KR20220068227A - 입양 세포 요법에 사용하기 위한 cbl 억제제 및 조성물 - Google Patents

입양 세포 요법에 사용하기 위한 cbl 억제제 및 조성물 Download PDF

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KR20220068227A
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cell
inhibitor
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아서 티. 샌즈
제니파 고슬링
사라 앤 웰란
크리스티아나 귀두치
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누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

세포-기반 면역요법의 효능을 증가시키기 위해 면역 세포의 생착을 지지하기 위한 신규한 Cbl 억제제를 사용하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 세포-기반 면역요법에 사용하기에 바람직한 세포의 증식을 위한 신규한 Cbl 억제제를 사용하는 세포-기반 면역요법 방법 및 조성물이 또한 제공된다.

Description

입양 세포 요법에 사용하기 위한 CBL 억제제 및 조성물
교차 참조
본 출원은 2019년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 제62/905,124호, 2019년 12월 27일에 출원된 제62/954,323호, 2020년 1월 15일에 출원된 제62/961,596호, 2020년 2월 18일에 출원된 제62/978,254호, 2020년 5월 29일에 출원된 제63/032,462호의 이점을 주장하고, 이들 각각의 내용은 전체가 이로써 포함된다.
발명의 분야
본원에서 제공되는 것은 세포-기반 면역요법(immunotherapy)에서 Cbl 억제제의 사용과 관련된 방법이다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은, 예를 들어, 면역 세포 조성물의 제조, 및 T 세포 기능 장애 및 암의 치료를 위한 이들의 사용에 유용하다.
Cbl(카시타스 B-계통 림프종(Casitas B-lineage Lymphoma)) 단백질은 세포 신호전달, 단백질 유비퀴틴화 및 단백질 기질의 분해에 관여하는 유비퀴틴 리가제의 패밀리의 일부이다. 패밀리의 구성원은 RING 유형 E3 리가제 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함한다. Cbl-b는 면역 활성화의 음성 조절 인자로서의 이의 기능으로 인해 면역계에서 중요한 역할을 한다. Cbl-b는 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 고도로 발현되며, 발현은 CD28 및 CTLA-4 및 기타 공자극성 및 억제성 신호에 의해 엄격하게 조절되었다. 문헌[Lutz-Nicoladoni et al., Frontiers in Oncology, 5(58):1-14 (2015)]을 참조한다.
Cbl-b는 T 세포 활성화의 부정적인 조절에 필수적인 역할을 한다. T 세포는 통상적으로 활성화를 위한 2개의 신호를 필요로 하고, 하나는 T 세포 수용체와 MHC 분자에 의해 제공된 펩티드의 상호작용에 의해 제공되고, 둘째는 항원 제시 세포 상의 공자극성 분자를 통해 제공된다. Cbl-b는 NK 세포의 활성화 및 이펙터 기능에 중요한 역할을 한다. B 세포에서, Cbl-b는 클러스터링된 B 세포 항원 수용체(BCR)에 동원되며, 세포내 이입된 BCR의 후기 엔도솜으로의 진입에 필요하다. 문헌[Veselits et al., PLOS One, 9(3):e89792 (2014)]을 참조한다. 골수 세포에서 Cbl-b의 활성은 완전히 특성화되지 않지만, TLR 신호전달의 음성 피드백 루프에서의 역할을 포함하고, 지방산에 의한 대식세포의 활성화를 조절한다.
연구에 따르면, Cbl-b 결핍 T 세포는 항원 인식 수용체 및 공자극성 분자(예: CD28)에 의한 활성화를 위한 낮은 임계값을 나타낸다는 것이 발견되었다. 예를 들어, T 세포에서 Cbl-b의 손실은 T-세포 활성화 및 증식 동안 CD28 공자극을 위한 요건을 분리시킨다. 문헌[Bachmaier, K. et al., Nature, 403(6766):211- 216 (2000)]을 참조한다. 이러한 Cbl-b-/- T 세포는 T 세포가 기능적으로 불활성화되고 T-세포 증식이 크게 손상되는 내성 메카니즘인 T-세포 아네르기에 대해 크게 내성이 있다. 문헌[Jeon et al., Immunity, 21(2):167-177 (2004) and Schwartz et al., Annu Rev Immunol., 21:305-34 (2003)]을 참조한다. 이 제안을 지지하는 증거는 Cbl-b 녹아웃 마우스에서 Cbl-b의 손실이 T-세포 내성의 유도 장애 및 자가면역의 악화를 초래한다는 사실을 포함한다. 문헌[Jeon et al., Immunity, 21(2):167-177 (2004)]을 참조한다. 중요하게는, 마우스에서 Cbl-b의 손실은 주로 세포 독성 T 세포에 의존하는 강력한 항종양 반응을 또한 초래했다. 한 연구는 Cbl-b-/- CD8+ T 세포가 T 조절 세포-매개 억제에 내성이 있고, 향상된 활성화 및 종양 침윤을 나타냄을 보여주었다. 나이브 Cbl-b-/- CD8+ T 세포의 치료적 전달은 확립된 종양의 거부를 매개하기에 충분하였다. 문헌[Loeser et al., J. Exp . Med., 204(4):879-891 (2007)]을 참조한다. 최근 연구는 Cbl-b도 또한 NK 세포의 활성화에서 역할을 하는 것으로 나타났다. Cbl-b의 유전적 결실 또는 이의 E3 리가제 활성의 표적화된 불활성화는 NK 세포가 마우스 모델의 전이성 종양을 자발적으로 거거부하도록 하였다. 문헌[Paolino et al., Nature, 507(7493):508-512]을 참조한다.
입양 세포 요법(ACT)은 전이성 흑색종(metastatic melanoma), 신경교종(glioma), 및 신장 암종(renal carcinoma)을 포함하여 달리 치료 내성 암(treatment-resistant cancer)에 사용된다. ACT에서, 환자 자신의 혈액 또는 종양 조직으로부터 NK 세포 또는 T 세포를 채취(harvesting)한 다음, 실험실에서 대량으로 증식시킨 후, 확장된 세포를 환자에게 다시 이동시켜 암에 대한 환자의 면역계의 반응을 향상시킨다. ACT의 일부 버전에서, T 세포 또는 NK 세포는 유전자 공학을 사용하여 변형시켜 환자의 암 세포를 표적으로 하여 암 세포를 보다 효율적으로 사멸시킬 수 있도록 한다. 입양 세포 요법의 유형은 자연 살해(NK) 세포 요법, 종양 침윤성 림프구(TIL) 요법, 조작된 T-세포 수용체 요법(TCR), 및 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR T) 요법을 포함한다.
명칭에서 알 수 있듯이, NK 세포 요법은 선천적 면역계의 일부이며 암 세포를 포함한 감염과 질환에 대한 첫 번째 방어 라인인 NK 세포를 사용한다. NK 세포는 건강한 세포와 바이러스 감염되거나 자연적으로 형질전환된 세포를 구별할 수 있는 이들의 선천적인 능력 때문에 세포 기반 면역요법을 위한 매력적인 도구이다. NK 세포 요법은 입양 자가(autologous) 또는 동종이계 세포 요법을 포함하며, 여기서 NK 세포는 조혈 줄기 세포 이식을 지지하는 데 사용된다. 세포는 치료 전에 환자로부터, 관련 공여체(donor)로부터 수득되거나, 또는 부분적으로 HLA-일치된 동종이계 NK 세포이다. 입양 전이 세포 요법은 또한 공여체, 환자, 제대혈, 분화 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포로부터의 NK 세포와 함께 사용된다.
TIL 요법은 환자의 종양 조직으로부터 TIL의 단리 및 확장을 포함한다. 침윤성 면역 세포는 종양의 성장과 진행을 조절하는 역할을 할 수 있지만, 역설적으로 종양이 번식할 수 있는 면역억제 환경을 생성하는 것을 도울 수 있다. 문헌[Schreiber, Science; 331(6024):1565-70(2011)]을 참조한다. 종양 면역 회피의 중요한 메커니즘은 종양 세포 및 침윤성 면역 세포 모두에서 CTLA-4 및 PD-L1과 같은 면역 체크포인트 조절제의 발현이다. 이러한 신호전달 경로를 차단함으로써, 면역 체크포인트 억제제는 숙주의 면역계를 재활성화하여 종양을 인식하고 제어할 수 있고; 이것은 몇 가지 현재 요법의 작용 메커니즘이다. 문헌[Pardoll, Nat. Rev. Cancer, 12(4):252-64 (2012), and Salgado et al., Adv . Anat . Pathol., 24(5):235-251, 및 24(6):311-335 (2017)]을 참조한다.
FDA에 의해 획기적인 요법 지정을 받고 있는 LN-145 요법은 재발성, 전이성 또는 지속적인 자궁경부암 환자를 치료하기 위한 TIL 요법이다. LN-145 요법 단계 II 임상 연구에서, 종양 조직은 환자로부터 수술적으로 단리되고, TIL이 단리되고 3주 동안 확장되는 GMP 시설로 보내진다. 주입 1주일 전에, 환자는 -8일 및 -7일째에 사이클로포스파미드 IV, -6일 내지 -2일째에 플루다라빈 IV, -1일째에 펨브롤리주맙(인간화 항-PD-1 항체)의 투여를 포함하는 사전 조정 요법(preconditioning therapy)이 제공된다. 그 후, 환자는 자가 확장된 TIL에 이어, +1 내지 +4일째에 알데스류킨 IV를 받는다. 그 후, 환자는 질환의 진행 또는 허용될 수 없는 독성의 부재하에 12개월 동안 21일마다 펨브롤리주맙의 주기를 받는다.
TCR 요법은 친화도 향상된 종양 특이적 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 발현시키고, 이에 의해 암 세포를 사멸시키는 T 세포의 유전 공학을 포함한다. 간략하게, 자가 T 세포는 성분채집술을 통해 수집되고, 예를 들어, 특정 종양 항원을 인식하는 T 세포를 발현하기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용하여 시험관내에서 형질전환된다. 형질전환된 세포는 환자에게 주입되기 전에 시험관내에서 확장된다. 재주사 7일 전에, 환자는 림프구 클리어런스(clearance)를 위해 저용량의 사이클로포스파미드 및 저용량의 플루다라빈을 받는다. 확장된 TCR-T 세포의 주입 후(1회 또는 단계적으로), IL-2는 14일 동안 피하 투여된다(250,000IU/2회/일). 이 요법은 효과적이지만 항원이 건강한 조직에서도 발현되는 경우 악영향을 일으킬 수 있다.
키메라 항원 수용체 요법(CAR T)은 환자의 T 세포를 사용하고, 이는 항원 결합 도메인, 전형적으로 단쇄 가변 단편, 및 CD19, CD28 또는 CD137과 같은 수용체로부터의 추가의 세포내 공자극 도메인으로 구성된 키메라 T 세포 수용체를 발현하도록 채취되어 유전적으로 조작된다. CAR T-기반 세포 요법의 하나의 장점은 CAR T 세포가 (TIL- 및 TCR-기반 세포 요법과는 대조적으로) MHC에서 발현되는 인식된 항원의 부재하에서도 암 세포에 결합할 수 있다는 것이다. CAR T-기반 세포 요법은 재발 암의 치료에 FDA 승인되었다. 예를 들어, KYMRIAH®(티사겐렉류셀)은 소아 및 젊은 성인의 재발/난치성 B-세포 급성 림프모구성 백혈병(B-세포 ALL)의 치료용으로 FDA 승인되었다. 환자 T 세포는 제거되고, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하여 뮤린 항-CD19 단쇄 항체 단편(scFv) 및 T 세포 신호전달(CD3-ζ) 및 공자극성(4-1BB) 도메인을 함유하는 세포내 부분을 포함한 CAR을 발현시킨다. 악시캅타진 실로류셀(YESCAR TA®)은 적어도 2개의 전처리 섭생을 받은 후에 암이 진행된 거대-B 세포 림프종을 갖는 성인을 위한 FDA 승인된 CAR T-기반 세포 요법이다. T 세포는 백혈구 성분채집술을 통해 환자로부터 제거되고, 시험관내에서 형질도입되어 CD3-ζ 및 CD28 유전자로부터 유래된 2개의 신호전달 도메인에 연결된 CD19에 대한 특이성을 갖는 뮤린 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 CAR을 발현시킨다.
현재 CAR T-기반 세포 요법은 다수의 제한을 갖는다. T 세포가 너무 적어서 공여할 수 없는 환자에게는 효과적인 요법이 아닐 수 있다. 표적 항원을 발현하는 정상 세포와의 교차 반응성도 문제가 될 수 있다. 또한, CD19 CAR T 세포로 1개월 내에 관해를 달성한 대형 B 세포 림프종 환자의 약 30 내지 50%가 궁극적으로 재발한다. 문헌[Shah and Fry, Nat. Rev. Clin . Oncol. 16:372-385 (2019)]을 참조한다. 마지막으로, CAR T-기반 세포 치료는 고형 종양(solid tumor)에 대해 낮은 효능을 나타낸다.
CAR-NK 세포 요법은 환자의 제대혈, 건강한 공여체, 줄기 세포 또는 NK 유래 세포주로부터의 NK 출발 물질의 선택적 확장을 포함한다. NK 세포는 CD3+ T 세포의 고갈과 CD56+ 세포의 긍정적인 선택에 의해 세포 집단(population) 내에서 농축된 다음, 피더 세포와 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-12 및 IL-18을 포함하는 사이토카인의 존재하에 선택적으로 확장된다. 이어서, 이들은 IL-2의 존재하에서 최종 확장 전에, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스, 트랜스포존 또는 CRISPR을 사용하여 유전 공학에 적용된다. 세포는 다시 한번 CD3+ T 세포를 고갈시키고, 환자에게 주입용으로 제형화되거나 미래 주입을 위해 냉동 보존된다. 문헌[Trager, Cell and Gene Therapy Insights, 5(5):585-600 (2011)]을 참조한다. 동종이계 CAR-NK 세포의 최근 단계 1 및 2 시험은 11명의 환자 중 7명에서 림프종 또는 만성 림프성 백혈병의 완전한 관해를 입증했다. 문헌[Liu et al., 2020, N. Engl. J. Med. 382:545-553]을 참조한다.
상기한 세포 기반 면역요법의 가능성에도 불구하고, 특히 기준선에서 결함이 있는 면역 세포의 수가 적은 집중적으로 치료된 대상체로부터의 면역 세포를 수집 또는 제조할 수 없기 때문에 많은 환자는 이들로부터 이익을 얻을 수 없다. 충분한 수의 면역 세포를 제조할 수 있는 환자라도 이들의 임상 결과는 유출된 면역 세포의 생착을 개선하거나 이들의 반응의 내구성을 증가시킴으로써 개선될 수 있다. 따라서, 보다 효과적인 면역 세포 요법이 필요하다.
일부 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 Cbl 억제제에 의한 세포 요법의 향상을 위한 방법 및 조성물이다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 채취 전에 생체 내에서 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체외에서 면역 세포의 초기 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체외에서 면역 세포의 급속한 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체외에서 면역 세포의 초기 확장을 향상시키고 면역 세포의 제2의 급속한 확장의 필요성을 제거한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 공자극의 부재하에서 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 환자에게 면역 세포의 주입을 받는 이점을 증가시킨다. 상기 방법은, 예를 들어, T 세포 기능 장애 및 암의 치료에 유용하다. 수술 이론에 의해 결부되는 것을 의도하지 않지만, 상기 방법은 Cbl 억제제가 기억 세포의 면역 세포 집단을 농축시켜 생체내 및 시험관내에서 면역 세포 반응의 내구성을 향상시킬 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 Cbl 억제제를 사용하여 생체내에서 면역 세포의 확장을 향상시키는 방법이다. 또 다른 측면에서, Cbl 억제제를 사용하여 생체외에서 면역 세포의 확장을 향상시키는 방법이 본원에서 제공된다. 다른 측면에서, 본원에 제공된 것은 본원에 제공된 방법에 의해 향상된 면역 세포이다. 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 면역 세포를 포함하는 조성물이다. 또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 면역 세포 또는 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법이다. 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 Cbl 억제제의 병용 투여에 의한 면역 세포 또는 조성물의 투여를 향상시키는 방법이다. 또 다른 측면에서, 이들 측면 중 어느 하나 또는 모두가 조합된다.
유용한 Cbl 억제제는 cCbl, Cbl-b 및/또는 Cbl-c 효소의 활성을 억제하는 화합물을 포함한다. Cbl 억제제는 소분자, 펩티드, 항체 또는 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 화학식 A에 따른 화합물 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A]
Figure pct00001
상기 화학식 A에서,
R1은 H, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3원 내지 6원 헤테로사이클릴, C1-C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1-C6 알킬-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴)이고;
Figure pct00002
는
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
이고;
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
Z3은 CH 또는 N이고;
X는 CH 또는 N이고;
R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -NH-(C1-C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -O-(C1-C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
R3a는 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고;
R3b는 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; 또는 R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 4원 내지 8원 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹에 의해 임의로 치환되고; 또는
R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
n은 0 또는 1이고;
Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이고, 단 R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로이면, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
Q는 CH 또는 N이고;
R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R10은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 할로알킬이거나; 또는 R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; 또는 R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
각각의 R12는 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 제미널(geminal) R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성한다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 본원에 기재된 화합물 101-129로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 항체이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 펩티드이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 siRNA이다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태(condition)를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 촉진하기에 적합한 조건하에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체로부터 순환 면역 세포를 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체의 종양 또는 이의 일부로부터 수득된 면역 세포를 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취된 면역 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 또는 두 단계로 생체외에서 상기 공여체로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 특정 구현예에서, 제2 단계는 급속한 확장 단계이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 확장 단계는 하나 이상의 Cbl 억제제의 존재하에 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 하나 이상의 Cbl 억제제와 조합된다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체로부터 종양 또는 이의 일부를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 촉진하기에 적합한 조건하에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 채취된 세포는 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 또는 두 단계로 생체외에서 상기 종양으로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 제2 확장 단계, 예를 들어, 급속한 확장 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체의 종양 또는 이의 일부로부터 면역 세포를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 채취된 세포는 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 또는 두 단계로 생체외에서 상기 종양으로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 단계는 Cbl 억제제의 존재하의 확장 단계이다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하의 제1 단계는 충분한 수의 효과적인 면역 세포를 산출하여 제2의 급속한 성장 단계가 필요하지 않다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 제2 확장 단계, 예를 들어, 급속한 확장 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체의 종양 또는 이의 일부로부터 면역 세포를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 채취된 면역 세포는 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 또는 두 단계로 생체외에서 상기 종양으로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에 제2 확장 단계, 예를 들어, 급속한 확장 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체의 종양 또는 이의 일부로부터 면역 세포를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 채취된 면역 세포는 유전적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 또는 두 단계로 생체외에서 상기 종양으로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 단계는 확장 단계이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 제2 확장 단계, 예를 들어, 급속한 확장 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 면역 세포의 효능을 향상시키기 위해 충분한 양의 Cbl 억제제를 투여하는 단계와 조합하여 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 내구성을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 생착을 향상시킨다.
특정 구현예에서, 전술한 방법 중 어느 하나가 조합된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취하기 전에 Cbl 억제제를 공여체에게 투여하고, Cbl 억제제의 존재하에 제1 확장을 수행하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취하기 전에 공여체에 Cbl 억제제를 투여하고, 제2의 급속한 확장을 수행하지 않는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, Cbl 억제제의 존재하에 제1 확장을 수행하고, 제2의 급속한 확장을 수행하지 않고/않거나 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에 제1 확장을 수행하고, 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, Cbl 억제제의 존재하에 제1 확장을 수행하고, 제2의 급속한 확장을 수행하지 않는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, Cbl 억제제의 존재하에서 제1 확장을 수행하고, 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, 제2의 급속한 확장을 수행하지 않고, 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에 제1 확장을 수행하고, 제2의 급속한 확장을 수행하지 않고, 확장된 면역 세포를 Cbl 억제제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체에서 면역 세포의 활성화 또는 확장을 촉진하기에 적합한 조건하에서 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체로부터 순환 면역 세포를 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취된 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생체외에서 공여체로부터 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체로부터 순환 면역 세포를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취된 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생체외에서 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 Cbl 억제제의 존재하에 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 확장된 면역 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 확장 방법, 조성물, 및 세포 치료 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 공여체로부터 순환 면역 세포를 채취하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 채취된 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생체외에서 면역 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포의 효능을 향상시키기에 충분한 양의 Cbl 억제제를 투여하는 단계와 조합하여 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 내구성을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 생착을 향상시킨다.
특정 구현예에서, 상기한 방법 중 어느 하나가 조합된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 순환 면역 세포를 채취하기 전에 공여체에게 Cbl 억제제를 투여하고, 채취된 면역 세포를 임의로 유전적으로 변형시키고, Cbl 억제제의 존재하에 확장을 수행하고/하거나 Cbl 억제제와 함께 확장된 면역 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
면역 세포는 당업자에게 유용한 것으로 간주되는 임의의 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 종양으로부터 또는 혈액 또는 혈장 내 순환 세포로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 종양 침윤성 림프구, T 세포, CAR-T 세포, TCR T 세포, 자연 살해 세포 및 NK-CAR 세포로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 특정 종양 항원의 존재를 위해 선택된 환자의 T 세포이다. 특정 구현예에서, 면역 세포는, 예를 들어, T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체의 존재를 위해 조작되고 선택된다. 상기 방법은 당업자에 의해 적절하다고 여겨지는 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 세포 생착(cell engraftment)을 향상시키는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 면역 세포 기능 장애를 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 T 세포 기능 장애를 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 재발성 또는 난치성 암의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 암 또는 T 세포 기능 장애의 치료를 위해 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 시험관내에서 면역 세포를 확장하는 방법이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 부재하에서보다 더 많은 기억 면역 세포가 생산되는 조건하에서 Cbl 억제제의 존재하에 시험관내에서 면역 세포를 확장하고, 임의로 확장된 세포를 임의로 Cbl 억제제의 존재하에 제2 라운드의 확장에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이며, Cbl 억제제의 부재하에서보다 더 많은 TSCM 및/또는 TCM이 생산된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 부재하에서보다 더 많은 TCM이 생산된다. 특정 구현예에서, 확장된 면역 세포는 제2 라운드의 확장에 적용되지 않는다. 특정의 다른 구현예에서, 확장된 면역 세포는 임의로 Cbl 억제제의 존재하에 제2 라운드의 확장에 적용된다.
