CN116688132B - Myo7a基因和/或蛋白的抑制剂在制备药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了MYO7A基因和/或蛋白的抑制剂在制备药物中的应用，所述抑制剂为抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂。本发明提供了新型免疫治疗靶点MYO7A，敲低CD8+T细胞的MYO7A基因可促进其分泌干扰素，抑制肿瘤生长，显著增强对癌症的治疗效果。本发明还通过辐照后的感染EBV的LCLs，并用其刺激自体的PBMC制得EBV特异的CD8+T细胞。由于LCLs和PBMC来自于同一供体，所以避免了免疫排斥，可用于过继回输，快速在体内评价CD8+T细胞中基因表达的变化对肿瘤的影响。

Description

MYO7A基因和/或蛋白的抑制剂在制备药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药、肿瘤免疫治疗和细胞过继治疗领域，具体地，涉及MYO7A基因和/或蛋白的抑制剂在制备药物中的应用。
背景技术
以过继细胞治疗和免疫检查点抑制剂治疗为代表的免疫疗法是一种新兴的肿瘤治疗方法，极大改变了癌症治疗的模式，获得了持久的临床反应。不过，肿瘤免疫治疗仍存在如不良反应、耐药性、高复发转移率和靶点非普适性导致药物的低响应率等问题。
免疫检查点对维持机体免疫稳态和抗肿瘤作用至关重要。肿瘤常常通过上调其表面的配体如PD-L1，结合免疫细胞上的抑制性受体结合如PD-1，劫持免疫检查点抵制免疫细胞对肿瘤的攻击。目前肿瘤免疫治疗最大的痛点是免疫检查点的响应率低。近年来，虽然随着免疫检查点抑制剂在临床试验中的巨大成功，已有多种免疫检查点如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3等单克隆抗体被批准或正在临床实验用于治疗多种实体瘤，但并非所有的肿瘤对免疫检查点抑制剂都有响应，比如PD-1/PD-L1等治疗性单克隆抗体在肿瘤治疗中的低响应率是限制其在临床上的广泛应用的重要原因之一。
因此，亟需探索和开发新的针对泛癌种的免疫治疗靶点以提高其杀伤实体瘤的响应率，这将为丰富临床免疫治疗难治性恶性实体瘤的疗法提供理论依据，对提高癌症病人生存率、延长病人的生存时间具有重要的临床意义。
发明内容
为了解决现有技术中免疫治疗靶点对杀伤实体瘤的响应率低的问题，本发明提供了MYO7A基因和/或蛋白的抑制剂在制备药物中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达被抑制的T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂在制备T细胞治疗癌症的增效剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于治疗癌症的组合物。
本发明的第五个目的是提供上述组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明聚焦于实体瘤的免疫检查点响应率低的前沿领域，通过对实体瘤的单细胞测序数据分析、筛选、利用基因工程手段改造人的免疫细胞验证新型免疫治疗靶点MYO7A提高CD8+T细胞肿瘤的治疗效果。基于本发明新发现的免疫治疗新靶点MYO7A，有望与其他免疫疗法如免疫检查点抑制剂、TCR-T和CAR-T联用，为推动肿瘤免疫治疗提供具有临床应用前景的新思路。
一种抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，所述T细胞为CD8+T细胞。
更优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与外周血单核细胞共培养得到。
进一步优选地，所述辐照的方法为用X射线照射。
具体的，所述辐照的方法包括以下步骤：用80Gy的X射线照射2×106个永生化的类淋巴母细胞系，将照射后的永生化的类淋巴母细胞系在含有120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基中培养。
进一步优选地，所述外周血单核细胞来源于受治疗者。
进一步优选地，所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
最优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与受治疗者的外周血单核细胞共培养得到；所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
优选地，所述试剂为sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以MYO7A基因和/或MYO7A蛋白作为靶标。
更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以MYO7A基因的第347bp～第830bp的片段作为基因编辑位点，所述基因编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
优选地，所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。
更优选地，所述基因编辑载体为表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2载体。
更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个。
最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列。
