MX2010006296A - Metodo para incrementar la inmunorreactividad. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona a un método in vitro o ex vivo para incrementar la inmunorreactividad de las células del sistema inmune, que se pusieron en contacto con un antígeno, el método que comprende la reducción o inhibición de la función Cb1-b de las células, para de esta manera incrementar la inmunorreactividad de las células hacia el antígeno.

Description

MÉTODO PARA INCREMENTAR LA INMUNORREACTIVI La presente invención se relaciona a mé dular la respuesta inmune ele las células.

La inmunización activa hizo posible por a lucha comprensiva contra las enfermedades infe enazantes y aún logró la erradicación mundial sos utilizando un mecanismo de defensa end stoso y altamente eficiente. Por lo tanto, esf do y serán llevados a cabo para desarrollar pro vacunación profilácticos y terapéuticos con dicaciones. Sin embargo, la inmunización eficien inducción de una respuesta inmune, que cond munidad protectora. Sin embargo, la munogenicidad del antigeno de inmunización con lla de que ocurra el efecto deseado. Las formul tigeno altamente interesantes y especificas sarrollado ara la revención el tratamiento uellos tratados. La razón principal para la actividad del sistema inmune es que estos antige conocidos ya que son "extraños". En mami incipalmente las células T que deciden si una esentada por las células que presentan antige rá reconocida como endógena o extraña. Para i spuesta inmune, esencialmente dos señales dependientemente entre si, son necesarias. Este be prevenir la exageración del sistema inmune, errequisito es para el receptor de célula T pa conocer el antigeno ofrecido por la APC. Si est so, entonces no tomará lugar reacción adiciona ra la inducción de una respuesta inmune, es ab encial tener una interacción del receptor CD2 perficie de la célula T con B7 expresado sob lamente cuando esta última clasifica la ni eli r . En el v n mutación decisivo en el control de la inmunorr iang et al., J Clin Invest (2007) doi : 10.1172/ embargo, en la ausencia de Cbl-b, las inistradas que son difícilmente inmunogénic ducir a la inducción de una fuerte respues más, los ratones deficientes de Cbl-b (inactiva homocigótico) son viables y su sistema inmune e onocer eficientemente tumores autologamente indu strucción de una respuesta inmune liti ncipalmente en las células T CD8+ (Loeser et 07) doi:10.1084/iem.20061699) . Sin embargo, la e pleta de la enzima que se ha descrito, también autoinmunidad incrementada después de la inmuni erantigenos . Loeser y colaboradores asi han si mostrar que Cbl-b como un regulador ne ponsable para la "inmunorreactividad" de las cél La tecnolo ía de siRNA ara la atenuac ra el tratamiento de enfermedades asociadas con El documento 2004/078130 A2 se re mposiciones para el tratamiento de enfermedades n POSH, tales como enfermedades virales, sórdenes neurológicos . POSH se puede hacer dispo n una pluralidad de proteínas asociadas a POSH, l-b.

El documento 2006/0292119 Al se relacion ra incrementar la respuesta inmune de célul diante la inhibición de inmunorreguladores negat lula. Tales inmunorreguladores negativos se sel oteínas, que están asociadas con la estabilidad r ejemplo, mediante ubicuitinación, desubicui moilación así como factores de transcripción, expresión de inhibidores de NFkB, o sup anscripción de genes objetivo NFkB. in embar o no s ha descrito el uso de ducción en o inhibición de la función Cbl-b lulas, para de esta manera increme unorreactividad de las células al antigeno.

El gen Cbl-b y sus productos génico scrito en detalle en la técnica relacionada (U . 3144 y Hs . 381921). Las secuencias Cbl-b se ha la base de datos de GenBank, por ejemplo, baj 008279 y NP_009112. Los anticuerpos anti-Cbl-b ibidores de antisentido son disponibles come ertos siRNAs son adecuados para reducir o resión de Cbl-b y asi también la función de ales son divulgados en el documento 21007/0 cleótidos de RNA/DNA mezclados y una Io roximadamente 20 bases, por ejemplo.

