JP2023505192A

JP2023505192A - 養子細胞療法としての遺伝子操作された二重陰性ｔ細胞

Info

Publication number: JP2023505192A
Application number: JP2022533347A
Authority: JP
Inventors: リーチャン; ジョンボクイ; ダニエルヴァシッチ; イスマットカトリ; ダラムライ; ユキシーロンレウン
Original assignee: ユニバーシティーヘルスネットワーク
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2023-02-08
Also published as: EP4069831A1; EP4069831A4; WO2021108926A1; CA3160422A1; US20230011889A1; CN114929865A

Abstract

本開示は、二重陰性T（DNT）細胞の抗がん活性を増強するために1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された、例えばキメラ抗原受容体（CAR）を有する、CD4- CD8- DNT細胞の開発および使用に関する。遺伝子改変されたDNT細胞は、エクスビボで生成され得、同種の健常ドナー細胞から増大され得、そしてがんの処置において同種移植片対宿主病（GvHD）および／または宿主対移植片拒絶を克服するためのオフ・ザ・シェルフ療法として使用され得る。TIFF2023505192000006.tif62128

Description

関連出願
本願は、2019年12月6日に出願された米国仮特許出願第62/944,634号の優先権を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。

分野
本開示は、細胞療法およびより具体的には養子細胞療法において使用するための1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性Ｔ細胞に関する。

序説
同種造血幹細胞移植（allo-HSCT）は、高リスクの造血系悪性腫瘍を有する患者に対する治癒の可能性のある処置であり、従来の化学療法よりも高い無疾患生存率を示している（Alatrash and Molldrem, 2009）。T細胞除去された移植片がより高い再発率をもたらすのに対して、ドナー由来T細胞を介した抗白血病効果は、患者の高い生存率に寄与する（Alatrash and Molldrem 2010）。しかし、臨床下でのallo-HSCTの利用は、適合するドナーの不足、処置の毒性、およびその他の付随する合併症、特に移植片対宿主病（GvHD）により制限される（Shlomchik 2007, Alatrash and Molldrem 2010）。GvHDは主に、患者の正常な組織を外来物質と認識するドナー由来リンパ球により引き起こされる（Shlomchik 2007）。その後、正常な組織に対して強い免疫応答が誘導され得、それによって組織が損傷し、重度の症例では患者の死に至る可能性もある（Shlomchik 2007、Alatrash and Molldrem 2010）。その結果、GvHDは、同種条件下での細胞療法の使用を制限する大きな障害となっている。

その一方、allo-HSCTを用いて達成された臨床的利益は、研究者が免疫細胞の抗白血病機能を調査する基礎を提供した。がん免疫療法は、現在、化学療法、放射線療法、および手術に次いで、がん処置の4本目の柱とみなされている。特に、様々な血液悪性腫瘍および固形悪性腫瘍を処置するT細胞を用いた養子細胞療法（ACT）の効果が、多数の臨床研究において実証されている（Tran, Robbins et al. 2016、Park, Riviere et al. 2018）。キメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックT細胞受容体を発現させる免疫細胞の遺伝子改変および人工抗原提示細胞の使用等の技術の進歩が、ACTの治療効果を改善した（Maus, Thomas et al. 2002、Kalos and June 2013、Harris and Kranz 2016）。特に、CD19-CAR技術を用いた自己患者T細胞の遺伝子改変は、B細胞白血病およびリンパ腫患者の処置において大きな成功を収めた。難治性または再発性CD19+ B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）患者において、従来の化学療法ではその推定応答率はおよそ30％であるのに対して、最大90％の完全寛解（CR）率が達成された（Neelapu, Locke et al. 2017、Schuster, Svoboda et al. 2017、Maude, Laetsch et al. 2018）。CD19-CAR T細胞療法は、これらの疾患に対する臨床利用に関してFDAにより承認された（Ruella and Kenderian 2017, 2018）。しかし、CAR19-T細胞療法により処置される患者数の増加に伴い、現行の形式の制約が明らかになってきた。複雑な増大方法は、治療的に関連する数のT細胞の生産の不確定性の原因となり、細胞の増大に要する時間は、疾患の進行を許容し、これは処置前に患者を死に至らしめる可能性があり、そして細胞の増大のために臨床的に承認された施設および高度に訓練された人員を必要とすることは、製造される細胞製品の非一貫性および高い製造コストの原因となっている（June, Riddell et al. 2015、Dwarshuis, Parratt et al. 2017、Ren, Liu et al. 2017）。まとめると、現行形式のCAR-T細胞療法は、非常に高コストであり、多くの患者にとってアクセス可能でなく、これらが幅広い臨床移行を実務的に困難にしている。また、CD19の下方調節は、CAR19媒介細胞傷害を回避するためにB-ALLにより利用される共通の抵抗機構であり、これが、その高い初期応答率にもかかわらず12.9月という比較的短い生存率中央値の原因となっている（Park, Riviere et al. 2018）。

二重陰性T細胞（DN T細胞またはDNT）は、CD3-TCR複合体を発現するが、CD4、CD8またはNKT細胞マーカーを発現しない成熟末梢Tリンパ球であり、それらは末梢血単核細胞（PBMC）の1～3％を占める（Zhang, Yang et al. 2000）。健常ドナー（HD）からDNTを増大させるためのプロトコルは報告されており、DNTは様々ながんタイプに対して有意な抗白血病活性を有する（Lee, Minden et al. 2017）。DMTは、パーフォリン／グランザイム依存経路を通じて用量依存的な様式で同種急性骨髄性白血病（AML）芽球の殺傷を誘導した（Merims, Li et al. 2011、Lee, Minden et al. 2017）。同種免疫細胞の使用は、望まれない同種免疫応答、例えばGvHDおよび宿主対移植片（HvG）拒絶の危険を有することが公知である。しかし、動物モデルにおいて、従来のCD4+またはCD8+ T細胞と異なり、同種マウスDNTの注入はGvHDを引き起こさないことが示された（Zhang, Yang et al. 2000、Young, DuTemple et al. 2003、He, Ma et al. 2007）。これらの知見と一致して、allo-HSCTを受けた患者において、GvHDの発病率および重篤度の減少が、より高い度数（frequency）の血中DNT細胞レベルと相関した（McIver, Serio et al. 2008）。より最近になって、HD末梢血（PB）から増大された同種DNTが正常細胞に対して毒性でなく、マウスへのDNTの注入が異種GvHDを引き起こさないことが示された（Lee, Minden et al. 2017）。さらに、同種DNTは、インビトロおよび異種移植モデルにおいてアロ反応を生じずに従来のT細胞と共存し、これによりDNTがHvG拒絶を回避することができることが示唆された（Lee, Kang et al. 2019）。さらに、DNTは、ドナー非依存的な様式で多数の血液がん標的を標的化し、これらは集合的に、オフ・ザ・シェルフ細胞療法としてのDNTの使用を支持している。

現行形式のCAR-T製品は、高度にパーソナライズされた様式で製造され、CAR-T療法の広い利用性は、高い製造コスト、バッチ間の非一貫性および複雑な物流により制限され、これらが、オフ・ザ・シェルフ様式で使用できる新しいCAR-T療法を構築するニーズを高めている（Dwarshius, Parrat et al. 2017、Torikai, Cooper et al. 2016）。最近、オフ・ザ・シェルフ処置としてのACTの使用を調査する研究の数が増加している（Torikai, Cooper et al. 2016、Ruella, Kenderian et al. 2017、Poirot, Ren et al. 2015、Ren et al. 2017、Qasim et al. 2017、Boyiadzis et al. 2017、Sheridan, C. et al、2018、Suck et al. 2016、Zeng, Tang et al. 2017）。オフ・ザ・シェルフACTは患者特異的ではないので、細胞製品は、即利用可能な処置用として事前に製造され得る。また、中心施設で大規模製造された細胞製品の検証は、製品の一貫性および信頼性を低コストで高める（Dwarshius, Parrat et al. 2017、Torikai, Cooper et al. 2016、Ruella, Kenderian et al. 2017）。しかし、効果的な臨床利用可能なオフ・ザ・シェルフの同種T細胞療法は、以下の基準を満たすべきである：1）臨床準拠条件下で治療的な数まで増大可能であること；2）ドナーに制限されない様式で多数のがんを標的化できること；3）移植片対宿主病（GvHD）を引き起こさないこと；4）HvG拒絶を回避できること；および5）その機能を妨げずに現行の適正製造基準（Good Manufacturing Practice）（cGMP）条件下で保管可能であること（June, Riddell et al. 2015）。異なる細胞製品の使用を含む、様々な異なる方法が、これらの基準を満たすべく前臨床開発下にある（Boyiadzis et al. 2017、Suck et al. 2016、Zeng, Tang et al. 2017、Li, Hermanson et al. 2018、Deniger et al. 2014）が、規模拡大性、持続性、または患者への同種免疫細胞製品の反復注入の実現性の問題が未解決のままである（Boyiadzis et al. 2017）。現在、最も成熟したオフ・ザ・シェルフCAR形質導入細胞製品は、ユニバーサルCAR19 T（UCART19）細胞と呼ばれ、これはGvHDの主要なメディエーターである、従来のT細胞（T_conv）上のαβTCR受容体を破壊する遺伝子ツールの使用を伴うものである（Poirot, Ren et al. 2015、Ren et al. 2017, Qasim et al. 2017）。さらに、CD52発現免疫細胞を広く除去する抗体薬である強免疫抑制薬アレムツズマブに対する耐性をUCART19細胞に付与するために、遺伝子編集を通じてCD52が破壊される。同種UCART19の持続を可能にするよう、患者は、長期的免疫抑制のためにアレムツズマブで処置されるが、これは様々な免疫抑制の有害現象、例えば感染の危険を増大させる。現在臨床試験下にある戦略は重点的に調査されている（Qasim et al. 2017、Sheridan, C. 2018）が、UCART19細胞で処置されたALL患者において不完全な改変が有害なGvHDを引き起こしている（Qasim et al. 2017）。他のアプローチは、HvGを回避するためのHLAクラスIのノックアウト等のアイデアを提案しているが、これらの細胞は、「自己性消失（missing-self）」シグナルに起因してNK細胞媒介拒絶にさらされる傾向があり得る。さらに、追加の遺伝子改変の導入は、その製品収量を低下させ、そしてすでにCAR-T療法の幅広い応用に対する大きな障壁となっているCAR-T製造のコストを増加させる。まとめると、これは、オフ・ザ・シェルフCAR-T療法を構築する上で追加の遺伝子改変に頼ることから生じ得る潜在的な問題および複雑性の増大を強調している。