优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。
更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更进一步优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。
更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。
优选地，所述癌症包括肝癌和/或淋巴癌。
更优选地，所述淋巴癌由EBV感染所引发。
MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达被抑制的T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，所述T细胞为CD8+T细胞。
更优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与外周血单核细胞共培养得到。
进一步优选地，所述辐照的方法为用X射线照射。
具体的，所述辐照的方法包括以下步骤：用80Gy的X射线照射2×106个永生化的类淋巴母细胞系，将照射后的永生化的类淋巴母细胞系在含有120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基中培养。
进一步优选地，所述外周血单核细胞来源于受治疗者。
进一步优选地，所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
最优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与受治疗者的外周血单核细胞共培养得到；所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
优选地，用于抑制MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂为sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以MYO7A基因和/或MYO7A蛋白作为靶标。
更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以MYO7A基因的第347bp～第830bp的片段作为基因编辑位点，所述基因编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
优选地，所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。
更优选地，所述基因编辑载体为表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2载体。
更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个。
最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列。
优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。
更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更进一步优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒按照质量比5：3：2共转染。
更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。
更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。
一种抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂在制备T细胞治疗癌症的增效剂中的应用。
优选地，所述T细胞为CD8+T细胞。
更优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与外周血单核细胞共培养得到。
进一步优选地，所述辐照的方法为用X射线照射。
具体的，所述辐照的方法包括以下步骤：用80Gy的X射线照射2×106个永生化的类淋巴母细胞系，将照射后的永生化的类淋巴母细胞系在含有120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基中培养。
进一步优选地，所述外周血单核细胞来源于受治疗者。
进一步优选地，所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
最优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与受治疗者的外周血单核细胞共培养得到；所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
所述增效剂用于增强T细胞治疗癌症的功能。优选地，所述增强T细胞治疗癌症功能包括促进T细胞分泌抗肿瘤因子。
更优选地，所述抗肿瘤因子包括颗粒酶、干扰素和/或穿孔素。
进一步优选地，所述颗粒酶为granzyme-B；所述干扰素为IFN-γ。
优选地，所述试剂为sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以MYO7A基因和/或MYO7A蛋白作为靶标。
更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以MYO7A基因的第347bp～第830bp的片段作为基因编辑位点，所述基因编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