Para contrarrestar el riesgo de una sob 1 sistema inmune, que puede conducir a la induc estado inmunologico "normal". Por lo tanto, de presente invención, solamente una cierta se lulas aisladas del sistema inmune se trata in vo y luego se regresa al paciente. Un procedimie enuación de Cbl-b in vitro o ex vivo eficiente p el prerrequisito para incrementar la inmunorreac La función Cbl-b de preferencia se re hibe al reducir o inhibir la expresión de rminos reducción o inhibición relacionados con l la función (y/o expresión) de Cbl-b en compara ción natural sin cambio para la inhibición com nción. La función (y/o expresión) de preferencia r al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95 En modalidades preferidas, la función d eferencia se reduce o se inhibe transientement labras, la función se reduce solo temporalmen te fin, las secuencias de DNA y/o RNA cortas mplementarias a una porción de la secuenci jetivo (Cbl-b) son utilizadas, de modo que de e hibridan con estas y las inactivan. La longitu cuencias es de preferencia por lo menos 15, 18, , 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 0 de bases hasta la secuencia objetivo coi eferencia hasta 2502, 2000, 1500, 1000, 500 o s secuencias de la SEQ ID nos. 1, 2, 3, 4, 5, n de preferencia utilizadas.

Del mismo modo la función de Cbl-b se pu inhibir mediante una pluralidad de otros ocidos, tal como al utilizar antagonistas hibidores en aptámeros o intrámeros particular tagonistas o inhibidores que suprimen el efec ción de Cbl-b también se pueden utilizar de acu vención ara incrementar la inmunorreactivid une in vivo o ex vivo.

La presente invención también se relac odo para reducir la inmunorreactividad de las c tema inmune, que comprende la reducción o inhibi ción de c-Cbl de las células, de modo unorreactividad de las células al antigeno es re ferencia mediante la reducción o inhibición tran ticular al utilizar RNA de antisentido de c-Cb a incrementar la inmunorreactividad, no es abs esario atenuar c-Cbl de manera conjunta junto o se muestra en los ejemplos, la atenuación d bio produce una reversión en los efectos logra ibición de Cbl-b. Cbl-b y c-Cbl por lo ta ciones antagonisticas . C-Cbl también cumple ción previamente desconocida en la regulación ctividad de la célula T en que su atenuación con c-Cbl y viceversa. El antisentido de c-Cbl o ner las mismas lineas de secuencia como aquella teriormente para Cbl-b. Las secuencias de la SEQ , 11, 12, 13, 14, 15 y/o 16 son de preferencia ut En modalidades especiales, las célula mado el antigeno y de preferencia presentan un f tigeno o, aún mejor, reconoce un fragmento de contexto de HLA y de esta manera se ac ilizadas en particular.

En modalidades preferidas, las célul ilizan de acuerdo con la invención son c esentan antigeno, PBMCs (células mononucleares riféricas) , linfocitos T, linfocitos B, crófagos y/o células dendriticas, en particular linfocitos T CD8+, linfocitos T CD4+, en parti 2, Thl7, Tregs (células T reguladoras) o CTL ra incremento general en la inmunorreactividad ( ra tratar una insuficiencia inmune) , varias célu suficientes para lograr un efecto a munorreactividad incrementada de acuerdo con la de preferencia mediada por estas células, en lulas CD8 o CD4 asi como células NK y/o NKT.

La electroporación de preferencia se ut transfección de células, en particular cél lulas NK con un inhibidor de Cbl-b tal como siRN construcción de Cbl-b de inactivación. Cualquier duce a la transfección, es decir, a la inhibici puede ser adecuado para este propósito. Optim 1985-047) es un ejemplo de tal medio.

Además, las células también se pueden cir, estimular con una sustancia inmunoestimu emplo, una citoquina o ligando inmunoestimulante m TLRs Cbl-b con células dendriticas que se han ob ciente y de preferencia se ha encargado con lo tumor (células) , ya que también es posible u ltivo para los propósitos inventivos.

La vacunación" como se utiliza en la va a entender en el sentido absoluto - es ministración de un inmunógeno que conduce a la soluta por el sistema inmune - si no más bi ministración inmunológica para incrementar la r el sistema inmune y/o activar el sistema rticular las células del mismo contra el a cuna .

