MXPA06007495A - Agente terapeutico alogenico de tumor - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con una vacuna que es basada en células tumorales alógenas y se usa para el tratamiento terapéutico de enfermedades tumorales. Se manifiesta también un método para la producción de semejante vacuna y células tumorales humanas transfectadas que se usan a manera de vacuna.

Description

AGENTE TERAPÉUTICO ALOGENICO DE TUMOR DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una vacuna basada en células tumorales alógenas para el tratamiento terapéutico de enfermedades tumorales, así como un método para la producción de semejante vacuna; además con células tumorales humanas transfectadas para el uso como vacuna. En adición a métodos de tratamiento convencionales de enfermedades cancerosas como la terapia por radiación y la quimioterapia que representa, desde los años 1950 la única opción de tratamiento para enfermedades tumorales avanzadas y altamente dispersadas, la inmunoterapia parece ser una aproximación nueva prometedora para tumores en metástasis. El objetivo de la inmunoterapia es fomentar la respuesta inmunológica natural contra la enfermedad tumoral mediante modificaciones de tecnología genética, es decir, influenciar de manera tal la "atención" del sistema inmunológico a células cancerosas y con esto la reacción defensiva que el tumor es atacado por el mismo cuerpo. En vista de que algunas enfermedades malignas, como por ejemplo el carcinoma avanzado de células renales, son relativamente sensibles a aproximaciones in unoterapéuticas, pero la terapia sistémica con citocinas como IL-2 e IFN-alfa es acompañada en parte con efectos segundarios considerables, se han desarrollado protocolos de inmunoterapia diferentes. La mayoría de los estudios clínicos proponen ahora la eliminación del tumor, seguido por una transfección ex-vivo de las células tumorales con un gen terapéutico, radiación de la población de células tumorales y reimplantación a continuación de las células tumorales ahora modificadas. Mediante esta vacunación de células tumorales puede incrementarse la respuesta antitumoral en función del gen terapéutico transfectado en diferente grado. Basado en esta aproximación, así ' como en resultados de ensayos con animales, se ha autorizado una serie de estudios clínicos de la fase I y II (Finke et al., 1997; Wittig et al., 2001). Primeros resultados con genes terapéuticos singulares transfectados produjeron, sin embargo, además de una buena tolerabilidad de la terapia sólo en pocos casos remisiones parciales o completas. En un modelo de ratón de carcinoma de colon, la transferencia del gen CD40L/CD154 pudo producir una emisión de citocinas, una erradicación del tumor y una inmunidad (Sun et al., 2000) . El inventor de la presente solicitud pudo demostrar que la transferencia de plásmidos de expresión de interleucina 7 humana (IL-7) en células tumorales produce una sensibilidad aumentada contra células efectores del sistema inmune, en particular en el caso de transferencia autóloga (Finke et al., 1997, Cáncer Gene Ther. 4: 260-268) . El inventor pudo comprobar igualmente que se pudo registrar una reacción clínicamente significativa en la mitad de los pacientes tratados después de transfección de dos genes terapéuticas (IL-7, GM-CS'F) en células tumorales autólogas (WO 02/060476) . En el documento US 5,681,562 se propone inyectar a pacientes con determinadas enfermedades de cáncer unas células que fueron transfectadas con ADN o ARN que codifican para citocinas. Se intenta estimular de esta manera el sistema inmune del paciente contra antígenos de tumores. Se describen unos ensayos en este documento en que se transfectaron fibroblastos de ratones con vectores retrovirales que codifican para IL-2. Se describe también el ensayo in Vivo según el cual se probó la efectividad del tratamiento en un modelo de carcinoma de intestino grueso murino. Los ratones, que recibieron inyecciones s.c. con fibroblastos transfectados desarrollaron un crecimiento tumoral claramente retardado en comparación con grupos de control. En ensayos in Vi tro con fibroblastos humanos transfectados pudo determinarse también un nivel de expresión de IL-.2 claramente aumentado. Además de la carencia de datos clínicos más allá del modelo de ratón, los vectores virales usados como vector de expresión, deben considerarse como poco ventajosos. Debido a la inestabilidad de la cepa atenuada inyectada no es posible excluir la posibilidad de una nueva mutación en una cepa virulenta; además, los componentes virales mismos pueden tener acción inmunológica, lo que produce la reducción de su efectividad a causa del sistema inmune del paciente. Estos riesgos selectivos se oponen de manera importante a una aplicación generalizada como vector de terapia genética. Varias publicaciones muestran que los mejores resultados terapéuticos se logran mediante una combinación de genes de citocina con el factor de crecimiento GM-CSF (Paillard, 1998, Hum. Gene The. 9: 2457-2458; Schadendorf et al., 1995, J. Mol. Med. 73: 473-477). El significado de G;-CSF en inyecciones de antígenos tumorales se mostró también en el incremento de la respuesta antitumoral clínica e inmunológica en el caso de vacunación con péptidos (Jáger et al., 1996). Aparentemente, la' activación de células dendríticas que presentan antígenos, así como la estimulación de una población de células efectoras, tienen un papel esencial. Hasta ahora no es claro, sin embargo, cuáles genes de citocinas excitan en combinación con GM-CSF en una composición inmunogénica la respuesta inmune anti-tumoral más efectiva. En ensayos con ratones resultó que una vacunación con constructos de expresión que codifican para IL-7 excita un efecto anti-tumoral (Miller et al., 1993, Blood 18: 3686-3694; Murphy et al., 1993, J. Clin. Invest. 92: 1918- 1924) . También se sabe que la incubación de CTL con IL-7 respectivamente células transfectadas con IL-7 causa regresión tumoral en ratones (Jicha et al., 1991; Hock et al., 1993) e induce la transfección con IL-7 y B7.1/CD80 CD28+CD25+ infiltrados de células T e inmunidad (Cayeux et al., 1995) . Hasta la fecha no hay éxitos' terapéuticos, ni siquiera en el modelo de ratón. Además, se han observado en ensayos para estimular respuestas inmunes mediante terapia genética con ADN plasmídica o secuencias de oligonucleótidos que determinadas secuencias de ácido nucleico que comprenden motivos CpG (CpG = citosin-guanosin-dinucleótido no metilado) , ' pueden mostrar una actividad de estimulación inmune enorme (Schmidt-Wolf et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 185-189). Secuencias de ácido nucleico con estimulación inmune (ISS) se han empleado por esta razón muy tempranamente como complementos en protocolos de inmunización basados en ADN contra agentes infecciosos (Sato et al., 1996, Science 273: 352-354). En experimentos con ratones resultó que la administración de secuencias de ADN ricas en CpG causa una fuerte activación de células B y excita la expresión de determinadas citocinas, por ejemplo, de IL-6 y GM-CSF. Igualmente pudo mostrarse en el modelo de ratón que una inmunización con oligodesoxirribonucleótidos (ODN) junto con una proteína de fusión, tres días antes de la inoculación de tumor, pudo inhibir un crecimiento tumoral en el ratón (Liu et al., 1998) . La tecnología del uso y la producción de ISS con estimulación inmune, conteniendo CpG, se explican ampliamente en el documento WO 98/18810. Es conocido del documento WO 00/04918 transfectar células tumorales con genes que codifican, por ejemplo, para interferón gama y GM-CSF. Como vectores de expresión se usan plásmidos. Este documento señala un concepto de tratar las enfermedades tumorales mediante inmunoterapia. No se muestran datos claros in Vivo o in Vitro o resultados clínicos que comprueban la actividad de las vacunas reivindicadas. Se hace notar que estos vectores basados en plásmidos no son apropiados sin reservas para la aplicación en la terapia genética humana, ya que además de las secuencias terapéuticas portan unidades funcionales genéticas necesarias para su replicación. Además tienen genes de resistencia a antibióticos que es indispensable para su selección. Es decir, se presenta una expresión permanente de proteínas de mamífero y de bacterias terapéuticamente no deseables. No obstante investigaciones de muchos años y aproximaciones prometedoras, hasta ahora no se ha logrado desarrollar una terapia efectiva basada en la inmunología contra enfermedades tumorales mediante la aplicación de sustancias inmunogénicas. El objetivo de la invención es ofrecer una vacuna como fármaco para el tratamiento de enfermedades asociadas con citocinas, como por ejemplo enfermedades de cáncer, que pueden aplicarse especifica y eficientemente y que produce en particular una inducción de respuestas inmunes específicamente tumorales. Además debe ofrecerse un método correspondiente para la producción de semejante vacuna. El objetivo se logra mediante las características de las reivindicaciones independientes. En el sentido de la presente' invención, significan: alógeno: de un individuo, genéticamente diferente, de la misma especia, en contraste con- "autólogo" (células del propio cuerpo) APC: Células que presentan antígenos (por sus siglas en inglés: Antigen Presenting Cells) B7.1/CD80: familia de diferenciación 80 (por sus siglas en inglés: Cluster of Differentiation 80) CD40L/CD154 familia de diferenciación 40 ligando DC: células dendríticas dSLIM: oligodesoxirribonucleótidos de lazo estable doble inmunomodulatorios GM-CSF: factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos IL-7: interleucina 7 ISS secuencias de ácido nucleico inmunoestimulatorias MIDGE: Minimalistic Immunologically Defined Gene Expression Vector (vector de expresión genética minimalista definida inmunológicamente; MIDGE® es una marca registrada de Mologen AG) ODN: oligodesoxirribonucleótido TAA: antígeno de asociación tumoral A continuación debe entenderse una serie de conceptos generales como sigue: Células transfectadas, en el sentido de la invención, con células tumorales alógenos humanos que fueron tratados ex Vivo con los vectores de expresión codificantes inventivos y que expresan en consecuencia de este tratamiento las secuencias de factores de citocina y coestimulantes codificadas y que se emplean como agente inmunoterapéutico .en enfermedades tumorales. En el contexto de la presente invención, el concepto factor coestimulante y/o citocina se relaciona tanto a factores coestimulantes y/o citocinas naturales como también todas las modificaciones, mutantes o derivados de los factores coestimulantes y/o citocinas, factores coestimulantes y/o citocinas producidos mediante tecnología recombinante que contienen modificaciones de aminoácidos como inversiones, deleciones, inserciones, adiciones, etc. siempre que al menos una parte de las funciones esenciales de los factores cqestimulantes y/o citocinas de tipo silvestre estén presentes. Semejantes factores coestimulantes y/o citocinas pueden comprender también aminoácidos inusuales y/o modificaciones como alquilación, oxidación, tiol-modificación, desnaturalización y oligomerización y semejantes. En el contexto con la presente invención, los factores coestimulantes y/o las citocinas pueden ser en particular proteínas, péptidos y/o péptidos fusionados que contienen - además de otras proteínas, péptidos o sus partes - los factores coestimulantes y/o las citocinas en forma completa o parcial. En otra modalidad de la presente invención, los factores coestimulantes y/o las citocinas son formas acortadas de los factores coestimulantes y/o citocinas naturales.