다른 측면에서, 본원에 제공된 것은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 세포를 포함하는 조성물이다. 본원에 기재된 방법의 조성물은, 예를 들어, 암 및/또는 면역 세포 기능 장애의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 재발성 또는 난치성 암의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포는 암 또는 면역 세포 기능 장애의 치료를 위해 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 시험관내 세포 성장에 대한 IL-2의 부재 및 존재하에 Cbl 억제제의 효과를 나타내기 위해 인간 난소 및 결장 종양 단편으로부터 유래된 세포를 사용한 TIL 연구 결과를 제공한다. 도 1a는 10μM, 1μM 및 0.1μM의 Cbl 억제제 단독의 존재하에서 28일 동안 배양한 후 세포/웰의 수를 나타낸다. 도 1b는 28일 배양 후 10μM, 1μM 및 0.1μM의 Cbl 억제제 및 6000 IU IL-2의 존재하에서 배양 후 동일한 공급 재료로부터의 세포 수를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 IL-2의 부재하(도 2a) 및 존재하(도 2b)에서 0.1μM, 1.0μM 및 10μM의 Cbl 억제제의 존재하에서 11일 동안 확장 후 TIL에서 수행된 유세포 계측법 연구 결과를 제공한다.
도 3a 및 3b는 IL-2의 부재 및 존재하에서 0.1μM, 1.0μM 및 10μM의 Cbl 억제제의 존재하에 11일 확장 후 CD4+/IFNγ(도 3a) 및 CD8+/IFNγ(도 3b) TIL의 수준을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 상이한 환자의 종양으로부터 성장된 % 림프구를 나타낸다. 난소 종양에서 유래된 TIL은 DMSO(대조군), IL-2, 및 10μM, 1μM, 및 0.1μM의 Cbl 억제제 단독의 존재하에 및 IL-2와 조합하여 성장시켰다. 도 4a, 4b 및 4d는 3명의 개별 환자의 난소 종양으로부터 유래된 TIL 세포이다. 도 4c는 결장 종양 조직으로부터 유래된 TIL 세포의 결과를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 IL-2, Cbl 억제제 및 이들의 조합의 존재하에 배양된 결장 종양 유래(도 5a) 및 난소 종양 유래(도 5b) TIL로부터의 TIL 결과를 제공한다.
도 6은 TIL 배양물에 최적의 출발 물질을 결정하기 위한 연구 결과를 제공한다. 결장 종양의 종양 세포 현탁액 대 종양 단편을 사용한 연구에서, 11일 동안 종양 단편으로부터 성장된 배양물은 TIL 배양의 출발 물질로서 종양 세포 현탁액을 사용한 배양물보다 약 10배 더 높은 확장을 보였다.
도 7은 인간 결장 종양으로부터 유래된 TIL의 배양 후 중심 기억 표현형(CD45RO+)을 나타내는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 %에 대한 11일째 및 28일째 결과를 제공한다.
도 8은 0일째 또는 3일째에 IL-2 또는 Cbl 억제제의 첨가가 비교된 2개의 상이한 난소 종양 샘플로부터의 세포 확장을 위한 가스 투과성 규소 바닥을 갖는 가스 투과성 플라스크를 사용하는 7일째 결과를 제공한다. "A"는 0일째 IL-2 단독의 첨가이다. "B"는 0일째 IL-2 및 1μM의 Cbl 억제제의 첨가이다. "C"는 0일째 IL-2의 첨가 및 3일째 1μM의 Cbl 억제제의 첨가이다. "D"는 3일째 IL-2의 첨가 및 3일째 Cbl 억제제의 첨가이다. "E"는 0일째 Cbl 억제제의 첨가이다.
도 9는 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 한쪽 옆구리에 E.G7-OVA 세포가 피하 이식된 마우스에서 확립된 종양을 거부할 수 있는 강력한 이펙터임을 보여주는 결과를 제공한다.
도 10은 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도를 나타내고 혈액에서의 생체내 지속성을 나타냄을 보여주는 결과를 제공한다. 혈액 내 OT-1 세포는 전이 후 4일 또는 9일에 평가하였다. 비장에서 수득된 OT-1 세포가 분석되었을 때 유사한 데이터가 수득되었다.
도 11a 및 11b는 Cbl 억제제, IL-2, Cbl 억제제 + IL-2 및 대조군으로 확장된 CD8+ OT-1 세포의 투여 후 경시적 종양 용적을 제공한다.
도 12a 및 12b는 Cbl 억제제, IL-2, Cbl 억제제 + IL-2, 및 대조군으로 확장된 항-CD3 자극 OT-1 세포의 투여 후 경시적 종양 용적(도 12a) 및 조건부 생존율(도 12b)을 제공한다.
도 13a(전달 후 4일째) 및 도 13b(전달 후 22일째)는 Cbl 억제제를 사용하거나 사용하지 않고 확장된 OT-1 세포의 혈액 내 총 CD45+ 세포의 빈도 및 생체내 지속성을 제공한다.
도 14a 내지 c는 OT-1 세포 성장에 대한 Cb1 억제제의 효과를 나타낸다. 도 14a는 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 종양 내의 총 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도를 나타냄을 보여주는 결과를 제공한다. 도 14b 및 14c는 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 종양에서 고갈 마커 PD1 및 TIM3(도 14b) 및 PD1, TIM3 및 LAG3(도 14c)의 발현을 감소시킴을 나타내는 결과를 제공한다.
도 15는 Cbl 억제제를 사용하거나 사용하지 않고 확장된 채취된 OT-1 세포에서 펩티드 재자극에 반응한 총 CD45+ 세포의 빈도를 제공한다.
도 16a 내지 16c는 OT-1 세포 성장에 대한 Cb1 억제제의 효과를 나타낸다. 도 16a 및 16b는 Cbl 억제제를 사용하거나 사용하지 않고 확장된 펩티드-재자극 OT-1 세포의 다작용성(IFN-γ 및 TNF-α 이중 양성 세포)을 제공한다. 도 16c는 Cbl 억제제를 사용하거나 사용하지 않고 확장된 다작용성(IFN-γ 및 TNF-α 이중 양성) OT-1 세포의 고갈 마커(PD1 및 TIM3) 빈도를 제공한다.
도 17a 및 17b는 비장 세포로부터 채취된 펩티드-재자극 OT-1 세포에서 IFN-γ 및 IL2 생산을 제공한다. 도 17a는 재자극시 IFN-γ 생산을 제공한다. 도 17b는 재자극시 IFN-γ 및 IL-2 생산을 제공한다.
도 18은 화합물 116의 경구 투여와 함께 또는 없이 IL-2 및 화합물 103으로 확장된 OT-1 세포의 항종양 효능을 제공한다.
도 19는 화합물 116의 경구 투여와 함께 또는 없이 IL-2 및 화합물 103으로 확장된 OT-1 세포로 처리된 마우스의 생존을 제공한다.
도 20a(전달 후 5일째) 및 20b(전달 후 20일째)는 화합물 116의 경구 투여와 함께 또는 없이 IL-2 및 화합물 103으로 확장된 OT-1 세포의 총 CD45+ 세포의 빈도 및 생체내 지속성을 제공한다.
도 21은 Cbl 억제제로 시험관내 확장된 종양 항원 특이적 T 세포(OT-1 세포)가 이후 시점에서 종양 재도전으로부터 마우스를 보호할 수 있는 강력한 기억 세포가 됨을 입증한다.
도 22a는 초기 OT-1 T 세포 전달 후 149일에 IL-2 단독, Cbl 억제제 단독 및 IL-2와 Cbl 억제제의 조합으로 확장된 OT-1 세포의 생체내 지속성을 보여주는 결과를 제공한다.
도 22b는 Cbl 억제제 확장 OT-1 세포의 수가 종양 재도전 후 혈액에서 보다 급속하게 증가했음을 보여주는 결과를 제공한다.
도 23a 및 23b는 IL-2와 함께 Cbl 억제제를 첨가하면 24-웰 포맷에서 IL-2 단독과 비교하여 생체외 TIL 확장 동안 CD4+ T 세포를 감소시키고 CD8+ 세포를 증가시킴을 보여주는 결과를 제공한다. 도 23a는 기억 표현형 CD4+ T 세포(CD3+CD8-)의 백분율을 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. 도 23b는 CD45RO + 중에서 CD8+ T 세포(CD3+CD8+)를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 24는 Cbl 억제제의 첨가가 24-웰 포맷에서 IL-2 단독과 비교하여 생체외TIL 확장 동안 CD8+ 중심 기억 T 세포를 증가시킴을 보여주는 결과를 제공한다.
도 25a 및 25b는 Cbl 억제제가 GREX10 포맷에서 IL-2 단독과 비교하여 생체외 TIL 확장 동안 CD8+ 세포를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 도 25a는 CD45RO + 중에서 기억 표현형 CD8+ T 세포(CD3+CD8+)의 백분율을 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. 도 25b는 환자의 암 조직으로부터 14일간의 생체외 배양 후 수득된 CD8+TIL의 총 수를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 26은 Cbl 억제제가 GREX10 포맷에서 IL-2 단독과 비교하여 생체외 TIL 확장 동안 CD8+ 중심 기억 T 세포를 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 27a 및 27b는 GREX10에서 확장된 pre-REP TIL이 비특이적 자극에 반응한 CD107a 동원에 의해 결정된 바와 같이 기능적임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소 및 유방(n=10)으로부터 유래된 CD8+ TIL(도 27a) 및 CD4+(도 27b) TIL은 유세포 계측법에 의해 분비 억제제 및 항-CD107a의 존재하에 6시간 동안 항-CD3/항-CD28 자극에 반응하는 CD107a+ 발현에 대해 평가하였다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산된다(*, p<0.05)
도 28a 및 28b는 GREX10에서 확장된 pre-REP TIL이 비특이적 자극에 반응하는 그랜자임+분비 및 그랜자임 B+CD107a+ 동원에 의해 결정된 바와 같이 기능적임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소 및 유방(n = 10)에서 유래된 CD8+ TIL은 유세포 계측법에 의해 분비 억제제의 존재하에 6시간 동안 항-CD3/항 CD28 자극에 반응한 그랜자임 B+ 단독(도 28a) 및 그랜자임 B+CD107a(도 28b) 발현을 평가하였다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 29는 pre-REP 확장 TIL이 고용량(6000IU/ml)의 IL-2 또는 고용량의 IL-2+1uM Cbl 억제제에 반응한 사이토카인 분비에 의해 결정된 바와 같이 기능적임을 나타내는 결과를 제공한다. 결장, 폐, 난소 및 유방(n=10)에서 유래된 TIL의 14일확장 동안 분비된 사이토카인을 Luminex를 사용하여 평가하였다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 30a 및 30b는 1μM의 Cbl 억제제와 조합된 고용량의 IL-2(6000IU/ml)로 확장된 TIL이 IL-2 단독과 비교하여 비특이적 자극에 반응하여 증가된 T 세포 화학유인물질 MIP1A(도 30a) 및 MIP1B(도 30b)를 분비함을 나타내는 결과를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 31은 고용량의 IL-2(6000IU/ml) 및 1μM의 화합물 103으로 확장된 TIL이 비특이적 자극에 반응하여 T 세포 성장 인자 사이토카인을 분비함을 나타내는 결과를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산되었다(*, p<0.05).
도 32a 내지 c는 Cbl 억제제가 치료 그룹 간에 공유되는 고유한 CDR3의 백분율을 증가시킴을 나타내는 결과를 제공한다. 그룹은 고용량의 IL-2(도 32a), 화합물 103과 함께 고용량의 IL-2(도 32b) 및 화합물 103 단독(도 32c)이었다.
도 33은 Cbl 억제제 화합물 103이 11일 기간에 걸쳐 복수의 온도(4℃-37℃)에서 안정하다는 것을 나타내는 결과를 제공한다.
도 34는 TIL 배양에서 Cbl 억제제의 안정성을 나타내는 결과를 제공한다.
정의
본원에 제공된 화합물 및 방법을 언급하는 경우, 하기 용어는 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 용어에 대한 복수의 정의가 있는 이벤트의 경우, 달리 명시되지 않는 한 이 섹션의 정의가 우선한다. 본원에 기재되거나 참조되는 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되며, 당업자에 의해 통상적인 방법론, 예를 들어, 문헌[참조: Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; and Rosenberg et al., J. Natl . Cancer Inst., 86(15):1159-1166 (1994)]에 기재된 널리 사용되는 분자 클로닝 방법론을 사용하여 통상적으로 사용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용과 관련된 절차는 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 제조자 정의 프로토콜 및 조건에 따라 수행된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다.
용어 "약"은 표시된 값 및 그 값의 상하 범위를 나타내며 이것을 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 ±10%, ±5%, 또는 ±1%를 나타낸다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 그 값의 1 표준 편차를 나타낸다. 로그 스케일인 경우, "약"은 지정된 값 ±0.1 또는 ±0.2 로그 단위를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "비정상적 세포 증식"은 과형성 또는 암 세포 증식을 포함한다. 암 세포는 혈액암 또는 본원에 기재된 것들과 같은 비혈액암으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 생체내 "활성화"는 생체내, 특히 면역 세포를 유효량의 Cbl 억제제와 접촉시켜 채취하기 전에 상기 개체(individual)의 면역 세포 집단의 활성을 조절하기 위한, 세포 기반 면역요법을 받고 있는 개체에서, 적합한 조건 세트를 제공함을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포, B 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다. 면역 세포는 순환 T 세포일 수 있다. 면역 세포는 종양 침윤성 림프구일 수 있다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 T-세포이고, T-세포의 조절 활성은 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈 및 감소된 T-세포 내성 중 하나 이상을 포함한다. 추가의 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 IL-2, IFN-γ, 및 TNFα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상과 같은 사이토카인의 생산 증가를 포함한다. 또 다른 추가의 구현에에서, 증가된 T-세포 활성화는 하나 이상의 CD25, CD69, 및 CD45RO와 같은 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, T-세포는 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합하여 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 NK 세포이고, NK 세포의 조절 활성은 NK 세포 활성화의 증가를 포함한다. 추가의 구현예에서, NK 세포 활성화의 증가는 IFN-γ와 같은 사이토카인의 생산 증가를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 B 세포이고, B 세포의 조절 활성은 증가된 B 세포 활성화(예: CD69의 증가 등)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다.
화합물, 예를 들어, Cbl 억제제, 또는 본 개시내용의 세포 집단과 연관된 "투여" 및 이의 변형(일부 구현예에서, 화합물 또는 세포 집단을 "투여하는")은 화합물 또는 화합물의 프로드럭, 또는 상기 화합물, 예를 들어, Cbl 억제제로 처리된 세포 집단을 세포의 활성화 또는 치료를 위해 동물의 시스템에 도입함을 의미한다. 본 개시내용의 화합물 또는 이의 프로드럭이 하나 이상의 다른 활성제(일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 집단의 주입, 수술, 방사선, 및 화학요법 등)와 조합하여 제공되는 경우, "투여" 및 이의 변형은 각각 화합물 및 다른 제제 또는 요소의 동시적 및 연속적 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "Cbl"은 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함하는 그룹으로부터 선택된 Cbl 단백질을 지칭한다. 이 용어는 또한 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함하여 이들 단백질의 천연 변이체를 포함한다. 이 용어는 또한 재조합 Cbl 단백질 또는 이의 절단된 변이체와 같은 이들 단백질의 비천연 변이체를 포함하며, 이는 일반적으로 천연 Cbl 또는 Cbl의 천연 변이체의 결합 능력(예: E2 효소에 결합하는 능력)을 보존한다.
본원에서 사용되는 용어 "Cbl 억제제"는 Cbl에 결합하고 Cbl 단백질의 활성 또는 기능을 억제하는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 Cbl-b의 활성을 억제하는 화합물이다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 공자극의 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있는 화합물이다.
생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 세포를 "접촉시키는"은 집단 내의 세포 또는 세포들을 특정 화합물, 분자, 또는 시약에 노출시키는 것을 지칭한다. 세포와 접촉될 수 있는 화합물은 사이토카인, 항체, 미토겐, 재조합 리간드 및 렉틴을 포함한다.
본원에서 사용되는 "공여체"는 포유동물이다. 본 개시내용의 방법에서 사용되는 면역 세포의 공급원의 목적을 위한 "포유동물"은 인간; 비인간 영장류; 가축 및 농장 동물; 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌, 마우스, 흰족제비, 래트, 고양이 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여체는 인간이다. "관련 공여체"는 치료를 받는 개체의 가까운 혈족이다. "살아 있는 무관한 공여체"는 치료를 받는 개체의 가까운 혈족이 아닌 개체이다.
"약물-향상 입양 세포 요법"은 입양 세포 요법에 사용하기 위해 채취될 세포의 양을 증가시키고, 시험관내에서 세포의 선택 및 확장에 필요한 시간을 단축시키고, 이를 필요로 하는 환자에게 주입하기 위한 입양 세포 요법에서 생성되는 세포의 수 및 내구성을 증가시키고/시키거나 이를 필요로 하는 환자에서 입양 세포 요법의 효능을 증가시키기 위한 하나 이상의 Cbl 억제제의 사용을 포함하는 입양 세포 요법을 지칭한다.
"약물-향상 키메라 항원 수용체 요법"은 입양 세포 요법에 사용하기 위해 채취될 세포의 양을 증가시키고, 시험관내에서 유전적으로 변형된 세포의 선택 및 확장에 필요한 시간을 단축시키고, 이를 필요로 하는 환자에게 주입하기 위한 유전적으로 변형된 세포의 수 및 내구성을 증가시키고/시키거나 이를 필요로 하는 환자에서 키메라 항원 수용체 요법의 효능을 증가시키기 위한 하나 이상의 Cbl 억제제의 사용을 포함하는 키메라 항원 요법을 지칭한다.
"약물-향상 TIL 요법"은 종양 단편으로부터 채취되는 세포의 양을 증가시키고, 시험관내에서 TIL의 선택 및 확장에 필요한 시간을 단축시키고, 이를 필요로 하는 환자에게 주입을 위해 생성되는 TIL의 수 및 내구성을 증가시키고/시키거나 이를 필요로 하는 환자에서 TIL 요법의 효능을 증가시키기 위한 하나 이상의 Cbl 억제제의 사용을 포함하는 종양 침윤성 림프구 요법을 지칭한다.
본원에 개시된 제제의 "유효량"은 구체적으로 기술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적이고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 제제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 유익한 임상 결과를 포함하여 유익한 결과와 같은 목적하는 생물학적 효과를 생성하기에 적합한 양이다. 일부 구현예에서, 용어 "유효량"은 개체(예: 인간과 같은 포유동물)의 질환 또는 장애를 "치료하는 데" 효과적인 제제의 양을 지칭한다.
"농축된" 세포 집단은 특정 표현형의 세포의 생존 또는 증식 또는 기능적 활성을 촉진시키는 시간 동안 정제, 선별 또는 조건(예: 특정 화합물 또는 분자의 존재하에서 시험관내 배양)에 노출되는 세포의 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 농축된 세포 집단은 정상적 조직 환경에서 발견되는 것보다 특정 세포 유형의 더 높은 농도 또는 비율을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포를 포함한다.
"면역 세포"는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 종양 침윤성 림프구, T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "성장을 억제한다"(예: 종양 세포와 같은 세포를 지칭함)는 Cbl 억제제로 처리된 세포와 접촉될 때 세포 성장(예: 종양 세포 성장)의 임의의 측정 가능한 감소를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 세포 성장은 세포 또는 Cbl 억제제로 처리된 세포와 접촉하지 않는 동일한 세포의 성장과 비교된다. 일부 구현예에서, 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 억제될 수 있다. 세포 성장의 감소는 단백질의 내재화, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 이펙터 기능 매개 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 메카니즘에 의해 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "예방제" 및 "예방제"는 병태, 질환, 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방에 사용될 수 있는 임의의 제제(들)를 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "예방제"는 본원에 제공된 화합물을 포함한다. 특정의 다른 구현예에서, 용어 "예방제"는 본원에 제공된 화합물을 지칭하지 않는다. 특정 구현예에서, 예방제는 암 또는 면역 매개 장애와 관련된 병태, 질환 또는 장애의 발병, 발달, 진행 및/또는 중증도를 예방하거나 방해하는 데 유용한 것으로 공지되어 있거나 사용되었거나 현재 사용되거나, 부작용의 발병을 예방하거나 방해하거나 부작용(예: 구역질, 구토)의 중증도를 감소시키는 데 유용한 것으로 공지되어 있거나 사용되었거나 현재 사용되는 제제일 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "예방적 유효량"은 병태, 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 발달, 재발 또는 발병의 예방 또는 감소를 초래하거나 부작용을 감소시키거나 예방하거나 또 다른 요법(예: 또 다른 예방제)의 예방 효과(들)를 향상시키거나 개선시키기에 충분한 요법(예: 예방제)의 양을 지칭한다.