En un aspecto particular, la presente i laciona al uso' de inhibidores de Cbl-b o antago producción de una composición farmacéu crementar la inmunorreactividad a un antige mitado, concurrentemente con una vacunación, adm l antigeno, se puede inducir al reducir la e l-b en una porción pequeña de las células T c S PBMCs (células de sangre mononuclear perif eden obtener de sangre completa y/o células de s dula ósea y del tejido de tumor mismo (TILs) de ealmente que sea inmunizado unos pocos dias p >r ejemplo, cinco dias, y tratado in vitro o ex te de atenuación de siRNA especifico de Cbl-b. realiza muy rápidamente. En el caso i eparación de células se puede administrar a evamente solo unos cuantos minutos después d movido. Las células opcionalmente se pueden mu pandir por protocolos de estimulación ex vivo ra las células respectivas antes de que las c implantadas . Las células T activadas in tribuyen sistémicamente a la inducción de una uñe en tanto un nivel celular como un nivel hu e lote, aún antigenos débilmente imunogénicos establecimiento de una protección inmune de la 1 mismo modo, el rechazo de tumores antólogos en cáncer se puede inducir de esta manera. Un anta 1-b aqui incrementa la inmunorreactividad, don liza ya sea en una quimioterapia/radioterapia concomitante en combinación con la inmu ivas, tal como anticuerpos específicos de a or .

Este método por lo tanto se utiliza para uficiencia inmune congénita o adquirida, en DA, mieloma múltiple, leucemia linfático unosupresión inducida por fármaco o un ionalmente con la selección de antígenos espe ermedad. El tratamiento de un cáncer ue involuc ndritica, de preferencia una vacunación anti-t a alternativa y/o además, el co-cultivo in vi ¡lulas inhibidas de Cbl-b con células dendritica 1 paciente, de preferencia que sea encargado co tumor (células) , también es posible, asi como -cultivo para los propósitos inventivos.

El incremento in vitro o ex vi munorreactividad se puede realizar en el método mo es descrito en lo anterior, las célula puestas a un antigeno opcionalmente antes o des moción de la células.

La secuencia cronológica de presentar lo inmunogenización, su captación por las c esentan antigeno y además la migración de estas S ganglios linfáticos locales, donde las sustan captado son presentadas a las células T mbién es im ortante una im lementación tera éuti Además, también es posible usar cé esentan antigeno, que de preferencia se or cíente mismo y se pueden poner en contacto con e rrespondiente y luego contribuir hacia el increm unorreactividad específica ya sea conjuntamen tes o después de la administración de las célul hibidas de Cbl-b, de preferencia células T.

Las células de preferencia son específic erto antígeno o células que comprenden un ciert n seleccionadas para la especificidad o pre tígeno, donde se incrementa la inmunorreactivi lulas seleccionadas. A través de la selección de tígeno y/o células con una especificidad de aume ra la misma, una respuesta inmune puede ser diri cierto objetivo en un paciente en una manera di jetivo sería en particular un tumor (a tra lección de or lo menos uno o más antí enos de t ulas del sistema"'''i"ñ1nürie a un antigeno.

Del mismo modo, la presente invención ipo, que comprende un recipiente, en partícul echable para contener las células del sistema i o un inhibidor de Cbl-b, tal como siRNA, en a incrementar la inmunorreactividad de las c tema inmune a un antígeno mediante el método la invención.

El recipiente y/o el equipo tamb prender una sustancia inmunoestimulante, de p oquina(s) o ligandos de otros receptores (po s) o anticuerpos a las moléculas de super ferencia CD3 y/o CD28, para aumentar adicion imulación. Del mismo modo, el equipo de recipien de comprender componentes estabilizantes, uciones reguladoras (para la estabilizació ulas soluciones de transfección o nucleofe eptor de célula T (c) , que usualmente no con ivación (b) ; La Fig. 2 muestra un análisis de Ma tern de la expresión de Cbl-b. Las célula laron de PBMC humana, transfectadas con Cb tenidas en cultivo y se compararon con un grupo , estimulación, después de la estimulación pués de la estimulación anti-CD3 y anti-CD2 lizó como el control de carga; La Fig. 3 muestra la secreción de IFN ulas CD8+ humanas dos dias después del trat NA. La concentración de IFN-? se midió los sob células T CD8+ sin estimulación (medio) (iz pués de la co-estimulación especifica de CD3 pués de la co-estimulación especifica de CD3 recho. Poblaciones de células de dos dias nsfectadas por medio de siRNA no es ecifico ( -estimulación especifica de CD3 y de CD28 (d dió. Poblaciones de células de dos dias ansfectadas por medio de siRNA no especifico ( RNA especifico de Cbl-b (2da barra), siRNA especi l-b (3ra barra) y siRNA especifico de Cbl-pecifico de c-Cbl-b (4ta barra) se compararon; y La Fig. 5 muestra la secuencia cronológi atenuación de Cbl-b in vitro para incre munorreactividad; La Fig. 6 muestra la captación de siR lulas T, aisladas de PBMCs (A) , y la captación d s PBMCs agotadas de células CD8 (B) ; La Fig. 7 muestra la expresión de mRN spués del RNAi (A) , y la cantidad de prot oducida después de RNAi en un Manchado de Western La Fig. 8 muestra la producción de IFN -2 des ués de la inhibición de Cbl-b; ores EG7ova después del tratamiento.

