KR20220068228A - 면역 세포의 확장을 위한 cbl 억제제 및 조성물 - Google Patents

면역 세포의 확장을 위한 cbl 억제제 및 조성물 Download PDF

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아서 티. 샌즈
제니파 고슬링
사라 앤 웰란
마이클 롯즈
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누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

면역 세포의 확장을 향상시켜 세포-기반 면역치료요법의 효능을 증가시키는 신규한 Cb1 억제제를 사용하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 또한 세포-기반된 면역치료요법 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

면역 세포의 확장을 위한 CBL 억제제 및 조성물
상호 참조
본 출원은 미국 가출원 2019년 9월 24일에 출원된 제62/905,124호, 2019년 12월 27일에 출원된 제62/954,323호, 2020년 1월 15일에 출원된 제62/961,596호, 2020년 2월 18일에 출원된 제62/978,254호, 및 2020년 5월 29일에 출원된 제63/032,462호의 이익을 주장하고, 이의 각각의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포 기반 면역치료요법(cell-based immunotherapy)에서 Cbl 억제제의 사용에 관한 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은, 예를 들면, 면역 세포 조성물의 제조 및 T 세포 기능장애 및 암의 치료를 위한 이의 용도에 유용하다.
Cbl(카시타스 B-계통 림프종(Casitas B-lineage Lymphoma)) 단백질은 세포 신호전달(cell signaling), 단백질 유비퀴틴화(protein ubiquitination), 및 단백질 기질의 분해에 관여하는 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligase) 계열의 일부이다. 이러한 계열의 구성원은 RING-형 E3 리가제 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함한다. Cbl-b는 면역 활성화의 음성 조절인자로서의 이의 기능으로 인하여 면역계에서 중요한 역할을 한다. Cbl-b는 사람 CD4+ 및 CD8+T 세포에서 고도로 발현되며, 발현은 CD28 및 CTLA-4 그리고 기타 공-자극 및 억제 신호에 의해 엄격하게 조절된다(참고: Lutz-Nicoladoni et al., Frontiers in Oncology, 5(58):1 내지 14 (2015)).
Cbl-b는 T 세포 활성화의 음성 조절(negative regulation)에 필수적인 역활을 한다. T 세포는 편리하게는 활성화를 위해 2개의 신호를 필요로 하는데, 첫째는 T 세포 수용체와 MHC 분자에 의해 제시된 펩타이드의 상호작용에 의해 제공되고, 둘째는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell) 상에서 공-자극성 분자를 통해 제공된다. Cbl-b는 NK 세포의 활성화와 효과기 기능(effector function)에 중요한 역활을 한다. B 세포에서, Cbl-b는 군집화된(clustered) B 세포 항원 수용체(BCR)로 보충되며 세포내이입된(endocytosed) BCR이 말기 엔도솜 내로 도입하는데 요구된다(참고: Veselits et al., PLOS One, 9(3):e89792 (2014)). 골수 세포에서 Cbl-b의 활성은 완전히 특성화되어 있지 않지만, TLR 신호전달의 음의 피드백 루프(negative-feedback loop)에서의 역활을 포함하고 지방산에 의한 대식세포 활성화를 조절한다.
연구에 따르면 Cbl-b 결핍성 T 세포는 항원 인식 수용체와 공-자극 분자(예컨대: CD28)에 의한 활성화에 대해 낮은 임계값(threshold)을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, T 세포에서 Cbl-b의 상실은 T-세포 활성화 및 증식 동안에 CD28 공자극(costimulation)에 대한 요건과 분리된다(참고: Bachmaier, K. et al., Nature, 403(6766):211 내지 216 (2000)). 이러한 Cbl-b-/- T 세포는 T 세포가 기능적으로 불활성화되어 있고 T-세포 증식이 크게 손상되는 내성 메카니즘인, T 세포 아네르기(anergy)에 대한 내성이 크다(참고: Jeon et al., Immunity, 21(2):167-177 (2004) 및 Schwartz et al., Annu Rev Immunol., 21:305-34 (2003)). 이러한 문제를 뒷받침하는 증거는 Cbl-b 녹아웃 마우스(knockout mouse)에서 Cbl-b의 손실이 T-세포 내성의 손상된 유도 및 악화된 자가면역성을 야기한다는 사실을 포함한다(참고: Jeon et al., Immunity, 21(2):167-177 (2004)). 중요하게도, 마우스에서 Cbl-b의 상실은 또한 주로 세포독성 T 세포에 따라 풍부한 항종양 반응을 야기하였다. 한가지 연구는 Cbl-b-/- CD8+ T세포가 T 조절성 세포-매개된 억제에 내성이고 향상된 활성화 및 종양 침윤을 나타내었음을 입증하였다. 나이브(naive) Cbl-b-/- CD8+ T 세포의 치료학적 전달은 확립된 종양의 거부를 매개하기에 충분하였다(참고: Loeser et al., J. Exp. Med., 204(4):879-891 (2007)). 최근의 연구는 Cbl-b가 또한 NK 세포 활성화에 역할을 담당한다는 것을 입증하였다. Cbl-b의 유전자 결실 또는 이의 E3 리가제 활성의 표적화된 불활성화는 NK 세포가 마우스 모델에서 전이성 종양을 자발적으로 거부하도록 하였다(참고: Paolino et al., Nature, 507(7493):508-512).
입양 세포 치료요법(Adoptive Cell Therapy)(ACT)는 또한 치료-내성 암, 예를 들면, 전이성 흑색종(metastatic melanoma), 신경교종(glioma) 및 신장 암종(renal carcinoma)에 사용된다. ACT에서, 환자 자신의 혈액이나 종양 조직으로부터 NK 세포 또는 T 세포를 수거(harvesting)한 다음, 실험실에서 대량으로 성장시킨 후, 확장된 세포를 환자에게 다시 전달하여 암에 대한 환자의 면역계를 강화시킨다. ACT의 일부 버전에서, T 세포 또는 NK 세포는 유전 공학을 이용하여 변형시켜 환자의 암세포를 표적화하여 암 세포를 보다 효율적으로 사멸시킬 수 있다. 입양 세포 치료요법의 유형은 천연 킬러(Natural Killer)(NK) 세포 치료요법, 종양 침윤 림프구(TIL) 치료요법, 가공된(engineered) T-세포 수용체 치료요법(TCR), 및 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR T) 치료요법이 포함된다.
이름이 내포하고 있는 바와 같이, NK 세포 치료요법은 선천적인 면역계의 일부인 NK 세포, 및 암 세포를 포함한 감염과 질환에 대한 1차 방어선을 사용한다. NK 세포는 건강한 세포와 바이러스에 감염되거나 천연적으로 형질전환된 세포 사이를 구별할 수 있는 이의 선천적인 능력으로 인하여 세포-기반 면역 치료요법을 위한 매력적인 도구이다. NK 세포 치료요법은 입양 자가 또는 동종이계 세포 치료요법을 포함하고, 여기서 NK 세포는 조혈 줄기 세포 이식을 지원하기 위해 사용된다. 세포는 치료 전 환자로부터, 또는 관련 공여체로부터 얻거나, 부분적으로 HLA-매치된(HLA-matched) 동종이계 NK 세포이다. 또한 입양 전달된 세포 치료요법은 공여체(donor), 환자, 제대혈, 분화 유도된 다능성 줄기 세포(differentiated induced pluripotent stem cell) 또는 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)로부터의 NK 세포화 함께 사용된다.
TIL 치료요법은 환자의 종양 조직으로부터의 TIL의 단리 및 확장을 포함한다. 침윤성 면역 세포는 종양의 성장과 진행을 제어하도록 기능을 할 수 있지만, 역설적으로 또한 종양이 번성할 수 있는 면역억제 환경(immunosuppressive environment)을 창출하는 데 도움을 줄 수 있다(참고: Schreiber, Science; 331(6024):1565-70(2011)). 종양 면역 회피(tumor immune evasion)의 중요한 메카니즘은 종양 세포 및 침윤성 면역 세포 둘 다에서, CTLA-4 및 PD-L1과 같은 면역 체크포인트 조절인자(immune checkpoint modulator)의 발현이다. 이러한 신호전달 경로를 차단함으로써, 면역 체크포인트 억제제는 숙주 면역 시스템을 재-활성화시켜 종양을 인식하고 이를 제어할 수 있는데, 이는 수개의 현재 치료요법의 작용 메카니즘이다(참고: Pardoll, Nat. Rev. Cancer, 12(4):252-64 (2012), Salgado et al., Adv. Anat. Pathol., 24(5):235-251, 및 24(6):311-335 (2017)).
FDA에 의해 획기적인 치료요법 설계로 승인된 LN-145 치료요법은, 재발, 전이 또는 지속적인 자궁경부암(cervical cancer) 환자의 치료를 위한 TIL 치료요법이다. LN-145 치료요법 제II상 임상 연구에서, 종양 조직은 환자로부터 외과적으로 단리되어 GMP 시설로 보내지며, 여기서 TIL은 단리되어 3주 기간에 걸쳐 확장된다. 주입 1주 전에, 환자에게 -8일 및 -7일째에 사이클로포스파미드 IV, -6일에서 -2일째에 플루다라빈 IV, 및 -1일째에 펨브롤리주맙(사람화된 항 PD-1 항체)의 투여를 포함하는 예비조건화(preconditioning) 치료요법이 제공된다. 이후에, 환자는 자가 확장된 TIL에 이어,+1 내지 +4일째에 알데슬류킨 IV를 제공받는다. 이후에, 환자는 질환 진행 또는 허용 불가능한 독성의 부재하에 12개월 동안 21일마다 펨브롤리주맙의 사이클을 제공받는다.
TCR 치료요법은 친화성 향상된, 종양-특이적인 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 발현하도록 함으로써 암 세포를 사멸시키는 T 세포의 유전적 가공을 포함한다. 요약하면, 자가 T 세포를 성분채집기(apheresis)를 통해 수집하고 시험관 내(in vitro)에서, 예컨대, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질전환시킴으로써, 특정 종양 항원을 인식하는 T 세포를 발현시킨다. 형질전환된 세포는 환자 내로 주입되기 전에 시험관 내에서 확장된다. 재주입 7일 전에, 환자에게 저 용량의 사이클로포스파미드를, 림프구 청소를 위해 저 용량의 플루다라빈을 제공한다. 확장된 TCR-T 세포를 주입한 후(1회 또는 단계 마다), IL-2를 14일 동안 피하 투여(250,000 IU/2회/일)한다. 이 치료요법은 효과적이지만, 항원이 건강한 조직에서 또한 발현되는 경우, 부작용을 유발할 수 있다.
키메라 항원 수용체 치료요법(CAR T)은 환자의 T 세포를 사용하며, 이는 수거되어 유전적으로 가공됨으로써 항원 결합 도메인(domain), 전형적으로 수용체로부터의 단일-쇄 가변 단편 및 추가의 세포내 공자극성 도메인, 예를 들면, CD19, CD28 또는 CD137로 구성된 키메라 T 세포 수용체(chimeric T cell receptor)를 발현한다. CAR T-기반 세포 치료요법의 한 가지 장점은 인식된 항원이 MHC에 발현되지 않더라도(TIL- 및 및 TCR-기반 세포 치료요법과는 대조적으로) CAR T 세포가 암세포에 결합할 수 있다는 것이다. CAR T-기반 세포 치료요법은 재발성 암의 치료로서 FDA 승인되었다. 예를 들어, KYMRIAH®(티사겐레클레우셀)는 어린이 및 젊은 성인에서 재발성/불응성(refractory) B 세포 급성 림프모구 백혈병(B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia)(B cell ALL)의 치료용으로 FDA-승인되었다. 환자 T 세포는 제거하여 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입(transducing)시킴으로써 쥐(murine) 항-CD19 단일 쇄 항체 단편(scFv), 및 T 세포 신호전달(CD3-ξ) 및 공-자극성(4-1BB) 도메인을 함유하는 세포내 부위를 지닌 CAR를 발현시킨다. 악시캅타젠 실로류셀(Axicabtagene ciloleucel)(YESCARTA®)은 적어도 2개의 사전 치료 요법(regimen)을 받은 후 이의 암이 진행된 거대-B 세포 림프종(large-B-cell lymphoma)을 지닌 성인에 대한 FDA-승인된 CAR T-기반 세포 치료요법이다. T 세포는 환자로부터 백혈구 성분채집술(leukapheresis)을 통해 제거되고, 시험관 내에서 형질도입되어 CD3-ζ 및 CD28 유전자로부터 유래된 2개의 신호전달 도메인에 연결된 CD19에 대해 특이성을 지닌 쥐 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 지닌 CAR을 발현한다.
현재의 CAR T-기반 세포 치료요법은 다수의 한계를 가지고 있다. 이는 기증하기에는 너무나 적은 T 세포를 지닌 환자에서는 효과적인 치료요법이 아닐 수 있다. 표적 항원을 발현하는 정상 세포와의 교차 반응성 또한 문제가 될 수 있다. 또한, CD19 CAR T 세포를 사용하여 1개월째에 차도가 이루어지는 거대 B 세포 림프종을 지닌 환자의 대략 30 내지 50%는 궁극적으로 재발된다(참고: Shah and Fry, Nat. Rev. Clin. Oncol. 16:372-385 (2019)). 최종적으로, CAR T-기반 세포 치료요법은 고형 종양에 대해 낮은 효능을 나타내었다.
CAR-NK 세포 치료요법은 환자 제대혈, 건강한 공여체, 줄기 세포 또는 NK-유래된 세포주로부터의 NK 출발 물질의 선택적인 확장을 수반한다. NK 세포는 CD3+ T 세포의 고갈 및 CD56+ 세포의 양성적인 선택에 의해 세포 집단 내에서 농축된 다음, 공급인자 세포(feeder cell) 및 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-12, IL-18의 존재 하에서 선택적으로 확장된다. 다음에, 그들을 IL-2의 존재하에서 최종적인 확장 전에, 유전적 가공, 예컨대, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스, 트랜스포존(transposon) 또는 CRISPR에 적용시킨다. 세포는 다시 한번 CD3+ T 세포를 고갈시키고 환자 내로 주입하기 위해 제형화하거나 추후 주입을 위해 동결보존한다(참고: Trager, Cell and Gene Therapy Insights, 5(5):585-600 (2011)). 동종이계 CAR-NK 세포에 대한 최근 제1상 및 제2상 시험에서 11명의 환자 중 7명에서 림프종(lymphoma) 또는 만성 림프구 백혈병( chronic lymphocytic leukemia)의 완치가 입증되었다(참고: Liu et al., 2020, N. Engl. J. Med. 382:545-553).
상술한 세포-기반 면역 치료요법의 가능성에도 불구하고, 많은 환자는, 특히 기본적으로 결함이 있는 적은 수의 면역 세포를 지닌 집중적으로 치료된 대상체로부터, 면역 세포를 수집하거나 제조하는데 있어서의 불능(inability)으로 인하여, 이로부터의 유리할 수 없다. 충분한 수의 면역 세포를 제조할 수 있는 환자의 경우에도, 이의 임상 결과는 유출된 면역 세포의 이식(engraftment)을 개선시키거나 이의 반응의 내구성을 증가시킴으로써 개선시킬 수 있다. 따라서, 보다 효과적인 면역 세포 치료요법이 요구되고 있다.
발명의 요약
몇 가지 양태에서, 본 발명은 Cbl 억제제에 의한 세포 치료요법의 강화를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 수거 전에 생체 내(in vivo) 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 외(ex vivo)에서 면역 세포의 초기 확장을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 외에서 면역 세포의 신속한 확장을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 외에서 면역 세포의 초기 확장을 향상시키고 면역 세포의 제2의 신속한 확장의 필요성을 제거한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 공-자극의 부재하에서 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 환자에게 면역 세포의 주입을 제공받는 이점을 증강시킨다. 이러한 방법들은, 예를 들면, T 세포 기능 장애(T cell dysfunction) 및 암의 치료에 유용하다. 작동 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 이러한 방법은, 부분적으로, Cbl 억제제가 기억 세포를 위한 면역 세포 집단을 농축시킬 수 있고, 이로써 생체 내 및 시험관 내에서 면역 세포 반응의 내구성을 향상시킨다는 발견을 기반으로 한다.
제1 양태에서, Cbl 억제제를 사용하여 생체 내에서 면역 세포의 확장을 향상시키는 방법이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, Cbl 억제제를 사용하여 생체 외에서 면역 세포의 확장을 향상시키는 방법이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 향상된 면역 세포가 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 면역 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 면역 세포 또는 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, Cbl 억제제의 조합 투여에 의해 면역 세포 또는 조성물의 투여를 향상시키는 방법이 본원에 제공된다. 여전히 다른 양태에서, 임의의 이러한 양태 또는 이러한 양태 모두는 조합된다.
유용한 Cbl 억제제는 cCbl, Cbl-b 및/또는 Cbl-c 효소의 활성을 억제하는 화합물을 포함한다. Cbl 억제제는 소 분자(small molecule), 펩타이드, 항체 또는 핵산일 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 화학식 (A)에 따른 화합물 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 이 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 (A)]
Figure pct00001
상기 화학식 (A)에서:
R1은 H, C1 내지 C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴, C1 내지 C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1 내지 C6 알킬-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴)이고;
Figure pct00002
는
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
이고:
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
Z3은 CH 또는 N이고;
X는 CH 또는 N이고;
R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴), -NH-(C1 내지 C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴), -O-(C1 내지 C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
R3a는 H, 할로, 또는 C1 내지 C6 알킬이고;
R3b는 H, 할로, C1 내지 C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 4- 내지 8-원의 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하며, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹으로 임의 치환되거나;
R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
n은 0 또는 1이고;
Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이며, 선택적으로, 단, R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로인 경우, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
Q는 CH 또는 N이고;
R4는 H, C1 내지 C6 알킬, C1 내지 C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R10은 H, C1 내지 C6 알킬, C1 내지 C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1 내지 C6 알킬, 또는 C1 내지 C6 할로알킬이거나; R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
각각의 R12는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1 내지 C6 알킬), -CN, C1 내지 C6 알킬-CN, C1 내지 C6 알킬-OH, 또는 C1 내지 C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 게미날(geminal) R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성할 수 있다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 본원에 기술된 화합물 101 내지 129로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 항체이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 siRNA이다.
일 양태에서, 이를 필요로 하는 환자의 병태(condition)를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체(donor) 내에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 증진시키기에 적합한 조건에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터 순환하는 면역 세포를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 종양 또는 이의 일부로부터 수득된 면역 세포를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법들은 수거한 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 본 방법은 상기 공여체로부터의 면역 세포를 생체 외에서 1 또는 2 단계로 확장시키는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 특정의 구현예에서, 제2 단계는 신속한 확장 단계이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 확장 단계는 하나 이상의 Cbl 억제제의 존재 하에 있다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 단계는 하나 이상의 Cbl 억제제와 조합된다.
다른 양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하는 확장 방법, 조성물, 및 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터 종양 또는 이의 일부를 수거하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체 내에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 촉진하기에 적합한 조건하에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 수거된 세포들은 유전적으로 변형된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 상기 종양으로부터의 면역 세포를 생체 외에서 1 또는 2 단계로 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 이러한 방법은 제2의 확장 단계, 예를 들면, 신속한 확장 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터, 종양 또는 이의 일부로부터의 면역 세포를 수거하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 수거된 세포들은 유전적으로 변형된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 상기 종양으로부터의 면역 세포를 생체 외에서 1 또는 2 단계로 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 단계는 Cbl 억제제의 존재하에서의 확장 단계이다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서의 제1 단계는 충분한 수의 효과적인 면역 세포를 생성함으로써 제2의 신속한 확장 확장 단계가 필요하지 않다. 다른 구현예에서, 이러한 방법은 제2의 확장 단계, 예를 들면, 신속한 확장 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 이를 필료로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터의 종양, 또는 이의 일부로부터 면역 세포를 수거하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 수거된 면역 세포는 유전적으로 변형된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 상기 종양으로부터의 면역 세포를 생체 외에서 1 또는 2 단계로 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은, Cbl 억제제의 존재하에, 제2의 확장 단계, 예를 들면, 신속한 확장 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 이를 필료로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터의 종양, 또는 이의 일부로부터 면역 세포를 수거하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 수거된 면역 세포는 유전적으로 변형된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 상기 종양 세포로부터의 면역 세포를 생체 외에서 1 또는 2 단계로 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 다른 구현예에서, 이러한 방법은, 제2의 확장 단계, 예를 들면, 신속한 확장 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 충분한 양의 Cb1 억제제를 투여하는 단계와 함께 투여함으로써, 예를 들면, 면역 세포의 효능을 향상시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 내구성을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 이식을 향상시킨다.
특정의 양태에서, 임의의 상기 방법은 조합된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계, 및 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계 및 Cbl 억제제의 존재 하에 제1의 확장을 수행하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계, 및 제2의 신속한 확장 단계를 수행하지 않는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 Cbl 억제제를 공여체에게 투여하는 단계, 및 Cbl 억제제의 존재 하에서 제1의 확장을 수행하는 단계, 제2의 신속한 확장을 수행하지 않는 단계 및/또는 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 Cbl 억제제의 존재 하에서 제1의 확장을 수행하는 단계, 및 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 Cb1 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계, Cbl 억제제의 존재 하에서 제1의 확장을 수행하는 단계, 및 제2의 신속한 확장을 수행하지 않는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계, Cbl 억제제의 존재 하에서 제1의 확장을 수행하는 단계, 및 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 Cb1 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거 전에 Cbl 억제제를 공여체에게 투여하는 단계, 제2의 신속한 확장을 수행하지 않는 단계, 및 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 Cbl 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 Cbl 억제제의 존재 하에서 제1의 확장을 수행하는 단계, 제2의 신속한 확장을 수행하지 않는 단계, 및 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 Cbl 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체 내에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 촉진하기에 적합한 조건에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터 순환하는 면역 세포를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거한 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터의 면역 세포를 생체 외에서 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터 순환화는 면역 세포를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거한 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 생체 외에서 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 Cbl 억제제의 존재 하에 있다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료요법 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 공여체로부터 순환하는 면역 세포를 수거하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 수거된 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포를 생체 외에서 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 면역 세포의 효능을 향상시키기에 충분한 양의 Cb1 억제제를 투여하는 단계와 함께 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 구현예에서, Cb1 억제제는 면역 세포의 내구성을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cb1 억제제는 면역 세포의 이식을 향상시킨다.