Todos los factores coestimulantes referidos en lo precedente, que son apropiados para modular la reacción del sistema inmune, son sustancias inmunogénicas en el sentido de la presente invención. Una vacuna inventiva representa, en el sentido de la invención presente, por lo tanto una composición inmunogénica, ya que contiene una combinación de sustancias inmunogénicas. Células tumorales se diferencian de .células normales, entre otras cosas, por una expresión modificada de proteínas de superficies celulares. Sobre todo la expresión de antígenos asociados con tumores (TAA) permite - en teoría - la detección y destrucción de estas células por el sistema inmune. Frecuentemente, sin embargo, el sistema inmune de los pacientes es suprimido, de manera que no logra detectar las células mutadas. Este problema se resuelve mediante el ofrecimiento de una vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales definidas, siendo que esta vacuna consiste de las células tumorales de otro paciente (células alógenas) y estas células tumorales fueron transfectadas previamente ex Vivo con constructos de expresión que codifican para interleucina 7, (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos GM-CSF (granulocyte makrophage-colony-stimulating factor) y los factores coestimulantes CD40L/CD154 y B7.1/CD80. Las células tumorales usadas pueden ser aquellas de pacientes con el mismo cuadro clínico como el paciente por tratar, o también de pacientes con un cuadro clínico diferente al del paciente por tratar. La combinación de los componentes (sustancias inmunógenas) de las vacunas debe garantizar que se produzcan todas las tres etapas de la cascada de señales que son necesarias en principio para inducir una respuesta inmune específica. Las tres etapas comprenden la presentación de antígeno, la coestimulación y la presencia de un ambiente local apropiado. La expresión de GM-CSF y CD40L/CD154 tiene la función de inducir el reclutamiento local y la activación de las células presentadoras de antígeno (APC) así como células dendríticas (DC) . En consecuencia se produce una presentación incrementada de TAA. La expresión de B7.1/CD80 produce un - incremento de la actividad coestimulante. Esto refuerza el carácter antigénico de TAA y se incrementa la cantidad de los linfocitos T activados contra TAA. La expresión de IL-7 induce adicionalmente la proliferación de los linfocitos T específicos del tumor. La vacuna inventiva produce, por lo tanto, en el lugar de aplicación una concentración alta de citocinas solubles que favorecen la proliferación y de moléculas coestimulantes junto con TAA en la superficie de las células tumorales, lo que induce la activación y proliferación de células T específicas del tumor. También se "atraen" APC y DC al sitio de la aplicación. Los constructos de expresión están presentes en forma de plásmidos, o preferentemente también de constructos de expresión genética minimalistas, definidos inmunológicamente. Estos son un cásete de expresión cerrado covalentemente lineal de cadena doble, que consiste sólo de un promotor CMV, un intrón, la secuencia' genética codificante y una secuencia de poliadenilación. El cásete de expresión está cerrado en ambos extremos de la cadena doble en forma covalente mediante un lazo corto de radicales de nucleosida de una sola cadena. Estos constructos de ADN cerrados en forma covalente, minimalistas se designan de aquí en adelante como vectores MIDGE (MIDGE: Minimalistic Immunologically Defined Gene Expression Vector); Cf. EO 0 941 318 Bl. Los constructos MIDGE tienen la ventaja de que es posible prescindir en ellos de estructuras que no son esenciales para la actividad terapéutica, lo que últimamente evita las desventajas de los vehículos genéticos convencionales. La preparación de un ambiente local que permite la inducción de una respuesta inmune específica es garantizado mediante el uso de un complemento en forma de secuencias de ácido nucleico inmunoestimulatorias (ISS) .