要旨
1つの局面において、1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞およびがんの処置のための遺伝子改変されたDNT細胞の関連する使用が提供される。標的抗原は、任意の適切な抗原、例えば、がん細胞の表面上に豊富なまたは優先的に発現される抗原であり得る。1つの態様において、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を発現するよう改変された二重陰性T（DNT）細胞が提供される。1つの態様において、DNT細胞は、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβ-TcR+である。

1つの態様において、標的抗原は、がん細胞上に発現される抗原である。1つの態様において、CARは、がん細胞上に発現される標的抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。例えば、1つの態様において、標的抗原は、CD4、CD33、CD19、CD20、CD123、LeY、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリー、およびNY-ESO-1から選択される。1つの態様において、標的抗原はCD4である。1つの態様において、標的抗原はCD19である。任意で、本明細書に記載されるDNT細胞は、例えば、異なる抗原を標的化する複数のCARを発現するよう細胞を改変することにより、複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変され得る。がんの処置のための本明細書に記載されるCAR-DNT細胞の方法および使用も提供される。

実施例に示されるように、CD19に対するCAR（CAR19）を発現するよう改変されたDNT細胞は、CAR形質導入なしで増大されたものに匹敵する増大プロフィールを保持していた。さらに、マウス異種移植モデルにおいてCAR19-DNTを用いたインビボ実験は、白血病量（leukemia load）の減少および生存長期化に関して用量依存的な効果を示した。注目すべきことに、CAR19-DNTはまた、標的細胞に対してCD19発現の非存在下で細胞傷害効果を示し、これによりそれらの二重細胞傷害機能および処置後または処置中に標的抗原の発現減少を示し得るがんを標的化するCAR-DNTの能力が確認された。

加えて、非形質導入同種DNTおよびCD19 CAR形質導入DNTの両方が移植片対宿主病（GvHD）を引き起こさないことが示されたが、DNTのCAR改変が宿主対移植片拒絶および／またはアロ反応性をもたらすかどうかは知られていなかった。特に、アロ抗原で刺激された従来のCAR T_conv細胞は同種ドナー細胞の強い殺傷を示したのに対して、CAR-DNTは同種細胞に対して細胞傷害性を生じなかった（図7aおよび7b）。また、CAR-T_conv細胞と共培養された同種PBMCはアロ反応性を生じ、有意に多くの数のCAR-T_conv細胞がPBMCにより殺傷されたのに対して、CAR-DNTと共培養されたそれらは、その後の共培養においてCAR-DNTに対する細胞傷害性を生じなかった。

したがって、1つの態様において、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞の集団の有効量を対象に投与する工程を含む方法が提供される。それを必要とする対象においてがんを処置するための、標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の有効量の使用も提供される。それを必要とする対象においてCD4+がんを処置する方法であって、CD4標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の有効量を対象に投与する工程を含む方法も提供される。それを必要とする対象においてCD4+がんを処置するための、CD4標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の有効量の使用も提供される。本明細書に記載される標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞またはDNT細胞の集団および遺伝子改変されたDNT細胞を含む薬学的組成物も提供される。1つの態様において、DNT細胞は、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を発現するよう遺伝子改変される。

1つの態様において、DNT細胞の集団は、任意で1または複数の健常ドナー由来の、同種細胞を含むまたは該細胞からなる。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞を生成するために使用されるDNT細胞は、複数のドナー由来のプールされたDNT細胞である。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、対象において移植片対宿主病（GvHD）を誘導しない。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、従来のCD4+CD8+ T細胞（T_conv細胞）と比較して対象においてより軽度のGvHDを誘導する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、対象において宿主対移植片（HvG）拒絶を回避または抑制する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、CAR-T_conv細胞と比較して対象においてHvG拒絶を抑制する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、2週間、3週間または4週間より長く、対象において持続する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、CD4+ CD8+ CAR T細胞の対照集団よりも長く、任意で2週間、3週間または4週間より長く、対象において持続する。1つの態様において、対象は、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後に免疫抑制療法を受けない。例えば、1つの態様において、対象は、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後60、30、21または14日以内に免疫抑制療法を受けない。

1つの態様において、遺伝子改変されたDNTの集団により産生されるサイトカインは、遺伝子改変されたT_conv細胞により産生されるサイトカインと比較して、単球によるIL-1βおよび／またはIL-6のより低レベルの産生を刺激する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNTの集団は、サイトカイン放出症候群（CRS）を誘導しない、または遺伝子改変されたT_conv細胞、例えばCAR-T_conv細胞と比較してより軽度のCRSを誘導する。

1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞は、HLA、内因性T細胞受容体、CD7、およびCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも排除するようにも遺伝子改変されない。

1つの態様において、標的抗原はCD4またはCD8である。1つの態様において、例えばCD4またはCD8標的抗原に結合する遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、フラトリサイドを誘導しない、または従来のT細胞もしくはCAR4もしくはCAR8形質導入された従来のT細胞の集団と比較してより軽度のフラトリサイドを誘導する。

1つの態様において、がんは血液悪性腫瘍、任意で白血病またはリンパ腫である。1つの態様において、がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、または慢性リンパ球性白血病である。1つの態様において、対象におけるがんは、1つまたは複数の固形腫瘍を含む。1つの態様において、がんは肺がんである。

1つの態様において、がんは再発がんである。1つの態様において、がんは、以前にCAR-T_conv (CD4+/CD8+)細胞の集団による処置を受けた対象における再発がんである。1つの態様において、がんは、標的抗原の不均一な発現を示す。

上記の節は、例として提供されるにすぎず、本開示および添付の特許請求の範囲を限定することを意図していない。本開示の組成物および方法に関するさらなる目的および利点は、本願の特許請求の範囲、詳細な説明、および実施例に照らして当業者により理解されるであろう。例えば、本開示の様々な局面および態様が多くの組み合わせで使用され得、それらのすべてが本明細書により明確に想定されている。これらのさらなる利点、目的および態様は、明確に、本開示の範囲に包含される。本明細書において本開示の背景を明確にするため、および特定の例では、その実施に関するさらなる詳細を提供するために使用されている刊行物および他の資料は、参照により組み入れられ、そして利便性を考慮して、添付の参考文献の節に一覧表示されている。

図面
本開示のさらなる目的、特徴および利点は、本開示の例示的な態様を示す添付図面と共に参照される以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。