"선택", "선택적 농축" 또는 "선택적 확장"은 특정 유형의 면역 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포 또는 (CD45RO+/CD95+) 기억 T 세포와 같은 특정 표현형의 T 세포의 농축과 함께 상기 면역 세포의 증식을 촉진시키는 조건하에 개체로부터 채취된 면역 세포의 생체외 배양 또는 공여체 또는 세포주로부터의 면역 세포 또는 줄기 세포의 시험관내 배양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 교환가능하게 사용된다. 용어 "대상체"는 비영장류(예: 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류(예: 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 침팬지 및 인간)를 포함하는 포유동물과 같은 동물을 지칭하고, 특정 구현예에서, 인간을 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상체는 농장 동물(예: 말, 소, 돼지 등) 또는 애완동물(예: 개 또는 고양이)이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원 자극에 대한 면역 반응성이 감소된 상태를 지칭한다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원 인식이 발생할 수 있는 T-세포 고갈 및/또는 T-세포 아네르기 모두의 공통 요소를 포함하지만, 후속 면역 반응은 종양 성장을 조절하는 데 비효과적이다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 또한 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포 사멸과 같은 다운스트림 T-세포 이펙터 기능으로 항원 인식을 번역하는 능력 손상과 같은 항원 인식에 대한 불응성 또는 비반응성을 포함한다.
용어 "T-세포 아네르기"는 T-세포 수용체를 통해 전달된 불완전하거나 불충분한 신호로 인한 항원 자극에 대한 무반응 상태를 지칭한다. "T-세포 아네르기"는 또한 공자극의 부재하에서 항원에 의한 자극시 발생할 수 있으며, 그 결과, 세포는 공자극의 맥락에서도 세포가 항원에 의한 후속 활성화에 대해 불응성이 된다.
용어 "T-세포 고갈"은 암 동안 발생할 수 있는 지속된 TCR 신호전달로 인한 T-세포 기능 장애의 상태를 지칭한다. 그것은 불완전하거나 결핍된 신호전달을 통해서가 아니라 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 아네르기와 구별된다. 그것은 불량한 이펙터 기능, 억제성 수용체의 지속된 발현 및 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되는 전사 상태에 의해 정의된다.
용어 "T-세포 내구성"은 저장소로서 지속하고 또한 일정 기간 동안 주입 후 증식을 계속하여 현재 및 잠재적으로 미래의 악성 종양의 박멸을 촉진시키기 위해 상기 T 세포에 의한 지속적인 면역 감시를 허용하는 이식되거나 주입된 T 세포의 능력을 지칭한다. 이러한 T 세포 중 일부는 활성화 상태에 있다. 내구성은 또한 주입시 생존하거나 지속되는 생착 세포의 능력을 지칭한다. T 세포 반응 또는 세포 생착의 내구성은 질환 관해와 관련될 수 있다.
"T-세포 기능 장애"는 항원 자극에 대한 T 세포의 감소된 반응성을 특징으로 하는 장애 또는 병태이다. 감소된 반응성은 종양의 비효율적인 제어를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "T-세포 기능 장애"는 혈액암 또는 비혈액암과 같은 암을 포함한다. 일부 구현예에서, "T-세포 기능 장애"는 T 세포가 아네르기이거나 사이토카인을 분비하고, 증식시키고/시키거나 세포 용해 활성을 실행하는 능력이 감소된 것이다.
"T-세포 기능을 향상시키는"은 T 세포가 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발 또는 자극하거나 고갈되거나 불활성인 T 세포를 갱신 또는 재활성화시킴을 의미한다. 향상된 T-세포 기능의 예로는 T-세포 활성화의 증가(예: 사이토카인 생산의 증가, T 세포 활성화 마커의 발현 증가 등), T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소 및/또는 Cbl 억제제로 처리하기 전 T 세포의 상태에 대한 T-세포 내성의 감소를 포함한다. T 세포 기능의 향상을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여될 때 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 단백질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량 또는 유효량은 대상체에게 투여될 때 질환 또는 질환의 진행을 예방하거나 개선하거나 증상의 개선을 초래하는 데 효과적인 조성물의 양을 지칭한다. 용어 "치료제"는 Cbl 억제제, 변형된 면역 세포 집단, 또는 이들의 조합, 또는 조성물을 지칭할 수 있다.
임의의 질환 또는 장애를 "치료하는" 또는 "치료"는 특정 구현예에서 대상체에 존재하는 질환 또는 장애를 개선하는 것을 지칭한다. 다른 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 대상체에 의해 식별될 수 없는 적어도 하나의 물리적 파라미터를 개선하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 물리적으로(예: 식별 가능한 증상의 안정화) 또는 생리학적으로(예: 물리적 파라미터의 안정화) 또는 둘 모두로 질환 또는 장애를 조절하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키거나 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 질환을 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 임상 결과를 포함하여, 개체에서 유익한 또는 목적하는 결과를 수득하기 위한 노력으로, 하나 이상의 치료제를 개체(인간 또는 달리)에게 투여하는 것을 포함할 수 있는 프로토콜을 수행하는 것을 지칭한다. 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환의 확산 예방, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료받지 않은 개체의 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 또한, "치료하는" 및 "치료"는 1회 투여량의 치료제 또는 치료제들의 투여에 의해 일어날 수 있거나, 또는 일련의 투여량의 치료제 또는 치료제들의 투여시 일어날 수 있다. "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 필요로 하지 않으며, 치료를 필요로 하지 않는다. "치료"는 또한 치료되는 개체 또는 세포의 자연적인 경과를 변경하도록(즉, 임상적 개입의 부재하에 발생하는 개체 또는 세포의 경과를 변경하도록) 설계된 하나 이상의 치료제를 개체에게 투여하는 것과 같은 임상적 개입을 지칭할 수도 있다.
본원에서 사용되는 "알킬"은 포화 선형(즉, 비분지된) 또는 분지된 1가 탄화수소 쇄 또는 이들의 조합을 지칭한다. 특정 알킬 그룹은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C20 알킬"), 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C10" 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C8 알킬"), 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C6 알킬"), 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C2-C6 알킬"), 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C4 알킬")이다. 알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 2급-부틸과 같은 그룹, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"아미노"는 그룹 -NH2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "아릴"은 단일 환(예: 페닐) 또는 하나 이상의 축합 환이 방향족이 아닐 수 있는 다수의 축합 환(예: 나프틸 또는 안트릴)을 갖는 방향족 카보사이클릭 그룹을 지칭한다. 특정 아릴 그룹은 6 내지 14개의 환상(즉, 환) 탄소 원자를 갖는 것들("C6-C14 아릴")이다. 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 방향족 환 위치 또는 비방향족 환 위치에서 모체 구조에 연결될 수 있다. 하나의 변형에서, 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 방향족 환의 위치에서 모체 구조에 연결된다. 아릴의 예는 페닐, 나프틸, 1-나프틸, 2-나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-6-일 등과 같은 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "아릴렌"은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가를 갖는다. 특정 아릴렌 그룹은 6 내지 14개의 환상 탄소 원자를 갖는 것들("C6-C14 아릴렌")이다. 아릴렌의 예로는 페닐렌, o-페닐렌(즉, 1,2-페닐렌), m-페닐렌(즉, 1,3-페닐렌), p-페닐렌(즉, 1,4-페닐렌), 나프틸렌, 1,2-나프틸렌, 1,3-나프틸렌, 1,4-나프틸렌, 2,7-나프틸렌, 2,6-나프틸렌 등과 같은 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"카르보사이클릴" 또는 "카르보사이클릭"은 모든 환 구성원이 탄소 원자인 1가 사이클릭 그룹, 예를 들어, 사이클로헥실, 페닐, 1,2-디하이드로나프틸 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬"은 비방향족, 포화 또는 불포화, 사이클릭 1가 탄화수소 구조를 지칭한다. 특정 사이클로알킬 그룹은 지정된 수의 환상(즉, 환) 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 3 내지 12개의 환상 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 그룹("C3-C12 사이클로알킬")이다. 특정 사이클로알킬은 3 내지 8개의 환상 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C8 사이클로알킬") 또는 3 내지 6개의 환상 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C6 사이클로알킬")이다. 사이클로알킬은 하나의 환, 예를 들어, 사이클로헥실, 또는 다중 환, 예를 들어, 아다만틸로 구성될 수 있지만, 아릴 그룹은 제외된다. 하나 이상의 환을 포함하는 사이클로알킬은 융합, 스피로, 또는 가교될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 사이클로알킬 그룹의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 노르보르닐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬렌"은 사이클로알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가를 갖는다. 특정 사이클로알킬렌 그룹은 3 내지 12개의 환상 탄소 원자("C3-C12 사이클로알킬렌"), 3 내지 8개의 환상 탄소 원자("C3-C8 사이클로알킬렌"), 또는 3 내지 6개의 환상 탄소 원자("C3-C6 사이클로알킬렌")를 갖는 것들이다. 사이클로알킬렌 그룹의 예로는 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 1,2-사이클로헥세닐렌, 1,3-사이클로헥세닐렌, 1,4-사이클로헥세닐렌, 사이클로헵틸렌, 노르보르닐렌 등을 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"할로" 또는 "할로겐"은 원자 번호 9-85를 갖는 17족 계열의 원소를 지칭한다. 할로 그룹은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오드를 포함한다.
"할로알킬", "할로알킬렌", "할로아릴", "할로아릴렌", "할로헤테로아릴", 및 유사한 용어는 적어도 하나의 할로 그룹으로 치환된 모이어티를 지칭한다. 할로알킬 모이어티 또는 다른 할로 치환된 모미어티가 하나 이상의 할로겐으로 치환되는 경우, 그것은 부착된 할로겐 모이어티의 수에 상응하는 접두사를 사용함으로써 지칭될수 있다. 예를 들어, 디할로아릴, 디할로알킬, 트리할로아릴, 트리할로알킬 등은 2개("디") 또는 3개("트리")의 할로 그룹으로 치환된 아릴 및 알킬을 지칭하며, 이는 반드시 그렇지는 않지만 동일한 할로일 수 있고; 따라서, 예를 들어, 할로아릴 그룹 4-클로로-3-플루오로페닐은 디할로아릴의 범위 내에 있다. 알킬 그룹의 각 수소가 할로 그룹으로 대체된 할로알킬 그룹의 서브세트는 "퍼할로알킬"로서 지칭된다. 특정 퍼할로알킬 그룹은 트리플루오로알킬(-CF3)이다. 유사하게, "퍼할로알콕시"는 할로겐이 알콕시 그룹의 알킬 모이어티를 구성하는 탄화수소 중의 각각의 H를 대신하는 알콕시 그룹을 지칭한다. 퍼할로알콕시 그룹의 예는 트리플루오로메톡시(-OCF3)이다. "할로알킬"은 모노할로알킬, 디할로알킬, 트리할로알킬, 퍼할로알킬, 및 알킬 그룹에서 가능한 임의의 다른 수의 할로 치환체를 포함하고; 할로알킬렌, 할로아릴, 할로아릴렌, 할로헤테로아릴 등의 다른 그룹에 대해서도 유사하다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"은 1 내지 14개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황과 같은 헤테로원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 환상 헤테로원자를 갖는 불포화된 방향족 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로아릴 그룹은 단일 환(예: 피리딜 또는 이미다졸릴) 또는 다수의 축합 환(예: 인돌리지닐, 인돌릴, 또는 퀴놀리닐)을 가질 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 축합 환은 방향족이다. 특정 헤테로아릴 그룹은 1 내지 12개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 환상 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 환("5원 내지 14원 헤테로아릴"); 1 내지 8개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 환상 헤테로원자를 갖는 5원 내지 10원 환("5원 내지 10원 헤테로아릴"); 또는 1 내지 5개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 환상 헤테로원자를 갖는 5, 6 또는 7원 환("5 내지 7원 헤테로아릴")이다. 하나의 변형에서, 헤테로아릴은 1 내지 6개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 환상 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭 방향족 5, 6, 또는 7원 환을 포함한다. 다른 변형에서, 헤테로아릴은 1 내지 12개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 환상 헤테로원자를 갖는 폴리사이클릭 방향족 환을 포함한다. 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 헤테로아릴 그룹은 방향족 환 위치 또는 비방향족 환 위치에서 모체 구조에 연결될 수 있다. 헤테로아릴의 예는 피리딜, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조[b]티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴 등의 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "헤테로아릴"은 또한 모이어티, 예를 들어,
Figure pct00005
, 호변이성체 구조
Figure pct00006
를 갖는 2,4-디하이드로-3H-1,2,4-트리아졸-3-온-2-일, 1H-1,2,4-트리아졸-5-올-1-일을 포함한다.
본원에 사용된 "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가를 갖는다. 특정 헤테로아릴렌 그룹은 1 내지 12개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 환상 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 환("5원 내지 14원 헤테로아릴렌"); 1 내지 8개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 환상 헤테로원자를 갖는 5원 내지 10원 환("5원 내지 10원 헤테로아릴렌"); 또는 1 내지 5개의 환상 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 환상 헤테로원자를 갖는 5, 6 또는 7원 환("5원 내지 7원 헤테로아릴렌")이다. 헤테로아릴렌의 예는 피리딜렌, 벤즈이미다졸릴렌, 벤조트리아졸릴렌, 벤조[b]티에닐렌, 퀴놀리닐렌, 인돌릴렌, 벤조티아졸릴렌 등의 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 그룹"은 지정된 수의 원자 및 헤테로원자를 갖거나, 또는 원자 또는 헤테로원자의 수가 지정되지 않은 경우, 1 내지 14개의 환형 탄소 원자로부터 적어도 3개의 환상 원자, 및 질소, 산소, 및 황과 같은 헤테로원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 환형 헤테로원자를 갖는 비방향족 포화된 또는 부분적으로 불포화된 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로사이클릭 그룹은 단일 환(예: 테트라하이드로티오페닐, 옥사졸리디닐) 또는 복수의 축합 환(예: 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로벤조[d]옥사졸릴)을 가질 수 있다. 복수의 축합 환은 바이사이클릭, 트리사이클릭 및 쿼드라사이클릭 환, 및 가교된 또는 스피로사이클릭 환 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 헤테로사이클릭 그룹의 예로는 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 디옥사닐, 3,6-디하이드로-2H-피라닐, 2,3-디하이드로-1H-이미다졸릴 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"옥소"는 그룹 =O, 즉 탄소 또는 다른 원소에 이중으로 결합된 산소 원자를 지칭한다.
"임의로 치환된"은 달리 명시되지 않는 한, 그룹이 치환되지 않거나 또는 그 그룹에 대해 나열된 하나 이상(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 치환체에 의해 치환된다는 것을 의미하며, 여기서 치환체는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 치환되지 않는다. 한 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 하나의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 2개의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 3개의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 4개의 치환체를 갖는다. 일부 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 5개의 치환체를 갖는다. 복수의 치환체가 존재하는 경우, 각 치환체는 다르게 나타내지 않는 한 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 그룹 -N(C1-C4 알킬)(C1-C4 알킬) 상의 각 (C1-C4 알킬) 치환체는 -N(CH3)(CH2CH3) 등과 같은 그룹을 생성하기 위해 서로 독립적으로 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 "소분자"는 분자량이 2,000달톤 이하인 화합물을 지칭한다.
본원 개시내용 이외에, 용어 "치환된"은 특정 그룹 또는 라디칼을 변형시키기 위해 사용되는 경우, 특정 그룹 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각각 서로 독립적으로 본원에서 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 치환체 그룹으로 대체됨을 의미할 수도 있다. 일부 구현예에서, 치환되는 그룹은 1, 2, 3, 또는 4개의 치환체, 1, 2, 또는 3개의 치환체, 1 또는 2개의 치환체, 또는 1개의 치환체를 갖는다.
치환체는 달리 나타내지 않는 한, 지정된 그룹 또는 라디칼 상의 임의의 화학적으로 가능한 위치에 부착될 수 있다. 따라서, -C1-C8 알킬-OH는, 예를 들어, -CH2CH2OH 및 -CH(OH)-CH3, 및 -CH2C(OH)(CH3)2를 포함한다.
원소의 특정 동위원소가 화학식으로 표시되지 않는 한, 본 개시내용은 본원에 개시된 화합물의 모든 동위원소, 예를 들어, 화합물의 중수소화 유도체(여기서, H는 2H, 즉 D일 수 있다)를 포함한다. 중수소화 화합물은 약동학(ADME) 특성에 바람직한 변화를 제공할 수 있다. 동위원소는 구조 내의 임의의 또는 모든 위치에서 동위원소 치환을 가질 수 있거나, 구조 내의 임의의 또는 모든 위치에서 자연적으로 풍부하게 존재하는 원자를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "부형제"는 사용된 용량 및 농도로 그것에 노출된 세포 또는 포유동물에 대해 무독성인 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 비히클 또는 안정제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충 수용액이다.
"약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 되도록 하는 형태이며, 제형 또는 조성물이 투여되는 개체에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형 또는 조성물은 무균일 수 있다.
약제학적 조성물에 기재된 화합물 또는 약제학적 조성물의 청구항에 기재된 화합물에 대한 언급은 약제학적 조성물의 다른 요소를 포함하지 않는, 즉 담체, 부형제 등이 없는 약제학적 조성물에 인용된 화학식으로 기재된 화합물을 지칭한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 화합물의 모든 염 및 화합물의 이러한 염을 사용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 한 구현예에서, 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약물 또는 약제로서 인간 및/또는 동물에게 투여될 수 있고, 투여시 유리 화합물(중성 화합물 또는 비염 화합물)의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하는 염이다. 염기성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 산으로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유기산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 설폰산, 및 살리실산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염기성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 아스파르테이트 염 및 글루타메이트 염이 또한 제조될 수 있다. 산성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 염기로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 산성 화합물의 무기염의 예로는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염; 암모늄염; 및 알루미늄 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산성 화합물의 유기 염의 예는 프로카인, 디벤질아민, N-에틸피페리딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 트리에틸아민 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 리신 염도 또한 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 목록은, 예를 들어, 문헌[참조: P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.)"Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use" Wiley-VCH, 2011 (ISBN: 978-3-90639-051-2)]을 참조한다. 일부 약제학적으로 허용되는 염은 문헌[참조: Berge, J. Pharm . Sci . 66:1 (1977)]에 개시되어 있다.
개요
세포 요법을 위해 Cbl 억제제를 사용하는 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 세포는 당업자에 의해 유용한 것으로 간주되는 임의의 면역 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 종양 침윤성 림프구, T 세포, NK 세포, CAR-T 세포, TCR-T 세포 또는 NK-CAR 세포이다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 T 세포를 활성화시키는 데 사용되어 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 결과를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 공자극의 부재하에 T 세포를 활성화하는 데 사용되어 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 결과를 가능하게 한다.
세포 치료 방법은 익히 공지되어 있으며, 본원에 제공된 단계는 달리 명시되지 않는 한 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 하기 단계들 중 어느 하나 또는 모두를 포함한다. 이하에서 상세히 기재되는 바와 같이, 하나 이상의 Cbl 억제제는 하나 이상의 단계를 향상시킬 수 있다.
제1 단계에서, 세포는 공여체로부터 채취된다. 채취는 표준 기술에 의해 진행될 수 있다. 특정 구현예에서, 순환 면역 세포, 예를 들어, 혈액 세포는 공여체로부터 채취된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 종양 또는 종양 조직은 공여체로부터 수득되어 단편화된 다음, 면역 세포가 종양 단편으로부터 단리되고 채취된다. 제2 단계에서, 채취된 면역 세포를 1개 또는 2개의 단계로 확장시킨다. 일반적으로, 채취된 순환 면역 세포는 전형적으로 수득되는 비교적 많은 수의 세포로 인해 한 단계로 확장된다. 대조적으로, 종양에서 채취된 면역 세포는 전형적으로 혈액에서 수득된 면역 세포와 비교하여 종양 단편으로부터 전형적으로 수득된 적은 수의 면역 세포로 인해 전형적으로 2단계로 확장을 필요로 한다. 어느 경우든, 채취된 면역 세포는 임의로 확장 전에 유전적으로 변형될 수 있다. 어느 경우든, 제1 확장은 3 내지 28일, 바람직하게는 3 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 제1 확장은 면역 세포의 수를 몇 배로 증가시켜야 한다.
일부 방법은 임의의 제2 확장을 포함한다. 제2 확장에서, 세포 배양 배지는 이러한 보충 없이 수득될 수 있는 것보다 면역 세포의 성장을 향상시키기 위해 보충될 수 있다. 제2 확장은 3 내지 14일, 바람직하게는 7 내지 14일 동안 진행할 수 있다. 중요하게는, 특정의 유리한 구현예에서, 초기 단계에서 Cbl 억제제의 효과로 인해, 종양으로부터 채취된 면역 세포에는 제2 확장이 필요하지 않다. 따라서, 특정 구현예에서, 제2 확장 단계는 없다. 확장 후(1단계이든 2단계이든), 확장된 면역 세포가 회복된다. 면역 세포는 저장될 수 있다. 추가 단계에서, 회수된 면역 세포는 표준 기술, 예를 들어, 주입에 의해 환자에게 투여된다. 아래에서 상세히 기재된 바와 같이, 하나 이상의 Cbl 억제제는 채취 전 숙주에서 면역 세포의 성장, 확장 및 발달을 향상시킬 수 있고, 확장 단계 중 어느 하나를 향상시킬 수 있고, 요법을 위한 면역 세포의 투여를 향상시키고/시키거나 투여 후 면역 세포를 향상시켜 이들의 생착을 향상시킬 수 있다. 구현예는 이하의 단락에서 간단히 기재되며, 이하 섹션에서 보다 상세히 기재된다.