Con esta finalidad se está previendo inventivamente que la vacuna comprende adicionalmente olidodesoxirribo?ucleótidos con inmunomodulación como complemento. Se prefiere en esto un olidodesoxirribonucleótidos con inmunomodulación que a) comprende una secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4, siendo que N^2 es un elemento seleccionado del grupo comprendiendo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento seleccionado del grupo comprendiendo CT o TT, así como C desoxicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitiminidina. b) comprende una cadena circular de ácido desoxirribonucléico con una secuencia de bases antiparalela, parcialmente complementaria y que tiene forma de halterios. Los motivos CpG de los ISS (véase al respecto Fig. 2a) producen un incremento de la actividad de células NK y macrófagos, así como una estimulación fuerte de la respuesta inmune THl celular. Actúan, por lo tanto, como moduladores inmunes y permiten y refuerzan la respuesta inmune específica del tumor. Se prefiere el uso de ISS cerradas en forma covalente con una longitud de 30 bp, tal como se describen en el documento WO 01/07055. Los constructos son denominados, de aquí en adelante, como dSLIM (double Stem-Loop Immuno odulating Oligodeoxyribonucleotides) .

La secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4 está posicionada en la región de una cadena del oligodesoxirribonucleótido y comprende 40 a 200 nucleótidos (véase Fig. 2b) . Objeto de la invención es también un método para la producción de una vacuna descrito en lo precedente para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales, siendo que las células tumorales de un donante genéticamente no idéntico (extraño) son transfectadas de la misma especie (alógeno) ex Vivo con moléculas de ácido nucleico que codifica para a) interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) , CD40L/CD154 y B7.1/CD80, o b) interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y CD40L/CD154 y a continuación se trasladan a una composición farmacéutica aplicable. Los oligodesoxirribonucleótidos con modulación inmune ya descrito en lo precedente comprenden una cadena circular de ácido desoxirribonucleico con una secuencia de bases antiparalela, parcialmente complementaria entre sí y tienen forma de halterios. Son también componente del método como complemento. Inventivamente se está previendo, por lo tanto, que una célula tumoral alógena comprende al menos tres, preferentemente cuatro moléculas de ácido nucleido que codifican juntamente para los factores coestimulatorios B7.1/CD80 y CD40L/CD154 y las citocinas interleucina 7 y GM-CSF. Objeto de la invención son, por lo tanto, también células tumorales humanos alógenos, transfectadas correspondientemente, que fueron transfectadas ex Vivo con moléculas de ácido nucleico que codifica para a) interleucina 7 (IL-7) factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-SCF) , CD40L/154 y B7.1/CD80, o b) interleucina 7 (IL-7) factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-SCF) y CD40L/154 y que comprenden los constructos de expresión correspondientes. Las células tumorales comprenden constructos de expresión en forma de un plásmido o también de un cásete de expresión cerrado en forma covalente que consiste sólo de un promotor CMV, un intrón, la secuencia genética codificante y una secuencia de poliadenilación, que está cerrada en forma covalente en ambos extremos de la cadena doble mediante un lazo corto de radicales de nucleótidos de una cadena. Se trata preferentemente de una célula tumoral alógena de una línea celular de carcinoma de células renales.