특정의 양태에서, 임의의 상기 방법은 조합된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 순환하는 면역 세포를 수거하기 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계, 수거한 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계, Cbl 억제제의 존재 하에서 확장을 수행하는 단계 및/또는 Cbl 억제제와 함께 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
면역 세포는 숙련가에게 유용한 것으로 고려된 임의의 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 종양으로부터 또는 혈액 또는 혈장 내 순환하는 세포로부터 단리될 수 있다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구, T 세포, CAR-T 세포, TCR T 세포, 천연 킬러 세포, NK-CAR 세포 중에서 선택된다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 특정 종양 항원의 존재에 대해 선택된 환자의 T 세포이다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 가공되고 예를 들어 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체의 존재에 대해 선택된다. 이러한 방법은 숙련가가 적합하다고 고려한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 세포 이식을 향상시키는데 유용하다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 면역 세포 기능 장애를 치료하는데 유용하다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 T 세포 기능장애(T cell dysfunction)를 치료하는데 유용하다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는데 유용하다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 세포는 고형 종양(solid tumor)의 치료에 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 세포는 재발성 또는 난치성 암의 치료에 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 세포는 암 또는 T 세포 기능 장애의 치료를 위한 화학치료요법과 함께 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 시험관 내에서 면역 세포를 확장하는 방법이 본원에 제공된다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 Cbl 억제제의 부재하에서보다 더 많은 기억 면역 세포가 생산되는 조건 하에서 Cbl 억제제의 존재 하에 시험관 내 면역 세포를 확장시키는 단계, 및 임의로 확장된 세포를 임의로 Cbl 억제제의 존재 하에서 제2 확장 라운드(round)에 적용시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이며, Cbl 억제제의 부재하에서 보다 더 많은 TSCM 및/또는 TCM이 생산된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 부재하에서 보다 더 많은 TCM이 생산된다. 특정의 구현예에서, 확장된 면역 세포는 제2의 확장 라운드에 적용되지 않는다. 특정의 다른 구현예에서, 확장된 면역 세포는 임의로 Cbl 억제제의 존재 하에서 제2 확장 라운드에 적용된다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 임의의 방법으로 제조된 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기술된 방법의 조성물은 예를 들면, 암 및/또는 면역 세포 기능장애의 치료에 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법으로 제조된 세포는 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법으로 제조된 세포는 재발성 또는 난치성 암의 치료에 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법으로 제조된 세포는 암 또는 면역 세포 기능장애의 치료를 위한 화학치료요법과 함께 사용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 사람 난소 종양(ovary tumor)및 결장 종양(colon tumor) 단편으로부터 유래된 세포를 사용하여 시험관 내에서 세포 성장에 있어서 IL-2의 부재 및 존재하에 Cb1 억제제의 효과를 나타내는 TIL 연구의 결과를 제공한다. 도 1a는 10μM, 1μM, 및 0.1μM의 Cbl 억제제 만의 존재하에 28일 동안 배양 후 세포의 수/웰(well)을 나타낸다. 도 1b는 28일 항온처리 후 10μM, 1μM, 및 0.1μM의 Cbl 억제제 및 6000IU IL-2의 존재하에서 배양 후 동일한 공급원 물질로부터의 세포의 수를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 IL-2의 부재(도 2a) 및 존재(도 2b) 하에서 0.1μM, 1.0μM, 및 10μM의 Cbl 억제제의 존재 하에서 11일 동안 확장 후 TIL에서 수행된 유 세포 분석법(flow cytometry) 연구의 결과를 제공한다.
도 3a 및 3b는 IL-2의 부재 및 존재하에서 0.1μM, 1.0μM, 및 10μM의 Cbl 억제제의 존재 하에 11일 확장 후 CD4+/IFNγ (도 3a) 및 CD8+/IFNγ(도 3b) TIL의 수준을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 상이한 환자로부터의 종양에서 성장한 림프구 퍼센트(%)를 나타낸다. 난소 종양으로부터 유래된 TIL은 DMSO(대조군), IL-2, 및 10μM, 1μM, 및 0.1μM의 Cbl 억제제 단독의 존재하에서, 및 IL-2와 함께 성장시켰다. 도 4a, 4b, 및 4d는 3명의 별개의 환자로부터의 난소 종양으로부터 유래된 TIL 세포이다. 도 4c는 결장 종양 조직으로부터 유래한 TIL 세포에 대한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 IL-2, Cb1 억제제, 및 이의 조합물의 존재하에서 배양된 결장 종양-유래된(도 5a) 및 난소 종양-유래된(도 5b) TIL의 결과를 제공한다.
도 6은 TIL 배양에 대한 최적의 출발 물질을 결정하기 위한 연구에 대한 결과를 제공한다. 결장 종양으로부터의 종양 단편 대 종양 세포 현탁액을 사용한 연구에서, 11일 동안 종양 단편으로부터 성장시킨 배양물은 TIL 배양물에 대한 출발 물질로서 종양 세포 현탁액을 사용하는 배양물보다 대략 10배 더 높은 확장을 나타내었다.
도 7은 사람 결장 종양으로부터 유래된 TIL의 배양 후 중추 기억 표현형(CD45RO+)을 나타내는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 %에 대한 11일째 및 28일째 결과를 제공한다.
도 8은 0일째 또는 3일째 IL-2 또는 Cbl 억제제의 첨가를 비교한 2개의 상이한 다른 난소 종양 샘플로부터의 세포 확장을 위해 가스 투과성 실리콘 바닥이 있는 가스 투과성 플라스크를 사용한 7일째 결과를 제공한다. "A"는 0일째에 IL-2 만을 첨가한 것이고, "B"는 0일째에 IL-2와 1μM의 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "C"는 0일째에 IL-2를 첨가하고 3일째에 1μM의 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "D"는 3일 때에 IL-2를 첨가하고 3일째에 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "E"는 0일째에 Cbl 억제제를 첨가한 것이다.
도 9는 Cbl 억제제를 사용하여 확장시킨 OT-1 세포가 한쪽 옆구리(flank)에 E.G7-OVA 세포를 피하 이식받은 마우스에서 확립된 종양을 거부할 수 있는 강력한 효과기(effector)임을 나타내는 결과를 제공한다.
도 10. Cbl 억제제를 사용하여 확장시킨 OT-1 세포가 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도와 혈액 내에서 생체내 지속성을 입증함을 나타내는 결과를 제공한다. 혈액 속의 OT-1 세포는 전달 후 4 또는 9일째에 평가하였다. 비장으로부터 수득한 OT-1 세포를 분석한 경우 유사한 결과가 수득되었다.
도 11a 및 11b는 Cbl 억제제, IL-2, Cbl 억제제 및 IL-2, 및 대조군을 사용하여 확장시킨 CD8+OT-1 세포를 투여한 후 시간 경과에 따른 종양 용적을 제공한다.
도 12a 및 12b는 Cbl 억제제, IL-2, Cbl 억제제 플러스 IL-2, 및 대조군을 사용하여 확장시킨 항-CD3 자극된 OT-1 세포의 투여 후 시간 경과에 따른 종양 용적(도 12a) 및 조건부 생존율(conditional survival rate)(도 12b)을 제공한다.
도 13a(전달 후 4일째)와 도 13b(전달 후 22일째)는 총 CD45+ 세포에서의 빈도 및 Cbl 억제제의 존재 및 부재하에서 확장된 OT-1 세포의 혈액 내의 생체 내 지속성을 제공한다.
도 14a 내지 14c는 OT-1 세포 성장에 대한 Cb1 억제제의 효과를 나타낸다. 도 14a는 Cbl 억제제를 사용하여 확장시킨 OT-1 세포가 종양 내 총 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도를 입증함을 나타내는 결과를 제공한다. 도 14b 및 14c는 Cbl 억제제를 사용하여 확장시킨 OT-1 세포가 종양 내에서 소모 마커(exhaustion marker) PD1와 TIM3(도 14b) 및 PD1, TIM3와 LAG3(도 14c)의 발현을 감소시킴을 나타내는 결과를 제공한다.
도 15는 Cbl 억제제의 존재 및 부재 하에 확장시킨 수거된 OT-1 세포에서 펩타이드 재자극에 대한 반응시 총 CD45+ 세포에서의 빈도를 제공한다.
도 16a 내지 16c는 OT-1 세포 성장에 대한 Cb1 억제제의 효과를 나타낸다. 도 16a 및 16b는 Cbl 억제제의 존재 및 부재하에서 확장시킨 펩타이드-재자극된 OT-1 세포의 다기능성(IFN-감마 및 TNF-알파 이중 양성 세포)을 제공한다. 도 16c는 Cbl 억제제의 존재 및 부재하에서 확장시킨 다기능성(IFN-감마 및 TNF-알파 이중 양성) OT-1 세포에서의 고갈 마커(PD1 및 TIM3) 빈도를 제공한다.
도 17a 및 17b는 비장세포로부터 수거한 펩타이드-재자극된 OT-1 세포에서 IFN-감마와 IL2 생산을 제공한다. 도 17a는 재시뮬레이션(resimulation) 시 IFN-감마 생산을 제공한다. 도 17b는 재자극시 IFN-감마 및 IL-2의 생산을 제공한다.
도 18은 화합물 116의 경구 투여의 존재 및 부재에 따른 IL-2 및 화합물 103을 사용하여 확장시킨 OT-1 세포의 항-종양 효능을 제공한다.
도 19는 화합물 116의 경구 투여의 존재 및 부재에 따른, IL-2 및 화합물 103을 사용하여 확장시킨 OT-1 세포로 처리된 마우스의 생존률을 제공한다.
도 20a(전달 후 5일째) 및 20b(전달 후 20일째)는 총 CD45+ 세포에 있어서의 빈도 및 화합물 116의 경구 투여의 존재 및 부재에 따른 IL-2 및 화합물 103을 사용하여 확장시킨 OT-1세포의 생체내 지속성을 제공한다.
도 21은 Cbl 억제제를 사용하여 시험관 내에서 확장시킨 종양 항원 특이적인 T 세포(OT-1 세포)가 이후 시점에서 종양 재-챌린지(re-challenge)로부터 마우스를 보호할 수 있음을 입증한다.
도 22a는 초기 OT-1 T 세포 전달 후 149일째에 IL-2 단독, Cbl 억제제 단독 및 조합 IL-2 및 Cbl 억제제를 사용하여 확장시킨 OT-1 세포의 생체내 지속성을 나타내는 결과를 제공한다.
도 22b는 Cb1 억제제 확장시킨 OT-1 세포의 수가 종양 재-챌린지 후 혈액 속에서 보다 신속하게 증가하였음을 나타내는 결과를 제공한다.
도 23a 및 23b는 24 웰 양식(well format)에서 Cbl 억제제와 IL-1의 첨가는 IL-2 만의 첨가와 비교하여 생체 외 TIL 확장 동안 CD4+ T 세포를 감소시키고 CD8+ 세포를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 도 23a는 기억 표현형 CD4+ T세포(CD3+CD8-)의 퍼센트를 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. 도 23b는 CD45RO+ 중에서 CD8+ T세포(CD3+CD8+)를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(two-tailed Wilcoxon signed rank test)(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 24는 24 웰 방식에서 Cbl 억제제의 첨가가 IL-2 단독과 비교하여 생체 외 TIL 확장 동안 CD8+ 중앙 메모리 T세포를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다.
a 및 25b는 GREX10 양식의 IL-2 단독과 비교하여 Cbl 억제제가 생체 외 TIL 확장 동안에 CD8+ 세포를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 도 25a는 CD45RO+ 중 기억 표현형 CD8+ T 세포(CD3+CD8+)의 퍼센트를 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. 도 25b는 환자의 암 조직으로부터 14일 생체 외 배양 후 수득된 CD8 + TIL의 총 수를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일(two-tailed) 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 26은 Cbl 억제제가 GREX10 형식의 IL-2에만 비해 생체외 TIL 확장 중에 CD8+ 중앙 메모리 T 세포를 증가시킨다는 결과를 제공한다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산되었다.
도 27a 및 27b는 GREX10에서 확장된 프레(pre)-REP TIL이 비특이적 자극에 대한 반응시 CD107a 동원(mobilization)에 의해 측정된 바와 같이 기능성임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소, 유방으로부터 유래된 CD8+ TIL(도 27a)과 CD4+(도 27b) TIL(n=10)을 유 세포 분석법에 의해 분비 억제제 및 항-CD107a의 존재하에서 6시간 동안 항-CD3/항CD28 자극에 대한 반응시 CD107a+ 발현에 대해 평가하였다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 28a 및 28b는 GREX10에서 확장시킨 프레-REP TIL이 비특이적 자극에 대한 반응시 Granzym+ 분비 및 Granzym B+CD107a+ 동원에 의해 측정된 바와 같이 기능성임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소 및 유방으로부터 유래한 CD8+ TIL(n=10)은 유 세포 분석법에 의한 분비 억제제 존재 하에서 6시간 동안 항-CD3/항CD28 자극에 대한 반응시 Granzym B+ 단독(도 28a)과 그랜자임(Granzyme) B+CD107a(도 28b) 발현에 대해 평가하였다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 29는 프레- REP 확장된 TIL이 고 용량(6000IU/ml)의 IL-2 또는 고 용량의 IL-2 + 1uM Cbl 억제제에 대한 반응시 사이토킨 분비에 의해 측정된 바와 같이 기능성임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소 및 유방으로부터 유래된 TIL(n=10)의 14일 확장 동안 분비된 사이토킨을 Luminex를 사용하여 평가하였다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 30a 및 30b는 1μM Cbl 억제제와 함께 고 용량의 IL-2(6000IU/ml)로 확장시킨 TIL이 IL-2 단독과 비교하여 비-특이적인 자극에 대한 반응시 증가된 T 세포 화학 유인제(chemoattractant) MIP1A(도 30a) 및 MIP1B(도 30b)를 분비함을 나타내는 결과를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2 테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 31은 고 용량의 IL-2(6000IU/ml)와 1μM 화합물 103으로 확장시킨 TIL이 비특이적 자극에 대한 반응시 T 세포 성장인자 사이토킨을 분비함을 나타내는 결과를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 2-테일 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.
도 32a 내지 32c는 Cbl 억제제가 치료 그룹 사이에 공유되는 유일한 CDR3의 퍼센트를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 그룹은 고 용량 IL-2(도 32a), 고 용량 IL-2와 화합물 103(도 32b) 및 화합물 103 단독(도 32c)이었다.
도 33은 Cbl 억제제 화합물 103이 11일 기간에 걸쳐 다수의 온도(4℃ 내지 37℃)에서 안정함을 나타내는 결과를 제공한다.
도 34는 TIL 배양에서 Cbl 억제제 안정성을 나타내는 결과를 제공한다.
정의
본원에 제공된 화합물 및 방법을 지칭하는 경우, 다음의 용어는 달리 정의하지 않는 한 다음의 의미를 갖는다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에서의 용어에 대해 다수의 정의가 존재하는 경우, 달리 기술되지 않는 한 당해 단락 내의 것이 우선한다. 본원에 기술되거나 참고된 기술 및 과정은 일반적으로 당해 분야의 기술자에 의해 잘 이해되어 있고 통상의 방법론, 예를 들면, 문헌: Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 및 Rosenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 86(15):1159-1166 (1994)에 기술된 널리 활용된 분자 클로닝(cloning) 방법론을 사용하여 통상적으로 사용된다. 적절하게는, 시판 키트(kit) 및 시약의 사용과 관련된 과정은 달리 나타내지 않은 한 일반적으로 제조업체가 정의한 프로토콜 및 조건에 따라 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 달리 나타내지 않는 한 복수의 참고를 포함한다.
용어 "약"은 나타낸 값과 이러한 값의 상하 범위를 나타내며 이를 포함한다. 특정의 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 10%, ± 5% 또는 ± 1%를 나타낸다. 특정의 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 이러한 값의 하나의 표준편차를 나타낸다. 대수 규모의 경우, "약"은 지정된 값 ± 0.1 또는 ± 0.2 로그 단위(log unit)를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비정상적인 세포 증식"이라는 용어는 과형성(hyperplasia) 또는 암 세포 증식을 포함한다. 암 세포는 혈액 암(hematologic cancer) 또는 본원에 기술된 것과 같은 비-혈액 암(non-hematologic cancer)으로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 생체 내 "활성화"는, 면역 세포를 수거 전에 세포-기반 면역치료요법을 받고 있는 개체(individual)의 면역 세포 집단의 활성을 조절하는데 효과적인 양의 Cb1 억제제와 접촉시키기 위해, 생체 내에서, 특히 상기 세포-기반 면역치료를 받고 있는 개체에서 적합한 조건의 세트를 제공함을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포이다. 면역 세포는 순환하는 T 세포일 수 있다. 면역 세포는 종양 침윤 림프구일 수 있다. 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 T-세포이며, T-세포의 조절 활성은 하나 이상의 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 소모, 및 감소된 T-세포 내성 중 하나 이상을 포함한다. 추가의 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는, 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IFN-γ, 및 TNFα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 증가된 생산을 포함한다. 여전히 다른 추가의 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 하나 이상의 T-세포 활성화 마커, 예를 들면, CD25, CD69 및 CD45RO 중 하나 이상의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, T-세포는 항-CD3 항체 단독과 또는 항-CD28 항체와 함께 접촉되었거나 접촉된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 NK 세포이고, NK 세포의 조절 활성은 증가된 NK 세포 활성화를 포함한다. 추가의 구현예에서, 증가된 NK세포 활성화는 IFN-γ와 같은 사이토킨의 증가된 생산을 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 B 세포이고, B 세포의 조절 활성은 증가된 B 세포 활성화(예를 들면, CD69의 증가 등)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 사람 면역 세포이다.
본 개시내용의 화합물, 예컨대, Cbl 억제제, 또는 세포의 집단에 관한 "투여" 및 이의 변형(일부 구현예에서, 화합물 또는 세포의 집단을 "투여하는")은 화합물 또는 화합물의 전구약물(prodrug), 또는 상기 화합물, 예컨대, Cb1 억제제로 처리된 세포의 집단을 세포의 활성화 또는 치료를 위해 동물의 시스템 내로 도입시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 화합물, 또는 이의 전구약물이 하나 이상의 다른 활성제(일부 구현예에서, 예컨대, 세포의 집단의 주입, 수술, 방사선조사, 및 화학치료요법 등)와 함께 제공되는 경우, "투여" 및 이의 변형은 각각 화합물 및 다른 제제 또는 성분의 동시 및 순차적인 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Cbl"은 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 Cbl 단백질을 지칭한다. 당해 용어는 또한 이러한 단백질의 천연적으로 존재하는 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체(splice variant) 또는 대립형질 변이체(allelic variant)를 포함한다. 당해 용어는 또한 이러한 단백질의 비-천연적으로 존재하는 변이체, 예를 들면, 재조합 Cb1 단백질 또는 트렁케이트된(truncated) 이의 변이체를 포함하고, 이는 일반적으로 천연적으로 존재하는 Cbl 또는 Cb1의 천연적으로 존재하는 변이체의 결합 능력(예: E2 효소에 결합하는 능력)을 보존하고 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Cbl 억제제"는 Cbl에 결합하여 Cbl 단백질의 활성 또는 기능을 억제하는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 Cbl-b의 활성을 억제하는 화합물이다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 공-자극(co-stimulation)의 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있는 화합물이다.
생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내에서 세포를"접촉시키는"은 세포 또는 집단(population) 내 세포를 특정 화합물, 분자 또는 시약에 노출시킴을 지칭한다. 세포와 접촉될 수 있는 화합물은 사이토킨, 항체, 미토겐(mitogen), 재조합 리간드(recombinant ligand), 및 렉틴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "공여체"는 포유동물이다. 본 개시내용의 방법에서 사용될 면역 세포에 대한 공급원 목적을 위한 "포유동물"은 사람; 비-사람 영장류; 가정 및 농장 동물; 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 거빌(gerbil), 마우스, 페렛(ferret), 랫트(rat), 고양이 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여체는 사람이다. "관련 공여체"는 치료를 받고 있는 개체의 가까운 혈족이다. "살아 있는 무관계 공여체"는 치료 중인 개체의 가까운 혈연관계가 아닌 개체이다.
"약물-향상된 입양 세포 치료요법(drug-enhanced adoptive cell therapy)"은 하나 이상의 Cb1 억제제를 사용하여 입양 세포 치료요법에서 사용하기 위한 수거될 세포의 양을 증가시키고/시키거나, 시험관 내에서 세포의 선택 및 확장에 필요한 시간 길이를 단축하고/하거나, 이를 필요로 하는 환자에게 주입하기 위한 입양 세포 치료요법에서 생산될 세포의 수와 내구성을 증가시키고/시키거나, 이를 필요로하는 환자에게서 입양 세포 치료요법의 효능을 증가시킴을 포함하는 입양 세포 치료요법에 관한 것이다.
"약물-향상된 키메라 항원 수용체 치료요법"은 하나 이상의 Cbl 억제제를 사용하여 입양 세포 치료요법에서 사용하기 위해 수거될 세포의 양을 증가시키고/시키거나, 시험관 내에서 유전적으로 변형된 세포의 선택 및 확장에 필요한 시간의 길이를 단축시키고/시키거나, 이를 필요로 하는 환자 내로 주입하기 위한 유전적으로 변형된 세포의 수 및 내구성을 증가시키고/시키거나 이를 필요로 하는 환자에서 키메라 항원 수용체 치료요법의 효과를 증가시킴을 포함하는 키메라 항원 치료요법(chimeric antigen therapy)을 지칭한다.
"약물-향상된 TIL 치료요법"은 하나 이상의 Cb1 억제제를 사용하여 종양 단편으로부터 수거될 세포의 양을 증가시키고/시키거나, 시험관 내에서 TIL의 선택 및 확장에 필요한 시간의 길이를 단축시키고/시키거나, 이를 필요로 하는 환자 내로 주입하기 위해 생산될 TIL의 수 및 내구성을 증가시키고/시키거나, 이를 필요로 하는 환자에서 TIL 치료요법의 효능을 증가시킴을 포함하는, 종양 침윤 림프구 치료요법(tumor infiltrating lymphocyte therapy)을 지칭한다.
본원에 개시된 제제의 "유효량"은 구체적으로 명시된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 기술된 목적과 관련하여, 경험적으로 및 통상의 방식으로 측정될 수 있다. 제제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 목적한 생물학적 효과, 예를 들면, 유리한 결과, 예를 들면, 유리한 임상 결과를 생산하기에 적절한 양이다. 일부 구현예에서, 용어 "유효량"은 개체인(예컨대, 사람과 같은 포유동물)의 질환병 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 제제의 양을 지칭한다.
"농축된" 세포 집단은 정제되거나, 분류되거나, 특정의 표현형 또는 기능적 활성의 세포의 생존 또는 증식을 촉진하는 기간 동안 조건(예컨대, 특정 화합물 또는 분자의 존재 하에서 시험관 내 배양)에 노출된 세포의 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 농축된 세포 집단은 정상 조직 환경에서 발견되는 것보다 높은 농도 또는 비율의 특정 세포 유형을 가질 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포와 조혈 전구 세포(progenitor cell)를 포함한다.
"면역 세포"는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수성 전구 세포, 림프구 전구세포, 종양 침윤 림프구, T 세포, B 세포, 및/또는 NK 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "성장을 억제한다"(예컨대: 종양 세포와 같은 세포를 지칭함)는 Cbl 억제제로 처리된 세포와 접촉하는 경우 세포 성장(예컨대, 종양 세포 성장)에서 임의의 측정 가능한 감소를 포함하는 것으로 의도된다. 특정의 구현예에서, 세포 성장은 Cbl 억제제로 처리된 세포 또는 세포들과 접촉하지 않은 동일한 세포의 성장과 비교된다. 일부 구현예에서, 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 까지 억제될 수 있다. 세포 성장에서의 감소는 다양한 메카니즘, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 단백질 내재화(protein internalization), 세포자멸사(apoptosis), 괴사(necrosis) 및/또는 효과기 기능-매개된 활성(effector function-mediated activity)에 의해 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "예방제(prophylactic agent)" 및 "예방제들(prophylactic agents)"은 병태, 질환 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하는 데 사용할 수 있는 임의의 제제(들)를 지칭한다. 특정의 구현예에서, 용어 "예방제"는 본원에 제공된 화합물을 포함한다. 특정의 다른 구현예에서, "예방제"는 본원에 제공된 화합물을 지칭하지 않는다. 특정의 구현예에서, 예방제는 암 또는 면역-매개된 장애와 관련된 병태, 질환 또는 장애의 발생, 발달, 진행 및/또는 중증도를 예방하거나 지연시키는데 유용하다고 공지되어 있거나, 사용되었거나 현재 사용 중이거나, 부작용의 발생을 방지 또는 지연시키거나 부작용(예컨대, 오심, 구토)의 중증도를 감소시키는데 유용한 것으로 공지되어 있거나, 사용되었거나, 현재 사용 중인 제제일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "예방학적 유효량"은 병태, 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 발달, 재발 또는 발생의 예방 또는 감소를 야기하거나, 다른 치료요법(예컨대, 다른 예방적 제제)의 예방 효과(들)을 향상시키거나 개선시키기에 충분한 치료요법(예컨대, 예방제)의 양을 지칭한다.