Cbl 억제제는 방법의 하나 이상의 단계에서 유용하다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 한 단계에서 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 하나 이상의 단계에 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 두 단계에 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 3단계에 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체에서 생체내 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체외에서 면역 세포의 제1 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체외에서 면역 세포의 제2의 또는 급속한 확장을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 환자에서 투여된 면역 세포의 투여 후 생착을 향상시킨다. 특정 구현예에서, 환자에게 투여되는 Cbl 억제제는 이러한 면역 세포 요법을 필요로 하는 환자에서 투여되는 면역 세포의 이점을 향상시킨다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 개체는 면역 세포의 공여체일 수 있다. 공여체는 자가 공여체일 수 있고 치료를 필요로 하는 환자일 수도 있다. 공여체는 또한 동종이계 요법을 위한 세포를 제공하는 개체일 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 채취 전에 공여체에게 투여된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체로부터 채취될 수 있는 면역 세포의 총 수를 증가시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 공여체에서 활성화된 세포의 수준을 증가시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 특정 활성을 갖는 세포를 증가시키고, 예를 들어, 특정 종양 또는 암 유형에 대해 세포 독성이거나 이에 결합한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 종양 침윤성 림프구의 수준을 증가시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 순환 T 세포의 수준을 증가시킨다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포의 확장을 향상시킨다. 면역 세포는 표준 기술에 따라 채취할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 샘플은 면역 세포를 포함하는 순환 혈액 세포 또는 혈장이다. 특정 구현예에서, 세포 샘플은 면역 세포를 포함하는 종양 조직이다. 특정 구현예에서, 채취된 면역 세포는 하나 이상의 Cbl 억제제의 존재하에 생체외에서 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에 배양은 종양 단편으로부터 체취된 면역 세포의 수율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에 배양은 보다 높은 증식률을 초래한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에 배양은 활성화된 면역 세포의 표현형을 나타내는 증식된 세포의 더 높은 백분율을 초래한다. 예를 들어, Cbl 억제제의 존재하에 배양되는 경우, 많은 상이한 종양 공급원 중 하나, 즉 흑색종, 유방암, 난소 또는 결장 종양으로부터 배양된 세포는 특정 구현예에서 일부 유형의 세포 기반 면역요법에 바람직한 표현형의 발현 증가를 나타낸다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에 면역 세포의 배양은 더 높은 관해율과 연관된 보다 내구성 있는 면역 반응을 촉진하는 기억 표현형(예: CD45RO+/CD95+)을 갖는 더 높은 수준의 세포를 산출한다. Cbl 억제제의 존재하에서 선택적으로 확장된 면역 세포는 IL-2, 다른 사이토카인, 또는 이들의 조합(예: IL-7 및 IL-15와 조합된 IL-2)의 존재하에서 배양된 것과는 다른 표현형을 나타내어 이를 필요로 하는 환자에게 주입시 면역 세포의 보다 효과적인 생착을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서의 확장은 면역 세포의 제2의 급속한 확장의 필요성을 제거한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 제2의 급속한 확장 단계를 향상시킨다. 특정 구현예에서, 임의의 확장 단계에서 Cbl 억제제는 화합물 103이다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 수용자 또는 환자에게 면역 세포의 투여를 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 개체에게 확장된 면역 세포와 조합하여 투여된다. 특정 구현예에서, 투여는 면역 세포의 생착 및/또는 성장 속도를 촉진시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 투여는 면역 반응의 내구성을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 투여는 현저하게 감소된 질환 진행 속도 및/또는 더 높은 관해율을 초래한다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 Cbl 억제제를 세포 면역요법을 향상시키기에 효과적인 양으로 개체에게 투여하고; 세포 면역요법을 위해 개체에게 유효량의 확장된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서의 세포 면역요법의 방법이다. Cbl 억제제는 당업자에 의해 적절하다고 간주되는 임의의 시간에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 채취 전, 채취 후, 주입 전, 주입 후, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 후 1일째에 투여되고 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 일 수 동안 지속된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일, 또는 최대 15, 20, 25, 30, 또는 35일 동안 매일 투여된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 개체에게 경구로, 정맥내로, 피하로, 또는 종양내로 투여된다. 특정 구현예에서, 환자에게 투여되는 Cbl 억제제는 경구적으로 전달되는 화합물 116이다. 특정 구현예에서, 이들 방법은 본원에 기재된 면역 세포 확장 구현예 중 어느 하나와 조합된다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기재된 화합물 103의 사용을 포함하고, 투여 단계는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 116의 경구 사용을 포함한다.
Cbl 억제제
Cbl 억제제는 Cbl 효소를 억제하는 소분자, 펩티드, 핵산 또는 항체를 포함한다. Cbl 효소는 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c를 포함한다. 본 개시내용의 치료 방법 및 조성물에 사용하기 위한 Cbl 억제제는 세포-기반 면역요법을 위한 화합물 및 약제학적 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Cbl 억제제는 T 세포, NK 세포, 순환 T 세포, 종양 침윤성 림프구 및 B 세포의 활성화를 증가시키는 것과 같은 면역계를 조절하고, 주입된 생체외 확장된 면역 세포의 생착을 증가시키거나 주입된 생체외 확장된 면역 세포에 대한 반응의 내구성을 증가시키는 생체내 치료 방법에 사용될 수 있다. 또한, Cbl 억제제는 이러한 면역 세포를 시험관내 또는 생체외에서 확장시키는 것을 도와 이들의 성장 및 증식을 증가시키거나 생성된 확장 면역 세포의 표현형을 조절하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 화학식 A에 따른 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A
Figure pct00007
상기 화학식 A에서,
R1은 H, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3원 내지 6원 헤테로사이클릴, C1-C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1-C6 알킬-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴)이고;
Figure pct00008
는
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
이고;
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
Z3은 CH 또는 N이고;
X는 CH 또는 N이고;
R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -NH-(C1-C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -O-(C1-C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
R3a는 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고;
R3b는 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; 또는 R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 4원 내지 8원 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹에 의해 임의로 치환되고; 또는
R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
n은 0 또는 1이고;
Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이고, 단 R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로이면, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
Q는 CH 또는 N이고;
R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R10은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 할로알킬이거나; 또는 R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; 또는 R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
각각의 R12는 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 제미널 R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성한다.
특정 구현예에서, R1은 H, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
, 또는
Figure pct00014
이다.
일부 구현예에서, R1은
Figure pct00015
이다. 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00016
이다. 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00017
이다.
일부 구현예에서, R1은
Figure pct00018
이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, X는 CH이다. 일부 구현예에서, X는 N이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R2는 H이다. 일부 구현예에서, R2는 -NH-(C1-C6 알킬)이다.
일부 구현예에서, R2는 -O-(C1-C6 알킬)이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서
Figure pct00019
Figure pct00020
를 형성한다. 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서
Figure pct00021
를 형성한다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R3b는 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R3b는 사이클로부틸이다. 일부 구현예에서, R3a는 H이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
화학식 A의 일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, Y는 C(R11a)(R11b)이다. 일부 구현예에서, R11a 및 R11b는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2, 또는 CF3이다. 일부 구현예에서, Y는 CH2이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, Q는 CH이다. 일부 구현예에서, Q는 N이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R4는 H이다. 일부 구현예에서, R4는 CH3이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R5a는 H이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00022
이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R5b는 H이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00023
이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00024
Figure pct00025
이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R1은 메틸이다. 화학식 A의 일부 구현예에서, R1은 트리플루오로메틸이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, Z1은 CH이다. 일부 구현예에서, Z1은 N이다. 일부 구현예에서, Z2는 CH이다. 일부 구현예에서, Z2는 N이다. 일부 구현예에서, Z3은 CH이다. 일부 구현예에서, Z3은 N이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R10은 H이다. 일부 구현예에서, R10은 CH3이다. 일부 구현예에서, R10은 CF3이다. 일부 구현예에서, R10은 사이클로프로필이다. 일부 구현예에서, R10은 사이클로프로필이고, R1은 메틸이다.
화학식 A의 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 1개의 R12 그룹에 의해 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬, -CN, 또는 C1-C6 알킬-CN으로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
일부 구현예에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 CN 또는 CH3에 의해 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 표 1의 화합물이다. 화합물은 국제 출원 번호 PCT/US2020/027492 또는 PCT/US2020/033274 또는 미국 가출원 제62/888,845호 또는 제62/888,870호에 따라 제조되고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
[표 1]
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위해 표 1의 화합물 번호 101 내지 129로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 구현예에서, 전문이 참조로 포함된 WO 2019/148005에 개시된 하나 이상의 소분자 Cbl 억제제가 본원에 기재된 방법에 사용된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 화합물의 임의의 거울상이성체 또는 부분입체이성체 형태, 및 시스/트랜스 또는 E/Z 이성체를 포함하는 임의의 또는 모든 입체화학적 형태를 포함한다. 입체화학이 화학 구조 또는 명칭으로 명시적으로 표시되지 않는 한, 구조 또는 명칭은 묘사된 화합물의 모든 가능한 입체이성체를 포함하도록 의도된다. 또한, 특정 입체화학적 형태가 묘사되는 경우, 모든 다른 입체화학적 형태뿐만 아니라 화합물의 라세미, 비-라세미, 에난티오 농축 및 스칼레믹 혼합물이 포함되도록 임의의 비율로 개시된 2종 이상의 입체화학적 형태의 혼합물을 포함하여 개시된 화합물의 일반적인 비-입체특이적 형태 및 임의의 비율의 혼합물이 기재되고 본 개시내용에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 개시된 화합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 이의 특정 입체화학적 형태를 포함하는 실질적으로 순수한 화합물의 조성물이 또한 의도된다. 화합물의 라세미, 비-라세미, 에난티오 농축 및 스칼레믹 혼합물이 본 개시내용에 포함되도록 임의의 비율로 개시된 화합물의 둘 이상의 입체화학적 형태의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함하여 임의의 비율로 개시된 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물이 또한 본 개시내용에 의해 포함된다. 입체화학이 분자의 또 다른 일부 또는 부분들에 대해서가 아니라 분자의 한 부분 또는 부분들에 대해 명시적으로 표시되는 경우, 구조는 입체화학이 명시적으로 표시되지 않는 부분 또는 부분들에 대한 모든 가능한 입체이성체를 포함하도록 의도된다. 본 개시내용은 본원에 기재된 화합물의 임의의 및 모든 호변이성체 형태를 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 화합물의 모든 염, 및 화합물의 이러한 염을 사용하는 방법을 포함한다. 한 구현예에서, 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약물 또는 약제로서 인간 및/또는 동물에게 투여될 수 있고, 투여시 유리 화합물(중성 화합물 또는 비염 화합물)의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하는 염이다. 염기성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 산으로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유기산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 설폰산, 및 살리실산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염기성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 아스파르테이트 염 및 글루타메이트도 또한 제조될 수 있다. 산성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 염기로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 산성 화합물의 무기염의 예로는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염; 암모늄염; 및 알루미늄 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산성 화합물의 유기 염의 예는 프로카인, 디벤질아민, N-에틸피페리딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 트리에틸아민 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 리신 염도 또한 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 목록은, 예를 들어, 문헌[참조: P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.)"Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use" Wiley-VCH, 2011 (ISBN: 978-3-90639-051-2)]을 참조한다. 일부 약제학적으로 허용되는 염은 또한 문헌[참조: Berge, J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977)]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 WO2019/148005에 개시된 바와 같이 제조되고, 이는 전문이 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제(들)는 프로겐라, 인크(Progenra, Inc.)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 공급원으로부터 시판된다.
일부 구현예에서, 화합물 101 내지 129 중 어느 하나, 또는 이의 둘 이상의 조합이 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법에 사용된다. 다른 구현예에서, 전문이 참조로 포함된 WO2019/148005에 개시된 바와 같은 Cbl 억제제 화합물 중 하나 이상이 본 개시내용의 방법에서 억제제로서 사용된다.
다양한 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 Cbl 억제제 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용되는 방법)은 WO 2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 측정된 바와 같이 1nM 미만, 1 내지 100nM, 100nM 내지 300nM, 301nM 내지 1000nM, 1,001nM 내지 3,000nM, 3,001nM 내지 10,000nM, 또는 10,000nM 초과의 IC50 값을 갖는다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 약 0.1 내지 10nM의 IC50을 갖는다. 추가의 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 100nM 미만의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현에에서, 및 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 결정된 바와 같이, 100nM 내지 300nM의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현에에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 결정된 바와 같이, 301nM 내지 1000nM의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 결정된 바와 같이, 1,001nM 내지 3,000nM의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현에에서, 그리고 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 결정된 바와 같이, 3,001nM 내지 10,000nM의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현에에서, 그리고 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 WO2019/148005의 생물학적 실시예 1에 기재된 바와 같은 Cbl 억제의 시험관내 검정에서 결정된 바와 같이, 10,000nM 초과의 IC50 값을 갖는다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 합성 또는 천연 펩티드이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 융합 단백질이다. 펩티드는, 예를 들어, 티로신(608)-인산화 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)(Cblin)의 DGpYMP 펩티드 모방체, 또는, 예를 들어, 세포 전달 부분 및 카시타스 b-계통 림프종-b(Cbl) 결합 펩티드를 포함하는 융합 펩티드일 수 있고, 여기서 Cbl 결합 펩티드는 서열 N/DX1PYX2P를 갖고, 여기서 X, X1, 및 X2는 임의의 아미노산으로부터 선택되고, N/D는 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D) 중 어느 하나이고, pY는 Cbl의 티로신 키나제 결합(TKB) 도메인에 결합하는 포스포티로신이며, 일부 구현예에서, Cbl 결합 펩티드는 비장 티로신 키나제(Syk)의 펩티드 단편이다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 항체, 예를 들어, Cbl 에피토프에 선택적으로 결합하여 이를 불활성화시키는 것이다. 모노클로날 및 폴리클로날 항-Cbl 항체는 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 핵산, 예를 들어, Cbl 단백질, 예를 들어, Cbl을 표적으로 하는 siRNA이다. 예를 들어, 미국 특허 제10,421,945호를 참조한다. 미국 특허 제10,421,945호, 미국 특허 제9,186,373호, 또는 미국 특허 제8,809,288호에 기재된 siRNA 조성물도 또한 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 Cbl 억제제는 자가 세포-기반 면역요법을 받고 있는 개체에서, 경구로, 정맥내로, 피하로, 종양내로, 또는 생체내 폐 투여에 의해 투여되거나, 동종이계 세포-기반 면역요법을 위한 면역 세포를 제공하는 공여체에게 경구로, 정맥내로, 피하로 또는 폐 투여에 의해 투여된다.
세포 채취
본원에 기재된 세포 치료 방법에서, 세포는 공여체로부터 채취된다. 세포는 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의의 세포일 수 있다. 채취는 표준 기술을 따를 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 공여체로부터 채취된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 순환 면역 세포이며, 성분채집술에 의해 채취된다. 특정 구현예에서, 순환 세포는 백혈구 성분채집술에 의해 채취된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 공여체로부터 수득된 종양으로부터 채취된다. 특정 구현예에서, 종양은 생검 또는 고형 종양 조직의 수술적 제거를 통해 공여체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 종양 조직은 개체으로부터 제거되고, 단편화되거나, 효소 소화에 적용하여 세포외 매트릭스 및/또는 기계적 파괴를 파괴하고, 배양 전에 종양 세포 현탁액을 제조하고, 이로부터 면역 세포가 단리될 것이다. 초기 세포 집단은 말초 혈액, 제대혈, 종양 또는 종양 생검, 림프, 피부, 종양 침윤성 림프구로부터 유래되거나, 줄기 세포 전구체 및 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 이종 세포 집단일 수 있다. 배양 조건은 생성된 세포 집단이 목적하는 면역 세포로 농축되도록 다른 세포 유형보다 면역 세포의 성장을 지지한다.
본원에 기재된 방법에서, 공여체가 Cbl 억제제로 전처리되는지 여부에 관계없이 동일한 제거 및 확장 단계가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 106 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 백혈구 성분채집술에 의해 수집된다. 일부 구현예에서, 108 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 백혈구 성분채집술에 의해 수집된다. 일부 구현예에서, 109 내지 1010개의 세포가 선택 및 확장을 위해 수집된다.
특정 구현예에서, 예를 들어, 1mm3 내지 2cm3의 종양 단편은 TIL의 단리 및 확장을 위해 환자로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 수집되는 종양 단편은 0.5mm3 내지 1cm3이다. 일부 구현예에서, 종양 단편은 1mm3 내지 8mm3이다. 일부 구현예에서, 수집되는 종양 단편은 1mm3 내지 5mm3이다. 일부 구현예에서, 수집되는 종양 단편은 1mm3 내지 3mm3이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 체취 단계를 향상시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 채취하기 전에 생체내에서 면역 세포를 활성화시킨다. 이러한 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 채취을 위해 목적하는 세포를 향상시키기에 충분한 양으로 공여체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 개체에게 채취 전에 투여된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체내 활성화를 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체내 분화를 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 생체내 자극을 향상시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 세포의 생체내 프라이밍을 향상시킨다. 일부 개체에서, Cbl 억제제의 투여는 환자가 고통받는 암 또는 종양을 특이적으로 인식하는 면역 세포의 증식을 자극한다.
Cbl 억제제의 투여량은 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 투여량일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 채취에 필요한 세포를 향상시키는 데 효과적이다. 특정 구현예에서, 투여량은 0.001 내지 5000mg, 0.01 내지 2500mg, 0.1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg의 Cbl 억제제이다. 특정 구현예에서, 투여량은 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg이다.
투여량은 당업자에 의해 적절하다고 여겨지는 일정으로 일정 기간 투여된다. 특정 구현예에서, 용량은 채취될 목적하는 세포를 향상시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제에 의한 치료 기간, 즉 생체내 활성화 기간은 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 10분 내지 약 1시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 20분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 45분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 15시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간이다. 일부 구현예에서, 생체내 활성화 기간은 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 또는 약 24시간이다. 일부 구현예에서, 생체내 활성화 기간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일, 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일, 또는 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일 또는 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일 또는 7 내지 60일이다. 일부 구현예에서, 생체내 확장 단계의 길이는 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일이다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF) 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-2와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-4와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-7과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-15와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-7 및 IL-15와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-12와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 IL-21과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 G-MCSF와 조합하여 투여된다.
일부 구현예에서, 공여체의 면역 세포 집단의 생물학적 활성은 활성화 전후 및/또는 채취 전에 측정된다. 면역 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가할 파라미터는 활성화 전후의 전체 수 또는 활성을 포함한다. 예를 들어, 생체내(예: 이미징에 의해) 또는 생체외(예: ELISA 또는 유세포 계측법에 의한)에서, 변형된 면역 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 파괴하는 면역 세포의 능력은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 문헌[참조: Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 생물학적 활성은 또한 IL-2 및 IFNγ와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양의 초기 크기 및/또는 수는 치료를 개시하기 전에 평가된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 확장 전에 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포주, B 세포주 및 NK 세포주로부터 선택된 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 선택적으로 확장되는 면역 세포, 또는 선택적으로 확장되고 임의로 유전적으로 조작되는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 세포주(예: T 세포주, B 세포주, NK 세포주 등)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 마우스, 래트, 비인간 영장류, 또는 돼지와 같은 이종 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 세포주는 세포 기반 면역요법에 사용하기 위해 채취 전에 Cbl 억제제에 노출된다.
특정 구현예에서, 채취된 세포는 동결보존 배지에서 제형화되고, 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 또는 적어도 5년의 장기간 저장을 위해 액체 질소 냉동고(-195℃) 또는 초저온 냉동고(-65℃, -80℃, 또는 -120℃)와 같은 극저온 저장 유닛에 넣는다. 동결보존 배지는 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 또는 8.0 내지 8.5의 pH를 유지하기 위한 배양 배지 또는 생리학적 완충제와 함께 글리세롤, DMSO(디메틸설폭사이드), NaCl, 덱스트로스, 덱스트란 설페이트, 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 포함할 수 있다. 냉동된 세포는 해동하고 자극 및/또는 확장 라운드에 적용시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 동결보존된 세포는 해동하고, 재조합 T 세포 수용체 또는 키메라 T 세포 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형시킨다.
일부 구현예에서, 해동된 세포는 본원에 기재된 방법에 의해 확장된다. T 세포를 추가로 동결보존하여 동결 배지에서 mL당 적어도 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 적어도 약 1010개 세포에서 적어도 약 1, 5, 10, 100, 150, 200 또는 50 바이알의 양으로 세포 은행을 생성할 수 있다. 동결보존된 세포 은행은 이들의 작용성을 유지할 수 있으며, 해동되고 추가로 자극 및 확장될 수 있다.
일부 측면에서, 해동된 세포는 세포 배양 백 및/또는 생물반응기와 같은 적절한 밀봉 용기 내에서 자극 및 확장되어 동종이계 세포 생성물로서 다량의 세포를 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 동결보존된 T 세포는 이들의 생물학적 기능을 극저온 저장 조건하에서 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월 또는 적어도 약 60개월 동안 유지시킨다.
특정 구현예에서, 채집된 세포 집단은 세포 집단이 생체외 또는 시험관내에서 확장되기 전에 특정 유형의 면역 세포가 농축되는 선택적 조건하에서 단리되거나 배양된다. 일부 구현예에서, 선택적 조건은 특정 T 세포 집단에 대해 세포 집단을 농축시킨다. 다른 구현예에서, 선택적 조건은 목적하는 T 세포 성숙 수준, 표현형 또는 특이성의 우세를 위해 세포 집단을 농축시킨다.