优选地，所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。
更优选地，所述基因编辑载体为表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2载体。
更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个。
最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列。
优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。
更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更进一步优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒按照质量比5：3：2共转染。
更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。
更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。
一种用于治疗癌症的组合物，包括抑制剂和T细胞，所述抑制剂为抑制T细胞中MYO7A基因和/或MYO7A蛋白的表达的试剂。
优选地，所述抑制剂为sgRNA、基因编辑载体和/或慢病毒中的一种或几种，所述sgRNA、基因编辑载体和慢病毒均以MYO7A基因和/或MYO7A蛋白作为靶标。
更优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。所述sgRNA以MYO7A基因的第347bp～第830bp的片段作为基因编辑位点，所述基因编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步优选地，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
优选地，所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个。
更优选地，所述基因编辑载体为表达sgRNA的CRISPR-CAS9载体，所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列。
更进一步优选地，所述CRISPR-CAS9载体为pLentiCRISPR V2载体。
更进一步优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个。
最优选地，所述基因编辑载体的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列。
优选地，所述慢病毒为由表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体和慢病毒包装质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
更优选地，所述包装质粒为psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
更优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比(2～5)：(3～5)：(2～3)共转染。
更进一步优选地，所述表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更进一步优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：5～7所示的序列中的任意一个的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
最优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的CRISPR-CAS9载体、psPAX2质粒和pMD2.G质粒的按照质量比5：3：2共转染。
更优选地，所述共转染的方法为脂质体转染。
更优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。
优选地，所述T细胞为CD8+T细胞。
更优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与外周血单核细胞共培养得到。
进一步优选地，所述辐照的方法为用X射线照射。
具体的，所述辐照的方法包括以下步骤：用80Gy的X射线照射2×106个永生化的类淋巴母细胞系，将照射后的永生化的类淋巴母细胞系在含有120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基中培养。
进一步优选地，所述外周血单核细胞来源于受治疗者。
进一步优选地，所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
最优选地，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与受治疗者的外周血单核细胞共培养得到；所述永生化的类淋巴母细胞系由EBV感染受治疗者的外周血单核细胞得到。
优选地，所述癌症包括肝癌和/或淋巴癌。
更优选地，所述淋巴癌由EBV感染所引发。