"선택", "선택적 농축" 또는 "선택적 확장"은 특정 유형의 면역 세포, 예컨대, CD8+ T 세포, 또는 특수한 표현형의 T 세포, 예를 들면, (CD45RO+/CD95+) 기억 T 세포의 농축과 함께, 상기 면역 세포의 증식을 촉진하는 조건 하에서, 개체로부터 수거된 면역 세포의 생체 외 배양물, 또는 공여체로부터의 면역 세포 또는 줄기세포의 시험관 내 배양물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 용어 "대상체"는 동물, 예컨대, 포유동물, 예를 들면, 비-영장류(예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 및 마우스) 및 영장류(예: 원숭이, 예를 들면, 시노몰구스 원숭이(cynomologous monkey), 침팬지 및 사람), 및 특정의 구현예에서, 사람을 지칭한다. 특정의 구현예에서, 대상체는 농장 동물(예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완 동물(예를 들면, 개 또는 고양이)이다. 특정의 구현예에서, 대상체는 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원성 자극에 대해 감소된 면역 반응성의 상태를 지칭한다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 T-세포 고갈 및/또는 항원 인식이 일어날 수 있지만, 면역 반응의 보증은 종양 성장을 제어하기에 효과적이지 않은 T-세포 아네르기 둘 다의 일반적인 성분을 포함한다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원 인식에 대해 재발성이거나 비반응성인, 예를 들면, 항원 인식을 하부 T-세포 효과기 기능으로 해독하는 능력, 예를 들면, 증식, 사이토킨 생산 및/또는 표적 세포 사멸의 손상을 포함한다.
용어 "T-세포 아네르기"는 T-세포 수용체를 통해 전달된 불완전하거나 불충분한 신호로부터 야기되는 항원 자극에 대해 비반응성 상태를 지칭한다. "T-세포 아네르기"는 또한 공-자극의 부재하에서 항원을 사용한 자극 시 야기되어, 심지어 공-자극의 맥락에서 항원에 의한 후속적인 활성화에 대해 불응성이 될 수 있다.
용어 "T-세포 고갈"은 암 동안 발생할 수 있는 지속적인 TCR 신호전달에서 발생하는 T-세포 기능 장애의 상태를 지칭한다. 이는 불완전 또는 결핍성 신호전달을 통해 발생하지 않지만 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 아네르기와는 구별된다. 이는 불량한 효과기 기능, 억제성 수용체의 지속된 발현, 및 기능성 효과기 또는 기억 T 세포와 구별되는 전사 상태에 의해 정의된다.
용어 "T-세포 내구성"은 저장소로서 존속하고 또한 일정 기간 동안 주입 후 증식을 지속함으로써 상기 T 세포에 의한 지속된 면역 감시(surveillance)가 현재 및 잠재적으로 미래의 악성의 근절을 촉진하도록 하는 이식되거나 주입된 T 세포의 능력을 지칭한다. 이러한 T 세포 중 일부는 활성화된 상태에 있다. 내구성은 또한 주입 시 생존하거나 지속하는 이식된 세포의 능력을 지칭한다. T 세포 반응 또는 세포 증식의 내구성은 질환 차도와 관련될 수 있다.
"T-세포 기능장애 장애"는 항원 자극에 대한 T 세포의 감소된 반응성에 의해 특성화된 장애 또는 병태이다. 감소된 반응성은 종양의 비효율적인 제어를 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "T-세포 기능장애 장애"는 혈액 암 또는 비-혈액 암과 같은 암을 포함한다. 일부 구현예에서, "T-세포 기능장애 장애"는 T 세포가 아네르기성(anergic)이고/이거나 사이토킨을 분비하고/하거나, 증식하고/하거나 세포분해 활성을 실행하는 능력이 감소된 것이다.
"T-세포 기능을 향상시키는"은 T 세포가 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 가지도록 유도, 유발 또는 자극하거나, 고갈된 또는 비활성 T 세포를 재생 또는 재활성화함을 의미한다. 향상된 T 세포 기능의 예는 증가된 T-세포 활성화(예컨대, 증가된 사이토킨 생산, T-세포 활성화 마커의 증가된 발현 등), 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포의 고갈, 및/또는 Cbl 억제제를 사용한 처리 전 T 세포의 상태와 관련하여 감소된 T세포 내성을 포함한다. T 세포 기능의 향상을 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여되는 경우 질환이나 장애를 치료하는데 효과적인 단백질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유효량 또는 유효량은 대상체에게 투여된 경우, 질환 또는 질환의 진행을 예방 또는 개선시키거나, 증상의 개선을 야기하는데 효과적인 조성물의 양을 지칭한다. 용어 "치료제"는 Cbl 억제제, 변형된 면역 세포 집단, 또는 이들의 조합 또는 조성을 지칭할 수 있다.
임의의 질환 또는 장애를 "치료하는" 또는 "치료"는, 특정의 구현예에서, 대상체 내에 존재하는 질환 또는 장애를 개선시킴을 지칭한다. 다른 실시 양태에서는, "치료하는" 또는 "치료"는 대상체에 의해 식별불가능할 수 있는, 적어도 하나의 물리적 매개변수를 개선하는 것을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로(예컨대, 식별 가능한 증상의 안정화) 또는 생리학적으로(예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화) 조절하는 것을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발생을 지연 또는 예방하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 용어 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함하여, 개체에게 유리하거나 목적한 결과를 수득하기 위한 노력에서, 개체(사람 또는 기타)에게 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있는 프로토콜을 실행하는 것을 의미한다. 유리하거나 목적한 임상 결과는 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환 범위의 감소, 질환의 안정화(즉 악화되지 않은) 상태, 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도(부분적인 또는 전체적인)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 개체의 예측된 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 또한, "치료하는" 및 "치료"는 치료제 또는 치료제들의 1회 용량의 투여에 의해 발생할 수 있거나, 치료제 또는 치료제들의 일련의 용량의 투여시 발생할 수 있다. "치료하는" 또는 "치료"는 신호 또는 증상의 완전한 개선을 요구하지 않고, 치유도 필요하지 않다. "치료"는 또한 치료 중인 개체 또는 세포의 자연스러운 경로를 변경하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 개체에게 투여하는 것과 같은 임상 개입(clinical intervention)을 지칭할 수 있다(즉, 임상 개입의 부재하에서 발생할 수 있는 개체 또는 세포의 경로를 변경시키기 위함).
본원에 사용된 바와 같은 "알킬"은 포화 직쇄(즉, 비측쇄) 또는 측쇄된 1가의 탄화수소 쇄 또는 이의 조합을 지칭한다. 특수한 알킬 그룹은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹, 예를 들면, 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1 내지 C20 알킬"), 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1 내지 C10" 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1 내지 C8 알킬"), 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1 내지 C6 알킬"), 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹(예컨대, C1 내지 C4 알킬")이다. 알킬 그룹의 예는 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 이의 동족체 및 이성체, 예를 들면, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"아미노"는 그룹 -NH2를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "아릴"은 단일 환(예컨대, 페닐), 또는 다중 축합된 환(예컨대, 나프틸 또는 안트릴)를 갖는 방향족 카보사이클 그룹을 지칭하며, 여기서 축합 환 중 하나 이상은 방향족일 수 없다. 특수한 아릴 그룹은 6 내지 14개의 고리형(즉, 환) 탄소 원자를 가진 것("C6-C14 아릴")이다. 적어도 하나의 환이 비-방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 모 구조에 방향족 환 위치 또는 비-방향족 환 위치에서 연결될 수 있다. 하나의 변형에서, 적어도 하나의 환이 비-방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 모 구조에 방향족 환 위치에서 연결된다. 아릴의 예는 페닐, 나프틸, 1 내지 나프틸, 2-나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-6-일 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "아릴렌"은 아릴과 동일하지만 2가를 갖는 잔기를 지칭한다. 특수한 아릴렌 그룹은 6 내지 14개의 고리 모양의 탄소 원자를 갖는 것("C6-C14 아릴렌")이다. 아릴렌의 예는 페닐렌, o-페닐렌(즉, 1,2-페닐렌), m-페닐렌(즉, 1,3-페닐렌), p-페닐렌(즉, 1,4-페닐렌), 나프틸렌, 1,2-나프틸렌, 1,3-나프틸렌, 1,4-나프틸렌, 2,7-나프틸렌, 2,6-나프틸렌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"카보사이클릴" 또는 "카보사이클릭"은 환 구성원 모두가 탄소 원자인 1가 사이클릭 그룹, 예를 들면, 사이클로헥실, 페닐, 1,2-디하이드로나프틸 등을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "사이클로알킬"은 비방향족의, 포화 또는 불포화된, 사이클릭 1차 탄화수소 구조를 지칭한다. 특수한 사이클로알킬 그룹은 고리식(즉, 환) 탄소 원자의 지정된 수를 갖는 것, 예를 들면, 3 내지 12개의 고리식 탄소 원자를 갖는 카보사이클릭 그룹("C3-C12 사이클로알킬")이다. 특수한 사이클로알킬은 3 내지 8개의 고리식 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C8 사이클로알킬") 또는 3 내지 6개의 고리식 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C6 사이클로알킬")이다. 사이클로알킬은 사이클로헥실과 같은, 하나의 환, 또는 아다만틸과 같은 다수의 환으로 이루어질 수 있지만, 아릴 그룹은 제외된다. 하나 이상의 환을 포함하는 사이클로알킬은 융합, 스피로, 또는 브릿지(bridge), 또는 이의 조합이 될 수 있다. 사이클로알킬 그룹의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1 내지 사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 노르보르닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "사이클로알킬렌"은 사이클로알킬과 동일하지만 2가를 갖는 잔기를 지칭한다. 특수한 사이클로알킬렌 그룹은 3 내지 12개의 고리식 탄소 원자를 갖는 것("C3-C12 사이클로알킬렌"), 3 내지 8개개의 고리식 탄소 원자를 갖는 것("C3-C8 사이클로알킬렌") 또는 3 내지 6개의 고리식 탄소 원자를 갖는 것("C3-C 사이클로알킬렌")이다. 사이클로알킬렌 그룹의 예는 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 1,2-사이클로헥세닐렌, 1,3-사이클로헥세닐렌, 1,4-사이클로헥세닐렌, 사이클로헵틸렌, 노르보르닐렌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"할로" 또는 "할로겐"은 원자 번호가 9 내지 85인 17족 계열의 원소를 말한다. 할로 그룹은 플루오로, 클로로, 브로모, 그리고 요오도를 포함한다.
"할로알킬", "할로알킬렌", "할로아릴", "할로아릴렌", "할로헤테로아릴" 및 유사한 용어는 적어도 하나의 할로 그룹으로 치환된 모이어티(moiety)를 지칭한다. 할로알킬 모이어티 또는 다른 할로-치환된 모이어티가 하나 이상의 할로겐으로 치환하는 경우, 이는 부착된 할로겐 모이어티의 수에 상응하는 접두사를 사용하여 지칭할 수 있다. 예를 들면, 디할로아릴, 디할로알킬, 트리할로아릴, 트리할로알킬 등은 2개의("디") 또는 3개의("트리") 할로 그룹으로 치환된 아릴 및 알킬을 지칭하고, 이는 동일한 할로일 수 있지만, 필수적인 것은 아니며; 따라서, 예를 들어, 할로아릴 그룹 4-클로로-3-플루오로페닐은 디할로아릴의 범위 내에 있다. 알킬 그룹의 각각의 수소가 할로 그룹으로 대체된 할로알킬 그룹의 서브세트는 "퍼할로알킬"로 지칭된다. 특수한 퍼할로알킬 그룹은 트리플루오로알킬(-CF3)이다. 유사하게, "퍼할로알콕시"는 할로겐이 탄화수소 내 각각의 알킬 대신체 치해져서 알콕시 그룹의 알킬 모이어티를 이루는 알콕시 그룹을 지칭한다. 퍼할로알콕시 그룹의 예는 트리플루오로메톡시(-OCF3)이다. "할로알킬"은 모노할로알킬, 디할로알킬, 트리할로알킬, 퍼할로알킬 및 알킬 그룹에서 가능한 임의의 다른 수의 할로 치환체; 및 다른 그룹의 경우 예를 들면, 할로알킬렌, 할로아릴, 할로아릴렌, 할로헤테로아릴 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "헤테로아릴"은 1 내지 14개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 황과 같은 헤테로원자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 고리식 헤테로원자를 갖는 불포화된 방향족 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로아릴 그룹은 단일 환(예를 들면, 피리딜 또는 이미다졸릴) 또는 축합 환 중 적어도 하나가 방향족인 다수의 축합 환(예를 들면, 인돌리지닐, 인도릴 또는 퀴놀리닐)을 가질 수 있다. 특수한 헤테로아릴 그룹은 1 내지 12개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 6개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5 내지 14원의 환("5- 내지 14-원의 헤테로아릴"); 1 내지 8개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10 내지 원의 환("5 내지 10원의 헤테로아릴"); 또는 1 내지 5개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5-, 6- 또는 7-원의 환("5- 내지 7-원의 헤테로아릴")이다. 다양한 변화에서, 헤테로아릴은 1 내지 6개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 고리식 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭의 방향족 5-, 6- 또는 7-원의 환을 포함한다. 다른 변화에서, 헤테로아릴은 1 내지 12개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹에서 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 고리식 헤테로원자를 갖는 폴리사이클릭 방향족 환을 포함한다. 적어도 하나의 환이 비-방향족인 하나 이상의 환을 갖는 헤테로아릴 그룹은 모 구조에 방향족 환 위치에서 또는 비-방향족 환 위치에서 연결될 수 있다. 헤테로아릴의 예는 피리딜, 벤조이미다졸릴, 벤토트리아졸릴, 벤조[b]티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴 등과 같은 그룹을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "헤테로아릴"은 또한 모이어티, 예를 들면,
Figure pct00005
, 호변이성체 구조,
Figure pct00006
를 갖는 2,4-디하이드로-3H-1,2,4-트리아졸-3-온-2-일, 1H-1,2,4-트리아졸-5-올-1-일을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴과 동일하지만 2가를 갖는 잔기를 지칭한다. 특수한 헤테로아릴렌 그룹은 1 내지 12개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5- 내지 14-원의 환("5 내지 14-원의 헤테로아릴렌"); 1 내지 8개의 고리식 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10 내지 원의 환("5- 내지 10 내지 원의 헤테로아릴렌"); 또는 1 내지 5개의 고리식 탄소 원자를 갖고 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 고리식 헤테로원자를 갖는 5-, 6-, 또는 7-원의 환("5- 내지 7-원의 헤테로아릴렌"이다. 헤테로아릴렌의 예는 피리딜렌, 벤즈이미다졸릴렌, 벤조트리아졸릴렌, 벤조[b]티에닐렌, 퀴놀릴렌, 인돌릴렌, 벤조티아졸릴렌 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 그룹"은 명시된 바와 같은 수의 원자 및 헤테로원자를 갖거나, 원자 또는 헤테로원자의 수가 명시되지 않은 경우, 적어도 3개의 고리식 원자, 1 내지 14개의 고리식 탄소 원자, 및 질소, 산소, 및 황과 같은 헤테로원자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 고리식 헤테로원자를 갖는 비-방향족의 포화되거나, 부분 불포화된 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로사이클릭 그룹은 단일 한(예컨대, 테트라하이드로페닐, 옥사졸리디닐) 또는 다수의 축합 환(예컨대, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥차하이드로벤조[d]옥사졸릴)을 가질 수 있다. 다수의 축합 환은 비하이클릭, 트리사이클릭, 및 쿼드라사이클릭 환, 뿐만 아니라 브릿지되거나 스피로사이클릭 환 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클릭 그룹의 예는 아지리디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 디옥사닐, 3,6-디하이드로-2H-피라닐, 2,3-디하이드로-1H-이미다졸릴 등을 포함하나, 이헤 한정되지 않는다.
"옥소"는 그룹 =O, 즉, 탄소 또는 다른 원소에 이중 결합된 산소 원자를 지칭한다.
"임의 치환된"은 달리 명시하지 않는 한, 그룹이 비치한되거나 이러한 그룹에 대해 나열된 치환체 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)에 의해 치환된 그룹을 의미하고, 여기서 치환체는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 임의 치환된 그룹은 비치환된다. 일 구현예에서, 임의 치환된 그룹은 하나의 치환체를 갖는다. 다른 구현예에서, 임의 치환된 그룹은 2개의 치환체를 가진다. 다른 구현예에서, 임의 치환된 그룹은 3개의 치환체를 가진다. 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 4개의 치환체를 가진다. 일부 구현예에서, 임의 치환된 그룹은 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 5개의 치환체를 가진다. 다수의 치환체가 존재하는 경우, 각각의 치환체는 달리 나타내지 않는 한 독립적으로 선택된다. 예를 들면, 그룹 -N(C-C4 알킬)(C1 내지 C4 알킬) 상의 각각의 (C1 내지 C4 알킬) 치환체는 서로 독립적으로 선택됨으로써, -N(CH3)(CH2CH3)와 같은 그룹을 생성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "소분자"는 분자량이 2,000달톤 이하인 화합물을 지칭한다.
본원의 개시내용 외에, 용어 "치환된"은 명시된 그룹 또는 라디칼을 개질시키는데 사용된 경우, 또한 명시된 그룹 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각각 서로 독립적으로 본원에 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 치환체 그룹으로 대체됨을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환체인 그룹은 1, 2, 3, 또는 4개의 치환체, 1, 2, 또는 3개의 치환체, 1개 또는 2개의 치환체 또는 1개의 치환체를 갖는다.
치환체는, 달리 나타내지 않는 한, 명시된 그룹 또는 라디칼 상의 화학적으로 가능한 위치에 부착될 수 있다. 따라서 -C1 내지 C8 알킬-OH는 예를 들면, -CH2CH2OH 및 -CH(OH)-CH3, 및 -CH2C(OH)(CH3)2를 포함한다.
원소의 특정 동위원소가 화학식에 나타나 있지 않는 한, 본 개시내용은 본원에 개시된 화합물의 모든 동위원소, 예를 들면, 화합물의 중수소화된 유도체(여기서 H는 2H, 즉 D일 수 있다)를 포함한다. 중수소화된 화합물은 약동학적(ADME) 특성에서 유리한 변화를 제공할 수 있다. 동위원소는 구조 내 임의의 또는 모든 위치에서 동위원소적 대체를 가질 수 있거나, 구조 내에 임의의 또는 모든 위치에서 천연적으로 풍부하게 존재하는 원자를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "부형제(excipient)"는 사용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 대해 무독성인 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 비히클 또는 안정화제를 포함한다. 흔히 생리학적으로 허용되는 부형제는 수성 pH 완충된 용액이다.
용어 "약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 제형 또는 조성물이 투여될 수 있는 개체에 대해 허용불가능하게 독성인 추가의 구성성분(component)을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형 또는 조성물은 멸균성일 수 있다.
약제학적 조성물에서 기술된 바와 같은 화합물, 또는 약제학적 조성물에 대한 청구범위에서 기술된 바와 같은 화합물에 대한 참고는 약제학적 조성물의 다른 성분이 없는, 즉, 담체, 부형제 등이 없는, 약제학적 조성물 속에 인용된 화학식으로 기술된 화합물을 지칭한다.
본 개시내용은 본원에 기술된 화합물의 모든 염 뿐만 아니라 이러한 화합물의 염을 사용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약물 또는 약제로서 사람 및/또는 동물에게 투여될 수 있고, 투여시, 유리 화합물(중성 화합물 또는 비-염 화합물)의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유하는 염이다. 기본 화합물의 목적한 염은 화합물을 산으로 처리함으로써 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 무기 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 및 인산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유기산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 설폰산 및 살리실산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아스파르테이트 염 및 글루타메이트 염과 같이 기본 화합물과 아미노산의 염을 또한 제조할 수 있다. 산성 화합물의 목적한 염은 화합물을 염기로 처리함으로써 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 산 화합물의 무기 염의 예는 알칼리 금속 및 알칼리 토 금속, 예를 들면, 나트륨, 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 및 칼슘 염; 암모늄염; 및 알루미늄 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 산 화합물의 유기 염의 예는 프로카인, 디벤질아민, N-에틸피페리딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 트리에틸아민 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 산성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들면, 리신 염을 또한 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 목록에 대해서는, 예를 들면, 문헌: P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.) "Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use" Wiley-VCH, 2011 (ISBN: 978-3-90639-051 내지 2)를 참고한다. 수개의 약제학적으로 허용되는 염이 문헌: Berge, J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)에 개시되어 있다.
개요
세포 치료요법을 위해 Cbl 억제제를 사용하는 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 세포는 숙련가에 의해 유용한 것으로 고려되는 임의의 면역 세포일 수 있다. 특정의 구현예에서, 세포는 종양 침윤 림프구, T 세포, NK 세포, CAR-T 세포, TCR-T 세포 또는 NK-CAR 세포이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 T 세포를 활성화하여 본원에 기술된 바와 같은 목적한 결과가 가능하도록 하는데 사용된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 공-자극의 부재하에서 T 세포를 활성화시켜 본원에 기술된 바와 같은 목적한 결과를 가능하도록 하는데 사용된다.
세포 치료요법을 위한 방법은 잘 알려져 있으며, 본원에 제공된 단계는 달리 명시되지 않는 한, 숙련가에게 공지된 표준 기술을 활용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 임의의 또는 모든 다음 단계를 포함한다. 하나 이상의 Cbl 억제제는 하기 상세히 설명한 바와 같이, 하나 이상의 단계를 향상시킬 수 있다.
제1 단계에서, 세포는 공여체로부터 수거한다. 수거는 표준 기술에 의해 진행할 수 있다. 특정의 구현에에서, 순환하는 면역 세포, 예를 들어, 혈액 세포를 공여체로부터 수거한다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 종양 또는 종양조직은 공여체로부터 수득하여 단편화한 다음, 면역 세포를 단리하고 종양 단편으로부터 수득한다. 제2 단계에서, 수거한 면역 세포는 1 또는 2 단계로 확장된다. 일반적으로, 수거된 순환 면역 세포는 획득되는 세포의 수가 상대적으로 많기 때문에 1 단계로 확장된다. 대조적으로, 종양으로부터 수거된 면역 세포는 혈액으로부터의 것과 비교하여 종양 단편으로부터 전형적으로 수득된 면역 세포의 수의 보다 적은 수로 인하여 일반적으로 2 단계로의 확장이 요구된다. 어느 경우에서도, 수거된 면역 세포는 확장 전에 임의로 유전적으로 변형될 수 있다. 어느 경우에서도, 제1의 확장은 3 내지 28일, 바람직하게는 3 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 제1의 확장은 면역 세포의 수에 있어서 수 배의 증가를 야기시켜야 한다.