Igual como en el caso de la vacuna misma, también en el método inventivo está previsto que las moléculas de ácido nucleico están presentes en uno o varios constructos de expresión. Puede ser, por lo tanto un constructo de expresión de ADN para la expresión múltiple de genes, - consistiendo de regiones de cadena doble que contienen un cásete de expresión lineal que tienen al menos una secuencia promotora y una secuencia codificante, - y siendo que estas regiones de cadena doble están enlazados entre sí mediante cadenas sencillas de ADN o cadenas dobles de ADN no codificante, - y los casetes de expresión en los extremos, en que no están unidos entre sí con otros casetes de expresión mediante cadenas sencillas de ADN o cadenas dobles de ADN no codificantes, están protegidos contra descomposición por exonucleasa. Semejante constructo de expresión de ADN para expresión genética múltiple ya está descrito en el documento PCT/DE03/02478. Por lo tanto es posible disponer varios ácidos nucleicos, que son objeto de la vacuna inventiva, en un sólo constructo de expresión. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico es un ADN, particularmente un ADNc o un ADN genómico . Desde luego puede resultar ventajoso también que la molécula de ácido nucleico sea un ARN. Las células -tumorales alógenas proceden de pacientes con carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar de células pequeñas o no pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovario y carcinoma de células renales, así como melanoma maligno. En el marco de la presente invención se usa en particular una línea de células de carcinoma de células renales que es particularmente apropiada para la producción de la vacuna inventiva. Una línea de células de carcinoma de células renales preferida fue depositada en la DSMZ (colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, por sus siglas en alemán) como cultivo viable bajo el número DSM ACC 2635. En las células de esta línea de células de carcinoma de células renales se insertan mediante métodos de transfección esencialmente conocidos de tipo biológico, químico y/o físico los constructos de expresión de ADN que producen en las células la expresión de los genes deseables. A las células alógenas así transfectadas se adiciona un complemento, preferentemente ISS, particularmente preferido dSLIM (véase lo precedente) . Después de exposición a radiación radioactiva de las células tumorales alógenas con rayos gama se administra la vacuna inventiva a pacientes con una enfermedad tumoral . El cuerpo del que se retiran las células no es - a diferencia de la terapia con células autólogas - no el cuerpo mismo que debe ser tratado con el fármaco. El uso de células alógenas tiene, por un lado, la ventaja de la caracterización única y procreación confiable de las células, por otro se considera el estímulo alógeno como efecto complementario adicionalmente favorable. Las células por tratar pueden proceder de un solo cuerpo (extraño) o reunirse de varios cuerpos con el mismo cuadro clínico. La invención se relaciona, por lo tanto, con la combinación de tres o cuatro ácidos nucleicos expresables que codifican para dos citocinas y uno o dos factores coestimulantes .' Como inmunomodulador adicional puede emplearse ISS, preferentemente dSLIM. En ensayos con cultivos de células en líneas de células humanas pudieron comprobarse después de la transfección células tres veces respectivamente cuatro veces positivas (véase Fig. 1) . "tres veces" respectivamente "cuatro veces" positivo quiere decir en este contexto que un porcentaje alto de las células fue transfectado simultáneamente con todos los tres o cuatro genes que codifican- para GM-CSF, IL-7, CD40L/CD154 y B7.1/CD80 y que estos tres o cuatro genes fueron expresados después por estas células. En la línea de células de carcinoma de colon pudieron detectarse 14.4% de todas las células como células cuatro veces positivas mediante análisis FACS (seleccionador de células activado por fluorescencia, por sus siglas en inglés).' Se pudo determinar además que independientemente del gen, 20.3% de todas las células estaban transfectadas con un gen después de la electroporación; con tres diferentes genes estaban aún 19.9% transfectadas exitosamente. Se determinó que la proporción porcentual de las células de carcinoma de colon exitosamente transfectadas después de transfección cuádruple con constructos de expresión que codifican para CD40/L/CD154, GM-CSF, B7.1/CD80 e IL-7 se ubica en 14.4% de las células. Es decir, 14.4% de las células estaban transfectadas con cuatro diferentes genes y capaces de expresarlos exitosamente. En total, 69.4% de todas las células estaban transfectadas con uno o varios genes. La transfección con varios genes tiene la ventaja que la citosina y los factores coestimulantes así expresados se expresan en proximidad espacial mayor en los órganos de efector del sistema inmune. Esta proximidad espacial es importante, ya que las señales coestimulantes proporcionan un refuerzo de la inoculación efectivo sólo en relación con antígenos. Para la transfección pueden usarse los métodos biológicos, químicos y/o físicos esencialmente conocidos, por ejemplo transfección mediante transferencia balística (EP 0 686 697), transfección por policationes, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, fusión de protoplastos, fusión de liposomas, sistemas de transfección virales, lipofección y/o electroporación in Vivo y/o in Vitro. En una modalidad preferida de la invención, la transfección se realiza mediante electroporación . Otros métodos ventajosos son los métodos de transfección biológicos como la transferencia de genes mediada por receptores. En esta se unen los constructos de expresión de ADN que codifican para al menos uno, preferentemente dos factores coestimulantes y dos citocinas, en forma covalente con un oligopéptido que es preferentemente la secuencia de localización de núcleo (Nuclear Localization Signal = NLS) del virus de Simian SV-40. Mediante el uso de otros péptidos, en parte producidos sintéticamente, es posible incrementar la eficiencia de transfección aún más. Estos "métodos son particularmente apropiados para la transferencia genética in Vivo específica de células después de aplicación intravenosa. La vacuna inventiva producida según el método inventivo de células tumorales alógenas modificadas muestra actividades sorprendentes. Ventajosamente es posible eliminar simultáneamente deficiencias en el sistema inmune de pacientes tumorales y reforzar la respuesta inmune intrínsicamente presente a antígenos específicos del tumor. La vacuna puede aplicarse en pacientes, cuyo tumor fue eliminado, como terapia complementaria para el