Ej emplos : E emplo 1 : Secuencias Las siguientes secuencias de siRNA se a la inhibición de Cbl-b, solo o en combinación: 1. Secuencia de sentido: .A.C.A.U.C.A.C.A.G.G.A.C.U.A.U.G.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: P.U.C.A.U.A.G.U.C.C.U.G.U.G.A.U.G.U.U.C.U.U (SEQ 2. Secuencia de sentido: .A.C.U.G.G.U.C.C.G.U.U.A.G.C.A.A.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: P.U.U.G.C.U.A.A.C.G.G.A.C.C.A.G.U.A.C.U.U. (SEQ 3. Secuencia de sentido: .U.C.G.A.A.U.U.U.U.G.G.G.U.A.U.U.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: P.U.A.A.U.A.C.C.C.A.A.A.A.U.U.C.G.A.C.C.U.U. (S .U.C.A.A.C.U.C.U.G.A.A.C.G.G.A.A.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: -P.U.U.U.C.C.G.U.U.C.A.G.A.G.U.U.G.A.U.U.U.U (SE 2. Secuencia de sentido: .C.A.A.U.C.C.C.U.C.A.C.A.A.U.A.A.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: -P.U.U.U.A.U.U.G.U.G.A.G.G.G.A.U.U.G.U.C.U.U (SE ) 3. Secuencia de sentido: .G.C.C.C.A.C.C.U.U.A.U.A.U.C.U.U.A.U.U (SEQ ID N Secuencia de antisentido: P.U.A.A.G.A.U.A.U.A.A.G.G.U.G.G.G.C.U.A.U.U <SE 4. Secuencia de sentido: .A.G.A.C.A.C.A.U.U.U.C.G.G.A.U.U.A.U.U {SEQ ID N Secuencia de antisentido: ilizar tubos CPT (Vacutainer) , y las PBMCs se se ntrifugación . En otra etapa, las células CD8 eparación se concentraron. Esas se transíectaron un siRNA específico de Cbl-b utilizando un ansfección Amaxa- (protocolo detallado en el Ejem ltivaron adicionalmente . Un lote idéntico con u pecífico se transfectó utilizando el protocolo i dio de un siRNA especifico de Cbl-b y se icionalmente como el control. Puesto que una so tencial de la función de Cbl-b y c-Cbl es supues ros lotes se trataron mediante siRNA específico a combinación de siRNA específico de c-Cbl y es l-b. Todos los lotes se cultivaron por dos días que la transfección condujo a la atenuación des presión de Cbl-b se demostró mediante el a chado de Western subsecuente. Para inducir la e l-b los cultivos se estimularon con CD3 en ot rictamente a la presencia del siRNA de Cbl-b.