일부 방법은 임의의 제2의 확장을 포함한다. 제2의 확장에서, 세포 배양 배지를 보충시켜 이러한 보충없이 수득될 수 있는 면역 세포의 성장을 향상시킬 수 있다. 제2의 확장은 3 내지 14일, 바람직하게는 7 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 중요하게는, 특정의 유리한 구현예에서, 제2의 확장은 조기 단계에서 Cbl 억제제의 효과로 인하여 종양으로부터 수거된 면역 세포의 경우 요구되지 않는다. 따라서, 특정의 구현예에서, 제2의 확장 단계는 없다. 확장 후(1 또는 2회의 단계에 상관없이), 확장된 면역 세포가 회수된다. 면역 세포는 저장될 수 있다. 추가의 단계에서, 회수된 면역 세포는 표준 기술, 예를 들면, 주입에 의해 환자에게 투여된다. 하기에 상세히 기술된 바와 같이, 하나 이상의 Cbl 억제제는 수거 전에 숙주 내에서 면역 세포의 성장, 확장 및 발달을 촉진할 수 있고/있거나, 확장 단계 중 어느 하나를 향상시킬 수 있고/있거나, 치료요법을 위한 면역 세포의 투여를 향상시킬 수 있고/있거나 투여 후 면역 세포를 향상시켜 이의 이식을 향상시킬 수 있다. 구현예는 다음 단락에서 간략하게 및 하기 단락에서 보다 상세히 기술되어 있다.
Cbl 억제제는 방법의 하나 이상의 단계에서 유용하다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 하나의 단계에서 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 하나 이상의 단계에서 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 2개의 단계에서 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 3개의 단계에서 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체 내에서 생체 내 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 외에서 면역 세포의 제1 확장을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 외에서 면역 세포의 제2 또는 신속한 확장을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 환자 내에서 투여된 면역 세포의 투여 후 이식을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, 환자에게 투여된 Cbl 억제제는 이러한 면역 세포 치료요법을 필요로 하는 환자에서 투여된 면역 세포의 이점을 향상시킨다.
특정의 구현예에서, 방법은 개체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 개체는 면역 세포의 공여체일 수 있다. 공여체는 자가 공여체 및 또한 치료가 요구되는 환자일 수 있다. 공여체는 또한 동종이계 치료요법을 위해 세포를 제공하는 개체일 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 수거 전에 공여체에게 투여된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체로부터 수거될 수 있는 면역 세포의 총 수를 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체 내에서 활성화된 세포의 수준을 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cb1 억제제는 특이적인 활성을 지닌 세포를 증가시키는데, 예컨대, 특수한 종양 또는 암 유형에 대해 세포독성이거나 이에 결합한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 종양 침윤 림프구의 수준을 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 순환하는 T 세포의 수준을 증가시킨다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 면역 세포는 표준 기술에 따라 수거할 수 있다. 특정의 구현예에서, 세포 샘플은 면역 세포를 포함하는 순한하는 혈액 세포 또는 혈장이다. 특정의 구현예에서, 세포 샘플은 면역 세포를 포함하는 종양 조직이다. 특정의 구현예에서, 수거된 면역 세포는 하나 이상의 Cbl 억제제의 존재 하에 생체 외 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서의 배양은 종양 단편으로부터 수거된 면역 세포의 수율을 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 존재 하에서의 배양은 보다 높은 증식율을 생성한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 존재 하에서의 배양은 활성화된 면역 세포의 표현형을 나타내는 증식된 세포의 보다 높은 비율을 생성한다. 예를 들어, 많은 상이한 종양 원, 즉, 흑색종(melanoma), 유방 암(breast cancer), 난소 종양(ovarian tumor) 또는 결장 종양(colon tumor) 중 하나로부터 배양된 세포는, Cbl 억제제의 존재 하에서 배양된 경우, 특정 구현예에서, 일부 유형의 세포-기반 면역치료요법에 대해 바람직할 수 있는 표현형의 증가된 발현을 나타낸다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재 하에서의 면역 세포의 배양은 높은 차도율(remission rate)과 관련된 보다 내구성인 면역반응을 촉진하는 기억 표현형(예컨대, CD45RO+/CD95+)을 지닌 세포의 높은 수준을 생성한다. Cbl 억제제의 존재 하에서 선택적으로 확장된 면역 세포는 IL-2, 다른 사이토킨, 또는 이의 조합(예를 들어 IL-7 및 IL-15와 조합된 IL-2)의 존재 하에서 배양된 것보다 상이한 표현형을 나타냄으로써 이를 필요로 하는 환자 내로 주입시 면역 세포의 보다 효과적인 이식을 제공할 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 존재 하에서의 확장은 면역 세포의 제2의, 신속한 확장에 대한 필요성을 제거한다. 특정의 구현예에서, Cbl억제제는 제2의 신속한 확장 단계를 향상시킨다. 특정의 구현예에서, 임의의 확장 단계에서 Cbl억제제는 화합물 103이다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 수용체 또는 환자에 대한 면역 세포의 투여를 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 확장된 면역 세포와 함께 이를 필요로 하는 개체에게 투여된다. 특정의 구현예에서, 투여는 면역 세포의 이식 및/또는 성장 속도를 촉진한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 투여는 면역반응의 내구성을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl억제제의 투여는 질환 진행의 현저히 감소된 속도 및/또는 보다 높은 차도율을 야기한다. 특정의 구현예에서, Cb1 억제제를 개체에게 세포 면역치료요법을 향상시키기에 효과적인 양으로 투여하는 단계; 및 유효량의 확장된 면역 세포를 세포 면역치료요법을 위해 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 세포 면역치료요법의 방법이 본원에 제공된다. Cbl 억제제는 숙련가에 의해 적합한 것으로 고려된 어느 시간에도 투여될 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 수거 전, 수거 후, 주입 전, 주입 후, 또는 이의 임의의 조합으로 투여된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 후 1일째에 투여되며 숙련가에 의해 적합하다고 고려된 일 수 동안 지속된다. 특수한 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 최대 15, 20, 25, 30 또는 35일 동안 매일 투여된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 개체에게 경구, 정맥내, 피하, 또는 종양 내로 투여된다. 특정의 구현예에서, 환자에게 투여된 Cbl 억제제는 경구 전달된 화합물 116이다. 특정의 구현예에서, 이러한 방법은 본 발명에 기술된 임의의 면역 세포 확장 구현예와 조합된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기술된 바와 같은 화합물 103의 사용을 포함하고, 투여 단계는 본원에 기술된 바와 같은 화합물 116의 경구사용을 포함한다.
Cbl 억제제
Cbl 억제제는 Cbl 효소를 억제하는 소 분자, 펩타이드, 핵산 또는 항체를 포함한다. Cbl 효소는 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함한다. 본 개시내용의 치료 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 Cbl 억제제는 세포-기반 면역치료요법을 위한 화합물 및 약제학적 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Cbl 억제제는 생체내 치료 방법에서 사용되어 면역계를 조절할 수 있는데, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 순환하는 T 세포, 종양 침윤 림프구 및 B 세포의 활성화를 증가시키거나, 주입된 생체 외 확장시킨 면역 세포의 이식을 증가시키거나, 주입된 생체 외 확장시킨 면역 세포에 대한 반응의 내구성을 증가시킬 수 있다. 또한, Cbl 억제제는 이러한 면역 세포를 시험관 내 또는 생체 외에서 확장시키는 것을 도와서 이의 성장 및 증식을 증가시키거나, 수득되는 확장된 면역 세포의 표현형을 조절하는데 사용될 수 있다.
특정의 구현예에서, Cbl억제제는 화학식 (A)에 따른 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 임의의 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 (A)
Figure pct00007
상기 화학식 (A)에서,
R1은 H, C1 내지 C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴, C1 내지 C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1 내지 C6 알킬-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴)이고;
Figure pct00008
는
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
이고;
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
Z3는 CH 또는 N이고;
X는 CH 또는 N이고;
R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3- 내지 6-원 헤테로사이클릴), -NH-(C1 내지 C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3- 내지 6-원 헤테로사이클릴), -O-(C1 내지 C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
R3a는 H, 할로, 또는 C1 내지 C6 알킬이고;
R3b는 H, 할로, C1 내지 C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소원자와 함께 취해져서 4- 내지 8-원의 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하며, 여기서 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹으로 임의 치환되거나;
R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
n은 0 또는 1이고;
Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이며, 임의로 단, R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로인 경우, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
Q는 CH 또는 N이고;
R4는 H, C1 내지 C6 알킬, C1 내지 C6 할로알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R10은 H, C1 내지 C6 알킬, C1 내지 C6 할로알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1 내지 C6 알킬, 또는 C1 내지 C6 할로알킬이거나; R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
각각의 R12는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1 내지 C6 알킬), -CN, C1 내지 C6 알킬-CN, C1 내지 C6 알킬-OH 또는 C1 내지 C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 게미날 R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성할 수 있다.
특정의 구현예에서, R1은 H, C1 내지 C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
, 또는
Figure pct00014
이다.
일부 구현예에서, R1은
Figure pct00015
이다. 일부 구현예에서, R1는
Figure pct00016
이다. 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00017
이다.
일부 구현예에서, R1은
Figure pct00018
이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, X는 CH이다. 일부 구현예에서, X는 N이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R2는 H이다. 일부 구현예에서, R2는 -NH-(C1 내지 C6 알킬)이다.
일부 구현예에서, R2는 -O-(C1 내지 C6 알킬)이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서
Figure pct00019
,
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
, 또는
Figure pct00028
를 형성한다. 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
, 또는
Figure pct00032
를 형성한다.
화학식식 (A)의 일부 구현예에서, R3b는 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R3b는 사이클로부틸이다. 일부 구현예에서, R3a는 H이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, Y는 C(R11a)(R11b)이다. 일부 구현예에서, R11a 및 R11b는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2 또는 CF3이다. 일부 구현예에서, Y는 CH2이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, Q는 CH이다. 일부 구현예에서, Q는 N이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R4는 H이다. 일부 구현예에서, R4는 CH3이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R5a는 H이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00033
,
Figure pct00034
, 또는
Figure pct00035
이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R5b는 H이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00038
,
Figure pct00039
,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
, 또는
Figure pct00043
이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R1은 메틸이다. 화학식 (A)의 일부 구현예에서, R1은 트리플루오로메틸이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, Z1는 CH이다. 일부 구현예에서, Z1는 N이다. 일부 구현예에서, Z2는 CH이다. 일부 구현예에서, Z2는 N이다. 일부 구현예에서, Z3는 CH이다. 일부 구현예에서, Z3는 N이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R10는 H이다. 일부 구현예에서, R10는 CH3이다. 일부 구현예에서, R10는 CF3이다. 일부 구현예에서, R10는 사이클로프로필이다. 일부 구현예에서, R10는 사이클로프로필이고, R1는 메틸이다.
화학식 (A)의 일부 구현예에서, R3a와 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 1개의 R12 그룹으로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1 내지 C6 알킬, -CN, 또는 C1 내지 C6 알킬-CN으로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
일부 구현예에서, R3a와 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 CN 또는 CH3로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 표 1의 화합물이다. 화합물은 국제 특허원 제 PCT/US2020/027492호 또는 제PCT/US2020/03274호 또는 미국 가특허원 제62/888,845호 또는 제62/888,870호에 따라 제조되며, 이들 각각은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
[표 1]
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 표 1의 화합물 101 내지 129번으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 임의의 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 구현예에서, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO 2019/148005호에 개시된 소 분자 Cbl 억제제 중 하나 이상이 본원에 기술된 방법에 사용된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 화합물의 임의의 거울상이성체 또는 부분입체이성체 형태를 포함하는 임의의 또는 모든 입체화학적 형태를 포함한다. 입체화학을 화학 구조 또는 명칭으로 명쾌하게 나타내지 않는 경우, 구조 또는 명칭은 나타낸 화합물의 모든 가능한 입체이성체를 포함하는 것으로 의도된다. 입체화학이 화학구조 또는 명칭에서 명쾌하게 나타나지 않는 한, 구조 또는 명칭은 묘사된 화합물의 모든 가능한 입체이성체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 특정의 입체화학적 형태가 묘사된 경우, 모든 다른 입체화학적 형태, 뿐만 아니라 일반적인 비-입체특이적인 형태 및 개시된 화합물의 임의의 비의 혼합물, 예를 들면, 임의의 비의 개시된 2개 이상의 입체화학적 형태의 혼합물이 또한 본 개시내용에 기술되고 포함됨으로써, 화합물의 라세미, 비-라세미(non-racemic), 거울상풍부한(enantioenriched) 및 대량의(scalemic) 혼합물이 포함될 수 있음이 이해된다. 개시된 화합물을 포함하는 조성물, 예를 들면, 실질적으로 순수한 화합물, 예를 들면, 이의 구체적인 입체화학적 형태의 조성물이 또한 의도된다. 개시된 화합물의 임의의 비의 혼합물을 포함하는 조성물, 예를 들면, 개시된 화합물의 2개 이상의 입체화학적 형태의 임의의 비의 혼합물을 포함하는 조성물이 또한 본 개시내용에 포함됨으로써, 화합물의 라세미, 비-라세미, 거울상풍부한, 및 대규모 혼합물이 본 개시내용에 포함된다. 입체화학이 분자의 하나의 부위 또는 부위들에 대해 명쾌하게 나타나 있지만, 분자의 다른 부위 또는 부위들에 대해 명쾌하게 나타나 있지 않은 경우, 구조는 입체화학이 명쾌하게 나타나 있지 않는 부위 또는 부위들에 대한 모든 가능한 입체이성체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용은 본원에 기술된 화합물의 임의의 및 모든 호변이성체 형태를 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기술된 화합물의 모든 염 뿐만 아니라 화합물의 이러한 염을 사용하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 사람 및/또는 동물에게 약물 또는 약제로서 투여될 수 있고, 투여 시, 유리 화합물(중성 화합물 또는 비-염(non-salt) 화합물)의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유하는 염이다. 기본 화합물의 목적한 염은 화합물을산으로 처리함으로써 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유기 산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 설폰산 및 살리실산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기본 화합물과 아미노산의 염, 예를 들면, 아스파르테이트 염 및 글루타메이트 염 또한 제조할 수 있다. 산성 화합물의 목적한 염은 화합물을 염기로 처리함으로써 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 산 화합물의 무기 염의 예는 알칼리 금속 및 알칼리 토 금속 염, 예를 들면, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 및 칼슘 염; 암모늄 염; 및 알루미늄 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 산 화합물의 유기 염의 예는 프로카인, 디벤질아민, N-에틸피페리딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 밑 트리에틸아민 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 산성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들면, 라이신 염을 또한 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 목록에 대해서는, 예를 들면, 문헌: P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.) "Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use" Wiley-VCH, 2011 (ISBN: 978-3-90639-051 내지 2)를 참조한다. 수개의 약제학적으로 허용되는 염이 또한 문헌: Berge, J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977)에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO 2019/148005호에 개시된 바와 같이 제조된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제(들)는 Progenra, Inc.을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
일부 구현예에서, 임의의 화합물 101 내지 129, 또는 이의 2개 이상의 조합이 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법을 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO 2019/148005호에 개시된 바와 같은 Cbl 억제제 화합물 중 하나 이상은 본 개시내용의 방법에서 억제제로서 사용된다.
다양한 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, Cbl 억제제 화합물(및 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 이러한 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은, 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예에 개시된 바와 같이 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 바와 같이, 1nM 미만, 1 내지 100nM, 100nM 내지 300nM, 301nM 내지 1000nM, 1001nM 내지 3,000nM, 3,001 nM 내지 10,000 nM, 또는 10,000nM 초과의 IC50 값을 갖는다. 특수한 구현예에서, Cbl 억제제는 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같이 Cbl 억제 시험관 내 검정에서 약 0.1 내지 10nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같이 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 100 nM 미만의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같은 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 100 nM 내지 300 nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같은 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 301 nM 내지 1000 nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같은 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 1,001 nM 내지 3,000 nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같은 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 3,001 nM 내지 10,000 nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 화합물(뿐만 아니라 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 제WO 2019/148005호의 생물학적 실시예 1에 기술된 바와 같은 Cb1 억제의 시험관 내 검정에서 측정된 것으로서 10,000 nM 초과의 IC50을 갖는다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 합성 또는 천연적으로 존재하는 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 융합 단백질이다. 펩타이드는 예컨대, 타이로신(608)-포스포릴화된 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1) (Cblin)의 DGpYMP 펩타이드 모사체(peptide mimetic), 또는 예컨대, 세포 전달 부위 및 카시타스(casitas) b-계통 림프종-b(Cb1) 결합 펩타이드를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 Cbl 결합 펩타이드는 서열 N/DX1PYX2P를 갖고, 여기서 X, X1　및 X2는 임의의 아미노산으로부터 선택되고, N/D는 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)이고, pY는 Cb1의 타이로신 키나제 결합(TKB) 도메인에 결합한 포스포타이로신이고, 일부 구현예에서, Cbl 결합 펩타이드는 비장 타이로신 키나제(Syk)의 펩타이드 단편이다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 항체, 예컨대, Cb1 에피토프에 선택적으로 결합함으로써 이를 불활성화시키는 것이다. 모노클로날 및 폴리클로날 항-Cbl 항체를 본 개시내용의 방법 및 조성물에서 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 핵산, 예컨대, Cb1 단백질, 예컨대, Cb1을 표적화하는 siRNA이다(참고: 예컨대, 미국 제10,421,945호). 미국 제10,421,945호, 미국 제9,186,373호, 또는 미국 제8,809,288호에 기술된 바와 같은 siRNA 조성물이 또한 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 개시내용의 Cbl 억제제는 자가 세포-기반 면역치료요법을 받고 있는 개체에서 생체 내에서 경구, 정맥내, 피하, 종양내, 또는 폐 투여에 의해 투여되거나, 동종이계 세포-기반 면역치료요법을 제공하는 공여체에 대해서는 경구, 정맥내, 피하 또는 폐 투여에 의해 투여된다.
세포의 수거
본원에 기술된 세포 치료요법에서, 세포는 공여체로부터 수거된다. 세포는 기술자에 의해 적합한 것으로 고려된 임의의 세포일 수 있다. 수거는 표준 기술에 따라 이루어질 수 있다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 공여체로부터 수거된다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 순환하는 면역 세포이고 성분채집기에 의해 수거된다. 특정의 구현예에서, 순환하는 세포는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해 수거된다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 공여체로부터 수득된 종양으로부터 수거된다. 특정의 구현예에서, 종양은 고형 종양 조직의 생검 또는 외과적 제거를 통해 공여체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 종양 조직을 개체로부터 제거되고 단편화되거나 효소 분해에 적용되어 세포외 매트릭스를 파괴하고/하거나 기계적 파괴에 적용시키고 면역 세포가 수득될 배양 전에 종양 세포 현탁액을 제조한다. 초기 세포 집단은 말초 혈액, 제대 혈, 종양 또는 종양 생검, 림프, 피부, 종양-침윤 림프구로부터 유래되거나, 줄기 세포 전구체로부터 유래된 이종 세포 집단 및 유도된 다능성 줄기 세포일 수 있다. 배양 조건은 다른 세포형보다 면역 세포의 성장에 우호적이어서 수득되는 세포 집단에 목적한 면역 세포가 농축되도록 한다.
본원에 기술된 방법의 경우, 공여체를 Cb1 억제제로 예비-처리하는 여부에 상관없이, 일부 제거 및 확장 단계를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 106 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 백혈구성분채집술에 의해 수집된다. 일부 구현예에서, 108 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 백혈구성분채집술에 의해 수집된다. 일부 구현예에서, 109 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 수집된다.
특정의 구현예에서, 예를 들면, 1 mm3 내지 2 cm3의 종양 단편이 TIL의 단리 및 확장을 위해 환자로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 수집된 종양 단편은 0.5 mm3 내지 1 cm3이다. 일부 구현예에서, 종양 단편은 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 구현예에서, 수집된 종양 단편은 1 mm3 내지 5 mm3이다. 일부 구현예에서, 수집된 종양 단편은 1 mm3 내지 3 mm3이다.
특정의 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 수거 단계를 향상시킨다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 수거 전에 생체 내에서 면역 세포를 활성화시킨다. 이러한 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 수거를 위한 목적한 세포를 향상시키기에 충분한 양으로 공여체에게 투여된다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 수거 전에 개체에게 투여된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 내 활성화를 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 내 분화를 향상ㅅ킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 생체 내 자극을 향상시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 세포의 생체 내 프라이밍(priming)을 향상시킨다. 일부 개체에서, Cbl 억제제의 투여는 환자가 이로부터 고통받은 암 또는 종양을 구체적으로 인식하는 면역 세포의 증식을 자극한다.
Cbl 억제제의 용량(dose)은 숙련가가 적합하다고 고려한 임의의 용량일 수 있다. 특정의 구현예에서, 용량은 수거에 요구되는 세포를 향상시키기에 충분하다. 특정의 구현예에서, 용량은 0.001 내지 5000 mg, 0.01 내지 2500 mg, 0.1 내지 2000 mg, 1 내지 1500 mg, 1 내지 1000 mg, 1 내지 750 mg, 1 내지 500 mg, 1 내지 400 mg, 1 내지 300 mg, 1 내지 250 mg, 1 내지 200 mg, 1 내지 100 mg, 1 내지 10 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.1 내지 1 mg의 Cbl 억제제이다. 특정의 구현예에서, 용량은 1 내지 5000 mg, 1 내지 2500 mg, 1 내지 2000 mg, 1 내지 1500 mg, 1 내지 1000 mg, 1 내지 750 mg, 1 내지 500 mg, 1 내지 400 mg, 1 내지 300 mg, 1 내지 250 mg, 1 내지 200 mg, 1 내지 100 mg, 1 내지 10 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.1 내지 1 mg이다.
용량은 기술자에 의해 적합한 것으로 고려된 스케쥴에서 일정 기간 동안 투여된다. 특정의 구현예에서, 투여량은 수거되는 것이 요구되는 세포를 향상시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제를 사용한 치료 기간, 즉, 생체 내 활성화 기간은 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 10분 내지 약 1시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 20분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 45분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 15시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간이다. 일부 구현예에서, 생체 내 활성화 기간은 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 또는 약 24시간이다. 일부 구현예에서, 생체내 활성화 기간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일, 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일 , 1 내지 28일 또는 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일 또는 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일 또는 7 내지 60일이다. 일부 구현예에서, 생체내 확장 상의 길이는 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일이다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 또는 과립구-대식구 코로니 자극 인자(G-MCSF) 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-2와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-4와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-7과 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-15와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-7 및 IL-15와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-12와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-21과 함께 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 G-MCSF와 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 공여체의 면역 세포 집단의 생물학적 활성은 활성화 전 및 후에 및/또는 수거 전에 측정된다. 면역 세포는 당해 분야에 공지된 방법으로 측정될 수 있다. 평가하기 위한 매개변수는 활성화 전 및 후에 세포의 전체 수, 또는 활성을 포함한다. 예를 들면, 항원에 대한 변형된 면역 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적인 결합은 생체내(예컨대, 영상화에 의해) 또는 생체외(예컨대, ELISA 또는 유 세포 분석법에 의해)에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 파괴하는 면역 세포의 능력은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 문헌: Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004)에 기술된, 예를 들면, 세포독성 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 생물학적 활성은 또한 특정 사이토킨, 예를 들면, IL-2 및 IFNγ의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 종야의 초기 크기 및/또는 수는 처리 개시 전에 평가한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 확장 전에 유전적으로 가공된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포주, B 세포주, 및 NK 세포주로부터 선택된 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 선택적으로 확장될 면역 세포 또는 선택적으로 확장고 임의로, 유전적으로 가공될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 세포주(예컨대, T-세포주, B 세포주, NK 세포주 등)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 이종이식체 공급원, 예를 들면, 마우스, 랫트, 비-사람 영장류, 또는 돼지로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포주는 세포-기반 면역치료요법에서 사용하기 위해 수거하기 전에 Cbl 억제제에 노출시킨다.