図1a～dは、エクスビボ増大されたDNT細胞に、それらの表現型および増大プロフィールに影響することなく、CARを形質導入できることを示す。エクスビボ増大されたDNT細胞に、形質導入を行なわないか（NT-DNT）またはCAR-19を形質導入するか（CAR19-DNT）のいずれかとした。1a）ヒストグラムは、CAR19-DNT（白抜き）またはNT-DNT（黒塗り）におけるプロテインLおよびストレプトアビジン染色を示す。数値は、CAR19を発現するDNT細胞のパーセンテージを表す。点グラフは、5名の異なる個体由来のDNT細胞におけるCAR19形質導入率の概要を示す。各点は、単一のドナーから増大されたDNTの形質導入率を表す。水平線はその平均を表し、エラーバーはSDを表す。1b）DNT細胞におけるCAR19発現は時間経過後も維持される。CAR19発現レベルを、2名の異なるドナー（ドナーAおよびドナーB）から得たCAR19形質導入DNT細胞における、形質導入後第0、3、6、9、および12日のプロテインL染色により決定した。各線は異なるドナーを表す。1c）CAR19形質導入を行いまたは行わずにエクスビボ増大されたDNT細胞を、抗CD3、CD4、およびCD8抗体で染色した。示されている図は、CD3+細胞に関してゲートされている。左パネルはNT-DNT細胞を示し、右パネルはCAR19形質導入DNT細胞を示す。1d）2名の異なるドナー由来のNTおよびCAR19形質導入DNT細胞の増大プロフィール。図1aの説明を参照のこと。図1aの説明を参照のこと。図1aの説明を参照のこと。図2a～cは、CAR19形質導入が、インビトロでCD19+ B-ALL標的に対するDNT細胞の抗白血病活性を増強することを示す。2aおよび2b）示されているエフェクター対標的比での4時間のインキュベート後の、CD19+ B-ALL細胞株NALM-6に対する（a）、または4対1のエフェクター対標的比で2時間の、5名の患者由来のCD19+原発性B-ALL芽球に対する（b）、DNT細胞により誘導される比殺傷率。2c）ELISAを用いて測定されたNALM-6との共培養後のNT-またはCAR19-DNT細胞由来の上清におけるIFNγレベル。図3a～dは、CAR19形質導入が、異種移植モデルにおいてCD19+ B-ALL標的に対するDNT細胞の抗白血病活性を増強することを示す。第0日に、致死未満照射されたNSGマウスに10⁶個のNALM-6細胞を接種した後、第3日に、様々な用量のCAR19-DNT細胞（マウスあたり0.33x10⁶、10⁶、もしくは3x10⁶細胞）またはビヒクル対照を静脈内投与した。NALM-6注射から3週間後に骨髄サンプルを収集し、抗ヒトCD10で染色し、そしてNALM6の検出のためにフローサイトメトリーにより分析した。3aおよび3b）NALM-6生着NSGマウスの骨髄におけるNALM-6の度数。3a.各点は、各マウスにおけるNALM-6生着レベルを表す。水平のバーは各グループの平均を表す。エラーバーはSDを表す。一元配置ANOVAを使用して異なる処置グループ間の差を決定した。3b.フローサイトメトリードットプロットは、ヒトCD10+細胞に関してゲートした各マウスにおけるNALM-6の度数を示す。ビヒクル（点線）またはCAR19-DNT（実線；マウスあたり3x10⁶細胞）で処置されたNALM-6生着NSGマウスの全体疾病スコア（overall sickness score）（3c）および生存率（3d）。図3aの説明を参照のこと。図3aの説明を参照のこと。図3aの説明を参照のこと。図4aおよび4bは、CAR19-DNTが、異種移植モデルにおいてB細胞リンパ芽球細胞株Daudiに対して優れた抗白血病活性を誘導することを示す。第0日に、致死未満照射されたNSGマウスに10⁶個のDaudi細胞を接種した後、第3日に、NT-DNT細胞またはCAR19-DNT細胞（マウスあたり3x10⁶細胞）を静脈内投与した。4a）Daudi注射から48日後に骨髄サンプルを収集し、抗ヒトCD20で染色し、そしてDaudiの検出のためにフローサイトメトリーにより分析した。各点は、各マウスにおけるDaudi生着レベルを表す。水平のバーは各グループの平均を表す。エラーバーはSDを表す。スチューデントt検定を使用して異なる処置グループ間の差を決定した。4b）マウスのフィットネスを評価するために、体重変化を観察した、各点は各グループの平均を表す。エラーバーはSEMを表す。二元配置ANOVAを使用して2つのグループ間の差を決定した。図5a～cは、CAR19-DNTがCD19low NALM-6を殺傷することができることを示す。5a）未処置またはCAR19-DNT細胞処置マウスの骨髄から得たCD10+ NALM-6細胞によるCD19発現レベルの代表的なフロープロット。数値は、CD19+細胞の度数を表す。5b）人道的エンドポイントで測定されたNALM-6によるCD19発現レベルの概要。水平バーは各グループの平均を表し、エラーバーはSDを表す。各点は個々のマウスを表す。5c）NALM-6細胞を、CAR19-DNT処置（CD19low）またはBPS処置（CD19high）マウスから単離し、2時間インビトロ細胞傷害アッセイにおいてCAR19-DNTの標的として使用した。同程度の細胞傷害性が見られた。図6a～cは、CAR19-DNTおよびCAR19-T_conv細胞がインビトロおよびインビボでCD19+ B-ALLに対して同程度の抗白血病活性を有することを示す。6a）CAR19-DNTまたはCAR19-T_conv細胞を、示されたエフェクター対標的比で2時間、NALM-6と共培養した。NALM-6の％比殺傷をフローサイトメトリーにより決定した。6b）ELISAを用いて測定された、NALM-6と共培養されたCAR19-DNTまたはCAR19-T_conv細胞由来の上清におけるIFNγレベル。6c）フローサイトメトリーにより決定された、NALM-6注射から3週間後に3x106個のCAR19-DNT細胞、CAR19-T_conv細胞またはビヒクル対照を静脈内投与されたNALM-6生着NSGマウスの骨髄におけるNALM-6の度数。図7a～cは、CAR19-DNTが内因性抗白血病活性を通じてCD19陰性白血病細胞を標的化できることを示す。7a）CD19陰性白血病細胞株OCI-AML3に対してCAR19-DNT（黒塗りシンボル）またはNT-DNT（白抜きシンボル）を示されたエフェクター対標的比で用いて行った2時間インビトロ殺傷アッセイは、CAR19-DNTおよびNT-DNTの両方が匹敵するレベルでOCI-AML3を効果的に標的化できることを示す。7b）CAR19-T_conv細胞に対して耐性の芽球に対するDNTの内因性抗白血病活性を示す、その疾患がCD19-CAR T_conv細胞療法後に再発した患者から得た原発性CD19陰性B-ALLサンプルに対してDNT細胞を様々なエフェクター対標的比で用いて行った2時間インビトロ殺傷アッセイ。7c）NT-DNTまたはCAR19-DNTを、2時間インビトロ殺傷アッセイにおいて、CD19+リンパ腫細胞株Daudiに対するエフェクターとして、示される様々なDNT対Daudi比で用いた。図8a～bは、NT-DNTはB-ALLに対する抗白血病活性を媒介するが、NT-T_conv細胞は媒介しないこと、およびCAR19形質導入が、TconvおよびDNT細胞の両方においてB-ALLに対する抗白血病活性を増強することを示す。NALM-6細胞を、NT-DNT細胞、CAR19-DNT細胞、NT-T_conv細胞、またはCAR19-T_conv細胞と共に、1：1のDNT対NALM-6比で、またはそれらなしで、2または5日間培養した。生きたNALM-6細胞の絶対数（8a）および度数の相対変化（8b）を決定した。図8cは、異なる日における各共培養物の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。一元配置（a）または二元配置（b）ANOVA検定を統計分析に使用した。ns - 有意でない；^*p<0.05；^**p<0.01；^***p<0.001；^****p<0.0001。図8aの説明を参照のこと。図8aの説明を参照のこと。図9a～fは、CDR19-DNTが正常細胞に対するアロ反応性を示さず、かつ同種エフェクターのアロ反応性を、それらを抑制することにより回避することを示す。9a. 混合リンパ球反応（MLR）の概要図。CAR19-DNTおよびCAR19-T_conv細胞を、照射した同種PBMCで6日間刺激し、その後のオーバーナイト殺傷アッセイにおいて同じ同種PBMCに対するエフェクター細胞として使用した。9b. CAR19-T_conv細胞がアロ反応性を誘導するのに対してCAR19-DNT細胞が誘導しないことを示す、様々なエフェクター対標的比でのCAR19-T_conv細胞（黒塗りシンボル）およびCAR19-DNT細胞（白抜きシンボル）により媒介される同種PBMCの比殺傷率。9c. CAR19-T_conv細胞または-DNTが同種PBMCのアロ反応性を誘導するかどうかを決定するために行われたMLRの概要図。同種PBMCを、別のドナー由来のCAR19-T_conv細胞またはCAR19-DNT細胞と6日間共培養した。その後、PBMC由来CD8⁺ T細胞を単離し、オーバーナイトインビトロ殺傷アッセイにおいて、共培養に使用されたのと同じT_conv細胞またはDNT細胞に対するエフェクター細胞として使用した。9d）同種CAR19-T_conv細胞とは対照的に、同種CAR19-DNTはレシピエント免疫細胞のアロ反応性を誘導せず、宿主対移植片拒絶を回避し得ることを示唆する、上記のCD8+ T細胞との一晩の培養後に残存する生きたCAR-T_conv細胞（黒塗りシンボル）または-DNT細胞（白抜きシンボル）の数の減少。9e）DNTの存在下または非存在下でアロ抗原により刺激されたときのアロ反応性CD8⁺ T細胞の細胞傷害性の程度を決定するために使用されたアッセイの概要図。同種CD8+ T細胞を、DNTありまたはなしで、照射されたPBMCにより4日間刺激した。その後、CD8+ T細胞を単離し、最初に刺激のために使用したのと同じ同種細胞に対するエフェクター細胞として使用した。9f）様々なエフェクター対標的比でのDNTの存在下または非存在下で刺激されたCD8+ T細胞による同種細胞の殺傷率が示されている。^**P<0.01；^****P<0.0001。図9aの説明を参照のこと。図9aの説明を参照のこと。図9aの説明を参照のこと。図9aの説明を参照のこと。図9aの説明を参照のこと。図10a～dは、CAR19-DNT細胞が異種GvHDを誘導しないのに対して、CAR19-T_conv細胞は誘導することを示す。ナイーブNSG細胞に、5x10⁶細胞のCAR19形質導入DNTまたはT_conv細胞を注入した。各グループのマウスのマウス体重の変化（10a）、全体疾病スコア（10b）、および生存率を観察した。10d）マウス肝臓組織をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織損傷を評価した。二元配置ANOVA検定（10aおよび10b）ならびにマンテル・コックス検定（10c）を統計分析に使用した。n.s. - 有意でない；^**p<0.01；^***p<0.001；^****p<0.0001。図10aの説明を参照のこと。図10aの説明を参照のこと。図10aの説明を参照のこと。図11a～bは、CAR19-DNTがより低い重症度のCRSを引き起こし得ることを示す。NTまたはCAR19形質導入DNT細胞またはT_conv細胞を、NALM-6と、5：1（a）または1：1（b）のT細胞対NALM-6比で3日間培養した。共培養物から回収した上清をマクロファージ様細胞株mTHP-1（11a）または単球細胞株THP-1（11b）に添加した。培養から3～4日後に、mTHP-1およびTHP-1により産生される、それぞれ、IL-1β（11a）およびIL-6（11b）レベルを、ELISAにより決定した。二元配置ANOVA検定を統計分析に使用した。ns - 有意でない；^*p<0.05；^****p<0.0001。図12は、CAR19-DNT細胞が凍結保存後もそれらの抗腫瘍機能を保持することを示す。新鮮なおよび凍結保存されたCAR19-DNTを用いてNALM-6に対して2時間インビトロ殺傷アッセイを行い、1ヵ月以上凍結保存されたCAR19-DNTがCD19+白血病標的に対する細胞傷害性の媒介に関して、新しく増大されたCAR19-DNTと同等の強さであることが示された。図13は、CAR19形質導入DNT細胞がドナー非依存的な様式で機能することを示す。3名の異なるドナーから得たDNT細胞にCAR19を形質導入し、NALM-6に対するエフェクター細胞として使用した。各線は、各ドナー由来のCAR19形質導入DNT細胞を表し、同程度のNALM-6細胞殺傷を示した（ドナーA、B、またはC）。図14a～cは、多数のがんタイプを標的化するためのプラットフォームとしてDNTを使用できることを示す。14a）野生型またはCD19を発現するよう遺伝子改変された肺がん細胞株A549に対するエフェクターとしてNT-DNTまたはCAR19-DNTを1対1のエフェクター対がん細胞比で用いて一晩行ったインビトロ殺傷アッセイ。14b）野生型またはCD19を発現するよう遺伝子改変された肺がん細胞株H460に対してNT-DNTまたはCAR19-DNTを1対1のエフェクター対がん細胞比で用いて一晩行ったインビトロ殺傷アッセイ。14c）NT-DNTまたはCAR19-DNTを、A549またはCD19形質導入A549と、1：1のDNT:A549比で1日間共培養した。ELISAを用いた、各グループから回収された上清におけるIFNγ。図15a～bは、CAR-DNT細胞が肺がん異種移植モデルにおいて固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を発揮することを示す。第0日に、NSGマウスに、CD19形質導入A549（10⁶個/マウス）を皮下注入した。第11日に、各マウスを、未処置とするかまたは腫瘍周囲注射を通じて5x10⁶個のNT-DNTもしくはCAR-19⁺-DNT細胞で処置した。その後、2～4日ごとに腫瘍体積を観察し（15a）、研究の最後に腫瘍重量を測定した（15b）。二元配置（15a）または一元配置（15b）ANOVA検定を統計分析に使用した。n.s. - 有意でない；^*p<0.05；^***p<0.001；^****p<0.0001。図16a～bは、CD19以外の抗原を発現するがんを標的化する異なるCAR構築物のプラットフォームとしておよびフラトリサイドを示さないCD4-CARのためのキャリアとしてDNTを使用できることを示す。16a）NT-DNT（●）およびCD4-CAR（CAR4；■）形質導入DNTの同程度の増大倍率は、CAR4-DNTの製造におけるフラトリサイドの非存在を示す。16b）NT-DNT（黒塗りシンボル）またはCD4-CARを形質導入されたDNT（CAR4-DNT；白抜きシンボル）を、2時間殺傷アッセイにおいて、CD4+急性リンパ球性T細胞白血病株CCRF-CEMに対するエフェクター細胞として、示されている様々なDNT対CCRF-CEM比で使用した。図17a～bは、CAR4-DNTの抗原特異性を示す。健常ドナー由来の同種PBMCを、NTもしくは空ウイルスベクター（EV）、またはCAR19、またはCAR4形質導入されたDNT細胞と、様々なDNT:PBMC比で共培養した。CD4+（17a）およびCD4-（17b）PBMCに対する％比殺傷を測定した。二元配置ANOVA検定を統計分析に使用した。n.s. - 有意でない；^****p<0.0001。図18a～bは、フラトリサイドなしでDNTにCAR4を形質導入できることを示す。T_conv細胞またはDNT細胞に、形質導入を行なわないかまたはCAR4を形質導入した。形質導入後第4日に、相対数（18a）ならびにCD4+、CD8+およびCD4- CD8-の組成（DN；18b）を比較した。

