CN114134182A - 一种新型免疫细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫细胞领域。本发明提供了一种新型免疫细胞的制备方法及其应用，使用含有进行了基因改造的DNA分子的慢病毒转染哺乳动物外周血中的细胞，使之能够多次传代，并且具有抗原提呈能力和激活扩增自然杀伤细胞的能力。该细胞进一步基因改造后能够实现更好的跨膜转移、抗原提呈和自然杀伤细胞的激活。该细胞经过基因改造后与不同细胞因子或小分子共同激活扩增单个核细胞可以得到更大量更高纯度的自然杀伤细胞，调控表观遗传改变自然杀伤细胞的受体和配体表达量，进而提高效应细胞的细胞毒性。本发明可以制备针对不同抗原的抗原提呈细胞、CTL细胞和应用方法。这些细胞和使用方法在肿瘤和传染性疾病的预防和治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

一种新型免疫细胞的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞，特别涉及工程化树突细胞(DC)，其刺激PBMC产生的特异性CTL和NK细胞，其制备方法和应用。

背景技术

(一)细胞免疫治疗及其类型

细胞免疫治疗，是采集人体免疫细胞，经过体外改造培养，使其数量成百千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的或感染病毒的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前细胞免疫治疗包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、API生物免疫治疗、DC-CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)、T细胞受体T细胞免疫疗法(TCR-T)等。

DC-CIK免疫疗法是一种以现代生物技术手段激发自身免疫系统来对抗肿瘤的一种治疗方法。其基本原理是，提取病人体内不成熟的免疫细胞，在体外进行培养后回输到病人体内，不仅可以准确高效的杀灭肿瘤细胞，还能激发机体产生抗肿瘤的免疫反应，从而使免疫系统发挥正常作用以杀死肿瘤细胞，并启动免疫监视防止肿瘤的转移和复发。DC细胞识别抗原、激活获得性免疫系统能力和杀伤能力，CIK细胞通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，两者联合可以提高CIK细胞的增活性，即DC-CIK生物治疗。但是DC细胞只有在体内识别或体外负载抗原后能够将特异性信号传递给CIK细胞使其发挥特异性杀伤的细胞毒性作用，这大大限制了该疗法的实际疗效。

NK细胞是人体免疫细胞的第一道防线，用于非特异性抗肿瘤和抗病毒感染，清除体内坏死细胞及脂肪等垃圾，抗衰老细胞等。NK细胞具有广谱的抗肿瘤作用，不显示肿瘤杀伤的特异性和MHC限制性，在机体其它免疫细胞(如T、B细胞)功能低下时，NK细胞的作用尤为重要。但是由于NK细胞体外扩增效率和纯度有效，这大大限制了NK的临床应用。

树突状细胞(DC)是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

(二)人树突状细胞(DC)的类型和激活T细胞、抗原呈递功能

人树突状细胞起源于造血干细胞。DC的来源有两条途径：①髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化为DC，称为髓样DC(mDC)，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞，包括朗格汉斯细胞，间皮(或真皮)DCs以及单核细胞衍生的DCs等；②来源于淋巴样干细胞，称为淋巴样DC或浆细胞样DC(pDC)，与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞。pDC细胞在病原体入侵后通过分泌大量干扰素α(IFN-α)介导抗炎症反应，而mDC细胞在将抗原呈递并驯化幼稚T细胞方面有重要作用。mDC细胞中的CD11c+亚型相对丰富，而占少数的CD141+mDC细胞亚型展现出一种强大的将MHC-I上的胞内抗原递呈到CD8+T细胞上，并促进其分化成细胞毒性T细胞(CTL)的能力。DC介导抗原呈递并介导T细胞最终分化成细胞毒性效应T细胞的过程是诱发抗病毒和抗癌获得性免疫中的重要步骤。

DC作为专职的抗原递呈细胞除了可以激活T细胞之外，还可向NK细胞递呈抗原，这可能也是DC启动免疫反应另一新途径。在无炎症状态下，DC少而缓慢地进入淋巴组织，虽亦可递呈抗原信息，然而对T细胞的作用却是形成耐受而非活化。这也与此时粘附分子低表达及其介导相应的DC粘附迁移有关，并可能是机体产生免疫耐受的一重要机制。