특정의 구현예에서, 수거된 세포는 동결보존 배지 속에서 제형화되고 극저온 저장 단위, 예를 들면, 액체 질소 동결기(-195℃) 또는 초-저온 동결기(ultra-low temperature freezer)(-65℃, -80℃, 또는 -120℃) 속에서 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 또는 적어도 5년의 긴 기간저장을 위해 둔다. 동결보존 배지는 글리세롤, DMSO(디메틸설폭사이드), NaCl, 덱스트로즈, 덱스트란 설페이트, 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)과 배양 배지 또는 pH를 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0. 또는 8.0 내지 8.5로 유지하기 위한 생리학적 완충제와 함께 포함할 수 있다. 동결된 세포는 해동시켜 자극 및/또는 확장의 라운드에 적용시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 동결보존된 세포는 해동시켜 유전적으로 변형시킴으로써 재조합 T 세포 수용체 또는 키메라 T 세포 수용체를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 해동된 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 확장된다. T 세포는 추가로 동결보존시켜 적어도 약 1, 5, 10, 100, 150, 200, 또는 500개 바이알(vial)의 양의 세포 뱅크(cell bank)를 동결 배지 mL 당 약 적어도 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 적어도 약 1010개의 세포에서 생성한다. 동결보존된 세포 뱅크는 이의 기능성을 유지할 수 있고 해동될 수 있으며 추가로 자극 및 확장될 수 있다.
일부 양태에서, 해동된 세포를 자극시키고 적합한 밀폐 용기, 예를 들면, 세포 배양 백(cell culture bag) 및/또는 생물반응기 속에서 확장시켜 동종이계 세포 생성물로서 세포의 양을 생성할 수 있다.
특정의 구현예에서, 동결보존된 T 세포는 이의 생물학적 기능을 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월, 또는 적어도 약 60개월 동안 극저온 저장 조건 하에서 유지한다.
특정의 구현예에서, 수거된 세포 집단은 특정 유형의 면역 세포가 세포 집단을 생체 외 또는 시험관 내에서 확장시키기 전에 농축되는 선택적인 조건 하에서 선택되거나 배양된다. 일부 구현예에서, 선택 조건은 특이적인 T 세포 집단에 대해 세포 집단을 농축시킨다. 다른 구현예에서, 선택적인 조건은 목적한 T 세포 성숙 수준, 표현형, 또는 특이성의 우세함을 위해 세포 집단을 농축시킨다.
유전적으로 변형된 세포
특정의 구현예에서, 수거된 면역 세포는 예를 들면, 확장 전에 유전적으로 가공된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이고 T 세포는 유전적으로 변형되어 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. T 세포는 유전적으로 변형되어 CAR 또는 TCR 수용체를 발현함으로써 당해 분야에 확립된 암 또는 악성-관련된 항원을 인식할 수 있다. 참고: 예컨대, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2):251 내지 257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308 (2008)). T 세포는 유전적으로 변형되어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현할 수 있으며, 이는 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 참고: 예컨대, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2):720 내지 724 (1993), 및 Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2):215-223 (2009)). 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이고 NK 세포는 유전적으로 가공되어 키메라 항원 수용체(NK CAR 세포) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다.
면역 세포의 확장
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 면역 세포는 숙련가가 적합한 것으로 고려한 임의의 방법에 의해 배양물 속에서 확장된다. 표준 기술이 여기서 유용하다. 일부 구현예에서, 생체 외 또는 시험관 내에서 면역 세포의 확장은 가스 투과성 막을 포함하는 하나 이상의 배양물 속에서 수행된다. 다른 구현예에서, 생체 외 또는 시험관 내에서 면역 세포의 확장은 G-RexTM 세포 배양 용기를 사용하여 확장된다.
순환하는 면역 세포
특정의 구현예에서, 혈액으로부터의 면역 세포는 1 라운드(round)의 확장에서 확장된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 가스 투과성 막을 포함하는 배양 용기를 사용하여 확장된다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 G-RexTM 세포 배양 용기를 사용하는 단일 확장을 사용하여 확장된다. 유리하게는, 일부 구현예에서, Cb1 억제제의 존재하에서 확장은 면역 세포의 충분한 수 및/또는 활성을 생성한다.
일부 구현예에서, 순환하는 면역 세포는 환자로부터 수집되어 생체 외에서 확장시킴으로써 수득되는 세포를 환자 내로 주입하기 전에 약 109 내지 약 2 x 1011개의 세포로 세포 수를 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재하에서 확장에 대해 세포의 수를 증가시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재 하에서 확장에 대해 세포의 하나 이상의 표현형을 증진시킨다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재하에서 확장에 대해 확장 시간을 감소시킨다. 특정의 구현예에서, 확장은 10 또는 수일 내에 완료된다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 이의 부재 하에서 확장에 대해 Cb1 억제제를 사용하여 배양물 속에서 적어도 1회 추가로 2배를 완료한다.
특정의 구현예에서, 혈액으로부터의 면역 세포는 1회의 확장 라운드에서 확장된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 가스 투과성 막을 포함하는 배양 용기를 사용하여 확장시킨다. 특정의 구현예에서, 면역 세포는 G-RexTM 세포 배양 용기를 사용한 단일 확장을 사용하여 확장시킨다. 유리하게는, 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 존재 하에서 확장은 면역 세포의 충분한 수 및/또는 활성을 생성한다.
종양 면역 세포
일부 구현예에서, 종양 면역 세포는 환자로부터 수집되어 생체 외에서 2회 확장된다 - 목적한 면역 세포의 선택적 확장을 위해 1회에 이어 수득되는 세포를 환자 내로 주입하기 전에 세포 수를 추가로 약 109 내지 약 2 x 1011개의 세포로 추가로 증가시키기 위한 제2의 확장("이중 확장"). 다른 구현예에서, 면역 세포는 환자로부터 수집되어 수득되는 세포를 환자 내로 주입하기 전에 생체 외에서 단지 1회 약 109 내지 약 2 x 1011개의 세포의 세포 수까지 확장된다("단일 확장"). 다른 구현예에서, 단일 확장은 G-RexTM 세포 배양 용기 속에서 일어난다. 일부 구현예에서, 이중 확장은 단일 세포 배양 용기 속에서 일어난다. 다른 구현예에서, 이중 확장은 동일한 G-RexTM 세포 배양 용기 속에서 일어난다.
확장 배양
특정의 방법에서, 확장 중인 세포는 이를 필요로 하는 개체 내로 주입하기 전에 특히 목적한 성숙 수준의 세포를 농축시킴을 포함하는, 증식을 촉진시키기 위한 하나 이상의 제제 또는 화합물의 존재 하에서 배양시킨다. 유용한 화합물은 전염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IL-4, IL-7,IL-12, IL-15, IL-21 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-2이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-4이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-7이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-12이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-15이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-7 및 IL-15의 조합이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-21이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 조합이다.
각각의 사이토킨은 0 내지 25000 IU/ml, 또는 0 내지 10,000 IU/ml, 또는 0 내지 5000 IU/ml, 또는 0 내지 2500 IU/ml, 또는 0 내지 1000 IU/ml, 또는 0 내지 500 IU/ml, 또는 0 내지 100 IU/ml의 농도에서 사용될 수 있다. 확장 동안 사용된 사이토킨은 배양 기간 동안 임의로 보충하여 배양 동안 세포에 의해 사용된 양을 대체할 수 있다.
특정의 방법에서, 확장 중인 세포는 추가의 IL-2를 제공함으로써 배양 동안 세포에 의해 사용된 양을 보충한다. 일부 구현예에서, IL-2는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 이중 발현 동안 그러나 선택적인 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 이중 확장 동안 그러나 제2의 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 선택적인 확장 상 및 제2의 확장 상 동안 이중 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 배양물에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11일마다 첨가된다(단일 확장 동안에, 선택적 확장, 제2의 확장, 또는 선택적인 확장과 제2의 확장 둘 다에 상관없이). 다른 구현예에서, IL-2는 확장 동안 1회, 2회, 또는 3회 만 보충된다(단일 확장, 선택적인 확장, 또는 선택적인 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안에 상관없이).
특정의 방법에서, 확장 중인 세포는 추가의 IL-7 및 IL-15를 제공함으로써 배양 동안 세포에 의해 사용된 양을 보충한다. 일부 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 이중 확장 동안 그러나 선택적인 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 이중 확장 동안 그러나 제2의 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 선택적인 확장 상 및 제2의 확장 상 둘 다 동안에 이중 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 배양물에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11일마다 첨가된다(단일 확장, 선택적인 확장, 제2의 확장, 또는 선택적인 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안에 상관없이). 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 확장 동안 1회, 2회, 또는 3회 만 보충된다(단일 확장, 선택적인 확장, 제2의 확장, 또는 선택적인 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안에 상관없이).
특정의 방법에서, 세포는 면역자극제의 존재 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 면역 세포의 표면 수용체에 결합하는 화합물이다. 표면 수용체는 당해 분야의 기술자에 의해 인식된 임의의 이러한 표면 수용체일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 T 세포 수용체에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 CD3에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 항-CD3 항체이다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 CD28에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 항-CD28 항체이다. 일부 구현예에서, 면역자극성 제제는 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 조합이다. 다른 구현예에서, 면역자극성 제제는 표면 상에 고정된다. 다른 구현예에서, 면역자극성 제제는 자기 비드(magnetic bead) 상에 고정된다.
특정의 방법에서, 세포는 공급인자 세포(feeder cell)의 존재 하에서 배양된다. 공급인자 세포는 전형적으로 처리됨으로써 이들 자체가 증식하지 않지만 대신에 자극제 또는 유리한 제제 또는 둘 다의 공급원으로서 면역 세포의 증식 또는 활성화에 보조한다. 일부 구현예에서, 공급인자 세포를 조사한다. 일반적으로, 공급인자 세포는 종양으로부터 수거된 면역 세포를 확장시키기 위해 사용되며 전형적으로 이중 확장의 제2의 확장 상 동안 가해진다. 일부 구현예에서, 공급인자 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이다. 특정의 구현예에서, 공급인자 세포는 제2의 확장 동안 가해지며, 공급인자 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이다.
특정의 방법에서, 세포는 공급인자 세포 및 면역자극성 제제의 존재 하에서 배양된다. 일반적으로, 공급인자 세포 및 면역자극성 제제의 조합은 종양으로부터 수거된 면역 세포를 확장시키는데 사용되며 전형적으로 이중 확장의 제2 확장 상 동안에 첨가된다. 일부 구현예에서, 공급인자 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이고 면역자극성 제제는 항-CD3 항체이다.
특정의 구현예에서, 하나 이상의 확장 단계는 Cbl 억제제로 향상된다 유리하게는, Cbl 억제제는 확장 단계의 시간을 감소시킬 수있고 다수의 확장이 필요한 경우에, 추가의 하나 이상의 확장 단계를 제거한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 추가의 면역자극성 제제에 대한 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 공급인자 세포에 대한 필요성을 제거한다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역자극인자 제제 및 공급인자 세포에 대한 필요성을 제거한다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하에서 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 항-CD3 항체의 부재하에 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 OKT3의 부재하에 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 4-IBB 작용제(agonist), 예컨대, 4-BBL의 부재하에 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하에서, 항-CD3 항체의 분재하에서, 및 4-IBB 작용제의 부재하에서 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기술된 바와 같은 Cbl 억제제 및 IL-2의 부재하에, 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하에, 항-CD3 항체, 예컨대, OKT3의 부재하에, 및 4-IBB 작용제, 예컨대, 4-BBL의 부재하에 진행된다. 특정의 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기술된 바와 같이, Cbl 억제제, IL-2, OKT3, 및 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 존재하에 및 4-IBB 작용제, 예컨대, 4-BBL의 부재하에 진행된다.
특정의 구현예에서, 방법은 Cbl 억제제의 존재 하의 확장을 포함한다. 특정의 구현예에서, 방법은 억제제의 존재 하의 및 추가의 면역자극성 제제 없는 확장을 포함한다. 특정의 구현예에서, 방법은 Cbl 억제제의 존재 하의 및 공급인자 세포 없는 확장을 포함한다. 특정의 구현예에서, 방법은 Cbl 억제제의 존재 하의 및 제2의 확장 단계 없는 확장을 포함한다. 특정의 구현예에서, 방법은 면역자극성 제제의 첨가 없는 및 제2의 확장 단계 없는 Cbl 억제제의 존재 하의 확장을 포함한다. 특정의 구현예에서, 방법은 공급인자 세포의 첨가 없는, 제2의 확장 단계 없는 Cbl 억제제의 존재 하의 확장을 포함한다.
특정의 구현예에서, 면역 세포는 Cbl 억제제의 존재 하에, 1 pM 내지 약 100 mM, 약 0.001 pM 내지 약 100 μM, 약 0.01 pM 내지 약 50 μM, 약 0.001 nM 내지 약 50 μM, 약 100 nM 내지 약 10 μM, 약 0.01 μM 내지 약 25 μM, 약 0.1 μM 내지 약 15 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 0.1 pM 내지 약 100 nM, 약 1 pM 내지 약 10 nM, 약 1 pM 내지 약 1 nM의 농도의 존재 하에서 생체 외 또는 시험관 내에서 배양된다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예컨대, 세포 배양 배지)에 첨가된 Cbl 억제제의 농도는 약 1 μM, 약 2 μM, 약 3 μM, 약 4 μM, 또는 약 5 μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예컨대, 세포 배양 배지)에 첨가된 Cbl 억제제의 농도는 약 1 μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예컨대, 세포 배양 배지)에 첨가된 Cbl 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 1 μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예컨대, 세포 배양 배지)에 첨가된 Cbl 억제제의 농도는 약 1 μM이다.
특정의 방법에서, Cbl 억제제의 존재하에서 확장 중인 세포는 추가의 Cbl 억제제를 제공함으로써 배양 동안 세포에 의해 사용된 양을 보충한다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 이중 확장 동안 그러나 선택적인 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안 그러나 선택적인 확장 상 동안에만 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 선택적인 확장 상 및 제2의 확장 상 둘 다 동안 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안(단일 확장, 선택적인 확장, 제2의 확장 또는 선택적인 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안에 상관없이) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11일마다 배양물에 첨가된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안(단일 확장, 선택적인 확장, 제2의 확장 또는 선택적인 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안에 상관없이) 1회, 2회, 또는 3회 만 보충된다.
특정의 방법에서, 세포는 첨가 공급업자 세포없이 및 항-CD3의 부재하에 및/또는 항-CD28 항체의 부재하에 생체 외 확장 동안 배양되고, Cbl 억제제 또는 IL-2는 배양물에 2 또는 3일 마다 첨가된다. 일부 구현예에서, 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 첨가 없이 및 항-CD3 항체 없이 단일 확장을 사용하여 배양되며, 여기서 Cbl 억제제 및 IL-2는 배양물에 2 또는 3일 마다 첨가된다. 다른 구현예에서, 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 첨가없이, 제2의 확장 상 동안 항-CD3 항체 없이 이중 확장을 사용하여 배양되며, 여기서 Cbl 억제제 및 IL-2는 선택적인 확장 상 및 제2의 확장 상 동안 2 또는 3일마다 배양물에 첨가된다.
특정의 구현예에서, 면역 세포는 본원에 기술된 방법을 사용하여 확장에 약 1일 내지 약 48일, 약 7일 내지 약 28일, 약 7일 내지 약 24일, 약 11일 내지 약 24일, 1일 내지 약 28일, 약 2일 내지 약 24일, 약 3일 내지 약 20일, 약 4일 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 12일, 또는 약 8일 내지 약 14일 동안 적용된다.
일부 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 약 7일 내지 약 28일의 기간 동안 이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 약 11 내지 약 28일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 약 10일 내지 약 24일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 약 7일 내지 약 14일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 10일 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 11일 동안이다.
일부 구현예에서, 확장은 이중 확장이고 여기서 선택적인 확장은 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 8일, 약 3일 내지 10일, 약 3일 내지 12일, 약 3일 내지 14일, 3일 내지 18일, 3일 내지 22일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 8일, 약 4일 내지 10일, 약 4일 내지 12일, 약 4일 내지 14일, 약 4일 내지 18일, 약 4일 내지 약 22일, 약 5일 내지 8일, 약 5일 내지 10일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 21일, 약 5일 내지 약 28일, 약 6일 내지 8일, 약 6일 내지 10일, 약 6일 내지 12일, 약 6일 내지 14일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 21일, 약 6일 내지 약 28일, 약 7일 내지 8일, 약 7일 내지 10일, 약 7일 내지 12일, 약 7일 내지 14일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 21일, 약 8일 내지 10일, 약 8일 내지 12일, 약 8일 내지 14일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 21일, 또는 약 8일 내지 약 28일이다. 다른 구현예에서, 확장은 이중 확장이고 여기서 제2의 확장은 약 3일 내지 약 15일, 약 4일 내지 14일, 약 5일 내지 13일, 약 6일 내지 12일, 약 7일 내지 11일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 21일, 약 6일 내지 약 28일, 약 7일 내지 8일, 약 7일 내지 10일, 약 7일 내지 12일, 약 7일 내지 14일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 21일, 약 8일 내지 10일, 약 8일 내지 12일, 약 8일 내지 14일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 21일, 또는 약 8일 내지 약 28일이다.
일부 구현예에서, 생체 외 확장의 총 기간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 14일, 약 18일, 약 22일 또는 약 28일 동안이다. 다른 구현예에서, 생체 외에서 확장의 총 기간은 10일 내지 14일이다. 여전히 다른 구현예에서, 생체 외에서 확장의 총 기간은 14일 내지 22일이다. 바람직한 구현예에서, 세포는 암 환자 또는 이를 필요로 하는 환자 내로 주입하기 전에 14일 미만 동안 확장된다. 보다 바람직한 구현예에서, 세포는 암 환자 또는 이를 필요로 하는 환자 내로 주입하기 전에 11일 미만 동안 확장된다.
확장된 면역 세포의 표현형
일반적으로, 융합 집단(환자 내로 주입되는 면역 세포)의 목적한 표현형은 보다 우수한 환자 치료 결과와 관련된 특성을 포함한다. 따라서, 특정의 구현예에서 목적한 표현형은 출발하는 세포의 집단에 상관없이 동일할 것이다(예컨대, 확장된 면역 세포가 직접 사용되는지 또는 확장된 면역 세포가 목적한 특성에 대해 추가로 스크리닝되는 것에 상관없이).
특정의 구현예에서, 확장된 면역 세포는 목적한 특성에 대해 스크리닝(screening)되고, 확장된 세포의 서브집단(subpopulation)은 환자 내로 주입하기 위해 선택된다. 이러한 경우에, 출발하는 집단은 확장된 면역 세포이고, 주입 집단은 주입을 위해 선택된 확장된 세포의 서브세트(subset)이다. 일부 구현예에서, 주입 집단은 종양 인식 활성을 나타내는 면역 세포로 농축된다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 가공된 T 세포 수용체를 발현하는 면역 세포로 농축된다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 가공된 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포로 농축된다.
특정의 구현예에서, Cb1 억제제의 존재하에서 확장된 면역 세포는 목절한 특성을 갖는 세포에 대해 이미 농축되어 있다. 그 결과, 특정의 구현예에서, Cb1 억제제의 존재하에서 확장된 면역 세포는 환자 내 주입을 위한 목적한 서브집단을 확인하기 위한 추가의 선택 단계를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 확장된 면역 세포를 IL-2 및/또는 IFNγ를 생산하는 이의 능력에 대해 스크리닝하고, IL-2 또는 IFNγ-생산 세포가 농축된 세포의 서브집단을 선택한다. 다른 구현예에서, 면역 세포를 성숙 단계-특이적인 마커를 사용하여 T 세포 표현형에 대해 스크리닝하고, 목적한 성숙 단계를 위해 농축된 세포의 서브집단을 선택한다. 예를 들면, 목적한 특성은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현하는 면역 세포일 수 있다: CD8+, CD45RA+, CD45RA-, CD45RO+, CD45RO-, CD95+, CD95-, CCR7+, CD62L+, CD62L-, CCR7-, CD56+, IL-2Rβ+, 및 IL-2Rβ-. 다른 구현예에서, 면역 세포를 기억 표현형을 지닌 T 세포에 대해 스크리닝하고 기억 T 세포가 농축된 세포의 소집단을 선택한다. 다른 구현예에서, 면역 세포를 TCM 또는 TSCM 세포에 대해 스크리닝하고 TCM 또는 TSCM 세포가 농축된 세포의 서브집단을 선택한다. TCM 및 TSCM를 구별하는 방법은 예를 들면, Schmueck-Henneresse et al., J. Immunol., 194(11):5559-5567 (2015) 및 Berger et al., J. Clin. Invest., 118(1):294-305 (2008)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 주입 짐단은 출발하는 집단보다 더 큰 퍼센트 및/또는 더 큰 TIL을 포함한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 출발 집단 보다 더 큰 퍼센트 및/또는 더 큰 수의 T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 주입은 출발 집단 보다 더 큰 퍼센트 및/또는 더 큰 수의 TCM 또는 TSCM 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 출발 집단보다 더 큰 퍼센트 및/또는 더 큰 수의 TEM 세포를 함유한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 출발 집단보다 더 적은 퍼센트 및/또는 더 작은 수의 나이브(
Figure pct00047
) T 세포를 함유한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 주입 집단은 약 10 내지 약 20%의 기억 T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 약 5 내지 약 40%의 기억 T 세포를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서 주입 집단은 약 10 내지 약 30%의 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 디억 T 세포는 TCM 또는 TSCM이다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD45RO+ 세포이다.
특정의 구현예에서, 방법은 CD8+ 세포가 농축된 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 방법은 감소된 양의 CD4+ 세포를 갖는 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 방법은 CD8+ 중심 기억 세포가 농축된 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 방법은 CD107a의 증가된 분비를 갖는 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 방법은 그랜자임, 예를 들면, 그랜자임 B의 증가된 분비를 갖는 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 사이토킨의 증가된 분비를 갖는 확장된 TIL을 제공한다. 특정의 구현예에서, 사이토킨은 IFN-γ, TNF-α, GMCSF, MIP1α, MIP1βb, IP10, IL-2, IL-8, IL-7, IL-21, IL-23, 및 이의 조합으로부터 분비된다. 본원에 사용된 바와 같이, 농축 또는 증가 또는 감소는 Cb1 억제제의 부재하에서 수거되거나 확장된 유사한 TIL과 관련되어 있다. 특정의 구현예에서, 농축, 증가, 또는 감소는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200% 이상까지이다. 양은 표준 기술, 예를 들면, 본원의 실시예에 기술된 것에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 주입 집단은 동결보존 배지 속에서 제형화되고 극저온 저장 유닛, 예를 들면, 액체 질소 동결기(-195℃) 또는 초-저온 동결기(-65℃, -80℃, 또는 -120℃) 속에 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 또는 적어도 5년의 긴 저장 기간 동안 제형화된다. 동결보존 배지는 글리세롤, DMSO(디메틸설폭사이드), NaCl, 덱스트로즈, 덱스트란 설페이트, 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)를 배양 배지 또는 pH를 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0. 또는 8.0 내지 8.5로 유지하기 위한 생리학적 완충제와 함께 포함할 수 있다. 동결된 세포를 해동하여 추가의 자극 및/또는 확장 라운드에 적용시킬 수 있다. 동결보존된 T 세포는 이의 생물학적 기능을 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월, 또는 적어도 약 60개월 동안 극저온 저장 조건 하에서 유지한다. 일부 양태에서, 제형 속에 보존제는 사용되지 않는다. 동결보존된 T 세포는 다수의 환자에게 동종이계 오프-더-쉘 세포 생성물(allogeneic off-the-shelf cell product)로서 투여(예컨대, 주입)된다.
