL-2의 측정

도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 동일한 상청액에 있어서, 상기 IL-2 농도를 측정함으로써 매우 유사한 결과가 얻어졌다. 자극이 없으면, 측정할 수 있는 반응이 없었던 반면에 모든 군에 있어서, 안티-CD3-특이 처리는 확실히 측정 가능한 시그널을 발생한다. 따라서, 상기 Cbl-b-감쇠군에 있어서, >200pg/mL가 측정되었다. 또한, 상기 Cbl-b 및 c-Cb-공감쇠 집단의 IL-2 농도는 매우 낮았고, <100pg/mL가 되었다. 결과적으로, 상기 안티-CD3 및 안티-CD28-비특이 공자극이 보다 높은 시그널을 얻었다. 모든 군에 있어서, siRNA 처리에 상관없이 >800pg/mL의 IL-2농도가 측정되었다. 상기 대조군은 1.3 및 1.4ng/mL의 Cbl-b-감쇠 역가와 매우 유사한 역가를 얻었다. 상기 어프로치에 있어서, c-Cbl만이 단독으로 사용되거나 또는 c-Cbl이 Cbl-b와 함께 사용되거나 하는 것에 상관없이, c-Cbl-특이 감쇠 후의 IL-2 농도는 매우 낮았고, 단지 800pg/mL가 되었다는 것이 흥미롭다.

실시예 7: 면역 반응성의 일시적 증가

생체외 처리로 인하여, T-세포 반응성이 효율적으로 증가되어 T-세포 리셉터의 독점 자극을 통하여 가능해져 T-세포의 증식을 유도한다. 이것은 본 명세서에 기재된 치료 어프로치를 위한 필수 전제조건이다. 상기 감쇠는 RNAi 기술의 사용으로 인한 일시적 성질이다.

이들 변형 세포의 용도는 일반적으로 백신의 면역원성을 증가시키고, 면역계의 반응성을 증가시키는 역할을 한다. 기본적 면역법 5일 후, CPT 튜브에 있어서, 환자로부터 전혈이 취해졌다. 약 20분 후, PBMC는 원심 분리에 의해 단리되었다. 상기 세포 조제는 Cbl-b 특이 siRNA로 트랜스펙션되었고, 그 후 즉시 환자에게 재이식되었다. 10일째, 전혈이 다시 취해졌고, 혈청이 추출되었다. 상기 혈청에 있어서, 염증성 사이토카인 역가가 측정되었고, 대조군과 비교되었다. 또한, 유도된 면역 반응의 성질이 Th1-제어 면역 반응(상승된 IFN-γ, IL-2 및 IL12 역가) 또는 Th2-지시 면역 반응(상승된 IL4, IL5 및 IL10 역가)에서의 체액성 경향의 세포 배양에 관하여 분석되었다. 필요에 따라서, PBMC 치료가 있거나 없이 다른 촉진 면역법이 14일 간격으로 행해진다(도 5).

실시예 8: CD4 T-세포 및 CD19 B-세포의 뉴클레오펙션

상술한 바와 같이 PBMC는 단리되었고, 실시예 3과 동일한 조건 하에 트랜스펙션되었다(U14). 트랜스펙션에 사용되는 올리고(siGLO 레드)는 2μM의 농도로 사용되었고, FACS에 의해 특이 흡수가 검출되었다; CD4 및 CD8 세포의 구별은 CD8-TIFC 및 CD3-APC에 의한 동시 이중 염색법으로 행해졌다(도 6A).

상술한 바와 같이 PBMC가 조제되었고 그들의 CD8 세포가 단리되었다. 이어서, 잔존하는 CD8-네가티브 세포는 상술한 바와 같이 siGLO 레드(올리고 농도가 3.3μM에 의해서라도)에 의해 다시 트랜스펙션되었다. CD-3FITC 및 CD19-APC에 의한 동시 이중 염색법에 의해 FACS에 의해 특이 흡수가 검출되었다. 또한, 본 실험에 있어서, CD3/CD19-네가티브 림프구의 단편에서 사용된 올리고의 효율적 흡수가 발생하였고, 이것은 주로 NK세포로 이루어진다는 것이 관찰되는 것이 흥미롭다.

따라서, 본 실시예는 CD8세포와 동일한 트랜스펙션 조건 하에 다른 면역 세포가 매우 효율적으로 트랜스펙션될 수도 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9 : mRNA 및 단백질 레벨에 대한 인간 CD4세포의 Cbl-b 발현의 일시적 증가

CD4 세포는 CD8 세포의 고갈에 의해 PBMC로부터 단리되었고, PHA/안티-CD3/28 자극에 의해 배양되었다. 2주일 후, 이들 CD4 세포는 Amaxa 트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 Cbl-b-특이 siRNA에 의해 트랜스펙션되었다(실시예 3 및 8 참조). 동일한 배치는 대조 배치로서 동일한 프로토콜을 사용한 비특이 siRNA로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후, 상기 세포는 1일 이상 동안 IL-2(5ng/mL)로 배양되었고, 다음 날 안티-CD3/28로 자극되었다.