(三)DC免疫功能的发挥通过粘附级联迁移完成

随着DC迁移，其粘附分子表型及分布也发生改变，受时相性表达调节，某些粘附分子，如ICAM-1的表达随其他粘附分子下调而逐渐增强，这有利于DC与T细胞的进一步粘附。随着细胞粘附力增强，可促进DC与T淋巴细胞通过抗原肽/MHC与TCR/CD3两复合物间的连接与结合。此外趋化因子及其受体的相互作用也是趋化调节DC迁移并精确定位的关键因素。

一般认为一种抗原引起T细胞活化需要双信号刺激作用。粘附分子在介导DC与T细胞抗原递呈过程中可通过″分子桥″作用及协同信号通路，辅助DC刺激T细胞活化。如前述，DC可表达多种属粘附分子家族的第二信号共刺激分子，如B7-1、B7-2、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3及CD40等，这些成分可分别与T细胞表达的相应配体，如CD28/CTLA-4、LFA-I、CD40L等相互结合作用。其中B7-CD28/CTLA-4通路被认为在T细胞活化中起关键作用，也与免疫耐受关系密切。B7家族可与CD28结合提供T细胞活化协同信号，还可与CTLA-4结合抑制T细胞增殖。

DC-SIGN(DC specific intercellular-adhesion-molecule-3 grabbingnonintegrin，DC-SIGN，又名CD209)是一种具有外源C型植物凝集素的II型膜蛋白，是一种黏附受体，它专一、大量地表达于成熟和未成熟的DC表面，对DC某些功能的发挥很重要。例如，DC-SIGN可与其配体即细胞间黏附分子2(ICAM-2)结合，该配体表达于血管和淋巴管内皮上。DC-SIGN与ICAM-2的相互作用可聚集DC并实现DC的跨膜转移，这对补充DC至炎症部位以及随后DC向淋巴组织的转移可能至关重要。外周组织及淋巴细胞DC上DC-SIGN的大量表达支持这种观点。血液中DC-SIGN+DC前体的存在提示，这些前体细胞随时准备离开血液到达炎症部位，且能快速补充，在炎症部位发挥其免疫监视的作用。DC-SIGN还可启动DC与幼稚T细胞的相互作用，这种功能通过DC-SIGN结合另外一种细胞配体ICAM-3而实现，该配体在幼稚T细胞表面高水平表达。

(四)现有DC细胞疗法的缺陷

血液中DC细胞量很少，不足外周血单核细胞的1％，现有的DC细胞疗法采用的是抗原负载的单核细胞衍生的DC细胞(MoDCs)，该细胞是经一系列细胞因子和PRR刺激因子作用后成熟和活化而得到的。这种方法已经广泛地应用于癌症疫苗的临床试验中，但该方法的临床受益情况却相当有限。主要是由于这种方法有几个明显的缺点：相对于原代血源DC细胞，MoDC细胞与体外衍生出的巨噬细胞有更大相关性；除此之外，体外形成的MoDCs生长潜能有限并且很难较长时间培养，因此，多轮疫苗接种需要重复制备MoDC细胞才能完成。

(五)因子对免疫细胞的增殖发育有重要影响

IL-15是一种调节T细胞和自然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。IL-15可以促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞。IL-15能明显上调其NK细胞的比例，且NK细胞亚群分布由CD56dim为主转变成CD56bright细胞为主。这可能与不同条件下NK细胞IL15R表达状态不同有关。IL-15可通过IL-2Rβ、γ链有效传递活化信号。IL-15和IL-2具有协同刺激NK细胞杀伤功能的作用，这是由于IL-2不能诱导高亲和力受体的表达，当加入IL-15后，促进IL-2高亲和力受体的表达，从而促进NK细胞杀伤功能。