치료 방법
본원에 제공된 세포 치료요법 방법에서, 확장된 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여한다. 특정의 구현예에서, 환자는 공여체와 동일하다.특정의 구현예에서, 환자 및 공여체는 동일한 개체가 아니다. 특정의 구현예에서, 공여체는 이종이고, 환자는 사람이다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기술된 방법에 따라 자가 세포를 투여받는다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기술된 방법에 따라 동종이계 세포를 투여받는다.
세포-기반 면역치료요법의 방법이 본원에 개시되어 있다. 세포-기반 면역치료요법 방법은 입양 세포 치료요법, 종양 침윤 림프구(TIL)-기반 치료요법, 키메라 T 세포 수용체(CAR) T 세포 치료요법, 가공된 T-세포 수용체(TCR) 치료요법, 천연 킬러 세포(NK) 치료요법, 또는 천연 킬러 키메라 항원 수용체 치료요법(NK CAR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 1회 이상의 치료 세션으로 주입 집단을 투여받을 수 있다.
특정의 구현예에서, 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 생체 외 또는 시험관 내 생산된 면역 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 주입 집단의 치료학적 유효량은 약 1 백만 내지 약 2000억개의 세포, 예를 들면, 예컨대, 1 백만 내지 약 500억개의 세포(예컨대, 약 5 백만개의 세포, 약 2억 5천만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포, 또는 앞서의 값 중 어느 2개로 정의된 범위), 예를 들면, 약 1000만 내지 약 1000억개의 세포(예컨대, 약 2000만개의 세포, 약 3000만개의 세포, 약 4000만개의 세포, 약 6000만개의 세포, 약 7000만개의 세포, 약 8000만개의 세포, 약 9000만개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억개의 세포, 약 900억개의 세포, 또는 앞서의 값 중 어느 2개로 정의된 범위)의 범위일 수 있고, 일부 경우에 약 1억개의 세포 내지 약 500억개의 세포(예컨대, 약 1200만개의 세포, 약 2억 5000만개의 세포, 약 3억 5000만개의 세포, 약 4억 5000만개의 세포, 약 6억 5000만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개이 세포, 약 450억개의 세포) 또는 이러한 범위 사이의 임의의 값의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 체중 kg 당 2 x 106 내지 2 x 108개의 살아있는 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
주입 집단 및 이의 조성물은 이를 필요로 하는 개체에게 표준 투여 기술, 제형, 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한, 제형 및 장치, 예를 들면, 주사기 및 바이알을 사용한 투여가 제공된다. 면역 세포를 포함하는 제형 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 폐 투여용의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 비경구적으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 대상체에게 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의해 말초계 전달을 사용하여 투여된다. 변형된 면역 세포의 조성물은 멸균 액체 제제, 예컨대, 등장성 수성 액제, 현탁제, 유제, 분산제, 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 점성조성물은 적절한 점도 범위 내에서 제형화되어 특수한 조직을 지닌 보다 긴 접촉 기간을 제공한다. 액체 또는 점성 조성물을 담체를 포함할 수 있고, 이는 예를 들면, 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 멸균 주사가능한 액제는 면역 세포를 용매, 예를 들면, 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들면, 멸균 수, 생리학적 염수, 글루코스, 덱스트로즈 등과의 혼합물 속에 혼입시킴으로써 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 주입 집단은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 다른 치료학적 개입과 관련하여, 동시에 또는 어떠한 순서로 순차적으로 공-투여(co-administering)된다.
일부 구현예에서, 개체는 면역 세포의 주입 진단을 투여하기 전에 제제 요법를 겪는다. 예를 들면, 주입 집단을 제공받기 전에, 개체는 다음 중 하나 이상을 겪을 수 있다: 면역억제, 면역고갈, 림프구 청소, 또는 줄기 세포 플러싱(flushing).
면역억제에 사용될 수 있는 제제는 사이클로스포린, 카크롤리무스, 릴로나셉트, 카나키누맙, 브로달루맙, 아나킨라, 레슬리주맙, 우스테키누맙, 메폴리주맙, 토실리주맙, 두필루맙, 익세키주맙, 세쿠키누맙, 구셀쿠맙, 틸드라키주맙, 벤랄리주맙, 사릴루맙, 바실릭시맙, 리산키주맙, 실툭시맙, 다클리주맙, 포말리도미드, 메토트렉세이트, 오말리주맙, 아자티오프린, 레날리도미드, 탈리도미드, 알레파셉트, 시롤리무스, 에팔리주맙, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 벨리무맙, 나탈리주맙, 핀골리모드, 레플루노미드, 디메칠 푸마레이트, 에베롤리무스, 아바타셉트, 테리플루노미드, 베돌리주맙, 에베롤리무스, 에마팔루맙, 시포니모드, 벨라타셉트, 바리시티닙, 무로코납-cd3, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 에베롤리무스, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 골리무맙, 세르톨리주맙, 또는 아달리무맙을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
면역고갈에 사용될 수 있는 제제는 사이클로포스파미드(사이톡산), 프루다라빈, 벤다무스틴, 시스플라틴, 에토포시드, 파클리탁셀, 및 겜시타빈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
림프구 청소(clearance)에 사용될 수 있는 제제는 에토돌락을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
줄기 세포 이동 또는 플러싱에 사용될 수 있는 제제는 G-CSF, 페그필그라스팀, 사이크로포스파미드, 및 플레릭사포르(모조빌, Genzyme)를 포함한, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 보충적인 주입 전 치료로서 이러한 제제 중 하나와 함께 투여된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 개체는 치료 전에, 세포의 주입 전 0 내지 60일 0 내지 30일, 0 내지 15일, 0 내지 14일, 0 내지 13일, 0 내지 12일, 0 내지 11일, 0 내지 10일, 0 내지 9일, 0 내지 8일, 0 내지 7일, 0 내지 6일, 0 내지 5일, 0 내지 4일, 0 내지 3일 0 내지 2일 또는 0 내지 1일 동안 면역억제, 면역고갈, 림프구 청소, 또는 줄기 세포 플러싱을 겪는다.
일부 구현예에서, 환자는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합을 사용한 면역고갈에 의해 조건화된다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈은 표준 기술에 따라서 투여될 수 있다. 특정의 구현예에서, 사이크롤포스파미드의 투여는 약 200 mg/m2/일 내지 약 2000 mg/m2/일(예컨대, 200 mg/m2/일, 300 mg/m2/일, 또는 500 mg/m2/일)의 용량에서이다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드의 용량은 약 300 mg/m2/일이다. 특정의 구현예에서, 플루다라빈의 투여는 약 20 mg/m2/일 내지 약 900 mg/m2/일(예컨대, 20 mg/m2/일, 25 mg/m2/일, 30 mg/m2/일, 또는 60 mg/m2/일)의 용량에서이다. 특정의 구현예에서, 플루다라빈의 용량은 약 25 mg/m2/일이다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 200 mg/m2/일 내지 약 2000 mg/m2/일(예컨대, 200 mg/m2/일, 300 mg/m2/일, 또는 500 mg/m2/일)의 용량에서이고, 플루다라빈의 투여는 약 20 mg/m2/일 내지 약 900 mg/m2/일(예컨대, 20 mg/m2/일, 25 mg/m2/일, 30 mg/m2/일, 또는 60 mg/m2/일)의 용량에서이다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500 mg/m2/일의 용량에서이고, 플루다라빈의 투여는약 30 mg/m2/일의 용량에서이다. 예시적인 구현예에서, 사이클로포스파미드의 용량은 3일에 걸쳐 500 mg/m2/일이고, 플루다라빈의 용량은 3일에 걸쳐 30 mg/m2/일이다. 림프고갈의 용량은 0일째에 T 세포 주입과 관련하여 -6일 내지 -4일(+/-1일 윈도우와 함께, 즉, -7 내지 -5일째 투여)로 계획될 수 있다. 림프고갈의 용량은 0일째에 T 세포 주입과 관련하여 -5 내지 -3일(+/-1일 윈도우(window)와 함께, 즉, -4 내지 -2일째 투여)로 계획될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 사이토킨을 세포 치료요법으로 투여받는다. 특정의 구현예에서, 사이토킨은 IL-2이다. IL-2는 표준 기술에 따라서 투여된다. 특정의 구현예에서, IL-2는 100,000 IU/kg 내지 1,000,000 IL/kg의 용량에서 투여된다. 특정의 구현예에서, IL-2 용량은 400,000 IU/kg 내지 800,000 IU/kg이다. 특정의 구현예에서, IL-2 용량은 약 600,000 IU/kg이다. 사이토킨의 투여는 0일째에 T 세포 주입과 관련하여 1 내지 3일(+/-1일 윈도우와 함께, 즉, 2 내지 4일째에 투여)째로 계획되어 있다. 특정의 구현예에서, 사이토킨은 투여 스케쥴에 걸쳐 총 6회 용량 동안 8시간 마다 투여된다. 특정의 구현예에서, IL-2는 1 내지 3일째에 총 6회 용량에 대해 8시간 마다 투여된다.
일부 구현예에서, 개체는 1회 이상의 치료 세션에 주입된 변형된 세포를 가질 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 세포 기반 면역치료요법은 다른 항-암 치료요법과 함께 투여된다.
Cbl 억제제를 사용한 조합 치료요법
특정의 구현예에서, 세포 치료요법은 하나 이상의 Cbl 억제제와 함께 투여된다. 예를 들면, 본 개시내용의 일부 치료학적 요법에서, 변형된 면역 세포 및 Cbl 억제제 둘 다는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 여기서 Cbl 억제제는 본원에 기술된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
일부 구현예에서, 이의 전문이 참고로 포함된, 제WO 2019/148005호에 개시된 소 분자 Cbl 억제제 중 하나 이상은 본원에 기술된 치료 방법에서 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 화학식 (A)에 따른다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 화합물 101 내지 129로부터 선택된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 화합물 116이다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제의 조합이 사용된다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 항체이다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 펩타이드이다. 특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 siRNA이다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 치료학적 세포의 이식을 지지하는 상기 세포를 제공받은 환자에게 투여된다.
이러한 양태 중 일부에서, 이식될 상기 세포는 조직 또는 기관으로서 조직화된다. 이러한 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 이식된 골수, 피부, 각막, 힘줄, 골 조직, 혈관, 또는 심장 판막의 이식을 지지하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 심장, 페, 신장,간, 및 췌장을 포함하는 이식가능한 기관을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 이식된 기관의 이식을 지지하기 위해 투여된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 상기 면역 세포의 이식을 지지하기 위해 면역 세포를 제공받는 환자에게 투여된다.
상기 치료학적 세포의 이식을 지지하는 치료학적 세포를 제공받는 개체에 대한 Cbl 억제제의 1일 용량은 1 내지 5000 mg, 1 내지 2500 mg, 1 내지 2000 mg, 1 내지 1500 mg, 1 내지 1000 mg, 1 내지 750 mg, 1 내지 500 mg, 1 내지 400 mg, 1 내지 300 mg, 1 내지 250 mg, 1 내지 200 mg, 1 내지 100 mg, 1 내지 10 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.1 내지 1 mg이다.
치료학적 세포를 제공받는 환자는 상기 세포의 이식을 지지하기 위한 Cbl 억제제를 면역 세포의 주입 후 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일, 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일, 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일, 또는 7 내지 60일 동안 투여받을 수 있다.
이를 필요로 하는 환자에게 투여 시, 주입을 통해 제공받은 치료학적 세포를 지지하기 위한 Cbl 억제제의 유효량은 0 내지 0.5μM, 0 내지 1 μM, 0 내지 5 μM, 0 내지 10 μM, 0 내지 25 μM, 0 내지 50 μM, 0 내지 100 μM, 또는 0 내지1000 μM의 상기 Cb1 억제제의 농도를 생성한다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제 외에, 하나 이상의 제제 또는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물은 또한 치료학적 세포의 주입 후 환자에게 투여되어 주입된 치료학적 세포의 이식을 촉진한다. 특정의 구현예에서, 추가의 제제는 IL-2이다. 특정의 구현예에서, 추가의 제제는IL-7이다. 특정의 구현예에서, 추가의 제제는 IL-15이다. 특정의 구현예에서, 추가의 제제는 IL-21이다. 특정의 구현예에서, 추가의 제제는 IL-7과 IL-15의 조합이다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 제제는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 포함한다.
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 임의의 또는 모든 하나 이상의 추가의 제제의 투여에 대한 필요성을 감소시키거나 심지어 제거한다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드는 Cbl 억제제의 부재하에서의 치료요법과 비교하여 감소된 용량에서 투여된다. 특정의 구현예에서, 플루다라빈은 Cbl 억제제의 부재하에서의 치료요법과 비교하여 감소된 용량에서 투여된다. 특정의 구현예에서, IL-2는 Cbl 억제제의 부재하에서의 치료요법과 비교하여 감소된 용량에서 투여된다. 특정의 구현예에서, IL-2는 투여되지 않는다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500 mg/m2/일의 용량에서이고, 플루다라빈의 투여는 25 mg/m2/일의 용량에서이다. 예시적인 구현예에서, 사이클로포스파미드의 용량은 3일에 걸쳐 500 mg/m2/일이고, 플루다라빈의 용량은 3일에 걸쳐 25 mg/m2/일이다. 림프고갈의 용량은 0일째에 T 세포 주입과 관련하여 -5 내지 -3일(+/-1일 윈도우와 함께, 즉, -4 내지 -2일째에 투여)로 계획될 수 있다. 특정의 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500 mg/m2/일의 용량에서이고, 플루다라빈의 투여는 약 25 mg/m2/일의 용량에서이고, IL-2는 투여되지 않는다.
T 세포 기능장애
특정의 구현예에서, 유효량의 Cbl 억제제가 이를 필요로 하는 환자에게 투여되어 T 세포 기능장애를 치료할 수 있다.
T 세포 기능장애를 앓는 개체에 대한 Cbl 억제제의 1일 용량은 1 내지 5000 mg, 1 내지 2500 mg, 1 내지 2000 mg, 1 내지 1500 mg, 1 내지 1000 mg, 1 내지 750 mg, 1 내지 500 mg, 1 내지 400 mg, 1 내지 300 mg, 1 내지 250 mg, 1 내지 200 mg, 1 내지 100 mg, 1 내지 10 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.1 내지 1 mg이다.
T 세포 기능장애의 치료를 위한 Cbl 억제제의 유효량은 이를 필요로 하는 환자에게 투여시, 환자 내에서 0.0001 내지 0.5 μM, 0.001 내지 1 μM, 0.001 내지 5 μM, 0.01 내지 10 μM, 0.1 내지 25 μM, 0.1 내지 50 μM, 0.01 내지 100 μM, 0.1 내지 1000의 상기 Cb1 억제제의 농도를 생성할 것이다.
T 세포 기능장애를 앓는 환자는 Cbl 억제제로 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일 또는 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일 또는 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일 또는 7 내지 60일 동안 치료될 수 있다.
Cbl 억제제를 사용한 주입 후 치료
특정의 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 주입 후에 개체에게 투여된다. 면역 세포의 주입과 Cb1 억제제의 투여 사이, 또는 이의 역의 시간 길이는 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 10분 내지 약 1시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 20분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 45분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 15시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간일 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 주 지지 치료요법으로서 투여된다. 일부 구현예에서, 이러한 기간은 약 1일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 7일, 6일 내지 약 7일, 1일 내지 약 2주, 또는 1주 내지 약 3주, 1주 내지 약 4주, 1주 내지 약 6주, 1주 내지 약 9주, 1주 내지 약 12주, 1주 내지 약 24주, 1주 내지 약 48주, 1주 내지 약 52주, 1주 내지 약 60주, 1주 내지 약 100주일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서 치료학적 요법은 입양 세포 치료요법 및 화학치료요법 둘 다를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 치료학적 요법의 일부 구현예는 약물 향상된 입양 세포 치료요법(DE-ACT), 약물-향상된 종양-침윤 림프구(DE-TIL) 치료요법, 약물 향상된 키메라 항원 수용체 치료요법(DE-CART), 또는 약물 향상된 NK-CAR 세포 치료요법을 포함한다.
주입 집단이 개체에게 투여된 후, 개체의 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 당해 분야에 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 측정하기 위한 매개변수는 생체 내(예컨대, 영상화에 의해) 또는 생체 외(예컨대, ELISA 또는 유 세포 분석법에 의해)에서 항원 변형된 면역 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적인 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 파괴하는 변형된 면역 세포의 능력은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 문헌: Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7):689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004)에 기술된 예를 들면, 세포독성 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 개체의 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 또한 특정의 사이토킨, 예를 들면, IL-2 및 IFNγ의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정할 수 있다. 일부 양태에서, 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 임상 결과, 예를 들면, 종양 크기 또는 종양의 수에서의 감소에 의해 측정된다.
치료된 병태
본원에 기술된 방법 및 조성물은 숙련가가 적합한 것으로 고려하는 임의의 병태에 대해 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 병태는 암이다. 특정의 구현예에서, 병태는 종양이다. 특정의 구현예에서, 병태는 혈액 암이다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 암은 혈액 암, 예를 들면, 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 또는 골수종(myeloma)이다. 본원에 고려된 바와 같은 혈액 암은 하나 이상의 백혈병, 예를 들면, B-세포 급성 림프성 백혈병(B-cell acute lymphoid leukemia)("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-cell acute lymphoid leukemia)("TALL"), 급성 림프성 백혈병(acute lymphoid leukemia)(ALL); 하나 이상의 만성 백혈병, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)(CML) 및 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)(CLL); 추가의 혈액 암 또는 혈액 병태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 B 세포 림프모구 백혈병(B cell prolymphocytic leukemia), 모구 형질세포양 수지세포 종양(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 광범위 큰 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma), 소포 림프종(follicular lymphoma), 털 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 소 세포- 또는 거대 세포-여포성 림프종(small cell- or a large cell-follicular lymphoma), 악성 림프증식성 병태(malignant lymphoproliferative condition), MALT 림프종(lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 변연부비세포 림프종(Marginal zone lymphoma), 다발 골수종(multiple myeloma), 골수이형성(myelodysplasia) 및 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 형질세포양 수지 세포 종양(plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 발텐스트롬마크로블로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 골수 혈액 세포의 비효율적인 생산(또는 이형성)에 의해 단일화된 혈액 병태의 다양한 수집물인 "전백혈병(preleukemia)"을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 암은 비-혈액 암, 예를 들면, 육종(sarcoma), 암종(carcinoma), 또는 골수종(melanoma)이다. 본원에 고려된 비-혈액암은 신경모세포종(neuroblastoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 결장 암(colon cancer), 결장직장 암(colorectal cancer), 유방 암, 상피 편평 세포 암(epithelial squamous cell cancer), 흑색종(melanoma), 위장 암(stomach cancer), 뇌 암(brain cancer), 폐 암(lung cancer)(예컨대, NSCLC), 췌장 암(pancreatic cancer), 자궁 경부 암(cervical cancer), 난소 암(ovarian cancer), 간 암(liver cancer), 방광 암(bladder cancer), 전립선 암(prostate cancer), 고환 암(testicular cancer), 갑상선 암(thyroid cancer), 자궁 암(uterine cancer), 부신 암(adrenal cancer) 및 두부 및 경부 암(head and neck cancer)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 암은 흑색종이다. 특정의 구현예에서, 암은 자궁경부 암이다. 특정의 구현예에서, 암은 난소 암이다. 특정의 구현예에서, 암은 두부 및 경부 편평 세포 암종이다. 특정의 구현예에서, 암은 비-소 세포 폐 암이다.
일부 구현예에서, 암은 전신계 치료요법의 하나 이상의 라인 후 재발되거나 불응성이다.
투여량 형태
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cbl 억제제는 환제(pill), 캡슐제, 정제, 시럽제, 앰플제(ampule), 로젠지제(lozenge), 개체에 대한 경구 투여용 산제로 제형화된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 또는 주사용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 시험관 내 또는 생체 외에서 세포 배양에 사용하기 위해 제형화된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 본원에 제공된 Cbl 억제제는 약제학적 조성물 또는 단일 단위 투여량 형태이다. 본원의 약제학적 조성물 및 단일 단위 투여량 형태는 예방학적 또는 치료학적 유효량의 하나 이상의 Cbl 억제제를 포함한다. 면역 세포를 제공하기 전에 생체 내 활성화를 겪는 개체에서, Cbl 억제제의 양은 치료되지 않은 참고 샘플과 비교하여 생체 내에서 면역 세포의 활성을 조절하기에 충분한 양이다. Cbl 억제제는 매일 1x, 2x, 또는 3x, 매일 4x, 또는 5x 투여될 수 있다.
특정의 구현예에서, 세포 기반 면역치료요법을 위한 개체에 대한 Cb1 억제제의 1일 투여량은 1 내지 5000 mg, 1 내지 2500 mg, 1 내지 2000 mg, 1 내지 1500 mg, 1 내지 1000 mg, 1 내지 750 mg, 1 내지 500 mg, 1 내지 400 mg, 1 내지 300 mg, 1 내지 250 mg, 1 내지 200 mg, 1 내지 100 mg, 1 내지 10 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 또는 0.1 내지 1 mg이다.
특정의 구현예에서, 개체에게 투여시, Cbl 억제제의 유효량은 영향받은 조직 또는 종양 또는 생체 내 활성화 상 동안에 인접하거나 주변 부위에 0 내지 0.5 μM, 0 내지 1 μM, 0 내지 5 μM, 0 내지 10 μM, 0 내지 25 μM, 0 내지 50 μM, 0 내지 100 μM, 또는 0 내지 1000 μM의 상기 억제제의 농도를 생성한다.
본원의 방법에 의해 생산된 세포는 표준 기술에 따라 제형화되고 투여될 수 있다. 요약하면, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 세포 집단과 함께, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예를 들면, 중성 완충된 염수, 포스페이트 완충된 염수 등; 탄수화물, 예를 들면, 글루코스, 만노스, 슈크로스, 덱스트란, 또는 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신; 항산화제; 킬레이팅제(chelating agent), 예를 들면, EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예컨대, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, 세포 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질환에 대해 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 병태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이고, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
실시예
실시예 1: 종양 조직으로부터 생체 외에서 사람 종양-침윤 림프구(TIL)의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
사람 난소 및 결장 종양의 샘플을 Cooperative Human Tissue Network(CHTN, c/o Vanderbilt University Medical Center, 테네시 주 나쉬빌 소재)로부터 입수하였다. 고형 종양 표본(specimen)을 주변 지방 및 괴사 부위가 없도록 조심스럽게 절개하였다. 종양을 멸균 조건 하에 스캘펄(scalpel) 및 스캘펄 홀더(scalpel holder)를 사용하여 8 mm3(2x2x2mm3) 단편으로 슬라이싱(slicing)하였다.