24시간 동안 자극된 CD4에서의 대조 트랜스펙션과 비교하여 상기 트랜스펙션된 조제에서의 Cbl-b mRNA 발현이 약 85%까지 감소되었다(도 7A). 웨스턴 블롯에서 검출한 바와 같이 Cbl-b mRNA에서의 급격한 감소는 Cbl-b의 단백질량의 비교적 강한 감소와 상관관계가 있었다(도 7B).

실시예 10: CD4 T-세포 반응성의 증가-항종양 활성으로 사이토카인의 측정

T-세포 조정 면역 반응에서의 CD4-세포의 중요한 임무 중 하나는 염증성 사이토카인의 생성이다. 특히, 상기 문헌은 사이토카인 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α를 특별히 언급한다.

따라서, 이들 3개의 사이토카인의 발현은 ELISA에 의해 측정되었다. 안티-CD/28 자극 24시간 후에, 인간 Cbl-b-사일런스 CD4 T-세포에 있어서, 이들 3개의 사이토카인이 현저하게 상승되었다(도 8).

실시예 11: 항종양 활성으로 사이토카인의 증가된 생성을 통해 CD4 T-세포 반응성의 증가의 일시적 추이

Cbl-b-사일런스 T-세포의 효율적 항종양 활성을 달성하기 위해, 증가된 사이토카인 생성이 T-세포 자극 후의 임의의 기간을 초과하여 계속되는 것을 더 유지하는 것이 중요하다. 그러나, 또한, 상기 기간은 환자의 비악성 조직에 미소망의 자기 면역을 영구적으로 확립하는 리스크를 최소한으로 하기 위해 제한되어야 한다.

따라서, IFN-γ의 생성은 다양한 시점에서 FACS에서의 세포내 염색으로 분석된다. 도 9의 도표는 적어도 48시간 동안 IFN-γ의 표시된 증가가 유지되었지만, 자극 6일 후, 대조군의 것과 비교할 만한 레벨로 떨어지다는 것이 명백하게 나타난다.

실시예 12: T-세포 반응성의 증가 - 기능 특성 및/또는 자극 마커 기능에 의한 표면 분자의 증가된 발현

인간 T-세포의 Cbl-b의 기능적으로 성공한 사일런싱을 위한 마커로서의 사이토카인 생성의 각각의 측정이 기술적으로 더욱 복잡하고, 따라서, 면밀하게 시간내에 실행가능하지 않는 경향이 있다. 따라서, FACS에 의해 기능적으로 중요한 표면 마커의 발현도 측정되었다.

세포 독성 T-세포의 분비 활성에 대한 표면 마커로서 CD107a가 문헌에 규정되어 있고, 따라서, 안티CD3/28자극 24시간 후에 Cbl-b-억제 CD8 T-세포에 대해 측정되었다. 따라서, Cbl-b siRNA로 트랜스펙션된 T-세포는 매우 상승된 분비 활성을 나타냈다(도 10a).

T-세포의 소포 수송에 있어서, 상기 CD107a 분자가 포함되기 때문에, CD4 T-세포의 분비 활성에 대한 주요 마커로서 사용되어도 좋다. 또한, 도 10b는 Cbl-b-siRNA-트랜스펙션 세포에서의 CD107a의 발현이 그것과 달리 처리된 대조군 세포의 것과 비교하여 현저하다는 것을 나타낸다.

CD40L 및 ICAM은 T-세포 자극에 의해 유도될 수 있는 2개의 다른 표면 분자이다. 이들 2개 분자는 특히, 항원 제시 세포와의 상호작용 및 B-세포의 자극/증식을 위한 CD40L, 항원 제시 세포와의 상호 작용 및 혈관계로부터 (악성)조직으로서 이동을 위한 ICAM과 기능성 관련성이 있다. 도 10b는 이들 2개의 표면 분자의 발현이 Cbl-b-siRNA-트랜스펙션 인간 CD4 T-세포에 있어서 현저하게 상승했다는 것을 나타낸다.

T-세포 반응성에 있어서 증가에 관여하는 바와 같은 본 명세서에 기재된 메카니즘 중 하나는 세포 표면 상의 CD3-리셉터의 적게 표명되는 감쇠이다. 또한, 도 10b는 Cbl-b-siRNA-트랜스펙션 인간 CD4 T-세포에 있어서, 여전히 상기 세포 표면상의 CD 리셉터의 양이 분명하게 상승되었다는 것을 나타낸다.