유전적으로 변형된 세포
특정 구현예에서, 채취된 면역 세포는, 예를 들어, 확장 전에 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이고, T 세포는 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전적으로 변형된다. T 세포는 당업계에서 확립된 방법에 의해 암 또는 악성 종양 관련 항원을 인식하기 위해 CAR 또는 TCR 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2):251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308 (2008)]을 참조한다. T 세포는 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2):720-724 (1993), and Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2):215-223 (2009)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이고, NK 세포는 키메라 항원 수용체(NK CAR 세포) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전적으로 변형된다.
면역 세포의 확장
특정 구현예에서, 본원에 기재된 면역 세포는 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 방법에 의해 배양에서 확장된다. 표준 기술이 여기서 유용하다. 일부 구현예에서, 생체외 또는 시험관내에서 면역 세포의 확장은 기체 투과성 막을 포함하는 하나 이상의 배양 용기에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 생체 외 또는 시험관내에서 면역 세포의 확장은 G-Rex™ 세포 배양 용기를 사용하여 수행된다.
순환 면역 세포
특정 구현예에서, 혈액으로부터의 면역 세포는 한 라운드의 확장으로 확장된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 기체 투과성 막을 포함하는 배양 용기를 사용하여 확장된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 G-Rex™ 세포 배양 용기를 사용하는 단일 확장을 사용하여 확장된다. 유리하게는, 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서의 확장은 면역 세포의 충분한 수 및/또는 활성을 산출한다.
일부 구현예에서, 순환 면역 세포는 환자로부터 수집되고, 생성된 세포를 환자에게 주입하기 전에 약 109 내지 약 2×1011 세포로 세포 수를 증가시키기 위해 생체외에서 확장된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재하에서의 확장에 비해 세포의 수를 증가시킨다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재하에서의 확장에 비해 세포의 하나 이상의 표현형을 개선한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 이의 부재하에서의 확장에 비해 확장 시간을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 확장은 10일 이하 후에 완료된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 이의 부재하에서의 확장에 비해 Cbl 억제제와의 배양에서 적어도 하나의 추가 배가를 완료한다.
특정 구현예에서, 혈액으로부터의 면역 세포는 한 라운드의 확장으로 확장된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 기체 투과성 막을 포함하는 배양 용기를 사용하여 확장된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 G-Rex™ 세포 배양 용기를 사용하는 단일 확장을 사용하여 확장된다. 유리하게는, 일부 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서의 확장은 면역 세포의 충분한 수 및/또는 활성을 산출한다.
종양 면역 세포
일부 구현예에서, 종양 면역 세포는 환자로부터 수집되고 생체외에서 2회 확장된다 - 목적하는 면역 세포의 선택적 확장을 위해 1회, 이어서 생성된 세포를 환자에게 주입하기 전에 세포 수를 약 109 내지 약 2 × 1011 세포로 추가로 증가시키기 위한 제2 확장("이중 확장"). 다른 구현예에서, 면역 세포는 환자로부터 수집되고, 생성된 세포를 환자에게 주입하기 전에 세포 수를 생체외에서 1회만 약 109 내지 약 2×1011 세포로 확장된다("단일 확장"). 다른 구현예에서, 단일 확장은 G-Rex™ 세포 배양 용기에서 일어난다. 일부 구현예에서, 이중 확장은 단일 세포 배양 용기에서 일어난다. 다른 구현예에서, 이중 확장은 동일한 G-Rex™ 세포 배양 용기에서 일어난다.
확장 배양
특정 방법에서, 확장을 겪는 세포는 하나 이상의 제제 또는 화합물의 존재하에 배양하여 이를 필요로 하는 개체에 주입되기 전에 특히 목적하는 성숙 수준의 세포의 농축을 포함하여 증식을 촉진시킨다. 유용한 화합물은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합과 같은, 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-4이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-7이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-12이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-7 및 IL-15의 조합이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15의 조합이다.
각 사이토카인은 0 내지 25000IU/ml, 또는 0 내지 10,000IU/ml, 또는 0 내지 5000IU/ml, 또는 0 내지 2500IU/ml, 또는 0 내지 1000IU/ml, 또는 0 내지 500IU/ml, 또는 0 내지 100IU/ml의 농도로 사용될 수 있다. 확장 동안 사용된 사이토카인은 임의로 배양 동안 세포에 의해 사용된 양을 대체하기 위해 배양 기간 동안 보충될 수 있다.
특정 방법에서, 확장을 겪는 세포는 배양 동안 세포에 의해 사용되는 양을 보충하기 위해 추가의 IL-2를 제공한다. 일부 구현예에서, IL-2는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 이중 확장 동안 보충되지만 단지 선택적인 확장 단계이다. 다른 구현예에서, IL-2는 이중 확장 동안 보충되지만 제2의 확장 단계 동안만이다. 다른 구현예에서, IL-2는 선택적 확장 단계 및 제2의 확장 단계 모두 동안의 이중 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-2는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11일마다(단일 확장, 선택적 확장, 제2의 확장, 또는 선택적 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안이든) 배양물에 첨가된다. 다른 구현예에서, IL-2는 확장 동안 단지 1회, 2회 또는 3회 보충된다(단일 확장, 선택적 확장, 제2의 확장, 또는 선택적 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안인지 여부에 관계없이).
특정 방법에서, 확장을 겪고 있는 세포는 배양 동안 세포에 의해 사용되는 양을 보충하기 위해 추가의 IL-7 및 IL-15가 제공된다. 일부 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 이중 확장 동안 보충되지만 선택적인 확장 단계만이다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 이중 확장 동안 보충되지만 제2 확장 단계 동안에만이다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 선택적 확장 단계 및 제2 확장 단계 모두 동안의 이중 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일마다 (단일 확장, 선택적 확장, 제2의 확장, 또는 선택적 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안이든) 배양물에 첨가된다. 다른 구현예에서, IL-7 및 IL-15는 확장 동안 단지 1회, 2회 또는 3회 보충된다(단일 확장, 선택적 확장, 제2의 확장, 또는 선택적 확장 및 제2의 확장 둘 다 동안이든).
특정 방법에서, 세포는 면역자극제의 존재하에 배양된다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 면역 세포의 표면 수용체에 결합하는 화합물이다. 표면 수용체는 당업자에 의해 인식되는 임의의 이러한 표면 수용체일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 T 세포 수용체에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 CD3에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 항-CD3 항체이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 CD28에 결합하는 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 항-CD28 항체이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 조합이다. 다른 구현예에서, 면역자극제는 표면에 고정된다. 다른 구현예에서, 면역자극제는 자기 비드 상에 고정된다.
특정 방법에서, 세포는 피더 세포의 존재하에 배양된다. 피더 세포는 전형적으로 그 자체가 증식하지 않도록 처리되지만, 대신에, 자극제 또는 유익한 제제, 또는 둘 모두의 공급원으로서 면역 세포의 증식 또는 활성화를 돕는다. 일부 구현예에서, 피더 세포는 조사된다. 일반적으로, 피더 세포는 종양으로부터 채취된 면역 세포를 확장시키는 데 사용되며, 전형적으로 이중 확장의 제2의 확장 단계 동안 첨가된다. 일부 구현예에서, 피더 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이다. 특정 구현예에서, 피더 세포는 제2 확장 동안 첨가되고, 피더 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이다.
특정 방법에서, 세포는 피더 세포 및 면역자극제 둘 다의 존재하에 배양된다. 일반적으로, 피더 세포와 면역자극제의 조합은 종양으로부터 채취된 면역 세포를 확장시키는 데 사용되며, 전형적으로 이중 확장의 제2 확장 단계 동안 첨가된다. 일부 구현예에서, 피더 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포이고, 면역자극제는 항-CD3 항체이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 확장 단계는 Cbl 억제제로 향상된다. 유리하게는, Cbl 억제제는 확장 단계의 시간을 감소시킬 수 있고, 복수의 확장이 필요한 경우, 추가의 하나 이상의 확장 단계를 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 추가의 면역자극제의 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 피더 세포의 필요성을 제거한다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 면역자극제 및 피더 세포의 필요성을 제거한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하에서 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 항-CD3 항체의 부재하에서 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 OKT3의 부재하에서 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 4-IBB 작용제, 예를 들어, 4-BBL의 부재하에 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하, 항-CD3 항체의 부재하 및 4-IBB 작용제의 부재하에 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기재된 바와 같은 Cbl 억제제 및 IL-2의 존재하, 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 부재하, 항-CD3 항체, 예를 들어, OKT3의 부재하 및 4-IBB 작용제, 예를 들어, 4-BBL의 부재하에서 진행한다. 특정 구현예에서, 확장 단계는 본원에 기재된 바와 같이 Cbl 억제제, IL-2, OKT3, 및 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 존재하 및 4-IBB 작용제, 예를 들어, 4-BBL의 부재하에 진행한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에서의 확장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에서의 확장을 포함하고 추가의 면역자극제를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에서 피더 세포의 첨가 없이 확장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Cbl 억제제의 존재하에 제2 확장 단계 없이 확장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 면역자극제의 첨가 없이 및 제2 확장 단계 없이 Cbl 억제제의 존재하에서의 확장을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 피더 세포를 첨가하지 않고, 제2 확장 단계 없이 Cbl 억제제의 존재하에서의 확장을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역 세포는 Cbl 억제제의 존재하에 1pM 내지 약 100mM, 약 0.001pM 내지 약 100μM, 약 0.01pM 내지 약 50μM, 0.001nM 내지 약 50μM, 약 100nM 내지 약 10μM, 약 0.01μM 내지 약 25μM, 약 0.1μM 내지 약 15μM, 약 1μM 내지 약 10μM, 약 0.1pM 내지 약 100nM, 약 1pM 내지 약 10nM, 약 1pM 내지 약 1nM의 농도로 생체외 또는 시험관내에서 배양된다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl 억제제의 농도는 약 1μM, 약 2μM, 약 3μM, 약 4μM 또는 약 5μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl 억제제의 농도는 약 1μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 1μM이다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl 억제제의 농도는 약 1μM이다.
특정 방법에서, Cbl 억제제의 존재하에서 확장하는 세포는 배양 동안 세포에 의해 사용되는 양을 보충하기 위한 추가의 Cbl 억제제가 제공된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 단일 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 이중 확장 동안 보충되지만, 선택적 확장 단계 동안에만이다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안 보충되지만, 제2 확장 단계 동안에만이다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 선택적 확장 단계 및 제2 확장 단계 둘 다 동안의 확장 동안 보충된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안(단일 확장, 선택적 확장, 제2 확장, 또는 선택적 화장 및 제2 확장 둘 다 동안이든), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11일마다 배양물에 첨가된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 확장 동안 1회, 2회 또는 3회만 보충된다(단일 확장, 선택적 확장, 제2 확장, 또는 선택적 확장 및 제2 확장 둘 다 동안이든).
특정 방법에서, 세포는 피더 세포를 첨가하지 않고 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 없이 생체외 확장 동안 배양되고, Cbl 억제제 또는 IL-2는 2일 또는 3일마다 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포의 첨가 없이, 그리고 항-CD3 항체 없이, 단일 확장을 사용하여 배양되고, 여기서 Cbl 억제제 및 IL-2는 2일 또는 3일마다 배양물에 첨가된다. 다른 구현예에서, 세포는 조사된 말초 혈액 단핵 세포를 첨가하지 않고, 제2 확장 단계 동안 항-CD3 항체 없이 이중 확장을 사용하여 배양되며, 여기서 Cbl 억제제 및 IL-2는 선택적 확장 단계 및 제2 확장 단계 동안 2 또는 3일마다 배양물에 첨가된다.
특정 구현예에서, 면역 세포는 약 1일 내지 약 48일, 약 7일 내지 약 28일, 약 7일 내지 약 24일, 약 11일 내지 약 24일, 약 1일 내지 약 28일, 약 2일 내지 약 24일, 약 3일 내지 약 20일, 약 4 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 12일, 또는 약 8일 내지 약 14일의 기간 동안 본원에 기재된 방법을 사용하여 확장시킨다.
일부 구현예에서, 확장은 단일 확장이며, 약 7일 내지 약 28일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이며, 약 11일 내지 약 28일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이며, 약 10일 내지 약 24일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이며, 약 7일 내지 약 14일의 기간 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고, 10일 동안이다. 다른 구현예에서, 확장은 단일 확장이고 11일 동안이다.
일부 구현예에서, 확장은 이중 확장이고, 여기서 선택적 확장은 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 8일, 약 3일 내지 10일, 약 3일 내지 12일, 약 3일 내지 14일, 3일 내지 18일, 3일 내지 22일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 8일, 약 4일 내지 10일, 약 4일 내지 12일, 약 4일 내지 14일, 약 4일 내지 18일, 약 4일 내지 약 22일, 약 5일 내지 8일, 약 5일 내지 10일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 21일, 약 5일 내지 약 28일, 약 6일 내지 8일, 약 6일 내지 10일, 약 6일 내지 12일, 약 6일 내지 14일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 21일, 약 6일 내지 약 28일, 약 7일 내지 8일, 약 7일 내지 10일, 약 7일 내지 12일, 약 7일 내지 14일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 21일, 약 8일 내지 10일, 약 8일 내지 12일, 약 8일 내지 14일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 21일, 또는 약 8일 내지 약 28일이다. 다른 구현예에서, 확장은 이중 확장이고, 여기서 제2 확장은 약 3일 내지 약 15일, 약 4일 내지 14일, 약 5일 내지 13일, 약 6일 내지 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 21일, 약 6일 내지 약 28일, 약 7일 내지 8일, 약 7일 내지 10일, 약 7일 내지 12일, 약 7일 내지 14일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 21일, 약 8일 내지 10일, 약 8일 내지 12일, 약 8일 내지 14일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 21일, 또는 약 8일 내지 약 28일이다.
일부 구현예에서, 생체외 확장의 총 기간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 14일, 약 18일, 약 22일, 또는 약 28일 동안이다. 다른 구현예에서, 생체외 확장의 총 기간은 10일 내지 14일이다. 또 다른 구현예에서, 생체외 확장의 총 기간은 14일 내지 22일이다. 바람직한 구현예에서, 세포는 암 환자 또는 이를 필요로 하는 환자에게 주입 전 14일 미만 동안 확장된다. 보다 바람직한 구현예에서, 세포는 암 환자 또는 이를 필요로 하는 환자에게 주입 전 11일 미만 동안 확장된다.
확장된 면역 세포의 표현형
일반적으로, 주입 집단(환자에게 주입되는 면역 세포)의 목적하는 표현형은 더 나은 환자의 치료 결과와 상관되는 특성을 포함한다. 이와 같이, 특정 구현예에서 목적하는 표현형은 세포의 개시 집단에 무관하게 동일할 것이다(예를 들어, 확장된 면역 세포가 직접 사용되든 또는 확장된 면역 세포가 바람직한 특성에 대해 추가로 스크리닝되든).
특정 방법에서, 확장된 면역 세포는 바람직한 특성에 대해 스크리닝되고, 확장된 세포의 하위 집단은 환자에게 주입하기 위해 선택된다. 이 경우, 개시 집단은 확장된 면역 세포이고, 주입 집단은 주입을 위해 선택된 확장된 세포의 서브세트이다. 일부 구현예에서, 주입 집단은 종양 인식 활성을 나타내는 면역 세포로 농축된다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 조작된 T 세포 수용체를 발현하는 면역 세포로 농축된다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 조작된 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포로 농축된다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제의 존재하에서 확장된 면역 세포는 바람직한 특성을 갖는 세포를 위해 이미 농축된다. 결과적으로, 특정 구현예에서 Cbl 억제제의 존재하에서 확장되는 면역 세포는 환자에게 주입하기 위한 바람직한 하위 집단을 확인하기 위한 추가 선택 단계를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 확장된 면역 세포는 IL-2 및/또는 IFNγ를 생산하는 이들의 능력에 대해 스크리닝되고, IL-2 또는 IFNγ 생산 세포에 대해 농축된 세포의 하위 집단이 선택된다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 성숙 단계 특이적 마커를 사용하여 T 세포 표현형에 대해 스크리닝되고, 목적하는 성숙 단계를 위해 농축된 세포의 하위 집단이 선택된다. 예를 들어, 바람직한 특성은 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 면역 세포일 수 있다: CD8+, CD45RA+, CD45RA-, CD45RO+, CD45RO-, CD95+, CD95-, CCR7+, CD62L+, CD62L-, CCR7-, CD56+, IL-2Rβ+ 및 IL-2Rβ-. 다른 구현예에서, 면역 세포는 기억 표현형을 갖는 T 세포에 대해 스크리닝되고, 기억 T 세포에 대해 농축된 세포의 하위 집단이 선택된다. 또 다른 구현예에서, 면역 세포는 TCM 또는 TSCM 세포에 대해 스크리닝되고 TCM 또는 TSCM 세포에 대해 농축된 세포의 하위 집단이 선택된다. TCM과 TSCM을 구별하는 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: Schmueck-Henneresse et al., J. Immunol., 194(11):5559-5567 (2015) and Berger et al., J. Clin. Invest., 118(1):294-305 (2008)]에 의해 기재된다.
일부 구현예에서, 주입 집단은 개시 집단보다 더 큰 백분율 및/또는 더 많은 수의 TIL을 포함한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 개시 집단보다 더 큰 백분율 및/또는 더 많은 수의 T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 주입은 개시 집단보다 더 큰 백분율 및/또는 더 많은 수의 TCM 또는 TSCM 세포를 함유한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 개시 집단보다 더 큰 백분율 및/또는 더 많은 수의 TEM 세포를 함유한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 개시 집단보다 더 낮은 백분율 및/또는 더 적은 수의 나이브 T 세포를 함유한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 주입 집단은 약 10 내지 약 20%의 기억 T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 주입 집단은 약 5 내지 약 40%의 기억 T 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 주입 집단은 약 10 내지 약 30%의 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 TCM 또는 TSCM이다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD45RO+ 세포이다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 CD8+ 세포에 대해 농축된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 CD4+ 세포의 양이 감소된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 CD8+ 중심 기억 세포에 대해 농축된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 CD107a의 분비가 증가된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 그랜자임, 예를 들어, 그랜자임 B의 분비가 증가된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 사이토카인의 분비가 증가된 확장된 TIL을 제공한다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, GMCSF, MIP1α, MIP1βb, IP10, IL-2, IL-8, IL-7, IL-21, IL-23 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 농축 또는 증가 또는 감소는 Cbl 억제제의 부재하에 채취되거나 확장된 유사한 TIL에 대해서이다. 특정 구현예에서, 농축, 증가 또는 감소는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200% 이상이다. 양은 본원의 실시예에 기재된 것들과 같은 표준 기술에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 주입 집단은 동결보존 배지에서 제형화되어 액체 질소 냉동고(-195℃) 또는 초저온 냉동고(-65℃, -80℃, 또는 -120℃)와 같은 극저온 저장 유닛에 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 또는 적어도 5년의 장기간 저장을 위해 배치된다. 동결보존 배지는 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 또는 8.0 내지 8.5의 pH를 유지하기 위한 배양 배지 또는 생리학적 완충제와 함께 글리세롤, DMSO(디메틸설폭사이드), NaCl, 덱스트로스, 덱스트란 설페이트, 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 포함할 수 있다. 냉동된 세포를 해동하고 추가의 자극 및/또는 확장 라운드를 수행할 수 있다. 동결보존된 T 세포는 극저온 저장 조건하에서 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월, 또는 적어도 약 60개월 동안 이들의 생물학적 기능을 유지한다. 일부 측면에서, 방부제는 제형에 사용되지 않는다. 동결보존된 T 세포는 해동하여 동종 기성품 세포 생성물로 여러 환자에게 투여(예: 주입)될 수 있다.
치료 방법
본원에 제공된 세포 치료 방법에서, 확장된 세포는 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 환자는 공여체와 동일하다. 특정 구현예에서, 환자와 공여체는 동일한 개체가 아니다. 특정 구현예에서, 공여체는 이종이며, 환자는 인간이다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 방법에 따라 자가 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 방법에 따라 동종이계 세포가 투여된다.
세포-기반 면역요법의 방법이 본원에 개시되어 있다. 세포 기반 면역요법 방법은 입양 세포 요법, 종양 침윤성 림프구(TIL) 기반 요법, 키메라 T 세포 수용체(CAR) T 세포 요법, 조작된 T 세포 수용체(TCR) 요법, 자연 살해 세포(NK) 요법 또는 자연 살해 키메라 항원 수용체 요법(NKCAR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 치료의 하나 이상의 세션에서 주입 집단이 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게, 본원에 제공된 바와 같이 생체외 또는 시험관내에서 생성된 유효량의 면역 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 주입 집단의 치료적 유효 용량은 약 100만 내지 약 2000억 세포의 범위 내, 예를 들어, 100만 내지 약 500억 세포(예: 약 500만 세포, 약 2500만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개로 정의되는 범위), 예를 들어 약 1,000만 내지 약 1,000억 세포(예: 약 2000만 세포, 약 3000만 세포, 약 4000만 세포, 약 6000만 세포, 약 7000만 세포, 약 8000만 세포, 약 9천만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개로 정의되는 범위), 일부 경우에, 약 1억 세포 내지 약 500억 세포(예: 약 1억 2000만 세포, 약 2억 5000만 세포, 약 3억 5000만 세포, 약 4억 5000만 세포, 약 6억 5000만 세포, 약 8억 세포, 약 9억 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포), 또는 이러한 범위 내의 임의의 값일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 체중 1kg당 2x106 내지 2x108개의 생존가능한 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
주입 집단 및 이의 조성물은 이를 필요로 하는 개체에게, 표준 투여 기술, 제형화, 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알과 같은 장치에 의한 제형화 및 투여가 제공된다. 면역 세포를 포함하는 제형 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 폐 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 비경구적으로 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다. 변형된 면역 세포의 조성물은 무균 액체 제제, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 유액, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공될 수 있으며, 이는 일부 측면에서, 선택된 pH로 완충될 수 있다. 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기에 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 용매, 예를 들어, 적절한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들어, 멸균수, 생리학적 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 면역 세포를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 주입 집단은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공투여된다.