종양 세포주 생성을 위해, 다수의 단편을 혈청-유리된 RPMI 1640 배지 중 1　mg/ml의 워씽톤 콜라게나제 형( Worthington collagenase type) 4, 10 μg/ml의 겐타마이신, 및 3000 U/ml DNAse의 혼합물 속에 침지하였다. 종양 단편을 Miltenyi gentlemacs octo dissociator를 사용하여 초기에 가공하고 30분 동안 37℃에서 온화하게 교반하면서 항온처리하였다. 단일-세포 슬러리를 멸균 메쉬(mesh)에 통과시켜 분해되지 않는 조직 단편을 제거하였다. 세포의 수득되는 슬러리를 세척하고 배지 속에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 100% Ficoll, 및 75% Ficoll과 25% 배지가 들어있는 2-단계 구배 위에 적층화하였다. 2000 rpm에서 20분 동안 항온처리 후, 인터페이스(interface)를 수집하였다. 상부의, 종양-세포가 농축된 분획을 대략 1x106개의 종양 세포에서 T75 조직 배양 플라스크(VWR) 속에서 20% 태아 송아지 혈청(Fetal Bovine Serum)(FBS)을 함유하는 RPMI 배지 속에 플레이팅(plating)하였다.
TIL 생성을 위해, 단일의 8　mm3 종양 단편을 25 mM HEPES, 10% 열 불활성화된 사람 AB 혈청, 100 U/mL의 페니실린, 100 μg/ml의 스프렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10 μg/ml의 겐타마이신 및 0.25 μg/ml의 Fungizone(완전 배지; CM)를 함유하는 2 mL RPMI 배지를 함유하는 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 0.1 내지 10 μM의 Cbl 억제제의 존재 또는 부재하에서 6000 IU/mL IL-2, 또는 0.1 내지 10 μM의 Cbl 억제제 단독과 함께 가하였다. 플레이트를 5% CO2가 들어있는 습윤화된 37℃의 항온처리기에 두었다. 배지의 1/2을 배양 개시 후 2일마다 대체하였다. 웰이 융합성(confluent)으로 되면, 내용물을 격렬히 혼합하고, 2개의 도터 웰(daughter well)로 분할하고, 0.1 내지 10 μM의 Cbl 억제제의 존재 또는 부재하에, 또는 0.1 내지 10 μM의 Cbl 억제제 단독과 함께, 6000 IU/mL IL-2가 들어있는 RPMI 배지가 있는 웰당 2 mL로 채웠다. 후속적으로, 배지의 1/2을 주 당 3회 대체하고, 배양물을 분할아여 1Х106개의 세포/mL의 세포 밀도로 유지하였다. TIL을 붓고 17 및 28일째에 계수하고, 계통(CD4, CD8)의 발현, 분화 및 다른 T 세포 마커, 예를 들면, ICOS, CD45RA, CD45RO, CD95, CCR7, CD62L, CD3ε, CD8α, CD14, CD19, CD20, CD11c, TCF1, PD-1, TIM3, LAG3, CD27, CD28, CD127, PD-1, CD122, CD132, KLRG-1, HLA, HLA-DR, CD33, CD61, Cd235, TCRγ, TCRδ, CD38, CD69, CD11a, CD58, CD99, CD103, CCR4, CCR5, CCR6, CCR9, CCR10, CXCR3, CXCR4, CLA, CD161, IL-18Ra, c-Kit, 및 CD130을 측정함으로써 유 세포 분석법으로 28일째에 면역표현형화하였다. 미토콘드리아 마커, 예를 들면, 미토트랙커(Mitotracker), 미토프로브(Mitoprobe), 및 2-NBDG를 또한 사용하여 세포의 분화 및/또는 활성화를 평가하였다. 유사한 결과와 함께 초기 TIL 생성 단계를 28일로부터 약 7 내지 11일로 단축시켰다.
도 및 표 2 내지 7의 데이타는 화합물 103을 사용한 것이다. 도 1은 세포의 평균 수/웰 및 종양 샘플 사이의 TIL 확장 가변성의 크기를 나타낸다. 이러한 이유로, 총 세포 수는 IL-2 단독 조건의 퍼센트로서 표 2에 나타낸다. 도 1a는 IL-2 단독 또는 Cbl 억제제 단독을 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 도 1b는 IL-2 단독 또는 0.1, 1, 또는 10 μM의 Cbl 억제제와 함께 IL-2를 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4d는 IL-2 단독; 0.1, 1, 또는 10 μM의 Cbl 억제제; 또는 0.1, 1, 또는 10 μM의 Cbl 억제제와 난소 TIL 및 결장 TIL과 함께 IL-2를 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 도 5a는 IL-2 단독; 0.5 μM의 Cbl 억제제; 또는 0.50 μM의 Cbl 억제제와 결장 TIL과 함께 IL-2를 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 도 5b는 IL-2 단독; 0.3, 0.5 또는 10 μM의 Cbl 억제제; 또는 0.3, 0.5 또는 10 μM의 Cbl 억제제와 결장 TIL과 함께 IL-2을 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 도 6은 IL-2 단독; 0.5 μM의 Cbl 억제제; 또는 0.50 μM의 Cbl 억제제와 종양 단편 또는 종양 현탁액으로부터의 결장 TIL과 함께 IL-2을 사용한 세포의 평균 수를 나타낸다. 놀랍게도, 심지어 IL-2의 존재하에서, Cb1 억제제의 존재하에서 TIL을 배양하는 것은 TIL의 고려할만한 확장을 야기하였다. 이는 놀랍게도 Cbl 억제제 및 IL-2 둘 다의 부재하에서 배양된 종양 샘플이 어떠한 생존하는 세포도 생성하지 않았음을 나타낸다. 추가로, IL-2 및 Cbl 억제제의 존재하에서 TIL을 배양하는 것은 IL-2 또는 Cb1 억제제 단독의 존재하에서 TIL을 배양하는 것보다, 4개의 종양 샘플 중 2개(TIL1 및 TIL4)로부터 실질적으로 추가의 TIL의 생산을 야기하였다. 따라서, Cbl 억제제는 IL 2의 부재하에서 세포 생존능(cell viability)을 뒷받침하고 일부 종양 샘플에서 IL-2의 효과를 향상시킨다.
[표 2]
Figure pct00048
∧17일째에 IL-2 단독과 관련한 총 세포 수의 퍼센트
신속한 확장 프로토콜
신속한 확장 프로토콜(REP)은 200:1의 비의 공급인자 세포 대 반응하는 TIL 세포에서 조사된, 동종이계의 공급인자 세포(Astarte Biologics)의 존재하에서 OKT3(항-CD3) 항체(Thermo Fisher Scientific) 및 IL-2를 사용하였다. PBMC, OKT3 항체(30 ng/mL), 완전 배지("CM"), AIM V 배지(GIBCO/BRL), 및 TIL 효과기 세포를 조합하고, 합하고, 75 cm2의 조직 배양 플라스크로 분취하였다. 플라스크를 직립시켜서 37℃에서 5% CO2 속에서 항온처리하였다. IL-2(6000 IU/mL) 및/또는 Cbl 억제제(0.1, 1, 10 μM)를 2일째에 가하였다. 5일째에, 배양 상층액을 흡인으로 제거하고 배지를 6000 IU/mL IL-2 및/또는 Cb1 억제제를 함유하는 CM/AIM V의 1:1 혼합물로 대체하였다. 6일째에, 및 이후 매일, 세포 농도를 측정하고, 세포를 필요한 경우6000 CU/mL IL-2/Cbl 억제제를 함유하는 추가의 배지가 들어있는 추가의 플라스크로 분할하여 세포 밀도를 대략 1 Х 106개의 세포/mL로 유지하였다. ERP의 개시 후 약 14일째에, 세포를 수거하고 추가의 실험 분석을 위해 동결보존하였다.
예비-REP 프로토콜 동안 확장된 TIL 만을 ERP 프로토콜에서 추가로 확장시켰다: TIL1, TIL3, TIL4 & TIL6. REP 동안 TIL 확장의 크기는 종양 샘플 사이에서 변화하였다. 이러한 이유로, 총 세포 수는 ERP 확장 프로토콜 동안 IL-2 단독 조건의 퍼센트로서 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00049
^42일째에 IL-2 단독과 관련한 총 세포수의 퍼센트(예비-REP 및 REP).
T 림프구를 표 4에 나타낸 바와 같이, 발달 모델(Restifo, Blood, 124:476-477, 2014)에 따라 계통 및 분화 마커 발현을 기반으로 정의하였다. 흥미롭게도, Cb1 억제제의 존재하에서 생체 외 확장된 사람 TIL은 표 5에 나타낸 바와 같이, TCM(CD45RO+, CD95+, CCR7+, CD62L+) 또는 TEM(CD45RO+, CD95+, CCR7-, CD62L-)을 갖는다. 추가로, Cbl 억제제는 도 7에 나타낸 바와 같이, 악성 난소 종양 샘플로부터의 CD8+ T 림프구를 선택적으로 확장하는 것으로 밝혀졌다. 이는 TIL이 IL-2 단독과 함께 생체외에서 배양된 경우, 필수적으로 등가의 수의 CD4+ 및 CD8+ T 림프구가 생산되었음을 고려할 때 놀라운 것이다. 단핵구(CD14+), B 세포(CD20+) 및 NK 세포(CD56+)를 총 세포의 수의 <10%에 대해 계수하였다.
[표 4]
Figure pct00050
[표 5]
Figure pct00051
^ 28일째에 총 TIL 세포 수의 퍼센트
^ 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 가공된 T 세포를 유사하게 확장시킬 수 있다. 요약하면, T 세포를 환자의 전체 혈액, 연막(buffy coat) 또는 류코팩(leukopak)으로부터 단리하고 상술한 바와 같이 확장하였다. 렌티바이러스 형질도입으로 CAR을 T 세포 내로 도입하였다. T 세포를 생성된 세포의 총 수 뿐만 아니라 이의 표현형에 대해 기억, 효과기, 고갈 및 줄기성(stemness)(예컨대, CD95, TCF7, CD62L, CCR7, CD45RO 및 CD45RA, TOX, PD-1, TIM3, LAG3) 및 형질도입 효능을 측정하는 유 세포 분석법 분석에 의해 이의 표현형에 대해 평가하였다. 수득되는 CAR T 세포를 확장시키고 CAR에 대한 특이적인 항원 또는 일반적인 T 세포 활성화 방법(예컨대, 항-CD3/CD28)에 의한 재활성화 후 사이토킨(예컨대, IFNγ)을 생산하는 이의 능력에 대해 평가하였다.
실시예 2: 말초 혈액 단핵 세포로부터 항원 특이적인 사람 T 세포의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
Cb1 억제제의 존재하에서 말초 혈액 단핵 세포로부터의 T 세포를 평가하였다.
CMV pp65(495 내지 503) 반응성 T 세포를 CMV 혈청양성 공여체(Conversant)를 해동시켜 확장시키고 2x106개의 세포/ml를 1% GlutaMax(Gibco), 1% 비-필수 아미노산(NEAA), 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 10% 열 불활성화된 사람 AB 혈청(Corning), 1 μg/ml CMV pp65(495-503)(Anaspec), 2 ng/mL IL-2(R&D), 및/또는 Cbl 억제제(01, 1, 10 μM)로 보충된 RPMI 배지(Gibco) 속에 재현탁시켰다. PBMC를 8일 동안 IL-2 및/또는 Cbl 억제제와 함께 배양하고 3일 내지 5일째에 보충하였다. 8일째에, 세포를 수거하고, 저 용량의 IL-2(100 U/ml) 및/또는 Cbl 억제제 속에 2백만개/ml에서 완전 RPMI 배지 속에서 2일 동안 재-플레이팅(re-plating)하였다. 11일째에, 세포를 혼주(pooling)시키고 계수하고, 11일째에 계통(CD4, CD8) 및 분화(예를 들면, CD45RA, CD45RO, CD95, CCR7, CD62L, TCF1, PD-1, TIM3, LAG3) 마커의 발현을 측정함으로써 유 세포 분석법으로 면역표현형화하였다.
확장 크기는 샘플 사이에서 변하였다. 놀랍게도, Cb1 억제제의 존재하에서 T 세포의 배양은, IL-2의 부재하에서도, T 세포의 고려할만한 확장을 야기하였다.
[표 6]
Figure pct00052
^11일째에 IL-2 단독과 관련한 총 세포 수의 퍼센트
T 림프구를 표 4에 나타낸 바와 같이, 발달 모델(Restifo, Blood, 124:476-477, 2014)에 따라 계통 및 분화 마커를 기반으로 정의하였다. 흥미롭게도, Cb1 억제제의 존재하에서 생체 외 확장된 사람 T 세포는 도 7에 나타낸 바와 같이, Tscm (CD45RA+, CD95+, CCR7+, CD62L+), TCM(CD45RO+, CD95+, CCR7+, CD62L+) 또는 TEM(CD45RO+, CD95+, CCR7-, CD62L-) 표현형을 가졌다. 또한, Cbl 억제제는 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 공여체 PBMC로부터 CD8+ T 림프구를 선택적으로 확장하는 것으로 밝혀졌다. 도 2a는 IL-2의 부재(도 2a) 및 존재(도 2b) 하에서 IL-2, 0.1 μM Cbl 억제제, 1 μM Cbl 억제제, 및 10 μM Cbl 억제제의 존재하에서 PBMC 샘플로부터의 T 세포의 선택적인 확장을 나타내었다. 0.1 또는 0.5 μM Cbl 억제제와 함께 IL-2의 존재하에서 배양된 세포는 배양물 속에서 최고 퍼센트의 CD8+ 세포를 나타내었다. 또한, 1μM Cbl 억제제 단독 속에서 배양된 세포는 IL-2 단독 속에서 배양된 것보다 더 높은 CD8+ 세포를 나타내었다.
[표 7]
Figure pct00053
11일째에 총 세포수의 퍼센트
T 세포 활성은 사이토킨 분비의 분석으로 측정하였다. 이러한 확장된 T 세포가 세포외 자극에 대해 반응할 수 있는지의 여부를 시험하기 위하여, T 세포를 25 ng/mL의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 0.5　μM 이오노마이신으로 자극시켰다. 90분 자극 후, 모넨신, 1:50(GolgiStop, BD Biosciences)을 가하였다. 6시간 후, 세포를 CD4+, CD8+, CD45RA+, CD95+, CCR7+, CD62L+의 표면 발현을 위해 염색하고, 후속적으로, 고정시키고, 투과하고 세포내 사이토킨, IFN-γ에 대해 염색하였다. 6시간 후, 본 발명자는 T 세포를 IL-2 및 Cb1 억제제로 확장시킨 경우 항-종양 반응의 중요한 효과기인, 축적된 세포내 IFN-γ에서 명확한 증가를 관찰하였다. 본 발명자는 CD4/8+　T 세포의 대략 50%가 IL-2 확장된 T 세포에서 IFN-γ 발현에 대해 양성이었고, 85% 초과의 IL-2 및 Cbl 억제제가 IFN-γ를 생산할 수 있는 CD4/8+　T 세포를 확시켰음을 발견하였다. 도 3a는 Cb1 억제제 및 IL-2의 존재하에서 배양된 T 세포가 IL-2 단독 또는 Cb1 억제제 단독의 존재하에서 배양된 것보다 더 높은 수준의 CD4/CD8+ 및 IFNγ+ 세포를 나타내었음을 나타낸다. CD4/8+ 및 IFNγ+ 세포 둘 다의 발현은 IL-2 및 Cbl 억제제 확장시킨 T 세포가 항-종양 반응을 유발하는 기능적 잠재능을 포함함을 시사한다.
실시예 3: 가스 투과성 플라스크(Gas Permeable Flask)를 사용하여 종양으로부터 생체 외에서 사람 종양-침윤 림프구(TIL)의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
도 6은 TIL 배양을 위한 최적의 출발 물질을 측정하기 위한 연구의 결과를 제공한다. 종양 단편 대 결장 종양으로부터 종양 세포 현탁액을 사용하는 연구에서, 11일 동안 종양 단편으로부터 성장시킨 배양물은 TIL 배양을 위한 출발 물질로서 종양 세포 현탁액을 사용하는 배양보다 대략 10배 더 높은 확장을 나타내었다.
배양을 40 mL 용량(capacity) 및 10 cm2의 가스 투과성 규소 바닥(GREX6M; Wilson Wolf Manufacturing, 미네소타 주)의 가스 투과성 플라스크에서 개시하였고, 각각의 플라스크에 0일(D0) 또는 3일(D3)째에 단독으로 또는 함께 첨가된 1 μM Cbl 억제제 및 또는 IL-2가 들어있는 40 mL의 배지 속에 5개의 종양 단편을 로딩(loading)하였다. G-REX 웰을 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃에서 5% CO2 속에서 7 내지 28일 동안 항온처리하였다.
도 8은 2개의 상이한 난소 종양 샘플로부터 세포 확장을 위해 가스 투과성 규소 바닥이 있는 가스 투과성 플라스크를 사용한 7일째 결과를 제공하며 여기서 0일째 또는 3일째에 IL-2 또는 Cbl 억제제를 비교하였다. "A"는 0일째에 IL-2를 단독으로 첨가한 것이다. "B"는 0일째에 IL-2 및 1 μM의 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "C"는 0일째에 IL-2를 첨가하고 3일째에 1 μM의 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "D"는 3일째에 IL-2를 첨가하고 3일째에 Cbl 억제제를 첨가한 것이다. "E"는 0일째에 Cbl 억제제를 첨가한 것이다.
실시예 4: 종양 모델에서 효능 및 작용 메카니즘을 측정하기 위한 생체내 전달된 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 확장에 대한 Cbl 억제제 효과의 평가
Cb1 억제제의 존재하에서 생체 외 종양 특이적인 T 세포의 배양은 IL-2 만을 사용한 표준 배양 조건과 비교하여 보다 우수한 항-종양 효과를 부여할 수 있다. 당해 실시예에서, 화합물 103 단독 또는 IL-2와 조합된 화합물 103에 대해 T 세포의 3일 생체 외 노출은 세포를 종양을 지닌 동물내로 전달 시 대조군과 비교하여 1개월에 걸쳐 지속적인 항-종양 표현형을 부여하였음을 입증하였다.
유전자이식 마우스로부터 종양 특이적인 T 세포를 Cb1 억제제를 사용하여 생체 외 CAR T 또는 TIL 확장에 대한 모델로서 활용하였다. 상업적으로 이용가능한 OT-1 유전자이식 동물은 MHC I 분자로 나타낸 경우 OVA 펩타이드 아미노산 257 내지 264를 인식하는 CD8 T 세포를 갖는다. OT-1 마우스로부터의 CD8+ T 세포를 비장세포의 단일 세포 현탁액으로부터 음성 선택(StemCell Technologies 제품 번호 19853 EasySepTM 마우스 CD8+ T 세포 단리 키트)으로 단리하였다. 이후에, 세포를 완전 배지(RPMI1640, 10% 열 불활성화된 FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 글루타민 및 β-머캅토에탄올) 속에 mL 당 0.5 x 106개의 농도로 재현탁시켰다. 6개의 웰 조직 배양 플레이트(Falcon)를 2 ug/mL의 항-마우스 CD3(Bio Xcell Cat #BE0001-1-R100mg InVivoMAb 항-마우스 CD3ε 클론: 145-2C11)로 >3시간 동안 37℃에서 코팅하고 세포 첨가 전에 PBS(MediaTech)로 세척하였다. 생체 외 확장을 위해, 1.5 x 106개의 세포/웰을 IL-2(300IU)(R&D Systems), Cbl 억제제(1μM) 또는 IL-2와 Cbl 억제제의 조합의 존재하에서 배양하였다. Cbl 억제제는 마우스 CBLB와 상호작용하는 것으로 밝혀졌으며 향상된 증식 및 사이토킨 분비의 유사한 프로파일을 입증한다. 3일의 OT-1 T 세포 활성화 및 확장 후, 세포를 수집하고 계수하고 분화의 발현 및 다음을 포함하는 추가의 T 세포 마커를 측정함으로써 유 세포 분석법에 의해 면역표현형화하였다: CD3, CD4, CD8, CD45, CD25, 그랜자임 B, CD107a, CD127, PD-1, TIM3, LAG3, KLRG-1, ICOS, TCF1, Ki67, T-bet 및 FOXP3. 확장 동안 CBL 억제제의 혼입에 대한 반응시 증가된 효과기 기능의 경향성이 측정된 향상된 그랜자임 T-bet로서 밝혀졌다.
사멸한 세포를 제거(Miltenyi Biotec 제품 번호 130-090-101)한 후 생체 내로 전달하여 OVA 항원을 발현하는, EG.7 림프구 모델에서 이의 트래피킹(trafficking) 및 기능을 모니터링하였다. 마우스 당 대략 5백만개 세포를 약 70 mm3의 종양 버든(tumor burden)을 갖는 마우스로 전달하였다. OT-1 세포의 생체 내 전달 후, 항종양 반응을 시간에 따라 모니터링하고 면역 반응의 품질 및 양을 다양한 시점에서 평가하였다. 혈액 및 비장으로부터 OT-1 세포는 이를 전달 후 4 및 9일째에 분석한 경우 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 보다 높은 빈도 및 생체 내 지속성을 입증하였다. 또한, Cb1 억제제로 확장시킨 OT-1 세포는 줄기 마커 TCF1+, PD-1+, 및 TIM-3-을 발현한 세포의 보다 높은 퍼센트를 나타내었다.
도 9는 Cb1 억제제로 확장시킨 OT-1 세포가 E.G7-OVA 세포가 피하 이식된 마우스에서 확립된 종양을 거부할 수 있는 강력한 효과기임을 나타내는 결과를 제공한다.
도 10은 Cb1 억제제로 확장시킨 OT-1 세포가 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 보다 높은 빈도 및 혈액 속 생체 내 지속성을 입증함을 나타내는 결과를 제공한다. 혈액 속의 OT-1 세포를 전달 후 4 또는 9일째에 평가하였다. 비장으로부터 수득한 OT-1 세포를 분석한 경우 유사한 데이타가 수득되었다.
실시예 5: Cbl 억제제-확장된 종양 항원 특이적인 T 세포의 평가
본 실시예는 Cb1-b 억제제의 존재하에서 확장된 세포의 치료학적 효능을 평가한다.
요약하면, 오브알부민(OT-1)에 대해 특이적인 유전자이식 T 세포 수용체를 발현하는 종양 항원 특이적인 CD8+ T 세포를 시험관 내에서 3일 동안 플레이트-결합된 CD3 및 1) 1 μM에서의 Cbl 억제제, 2) 300 IU에서의 IL-2, 및 3) Cbl 억제제와 IL-2의 조합의 존재 하에서 확장시켰다. 확장된 OT-1 세포를 FACS 분석으로 특성화하고 오브알부민(OVA) 발현 종양을 지닌, E.G7-OVA 마우스 내로 전달하였다. 확장된 OT-1 세포의 생체 내 전달 후, 항종양 반응을 시간에 걸쳐 모니터링하고 면역 반응의 품질 및 양을 다양한 시점에서 평가하였다. 분석은 혈액, 종양, 및 비장 샘플에서 FACS 분석을 포함하였다. 분석은 또한 OVA 제I 부류 펩타이드를 사용한 비장세포의 재-자극으로 항원-특이적인 T 세포의 다기능성을 평가함을 포함하였다.
0일째에, E.G7-OVA 세포를 각각의 마우스 내로 이식하였다. 5일째에, 대략 5 x 106개의 시험관 내 확장된 OT-1 세포를 각각의 마우스의 꼬리 내로 주사하였다. 9일째에, 혈액을 FACS로 분석하였다. 14일째에, 혈액, 종양 및 비장 샘플을 FACS로 분석하였다. 27일째에, 혈액을 FACS로 분석하였다. 종양 용적을 5일 마다 이식 후 약 50일 전에체서 측정하였다.
도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, 화합물 103으로 확장시킨 CD8+ OT-1 세포는 적어도 IL-2로 확장시킨 CD8+ OT-1 세포와 같이 강력하였다. 화합물 103 및 IL-2의 조합을 사용한 확장은 또한 이식 후 적어도 20일 전체에서 유사한 효능을 나타내었다.