上述组合物在制备治疗癌症的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了新型免疫治疗靶点MYO7A，敲低CD8+T细胞的MYO7A基因可促进其分泌干扰素，抑制肿瘤生长，显著增强对癌症的治疗效果。本发明还通过辐照后的感染EBV的LCLs，并用其刺激自体的PBMC制得EBV特异的CD8+T细胞。由于LCLs和PBMC来自于同一供体，所以避免了免疫排斥，可用于过继回输，快速在体内评价CD8+T细胞中基因表达的变化对肿瘤的影响。
附图说明
图1为单细胞测序数据分析结果；A为肝癌和肝内胆管癌各细胞群的聚类分析结果；B为MYO7A、PDCD1、TIGIT、CTLA-4、PHLDA1、TNFRSF9、AFAP1L2、KLRD1、CCL5、CTSW、GNLY、TOX和TCF7共13个相关耗竭基因在肝癌肝内胆管癌各个细胞群中的相对表达量。
图2为原发性肝癌肿瘤的多重免疫组化检测结果；A为原发性肝癌肿瘤微环境以及癌旁组织中CD8+T细胞中MYO7A的表达情况；B为A中单位面积内MYO7A阳性的CD8+T细胞比例的统计结果；C为A中MYO7A阳性的CD8+T细胞的面积占癌旁组织和肿瘤组织面积比例的统计结果；白色比例尺＝50μm，Means±SD，n＝5，非配对Student’s t检验，*P<0.05。
图3为敲除MYO7A和清除CD8+T细胞对肝癌皮下瘤的影响；A为MYO7A+/+小鼠和MYO7A-/-小鼠肝癌皮下瘤的生长曲线；B为MYO7A+/+小鼠和MYO7A-/-小鼠肝癌皮下瘤的照片；C为MYO7A+/+小鼠和MYO7A-/-小鼠肝癌皮下瘤的重量统计结果；D为接种肝癌细胞Hepa1-6细胞和用不同抗体处理小鼠的流程图；E为不同抗体处理情况下MYO7A+/+小鼠和MYO7A-/-小鼠肝癌皮下瘤的生长曲线。
图4为敲低MYO7A对CD8+T细胞抗肿瘤功能的影响；A为3条用于敲低MYO7A的sgRNA；B为sgRNA的敲低效率鉴定结果；C为IFN-γ的流式细胞术检测结果；D为C中的统计结果。
图5为永生化的类淋巴母细胞系的构建情况；A为LCLs呈聚团样生长；B为流式检测LCLs表面关键分子如CD19和CD20的表达情况；C为流式检测LCLs作为抗原呈递细胞的关键分子如CD80和CD86的表达情况；D为LCLs皮下注射免疫缺陷小鼠之后在皮下成瘤的照片；E为LCLs皮下肿瘤的解剖图；F为LCLs皮下肿瘤的生长曲线；G为LCLs皮下肿瘤的免疫组化结果。
图6为辐照的LCLs刺激PBMC产生CD8+T细胞的情况。
图7为过继回输敲低T细胞中MYO7A后的抗肿瘤效果；A为LCLs肿瘤模型过继回输靶向EBV特异性CTLs的流程图；B为过继回输后LCLs肿瘤的生长曲线；C为过继回输后LCLs皮下肿瘤的解剖图；D为过继回输后LCLs皮下肿瘤的重量统计结果；E为过继回输后LCLs肿瘤的Granzyme-B表达情况；F为过继回输后LCLs肿瘤的IFN-γ表达情况；G为F中IFN-γ的平均荧光强度(MFI)统计结果；H为过继回输后LCLs肿瘤的perforin表达情况；I为H中perforin的平均荧光强度(MFI)统计结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1通过单细胞数据分析确定CD8+T细胞中的新型免疫治疗靶点
一、单细胞转录组测序数据分析
对37例肝细胞癌和肝内胆管癌的单细胞转录组测序数据(GEO(Gene ExpressionOmnibus)数据库：GSE151530)采用Seurat R包(Version＝4.0.5)进行分析。
为排除低质量细胞，删除检测到的基因少于200个且线粒体基因计数超过15％的细胞。对于每个癌症数据集，通过Seurat的NormalizeData函数对过滤后的表达式矩阵进行归一化。通过FindVariableFeatures函数鉴定出2000个高变异基因，并用于后续的主成分分析。通过FindNeighbors函数(dims＝1:30)和FindClusters函数将细胞划分为多个集群，即细胞聚类。采用统一流形近似投影(UMAP)和RunUMAP函数、FeaturePlot函数对细胞聚类和主成分分析得到的基因表达情况进行可视化展示。
二、分析结果
如图1中的A和B所示，基因MYO7A在肝癌和肝内胆管癌浸润的CD8+T细胞中与经典的免疫检查点PD-1(即PDCD1)、TIGIT和CTLA-4以及耗竭相关基因TOX存在共表达现象。表明MYO7A可能作为一种新型的免疫逃逸基因负调控CD8+T细胞的抗肿瘤功能。
实施例2MYO7A在肿瘤浸润的CD8+T细胞中表达上调
一、实验方法
1、多重免疫组化
选取5例原发性肝癌的病理组织标本，应用多重染色实验技术鉴定肿瘤免疫微环境中CD8+T细胞亚群的蛋白表达情况，具体步骤如下：
采用PANO 7-plex IHC多色荧光试剂盒(Panovue，0004100100)进行多重免疫荧光染色，分别使用如表1中所示的一抗对病理组织标本进行染色，4℃染色过夜(16h)；然后，用表1中所示的二抗孵育病理组织标本，37℃孵育1h，并进行酪胺信号放大，在每次酪胺信号放大后，微波热处理切片；待标记所有的抗原后，用4‘-6’-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(Abcam，ab285390)对细胞核进行常温(25℃)染色10分钟。
表1多重免疫组化所用抗体的信息
2、染色情况分析
使用奥林巴斯VS200全景扫描平台(奥林巴斯德国)和奥林巴斯UPLXAPO20X物镜对病理组织标本进行多色荧光图像的全切片扫描，使用QuPath软件对整个病理组织标本的多色荧光图像进行定量病理分析，构建TUMOR、STROMA和三级淋巴结构(tertitary lymphoidstructures，TLS)共三个组织分类，并记录病例下各组织分类的面积和数量，用QuPath软件对细胞进行精准识别计数，统计出所有细胞的数目与阳性细胞的数目，并根据软件自带的公式计算阳性细胞在病理组织标本中的占比，公式的简要描述如下：细胞比例＝染色呈阳性的表型细胞计数/整个样本的细胞计数；密度＝染色呈阳性的表型细胞的面积/整个样本的细胞总面积。