様々な態様の説明
以下は、本開示を実施する上で当業者を補助するために提供される詳細な説明である。それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示の属する技術の分野における当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書の説明の中で使用される用語は、特定の態様を説明するためのものにすぎず、本開示の限定は意図されていない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、図面およびその他の参考文献は、明示的に、それらの全体が参照により組み入れられる。

I. 定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、それ以外のことが示されていない限り、以下のそれらに起因する意味を有し得る。しかし、当業者に知られているまたは理解されている他の意味も有し得、それらも本開示の範囲に含まれることが理解されるべきである。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。相反する場合、定義を含めて、本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は一例にすぎず、限定を意図していない。

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、身体の隣接組織または他の部分に拡散し得る、制御されない異常な細胞成長により引き起こされる疾患グループの中の1つを表す。がん細胞は、がん細胞がひとかたまりになっている固形腫瘍を形成し得、または血液系がん、例えば白血病におけるように、分散した細胞として存在し得る。

「がん細胞」という用語は、制御されない異常な成長および別の組織に浸潤する能力により特徴づけられる細胞またはそのような細胞由来の細胞を表す。がん細胞は、例えば、がん患者から得られる原発性がん細胞またはそのような細胞由来の細胞株を含む。1つの態様において、がん細胞は、血液系がん細胞、例えば白血病細胞またはリンパ腫細胞である。

「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳類を含む動物界のすべての構成員を含み、適宜、ヒトを表す。任意で、「対象」という用語は、がんを有すると診断されたまたは寛解状態にある哺乳類を含む。1つの態様において、「対象」という用語は、がんを有する、またはがんを有する疑いのあるヒトを表す。

1つの態様において、本明細書に記載される方法および使用は、がんの処置を提供する。「処置（treating）」または「処置（treatment）」という用語は、本明細書で使用される場合、および当業者によく理解されているように、臨床結果を含む、有益または望ましい結果を獲得するためのアプローチを意味する。有益または望ましい臨床結果は、検出可能であろうが検出可能でなかろうが、1つまたは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、安定化された（すなわち、悪化しない）疾患状態（例えば、患者を寛解状態で維持すること）、疾患を防ぐことまたは疾患の広がりを防ぐこと、疾患の進行を遅らせるまたは鈍化させること、疾患状態の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解（部分的か全体的かによらず）を含み得るがこれらに限定されない。「処置（treating）」および「処置（treatment）」はまた、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して生存を長期化することを意味し得る。「処置（treating）」および「処置（treatment）」はまた、本明細書で使用される場合、予防的処置を含む。1つの態様において、処置方法は、治療有効量の本明細書に記載されるCAR-DNT細胞を対象に投与することを含み、任意で、1回の投与からなる、あるいは一連の投与を含む。

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」というフレーズは、望ましい結果を達成するために必要とされる用量および期間において効果的な量を意味する。例えば、がんの処置に関して、有効量は、例えば、その化合物の投与なしで得られる応答と比較して、寛解を誘導する、腫瘍量を減少させる、および／または腫瘍の広がりもしくはがん細胞の成長を防ぐ量である。有効量は、その動物の疾患状態、年齢、性別および体重等の要因に依存して異なり得る。そのような量に対応する個々の化合物の量は、個々の薬物または化合物、薬学的配合、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置される対象またはホストの性質等の様々な要因に依存して異なり得るが、そうであったとしても、それは当業者により慣用的に決定され得るものである。

1つの態様において、本明細書に記載される方法、使用および組成物は、1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の生産、投与、または使用を伴う。例えば、1つの態様において、本明細書に記載される方法、使用および組成物は、CAR-DNT細胞またはCAR-DNTの生産、投与、または使用を伴う。本明細書で使用される場合、「CAR-DNT細胞」または「CAR-DNT」は、1つまたは複数のキメラ抗原受容体（CAR）分子を発現するよう改変された二重陰性T細胞（「DNT細胞」または「DNT」）を表す。そのようなCAR-DNT細胞は、DNT細胞由来であると表現され得る。

DNTは、それらを他の種類のT細胞と区別する多くの特徴を示す。1つの態様において、DNTは、CD4またはCD8を発現しない。1つの態様において、10～20日間増大されたDNTは、CD3-TCR複合体を発現し、CD4およびCD8を発現しない。1つの態様において、DNTは、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβTcR+である。1つの態様において、DNTは、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+およびαβTcR+である。1つの態様において、増大されたDNTは、CD11a+、CD18+、CD10-、および／またはTCR Vα24-Jα18-であり得る。1つの態様において、増大されたDNTは、CD49d+、CD45+、CD58+ CD147+ CD98+ CD43+ CD66b- CD35- CD36-および／またはCD103-であり得る。

DNTは、当技術分野で公知の技術、例えば、非限定的に、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて取得され得る。DNT細胞を生産および／または増大させる方法はまた、参照により本明細書に組み入れられるWO2007056854およびWO2016023134に記載されている。

本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、その細胞の意図されたレシピエントである対象を起源として得られる細胞を表す。1つの態様において、本明細書に記載されるDNT細胞またはDNT細胞の集団は、自己細胞を含むまたは該細胞からなる。

本明細書で使用される場合、「同種」という用語は、その細胞の意図されたレシピエントとは異なる個体であるが、レシピエントと同じ種である対象を起源として得られる細胞を表す。任意で、同種細胞は、細胞培養物由来の細胞であり得る。1つの態様において、DNTは、健常ドナーから得られる同種細胞である。本明細書で使用される場合、「健常ドナー」（「HD」）という用語は、がんを有さない1または複数の対象を表す。1つの態様において、健常ドナーは、検出可能ながん細胞を有さない対象、例えば、検出可能な白血病細胞を有さない対象である。1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNT細胞は、任意で1または複数の健常ドナー由来の、同種細胞である。1つの態様において、記載される遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、任意で1または複数の健常ドナー由来の、同種細胞を含むまたは該細胞からなる。

本明細書で使用される場合、「CAR」という用語は、キメラ抗原受容体を表す。1つの態様において、CAR分子は、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ならびに1つまたは複数の細胞内ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／またはCD3ゼータドメインを含む。抗原結合ドメインは、任意の適切な抗原、例えば、がん細胞の表面上に豊富であるまたは優先的に発現される抗原に結合し得る。1つの態様において、抗原結合ドメインはCD19に結合する。1つの態様において、抗原結合ドメインはCD4に結合する。

1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞は、標的抗原に結合するタンパク質をDNT細胞の表面上に発現させるよう細胞を遺伝子改変することによりDNT細胞からもたらされる。例えば、1つの態様において、CAR-DNT細胞は、1つまたは複数のCAR分子を発現するようDNT細胞を改変することによりDNT細胞からもたらされる。DNT細胞は、任意の適切な技術により1つまたは複数のCAR分子を発現するよう改変され得る。任意で、DNTは、適切な発現ベクター、プラスミドまたはmRNAを用いた形質導入により遺伝子改変され得る。

1つの態様において、遺伝子改変されたDNTは、対象への投与または使用前に凍結保存され得る。本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、細胞、例えば遺伝子改変されたDNT、例えばCAR-DNTを超低温に冷却することにより保存するプロセスを表す。そのような低温は、-80℃の冷凍庫もしくは固体二酸化炭素を用いた-70℃～-90℃の範囲、または液体窒素を用いた-196℃であり得、細胞に損傷を与え得る酵素的または化学的活性を鈍化／停止させるために使用され得る。凍結保存方法は、凍結時の細胞内氷晶の形成に起因するさらなる損傷を引き起こすことなく低温に達することを追求する。あるいは、新たに増大されたDNT細胞が、凍結保存されずに、本明細書に記載されるように遺伝子改変され、使用または投与され得る。

本明細書で使用される場合、「免疫抑制療法」は、移植片対宿主病（GvHD）、宿主対移植片拒絶、および／またはアロ反応性を防ぐまたは減少させるよう対象の免疫系を抑制するための1つまたは複数の薬剤の投与または使用を表す。免疫抑制療法の例は、アレムツズマブ、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンA（CSA）、タクロリムス（TAC）、ラパマイシン標的（TOR）阻害剤、例えばシロリムス（SIR）および／または抗増殖剤、例えばミコフェノール酸モフェチル（MMF）を含むがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「サイトカイン放出症候群」または「CRS」は、注入された製品および免疫療法による影響を受けた宿主免疫細胞による炎症性サイトカインの大規模、急速かつ全身的な放出により特徴づけられる免疫療法後に起こり得る、全身炎症反応を引き起こす状態を表す。

範囲のある値が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈がそれ以外のことを明確に示していない限りその下限値の単位の10分の1までの、各々の中間値、およびその言及されている範囲内の任意の他の言及されているまたは中間の値が、説明に含まれていることが理解される。任意の下限値から任意の上限値までの範囲が想定される。独立してそのより小さな範囲内に含まれ得るこれらのより小さな範囲の上限値および下限値もまた、説明に含まれ、これらは、言及されている範囲における任意の個別に排除される限度値として扱われ得る。言及されている範囲がその限度値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度値の両方を排除する範囲も説明に含まれている。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「a」、「an」、および「the」という単数形は、文脈がそれ以外のことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。

詳細な説明および特許請求の範囲内のすべての数値は、示されている値が「約」または「およそ」によって修飾され、当業者により予想され得る実験誤差およびばらつきを考慮する。

「および／または」というフレーズは、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、そのように接続される要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの例では同時に存在し、他の例では別々に存在する要素、を意味すると理解されるべきである。「および／または」と共に列挙される複数の要素も同じ様式で、すなわち、そのように接続される要素の「1つまたは複数」と解釈されるべきである。この「および／または」条項により具体的に特定される要素以外の他の要素も、任意で、それらの具体的に特定されている要素に関連するか関連しないかによらず、存在し得る。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、あるリストにおいてアイテム間に介在する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも1つを含むが、複数の要素またはリスト中の要素の2つ以上および任意で追加の列挙されていないアイテムも含むと解釈されるべきである。「～の中の1つのみ」もしくは「～の中の1つだけ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる」等の、そうでないことを明確に示す用語のみが、複数の要素またはリスト中の要素の中の1つの要素だけを含むことを表す。一般に、「または」という用語は、本明細書で使用される場合、排他性を表す用語、例えば「いずれか」、「～の中の1つ」、「～の中の1つのみ」または「～の中の1つだけ」が先行する場合に、排他的な二者択一（すなわち、「一方または他方であるが、両方でない」）を示すと解釈されるにとどまるべきである。