Ejemplo 3 : Protocolo de transfección Nucleofección con siRNAs en células T hum La nucleofección se realiza al juntamente con otro asistente de laboratorio. U liza 'el pipeteo de los oligos de siRNA y la ot nsfiere los especímenes a un medio de cul nificativamente acelera el procedimiento. 1. Preparar el medio para el RPMI en/strep., +L-glut, +10% FCS) . 2. Pipetear el medio de cultivo en por lo os Falcon de 50 mL/construcciones (uno para reco ulas nucleofectadas y uno para el medio de ula) f 1 mL/L de espécimen de nucleofección en var los tubos a 37°C. 3. Marcar los tubos Eppendorf para cada nucleofección . leofección . Mezclar mediante pipeteo y tran Ilición a la célula (prevenir las burbujas de aire celda contra la mesa para remover las burbujas. 7. Cerrar la cubierta y colocar la ce spositivo de transfeccion Amaxa (electroporador ) . 14 y no V-24 como la mejor opción utilizando l leofectora Optimem) . Empujar el botón x y remove spués de la señal OK. (Empujar el botón x nuevam la siguiente electroporacion) . 8. Inmediatamente adicionar 500 µ?. de RPM celda de nucleofección y mezclar cuidadosament pipeteo utilizando la pipeta Pasteur. Trans ulas al tubo Falcon de recolección. Lavar la cel 500 pL de RPMI precalentado y transferir el re ulas al tubo Falcon de recolección. 9. Repetir las etapas 5-7 con cada muestr 10. Colocar los tubos Falcon en la incuba ra verificar si el gen objetivo se ha regulado h cuanto al tiempo de activación. Los espec teinas se toman en la base de las cinéticas de proteina.

Ejemplo 4 : Eficiencia de Nucleofeccion CD8+ se aisló de la sangre humana perif descrita en lo anterior. La selección negativa ilizando cuentas. sultado (comparación de Amaxa) : Pureza de la población: 97% CD8+ (FACS) spositivo Viabilidad Viabilidad Efic después de después de 24h siGl 3.5h Tripano- Tripano-azul FACS azul negativo negativo (%) (%) xa V-24 94 93 96 >lución V-24 hTC 99 92 ícleofector )timem V-24 RMPI 92 67 timem U-14 RMPI 95 92 Así se detectó una expresión defi ducida de Cbl-b en la química de proteína.

Ejemplo 5: Incremento transiente en la célula T-medición de IF -? Así se demostró que la expresión de lulas CD8+ humanas se puede suprimir con por l eficiencia. Como otra consecuencia, ahora será e la reactividad de la población de células T ede incrementar. Para asegurarse que el efecto clusivamente específico de Cbl-b y no pueda ser caso de la atenuación de la expresión de Cbl-b - .tulos de IFN-? en los sobrenadantes se midiero ráfico de la influencia de la atenuación de la ídiante el tratamiento siRNA sobre la reactivida se muestra en la Fig. 3. Dos dias desp ansfección, todos los cultivo de célula ansfectaron con siRNA especifico de Cbl-b y/o timularon como es descrito y se compararon con ntrol que se ha transfectado con un siRNA no s células no estimuladas tuvieron esencialmen presión de IFN-?. Después de la estimulaci clusiva, todos los cultivos tuvieron una evada, de modo que por lo menos 500 pg/mL de I r detectado en los sobrenadantes. Las señales pecifico de c-Cbl y células no espe ansfectadas fueron muy similares (baja) . Sol lulas transíectadas con siRNA especifico de Cbl e se trato con siRNA no específico, produjo un ??-? en una cantidad de 1.2 ng/mL, mientras que atado con siRNA específico de Cbl-b tuvo una co IFN-? de 3.8 ng/mL. Fue notable que e /atenuado especifico de Cbl-b y c-Cbl tuco títu /mL, que fueron así mucho menores que aquellos e nuado, con Cbl-b. También fue inesperado que la células, que se trató con siRNA específico de reactividad significativamente menor y sol /mL de IFN-? se midió en el sobrenada centración es significativamente menor que a po de control co-estimulado no específicamente comparable a los valores del grupo de control e amente con anti-CD3. Así, en contraste con ino, una redundancia de Cbl-b y c-Cbl en cél anas se excluyó experimentalmente y un pro a éutico or la vía de Cbl-b sus re uladores periferia y combatirlas en la corrida en la co construir una respuesta inmune. Cuando s mediatamente después de que un cáncer sea diagnos seminación de un tumor primario también se previe era .

Ejemplo 6: Incremento transiente en la célula T - Medición de IL-2 Un resultado muy similar se obtuvo al centraciones de IL-2 en los mismos sobrenadante de observar de la Fig. 4. Sin la estimulació puesta medible, mientras que un tratamiento i-CD3 condujo una señal definitivamente medibl grupos. Asi >200 pg/mL se midió en el grupo at -b. La concentración de IL-2 en la población at -b y c-Cbl fue nuevamente mucho menor y cuant mL. La co-estimulación especifica de anti-CD3 y su vez rodu o señales más altas. Las concentr Ejemplo 7 : Incremento transiente munorreactividad Debido al tratamiento in vitro o ex actividad de célula T es eficientemente increme posible a través de la estimulación exclusiva célula T inducida a proliferación de células T. errequisito esencial para el procedimiento scrito aquí. Esta atenuación es de una ansiente debido al uso de la tecnología de RNAi.