전통의 T-세포 활성 마커 CD 69의 세포 표면 발현도 분명하게 상승되는반면에, 잔존된 CD25의 발현이 변함없다는 것은 흥미롭다. 이것은 CD25가 자극 마커로서도 규정될지라도 그것의 기능이 특히, 소위 T-제어 세포라 불리는 것의 존재 및 생존과 관련되기 때문에 특정 기능 관련성이 있을 수 있다. 따라서, 전반적으로 도 10은 표면 마커로서의 역할을 하는 추가 기능적으로 중요한 분자 또는 분자들이 Cbl-b-siRNA 트랜스펙션에 의해 표면 분자에 분명하게 다량 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.

도 13: Cbl-b-결손 T-세포 및 수지상 세포의 공동 트랜스퍼는 생체내 종양 모델에서 효과적 치료 절차이다.

0.1밀리온 EG7ova 세포의 피하 주사액으로 야생형 마우스에 종양이 유발되었다. 이어서, CD8-T세포 및 수지상 세포는 5일 및 6일에 주입되었고, 이 양자세포 요법의 효과는 종양의 크기를 측정함으로써 계속적으로 추적되었다. 도 11A는 야생형 T-세포에 의해서 보다는 Cbl-b-결손 T-세포의 트랜스퍼에 의해 장시간 동안 더욱 더 강하게 종양 성장이 억제되는 것을 나타낸다.

또한, 도 11B는 Cbl-b-결손 T-세포에 의한 치료가 관찰 기간 종료 80일까지 치료된 마우스의 상당한 부분의 장기 생존율을 확보했다는 것을 나타낸다. 그것과는 달리, 야생형 T-세포에 의한 치료는 대조군에 비하여 약간 긴 평균 여명만을 야기한다. 따라서, 도 11B는 일반적인 T-세포에 의한 치료에 비하여 Cbl-b-결손 또는 억제된 T세포에 의한 치료가 현저한 장점을 갖는다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDIZINISCHE UNIVERSITAT INNSBRUCK APEIRON BIOLOGICS AG <120> Verfahren zur Erhoung der Immunreaktivitat <130> r53419 <150> AT A 1996/2007 <151> 2007-12-10 <160> 16 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 1 gaacaucaca ggacuaugau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 2 ucauaguccu gugauguucu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 3 guacuggucc guuagcaaau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 4 uuugcuaacg gaccaguacu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 5 ggucgaauuu uggguauuau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 6 uaauacccaa aauucgaccu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 7 uaucagcauu uacgacuuau u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 8 uaagucguaa augcugauau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 9 aaucaacucu gaacggaaau u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 10 uuuccguuca gaguugauuu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 11 gacaaucccu cacaauaaau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 12 uuuauuguga gggauugucu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 13 uagcccaccu uauaucuuau u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 14 uaagauauaa ggugggcuau u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 15 ggagacacau uucggauuau u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNAi <400> 16 uaauccgaaa ugugucuccu u 21

Claims (22)

1. 생체외에서 면역계 세포의 면역 반응성을 증가시키는 방법으로서:
   Cbl-b mRNA 서열의 일부와 상보하는 하나 이상의 짧은 DNA 또는 RNA 서열을 사용하여 상기 세포의 Cbl-b 발현을 일시적으로 감소 또는 억제하는 단계를 포함하여 세포의 면역 반응성을 증가시키고,
   상기 세포는 항원 제시 세포, PBMC(말초 혈액 단핵 세포), T-림프구, B-림프구, 단핵 세포, 매크로파지, 및 CD3/CD19-네가티브 림프구 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
2. 생체외에서 면역계 세포의 면역 반응성을 증가시키는 방법으로서:
   ·생체외에서 Cbl-b mRNA 서열의 일부와 상보하는 적어도 하나의 짧은 DNA 또는 RNA서열에 의해 세포를 처리하여 Cbl-b 발현을 일시적으로 감소 또는 억제함으로써 생체외에서 세포의 면역 반응성을 증가시키는 단계를 포함하고,
   상기 세포는 항원 제시 세포, PBMC(말초 혈액 단핵 세포), T-림프구, B-림프구, 단핵 세포, 매크로파지, 및 CD3/CD19-네가티브 림프구 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 세포는 항원과 접촉되는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 세포가 증식되는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
5. 삭제
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 Cbl-b mRNA 서열의 일부와 상보하는 짧은 DNA 또는 RNA 서열은 Cbl-b 안티센스 RNA 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
7. 제 3 항에 있어서,
   상기 세포는 항원을 취하고 있고, 항원 단편이 존재하거나 또는 HLA의 배경에서 항원 단편을 더욱 인지함으로써 활성화되는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
8. 삭제
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 T-림프구는 CD8+ 또는 CD4+ T-림프구인 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포는 면역 자극 기질로 처리되는 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 면역 자극 기질은 면역 자극 사이토카인 또는 다른 면역 자극 리셉터의 리간드, 또는 CD3 혹은 CD28 등의 표면 분자에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
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20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 CD3/CD19-네가티브 림프구는 NK 세포, NKT 세포 또는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응성 증가 방법.
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