二、实验结果
如图2中的A～C所示，多重免疫组化检测人原发性肝癌肿瘤微环境(即Tumor)以及癌旁组织(即Peritumor)中CD8+T细胞中MYO7A的表达，发现相较于癌旁组织，肿瘤组织中单位面积内MYO7A阳性的CD8+T细胞比例明显升高；MYO7A阳性的CD8+T细胞的面积与肿瘤组织面积比高于其与癌旁组织的面积比。
以上结果证实肿瘤微环境浸润的CD8+T细胞中MYO7A的表达上调。
实施例3小鼠肝癌模型中敲除MYO7A和清除CD8+T细胞对肝癌皮下瘤的影响
一、敲除MYO7A对小鼠肝癌皮下瘤的生长状况的影响
1、实验方法
选取健康的5周龄野生型(MYO7A+/+)C57BL/6J小鼠(集萃药康，C57N000013)和MYO7A敲除型(MYO7A-/-)C57BL/6J小鼠(集萃药康，T036189)，腹部向上，头呈低位，右手持注射器，插入小鼠腹部，分别经皮下注射3×106个/只小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞至小鼠的后肢根部连线处任一侧1.5cm处，缓慢以45°左右进针，进针深度小于1cm，进针的感受为局部皮肤凹陷消失和落空感。注射结束之后进行常规饲养管理。
从接种肝癌细胞Hepa1-6细胞后的第4天开始，每间隔3天测量小鼠肿瘤的长和宽，统计肿瘤的生长曲线，并剥离肿瘤进行拍照和称重。
2、实验结果
如图3中的A～C所示，与野生型小鼠相比，MYO7A敲除型小鼠的肝癌皮下瘤的生长速度更慢，体积更小，重量更轻。以上结果表明，敲除MYO7A能抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞的皮下瘤生长。
二、清除体内CD8+T细胞对MYO7A敲除型小鼠的肝癌皮下瘤生长状况的影响
1、实验方法
选取健康的5周龄野生型(即MYO7A+/+)C57BL/6J小鼠(集萃药康，C57N000013)和MYO7A敲除型(即MYO7A-/-)C57BL/6J小鼠(集萃药康，T036189)，接种前用75％v/v酒精对进针部位擦拭消毒，排去注射器内的空气，从进针部位向前穿刺大约1cm，分别经皮下注射3×106个/只小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞至小鼠的右前腋下注射结束之后进行常规饲养管理。
如图3中的D所示，分别于接种肝癌细胞Hepa1-6细胞的前一天(即Day-1)、当天(即Day 0)、接种后的第7天(即Day 7)和第14天(即Day 14)，对野生型小鼠和MYO7A敲除型小鼠通过腹腔注射100μg/只的CD8抗体(厂家：BioXcell，货号：BE0004-1)，即得到CD8抗体处理的野生型小鼠(即MYO7A+/++α-CD8)和CD8抗体处理的MYO7A敲除型小鼠(即MYO7A-/-+α-CD8)；对野生型小鼠和MYO7A敲除型小鼠通过腹腔注射100μg/mouse的对照抗体cIg(厂家：BioXcell，货号：BE0089)，即得到对照抗体处理的野生型小鼠(即MYO7A+/++cIg)和对照抗体处理的MYO7A敲除型小鼠(即MYO7A-/-+clg)。
从接种肝癌细胞Hepa1-6细胞的第7天开始，每间隔3天测量小鼠肿瘤的长和宽，统计肿瘤的生长曲线。
2、实验结果
如图3中的E所示，用CD8抗体清除小鼠体内的CD8+T细胞后，敲除MYO7A抑制肝癌的抗肿瘤活性消失。
实施例4敲低MYO7A对CD8+T细胞抗肿瘤功能的影响
一、sgRNA的设计
以MYO7A基因(NCBI Gene ID:4647)的第347bp～第830bp(SEQ ID NO.1)作为基因编辑位点，如图4中的A所示，共设计得到3条用于敲低MYO7A的sgRNA，具体序列如下：
sgRNA-1：5’-GTTCGACGTGCCCATCGGGG-3’(SEQ ID NO.2)；
sgRNA-2：5’-GCAACCTGCTTATCCGCTAC-3’(SEQ ID NO.3)；
sgRNA-3：5’-AGTTCCTGGCAGCCATCAGT-3’(SEQ ID NO.4)。
二、CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
1、酶切
用BmsBI(厂家：ThermoFisher，货号：ER0451)37℃酶切pLentiCRISPR-V2质粒(厂家：Addgene，货号：52961)，核酸电泳后，用胶回收试剂盒(厂家：TIANGEN，货号：DP219)回收得到酶切后的pLentiCRISPR-V2质粒。
2、连接
分别设计合成3对引物，用于将3个sgRNA连接至pLentiCRISPR-V2质粒，具体序列如下：
上游连接引物F-sgRNA-1：5’-CACCGTTCGACGTGCCCATCGGGG-3’(SEQ ID NO.5)；
下游连接引物R-sgRNA-1：5’-AAACCCCCGATGGGCACGTCGAAC-3’(SEQ ID NO.6)；
上游连接引物F-sgRNA-2：5’-CACCGCAACCTGCTTATCCGCTAC-3’(SEQ ID NO.7)；
下游连接引物R-sgRNA-2：5’-AAACGTAGCGGATAAGCAGGTTGC-3’(SEQ ID NO.8)；
上游连接引物F-sgRNA-3：5’-CACCAGTTCCTGGCAGCCATCAGT-3’(SEQ ID NO.9)；
下游连接引物R-sgRNA-3：5’-AAACACTGATGGCTGCCAGGAACT-3’(SEQ ID NO.10)。