Esta aplicabilidad de estas células rve para incrementar la inmunogenicidad de vacu crementar la reactividad del sistema inmune e neo días después de una inmunización básica, mpleta se toma de un paciente en tubos CPT. roximadamente veinte minutos, las PBMCs se aísl ntrifugación . Las preparaciones de células se - .evado de IL-4, IL5 y IL10). Si es necesa inmunizaciones de refuerzo con o sin terapia d balizan en un intervalo de 14 dias (Fig. 5) .

Ejemplo 8: Nucleofección de células T CD CD19 Las PBMCs se aislaron como es descr terior y se transfectaron bajo las mismas condi el Ejemplo 3 (U14) . El oligo utilizado para t iGlo rojo) se utilizó una concentración de 2 ptación especifica se detectó mediante ferenciación de células CD4 y CD8 se realizó nchado doble simultáneo con CD8-TIFC y CD3-APC ( Las PBMCs se prepararon como es desc terior y sus células CD8 se aislaron. Las célula CD8 restantes luego se transfectaron con siGl descrito en lo anterior (aunque con una conce ciente bajo las mismas condiciones de transfe células CD8.

Ejemplo 9: Reducción transiente en la -b en células CD4 humanas sobre un mR A y eína Las células CD4 se aislaron de las PBMC agotamiento de células CD8 y se cultivaron m imulación de PHA/anti-CD3/28. Después de dos as células CD4 se transfectaron mediante ecifico de Cbl-b utilizando el protocolo de tr xa (ver Ejemplos 3 y 8) . Un dato idéntico se un siRNA no especifico utilizando el protocol o el lote de control. Después de la transfe ulas se cultivaron con IL-2 (5 ng/mL) por un di imularon con anti-CD3/28 el siguiente dia.

La expresión mRNA de Cbl-b en la p nsfectada se redujo por aproximadamente 85% en c respuesta inmune mediada por célula T es la pro oquinas inflamatorias. La literatura men ticular las citoquinas IL-2, IFN-? y TNF-OÍ en pa La expresión de estas tres citoquinas po determinó mediante ELISA. En el tiempo 24h des imulación de anti-CD2/28, estas tres cito varon significativamente en las células T CD4 s Cbl-b humanas (Fig. 8).

Ejemplo 11: Curso transiente del increm ctividad de célula T CD4 a través de la rementada de citoquinas con actividad anti-tumor Para lograr la actividad anti-tumor ef células T silenciadas con Cbl-b, es importa ducción de citoquina incrementada permanezca ha ante un cierto periodo de tiempo despué imulación de la célula T. Sin embargo, ese m o también debe ser limitado con el fin de mi troles .

Ejemplo 12 : Incremento en la reactivida - expresión incrementada de moléculas de supe opiedades funcionales y/o función de ma timulación La determinación respectiva de la pro toquina como un marcador para silenciar funcio era exitosa el Cbl-b en células T humanas es t s compleja y por lo tanto tiende a no ser eje trechamente en el tiempo. La expresión de los ma perficie funcionalmente importantes mediante F to también se determinó .

CD107a se define en la literatura como superficie para la actividad secretoria de totóxicas y por lo tanto se determinó en las cé primidas de Cbl-b después de 24h de la estin - n S células de control tratadas de otra manera smas .

CD40L e ICA son otras dos moléculas de e pueden ser inducidas por la estimulación de tas dos moléculas son de relevancia funcional, rticular para la interacción con las células qu tigeno y para la estimulación/proliferación de M para la interacción con células que presenta migración fuera del sistema vascular en aligno) - La Fig. 10B muestra que la expresión de léculas de superficie fue significativamente ele lulas T CD4 humanas transíectadas con Cbl-b-siRNA Uno de los mecanismos descrito sponsable para el incremento en la reactividad d la atenuación menos pronunciada de los rece bre la superficie de la célula. La Fig. 10B mues ntidad de los rece tores CD3 todavía sobre en la nción está especialmente asociada con la p pervivencia de las llamadas células T reguladoras En conjunto, la Fig. 10 por lo tanto m s moléculas funcionalmente importantes adic léculas que sirven como marcadores de superficie tectar en cantidades claramente más grandes perficie de la célula mediante la transfección RNA.