特許請求の範囲において、および上記明細書中において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「～から構成される（compoosed of）」等のすべての移行句は、開放型である、すなわち、含むがそれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。「～からなる」および「～から本質的になる」という移行句のみが、それぞれ、閉鎖型または準閉鎖型の移行句であり得る。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、1つまたは複数の要素のリストを参照する「少なくとも1つ」というフレーズは、その要素のリスト中のいずれか1つまたは複数の要素から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、必ずその要素のリスト内に具体的に列挙されている各々かつあらゆる要素の少なくとも1つを含むということではなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解されるべきである。この定義はまた、任意で、具体的に特定されている要素に関連するか関連しないかによらず、「少なくとも1つ」というフレーズが参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が存在し得ることを許容する。

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、参照がなされている数値のプラスまたはマイナス0.1～50％、5～50％、または10～40％、10～20％、10～15％、好ましくは5～10％、最も好ましくは約5％を意味する。

2つ以上の工程または行動を含む本明細書に記載される特定の方法において、その方法の工程または行動の順は、文脈がそれ以外のことを示していない限り、その方法の工程または行動が示されている順に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

本開示の実施または試験には、本明細書に記載されているのと同様または同等のあらゆる方法および材料を使用することができるが、ここにはその好ましい方法および材料が記載されている。

II. 製品および組成物
1つの局面において、1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞が提供される。1つの態様において、DNT細胞は、特定の標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を発現するよう遺伝子改変される。

標的抗原に結合するタンパク質、例えば、非限定的に、CARをコードする核酸をDNT細胞が発現するよう改変するために、任意の適切な方法が使用され得る。実施例に示されるように、改変されたDNT細胞は、CARをコードする配列を含むベクター、プラスミドまたはmRNAでの形質導入により作製され得る。したがって、1つの態様において、改変されたDNT細胞は、CARまたは標的抗原に結合する別の適切なタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターでの形質導入により作製される。

標的抗原は、任意の適切な抗原、例えば、がん細胞の表面上に発現される標的であり得る。適切な抗原は、CD4、CD33、CD19、CD20、CD123 LeY、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリーおよびNY-ESO-1を含むがこれらに限定されない。1つの態様において、標的抗原はCD19である。1つの態様において、標的抗原はCD4である。

1つの態様において、CARは、細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、CARの細胞外結合ドメインは、適切な標的抗原に結合する。例えば、CARは、がん細胞上に発現される標的抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを含み得る。

実施例に示されるように、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNT細胞は、凍結保存後も活性を維持する。したがって、1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞は、凍結または凍結保存されている。例えば、1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変された同種DNT細胞の集団は、エクスビボで増大および改変され、その後に、臨床使用に適したオフ・ザ・シェルフ細胞療法を生成するために凍結保存され得る。1つの態様において、細胞は、-20℃未満、50℃未満、60℃未満、-20～-196℃の間、-70℃～-196℃の間、または-70℃～-90℃の間の温度で凍結される。

本開示にしたがう改変されたDNT細胞は、組成物の形態で提供され得る。例えば、1つの態様において、本明細書に記載される改変されたDNT細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。CAR-DNTは、当技術分野で公知の薬学的に許容される配合物を用いて、対象への使用用に配合され得るまたは対象への投与用に調製され得る。適切な配合物の選択および調製のための従来的な手法および成分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences （2003 - 第20編）および1999年発行のThe United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)に記載されている。「薬学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトの処置に適合することを意味する。本明細書に記載される遺伝子改変されたDNTを、適切な容器もしくは包装および／またはその使用のための、例えば対象におけるがんの処置のための説明書と共に含むキットも提供される。

本明細書に記載される改変されたDNT細胞の集団も提供される。1つの態様において、1または複数の健常ドナーから生成された遺伝子改変された同種DNTの集団が提供される。1つの態様において、遺伝子改変された同種DNT細胞の集団は、対象において移植片対宿主病（GvHD）を誘導しない。1つの態様において、遺伝子改変された同種DNT細胞の集団は、従来のCAR-T細胞（CAR-T_conv細胞）と比較して対象においてより軽度のGvHDを誘導する。

1つの態様において、遺伝子改変された同種DNT細胞の集団は、対象において宿主対移植片拒絶を回避または抑制する。1つの態様において、CAR-DNT細胞の集団は、CAR-T_conv細胞と比較して対象においてHvG拒絶を回避または抑制する。1つの態様において、CAR4-DNTの集団が提供される。1つの態様において、CAR4-DNTの集団は、フラトリサイドを誘導しない。CAR8-DNTの集団も提供される。

1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNT細胞は、HvG拒絶またはGvHDを回避するために改変を必要としない。例えば、1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNT細胞、任意でCAR-DNT、例えばCAR4-DNTは、HLA（任意でクラスIもしくはクラスII）、T細胞受容体、CD7、またはCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも除去するようにも遺伝子改変されない。

III. 方法および使用
実施例に示されるように、遺伝子改変されたDNT細胞は、B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）細胞株（NALM-6）および患者のALL芽球を含むがん細胞に対する細胞傷害性を増強することが示された。CAR19-DNTが、マウスNALM-6異種移植モデルにおいて生存を延長するのに効果的であることも示され、CAR19-DNT処置を受けたマウスは、対照と比較して優れた全体健康スコアを示した。注目すべきことに、CAR19-DNTはまた、非形質導入対照と比較して、CD19+肺がん細胞株に対する細胞傷害活性の増加も示す。CAR-DNTはまた、従来のCAR19 T細胞とは対照的に、オフ腫瘍アロ反応性（off-tumor alloreactivity）を誘導しないことも示された。注目すべきことに、T_conv細胞の遺伝子改変は外来ペプチドに起因して宿主対移植片（HvG）拒絶を増進し得るのに対して、改変されたDNTは有意なアロ反応性を誘導しないかまたは従来のCAR T細胞よりも軽度のアロ反応性を示した。学説により制限されるものではないが、これは、T_conv細胞媒介免疫応答を抑制するDNTの能力に起因すると考えられる。抗CD4 CARを形質導入されたDNTも生成され、いかなるフラトリサイドの兆候も示さずにCD4+白血病細胞株に対して有効であることが実証され、これによりDNTが汎用CARキャリアとしてまたは他の標的化細胞療法において有用であり得ることが示された。

したがって、1つの局面において、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、標的抗原に結合する有効量の遺伝子改変されたDNTの集団を対象に投与する工程を含む方法が提供される。それを必要とする対象におけるがんの処置のための、1つまたは複数の標的抗原に結合する有効量の遺伝子改変されたDNT細胞の集団の使用も提供される。1つの態様において、CAR-DNT細胞の集団は、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβ-TcR+である細胞を含むまたは該細胞からなる。1つの態様において、標的抗原は、がん細胞の表面上に発現される。1つの態様において、遺伝子改変されたDNTは、キメラ抗原受容体（CAR）二重陰性T（DNT）細胞である。

本明細書に記載される方法または使用において使用するための遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、1または複数の適切なドナーからもたらされ得る。適切なドナーは、処置される対象または処置される対象と同じ種の1もしくは複数のドナーを含む。したがって、1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、自己細胞を含むまたは該細胞からなる。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、同種細胞を含むまたは該細胞からなる。任意で、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、1または複数の健常ドナー由来の同種細胞を含むまたは該細胞からなる。1つの態様において、CAR-DNT細胞の集団は、がんの処置のためのそれらの使用または投与前に凍結保存された、1または複数のドナー由来の遺伝子改変されたDNTを含むまたは該DNTからなる。

現在利用可能な同種CAR免疫細胞療法は、HvG拒絶を回避するために同種CAR-T細胞上のHLAをノックアウトするかまたはCD52+レシピエントＴ細胞を除去するためのさらなる遺伝子改変を伴うものである（Zhao et al. 2018）。あるいは、同種CAR製品の複数回の注入が可能なように免疫抑制剤の反復投与が使用される。しかし、これらは製品製造のコストおよび複雑さを増大させ得るまたは感染に対するレシピエントの免疫系を妨害し得る。図7に示されるように、本明細書に記載される同種CAR-DNT細胞は、アロ反応性を生じることなく従来のT細胞と共存し得るおよび／または従来の（CD4+/CD8+）CAR T細胞よりも軽度のアロ反応性を生じ得る。1つの態様において、本明細書に提供される遺伝子改変された同種DNTは、HvG拒絶を回避するよう遺伝子改変されない。1つの態様において、遺伝子改変されたDNTは、HLA（任意でクラスIもしくはクラスII）、内因性T細胞受容体、CD7またはCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも除去するようにも改変されない。

1つの態様において、遺伝子改変された同種DNTは、対象に投与または使用されたときに移植片対宿主病を引き起こさない。1つの態様において、遺伝子改変された同種DNTは、宿主対移植片アロ拒絶を回避する。1つの態様において、遺伝子改変された同種DNTは、従来の（CD4+/CD8+）CAR T細胞よりも宿主対移植片アロ拒絶に対して耐性がある。1つの態様において、遺伝子改変された同種DNTは、アロ反応性T細胞を抑制することにより宿主対移植片アロ拒絶を回避し、そのため、標準的なリンパ球除去プレコンディショニングの後に、さらなる免疫抑制療法を必要とせずに使用できる。

1つの態様において、対象は、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与前にリンパ球除去化学療法を受ける。リンパ球除去プレコンディショニングは、一般に、対象において、養子移入されたリンパ球の増大および成長のためのスペースおよび好ましい恒常性サイトカイン環境を形成すると考えられている。例えば、1つの態様において、化学療法（例えば、フルダラビン＋シクロホスファミド）を用いるリンパ球除去が、DNTを含むT細胞療法の投与前に使用され得る。リンパ球除去プレコンディショニングは、典型的に、アロ反応性、例えばGvHDまたはHvG拒絶の回避または減少を助けるために細胞療法の投与と同時または投与後に使用され得るより長期間の免疫抑制と異なり、数週間の間続けられる。

1つの態様において、対象は、がんの処置のための遺伝子改変されたDNT細胞の投与または使用と同時にまたはその後に免疫抑制療法を受けない。1つの態様において、リンパ球除去化学療法によりプレコンディショニングされた対象において、注入された遺伝子改変された同種DNT細胞に対するアロ反応性またはHvGを抑制するまたは減少させるために、さらなる免疫抑制剤、例えばアレムツズマブが必要とされない。例えば、1つの態様において、対象は、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後60、30、21、14、0または-7日以内にさらなる免疫抑制療法を受けない。