将合成的引物退火成双链DNA片段后，分别将sgRNA-1(SEQ ID NO.2)、sgRNA-2(SEQ ID NO.3)和sgRNA-3(SEQ ID NO.4)的双链DNA片段连接至酶切后的pLentiCRISPR-V2质粒，使各sgRNA插入至pLentiCRISPR-V2质粒的第2235bp和第4119bp之间的位置；连接反应体系为：上游连接引物(100μM)，4μL；下游连接引物(100μM)，4μL；10×退火Bufferr(100mM Tris,pH 7.5-8.0；500mM NaCl；10mM EDTA)2μL；补足ddH2O定容至20μL；连接反应条件为：95℃，5分钟，PCR梯度降温，每10秒降温1℃，直至25℃，即得到连接产物。
将连接产物转化入感受态细菌DH5α中，抽提质粒后进行测序鉴定。
所得测序结果正确的质粒即为分别连接有sgRNA-1(SEQ ID NO.2)、sgRNA-2(SEQID NO.3)和sgRNA-3(SEQ ID NO.4)的CRISPR/Cas9基因编辑载体，依次命名为LentiCRISPR-sgRNA-1、LentiCRISPR-sgRNA-2和LentiCRISPR-sgRNA-3。
三、CRISPR/Cas9基因编辑载体的敲低效率鉴定
1、慢病毒包装
将HEK293T细胞接种至10cm2培养皿，待细胞密度达到70％～80％时，使用Lipo3000试剂(ThermoFisher，L3000015)，将慢病毒包装质粒psPAX2、慢病毒包装的辅助质粒pMD2.G和上一步所得分别连接有sgRNA-1(SEQ ID NO.2)、sgRNA-2(SEQ ID NO.3)和sgRNA-3(SEQ ID NO.4)的CRISPR/Cas9基因编辑载体(即LentiCRISPR-CAS9-sgRNA-1或LentiCRISPR-sgRNA-2或LentiCRISPR-sgRNA-3)按照比例5μg：3μg：2μg，共转染至HEK293T细胞；48小时后，收取细胞上清，即得到分别包装有sgRNA-1(SEQ ID NO.2)、sgRNA-2(SEQID NO.3)和sgRNA-3(SEQ ID NO.4)的慢病毒，依次命名为V-sgRNA-1、V-sgRNA-2和V-sgRNA-3，分装放于-80℃保存。
按照相同的方法，用pLentiCRISPR-V2质粒代替上一步所得连接有sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，进行细胞培养和转染，48小时后，收取细胞上清，即得到包装有空载体的对照慢病毒，命名为V-control。
2、CD8+T细胞获取
用聚蔗糖Ficol(GE,17-5442-02)从人的外周血全血中分离得到外周血单核细胞(PBMC)，再用CD8+T细胞分离纯化试剂盒(BioLegend，480129)从PBMC中纯化得到CD8+T细胞。
3、慢病毒感染
在慢病毒感染前，向CD8+T细胞中加入8μg/mL聚凝胺Polybrane(Biosharp，BL628A)吹打混匀。
按照1mL慢病毒感染106个CD8+T细胞的剂量，分别将制得的慢病毒V-control、V-sgRNA-1、V-sgRNA-2和V-sgRNA-3与CD8+T细胞混合均匀，25℃、500×g离心感染3小时，即得到不同慢病毒感染的CD8+T细胞，依次记为control组、sgRNA-1组、sgRNA-2组和sgRNA-3组。
4、流式细胞术检测
使用一抗MYO7A(Abcam，ab150386)和山羊抗兔IgG H&L(PE)预吸附二抗(Abcam，ab72465)，通过流式细胞术，检测不同慢病毒感染的CD8+T细胞中MYO7A的表达水平。
5、实验结果
如图4中的B所示，与control组相比，sgRNA-1组、sgRNA-2组和sgRNA-3组中MYO7A的表达水平均有所下调，其中sgRNA-3组的MYO7A表达水平下调幅度最大表明sgRNA-3(SEQID NO.4)的敲低效率最高。后续对sgRNA-3组进行进一步地分析检测。
四、敲低MYO7A对CD8+T细胞分泌IFN-γ的影响
1、刺激处理
同时加入终浓度100ng/mL丙二醇甲醚醋酸酯PMA(InvivoGen，tlrl-pma)、终浓度2μg/mL离子霉素(TargetMol，T11665)和高尔基体阻断剂(BD，554724，稀释倍数为1:1500)，刺激control组和sgRNA-3组，共刺激4小时。
2、流式细胞术检测
使用BV510-活细胞染料(BioLegend,564406)、CD3-FITC(BioLegend，317306)、CD8-PerCP/Cyanine5.5(BioLegend，980918)、IFN-γ-PE-cy7(BioLegend，502528)和固定破膜试剂盒(BD,554714)，通过流式细胞术，检测刺激处理后control组和sgRNA-3组的胞内IFN-γ的水平。
3、实验结果
如图4中的C和D所示，与control组相比，sgRNA-3组在CD8+T细胞中敲低MYO7A后，其IFN-γ的分泌水平明显增加。表明敲低MYO7A的CD8+T细胞其抗肿瘤功能明显增强。
实施例5永生化的类淋巴母细胞系(LCLs)的构建
一、EBV病毒制备
用终浓度20ng/mL佛波肉荳蔻醋酸(简称为TPA或PMA)(TargetMol,T17144-1 mg，CAS NO:16561-29-8)和终浓度5μM丁酸钠(Sigma-Aldrich，303410-100G)诱导CNE2-EBV细胞系12小时，再继续培养60小时，收集细胞上清，3000×g离心10分钟，弃细胞碎片沉淀，收集上清即得到EBV病毒液，按照2mL/管分装，放于-80℃冰箱备用。
二、EBV病毒感染人PBMC
1、实验方法
按照实施例4中的方法分离得到人的PBMC。
用含50％v/v上一步所得EBV病毒液的RPMI 1640培养基感染所得PBMC，感染剂量约为10000个EBV病毒颗粒/mL；感染48小时后更换为RPMI 1640完全培养基(即含10％v/v/胎牛血清和1％v/v双抗的RPMI 1640培养基)继续培养，之后每间隔3天换液一次。