mejoramiento y la recuperación de la respuesta inmune contra células tumorales residuales o para reducir la masa tumoral remanente. Se abre una perspectiva para pacientes con tumor primario tratado quirúrgicamente sin metástasis aparentes que podrían verse favorecidos por una terapia aditiva específica del tumor que reduce la tasa recidiva. Otras modalidades ventajosas resultan de las reivindicaciones dependientes y de la descripción. La invención, incluyendo la actividad sorprendente del fármaco inventivo (como inyectable para la terapia de carcinoma) ,. así como el método inventivo, se describe a continuación con más detalle mediante las figuras y los ejemplos de realización; en esto muestran: Fig. 1 Intensidades FACS de células de carcinoma de colon humano cuatro veces transfectadas. La transfección se realizó mediante electroporación con vectores de expresión que codifican para CD40L/CD154, CM-C?F, B7.1/CD80 e IL-7; Fig. 2a y b el esquema de los inmunomoduladores (dSLIM) : estructura en forma de halterios con respectivamente tres motivos CG representados esquemáticamente en las estructuras de horquilla de los lazos; en estos significan I: lazo y II: tronco. Para la comprobación de los productos genéticos se usaron anticuerpos en que se acoplan cuatro colorantes fluorescentes distinguibles. En la Fig. 1 designados como CD80-FITC hGMCSF-PE IL7-PerCP CD154-APC. El seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS) detecta estos colores en cuatro diferentes canales. En la abscisa se designan con FL1-H, FL2-H, FL3-H Y FL4-H. Los índices en la abscisa indican la intensidad relativa de fluorescencia. En la ordenada se indican los conteos que se corresponden aproximadamente con la cantidad de las células medidas. La evaluación se hace mediante el así llamado "gating", es decir, se cuentan sólo células que pasan por una puerta de energía determinada. En la siguiente tabla 1 se representa la proporción porcentual de las células de carcinoma de células renales alógenas transfectadas exitosamente después de transfección triple con constructos de expresión que codifican para CD40L/CD154, GM-CSF e IL-7 respectivamente transfección cuádruple con constructos de expresión que codifican para CD40L/CD154, GM-CSF, B7.1/CD80 e IL-7. Tab. 1: La transfección de los factores coestimulantes B7.1/CD80 respectivamente CD40L/CD154 se comprobó mediante teñido de las células con anticuerpos marcados con fluorescencia; el grado de transfección con citocinas IL-7 respectivamente GM-CSF se comprobó mediante la concentración de las citocinas en el medio del cultivo celular. La vacuna inventiva, consistiendo- de células alógenas, transfectadas ex Vivo, fue administrada a pacientes con tumores sólidos metastásicos a un intervalo de 7 a 10 días en forma de 4 ciclos de inyecciones consistiendo en cada caso de 2 inyecciones. Las células fueron previamente transfectadas con vectores de expresión que codifican para IL-7, GM-SCF, CD401/CD154 y/o B7.1/CD80 y se mezclaron a continuación con secuencias inmunoestimulatorias (ISS) . Las primeras dos inyecciones se realizaron el día 1 en los puntos típicos de inyección en la piel (intradermal) lateralmente en el brazo izquierdo y derecho, el día 7 (hasta 10) en los puntos típicos de inyección intradermal en la cara anterior del muslo izquierdo y derecho, el día 14 (hasta 20) debajo de la piel (subcutáneo) aproximadamente 30 mm a la izquierda y derecha del ombligo y el día 21 (hasta 30) nuevamente en los brazos, pero debajo de la piel (subcutáneo) . Al iniciar el tratamiento, todos los, pacientes estaban en una etapa avanzada de la enfermedad. Para la evaluación del éxito clínico se aplicarán las siguientes determinaciones de la Organización Mundial de la Salud (1979) : Como reacción parcial (partial response, PR) se designa el retroceso de los focos tumorales detectables por más de 50% en las últimas cuatro semanas así como la supresión de nuevos focos tumorales. Por estado estable de la enfermedad (stable disease, SD) se debe entender que el estado es invariable. Una respuesta mixta (mixed response, MR) es, por ejemplo, el progreso de la metastatización y un retroceso de las metástasis en otro lugar. Una respuesta completa (complete response, CR) designa el retroceso total de los focos tumorales. A continuación se explica la invención mediante ejemplos, sin que la invención quedara limitada, sin embargo, a estos ejemplos. Vacunación El paciente, masculino, enfermo de un carcinoma pulmonar de células pequeñas, recibió con intervalo de 7 días cuatro inyecciones secuenciadas con la vacuna inventiva. La línea de células del carcinoma de células renales recibió el tratamiento previamente descrito. Un control de exposición se realizó 24 h después de la transfección. El control de la expresión de los factores coestimulantes B7.1/CD80 respectivamente CD40L/CD154 se realizó mediante teñido de las células con anticuerpos marcados por fluorescencia seguida por medición de citometría de paso. La determinación de la expresión de las citocinas IL-7 y GM-CSF se realizó mediante medición de la concentración en el medio del cultivo celular con la ayuda de ELISA. Exitosamente transfectado significa: células positivas vivas. Los datos de la transíección se representan en la tabla 1. La proporción porcentual de células exitosamente transfectadas con B7.1/CD80 era de entre 66.3 y 87.6%. La proporción de las células transfectadas con CD40L/CD154 entre 21.6 y 29.5%. La concentración de .la citocina IL-7 era de IxlO6 células entre 14.9 y 38.2 ng. La concentración de GM-CSF era de lxlO6 células entre 370.6 y 1,567.2 ng. En el caso de la transfección para la vacunación triple con constructos de expresión que codifican para CD40L/CD154, GM-CSF e IL-7, la proporción porcentual de células transfectadas exitosamente con CD40L/CD154 se ubicaba en 60.8%. La concentración de la citocina IL-7 era de IxlO6 células 21.7 ng. La concentración de GM-CSF era de lxlO6 células 698.9 ng. Tratamiento de enfermedades tumorales metastásicas Selección de los pacientes: Tenían derecho a ser admitidos pacientes con carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar de células pequeñas y no células pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovario y carcinoma de células renales, así como melanoma maligno, con edades entre 18 y 70 años, y un índice de Karnofs y de 70-100. Los criterios de rechazo eran: tratamiento previo con citocinas o quimioterapia con menos de 28 días de antigüedad, valores de creatina superiores a 265 micromol/1, valores de bilirubina superiores a 51 micromol/1, insuficiencia cardiaca no compensada, arritmia ventricular, enfermedades psiquiátricas severas, hepatitis A, B o C activa, infección con VIH.