도 12에 나타낸 제2의 연구에서, CD2 만으로 확장시킨 대조군 세포는 최소의 항종양 활성을 입증하였다. 화합물 103으로 확장시킨 세포는 보다 드러난 종양 성장의 억제(패널 A) 및 장기간 생존(B)에 의해 입증되는 바와 같이 IL-2 확장된 세포와 비교하여 증가된 잠재능을 나타내었다. 또한, 세포 화합물 103 및 IL-2 확장시킨 세포는 보다 드러난 종양 성장의 억제(패널 A) 및 장기간 생존(B)에 의해 입증된 바와 같이 IL-2와 비교하여 증가된 잠재능을 나타내었다.
도 12에 나타낸 실험은 화합물 103으로 확장시킨 OT-1 세포가 종양 성장의 보다 현저한 억제(도 12a) 및 증진된 장기간 생존(도 12b)에 의해 입증되는 바와 같이 IL-2 확장된 세포와 비교하여 증가된 잠재능을 나타내었다. 중요하게도, OT-1 화합물 103 및 IL-2 세포로 확장시킨 세포는 종양 성장의 보다 현저한 억제(도 12a) 및 보다 우수한 장기간 생존(도 12b)에 의해 입증된 바와 같이 단일 제제 단독, IL-2 또는 화합물 103과 비교하여 증가된 잠재능을 나타내었다.
실시예 6: Cb1 억제제-확장시킨 종양 항원 특이적인 T 세포는 IL-2로 확장시킨 동일한 세포와 비교하여 보다 우수한 특성을 입증한다
OT-1 세포를 앞서의 실시예에 따라 확장시키고 오브알부민(OVA) 발현 종양을 지닌 E.G7-OVA 마우스에게 투여하였다. 세포를 이의 생체 내 특성에 대해 평가하였다.
확장된 OT-1 세포를 혈액 속에서 전달 후 4일 및 22일째에 평가하였다. 도 13a(4일째) 및 도 13b(22일째)에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제 확장시킨 세포는 총 CD45+ 세포 내에서 보다 높은 빈도를 나타내었고, IL-2 단독으로 확장시킨 세포보다 더 오래 지속하였고 항-CD3 단독으로 확장시킨 세포보다 더 오래 지속하였다. Cb1 억제제와 IL-2의 조합으로 확장시킨 세포는 총 CD45+ 세포에서 심지어 더 높은 빈도 및 더 높은 지속성을 나타내었다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 4일째에 종양에서 평가하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제 확장시킨 세포는 IL-2 만으로 확장시킨 세포 및 항-CD3 단독으로 확장시킨 세포와 비교하여 총 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도로 나타난 바와 같이 종양을 침윤시키는 증가된 능력을 입증한다. Cb1 억제제 및 IL-2의 조합으로 확장시킨 세포는 총 CD45+ 세포에서 가장 높은 빈도에 의해 입증된 바와 같이 보다 우수하게 종양을 침윤시킨다. 또한, Cb1 억제제 또는 Cb1 억제제와 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포는 IL-2 단독으로 확장시킨 OT-1과 비교하여 고갈 마커 PD1 및 TIM3(도 14b) 및 PD1, TIM3, 및 LAG3(도 14c)의 보다 낮은 수준의 발현을 나타내었다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 11일째에 비장세포로부터 평가하였다. 수거된 비장세포를 OVA 제I 부류 펩타이드로 72시간 동안 재-자극시켰다. 도 15에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제 확장시킨 세포는 IL-2 단독으로 확장시킨 세포와 비교하여 펩타이드 재자극에 대한 반응시 증식하는 보다 우수한 고유 능력을 나타내었다. Cbl 억제제 및 IL-2의 조합으로 확장시킨 세포는 펩타이드 재자극에 대한 반응시 증식하는 심지어 보다 큰 고유 능력을 나타내었다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 11일째에 비장세포로부터 평가하였다. 수거된 비장세포를 OVA 제I 부류 펩타이드로 4시간 동안 재-자극시켰다. 도 16a 및 16b에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제 확장시킨 세포는 IL-2 단독으로 확장시킨 세포와 비교하여 펩타이드-재자극시킨 OT-1 세포에서 비교가능한 다기능성(IFN-감마 및 TNF-알파 이중 양성 세포)을 나타내었다. 도 16c에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제 확장시킨 세포는 IL-2 단독으로 확장시킨 세포와 비교하여 다기능성(IFN-감마 및 TNF-알파 양성) 세포에서 고갈 마커(PD1 및 TIM3)의 보다 낮은 발현 수준을 나타내었다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 11일째에 비장세포로부터 평가하였다. 수거된 비장세포를 OVA 제I 부류 펩타이드로 24시간 동안 재-자극시켰다. IL-2 생산을 펩타이드 재자극 24시간 후 측정하였다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 확장 조건은 IFN-감마 생산에 영향을 미치지 않았다. 도 17b에 나타낸 바와 같이, Cbl 억제제는 재자극시 증가된 IL-2 생산을 나타내었다. 총 IL-2 및 이중 IFN-g/IL-2 둘 다를 생산하는 세포는, 세포를 Cb1 억제제의 존재하에서 시험관 내에서 확장시킨 경우, 증가하였다.
실시예 7: 경구 Cbl 억제제 치료는 확장된 OT-1 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다.
종양 용적을 세포 전달 후 5일 마다 대략적으로 측정하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 화합물 116의 경구 투여는 화합물 103 및 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포의 항-종양 효능을 향상시켰다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 화합물 116의 경구 투여는 화합물 103 및 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포의 항-종양 활성을 향상시켰다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 화합물 116의 경구 투여는 화합물 116의 경구 치료를 받지 않은 마우스와 비교한 경우 화합물 103 및 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포로 처리한 마우스의 생존을 향상시켰다.
OT-1 세포를 전달 후 5일 및 20일째에 마우스 혈액 속에서 평가하였다. 도 20a 및 20b에 나타낸 바와 같이, 화합물 116은 Cb1 억제제 및 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포의 증가된 빈도를 유도하였다. 화합물 116은 또한 Cb1 억제제 및 IL-2로 확장시킨 OT-1 세포의 보다 긴 지속성을 유도하였다.
실시예 8: 확장된 OT-1 세포의 장기간 항-종양 효능
OT-1 세포가 장기간 종양 보호할 수 있는지를 측정하기 위하여, 상기 실험의 장기간 생존자(survivor)(도 12)를 시험관 내 확장시킨 OT-1 세포에서의 초기 입양 전달 후 149일째에 치사 용량의 E.G7-OVA 종양 세포로 재-챌린지하였다. 재-챌린지는 오브알부민 항원을 발현하는 E.G7-OVA 종양 세포를 이식시킨 부위에서 OT-1 세포 확장을 유도함으로써 종양 성장을 효과적으로 제어하였다(도 21). 도 21에서의 결과는 거부된 종양이 초기 OT-1 T 세포 전달 후 149일째에 종양 재-챌린지에 대해 내성이었음을 입증한다.
기억 반응(recall response)의 잠재능을 평가하기 위하여, OT-1 세포의 수를 종양 재-챌린지 전 0일째(초기 입양 전달 후 149일째) 및 재-챌린지 후 5일, 12일, 20일, 및 27일째에 혈액 속에서 평가하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 초기 입양 전달 후 149일째에, Cb1 억제제 또는 Cb1 억제제와 IL-2의 조합으로 확장시킨 OT-1 세포는 혈액 속에서 보다 더 높은 수로 나타나며, 이는 생체 내에서 지속하는 보다 우수한 능력을 나타낸다.
Cb1 억제제(단독 또는 IL-2와 함께)로 확장시킨 기억 OT-1 세포의 기억 반응을 평가하기 위해, OT-1 세포의 수를 종양 재-챌린지 후 5일, 12일, 20일, 및 27일째에 혈액 속에서 평가하였다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, Cb1 억제제, 또는 Cb1 억제제와 IL-2의 조합으로 시험관내 확장시킨 OT-1 세포는 5일째에 혈액 ml 당 보다 높은 수의 OT-1 세포에 의해 입증된 바와 같이, IL-2 단독으로 확장시킨 OT-1 세포와 비교하여 유의적으로 보다 신속한 기억 반응을 증가시킬 수 있다.
실시예 9: Cb1 억제제로 확장시킨 세포의 표현형
Cbl 억제제의 존재하에서 배양시킨 세포를 집중적으로 특성화하였다.
초기 연구는 난소 및 CRC 종양 조직(평균 약 0.5 내지 0.8g)을 사용한 TIL 확장을 포함하였다. 이를 다수의 조각(크기가 대략 2mm3)으로 단편화하고, 24 웰 플레이트 당 하나의 단편을 가하였다. 이러한 단편을 6000IU IL-2 또는 6000IU IL-2 + 1uM 화합물 103 속에서 신속한 확장(예비-REP) 전에 28일 동안 배양하였다. 이후에 웰을 처리하여 혼주시키고 총 세포 수를 유 세포 분석법으로 평가하였다. TIL 확장 후 세포의 표현형을 특성화하였다. 이는 대부분 CD45RO+ 및 CD4+ 및 CD8+이었다. 도 23a에서, CD4의 %에 있어서 감소가 존재하였다. 도 24b에서, 세포 내 CD8에서 상응하는 증가가 존재하였다. 둘 다를 IL-2 단독과 비교하여 IL-2 + 화합물 103으로 확장시켰다. 이는 Cbl 억제제가 다수의 종양에서 CD8 T 세포를 선택적으로 확장시킴을 나타낸다.
암 조직 단편의 28일 생체 외 배양 후 수득된 신선한 난소 및 결장 암 조직으로부터 직접 유래된 TIL(신선함, n = 8)을 유 세포 분석법으로 분석하였다. 도 24는 CD8 + CD45RO + 중에서 중심 기억(CD45RO + CCR7 + ) 및 효과기 기억(CD45RO + CCR7 -) 표현형 각각의 퍼센트를 나타내는 FACS 데이타를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계적 유의성은 3-테일 윌콕슨 윌콕슨 부호 순위 검정(*, p < 0.05)을 사용하여 계산하였다. CD8 T 세포는 T 세포 분화 표현형 마커; CCR7 및 CD45RO를 평가함으로써 추가로 특성화하였다. 중심 기억 T 세포(CCR7+CD45RO+ 세포)의 유의적인 증가가 IL-2 단독과 비교하여 IL-2 + 화합물 103으로 확장시킨 TIL에서 관찰되었다(도 24). 이는 거의 분화되지 않은, 지속성 T 세포의 확장을 나타낸다.
암 세포 단편의 14일 생체 외 배양 후 수득된 신선한 난소, 결장 및 유방 암 조직으로부터 직접 유래된 TIL(신선함,　n　= 7)을 유 세포 분석법으로 분석하였다. 종양을 단편화하고 5개의 단편을 50ml 용적 속에서 IL-2 또는 IL-2 + 화합물 103을 함유하는 GREX 10 플라스크에 14일 동안 가하고, 세포를 5일 마다 공급하였다. CD8 T 세포에 집중하여, IL-2 + 화합물 103을 사용한 CD8 T 세포의 증가된 확장 및 CD8 T의 %(도 25a) 및 총 수(도 25b)를 관찰하였다.
암 조직 단편의 14일의 생체 외 배양물로부터 수득한 신선한 난소, 결장 및 유방 암으로부터 직접 유래된 TIL을 유 세포 분석법으로 분석하였다. 도 26은 CD8 + CD45RO + 중에서 중심 기억 (CD45RO + CD8+) 및 효과기 기억(CD45RO+ CD8-) 표현형의 퍼센트를 나타내는 FACS 데이타를 제공한다. FACS 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 이는 흑색으로 강조된 것으로서 중심 기억 세포의 유의적인 증가를 입증한다.
확장된 TIL이 세포외 자극에 대해 반응할 수 있는지를 시험하기 위해, TIL을 분비 억제제 및 항-CD107a의 존재 하에서 6시간 동안 항-CD3/CD28로 자극시켰다. 6시간 후, T 세포의 탈과립화 및 세포독성 활성과 관련된, CD107a의 표면 발현에서 명확한 증가가 관찰되었다. 자극 시, IL2로 확장시킨 CD8+ TIL의 평균 40%는 CD107A 발현에 대해 양성이며, IL2 + 화합물 103로 확장시킨 CD8+　TIL의 60% 초과가 CD107a를 생산할 수 있었다(도 27a). 자극 시, IL2로 확장시킨 CD4+ TIL의 평균 50%는 CD107A 발현에 대해 양성이고, IL2 + 화합물 103으로 확장시킨 CD4+　TIL의 60% 초과는 CD107a를 생산할 수 있었다(도 27b).
세포독성의 맥락에서, 세포자멸사를 매개하기 위해 분비된 프로테아제인, 그랜자임 B(Grb)를 평가하였다. 자극 시, IL-2 단독과 비교하여 IL-2 + 화합물 103으로 확장시킨 TIL에서 생산된 Grb의 유의적인 증가가 존재하였다(도 28a). CD107A+GRB+ 세포를 또한 평가하였고, 다시 IL-2 + 화합물 103으로 확장시킨 세포 내에서 유의적인 증가가 자극시 관찰되었다(도 28b). 이로부터, 본 발명자는 Cbl 억제제가 세포독성 잠재능을 증가시키면서 TIL을 확장시키는 것으로 여겨진다고 결론지었다.
또한 GREX 내 14일 확장 동안 분비된 사이토킨 및 케모킨을 평가하였다. IL-2 + 화합물 103로 확장시킨 플라스크에서, IFN-γ의 유의적인 증가가 존재하였고, 증가 경향성이 GMCSF, MIP1α, MIP1β 및 IP10에서 관찰되었다(도 29).
Cbl 억제제의 첨가로, 관찰은 증가된 수의 세포, 사이토킨 분비로 입증된 바와 같이 이것이 기능하는 측면에서 보다 강력할 수 있는, 잠재적으로 보다 우수한 품질의 보다 지속적인 중심 기억 T 세포, 및 그랜자임 B의 증가된 발현 및 탈과립화 마커 CD107A를 포함하였다. 이는 고형 종양 징조가 있는 환자에 대한 새로운 임상 접근법을 뒷받침한다.
처리된 세포에서 화학유인물질 분비를 평가하기 위해, 다수의 종양 징후로부터 고 용량의 IL-2 +/- 1 μM 화합물 103 어느 하나로 GREX10에서 확장시킨 1 x 105개의 TIL(n=10)을 24시간 동안 +/- 항-3/CD28로 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 Luminex로 평가하였다. IL-2 및 화합물 103으로 확장시킨 TIL은 자극시 MIP1α(도 30a) 및 MIP1β(도 30b)의 분비에서 유의적인 증가를 나타내었다.
처리된 세포에서 사이토킨 분비를 평가하기 위해, 다수 종양 징후로부터 고 용량의 IL-2 +/- 1 μM 화합물 103으로 GREX10에서 확장시킨 1 x 105 TIL(n=10)을 24시간 동안 +/- 항-3/CD28로 24시간 동안 배양하였다. IL-2 및 화합물 103으로 확장시킨 TIL은 자극시 IL-2, IL-5, IL-7, IL-21, IL-23, TNF-α, 및 IFN-γ의 유의적인 분비를 나타내었다(도 31).
CDR3 다양성을 평가하기 위하여, 대표적인 유방(breast) TIL을 고 용량의 IL-2(도 32a), 고 용량의 IL-2과 화합물 103(도 32b) 또는 화합물 103 단독(도 32c)으로 확장시켰다. TIL을 14일 동안 GREX10 속에서 배양하였다. IL-2 +/- 화합물 103으로 확장시킨 TIL의 총 RNA를 단리하고 RT-PCR 및 서열 분석에 iRepertoire(Huntsville, 미국 앨리바마주 소재)에 의해 적용시켰다. 미가공 데이타(raw data)를 iRepertoire에 의해 변형된 Smith-Waterman 알고리즘을 지닌 IRmap 프로그램을 사용하여 분석하였다. CDR3algerbra 소프트웨어를 사용하여, 나타낸 처리로 샘플에 걸쳐 공유된 CDR3의 계산을 평가하였다. 데이타를 CDR3의 빈도로 필터링함으로써 원래의 데이타에서 예비-세트 빈도로 공유된 CDR3 서열 만을 나타내도록 하였다. 모든 CDR3 빈도를 1000만개의 판독물로 규모를 증가시켜 샘플 중에서 판독물 깊이에서의 차이에 대해 설명하였다. 데이타를 표준화함으로써 각각의 uCDR3-VDJ 조합을 판독물 수와 상관없이 1의 품질로 처리한 다음, V 용법 및 J 용법에 대해 분석하였다. 유일한 CDR3이 화합물 103 그룹에서 증가하였다.
실시예 10: Cb1 억제제로 확장시킨 세포의 표현형
화합물 안정성을 평가하기 위하여, 1일째에, 1 μM 화합물 103 또는 DMSO를 가하여 10% 사람 혈청을 함유하는 완전 RMPI에 가하고 4℃, 22℃ 또는 37℃에서 11일 기간에 걸쳐 저장하였다. 화합물 103의 농도를 각각의 나타낸 시점 및 저장 온도에서 질량 분광법으로 평가하였다. 화합물 103은 RPMI 배지 속에서 적어도 11일 동안 안정하였다(도 33).
배양물 속에서 화합물 안정성을 평가하기 위하여, TIL을 1 μM의 화합물 103의 존재 하에서 배양하고, 이를 14일에 걸쳐 4일마다 순차적으로 가한 후 PBS 속에서 2회 세척하였다(W1: 세척 1, W2: 세척 2). 화합물 103의 양을 초기 배지에서, 및 순차적인 세척 둘 다 후 재현탁 완충제(W1&W2), 및 세포 펠렛 분해물(최종 생성물) 속에서 측정하였다(도 34). 화합물 103의 잔류량은 생성물에 대한 약리학적 효과 수준(pharmacological effect level)(PEL) 미만이었다.
실시예 11: 확장 프로토콜
-1일째에, 종양 조직을 수거하고 단편화하였다. 0일째에, 세포를 10% 혈청과 화합물 103 및 IL2(6000 IU)가 보충된 RPMI 배지 속에서 확장시켰다. 4일째에, 화합물 103을 가한다. 7일째에, 화합물을 다시 가한다. 11일째에, 세포를 수거한다. 11일째에, 신속한 확장을 수거된 세포와 화합물 103, IL-2(3000 IU), 및 임의로 OKT3 및 임의로 조사된 말초 혈액 단핵 세포로 개시하였다. 16일째에, 화합물 103 및 IL-2(3000 IU)를 가한다. 22일째에, 확장된 세포를 수거하고 주입을 위해 준비하였다. 24일째에, 세포를 환자에게 투여하였다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허, 특허원은 각각의 개개 공보 또는 특허원이 구체적으로 및 개별적으로 참고에 의해 포함된 것으로 나타난 경우와 같이 참고에 의해 본원에 포함된다. 특허청구된 주제는 다양한 구현예의 측면에서 기술되었지만, 기술자는 다양한 변형, 치환, 누락, 및 변화가 이의 취지로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 주제의 범위는 이의 등가물을 포함하는, 다음의 청구범위의 영역에 의해서만 제한된 것으로 의도된다.

Claims (42)

  1. a. 면역 세포를 시험관 내(in vitro)에서 Cbl 억제제의 존재 하에서 배양물 속에서 확장된 세포(expanded cell)의 실질적인 수가 제1의 확장에서 생산되는 조건 하에서 확장시키는 단계를 포함하는, 확장된 면역 세포를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1의 확장 단계를 포함하고 추가의 확장 단계를 포함하지 않는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1의 확장 단계 a 및 하나 이상의 추가의 확장을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1의 확장이 8 내지 12일 동안인, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 제2의 확장이 8 내지 12일 동안이고 추가의 확장이 없는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 3 내지 5일 마다 배양물에 첨가되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 제1 확장의 0일, 4일, 및 7일째에 또는 약 0일, 약 4일, 및 약 7일째에 배양물에 첨가되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 제2의 확장 단계의 0일 및 5일째에 또는 약 0일 및 약 5일째에 배양물에 첨가되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 IL-2를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2가 0일째에 제1의 확장에 첨가되고 0일 및 5일째에 제2의 확장에 첨가되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 면역 세포의 표면 수용체에 결합하는 구성성분(component)을 포함하지 않는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 항-CD3 항체 또는 OKT3을 포함하지 않는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이, 첨가된 공급인자 세포(added feeder cell)를 포함하지 않는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이, 첨가된 조사된(added irradiated) 말초 혈액 단핵 세포를 포함하지 않는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이, 첨가된 4-IBB 작용제(agonist)를 포함하지 않는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 공여체로부터 수거(harvesting)되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 종양 또는 종양 단편으로부터 유래되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 종양 침윤 림프구인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011개의 확장된 면역 세포를 생산하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 면역 세포가 추가의 확장없이 치료요법에서 사용될 수 있는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 면역 세포가 전염증성 사이토킨(proinflammatory cytokine)을 분비하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 분비된 전염증성 사이토킨이 IL-2인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 분비된 전염증성 사이토킨이 IFNγ인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 확장의 길이가 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 확장의 길이가 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 확장의 길이 모두가 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 가스 투과성의 신속한 확장 세포 배양 막을 포함하는 배양 용기 속에서 시험관 내 확장되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 G-RexTM 용기 속에서 시험관 내 확장되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl-b 억제제가 0.5 내지 50 μM의 농도에 있는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 cCbl, Cbl-b, 및 Cbl-c로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소의 활성을 억제하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 Cbl-b의 활성을 억제하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Cbl 억제제가 소 분자(small molecule), 펩타이드, 항체, 또는 핵산인, 방법.
  34. 제24항에 있어서, Cbl 억제제가 하기 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 이 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    Figure pct00054
    화학식 (A)
    상기 화학식 (A)에서:
    R1은 H, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴, C1-C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1-C6 알킬-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴)이고;
    Figure pct00055
    는
    Figure pct00056
    또는
    Figure pct00057
    이고:
    Z1은 CH 또는 N이고;
    Z2는 CH 또는 N이고;
    Z3은 CH 또는 N이고;
    X는 CH 또는 N이고;
    R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴), -NH-(C1 내지 C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3- 내지 6-원의 헤테로사이클릴), -O-(C1 내지 C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
    R3a는 H, 할로, 또는 C1 내지 C6 알킬이고;
    R3b는 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 4- 내지 8-원의 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하며, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹으로 임의 치환되거나;
    R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
    n은 0 또는 1이고;
    Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이며, 단, R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로인 경우, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
    Q는 CH 또는 N이고;
    R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    R10은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 할로알킬이거나; R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
    각각의 R12는 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 게미날(geminal) R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성할 수 있다.
  35. 제24항에 있어서, Cbl 억제제가 화합물 101 내지 129로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소 분자(small molecule), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매화물인, 방법.
  36. 제24항에 있어서, Cbl 억제제가 펩타이드인, 방법.
  37. 제24항에 있어서, Cb1 억제제가 항체인, 방법.
  38. 제24항에 있어서, 핵산이 siRN인, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 확장된 면역 세포를 포함하는 조성물.
  40. 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제29항에 따른 조성물을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 T 세포 기능장애(T cell dysfunction)를 치료하는 방법.
  41. 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제29항에 따른 화합물을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암(cancer)을 치료하는 방법.
  42. 제31항 또는 제32항에 있어서, 환자에게 Cb1 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물을, 치료를 향상시키기에 효과적인 양으로 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
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