1つの態様において、従来の同種CD4+/CD8+ T細胞は宿主対移植片（HvG）拒絶を起こし易く、HvGを抑制するためにさらなる免疫抑制療法、例えばアレムツズマブが必要とされるのに対して、遺伝子改変されたDNT細胞の集団は、さらなる免疫抑制療法、例えばアレムツズマブを必要とすることなく、HvGを回避または抑制する。例えば、1つの態様において、遺伝子改変された同種DNT細胞は、リンパ球除去プレコンディショニングされた対象において、HvGを抑制するためのさらなる免疫抑制療法なしに、2週間、3週間、4週間、6週間、または8週間よりも長く持続する。1つの態様において、遺伝子改変されたDNT細胞は、対象における当該細胞の投与または使用から2週間、3週間、4週間、6週間、または8週間後に、対象由来の生物学的サンプルにおいて検出され得る。

1つの態様において、多用量の遺伝子改変された同種DNT細胞が、細胞または患者に対するさらなる操作なしに、患者に注入され得る。例えば、態様において、遺伝子改変された同種DNT細胞は、初期注入後約1週間、2週間、3週間、および／または4週間以内に患者に再注入され得る。

本明細書に記載される方法における使用に適した1つまたは複数の標的抗原に結合する遺伝子改変されたDNT細胞は、任意の適切な方法により生成され得る。例えば、1つの態様において、CAR-DNT細胞の集団は、1つまたは複数のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクター、プラスミドまたはmRNAで形質導入されたDNT細胞を含む。

本明細書に記載される方法に従い使用されるCAR-DNT細胞は、1つまたは複数の適切なCAR分子を発現し得る。1つの態様において、CARは、細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CARの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される方法に適した任意の標的抗原に結合し得る。したがって、1つの態様において、CARは、対象においてがん細胞上に発現される標的抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。適切な標的抗原は、CD4、CD33、CD19、CD20、CD123、LeY、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリーおよびNY-ESO-1を含む。1つの態様において、標的抗原はCD19である。1つの態様において、標的抗原はCD4である。

本明細書に記載される遺伝子改変されたDNT細胞は、様々ながんの処置において使用され得る。1つの態様において、がんは、血液悪性腫瘍、例えば白血病またはリンパ腫である。任意で、がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、または慢性リンパ球性白血病である。1つの態様において、がんは、肺がんを含むがこれに限定されない1つまたは複数の固形腫瘍を含む。

1つの態様において、それを必要とする対象においてCD4+がんを処置する方法であって、CD4に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の有効量を対象に投与する工程を含む方法が提供される。それを必要とする対象においてCD4+がんを処置するための、CD4に結合するよう遺伝子改変された有効量のDNTの使用も提供される。1つの態様において、DNT細胞は、CD4標的化CAR-DNT（CAR4-DNT）である。1つの態様において、遺伝子改変されたDNTは、同種である。1つの態様において、がんは血液悪性腫瘍である。1つの態様において、がんはT細胞がん、例えばT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）、末梢T細胞リンパ腫（PTCL）および／または皮膚T細胞リンパ腫(CTCL）である。T細胞がんに対して従来の自己CART療法を使用することは、CART細胞を生成するために使用される自己T細胞生産物に患者のがん性T細胞が混入する可能性があるため、困難である。さらに、従来のT細胞自身におけるCD4発現が、CD4標的化された従来のCART細胞間でのフラトリサイドを引き起こし得るのに対して、CAR4-DNT細胞の製造は、フラトリサイドの兆候を示さない（図10a）。図10bに示されるように、同種CAR4-DNT細胞は、CD4+急性リンパ球性T細胞白血病細胞株に対して細胞傷害性であることが示された。さらに、同種CAR4-DNTは、CD4を発現せず、がん性T細胞の混入なしに健常ドナーから生成できるため、自己T細胞療法に付随する問題を回避することができる。

実施例に示されるように、本明細書に記載されるCAR-DNTは、がん細胞のCAR標的化およびCAR非依存的の二重の殺傷を示す。1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNTは、再発または反復性のがんを有する対象への使用または投与用である。例えば、1つの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変されたDNTは、従来のCAR-T細胞処置、例えば、従来のCAR19 T細胞処置後に再発性のがんを有する対象への使用または投与用である。1つの態様において、がんは、再発性急性リンパ芽球性白血病、任意でB細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）である。1つの態様において、がんはCD19-B-ALLを含むまたはCD19-B-ALLからなる。

1つの態様において、本明細書に記載される方法および使用は、標的抗原の不均一な発現を示すがん、例えば、CD4、CD33、CD19、CD20、CD123および／またはLeYの不均一な発現を示すがんの処置用である。1つの態様において、本明細書に記載される方法および使用は、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリーおよび／またはNY-ESO-1の不均一な発現を示すがんの処置用である。

IV. 実施例
実施例1.
DNTにキメラ抗原受容体（CAR）を形質導入できるかどうかを決定するため、DNTに、広く使用されているCD19-CAR（CAR19）を形質導入し、その発現を、プロテインL結合を用いて決定した。DNTは、55.5％±7.51％の平均形質導入率でCAR19により形質導入され（図1a）、CAR19発現は、少なくとも12日間維持された（図1b）。CAR19形質導入によるDNTにおける表現型変化は見られず、DNTは、CD3陽性、CD4およびCD8二重陰性の表現型を保持し（図1c）、かつDNTは、CAR19形質導入なしで増大されたものに匹敵する増大プロフィールを保持していた（図1d）。

CD19+ B-ALL細胞株NALM-6に対するインビトロ殺傷アッセイを、非形質導入（NT）-またはCAR19-DNT細胞を用いて実施し（図2a）、5名の原発性B-ALL患者の芽球（図2b）から、非形質導入（NT）-DNT細胞はNALM-6および一部のB-ALL患者サンプル（100709、110291、および090652）に対して一定程度の細胞傷害性を誘導できるが、細胞傷害性の程度はCAR19形質導入により有意に増強されることが示された。さらに、CAR19+ DNT細胞によるB-ALLとの共培養後の上清から、NT-DNT細胞のそれよりも高レベルのIFNγが検出された（図2c）。

CAR19-DNTの抗白血病活性をインビボで決定するため、NALM-6を生着させた免疫不全NSGマウスを未処置とするかまたはマウスあたり0.33x10⁶、10⁶、または3x10⁶細胞という異なる数のCAR19-DNT細胞で処置し、その白血病量およびマウスの生存を比較した。骨髄におけるNALM-6生着レベルは、フローサイトメトリーにより決定した。CAR19-DNT細胞は、用量依存的な様式で白血病量を減少させ、その平均NALM-6生着レベルは、未処置グループにおける79.2％±3.6％に対して、最も高用量のCAR19-DNT細胞で処置されたマウスにおいて0.19％±0.11％であった（図3aおよび3b）。さらに、3x10⁶個のCAR19-DNT細胞で処置したマウスは、未処置グループの28日間という生存期間中央値と比較して、44日間の生存期間中央値という長期の生存を示した（図3c）。これと一致して、CAR19-DNT処置レシピエントにおいて、みすぼらしさ（scruffiness）、背中の曲がり（arch in back）、抜け毛、および活動性の喪失により評価される、有意に優れた全体健康スコアが観察された（図3d）。

本発明者らの知見を異なるB-ALL標的を用いて検証するため、B細胞リンパ芽球株であるDaudiを生着させたNSGマウスをNT-またはCAR19-DNT細胞で処置した。CAR19-DNT細胞で処置されたマウスの骨髄において、NT-DNT処置マウスで見られたものよりも有意に低いレベルのDaudi生着が観察された（図4a）。さらに、NT-DNTグループにおいて、CAR-DNTグループよりも有意に低いマウス体重が観察され（図4b）、これによりNT-DNT細胞で処置されたマウスと比較してCAR19-DNT細胞で処置されたマウスの優れた適合性が示唆された。

人道的エンドポイントにおけるNALM-6のエクスビボ分析は、CAR19-DNT細胞処置グループから得られたNALM-6によるCD19の発現が、未処置由来のそれよりも減少していたことを示し（図5aおよび5b；53.22％±5.12％対91.67％±0.30％）、これによりNALM-6が、CAR-T細胞処置後のCD19- B-ALL再発患者において見られるようにCD19の下方調節を通じてCAR19-DNT細胞媒介抗白血病活性を回避し得ることが示唆された。驚くべきことに、CAR19-DNT処置マウスから得られたNALM-6をエクスビボでCAR19-DNTの標的として用いた場合、それらは未処置NALM-6と同程度に効率的にCAR19-DNT細胞により殺傷され（図5c）、これによりCAR19-DNT細胞を用いたさらなる処置がCAR19-DNT細胞の治療的利益を増強し得ることが示唆された。

CAR19-DNTの効力をCAR19-T_conv細胞のそれと比較するため、同じ健常ドナー由来のCAR19-DNTおよびCAR19-T_conv細胞を用いてNALM-6に対するインビトロ殺傷アッセイを実施し、両方の細胞型が同程度の細胞傷害性を誘導することが示された（図6a）。同様に、NALM-6との共培養後にCAR19-DNTおよびCAR19-T_convにより同程度の量のIFNγが産生された（図6b）。さらに、等しい数のCAR19-DNTおよびCAR19-T_conv細胞を用いたNALM-6生着NSGマウスの処置は、どちらも、白血病の根絶をもたらし、これによりCAR19-DNTがCAR19-T_conv細胞のそれと同程度の抗白血病活性を誘導することが支持された（図6c）。

Ruellaら（Ruella, Barrett et al. 2016）は、二特異性を有するCARが、CD19の下方調節によりB-ALLの再発を防ぐことができることを示した。DNT細胞がNKG2DおよびDNAM-1により媒介される内因性の抗白血病活性を有することをふまえて、CD19白血病細胞株およびCAR19-T_conv細胞処置後に再発した患者由来の原発性B-ALL芽球に対する細胞傷害性を媒介するCAR19形質導入DNTおよびNT-DNTの能力を試験した。注目すべきことに、CAR19-DNTは、標的細胞に対してCD19発現の非存在下で細胞傷害性を効果的に誘導する（図7a）。興味深いことに、従来のCD19-CAR T細胞処置を受けた後に再発した患者から得られた原発性B-ALL芽球に対する有意な程度のインビトロDNT媒介細胞傷害性が、用量依存的な様式で見られた（図7b）。さらに、CAR19-DNTはCD19+非ホジキンリンパ腫細胞株であるDaudiに対して優れた細胞傷害性を示したのに対して、NT-DNTはDaudiに対する有意な程度の細胞傷害性を用量依存的な様式で誘導した（図7c）。これらの結果は、CAR媒介および内因性の抗白血病活性というそれらの二重の細胞傷害機能を通じて、CAR-DNTが患者における抗原陰性再発を防ぐ能力を有すること、それがそれらの全体としての治療価値を向上させていることを示唆している。まとめると、CAR19-DNTは、CAR抗原の下方調節を通じた免疫逃避を防ぐことによりCAR19-T_conv細胞のそれよりも優れた抗白血病活性を誘導し得、従来的なCAR19 T細胞処置後の再発患者を処置する可能性を有する。