IL15RA是IL-15的高亲和力受体。IL15RA作为异源三聚体与IL-2受体β和γ亚单位联合启动信号转导。IL-15以高亲和力与IL-15R的α亚单位结合。IL-15也与IL-2受体的β和γ链结合，但不与IL-2受体的α亚单位结合。IL-15在结构和功能上与IL-2相关。这两种细胞因子共享一些受体的亚单位，允许它们相互竞争并负向调节彼此的活动。

OK432是冷冻干燥制成的菌苗，OK432激活的中性粒细胞能够杀死IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。OK432诱导的中性粒细胞对自体癌细胞的杀伤作用通过CD11b/CD18和ICAM-1之间的反应实现的。OK432诱导的单核细胞能够杀死自体癌细胞。OK432刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞甚至对抗NK细胞的癌细胞都显示出活性。

CD52/CDW52是一种小的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖蛋白。它有一个成熟的肽，只包含12个氨基酸，并在人体淋巴细胞上大量表达。CD52/CDW52可能在碳水化合物的运输和定向中起作用。它是补体介导的细胞裂解的一个非常好的靶点。

基因修饰技术手段中，表观遗传是重要的基因修饰方式。表观遗传是指在不改变DNA序列的情况下改变基因的表达从而对机体表型产生影响，是具有遗传性的重要调控方式，包括DNA甲基化、非编码RNA调控、组蛋白修饰、染色质重塑等多种方式。表观遗传在整个生命进程中都发挥着重要的作用，越来越多的研究显示，表观遗传调控不仅参与干细胞发育及组织分化，也同肿瘤、免疫性疾病、代谢性疾病以及神经相关疾病等发展进程密切相关。组蛋白修饰是重要的表观遗传学调控手段之一，包括甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰及泛素化修饰等等，细胞通过组蛋白可逆性的修饰实现对染色质构象的改变和基因表达的调控。

组蛋白的甲基化修饰是重要的组蛋白修饰手段，调控了细胞多种生理和病理进程。PRC2复合物(polycomb repressive complex 2)是调控组蛋白甲基化修饰的重要蛋白复合体。由EZH1、EZH2、Suz12和Eed四个亚基组成，其中EZH2是PRC2复合物的催化核心，可以调控组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化修饰。研究显示，组蛋白甲基化酶EZH2在调控干细胞发育和免疫调节中发挥了重要的作用，EZH2可调控早期B细胞的发育，CD4+Th1和Th2细胞分化的可塑性以及维持调节性T细胞的稳定性。

因此EZH2可能是药物治疗的一个新靶点，具有重要的科研价值和临床应用意义。

为了生产具有抗原提呈能力的细胞疫苗、活化的细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞，并将其用于临床治疗，有必要研究新的方法来制备这种细胞。

发明内容

本发明目的在于解决原代血源DC细胞，体外形成的MoDCs生长潜能有限并且很难较长时间培养，多轮疫苗接种需要重复制备MoDC细胞才能完成，NK细胞扩增成本高体系不稳定此类问题中的至少一个。

本申请的发明人在研究中发现多种改善DC细胞体外生长潜能、提高DC抗原提呈能力和激活CTL、NK细胞能力的方案。

本发明所采取的技术方案是：

本申请的发明人通过创造性序列设计智力劳动经检测试验结果惊奇的发现，通过自主设计目标基因的慢病毒载体及由此得到的慢病毒对外周血来源的PBMC细胞进行转染，并分阶段分步骤采用多种目标影响物加载并联合细胞因子刺激PBMC，得到杀伤力、抗原呈递能力提高的工程化的DC、CTL和NK细胞。

发明人首先构建分别携带自主设计的重组NT基因和携带细胞特异性细胞间黏附分子3结合非整合素(specific intercellular-adhesion-molecule-3 grabbingnonintegrin，SIGN)基因的慢病毒载体；接着一方面用重组NT基因的慢病毒载体转染293T细胞得到重组NT基因和SIGN基因的慢病毒颗粒；携带重组NT基因的慢病毒颗粒转染树突状细胞(DC)获得单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株，加载抗原，再刺激与MoDC-NT同HLA-A的PBMC，获得抗原特异性CTL；