Tratamiento: Además de la anamnesis, se determinaron los siguientes parámetros antes del inicio del tratamiento: examen físico, ' hematología (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y número de plaquetas), valores químicos de sangre y análisis de orina. Se tomó sangre para la determinación del estado inmunológico. Se realizaron ensayos de piel DHT (Delayed type hypersensitivity hipersensibilidad de tipo retrasado) con la prueba múltiple de Merieux (Leimen, Alemania) . Se realizaron tomas de rayos X de tórax así como tomografías computarizadas de tórax y abdomen. Los pacientes recibieron cuatro inyecciones subcutáneas con al menos 8xl06 - 1.4xl07 células con células tumorales previamente tratadas ex Vivo . Análisis inmunológicos comprensivos, análisis hematológicos y análisis clínicos superficiales (exploración física, análisis de ultrasonido y exploración del abdomen, en caso necesario) se repitieron los días 14, 28 y 56. Un análisis clínico e inmunológico completo, comparable al análisis de selección realizado inicialmente, se hizo el día 84. Constructos de expresión genética minimalista definidos inmunológicamente (MIDGE) Unos vectores de expresión de ADN minimalistas cerradas en forma covalente fueron usados para la transfección de las células tumorales. Los vectores de expresión sirvieron para la expresión de la interleucina 7 (IL-7)' humana, del factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) , - de los factores coestimulantes B7.1/CD80 y CD40L/CD154. Los vectores MIDGE fueron sintetizados según el protocolo SOP y en un laboratorio de clase B seguido por control de calidad. Las secuencias que codifican para IL-7 (NCBI Acc. Nr.:J04156), GM-CSF (NCBI Acc.Nr. :'M11220) , B7.1/CD80 (NCBI Acc.Nr. :AF177937) and CD40L/CD154 (NCBI Acc.Nr .: S49008, tomadas del banco de datos (www.ncbi.nlm.nih.gov) del National Center for Biotechnology Information) se insertaron en plásmidos pMOK y sirvieron de constructos básicos para la producción de los vectores MIDGE. El plásmido pMOK tiene, además de los "promotores inmediatos tempranos" fuertes del virus CMV, un intrón y una secuencia de poliadenilación del virus SV40 (MOLOGEN, Berlin) . El plásmido pMOK que codifica para IL-7 - fue digerido completamente con la enzima restrictiva Eco311 durante la noche a 37 °C. Mediante la digestión restrictiva se produjeron dos fragmentos de ADN. Uno consistía del .gen de resistencia a kanamicina, así como de otras secuencias necesarias para la propagación del plásmido en bacterias. El otro fragmento consistía de las secuencias que deberían convertirse en componentes del ADN de MIDGE: promotor de CMV reforzado, intrón quimera, la secuencia génica para IL-7 y la secuencia de poliadenilación de SV-40. Mediante la enzima T4-ADN 'ligasa se ligan los olig?desoxirribo-nucleótidos en forma de horquilla fosforilizados (TIN-MolBiol, Berlin, ODN 1 = Seq.ID 5 de WO 03/031469 A2 (Mologen et al.) sin base X modificada) y ODN 2 = Seq. ID 6 de WO 03/031469 A2 (Mologen et al.)) en presencia de la enzima restrictiva Eco311 durante la noche a 37 °C con el fragmento de ADN que forma el ADN de MIDGE. En este sendito se remite a la representación mostrada en el documento WO 03/031469 A2 (Mologen et al.) y las secuencias de los oligonucleótidos (ODN) allí. La reacción se detuvo mediante calentamiento a 70 °C. La mezcla resultante de ácidos nucleicos fue tratada con la enzima T7-ADN-polimerasa. El ADN de MIDGE fue purificado mediante cromatografía de intercambio de aniones y se precipitó con isopropanol (Cf. EP 0 941 318 Bl) . La producción de los vectores que codifican para GM-CSF, B7.1/CD80 y CD40L/CD154 se llevó a cabo de manera correspondiente . Producción del MIDGE acoplado a NLS Para la producción de NLS-MIDGE se remite a la representación mostrada en el documento WO 03/031469 A2 (Mologen et al.) y las secuencias de los oligonucleótidos (ODN) allí. El péptido NLS (Seq. ID 4 del ..documento WO 03/031469 A2 (Mologen et al.)) se acopla primeramente a los ODN. Para esto se usó el ODN 1, provisto en el lazo de horquilla con un desoxi uracil (XT) modificado en su grupo amino, así como el ODN 2 no modificado del documento WO 03/031469 A2 (Mologen et al.): Primeramente se activa el oligonucleótido modificado por un grupo amino ODN 1 (0.1 M) mediante sulfo-KMUS (5 mM) en PBS a temperatura ambiente. Después de 120 minutos se detuvo la reacción mediante 50 mM de tris- (hidroximetil) -aminometano y se obtuvo el ODN 1 activado después de precipitación en etanol (300 mM NaOAc-, pH 5.2, 5.5 mM MgCl2, 70% etanol), centrifugación y lavado una vez con etanol de 70%. El ODN 1 (0.1 mM) así obtenido se disolvió en PBS y reaccionó con el péptido de NLS (0.2 mM) durante una hora a temperatura ambiente. La reacción se verificó mediante electrofóresis en gel (3%) y teñido con bromuro de etidio. El NLS generado acoplado a ODN 1 se purificó mediante HPLC y se uso junto con el TDN 2 para la síntesis de los constructos de MIDGE-NLS tal como se describió en lo precedente. Oligodesoxinucleótidos inmunomodulatorios de cadena doble (d-SLIM) Oligodesoxinucleótidos inmunomodulatorios de cadena doble son moléculas con secuencias CG. Para esto se cierran en forma covalente unos oligodesoxinucleótidos lineales (ODN) mediante lazo de nucleótido, de manera que queden protegidos contra degradación por exonucleasas. En esto se producen unas moléculas en forma de halterios, que se llaman dSLIM, "double stem-loop immunomodulator" (inmunomodulador doble de lazo estable, véase Fig. 2) . El efecto de modulación inmune se basa en una activación no específica del sistema inmune por las secuencias CG no metilados que ligan con receptores semejantes a Toll. Cada lazo del d?LIM contiene tres motivos CG no metilados. Inmunomoduladores de cadena doble d-SLIM del tipo ISS30 fueron producidos según (SOP) seguido por control de calidad final en el laboratorio clase B. Para esto se ligan unos oligodesoxirribonucleótidos (ODN) de cadena simple, en forma de