일부 구현예에서, 개체는 면역 세포의 주입 집단이 투여되기 전에 제조 섭생 받는다. 예를 들어, 주입 집단을 받기 전에, 개체는 면역억제, 면역 고갈, 림프구 클리어런스, 또는 줄기 세포 플러싱(flushing) 중 하나 이상을 받을 수 있다.
면역억제에 사용할 수 있는 제제는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 릴로나셉, 칸나키누맙, 브로달루맙, 아나킨라, 레슬리주맙, 우스테키누맙, 메폴리주맙, 토실리주맙, 두필루맙, 익세키주맙, 세쿠키누맙, 구셀쿠맙, 틸드라키주맙, 벤랄리주맙, 사리루맙, 바실릭시맙, 리산키주맙, 실툭시맙, 다클리주맙, 포말리도마이드, 메토트렉세이트, 오말리주맙, 아자티오프린, 레날리도마이드, 탈리도마이드, 알레파셉트, 시롤리무스, 에팔리주맙, 미코페놀산, 미코페놀레이트 모페틸, 벨리무맙, 나탈리주맙, 핑골리모드, 레플루모마이드, 디메틸 푸마레이트, 에베롤리무스, 아바타셉트, 테리플루모마이드, 베돌리주맙, 에베롤리무스, 에마팔루맙, 시포니모드, 벨라타셉트, 바릭시티닙, 무로모납-cd3, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 에베롤리무스, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 또는 아달리무맙을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
면역 고갈에 사용될 수 있는 제제는 사이클로포스파미드(시톡산), 플루다라빈, 벤다무스틴, 시스플라틴, 에토포시드, 파클리탁셀 및 겜시타빈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
림프구 클리어런스에 사용될 수 있는 제제는 에토돌락을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
줄기 세포 동원 또는 플러싱에 사용될 수 있는 제제는 G-CSF, 페그필글라스팀, 사이클로포스파미드 및 플레릭사포르(Mozobil, Genzyme)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 보충 주입 전 치료로서 이들 제제 중 하나와 조합하여 투여된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 개체는 세포 주입 전 0 내지 60일, 0 내지 30일, 0 내지 15일, 0 내지 14일, 0 내지 13일, 0 내지 12일, 0 내지 11일, 0 내지 10일, 0 내지 9일, 0 내지 8일, 0 내지 7일, 0 내지 6일, 0 내지 5일, 0 내지 4일, 0 내지 3일, 0 내지 2일 또는 0 내지 1일 동안 치료 전 면역억제, 면역 고갈, 림프구 클리어런스, 줄기 세포 플러싱을 겪는다.
일부 구현예에서, 환자는 사이클로포스파미드와 플루다라빈의 조합에 의한 면역 고갈에 의해 조정(conditioning)된다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈은 표준 기술에 따라 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 200mg/m2/일 내지 약 2000mg/m2/일(예: 200mg/m2/일, 300mg/m2/일, 또는 500mg/m2/일)의 투여량이다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여량은 약 300mg/m2/일이다. 특정 구현예에서, 플루다라빈의 투여는 약 20mg/m2/일 내지 약 900mg/m2/일(예: 20mg/m2/일, 25mg/m2/일, 30mg/m2/일, 또는 60mg/m2/일)의 투여량이다. 특정 구현예에서, 플루다라빈의 투여량은 약 25mg/m2/일이다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 200mg/m2/일 내지 약 2000mg/m2/일(예: 200mg/m2/일, 300mg/m2/일, 또는 500mg/m2/일)의 투여량이고, 플루다라빈의 투여는 약 20mg/m2/일 내지 약 900mg/m2/일(예; 20mg/m2/일, 25mg/m2/일, 30mg/m2/일, 또는 60mg/m2/일)의 투여량이다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500mg/m2/일의 투여량이고, 플루다라빈의 투여는 약 30mg/m2/일의 투여량이다. 예시적인 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 3일 동안 500mg/m2/일이고, 플루다라빈의 투여는 3일 동안 30mg/m2/일이다. 림프구 고갈의 투여는 0일째 T 세포 주입에 비해 -6일 내지 -4일째(+/- 1일 윈도우, 즉 -7일째 내지 -5일째 투여 포함)에 예정될 수 있다. 림프구 고갈의 투여는 0일째 T 세포 주입에 비해 -5일째 내지 -3일째(+/- 1일 윈도우, 즉 -4일째 내지 -2일째 투여 포함)에 예정될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 세포 요법과 함께 사이토카인이 투여된다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다. IL-2는 표준 기술에 따라 투여된다. 특정 구현예에서, IL-2는 100,000IU/kg 내지 1,000,000IL/kg의 투여량으로 투여된다. 특정 구현예에서, IL-2 투여량은 400,000IU/kg 내지 800,000IU/kg이다. 특정 구현예에서, IL-2 투여량은 약 600,000IU/kg이다. 사이토카인의 투여는 0일째 T 세포 주입에 비해 1일 내지 3일째(+/- 1일 윈도우, 즉 2일 내지 4일째 투여 포함)에 예정될 수 있다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 투여 일정에 걸쳐 총 6회 투여량으로 8시간 마다 투여된다. 특정 구현예에서, IL-2는 1일 내지 3일째에 총 6회 투여 량으로 8시간 마다 투여된다.
일부 구현예에서, 개체는 하나 이상의 치료 세션에서 주입된 변형된 세포를 가질 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 세포-기반 면역요법은 다른 항암 요법과 조합하여 투여된다.
Cbl 억제제와의 병용 요법
특정 구현예에서, 세포 요법은 하나 이상의 Cbl 억제제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 치료 섭생에서, 변형된 면역 세포 및 Cbl 억제제 둘 다는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되며, 여기서 Cbl 억제제는 본원에 기재된 화합물 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
일부 구현예에서, 전문이 참조로 포함된 WO2019/148005에 개시된 하나 이상의 소분자 Cbl 억제제가 본원에 기재된 치료 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 화학식 A에 따른다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 화합물 101 내지 129로부터 선택된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 화합물 116이다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제의 조합이 사용된다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 항체이다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 펩티드이다. 특정 구현예에서, Cbl 억제제는 siRNA이다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 치료 세포를 받고 있는 환자에게 투여되어 상기 세포의 생착을 지지한다.
이들 구현예들 중 일부에서, 생착되는 상기 세포는 조직 또는 기관으로서 조직화된다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 Cbl 억제제는 이식된 골수, 피부, 각막, 힘줄, 뼈 조직, 혈관 또는 심장 판막의 생착을 지지하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 심장, 폐, 신장, 간, 및 췌장을 포함하는 이식 가능한 기관을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 이식된 기관의 생착을 지지하기 위해 투여된다. 다른 구현예에서, Cbl 억제제는 면역 세포를 받고 있는 환자에게 투여되어 상기 면역 세포의 생착을 지지한다.
상기 치료 세포의 생착을 지지하기 위해 치료 세포를 받고 있는 개체에 대한 Cbl 억제제의 1일 투여량은 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg이다.
치료 세포를 받고 있는 환자는 면역 세포의 주입 후 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일, 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일, 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일, 또는 7 내지 60일 동안 상기 세포의 생착을 지지하기 위해 Cbl 억제제가 투여될 수 있다.
주입을 통해 받은 치료 세포의 생착을 지지하기 위한 Cbl 억제제의 유효량은 이를 필요로 하는 환자에게 투여시 환자 내에서 0 내지 0.5μM, 0 내지 1μM, 0 내지 5μM, 0 내지 10μM, 0 내지 25μM, 0 내지 50μM, 0 내지 100μM 또는 0 내지 1000μM의 상기 Cbl 억제제의 농도를 초래한다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제 이외에, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제 또는 화합물도 치료 세포의 주입 후 환자에게 투여되어 주입된 치료 세포의 생착을 촉진한다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 IL-2이다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 IL-7이다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 IL-15이다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 IL-21이다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 IL-7 및 IL-15의 조합이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 포함한다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제의 투여는 임의의 또는 모든 하나 이상의 추가 제제의 투여 필요성을 감소시키거나 심지어 제거한다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드는 Cbl 억제제가 없는 요법과 비교하여 감소된 투여량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 플루다라빈은 Cbl 억제제 없는 요법과 비교하여 감소된 투여량으로 투여된다. 특정 구현예에서, IL-2는 Cbl 억제제 없는 요법과 비교하여 감소된 투여량으로 투여된다. 특정 구현예에서, IL-2는 투여되지 않는다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500mg/m2/일의 투여량이고, 플루다라빈의 투여는 약 25mg/m2/일의 투여량이다. 예시적인 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 3일 동안 500mg/m2/일이고, 플루다라빈의 투여는 3일 동안 25mg/m2/일이다. 림프구 고갈의 투여는 0일째 T 세포 주입에 비해 -5일 내지 -3일째(+/- 1일 창, 즉 -4일째 내지 -2일째 투여 포함)에 예정될 수 있다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드의 투여는 약 500mg/m2/일의 투여량이고, 플루다라빈의 투여는 약 25mg/m2/일의 투여량이고, IL-2는 투여되지 않는다.
T 세포 기능 장애
특정 구현예에서, 유효량의 Cbl 억제제는 T 세포 기능 장애를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
T 세포 기능 장애를 앓고 있는 개체에 대한 Cbl 억제제의 1일 용량은 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg이다.
T 세포 기능 장애의 치료를 위한 유효량의 Cbl 억제제는 이를 필요로 하는 환자에게 투여시 환자 내에서 0.0001 내지 0.5μM, 0.001 내지 1μM, 0.001 내지 5μM, 0.01 내지 10μM, 0.1 내지 25μM, 0.1 내지 50μM, 0.01 내지 100μM, 0.1 내지 1000의 상기 Cbl 억제제의 농도를 초래한다. , .
T 세포 기능 장애를 앓고 있는 환자는 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일 또는 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일 또는 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일 또는 7 내지 60일 동안 Cbl 억제제로 치료될 수 있다.
Cbl 억제제에 의한 주입 후 치료
특정 구현예에서, Cbl 억제제는 개체에게 면역 세포의 주입 후에 투여된다. 면역 세포의 주입과 Cbl 억제제의 투여 사이의, 또는 그 반대의, 시간은 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 10분 내지 약 1시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 20분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 45분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 15시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간일 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 후 지지 요법으로서 투여된다. 일부 구현예에서, 이 기간은 약 1일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 7일, 6일 내지 약 7일, 1일 내지 약 2주, 또는 1주 내지 약 3주, 1주 내지 약 4주, 1주 내지 약 6주, 1주 내지 약 9주, 1주 내지 약 12주, 1주 내지 약 24주, 1주 내지 약 48주, 1주 내지 약 52주, 1주 내지약 60주, 1주 내지 약 100주일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 치료 섭생은 입양 세포 요법 및 화학 요법 모두를 포함한다. 본원에 기재된 치료 섭생의 일부 구현예는 약물 향상 입양 세포 요법(DE-ACT), 약물 향상 종양 침윤성 림프구(DE-TIL) 요법, 약물 향상 키메라 항원 수용체 요법(DE-CAR T) 또는 약물 향상 NK-CAR 세포 요법을 포함한다.
주입 집단이 개체에게 투여된 후, 개체의 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가할 파라미터는 생체내(예: 이미징에 의해) 또는 생체외(예: ELISA 또는 유세포 계측법에 의해)에서 변형 면역 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 파괴하는 변형된 면역 세포의 능력은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 문헌[참조: Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7):689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체의 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 또한 IL-2 및 IFNγ와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 주입 후 면역 세포의 생물학적 활성은 종양 크기 또는 종양 수의 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
치료되는 병태
본원의 방법 및 조성물은 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 상병태의 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 병태는 암(cancer)이다. 특정 구현예에서, 병태는 종양(tumor)이다. 특정 구현예에서, 병태는 혈액암(hematologic cancer)이다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 암은 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 또는 골수종(myeloma)과 같은 혈액암이다. 본원에서 고려되는 혈액암은 하나 이상의 백혈병, 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병(B-cell acute lymphoid leukemia; "BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-cell acute lymphoid leukemia; "TALL"), 급성 림프성 백혈병(acute lymphoid leukemia; ALL); 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML) 및 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B-세포 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 모세포 백혈병(hairy cell leukemia), 소세포 또는 거대세포 여포성 림프종(small cell- or a large cell-follicular lymphoma), 악성 림프 증식성 병태(malignant lymphoproliferative conditions), MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 변연부 림프종(Marginal zone lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성(myelodysplasia) 및 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 병태, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 형질세포양 수지상 세포 신생물(plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia) 및 "전백혈병(preleukemia)"을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이는 골수 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성(dysplasia))에 의해 통합된 혈액학적 병태의 다양한 수집이다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 암은 육종(sarcoma), 암종(carcinoma), 또는 흑색종(melanoma)과 같은 비혈액암(non-hematologic cancer)이다. 본원에서 고려되는 비혈액암은 신경모세포종(neuroblastoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 상피 편평 세포암(epithelial squamous cell cancer), 흑색종, 위암(stomach cancer), 뇌암(brain cancer), 폐암(lung cancer)(예: NSCLC), 췌장암(pancreatic cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 부신암(adrenal cancer), 및 두경부암(head and neck cancer)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 흑색종이다. 특정 구현예에서, 암은 자궁경부암이다. 특정 구현예에서, 암은 난소암이다. 특정 구현예에서, 암은 두경부 편평 세포 암종이다. 특정 구현예에서, 암은 비소세포 폐암(non-small cell lung caner)이다.
일부 구현예에서, 암은 전신 요법의 하나 이상의 라인 후에 재발되거나 난치성이다.
투여 형태
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Cbl 억제제는 개체에게 경구 투여하기 위한 환제, 캡슐, 정제, 시럽, 앰풀, 로젠지, 분말로서 제형화된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 주입 또는 주사용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, Cbl 억제제는 시험관내 또는 생체외에서 세포 배양에 사용하기 위해 제형화된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 본원에 제공된 Cbl 억제제는 약제학적 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본원에 제공된 약제학적 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 예방적 또는 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 Cbl 억제제를 포함한다. 면역 세포를 제공하기 전에 생체내 활성화를 겪는 개체에서, Cbl 억제제의 양은 미처리된 참조 샘플과 비교하여 생체내에서 면역 세포의 활성을 조절하기에 충분한 양이다. Cbl 억제제는 1일 1회, 2회, 또는 3회, 1일 4회, 또는 5회 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포-기반 면역요법을 위한 개체에 대한 Cbl 억제제의 1일 용량은 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg이다.
특정 구현예에서, Cbl 억제제의 유효량은 개체에게 투여시 생체내 활성화 단계 동안 영향을 받은 조직 또는 종양 또는 인접 또는 주변 영역 내에서 0 내지 0.5μM, 0 내지 1μM, 0 내지 5μM, 0 내지 10μM, 0 내지 25μM, 0 내지 50μM, 0 내지 100μM 또는 0 내지 1000μM의 상기 억제제의 농도를 초래한다.
본원에 제공된 방법에 의해 생성된 세포는 표준 기술에 따라 제형화되고 투여될 수 있다. 간단히, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에 기재된 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예를 들어, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란 또는 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA 및 글루타티온; 보조제(예: 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 병태, 환자의 질환 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이며, 적절한 용량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
실시예
실시예 1: 종양 조직으로부터 생체외 인간 종양 침윤성 림프구( TIL )의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
인간 난소 및 결장 종양 샘플은 협동 인간 조직 네트워크(Cooperative Human Tissue Network)(CHTN, c/o Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN)에서 입수했다. 고형 종양 표본은 주변 지방 및 괴사 영역이 없도록 조심스럽게 절개되었다. 메스와 메스 홀더를 사용하여 무균 조건하에서 종양을 8 mm3(2x2x2mm3) 단편으로 잘랐다.
종양 세포주 생성을 위해, 다수의 단편을 무혈청 RPMI 1640 배지 중 1mg/ml 워싱턴 콜라게나제 타입 4, 10μg/ml 겐타마이신 및 3000U/ml DNAse의 혼합물에 침지시켰다. 종양 단편을 먼저 밀테니 젠틀맥 옥토 디스소시에이터를 사용하여 처리하고, 부드럽게 교반하면서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 단일 세포 슬러리를 멸균 메쉬를 통해 통과시켜 미소화된 조직 단편을 제거하였다. 생성된 세포의 슬러리를 세척하고 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 100% 피콜, 75% 피콜 및 25% 배지를 사용하여 2단계 구배에 적층시켰다. 2000rpm에서 20분간 원심분리한 후, 계면을 수집하였다. 상부 종양 세포 농축 분획을 20% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 배지 중 T75 조직 배양 플라스크(VWR)에서 약 1x106 종양 세포로 플레이팅하였다.
TIL 생성을 위해, 25mM HEPES, 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청, 100U/mL 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10μg/ml 겐타마이신 및 0.25μg/ml 펀기존을 함유하는 2mL RPMI 배지(완전 배지; CM)를 함유하는 24웰 플레이트의 각 웰에 단일 8mm3 종양 단편을 0.1 내지 10μM의 Cbl 억제제의 존재 또는 부재하에 6000IU/mL IL-2, 또는 0.1 내지 10μM의 Cbl 억제제 단독과 함께 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2를 갖는 가습화된 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 배양 개시 후, 2일마다 배지의 절반을 교체하였다. 웰이 합류되면 내용물을 격렬하게 혼합하고 두 딸 웰로 분할하고, 0.1 내지 10μM의 Cbl 억제제의 존재 또는 부재하에 6000IU/mL IL-2, 또는 0.1 내지 10μM의 Cbl 억제제 단독과 함께 RPMI 배지를 웰당 2mL로 충전시켰다. 이어서, 배지의 절반을 매주 3회 교체하고, 배양물을 분할하여 1×106 세포/mL의 세포 밀도를 유지시켰다. TIL을 풀링하고, 17일째와 28일째에 계수하고, 28일째에, 계통(CD4, CD8), 분화, 및 ICOS, CD45RA, CD45RO, CD95, CCR7, CD62L, CD3ε, CD8α, CD14, CD19, CD20, CD11c, TCF1, PD-1, TIM3, LAG3, CD27, CD28, CD127, PD-1, CD122, CD132, KLRG-1, HLA, HLA-DR, CD33, CD61, Cd235, TCRγ, TCRδ, CD38, CD69, CD11a, CD58, CD99, CD103, CCR4, CCR5, CCR6, CCR9, CCR10, CXCR3, CXCR4, CLA, CD161, IL-18Ra, c-Kit 및 CD130을 포함하는 다른 T 세포 마커의 발현을 측정함으로써 유세포 계측법으로 면역표현형화했다. Mitotracker, Mitoprobe, 및 2-NBDG를 포함하는 미토콘드리아 마커를 또한 사용하여 세포의 분화 및/또는 활성화를 평가할 수 있다. 초기 TIL 생성 단계는 유사한 결과와 함께 28일에서 약 7 내지 11일로 단축될 수 있다.
도 및 표 2 내지 7의 데이터는 화합물 103을 사용한 것이다. 도 1은 세포/웰의 평균 수와 종양 샘플 간의 TIL 확장 변동의 크기를 도시한다. 이런 이유로, 총 세포 수를 IL-2 단독 상태의 백분율로서 표 2에 제시된다. 도 1a는 IL-2 단독 또는 Cbl 억제제 단독을 포함하는 세포의 평균 수를 도시한다. 도 1b는 IL-2 단독, 또는 0.1, 1, 또는 10μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2를 포함하는 세포의 평균 수를 도시한다. 도 4a 내지 4d는 난소 TIL 및 결장 TIL과 함께 IL-2 단독; 0.1, 1 또는 10μM의 Cbl 억제제; 또는 0.1, 1 또는 10μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2를 갖는 세포의 평균 수를 도시한다. 도 5a는 결장 TIL과 함께 IL-2 단독; 0.5μM의 Cbl 억제제; 또는 0.50μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2를 갖는 세포의 평균 수를 도시한다. 도 5b는 결장 TIL과 함께 IL-2 단독; 0.3, 0.5 또는 10μM의 Cbl 억제제; 또는 0.3, 0.5 또는 10μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2를 갖는 세포의 평균 수를 도시한다. 도 6은 종양 단편 또는 종양 현탁액으로부터의 결장 TIL과 함께 IL-2 단독; 0.5μM의 Cbl 억제제; 또는 0.50μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2를 포함하는 세포의 평균 수를 도시한다. 주목할 만하게, Cbl 억제제의 존재하에 TIL을 배양하면 IL-2의 부재하에서도 TIL의 상당한 확장을 초래했다. 이는, Cbl 억제제와 IL-2 둘 다의 부재하에 배양된 종양 샘플이 임의의 살아 있는 세포를 생성하지 않았음을 고려하면, 놀라운 일이다. 또한, IL-2 및 Cbl 억제제의 존재하에서 TIL을 배양하는 경우, IL-2 또는 Cbl 억제제 단독의 존재하에서 TIL을 배양한 경우보다 4개의 종양 샘플 중 2개(TIL1 및 TIL4)로부터 실질적으로 더 많은 TIL의 생산을 초래했다. 따라서, Cbl 억제제는 IL2의 부재하에서 세포 생존을 지지하고 일부 종양 샘플에서 IL-2의 효과를 향상시킨다.