B-ALLに対する内因性とCAR19媒介性の抗白血病活性を比較するため、NALM-6細胞をNT-DNT細胞、CAR19-DNT細胞、NT-T_conv細胞、またはCAR19-T_conv細胞ありまたはなしで2または5日間培養した。NT-DNT細胞処置培養物において、NT-T_conv細胞で処置されたものよりも有意に少ない数のNALM-6細胞が観察され、これによりDNT細胞はNALM-6に対する内因性の抗白血病活性を媒介するがT_conv細胞はそうではないことが示された（図8aおよび8b）。しかし、CAR19-DNT細胞とCAR19-T_conv細胞の間で、培養されたNALM-6細胞の数に関して著しい差は見られなかった（図8aおよび8b）。同様に、NT-DNT細胞と共培養された場合にNALM-6細胞の度数の顕著な減少が時間と共に観察されたのに対して、NT-T_conv細胞との共培養は相対的なNALM-6度数を減少させなかった（図8c）。CAR19-DNT細胞およびCAR19-T_conv細胞の両方との共培養は、2日間で、NALM-6細胞度数を10％以下に減少させた（図8c）。

遺伝子改変されていないDNTは、GvHDを引き起こさないまたはアロ反応性を誘導しないことが以前に示されている。CAR19形質導入T細胞はCAR由来の細胞内ドメインによる活性化の増大のためにより高い基礎活性化レベルを有し得、かつCAR由来の外来抗原の結果としてアロ反応性を誘導し得るため、オフ・ザ・シェルフ細胞療法として同種CAR-DNTを使用するために、これらの細胞がGvHDおよび／またはHvG拒絶を誘発するかどうかを決定することが重要である。したがって、インビトロ混合リンパ球反応（MLR）アッセイを実施し、同種免疫応答を誘導するCAR19-DNTの能力を決定した。CAR19-DNTを、照射した同種PBMCで刺激した（図9a）。並行して、CAR19-T_conv細胞を対照として刺激した。ついで、アロ抗原で刺激されたCAR19-DNTおよびCAR19-T_conv細胞を収集し、同じ同種ドナー由来の生きたPBMCに対するエフェクターとして使用した。CAR改変のないDNT（NT-DNT）において見られるように、アロ抗原刺激されたCAR19-DNTは、刺激のために使用された同じ同種細胞に対して細胞傷害性が誘発されないことにより証明されるようにアロ反応性を生じなかったのに対して、CAR19-T_conv細胞は、用量依存的な様式で高い程度のアロ反応性を生じた（図9b）。一方、図9cに示されるように、CAR19-T_conv細胞と、以前にCAR19-T_conv細胞で刺激された同種CD8+ T細胞との共培養は、用量依存的な様式で有意な程度の殺傷を誘導し（図9d）、これにより同種CAR19-T_conv細胞がレシピエントの免疫系の同種応答を誘発し得、拒絶され得ることが示唆された。これに対して、CAR19-DNTで刺激された同種CD8+ T細胞により殺傷されたCAR19-DNTの数は、有意に少なく（図9c～d）、ここでも、CAR19-DNT細胞が低アロ反応性であり、HvG拒絶を回避し得ることが支持された。CAR19-DNT細胞がどのようにしてアロ反応性を回避しているかを理解するため、DNT細胞をアロ-Agの存在下で同種CD8⁺ T細胞と共培養するインビトロアッセイを実施した（図9e）。驚くべきことに、DNT細胞の存在は、CD8⁺ T細胞のアロ反応性の発生を阻害したのに対して、DNTの非存在下で刺激されたそれらは、強力なアロ反応性を誘導し（図9f）、これによりCAR19-DNT細胞がアロ拒絶からそれら自身を保護するために積極的にアロ反応性を抑制していることが示唆された。

同種CAR19-DNTの安全性をさらに決定するために、ナイーブNSGマウスを未処置とするかまたはCAR19-DNT細胞もしくはCAR19-T_conv細胞を注入した。CAR19-T_conv細胞処置されたマウスは、GvHDの兆候を生じ、体重を減らし始め、他の疾病兆候、例えば猫背および運動性低下を示したことが観察された（図10aおよび10b）。CAR19-T_conv細胞で処置されたマウスの生存率低下も観察されたのに対して、CAR19-DNTグループは死亡例を示さなかった（図10c）。CAR19-T_conv細胞処置グループの肝臓組織学においては重度の組織損傷も観察されたが、未処置およびCAR19-DNT細胞処置マウスにおいては観察されなかった（図10d）。

サイトカイン放出症候群は、患者において見られる一般的なCAR-T細胞関連毒性であり（Giavridis et al., 2018）、これは主としてCAR-T細胞により活性化された単球により産生されるIL-1βおよびIL-6により媒介される。単球によるIL-1βおよびIL-6産生に対するCAR-DNT細胞の影響をCAR19-T_conv細胞との比較で評価するため、NALM-6細胞をNTもしくはCAR形質導入DNT細胞またはCAR19-T_conv細胞と共に培養した。その後、T細胞により産生されるサイトカインを用いて単球細胞株THP-1またはmTHP-1を3～4日間刺激し、CRS関連サイトカインIL-1βおよびIL-6のレベルを測定した。NT-DNTと比較して、CAR19-DNT細胞により産生された上清を用いて刺激したとき、単球細胞株によるIL-1βおよびIL-6産生の有意な増加が観察された。しかし、CAR19-T_conv細胞により産生されたサイトカインの存在下で、CAR19-DNT細胞のそれよりも有意に高いレベルのIL-1βおよびIL-6が得られた（それぞれ、図11aおよび11b）。まとめると、結果は、CAR19-DNT細胞および他の抗原、例えばCD4、CD8を標的化するCAR-DNTを含むがこれらに限定されない遺伝子改変されたDNT細胞は、CAR-T_conv細胞よりも重度のCRSを引き起こす可能性が低いことを示唆している。

CAR19-DNT細胞が凍結保存後もそれらのオフ・ザ・シェルフ特性を保持しているかどうかを決定するため、凍結保存されたCAR19-DNT細胞の抗白血病活性およびT_conv細胞のアロ反応性に対するCAR19-DNT細胞の耐性を決定した。60日を超えて凍結保存されたCAR19-DNT細胞は、NALM-6細胞に対して、新鮮なCAR19-DNT細胞のそれと比較して同程度の抗白血病活性を示す（図12）。

以前に、NT-DNT細胞がドナー非依存的な様式でそれらの抗白血病活性を媒介し、オフ・ザ・シェルフT細胞療法の要件の1つを満たすことが示された。CAR-DNT細胞が同様の様式で機能するかどうかを決定するため、3名の異なるドナーから得られたDNT細胞を用いて製造されたCAR19-DNT細胞を、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいてNALM-6に対するエフェクター細胞として使用した。3名のドナーのすべてにより、NALM-6の同等の用量依存的な殺傷が観察され（図13）、これによりCAR19-DNT細胞がドナー非依存的な様式で機能し、そのオフ・ザ・シェルフ性を保持していることが支持された。

CAR-DNT技術が固形腫瘍を含む他の形態の悪性腫瘍に適用可能かどうかを決定するため、CD19発現に関して形質導入された肺がん細胞株A549およびH460を標的化するCAR19-DNTの効果を試験した。B-ALLのそれと同様、CAR19-DNTは、CD19+ A549およびCD19+ H460に対してNT-DNTのそれよりも優れた細胞傷害活性を誘導し、一方、CAR19-DNTおよびNT-DNTは野生型A549（図14a）およびH460（図14b）に対しては同程度の細胞傷害性を誘導した。さらに、上清中のIFNγレベルの増加は、CAR19-DNT細胞をCD19形質導入A549と共培養したときにのみ観察された（図14c）。まとめると、結果は、固形腫瘍上に発現される抗原を認識する受容体で遺伝子改変されたDNTがそれらの抗がん活性を有意に増強し得ることを示している。

遺伝子改変されたDNT細胞が異種移植モデルにおいて固形がんを効果的に標的化することができるかどうかをさらに評価するため、NSGマウスにCD19形質導入A549細胞を皮下注射した。その後、マウスを未処置とするかまたはNT-もしくはCAR19-DNT細胞で処置した。未処置対照と比較してNT-DNT細胞で処置されたマウスにおいて有意に遅い腫瘍成長が観察され、これによりNT-DNT細胞の不完全であるが効果的な内因性抗腫瘍活性が示された（図15a）。CAR19-DNT細胞処置マウスにおける腫瘍サイズは、ほぼ不変であり、未処置およびNT-DNT細胞処置グループよりも有意に低い、腫瘍体積の変化倍率を示した。同様に、研究の最後に、NT-DNTおよびCAR19-DNT細胞処置されたマウスの両方において、未処置と比較して減少した腫瘍重量が観察され、CAR19-DNT細胞処置でより大きな減少が見られた（図15b）。

T細胞白血病およびリンパ腫を処置するための従来のT細胞を用いた抗CD4 CARの製造は、製造時の抗CD4 CAR T細胞のフラトリサイドのために困難であった。加えて、患者のがん性T細胞が自己CART製品に混入し得るため、T細胞がんは、自己CART製品を製造する上での難関であった。同種DNTがT細胞がん、例えばT-ALL、PTCLおよびCTCL等を標的化するよう遺伝子改変され得るかどうかを決定するため、本発明者らはDNT細胞によるCD4発現の欠如を利用し、同種DNTを構築し、それに抗CD4 CAR（CAR4）を形質導入した。CAR4-DNTが非形質導入DNTと同様に良好に増大されたことから、本発明者らはフラトリサイドの兆候がないことを見出した（図16a）。予想された通り、CAR4-DNTは、CD4+ T細胞白血病細胞株であるCCRF-CEMを、NT-DNTのそれよりも効果的に標的化した（図16b）。CAR4-DNTはがん性T細胞の混入またはフラトリサイドなしに同種健常ドナーから生成され得るので、同種CAR4-DNTは、CD4+ T細胞がんの処置に関して特別に良い位置にいる。DNT細胞はCD8も発現しないので、抗CD8 CAR（CAR8）をDNTに形質導入することができ、そしてCD8 T細胞性悪性腫瘍を処置するために使用され得ることが予想される。