另一方面，用携带重组NT基因的慢病毒颗粒转染PBMC得到工程化的NT-树突状细胞(EDC-NT)，再用前述得到的SIGN基因的慢病毒颗粒感染工程化的NT-树突状细胞(EDC-NT)得到功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株，并刺激PBMC制备得到效应细胞；进而，用携带HLA-A0201、HLA-A1101和HLA-A2402基因序列的慢病毒颗粒进一步感染上述的EDC-NTSIGN株得到多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)；进一步，采用携带抗原基因的慢病毒颗粒感染多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)得到抗原特异性多功能树突细胞，进一步刺激PBMC获得杀伤能力更强的抗原特异性CTL；最后由携带细胞因子和融合蛋白基因的慢病毒转染上述的EDC-NTSIGN株制备多功能NK滋养细胞株(EDC-NK)，用细胞灭活剂将多功能NK滋养细胞株(EDC-NK)失活或不失活，再刺激PBMC，再联合细胞因子培养得到杀伤能力和增值速度更快的NK细胞。

本发明实现目的采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种用于制备新型免疫治疗细胞的重组NT基因慢病毒颗粒，其中，所述NT基因慢病毒颗粒通过携带NT基因的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统感染宿主细胞获得，所述携带NT基因的慢病毒载体中，所述重组NT基因由核苷酸序列片段A、核苷酸序列片段B、核苷酸序列片段C和核苷酸序列片D组成，所述NT基因的核苷酸序列选自NT1基因和NT2基因中的任一种，所述NT1基因中核苷酸序列为A，所述NT2基因中5′到3′的组成为-B-C-D-E-，所述B为编码Tax2基因(1-3aa)，所述C为编码Tax1基因(2-255aa)，所述D为编码T2A基因，所述E为编码Tax1基因(227-337aa)。

所述NT1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Tax2(1-3aa)基因序列如SEQ ID No.2所示，Tax1(2-255aa)基因序列如SEQ ID No.3所示，Tax1(227-337aa)基因如SEQ ID No.4所示。

在一实施例中，所述NT2基因的结构组成为5′-3′顺次连接的结构-Tax2(1-3aa)-Tax1(2-255aa)-T2A-Tax1(227-337aa)-，其中，所述宿主细胞为293T细胞。

本方案中，Tax蛋白是由HTLV-1基因组中的pX基因区域的Tax基因编码，分子量为40x10³，由353个氨基酸组成，其N末端的48个残基含有核定位信号(NLS)，分布在细胞核内，作为反式激活者，Tax本身并无DNA结合能力，它通过与宿主细胞转录因子的直接或间接作用激活病毒和细胞基因。这些细胞转录因子包括cAMP反应要素结合蛋白或激活转录因子(REB/ATF)、核因子κB(NFκB)和血清反应因子(SRF)。通过与这些转录因子的相互作用，Tax蛋白不仅可激活病毒自身的长末端重复序列(LTR)的转录，也可激活一些即早期血清反应基因、细胞因子基因和其受体基因。这些细胞基因的激活导致T细胞的增殖、转化，并与其它因素一起参与白血病的发生。

第二方面，本发明提供了，一种工程化单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株，其中，所述MoDC-NT株由第一方面所述的重组NT基因慢病毒颗粒转染树突状细胞获得，所述感染同时添加促慢病毒感染剂促进。

在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂为多聚阳离子化合物聚凝胺，在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂为纳米聚合物。

在一实施例中，所述感染时间为所述树突细胞培养的第7天。

在一实施例中，所述慢病毒感染前和感染后向所述树突状细胞培养基隔天添加含IL-4和GM-CSF的培养基。

在一实施例中，所述感染后添加TNF-a和LPS。在一实施例中，所述感染后添加TNF-a和Poly(I:C)。在一实施例中，所述TNF-a浓度是5ng/ml。在一实施例中，所述TNF-a浓度是20ng/ml。在一实施例中，所述LPS浓度是5ug/ml。在一实施例中，所述LPS浓度是20ug/ml。在一实施例中，所述Poly(I:C)浓度是5ug/ml。在一实施例中，所述Poly(I:C)浓度是50ug/ml。