[표 2]
Figure pct00029
급속한 확장 프로토콜
급속한 확장 프로토콜(REP)은 조사된 동종이계 피더 세포(Astarte Biologics)의 존재하에서 OKT3(항-CD3) 항체(Thermo Fisher Scientific)와 IL-2를, 피더 세포와 반응성 TIL 세포의 200:1 비율로 사용했다. PBMC, OKT3 항체(30 ng/mL), 완전 배지("CM"), AIM V 배지(GIBCO/BRL), 및 TIL 이펙터 세포를 조합하고, 혼합하고, 75cm2의 조직 배양 플라스크에 분액화하였다. 플라스크를 5% CO2 중 37℃에서 직립 배양하였다. 2일째에 IL-2(6000IU/mL) 및/또는 Cbl 억제제(0.1, 1, 10μM)를 첨가하였다. 5일째에, 배양 상청액을 흡인에 의해 제거하고, 배지를 6000IU/mL IL-2 및/또는 Cbl 억제제를 함유하는 CM/AIMV의 1:1 혼합물로 교체하였다. 6일째, 그리고 그 후 매일, 세포 농도를 결정하고, 세포를 세포 밀도를 약 1×106 세포/mL로 유지하기 위해 필요에 따라 6000 CU/mL IL-2/Cbl 억제제를 함유하는 추가 배지를 포함하는 추가의 플라스크로 분할하였다. REP의 개시 후 약 14일에, 세포를 채취하고, 미래의 실험 분석을 위해 동결보존하였다.
pre-REP 프로토콜 동안 확장된 TIL만이 REP 프로토콜에서 추가로 확장되었다: TIL1, TIL3, TIL4 및 TIL6. REP 동안 TIL 확장의 크기는 종양 샘플간에 달랐다. 이런 이유로, 총 세포 수는 REP 확장 프로토콜 동안 IL-2 단독 상태의 백분율로서 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
Figure pct00030
T 림프구는 표 4에 나타낸 바와 같이 발생 모델(Restifo, Blood, 124:476- 477, 2014)에 따라 계통 및 분화 마커 발현에 기초하여 정의되었다. 흥미롭게도, Cbl 억제제의 존재하에 생체외에서 확장된 인간 TIL은 표 5에 나타낸 바와 같이, TCM(CD45RO+, CD95+, CCR7+, CD62L+) 또는 TEM(CD45RO+, CD95+, CCR7-, CD62L-) 표현형을 갖는다. 추가로, Cbl 억제제는 도 7에 도시된 바와 같이, 악성 난소 종양 샘플로부터 CD8+ T 림프구를 선택적으로 확장시키는 것으로 밝혀졌다. 이는, TIL을 IL-2 단독으로 생체외에서 배양한 경우, 본질적으로 동등한 수의 CD4+ 및 CD8+ T 림프구가 생성되었다는 것을 고려하면, 주목할 만하다. 단핵구(CD14+), B 세포(CD20+) 및 NK 세포(CD56+)는 총 세포 수의 10% 미만을 차지하였다.
[표 4]
Figure pct00031
[표 5]
Figure pct00032
실시예 2: 말초 혈액 단핵 세포로부터 항원 특이적 인간 T 세포의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
Cbl 억제제의 존재하에 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포의 생체외 확장이 평가되었다.
CMV pp65(495-503) 반응성 T 세포는 CMV 혈청 양성 공여체(Conversant)를 해동하여 확장시켰고, 2x106 세포/ml를 1% GlutaMax(Gibco), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청(Corning), 1μg/ml CMV pp65(495-503)(Anaspec), 2ng/mL IL-2(R&D) 및/또는 Cbl 억제제(01, 1, 10μM)가 보충된 RPMI 배지(Gibco)에 재현탁시켰다. PBMC를 IL-2 및/또는 Cbl 억제제와 함께 8일 동안 배양하고, 3일 및 5일째에 보충하였다. 8일째에 세포를 채취하고, 저용량 IL-2(100U/ml) 및/또는 Cbl 억제제를 200만/ml로 완전 RPMI 배지에 2일 동안 재플레이팅하였다. 11일째에, 세포를 풀링하고, 계수하고, 11일째에 계통(CD4, CD8) 및 분화(CD45RA, CD45RO, CD95, CCR7, CD62L, TCF1, PD-1, TIM3 LAG3) 마커의 발현을 측정하여 유세포 계측법에 의해 면역표현형화하였다.
확장의 크기는 샘플 간에 다양했다. 주목할 만하게, Cbl 억제제의 존재하에 T 세포를 배양하면 IL-2의 부재하에서도 T 세포의 상당한 확장을 초래하였다.
[표 6]
Figure pct00033
T 림프구는 표 4에 나타낸 바와 같이 발생 모델(Restifo, Blood, 124:476- 477, 2014)에 따라 계통 및 분화 마커 발현에 기초하여 정의되었다. 흥미롭게도, Cbl 억제제의 존재하에 생체외에서 확장된 인간 T 세포는 표 7에 나타낸 바와 같이, TSCM(CD45RA+, CD95+, CCR7+, CD62L+), TCM(CD45RO+, CD95+, CCR7+, CD62L+) 또는 TEM(CD45RO+, CD95+, CCR7-, CD62L-) 표현형을 갖는다. 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제는 공여체 PBMC로부터 CD8+ T 림프구를 선택적으로 확장시키는 것으로 밝혀졌다. 도 2a는 IL-2의 부재하(도 2a) 및 존재하(도 2b)에 IL-2, 0.1μM의 Cbl 억제제, 1μM의 Cbl 억제제 및 10μM의 Cbl 억제제의 존재하에 PBMC 샘플로부터 T 세포의 선택적 확장을 도시한다. 0.1 또는 0.5μM의 Cbl 억제제와 조합된 IL-2의 존재하에서 배양된 세포는 배양 중 CD8+ 세포의 최고 백분율을 나타냈다. 게다가, 1μM의 Cbl 억제제 단독에서 배양된 세포는 IL-2 단독에서 배양된 세포보다 더 높은 백분율의 CD8+ 세포를 나타냈다.
[표 7]
Figure pct00034
T 세포 활성은 사이토카인 분비의 분석에 의해 결정되었다. 이러한 확장된 T 세포가 세포외 자극에 반응할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, T 세포를 25ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 0.5μM 이오노마이신으로 자극하였다. 90분 자극 후, 모넨신 1:50(GolgiStop, BD Biosciences)이 첨가되었다. 6시간 후, 세포를 CD4+, CD8+, CD45RA+, CD95+, CCR7+, CD62L+의 표면 발현을 위해 염색하고, 이어서 고정시키고, 투과하고 세포내 사이토카인인 IFN-γ를 염색시켰다. 6시간 후, 본 발명자들은 T 세포가 IL-2 및 Cbl 억제제로 확장되었을 때 항종양 반응의 중요한 이펙터인 축적된 세포내 IFN-γ의 명백한 증가를 관찰했다. 본 발명자들은 CD4/8+ T 세포의 약 50%가 IL-2 확장된 T 세포에서 IFN-γ 발현에 양성이었고, 85%를 초과하는 IL-2 및 Cbl 억제제 확장된 CD4/8+ T 세포가 IFN-γ를 생산할 수 있었음을 발견했다. 도 3a는 Cbl 억제제 및 IL-2의 존재하에서 배양된 T 세포가 IL-2 단독 또는 Cbl 억제제 단독의 존재하에서 배양된 것들보다 더 높은 수준의 CD4/CD8+ 및 IFNγ+ 세포 모두를 나타냈음을 도시한다. CD4/8+ 세포와 IFNγ+ 세포 모두의 발현은 IL-2 및 Cbl 억제제로 확장된 T 세포가 항종양 반응을 유도하는 기능적 가능성을 함유한다는 것을 시사한다.
실시예 3: 기체 투과성 플라스크를 사용한 종양 조직으로부터 생체외 인간 종양 침윤성 림프구( TIL )의 확장을 위한 Cbl 억제제의 평가
도 6은 TIL 배양의 최적의 출발 물질을 결정하기 위한 연구 결과를 제공한다. 종양 단편 대 결장 종양의 종양 세포 현탁액을 사용한 연구에서, 종양 단편으로부터 11일 동안 성장된 배양물은 TIL 배양의 출발 물질로서 종양 세포 현탁액을 사용한 배양물보다 약 10배 더 높은 확장을 보였다.
배양은 40mL 용량 및 10cm2 가스 투과성 규소 바닥(GREX6M; Wilson Wolf Manufacturing, MN)이 있는 가스 투과성 플라스크에서 시작하였고, 각 플라스크에 0일째(D0) 또는 3일째(D3)에 단독으로 또는 조합하여 첨가된 IL-2 및/또는 1uM의 Cbl 억제제를 포함하는 40mL 배지 중 5개의 종양 단편을 적재했다. G-REX 웰을 가습화된 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 7 내지 28일 동안 배양했다.
도 8은 0일 또는 3일째의 IL-2 또는 Cbl 억제제의 첨가가 비교된 2개의 상이한 난소 종양 샘플로부터의 세포 증식을 위한 가스 투과성 규소 바닥을 갖는 가스 투과성 플라스크를 사용한 7일째 결과를 제공한다. "A"는 0일째 IL-2 단독의 첨가이다. "B"는 0일째 IL-2 및 1μM의 Cbl 억제제의 첨가이다. "C"는 0일째 IL-2의 첨가 및 3일째 1μM의 Cbl 억제제의 첨가이다. "D"는 3일째 IL-2의 첨가 및 3일째 Cbl 억제제의 첨가이다. "E"는 0일째 Cbl 억제제의 첨가이다.
실시예 4: 종양 모델에서의 효능 및 작용 메카니즘을 결정하기 위한 생체내로 전달된 항원 특이적 T 세포의 생체외 확장에 대한 Cbl 억제제 효과의 평가.
Cbl 억제제의 존재하에 생체외에서 종양 특이적 T 세포의 배양은 IL-2 단독을 사용하는 표준 배양 조건과 비교하여 우수한 항종양 효과를 제공할 수 있다. 본 실시예에서, T 세포를 단독으로 또는 IL-2와 조합하여 화합물 103에 짧은 3일간 생체외 노출시킨 것만으로도, 대조군과 비교하여 세포를 종양 보유 동물에게 전달시 1개월 이상 동안 지속하는 항종양 표현형을 제공함을 입증했다.
유전자 도입 마우스로부터의 항원 특이적 T 세포는 Cbl 억제제를 이용한 생체외 CAR T 또는 TIL 확장의 모델로서 활용될 수 있다. 시판되는 OT-1 유전자 도입 동물은 MHCI 분자에 의해 제시될 때 OVA 펩티드 aa 257-264를 인식하는 CD8 T 세포를 갖는다. OT-1 마우스의 CD8+ T 세포는 음성 선택에 의해 비장 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 단리되었다(StemCell Technologies cat# 19853 EasySep™ 마우스 CD8+ T 세포 단리 키트). 이어서, 세포를 완전 배지(RPMI1640, 10% 열 불활성화 FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 글루타민 및 β-머캅토에탄올)에 0.5 x 106/mL의 농도로 재현탁시켰다. 6웰 조직 배양 플레이트(Falcon)를 2ug/mL의 항-마우스 CD3(Bio Xcell Cat #BE0001-1-R 100mg 생체내 MAb 항-마우스 CD3ε 클론: 145-2C11)으로 37℃에서 3시간 초과 동안 코팅하고, 세포 첨가 전 PBS(MediaTech)로 세척했다. 생체외 확장을 위해, 1.5 x 106 세포/웰을 IL-2(300IU)(R&D Systems), Cbl 억제제(1μM) 또는 IL-2와 Cbl 억제제의 조합의 존재하에 배양했다. Cbl 억제제는 마우스 CBLB와 상호작용하고 향상된 증식 및 사이토카인 분비의 유사한 프로필을 입증하는 것으로 나타났다. OT-1 T 세포의 활성화 및 확장 3일 후, 세포를 수집하고 계수하고, 분화 및 CD3, CD4, CD8, CD45, CD25, 그랜자임 B, CD107a, CD127, PD-1, TIM3, LAG3, KLRG-1, ICOS, TCF1, Ki67, T-bet 및 FOXP3을 포함하는 추가의 T 세포 마커의 발현을 측정하여 유세포 계측법으로 면역표현형화였다. 측정된 향상된 그랜자임 및 T-bet로서, 확장 동안 CBL 억제제의 포함에 응답하여 증가된 이펙터 기능의 경향이 발견되었다.
죽은 세포는 OVA 항원을 발현하는 EG.7 림프종 모델에서 이들의 수송 및 기능을 모니터링하기 위해 생체내 전달하기 전에 제거되었다(Miltenyi Biotec Cat # 130-090-101). 마우스당 약 500만 개의 세포를 평균 종양 부담이 약 70mm3인 마우스로 옮겼다. OT-1 세포를 생체내 전달 후, 항종양 반응을 경시적으로 모니터링하고, 면역 반응의 질과 양을 다양한 시점에서 평가하였다. 혈액 및 비장 유래의 OT-1 세포는 전달 후 4일 및 9일째에 분석되었을 때 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도 및 생체내 지속성을 입증했다. 또한, Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포는 줄기 마커 TCF1+, PD-1+ 및 TIM-3-를 발현하는 더 높은 백분율의 세포를 나타냈다.
도 9는 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 E.G7-OVA 세포가 피하 이식된 마우스에서 확립된 종양을 거부할 수 있는 강력한 이펙터임을 보여주는 결과를 제공한다.
도 10은 Cbl 억제제로 확장된 OT-1 세포가 총 CD8+ T 세포 및 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도 및 혈액에서의 생체내 지속성을 입증함을 보여주는 결과를 제공한다. 혈액 내 OT-1 세포를 전달 후 4일 또는 9일째에 평가하였다. 비장에서 수득된 OT-1 세포가 분석되었을 때에 유사한 데이터가 수득되었다.
실시예 5: Cbl 억제제-확장 종양 항원 특이적 T 세포의 평가
이 실시예는 Cbl-b 억제제의 존재하에서 확장된 세포의 치료 효능을 평가한다.
간단히, 난백알부민(OT-1)에 특이적인 유전자 도입 T 세포 수용체를 발현하는 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포를 플레이트 결합 CD3 + 1) 1μM의 Cbl 억제제, 2) 300IU의 IL-2, 및 3) Cbl 억제제와 IL-2의 조합의 존재하에 3일 동안 시험관내에서 확장시켰다. 확장된 OT-1 세포는 FACS 분석에 의해 특성화되었고, 난백알부민(OVA) 발현 종양을 보유하는 E.G7-OVA 마우스로 전달했다. 확장된 OT-1 세포의 생체내 전달 후, 항종양 반응을 경시적으로 모니터링하고, 면역 반응의 질 및 양을 다양한 시점에서 평가하였다. 분석에는 혈액, 종양 및 비장 샘플에 대한 FACS 분석이 포함되었다. 분석에는 항원 특이적 이펙터 T 세포의 다작용성을 평가하기 위한 OVA 클래스 I 펩티드에 의한 비장세포의 재자극도 포함되었다.
0일째에, E.G7-OVA 세포를 각 마우스에 이식하였다. 5일째에, 약 5x106개의 시험관내 확장된 OT-1 세포를 각 마우스의 꼬리에 주입하였다. 9일째에 혈액을 FACS로 분석하였다. 14일째에 혈액, 종양 및 비장 샘플을 FACS로 분석하였다. 27일째에 혈액을 FACS로 분석하였다. 종양 용적은 이식 후 약 5일 내지 약 50일마다 측정하였다.
도 11a 및 11b에 도시된 바와 같이, 화합물 103으로 확장된 CD8+OT-1 세포는 적어도 IL-2로 확장된 CD8+ OT-1 세포만큼 강력하였다. 화합물 103과 IL-2의 조합에 의한 확장은 또한 이식 후 적어도 20일 동안 유사한 효능을 보였다.
도 12에 도시된 제2 연구에서, CD3 단독으로 확장된 대조군 세포는 최소 항종양 활성을 입증했다. 화합물 103으로 확장된 세포는 종양 성장의 보다 현저한 억제(패널 A) 및 장기간 생존(B)에 의해 입증된 바와 같이, IL-2 확장 세포와 비교하여 증가된 효능을 나타냈다. 또한, 세포 화합물 103 + IL-2 확장 세포는 종양 성장의 보다 현저한 억제(패널 A) 및 장기간 생존(B)에 의해 입증된 바와 같이 IL-2에 비해 증가된 효능을 나타냈다.
도 12에 묘사된 실험은 화합물 103으로 확장된 OT-1 세포가 종양 성장의 보다 현저한 억제(도 12a) 및 개선된 장기간 생존(도 12b)에 의해 입증된 바와 같이, IL-2 확장 세포에 비해 증가된 효능을 나타냈음을 입증한다. 중요하게는, 화합물 103 + IL-2 세포로 확장된 OT-1 세포는 종양 성장의 보다 현저한 억제(도 12a) 및 우수한 장기간 생존(도 12b)에 의해 입증된 바와 같이 단일 제제 단독, IL-2 또는 화합물 103에 비해 증가된 효능을 나타냈다.
실시예 6: Cbl 억제제-확장 종양 항원 특이적 T 세포는 IL-2로 확장된 동일한 세포와 비교하여 우수한 특성을 입증한다
OT-1 세포는 이전 실시예에 따라 확장되었고 난백 알부민(OVA) 발현 종양을 보유하는 E.G7-OVA 마우스에 투여되었다. 세포를 이들의 생체내 특성에 대해 평가하였다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 4일 및 22일째에 혈액에서 평가하였다. 도 13a(4일째) 및 도 13b(22일째)에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 총 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도를 나타내었으며, IL-2 단독으로 확장된 세포보다 더 오래 지속되었고, 항-CD3 단독으로 확장된 세포보다 더 오래 지속되었다. Cbl 억제제와 IL-2의 조합으로 확장된 세포는 총 CD45+ 세포에서 훨씬 더 높은 빈도와 더 높은 지속성을 보였다.
확장된 OT-1 세포를 전달 후 4일째 종양에서 평가하였다. 도 14a에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 IL-2 단독으로 확장된 세포 및 항-CD3 단독으로 확장된 세포와 비교하여 총 CD45+ 세포에서 더 높은 빈도로 나타낸 바와 같이 종양에 침윤하는 능력의 증가를 입증한다. Cbl 억제제와 IL-2의 조합으로 확장된 세포는 총 CD45+ 세포에서 최고 빈도로 입증된 바와 같이 더 나은 종양에 침윤한다. 또한, Cbl 억제제 또는 Cbl 억제제+IL-2로 확장된 OT-1 세포는 IL-2 단독으로 확장된 OT-1 세포와 비교하여 고갈 마커 PD1 및 TIM3(도 14b) 및 PD1, TIM3 및 LAG3(도 14c)의 더 낮은 수준의 발현을 보였다.
확장된 OT-1 세포는 전달 후 11일째에 비장 세포로부터 평가되었다. 채취된 비장 세포를 OVA 클래스 I 펩티드로 72시간 동안 재자극하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 IL-2 단독으로 확장된 세포와 비교하여 펩티드의 재자극에 반응하여 증식하는 뛰어난 고유 능력을 보였다. Cbl 억제제와 IL-2의 조합으로 확장된 세포는 펩티드의 재자극에 반응하여 증식하는 훨씬 더 큰 고유 능력을 보였다.
확장된 OT-1 세포는 전달 후 11일째에 비장 세포로부터 평가되었다. 채취된 비장 세포를 OVA 클래스 I 펩티드로 4시간 동안 재자극하였다. 도 16a 및 16b에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 IL-2 단독으로 확장된 세포와 비교하여 펩티드 재자극된 OT-1 세포에서 동등한 다작용성(IFN-γ 및 TNF-α 이중 양성 세포)을 나타내었다. 도 16c에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 IL-2 단독으로 확장된 세포와 비교하여 다작용성(IFN-γ 및 TNF-α 이중 양성) 세포에서 고갈 마커(PD1 및 TIM3)의 더 낮은 수준의 발현을 보여주었다.
확장된 OT-1 세포는 전달 후 11일째에 비장 세포로부터 평가되었다. 채취된 비장 세포를 OVA 클래스 I 펩티드로 24시간 동안 재자극하였다. 펩티드 재자극 24시간 후에 IL-2 생산을 측정하였다. 도 17a에 도시된 바와 같이, 확장 조건은 IFN-γ 생산에 영향을 미치지 않았다. 도 17b에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제 확장 세포는 재자극시 IL-2 생산의 증가를 보였다. 세포가 Cbl 억제제의 존재하에 시험관내에서 확장된 경우, 총 IL-2 및 이중 IFN-g/IL-2 생산 세포 모두가 증가되었다.
실시예 7: 경구 Cbl 억제제 치료는 확장된 OT -1 세포의 항종양 효능을 향상시킨다
종양 용적은 세포 전달 후 거의 5일마다 측정하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, 화합물 116의 경구 투여는 화합물 103 + IL-2로 확장된 OT-1 세포의 항종양 효능을 향상시켰다. 도 19에 도시된 바와 같이, 화합물 116의 경구 투여는 화합물 116의 경구 치료를 받지 않은 마우스와 비교될 때 화합물 103+IL-2로 확장된 OT-1 세포로 치료된 마우스의 생존을 향상시켰다.