2、实验结果
如图5中的A所示，感染21天后，可在显微镜下观察到感染细胞形成LCLs克隆。
三、LCLs的关键分子鉴定
1、实验方法
使用流式抗体CD3-FITC(BioLegend，317306)、CD4-APC(BioLegend，980812)、CD8-PerCP/Cyanine5.5(BioLegend，980918)、CD19-PE(BioLegend，982402)、CD20-BV421(BioLegend，375514)、CD80-BV421(BioLegend，305222)和CD86-PE-Cy7(BioLegend，374210)，通过流式细胞术对上一步所得感染细胞。
2、实验结果
如图5中的B所示，人外周血PBMC正常表达CD3、CD4和CD8，且三者的表达量均高于B细胞的标志物CD19和CD20的表达量，而本实施例构建的LCLs细胞是不表达CD3、CD4和CD8，但高表达B细胞标志物CD19和CD20。
如图5中的C所示，本实施例构建的LCLs细胞还高表达抗原呈递的关键分子CD80和CD86，且二者的表达量显著高于PBMC中的B细胞。
以上结果表明，本实例构建的LCLs是一类B淋巴细胞瘤，同时具有B细胞和肿瘤细胞的双重特性，可以作为一种抗原呈递细胞。
4、LCLs的成瘤性鉴定
1、实验方法
选取健康的6周龄免疫缺陷小鼠B-NDG(Zhuhai BesTest Bio-Tech，NDG5W)经皮下注射107个/只所得LCLs至右前腋下，之后进行常规饲养管理。
从接种LCLs的当天(即第0天)开始，每3天～4天测量小鼠肿瘤的长和宽，统计肿瘤的生长曲线；在接种LCLs的第19天剥离小鼠的肿瘤，使用CD79α抗体(Abcam，ab79414)和EBERs抗体(中杉金桥，ISH-7001UM)进行免疫组化检测LCLs肿瘤组织中B细胞表面CD79α和EBERs的表达水平。
2、实验结果
如图5中的D～E所示，接种LCLs的第19天时能看到在免疫缺陷小鼠体的皮下形成了明显的肿瘤包块。如图5中的F所示，LCLs在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤的生长周期大约在2周～3周。如图5中的G所示，人的B细胞标志物CD79α和EBV的病毒蛋白EBERs均在LCLs肿瘤中显著高表达。
以上结果表明，LCLs在免疫小鼠皮下可成瘤，且肿瘤内可见人B细胞的CD79α和EBERs表达。
CD8+T细胞是杀伤肿瘤细胞最常见的一种适应性免疫细胞，其杀伤肿瘤的首要条件是肿瘤细胞上的HLA-I分子、肿瘤细胞呈递的多肽抗原和T细胞上的T细胞受体(TCR)-CD3复合物结合启动了第一信号，再通过第二信号即APC表面的B7(CD80/CD86)分子(配体)和T细胞上的CD28分子(受体)的结合，只有第一信号和第二信号同时激活了的CD8+T细胞才能活化杀伤靶细胞。由于CD8+T细胞识别靶细胞需要同时激活第一信号和第二信号，第一信号是特异性信号，需要靶细胞与CD8+T细胞的HLA-I进行配对，否则会发生排斥反应，而HLA-I分子在人体是一种高度变异的基因，完全配对的HLA-I分子少之又少，这给肿瘤研究带来了不少困难。目前科学家常通过OT1小鼠、含有OVA抗原的小鼠来源的肿瘤如MC38OVA和B16F10OVA来实现研究肿瘤特异性CD8+T细胞中基因功能的研究；或者通过只匹配HLA-I前面两个位点达到粗略匹配进行实验，即使只匹配前两个基因位点也很难实现，且也具有一定的免疫排斥风险。
本发明制得的LCLs含病毒EBV，并高表达抗原呈递细胞B7(CD80/CD86)，其中EBV能被LCLs呈递的多肽抗原和T细胞受体(TCR)-CD3复合物结合启动了第一信号，CD80/CD86分子(配体)和T细胞上的CD28分子(受体)的结合启动了第二信号。可见本发明制得的LCLs作为人的肿瘤细胞可用于研究CD8+T细胞的基因功能。
实施例6过继回输敲低T细胞中MYO7A后的抗肿瘤效果
一、EBV特异性细胞毒性T细胞(EBV-specific CTLs)的制备
1、实验方法
按照实施例5中的方法制得LCLs，用80Gy的X射线照射2×106个LCLs，将照射后的LCLs在含有120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基中继续培养。
按照实施例5中的方法制得PBMC。用含有10％v/v胎牛血清的RMPI 1640培养基重悬PBMC，将PBMC与照射培养后的LCLs以30:1的数量比进行混合培养，即用照射培养后的LCLs刺激PBMC。每隔3～4天添加含120IU/mL IL-2(R&D,202-IL-050)的RMPI 1640完全培养基，共培养21天，所得混合细胞中激活的CD8+T细胞即为EBV-specific CTLs。
通过流式细胞术检测第21天常规培养的PBMC以及用照射培养后的LCLs刺激的PBMC中的CD8+T细胞含量。
2、实验结果
如图6所示，辐照的LCLs刺激的PBMC中CD8+T细胞的比例(83.4％)明显高于无刺激的PBMC中CD8+T细胞的比例(27.7％)，结合实施例5中已经证实LCLs表面高表达抗原呈递分子CD80和CD86，表明辐照的LCLs可以呈递LCLs中释放的EBV抗原至CD8+T细胞，这会导致CD8+T细胞激活并扩增，得到的EBV-specific CTLs也会进一步识别LCLs肿瘤细胞发挥特异性的杀伤功能。
二、EBV-specific CTLs中MYO7A的敲低
按照实施例4中的方法，按照1mL慢病毒感染106个CTLs的剂量，分别将慢病毒V-control和V-sgRNA-3与本实施例所得EBV-specific CTLs混合均匀，25℃、500×g离心感染3小时，依次得到空载对照EBV-specific CTLs(即Ctrl EBV-specific CTLs)和MYO7A敲低型EBV-specific CTLs(即MYO7A-/-EBV-specific CTLs)。