horquilla, fosforilados en el extremo 5' con T4-ADN-ligasa. Después de digestión de los eductos restantes con T7-polimerasa y purificación por cromatografía, se concentraron los ODN mediante precipitación en etanol y acetato de sodio-magnesio y disueltos en PBS. El método detallado se representa en el documento WO 01/07055. La Fig. 2b muestra semejante d-SLIM. Caracterización de la línea de células tumorales alógenas La línea de células usada procede de un carcinoma de célula renal primario de una paciente femenina. De estas células primarias se preparó una línea de células y se depositó en la DSMZ (colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, por sus siglas en alemán) como cultivo viable bajo el número DSM ACC 2635. Después de una operación de selección se determinó de unos cultivos primarios de la paciente de tumor aquellas células que sirvieron como materia prima para la producción del banco celular master. La población celular tuvo que caracterizarse por la expresión estable de TAA, por una tasa de división constante y buena, así como un comportamiento de crecimiento tan homogéneo como fuera posible. También debía estar garantizada la ausencia de contaminación viral o bacteriana. La línea de células de carcinoma de células renales fue verificada como negativa con relación a virus IH, virus de hepatitis B y C por un laboratorio certificado. También se realizó una caracterización con relación al tipo HLA, la expresión de TAA y la liberación de citocinas. Con_ esta finalidad se establecieron diferentes técnicas como ELISA para le determinación de citocinas, por ejemplo, de TNF-alfa, IL-6, GM-CSF e IL-7. Además se desarrollaron mediciones de FACS intracelulares y ensayos de RT-PCR de tiempo real. Después de la transfección, las células se investigaron con relación a antígenos de superficie, moléculas de transducción de señal y genes reporteros. La línea de células se caracteriza por los siguientes valores inmunológicos de marcadores de superficie específicos: EpCAM: positivo Her-2/nuevo negativo citoceratina 7+8 positivo HLA-A1 : positivo HLA-A2 : positivo fibroblastos: negativo Determinación de antígenos específicos del tumor: PRAME: positivo SCP-1: positivo MAGE-4 negativo fertilina beta: negativo MAGE-3 negativo RAGE-1: positivo MAGE-1 negativo G250: positivo Electroporación Para la transferencia génica ex Vivo al núcleo celular de las células tumorales y de las células de control se usó preferentemente el método de electroporación. Las células tumorales se desprenden con una solución de tripsina/EDTA del recipiente -de cultivo y se ajustan a una densidad de 1-I.5xl07 células por 600 µl en medio (sin FCS) o PBS. Esta suspensión celular de 600 µl se mezcla en cada caso con 5-10 µg de vector de expresión, se traslada a cubetas enfriadas de electroporación (Eurogentec) y se somete a electroporación a la corriente de 300V y la capacidad de 1050 microfaradios en un aparato de electroporación Easyject (EquiBio) . A continuación se trasladan las células a un medio fresco (5-20ml) y se incuban en una estufa de cultivo de células (5% C02, 37 °C, humedad saturada) durante 24 h. Siguió la medición de las moléculas de superficie (CD40L/CD154 y B7.1/CD80) y de las citocinas (GM-CSF e IL-7) mediante citometría de paso de cuatro colores. También se llevó a cabo un control del número de células y de su viabilidad. Inmediatamente después de la transferencia génica se cubrieron las células tumorales con 10 ml de medio de suspensión celular precalentado y se trasladaron mediante pipeteado cuidadoso a probetas de centrífuga de 15 ml. Después de la sedimentación de las células a 300xg y 4°C durante 5 mih se disolvieron en medio. Nuevamente se retuvieron alícuotas para ensayos de esterilidad, ensayos de recuperación y viabilidad celular, análisis de FACS y para determinar la- expresión de citocina. La eficiencia de transfección fue determinada tal como se ha descrito /Foa et al., 1994, Nat. Im un. 13: 65-75). La suspensión de células tumorales transfectadas se secó de nuevo, se absorbió en 1.5 ml de medio de congelación (80% FCS, 10% DMSO, 10% medio de suspensión) y se almacenó en porciones de células de 8xl06 a 1.4xl07 en probetas de congelación selladas de 2 ml. Las probetas se almacenaron a -80°C a 1°C en nitrógeno líquido. Acabado de la vacuna inventiva Después e descongelar cuidadosamente la probeta de congelación se determinó nuevamente la cantidad de células y se retuvieron alícuotas para '- pruebas de esterilidad. Después de un nuevo lavado de las células se resuspendió la masa de células obtenida en Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (DPBS, Camprex Kat . No. 17-512F) . Para cada preparación se adicionó a la suspensión 500 microgramos del complemento dSLIM. La vacuna completa se trasladó a un recipiente de reacción estéril libre de endotoxinas. Se absorbieron mediante- cánulas respectivamente 750 microlitros de esta preparación en jeringas . Antes de la aplicación se realizó cinco veces una radiación de las jeringas con rayos gama, lo que correspondió a una dosis total de 150 Gray. Preparación de linfocitos Monocitos de sangre periféricos (PBMC) se obtuvieron de sangre periférica heparinizada mediante Lymphoprep (GIBCO, Karisruhe) mediante centrifugación por densidad. Las células se lavaron dos veces con PBS y se liofilizaron en nitrógeno líquido en presencia de más de 20% FCS para ELISPOT y ensayo citotóxico. Análisis estadístico Se usó el ensayo de Wilcoxon adaptado por pares y o pares para el análisis de datos estadísticamente significativos. Se consideró un valor p < 0.05 como significativo.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales conteniendo células tumorales de un donador genéticamente no idéntico (extraño) de la misma especie (alógeno) , siendo que estas células tumorales fueron transfectadas previamente ex Vivo con moléculas de ácido nucleido que codifica para interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS), CD40L/CD154 y B7.1/CD80.

2. Vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales conteniendo células tumorales de un donador genéticamente no idéntico (extraño) de la misma especie (alógeno) , siendo que estas células tumorales fueron transfectadas previamente ex Vivo con moléculas de ácido nucleido que codifica para interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS) y CD40L/CD154.-

3. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque las moléculas de ácido nucleico codificantes están presentes en uno o varios constructos de expresión.

4. Vacuna según la reivindicación 3, caracterizada porque el constructo de expresión es a) un plásmido o b) un cásete de expresión cerrado en forma covalente, lineal .de cadena doble, que consiste sólo de un promotor de CMV, un intrón, la secuencia génica codificante y una secuencia de poliadenilación, y que está cerrado en forma covalente en ambos extremos de la cadena doble por un lazo corto de radicales de nucleótidos de cadena sencilla.

5. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque esta comprende adicionalmente como complemento unos oligodesoxirribo-nucleótidos inmunomodulantes.

6. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada porque el oligodesoxirribonucleótido inmunomodulante a) es una secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4, siendo que N1N2 es un elemento seleccionado del grupo comprendiendo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento seleccionado del grupo comprendiendo CT o TT, así como C desoxicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina, b) y comprende una cadena circular de ácido desoxirribonucleico con una secuencia de bases antiparalela, parcialmente complementaria entre sí y está formada en forma de halterios.

7. Vacuna según la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4 está posicionada en la región de una cadena del oligodesóxirribonucleótido y comprende 40 a 200 nucleótidos.

8. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque ésta comprende un vehículo farmacéuticamente compatible.

9. Vacuna según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque las células tumorales alógenas están 'seleccionadas de carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar de células pequeñas o no de células pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovario y carcinoma de células renales, así como melanoma maligno.

10. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque las células tumorales provienen de la línea de células de carcinoma de células renales que está depositada en la DSMZ con el número DSM ACC 2635.

11. Método para la producción de una vacuna según una de las reivindicaciones 1 a 10 para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales, siendo que las células tumorales de un donador no genéticamentie idéntico (extraño) de la misma especia (alógena) son transfectadas previamente ex Vivo con moléculas de ácido nucleido que codifica a) para interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS) , CD40L/CD154 y B7.1/CD80 o b) para interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS) y CD40L/CD154 y se traslada a continuación a una. composición farmacéutica aplicable.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque se emplean adicionalmente oligo-desoxirribonucleótidos inmunomodulantes como complemento.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque el oligodesoxirribonucleótido inmunomodulante comprende una cadena circular de ácido desoxirribonucleico con una secuencia de bases antiparalela, parcialmente complementaria entre sí, y tiene forma de halterios.

14. Método según la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque el oligodesoxirribonucleótido inmunomodulante comprende una secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4, siendo que N1N2 es un elemento seleccionado del grupo comprendiendo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento seleccionado del grupo comprendiendo CT o TT, así como C desoxicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina.

15. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia con la serie de bases N1N2CGN3N4 está posicionada en la región de una cadena del oligodesoxirribonucleótido y comprende 40 a 200 nucleótidos .

16. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque las moléculas de ácido nucleico están presentes en uno o, arios constructos de expresión.

17. Método según una o varias de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la transfección se lleva a cabo mediante transferencia balística, transfección por policationes, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, fusión de protoplastos, fusión de liposomas, sistemas de transfección viral, lipofección y/o electroporación.

18. Método . según la reivindicación 11, ' caracterizado porque las células tumorales alógenas están seleccionadas de carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar de células pequeñas o no de células pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovario y carcinoma de células renales, así como melanoma maligno.

19. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque las células tumorales provienen de varios pacientes con el mismo cuadro clínico.

20. Método según una de las reivindicaciones 11 a 19, caracterizado porque se emplean las células tumorales de la línea de células de carcinoma de células renales que está depositada en la DSMZ con el número D?M ACC 2635.

21. Célula tumoral humana que fue transfectada con moléculas de ácido nucleico que codifican para a) interieucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS), CD40L/CD154 y B7.1/CD80 o b) interleucina 7 (IL-7), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CFS) y CD40L/CD154 y que comprende los constructos de expresión correspondientes.

22. Célula tumoral humana según la reivindicación 21, caracterizada porque el constructo de expresión a) es un plásmido o b) un cásete de expresión cerrado en forma covalente, lineal de cadena doble, que consiste sólo de un promotor de CMV, . un intrón, la secuencia génica codificante y una secuencia de poliadenilación, y que está cerrado en forma covalente en ambos extremos de la cadena doble por un lazo corto de radicales de nucleótidos de cadena sencilla.

23. Célula tumoral humana según la reivindicación 21 y 22, caracterizada porque es una célula tumoral alógena de una línea de células de carcinoma de células renales.

24. Célula tumoral humana según la reivindicación 23, caracterizada porque se trata de células tumorales de la línea de células de carcinoma de células renales que está depositada en la DSMZ con el número DSM ACC '2635.

25. Célula tumoral humana según una o varias de las reivindicaciones 21 a 24 para uso como vacuna para el tratamiento de enfermedades tumorales .