在一实施例中，使用NT-1慢病毒的10份细胞均构建成功，实现了细胞扩增。

在一实施例中，使用NT-2慢病毒的10份细胞均构建成功，实现了细胞扩增。

通过该方案制备的单核细胞来源的MoDC-NT细胞具有典型的树突状细胞的表型，且可以实现多次传代增殖，可为某些需要大量抗原提呈细胞但又不能长时间等待的人提供较为充足的自体DC细胞进行抗原提呈。且通过该方案制备的细胞具有更高的纯度。同时该细胞也可进行HLA配型使用。

本发明的第三方面提供了一种抗原特异性CTL，其制备步骤包括：(1)向采用第二方面所述方法制备所得的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株加载抗原；(2)取与第二方面所述的MoDC-NT相同HLA-A的血液制备PBMC；(3)用(1)所得的加载抗原的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)刺激(2)所得的PBMC，添加比例可以是MoDC-NT∶PBMC＝1∶1-1∶1000；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间。

在一实施方式中，(3)加载抗原的树突状细胞(MoDC-NT)和添加的PBMC的添加比例可以是MoDC-NT∶PBMC＝1∶1。在一实施方式中，3)加载抗原的树突状细胞(MoDC-NT)和添加的PBMC的添加比例可以是MoDC-NT∶PBMC＝-1∶1000。

在一实施方式中，所述单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株加载抗原是通过抗原肽负载，在一实施方式中，所述单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株加载抗原的方式是将抗原基因转染到树突状细胞(MoDC-NT)株中。

在一实施例中，(2)所述血液来源自外周血，在一实施例中，(2)所述血液来源脐带血。在一实施方式中所述培养的时长为一周，在一实施方式中所述培养的时长两周、在一实施方式中所述培养的时长三周或更长时长。

在一实施方式中所述PBMC为CD3+T细胞，在一实施方式中CD8+T细胞。

在一实施例中，通过使用一定量负载了M1多肽的MoDC-NT刺激MHC匹配的PBMC制备得到的M1特异性CTL，其CD8+阳性细胞占CD3+CD56-细胞的89.57％，同时CD3+CD56+双阳细胞为3.92％，CD3-CD56+双阳细胞占比为1.70％，其中M1Tetramer-GILGFVFTL阳性细胞占CD3+CD8+双阳性细胞的20.73％，这样可以在患者体内实现对表达M1特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

本发明的第四方面提供了一种工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株，其中所述工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备方法包括步骤：采用本发明第一方面所述的重组NT基因慢病毒颗粒感染事先培养的PBMC，感染后继续培养后分选去掉细胞中的CD3+的细胞，所述感染同时加促慢病毒感染剂促进，所述慢病毒感染前PBMC先后分别在含免疫激动剂培养基和含IL-2的培养体系培养，感染后PBMC在含血清和IL-2的培养体系培养。

在一实施例中，所述工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备方法包括步骤：(1)分离含抗凝剂外周血中单个核细胞(PBMC)；(2)用含有免疫细胞激动剂的培养基培养(1)所得的细胞24小时；(3)向(2)培养体系中加入IL-2继续培养4-5天；(4)采用第一方面所述的重组NT基因慢病毒颗粒感染(3)培养后的细胞，同时加入促慢病毒感染试剂；(5)用含有血清和IL-2的培养基培养(4)所得细胞1-2周；(6)用磁珠或流式分选去掉(5)所得细胞中CD3+的细胞；(7)将(6)中保留下来的细胞继续用(5)中培养条件继续培养2-3个月。

在一实施例中，所述免疫激动剂为PHA；在一实施例中，所述免疫激动剂为PMA；在一实施例中，所述免疫激动剂为其他激动剂。在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂多聚阳离子化合物聚凝胺；在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂为纳米聚合物。在一实施例中，所述分选方法为磁珠分选；在一实施例中，所述分选方法为流式细胞法筛选。