三、过继回输MYO7A敲低型EBV-specific CTLs对小鼠肿瘤生长状况的影响
1、实验方法
选取健康的5周龄免疫缺陷小鼠B-NDG(Zhuhai BesTest Bio-Tech，NDG5W)，经皮下注射107个/只按照实施例5中的方法制得的LCLs至右前腋下，之后进行常规饲养管理。
如图7中的A所示，分别于接种LCLs后的第4天、第8天和第12天，分别将9×106个Ctrl EBV-specific CTLs和9×106个MYO7A-/-EBV-specific CTLs过继回输给免疫缺陷小鼠，即得到对照组免疫缺陷小鼠(即Ctrl组)和敲低组免疫缺陷小鼠(即sgRNA组)。
从接种LCLs当天开始，每间隔3天测量小鼠肿瘤的长和宽，统计肿瘤的生长曲线，并剥离肿瘤进行拍照和称重。
第一次过继回输的第12天，对肿瘤进行流式细胞术检测，使用流式抗体BV510-活细胞染料(BioLegend,564406)、CD45-APC-Cy7(BioLegend，368516)、CD3-FITC(BioLegend，317306)、CD8-PerCP/Cyanine5.5(BioLegend，980918)、IFN-γ-PE-Cy7(BioLegend，502528)、granzyme-B-PE(BioLegend，372208)、perforin-BV421(BioLegend，308122)和破膜固定试剂盒(BD,554714)，检测肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞及抗肿瘤细胞因子granzyme-B、IFN-γ和perforin的占比。
2、实验结果
如图7中的B～D所示，与过继回输Ctrl EBV-specific CTLs的小鼠(即Ctrl组)相比，过继回输MYO7A-/-EBV-specific CTLs的小鼠(即sgRNA组)的肿瘤生长速度更慢，肿瘤体积明显缩小且剥离的肿瘤的重量明显变轻。
如图7中的E～I所示，与Ctrl组相比，过继回输了MYO7A-/-EBV-specific CTLs小鼠的分泌抗肿瘤细胞因子granzyme-B、IFN-γ和perforin的比例明显增多，IFN-γ和perforin的平均荧光强度也明显增多。
以上结果表明，敲低EBV特异性CD8+T细胞中的MYO7A能显著增强CD8+T细胞的抗肿瘤功能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抑制T细胞中MYO7A基因和MYO7A蛋白的表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述T细胞为CD8+T细胞，所述癌症为肝癌或B细胞淋巴癌，所述试剂为sgRNA、基因编辑载体和慢病毒中的一种或几种；
所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列；
所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体；
所述慢病毒含有所述基因编辑载体。
2.MYO7A基因和MYO7A蛋白的表达被抑制的T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述T细胞为CD8+T细胞，所述癌症为肝癌或B细胞淋巴癌，抑制所述MYO7A基因和MYO7A蛋白的表达的试剂为sgRNA、基因编辑载体和慢病毒中的一种或几种；
所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列；
所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体；
所述慢病毒含有所述基因编辑载体。
3.一种抑制T细胞中MYO7A基因和MYO7A蛋白的表达的试剂在制备T细胞治疗癌症的增效剂中的应用，其特征在于，所述T细胞为CD8+T细胞，所述癌症为肝癌或B细胞淋巴癌，所述试剂为sgRNA、基因编辑载体和慢病毒中的一种或几种；
所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列；
所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体；
所述慢病毒含有所述基因编辑载体。
4.一种用于治疗癌症的组合物，其特征在于，包括抑制剂和T细胞，所述抑制剂为抑制T细胞中MYO7A基因和MYO7A蛋白的表达的试剂，所述T细胞为CD8+T细胞，所述癌症为肝癌或B细胞淋巴癌，所述试剂为sgRNA、基因编辑载体和慢病毒中的一种或几种；
所述sgRNA的编码序列为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列；
所述基因编辑载体为表达所述sgRNA的CRISPR-CAS9载体；
所述慢病毒含有所述基因编辑载体。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述CD8+T细胞由经过辐照的永生化的类淋巴母细胞系与外周血单核细胞共培养得到。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述外周血单核细胞来源于受治疗者。
7.权利要求4～6任一所述组合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌或B细胞淋巴癌。
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