Ejemplo 13: La transferencia conjunta de ficiente de Cbl-b y células dendriticas es un pr rapéutico efectivo en un modelo de tumor in vivo .

Un tumor se indujo en ratones de tipo diante la inyección subcutánea 0.1 millones 7ova. Luego las células T CD8 y las células den yectaron en los dias 5 y 6 y el efecto de esta lula adoptiva se rastreo continuamente al e imiento del t m r. La Fi . 11A muestra ue el s. En contraste con eso, el tratamiento con las tipo silvestre condujo a solamente una expectaci eramente más larga en comparación con el grupo lo tanto, la Fig. 11B muestra que el trata ulas T deficientes de Cbl-b o inhibidas tiene u nificante en comparación con el tratamiento con males .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Métodos in vitro o ex vivo para incr unorreactividad de células del sistema inmune, sto en contacto con un antigeno, caracteriza prenden una reducción en o inhibición de la fun estas células, de modo que se incr unorreactividad de las células al antigeno. 2. Un método de conformidad con la rei caracterizado en que la función de Cbl-b se r ibe al reducir o inhibir la expresión de Cbl-b. 3. El método de conformidad con la reivin 2, caracterizado en que la reducción en o inhibi ción de Cbl-b es transiente. 4. El método de conformidad con cualqui vindicaciones 1 a 3, caracterizado en que la ex -b se reduce o se inhibe al utilizar RNA de anti -b o siRNA. igeno, de preferencia mediante la reducción o ansíente, en particular mediante el uso d isentido de c-Cbl o siRNA. 7. El método de conformidad con cualqui ivindicaciones 1 a 6, caracterizado en que las c tado el antigeno y de preferencia presentan un antigeno o reconocen mejor un fragmento de ß??? texto de HLA y de esta manera son activadas. 8. El método de conformidad con cualqui ivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que l prenden células que presentan antigeno, PBMC onucleares de sangre periférica) , linfocitos T, monocitos, macrófagos, células NK, células NKT dríticas, en particular linfocitos T, de focitos T CD8+ o CD4+. 9. El método de conformidad con cualqui vindicaciones 1 a 8, caracterizado en que las hibidores antagonistas de Cbl-b y la reimplantac lulas en el paciente, en donde la inmunorreac crementa mediante una reducción en o inhibic nción de Cbl-b de las células. 11. El uso de conformidad con la reivind racterizado porque es para el tratamiento munoinsuficiencia congénita o adquirida, en DA, mieloma múltiple, leucemia linfática munosupresión inducida por fármaco o un cáncer. 12. El uso de conformidad con la reivind racterizado en que el cáncer forma tumores sólido 13. El uso de conformidad con la reivin 12, caracterizado porque es para el tratamie ncer en combinación con otro tratamiento anti eferencia quimioterapia, radioterapia, adminis a vacunación biológica o soportada en célula den rticular vacunación de tumor. nen en contacto con el antigeno in vitro o ex vi 16. El uso de conformidad con cualqui ivindicaciones 10 a 15, caracterizado en que el vitro o ex vivo en la inmunorreactividad o las fine como en las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 9. 17. El uso de conformidad con cualqui ivindicaciones 10 a 16, caracterizado en que l pecificas para un cierto antigeno o células que cierto antigeno se seleccionan para la especif la presencia del antigeno, y se incr munorreactividad de las células seleccionadas. 18. El uso de conformidad con la reivind racterizado en que el antigeno es un antigeno de 19. El uso de conformidad con cualqui vindicaciones 1 a 18, caracterizado en que las panden antes de la reimplantación. 20. Un recipiente, de preferencia S reivindicaciones 10 a 19, caracterizado porque recipiente, de preferencia un tubo desecha tener células, un inhibidor de Cbl-b y de pref dio de célula y/o una solución reguladora de tran 22. El recipiente de conformidad ivihdicación 20 o el equipo de conformida ivindicación 21, caracterizado porque comp stancia inmunoestimulante, de preferencia cito rticular CD3 y/o CD28.