CAR4-DNT細胞の抗原特異性をさらに評価するため、健常ドナー由来のPBMCを、NTもしくは空ウイルスベクター（EV）、CAR19、またはCAR4形質導入DNT細胞と、漸増するDNT対PBMC比で共培養した。PBMC内のCD4⁺細胞に対するCAR4-DNT細胞の有意に改善された殺傷が観察されたのに対して、NT-、EV-、およびCAR19-DNTは、CD4⁺ PBMCに対して最小の毒性を示した（図17a）。対照的に、CD4^- PBMCに対するCD4-、EV-、NT-DNT細胞の最小の毒性が観察されたのに対して、CD19-DNT細胞は、おそらくCD19⁺ PBMCの標的化が理由で改善された毒性を示した。まとめると、これらの結果は、CAR4-DNT細胞の抗原特異性およびDNT細胞プラットフォームにおいて異なるCAR技術を用いて様々な抗原を標的化する柔軟性を示している。上述のように、フラトリサイドは、T細胞性悪性腫瘍の処置のためのCAR-T細胞の変換における大きなハードルである。CAR4-T細胞製造時のフラトリサイドの程度を評価するため、NTもしくはCAR4形質導入DNTまたはT_conv細胞の数および組成を比較した。T_conv細胞にCAR4を形質導入したときに細胞数の有意な減少が観察された（図18a）。さらに、NT-T_conv細胞と比較してCAR4-T_conv細胞においてCD4+ T細胞の度数の有意な減少が観察された（図18b）。対照的に、NT-DNTに対するCAR4-DNTの相対数および組成は同等であった。これらの結果は、CAR4がフラトリサイドなしにDNTに効果的に形質導入され得ることを示している。CAR4およびCAR8の集団は、したがって、がんの処置のために、NT-DNTおよびCAR4-T_convおよびCAR8-T_convよりもずっと低用量で使用または投与することができる。

まとめると、これらの結果は、1）オフ・ザ・シェルフ療法として使用することができる；2）異なる抗原標的化技術、例えばCAR技術を採用することができる；ならびに3）他の液体および固形がんタイプを処置するために使用することができるプラットフォームとしてのDNTの幅広い応用性を支持している。

参考文献：

Claims

それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞の集団の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
それを必要とする対象においてがんを処置するための、1つまたは複数の標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞の集団の有効量の使用。
前記DNT細胞が、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項1記載の方法または請求項2記載の使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβ-TCR+である細胞を含むまたは該細胞からなる、請求項1～3のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、自己細胞を含むまたは該細胞からなる、請求項1～4のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、任意で1または複数の健常ドナー由来の、同種細胞を含むまたは該細胞からなる、請求項1～5のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象において移植片対宿主病（GvHD）を誘導しない、または従来のT細胞もしくは遺伝子改変された従来のT細胞と比較して対象においてより軽度のGvHDを誘導する、請求項1～6のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象において宿主対移植片（HvG）拒絶を回避または抑制し、任意で、該DNT細胞の集団が、従来のT細胞もしくは遺伝子改変された従来のT_conv細胞と比較して対象においてHvG拒絶を回避または抑制する、請求項1～7のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、CD4+ CD8+ CAR T細胞の対照集団よりも長く、任意で2週間、3週間もしくは4週間より長く、対象において持続する、および／または遺伝子改変された同種DNT細胞の集団が、さらなる免疫抑制療法を必要とせずにHvG拒絶を回避する、請求項8記載の方法または使用。
対象が、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後に免疫抑制療法を受けない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法または使用。
対象が、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後60、30、21または14日以内に免疫抑制療法を受けない、請求項9記載の方法または使用。
対象が、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与前にリンパ球除去化学療法プレコンディショニングを受け、任意で、リンパ球除去化学療法がフルダラビンおよび／またはシクロホスファミドを含む、請求項1～10のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、1つまたは複数のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクター、プラスミドまたはmRNAで形質導入されたDNT細胞を含む、請求項1～11のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞がCAR-DNTであり、CARが細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1～12のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞がCAR-DNTであり、CARが対象におけるがん細胞上に発現される標的抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、請求項1～14のいずれか1項記載の方法または使用。
標的抗原が、CD4、CD8、CD33、CD19、CD20、CD123および／またはLeY、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリー、ならびにNY-ESO-1から選択される、請求項1～15のいずれか1項記載の方法または使用。
標的抗原がCD4である、請求項16記載の方法または使用。
標的抗原がCD19である、請求項16記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNTの集団が凍結保存される、請求項1～18のいずれか1項記載の方法または使用。
がんが血液悪性腫瘍、任意で白血病またはリンパ腫である、請求項1～19のいずれか1項記載の方法または使用。
がんが、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、または慢性リンパ球性白血病である、請求項20記載の方法または使用。
がんが急性リンパ芽球性白血病である、請求項20記載の方法または使用。
対象におけるがんが1つまたは複数の固形腫瘍を含む、請求項1～19のいずれか1項記載の方法または使用。
がんが肺がんである、請求項23記載の方法または使用。
がんが標的抗原陰性の再発がんである、または対象がCAR-T_conv細胞の集団を用いた処置、任意で、CAR19-またはCAR20-T_conv細胞の集団を用いた処置を以前に受けている、請求項1～24のいずれか1項記載の方法または使用。
がんが標的抗原の不均一な発現を示す、請求項1～25のいずれか1項記載の方法または使用。
がんが、再発急性リンパ芽球性白血病、任意で再発B細胞急性リンパ芽球性白血病または再発CD19- B細胞急性リンパ芽球性白血病である、請求項25記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞がCAR-DNTであり、CAR-DNTが対象においてがん細胞のCAR標的化殺傷およびCAR非依存的殺傷を示す、請求項1～27のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNTが、HLA、T細胞受容体、CD7、およびCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも排除するようにも遺伝子改変されていない、請求項1～27のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNTの集団により産生されるサイトカインが、従来のT細胞（T_conv）、任意でCAR-T_conv細胞により産生されるサイトカインと比較して、単球によるIL-1βおよび／またはIL-6のより低レベルの産生を刺激する、請求項1～29のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象において重度のサイトカイン放出症候群（CRS）を誘導しない、または従来のT細胞（T_conv）、任意でCAR-T_conv細胞と比較して対象においてより軽度のCRSを誘導する、請求項1～30のいずれか1項記載の方法または使用。
それを必要とする対象においてCD4+がんを処置する方法であって、CD4標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
それを必要とする対象においてCD4+がんを処置するための、CD4標的抗原に結合するよう遺伝子改変されたDNT細胞の集団の使用。
遺伝子改変されたDNT細胞が、CD4標的キメラ抗原受容体（CAR）-DNT細胞（CAR4-DNT細胞）である、請求項32記載の方法または請求項33記載の使用。
CD4+がんが、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）、末梢T細胞リンパ腫（PTCL）、または皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）である、請求項32～34のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβ-TCR+である細胞を含むまたは該細胞からなる、請求項32～35のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、フラトリサイドを誘導しない、またはCAR4形質導入された従来のT細胞の集団と比較してより軽度のフラトリサイドを誘導する、請求項32～36のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、任意で1または複数の健常ドナー由来の、同種細胞を含むまたは該細胞からなる、請求項32～37のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象において移植片対宿主病（GvHD）を誘導しない、または従来のT細胞もしくはCAR-T_conv細胞と比較して対象においてより軽度のGvHDを誘導する、請求項31～35のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象において宿主対移植片（HvG）拒絶を回避または抑制し、任意で、遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、従来のT細胞またはCAR-T_conv細胞と比較して対象においてHvG拒絶を回避または抑制する、請求項32～39のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、CAR4 CD4+ CD8+ T細胞（CAR4-Tconv細胞）の対照集団よりも長く、任意で2週間、3週間もしくは4週間より長く、対象において持続する、および／または遺伝子改変された同種DNT細胞の集団が、さらなる免疫抑制療法を必要とせずにHvG拒絶を回避もしくは抑制する、請求項32～40のいずれか1項記載の方法または使用。
対象が、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後に免疫抑制療法を受けない、請求項32～41のいずれか1項記載の方法または使用。
対象が、遺伝子改変されたDNT細胞の集団の投与後60、30、21または14日以内に免疫抑制療法を受けない、請求項42記載の方法または使用。
がんが再発性がんであり、かつ対象がCAR-Tconv細胞の集団を用いた処置を以前に受けている、またはがんが、CD4標的抗原陰性の再発がんである、請求項32～43のいずれか1項記載の方法または使用。
がんがCD4標的抗原の不均一な発現を示す、請求項32～44のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNTが、HLA、内因性T細胞受容体、CD7、およびCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも排除するようにも遺伝子改変されていない、請求項32～45のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNTの集団により産生されるサイトカインが、CAR4-T_conv細胞により産生されるサイトカインと比較して、単球によるIL-1βおよび／またはIL-6のより低レベルの産生を刺激する、請求項32～46のいずれか1項記載の方法または使用。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、対象においてサイトカイン放出症候群（CRS）を誘導しない、またはCAR4-T_conv細胞と比較して対象においてより軽度のCRSを誘導する、請求項32～47のいずれか1項記載の方法または使用。
標的抗原に結合するよう遺伝子改変された二重陰性T（DNT）細胞。
標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列を発現するよう遺伝子改変された、請求項49記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CD4-、CD8-、CD3+、γδ-TCR+および／またはαβ-TcR+である、請求項49または50記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
遺伝子改変されたDNT細胞の同種集団が、対象において移植片対宿主病（GvHD）を誘導しない、または従来のT細胞もしくは従来のCAR-T細胞（CAR-T_conv細胞）と比較して対象においてより軽度のGvHDを誘導する、請求項49～51のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
遺伝子改変されたDNT細胞の同種集団が、対象において宿主対移植片拒絶を回避または抑制し、任意で、CAR-DNT細胞の集団が、CAR-T_conv細胞と比較して対象においてHvG拒絶を抑制する、請求項49～52のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
任意でCARをコードする核酸配列を含む、ベクター、プラスミドまたはmRNAで形質導入された、請求項49～53のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CARが細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項49～54のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CARががん細胞上に発現される標的抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、請求項49～55のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CD4、CD8、CD33、CD19、CD20、CD123、LeY、メソテリン、EGFR、ROR1、EpCam、MUC1、HER1/2、MET/HGF、ネオアンチゲン（ドライバー、非ドライバー）、MAGEファミリー、ならびにNY-ESO-1から選択される標的抗原に結合するよう遺伝子改変された、請求項56記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
標的抗原がCD4である、請求項57記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
標的抗原がCD19である、請求項57記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CAR-DNT細胞が凍結保存されている、請求項49～59のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
CAR-DNTが、HLA、内因性T細胞受容体、CD7、またはCD52をコードする遺伝子から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を減少させるようにも排除するようにも遺伝子改変されていない、請求項49～60のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団により産生されるサイトカインが、CAR-T_conv細胞により産生されるサイトカインと比較して、単球によるIL-1βおよび／またはIL-6のより低レベルの産生を刺激する、請求項49～61のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
遺伝子改変されたDNT細胞の集団が、サイトカイン放出症候群（CRS）を誘導しない、またはCAR4-T_conv細胞と比較してより軽度のCRSを誘導する、請求項49～62のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞。
請求項49～63のいずれか1項記載の遺伝子改変されたDNT細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
それを必要とする対象におけるがんの処置のための、請求項64記載の組成物の使用。