OT-1 세포는 전달 후 5일째 및 20일째에 마우스 혈액으로 평가되었다. 도 20a 및 20b에 도시된 바와 같이, 화합물 116은 Cbl 억제제 + IL-2로 확장된 OT-1 세포의 빈도 증가를 유도했다. 화합물 116은 또한 Cbl 억제제 + IL- 2로 확장된 OT-1 세포의 더 긴 지속성을 유도하였다.
실시예 8: 확장된 OT -1 세포의 장기간 항종양 효능
OT-1 세포가 장기간 종양 보호할 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해, 상기 실험의 장기간 생존자(도 12)는 시험관내 확장된 OT-1 세포의 초기 입양 전달 후 149일째에 치사 투여량의 E.G7-OVA 종양 세포로 재도전하였다. 재도전은 난백 알부민 항원을 발현하는 E.G7-OVA 종양 세포로 생착된 부위에서 OT-1 세포 확장을 유도하여 종양 성장을 효과적으로 조절하였다(도 21). 도 21의 결과는 종양을 거부한 마우스가 초기 OT-1 T 세포 전달 후 149일째에 종양의 재도전에 내성이었음을 입증한다(도 21).
리콜 반응의 효능을 평가하기 위해, OT-1 세포의 수를 종양 재도전 전 0일째 (초기 입양 전달 후 149일째) 및 재도전 후 5일, 12일, 20일 및 27일째에 혈액에서 평가했다. 도 22a에 도시된 바와 같이, 초기 입양 전달 후 149일째에, Cbl 억제제 또는 Cbl 억제제+IL-2의 조합으로 시험관내 확장된 OT-1 세포는 혈액에 많은 수로 존재하고, 생체내에서 지속되는 우수한 능력을 나타낸다.
Cbl 억제제(단독 또는 IL-2와의 조합)로 확장된 기억 OT-1 세포의 리콜 반응을 평가하기 위해, OT-1 세포의 수를 종양 재도전 후 5일, 12일, 20일 및 27일째에 혈액에서 평가했다. 도 22b에 도시된 바와 같이, Cbl 억제제, 또는 Cbl 억제제+ IL-2의 조합으로 시험관내 확장된 OT-1 세포는 5일째에 혈액 1ml당 OT-1 세포의 더 많은 수로 입증된 바와 같이(도 22b) IL-2 단독으로 확장된 OT-1 세포와 비교하여 유의하게 더 급속한 리콜 반응을 시작할 수 있었다.
실시예 9: Cbl 억제제로 확장된 세포의 표현형
Cbl 억제제의 존재하에 배양된 세포는 광범위하게 특성화되었다.
초기 연구는 난소 및 CRC 종양 조직(평균 약 0.5 내지 0.8g)에 의한 TIL의 확장을 포함했다. 이들을 다수의 조각(크기 약 2mm3)으로 단편화하고, 24-웰 플레이트당 하나의 단편을 추가하였다. 이들 단편은 6000IU IL-2 또는 6000IU IL-2+1uM 화합물 103으로 급속한 확장 전 28일 동안 배양하였다(pre-REP). 그 후, 웰을 처리에 의해 풀링하고, 총 세포 수를 유세포 계측법에 의해 평가하였다. TIL 확장에 이어, 세포의 표현형이 특성화되었다. 이들은 대다수 CD45RO+ 및 CD4+ 및 CD8+였다. 도 23a에서, CD4의 %의 감소가 있었다. 도 24b에서, 세포 내의 CD8의 상응하는 증가가 있었다. 둘 다 IL-2 단독과 비교하여 IL-2 + 화합물 103으로 확장되었다. 이것은 Cbl 억제제가 여러 종양에서 CD8 T 세포를 선택적으로 확장시킴을 나타낸다.
암 조직 단편의 28일간의 생체외 배양 후 수득된 신선한 난소 및 결장암 조직(신선함, n=8)으로부터 직접 유래된 TIL을 유세포 계측법으로 분석하였다. 도 24는 각각 CD8+CD45RO+ 중에서 중심 기억(CD45RO+CCR7+) 및 이펙터 기억(CD45RO+CCR7-) 표현형의 백분율을 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 통계적 유의성은 양측 윌콕슨 부호 순위 검정을 사용하여 계산된다(*, p<0.05). CD8 T 세포는 T 세포 분화 표현형 마커; CCR7 및 CD45RO를 평가함으로써 추가로 특성화되었다. 중심 기억 T 세포(CCR7+CD45RO+ 세포)의 유의한 증가는 IL-2 단독에 비해 IL-2 + 화합물 103으로 확장된 TIL에서 관찰되었다(도 24). 이것은 덜 분화된 지속성 T 세포의 확장을 나타낸다.
암 조직 단편의 14일간의 생체외 배양 후 수득된 신선한 난소, 결장 및 유방암 조직(신선함, n=7)으로부터 직접 유래된 TIL을 유세포 계측법으로 분석하였다. 종양을 단편화하고 5개의 단편을 IL-2 또는 IL-2 + 화합물 103을 포함하는 GREX 10 플라스크에 14일 동안 50ml 용적으로 첨가하였고, 세포는 5일마다 공급된다. CD8 T 세포에 초점을 맞추면, IL-2 + 화합물 103에 의한 CD8 T 세포의 확장 증가 및 % CD8 T(도 25a) 및 총 수(도 25b)의 증가가 관찰되었다.
암 조직 단편의 14일간의 생체외 배양 후 수득된 신선한 난소, 결장 및 유방암 조직(신선함, n=7)으로부터 직접 유래된 TIL을 유세포 계측법으로 분석하였다. 도 26은 CD8+CD45RO+에서 각각 중심 기억(CD45RO+CD8+) 및 이펙터 기억(CD45RO+CD8-) 표현형의 백분율을 나타내는 FACS 데이터를 제공한다. FACS 결과는 평균±SEM으로 표현되었다. 이것은 검은색으로 강조된 바와 같은 중심 기억 세포의 유의한 증가를 증명한다.
확장된 TIL이 세포외 자극에 반응할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 분비 억제제와 항-CD107a의 존재하에서 TIL을 항-CD3/CD28로 6시간 동안 자극하였다. 6시간 후, CD107a의 표면 발현에서 명백한 증가가 관찰되었고, 이는 T 세포의 탈과립화 및 세포독성 활성과 관련된다. 자극시, IL2로 확장된 CD8+ TIL의 평균 40%가 CD107A 발현에 양성이었고, IL2 + 화합물 103으로 확장된 CD8+ TIL의 60% 초과가 CD107a를 생산할 수 있었다(도 27a). 자극시, IL2로 확장된 CD4+ TIL의 평균 50%가 CD107A 발현에 양성이었고, IL2 + 화합물 103으로 확장된 CD4+ TIL의 60% 초과가 CD107a를 생산할 수 있었다(도 27b).
세포독성과 관련하여, 아폽토시스를 매개하기 위해 분비된 프로테아제인 그랜자임 B(Grb)를 평가하였다. 자극시, IL-2 단독과 비교하여, IL-2 + 화합물 103으로 확장된 TIL에서 생성된 Grb의 유의한 증가가 있었다(도 28a). CD107A + GRB + 세포도 평가되었고, 자극시 IL-2 + 화합물 103으로 확장된 세포의 유의한 증가가 다시 관찰되었다(도 28b). 이로부터, 본 발명자들은 Cbl 억제제가 증가된 세포독성 가능성으로 TIL을 확장하는 것으로 나타나는 것으로 결론지었다.
GREX에서 14일 확장 동안 분비된 사이토카인과 케모카인이 또한 평가되었다. IL-2 + 화합물 103으로 확장된 플라스크에서, IFN-γ의 유의한 증가가 있었고, GMCSF, MIP1α, MIP1β 및 IP10에서 증가 경향이 관찰되었다(도 29).
Cbl 억제제의 첨가로, 관찰은 세포 수의 증가, 사이토카인 분비에 의해 입증되는 기능면에서 더 강력할 수 있는 더 우수한 품질의 더 지속적인 중심 기억 T 세포, 및 그랜자임 B와 탈과립화 마커 CD107A의 발현 증가를 포함했다. 이들은 고형 종양 적응증 환자를 위한 새로운 임상적 접근을 지지한다.
처리된 세포에서 화학유인제 분비를 평가하기 위해, 다수의 종양 적응증(n = 10)에서 어느 하나의 고용량 IL-2 +/- 1μM 화합물 103으로 GREX10에서 확장된 1x105 TIL를 24시간 동안 +/- 항-3/CD28 24시간 동안 배양했다. 상청액은 Luminex에 의해 평가되었다. IL-2 및 화합물 103으로 확장된 TIL은 자극시 MIP1α(도 30a) 및 MIP1β(도 30b)의 분비의 유의한 증가를 나타내었다.
처리된 세포에서 사이토카인 분비를 평가하기 위해, 다수의 종양 적응증(n = 10)으로부터의 어느 하나의 고용량 IL-2 +/- 1μM 화합물 103으로 GREX10에서 확장된 1 x 105 TIL을 24시간 동안 +/- 항-3/CD28 24시간 동안 배양했다. IL-2 및 화합물 103으로 확장된 TIL은 자극시 IL-2, IL-5, IL-7, IL-21, IL-23, TNF-α 및 IFN-γ의 유의한 분비를 나타내었다(도 31).
CDR3의 다양성을 평가하기 위해, 고용량의 IL-2(도 32a), 화합물 103과 함께 고용량의 IL-2(도 32b) 또는 화합물 103 단독(도 32c)으로 확장된 대표적인 유방 TIL은 GREX10에서 14일 동안 배양되었다. IL-2 +/- 화합물 103으로 확장된 TIL의 총 RNA를 단리시키고, RT-PCR과 iRepertoire(Huntsville, AL, USA)에 의한 서열분석을 실시하였다. 원시 데이터는 변형된 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)을 사용하는 IRmap 프로그램을 사용하여 iRepertoire에 의해 분석되었다. CDR3algerbra 소프트웨어를 사용하여 지정된 처리로 샘플에 걸쳐 공유된 CDR3의 계산을 평가했다. 데이터는 CDR3의 빈도로 여과하여 원래 데이터에서 빈도가 미리 설정된 빈도로 공유된 CDR3 서열만이 표시되었다. 샘플 간의 판독 깊이의 차이를 고려하여 모든 CDR3 빈도를 1,000만 판독치로 스케일링했다. 데이터는 각 uCDR3-VDJ 조합이 판독 계수에 무관하게 1의 양으로 처리되도록 정규화된 다음, V 사용량 및 J 사용량에 대해 분석되었다. 독특한 CDR3은 화합물 103 그룹에서 증가되었다.
실시예 10: Cbl 억제제로 확장된 세포의 표현형
화합물의 안정성을 평가하기 위해, 1일째에 1μM 화합물 103 또는 DMSO를 첨가하여 10% 인간 혈청을 함유하는 완전 RMPI에 첨가하고, 4℃, 22℃ 또는 37℃에서 11일 시점에 걸쳐 저장했다. 화합물 103의 농도는 질량 분석법에 의해 각각 표시된 시점 및 저장 온도에서 평가되었다. 화합물 103은 RPMI 배지에서 적어도 11일 동안 안정되었다(도 33).
배양 중 화합물의 안정성을 평가하기 위해, TIL을 1μM의 화합물 103의 존재하에 배양하고, 이는 14일 동안 4일마다 순차적으로 첨가한 후, PBS로 2회 세척하였다(W1: 세척 1, W2: 세척 2). 화합물 103의 양을 초기 배지 및 두 연속 세정 후 재현탁 완충액(W1 및 W2) 및 세포 펠렛 용해물(최종 생성물)에서 측정하였다(도 34). 화합물 103의 잔류량은 생성물의 약리학적 효과 수준(PEL) 이하였다.
실시예 11: 확장 프로토콜
-1일째에 종양 조직을 채취하여 단편화한다. 0일째에, 세포를 화합물 103 및 IL-2(6000IU)를 포함하는 10% 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 확장시킨다. 4일째에, 화합물 103을 첨가한다. 7일째에, 화합물 103을 다시 첨가한다. 11일째에, 세포를 채취한다. 11일째에, 화합물 103, IL-2(3000 IU), 및 임의로 OKT3 및 임의로 조사된 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 채취된 세포로 급속한 확장이 개시된다. 16일째에, 화합물 103 및 IL-2(3000IU)를 첨가한다. 22일째에, 확장된 세포를 채취하여 주입을 준비한다. 24일째에, 세포가 환자에게 투여된다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 각각 개별적 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 바와 같이 참조로 본원에 포함된다. 청구된 주제가 다양한 구현예와 관련하여 기재되었지만, 당업자는 다양한 변형, 치환, 생략 및 변화가 이의 정신으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 주제의 범위는 이의 등가물을 포함하여 이하의 청구범위의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.

Claims (67)

  1. 이를 필요로 하는 개체(individual)에서의 면역요법(immunotherapy)의 방법으로서,
    a. 집단(population)을 Cbl 억제제와 접촉시킴으로써 면역 세포의 집단을 활성화시키는 단계;
    b. 활성화된 면역 세포를 채취(harvesting)하는 단계;
    c. 채취된 면역 세포를 이러한 면역 세포를 선택적으로 확장시키기에 적합한 조건하에서 시험관내에서 확장시키는 단계;
    d. 면역요법을 위한 개체에게 유효량의 확장된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성화 단계가 공여체(donor)에서 생체내에서 일어나는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 참조 샘플과 비교하여 생체내 면역 세포의 활성을 조절하기에 충분한 양으로 공여체에게 투여되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 채취하기 전의 상기 생체내 Cbl 억제제 접촉 시간이 1일 내지 48일인, 방법.
  5. 이를 필요로 하는 개체에서의 세포 면역요법의 방법으로서,
    a. Cbl 억제제를 세포 면역요법을 향상시키기에 효과적인 양으로 개체에게 투여하는 단계; 및
    b. 세포 면역요법을 위한 개체에게 확장된 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 억제제로부터 면역 세포를 채취한 후 및/또는 확장된 면역 세포를 투여하기 전에 투여되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 확장된 면역 세포를 투여한 후에 투여되는, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 확장된 면역 세포의 투여 후 1일째부터 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9일 또는 최대 10, 15, 20, 25 또는 30일 동안 계속 매일 투여되는, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 투여된 Cbl 억제제가 화합물 116인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 상기 Cbl 억제제가 경구로, 정맥내로, 피하로, 또는 종양내로 투여되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 개체에게 1일 1회, 2회 또는 3회 투여되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제의 1일 용량이 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일, 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일, 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일, 또는 7 내지 60일 동안 투여되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제의 용량은 면역 세포의 부위에서 0 내지 0.5μM, 0 내지 1μM, 0 내지 5μM, 0 내지 10μM, 또는 0 내지 100μM의 상기 억제제의 농도를 초래하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 활성화 단계가 시험관내 또는 생체외에서 일어나는, 방법.
  16. 이를 필요로 하는 개체에서의 면역요법의 방법으로서,
    a. 공여체로부터 면역 세포를 포함하는 세포 집단을 채취하는 단계;
    b. Cbl 억제제의 존재하에서 생체외로 면역 세포를 확장시키는 단계; 및
    c. 요법을 위한 개체에게 유효량의 확장된 면역 세포를 주입하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 0.5 내지 50μM의 농도인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11일마다 면역 세포에 첨가되는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 단일 단계로 확장되는, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 7 내지 28일 동안 확장되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 채취 단계가 고형 종양 조직의 성분채집술, 백혈구 성분채집술, 또는 수술적 제거에 의한 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 채취된 세포 집단이 종양 또는 종양의 일부를 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 확장의 길이가 0 내지 4일, 0 내지 7일, 0 내지 11일, 0 내지 14일, 또는 0 내지 30일인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장이 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 존재를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 기체 투과성의 급속한 확장 세포 배양 막, 예를 들어, G-Rex™을 포함하는 배양 용기에서 확장되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 주입 전에 상기 확장된 세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 면역 세포가 CD4+ T 세포보다 더 많은 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 세포의 대부분이 기억 표현형(CD45RO+)을 갖는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 세포가 TSCM 또는 TCM 세포에 대해 선택적으로 농축되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 채취된 세포를 시험관내에서 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 세포가 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 유전적 변형 후 항종양 세포 활성에 대해 상기 변형된 세포를 검정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 세포를 수용하는 환자에서 세포 생착(cell engraftment)을 향상시키는 방법으로서, 세포의 생착을 향상시키기 위해 유효량의 Cbl 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 확장된 세포의 주입 후 장기간 동안 주기적으로 투여되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 세포의 주입 후 0 내지 2일, 0 내지 4일, 0 내지 5일, 0 내지 6일, 0 내지 7일 동안 투여되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 Cbl 억제제, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제와 조합하여 개체에게 주입되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 하나 이상의 치료 라운드(round of treatment)로 개체 내로 주입되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 자가(autologous)인, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 동종이계인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 종양 침윤성 림프구인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 분비하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 분비된 전염증성 사이토카인이 IL-2인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 분비된 전염증성 사이토카인이 IFNγ인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 내구성이 Cbl 억제제의 부재하에서의 암 요법의 표준 과정 후 면역 반응보다 더 긴, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 내구성이 Cbl 억제제의 부재하에서의 암 요법의 표준 과정 후 면역 반응보다 더 긴, 방법.
  47. 이를 필요로 하는 환자에서 T 세포 기능 장애를 치료하는 방법으로서, T 세포 기능 장애를 치료하기 위해 Cbl 억제제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 개체에게 경구로, 정맥내로, 피하로, 종양내로, 또는 폐 투여에 의해 투여되는, 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 개체에게 1일 1회, 2회 또는 3회 투여되는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제의 1일 용량이 1 내지 5000mg, 1 내지 2500mg, 1 내지 2000mg, 1 내지 1500mg, 1 내지 1000mg, 1 내지 750mg, 1 내지 500mg, 1 내지 400mg, 1 내지 300mg, 1 내지 250mg, 1 내지 200mg, 1 내지 100mg, 1 내지 10mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 또는 0.1 내지 1mg인, 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 1 내지 7일, 1 내지 10일, 1 내지 14일, 1 내지 21일, 1 내지 28일, 1 내지 45일, 1 내지 60일, 2 내지 3일, 2 내지 4일, 2 내지 5일, 2 내지 6일, 2 내지 7일, 2 내지 10일, 2 내지 14일, 2 내지 21일, 2 내지 28일, 2 내지 45일, 2 내지 60일, 4 내지 5일, 4 내지 6일, 4 내지 7일, 4 내지 10일, 4 내지 14일, 4 내지 21일, 4 내지 28일, 4 내지 45일, 4 내지 60일, 7 내지 10일, 7 내지 14일, 7 내지 21일, 7 내지 28일, 7 내지 45일, 또는 7 내지 60일 동안 투여되는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 cCbl, Cbl-b 및 Cbl-c로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소의 활성을 억제하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 Cbl-b의 활성을 억제하는, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 소분자, 펩티드, 항체 또는 핵산인, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 화학식 A의 화합물 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    화학식 A
    Figure pct00035

    상기 화학식 A에서,
    R1은 H, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬, 3원 내지 6원 헤테로사이클릴, C1-C6 알킬-(C3-C6 사이클로알킬), C1-C6 알킬-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴)이고;
    Figure pct00036
    는
    Figure pct00037
    또는
    Figure pct00038
    이고;
    Z1은 CH 또는 N이고;
    Z2는 CH 또는 N이고;
    Z3은 CH 또는 N이고;
    X는 CH 또는 N이고;
    R2는 H, 할로, C3-C6 사이클로알킬, -NH-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -NH-(C1-C6 알킬), -NH-(C3-C6 사이클로알킬), -O-(3원 내지 6원 헤테로사이클릴), -O-(C1-C6 알킬), 또는 -O-(C3-C6 사이클로알킬)이고;
    R3a는 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고;
    R3b는 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이거나; 또는 R3a 및 R3b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 4원 내지 8원 헤테로사이클릴 또는 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬은 1 내지 3개의 R12 그룹에 의해 임의로 치환되고; 또는
    R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
    n은 0 또는 1이고;
    Y는 C(R11a)(R11b) 또는 S이고, 단 R3a 및 R3b 중 하나 또는 둘 다가 할로이면, Y는 C(R11a)(R11b)이고;
    Q는 CH 또는 N이고;
    R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    R10은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    R11a 및 R11b는 독립적으로 H, 할로, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 할로알킬이거나; 또는 R11a 및 R11b는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C3-C6 사이클로알킬을 형성하거나; 또는 R3b 및 R11a는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 C1-C6 알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬을 형성하고;
    각각의 R12는 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 여기서 2개의 제미널(geminal) R12 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해져서 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성한다.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 화합물 101 내지 129, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소분자인, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 펩티드인, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl 억제제가 항체인, 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 siRNA인, 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 요법을 위한, 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 개체의 암을 치료하기 위한, 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 개체에서 이후의 재발성 또는 난치성 암을 치료하기 위한, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 암이 고형 종양(solid tumor)인, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간 환자인, 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역요법이 요법의 하나 이상의 추가 모드(mode)와 조합하여 수행되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 요법의 추가 모드가 면역 고갈, 면역 억제, 림프구 클리어런스(clearance), 줄기 세포 플러싱(flushing), 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 치료 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 요법의 추가 모드가 화학요법 및 면역요법으로부터 선택되는, 치료 방법.
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