在一实施例中，使用NT-1慢病毒的10份细胞中，有一份在培养一个月左右的时候细胞不再增殖，逐渐死亡，其余9份均构建成功，细胞构建成功率约为90％。

在一实施例中，使用NT-2慢病毒的10份细胞中，有两份份在培养40天左右的时候细胞不再增殖，逐渐死亡，其余10份均构建成功，细胞构建成功率约为100％。

在一实施例中，NT树突状细胞(EDC-NT)株具有典型的DC表型，且可以实现长时间传代增殖，可以将需求者的EDC-NT提前准备完成，长期液氮存储，当需要的时候复苏后即可(或短暂扩增培养)使用，且为某些需要大量抗原提呈细胞的人无限量提供充足的自体DC细胞进行抗原提呈，且为一次制备终生使用。同时该细胞也可进行HLA配型使用。

本发明的第五方面提供了一种新型免疫细胞，其制备方法包括步骤：(1)第四方面所述NT树突状细胞(EDC-NT)株加载或不加载抗原；(2)取与所述EDC-NT相同或不同HLA-A的血液制备PBMC；(3)用(1)所得的加载或不加载抗原的NT树突状细胞(EDC-NT)刺激(2)所得的PBMC，混合培养；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间。

一实施例中(1)所述NT树突状细胞(EDC-NT)株加载抗原的方式为抗原肽负载。

一实施例中(1)所述NT树突状细胞(EDC-NT)株加载抗原的方式为将抗原基因转染到NT树突状细胞(EDC-NT)株中。

一实施例中(2)所述PBMC与EDC-NT的HLA-A相同。一实施例中(2)所述PBMC与EDC-NT的HLA-A不同。

一实施例中(2)所述血液来自外周血。一实施例中(2)所述血液来自脐带血。

一实施例中(3)所述PBMC选自PBMC和一实施例中(3)所述PBMC为CD3+T和一实施例中(3)所述PBMC为CD8+T细胞。

一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1。一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1000。

本发明的第六方面提供一种工程化的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株，其制备方法包括步骤：(1)采用SIGN慢病毒颗粒重复感染本发明第四方面所述的工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株；(2)步骤(1)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(3)分选收集(2)所得细胞中CD209+的细胞；(4)将步骤(3)所得细胞继续培养一段时间。

其中，所述SIGN基因的序列选自如SEQ ID No.5所示的核酸序列。

所述SIGN基因的慢病毒颗粒的制备方法包括由包含携带SIGN基因的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统感染宿主细胞获得。

全新SIGN设计的碱基序列可以使得其能够很好的在人免疫细胞中高效的转录和翻译，进而充分实现其生物学活性。

在一具体实施例中，功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株具有典型的DC表型，并且高表达DC-SIGN，这样就可以实现更好的信号传导，更有利于激活T细胞和NK细胞，使临床应用可能性进一步提高。

在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂多聚阳离子化合物聚凝胺；在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂为纳米聚合物。在一实施例中，所述分选方法为磁珠分选；在一实施例中，所述分选方法去流式细胞筛选。

在一具体实施方式中可激活的效应细胞为T细胞。

在一具体实施方式中，可激活的效应细胞为NK细胞。

在一具体实施例中，相比EDC-NT细胞，EDC-NTSIGN细胞可以更好的激活效应细胞(T细胞、NK细胞)，21天的培养周期，细胞总数提高了33.23％。(如图14所示)。更大数量的效应细胞，更易满足临床应用，减少患者大量采血带来的痛苦，增加患者治愈的可能性。

本发明的第七方面提供了一种新型免疫细胞，其制备方法包括步骤：(1)第六方面所述功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株加载或不加载抗原；(2)取与所述EDC-NTSIGN相同或不同HLA-A的血液制备PBMC；(3)用(1)所得的加载或不加载抗原的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株刺激(2)所得的PBMC，混合培养；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间。

一实施例中(1)所述功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株加载抗原的方式为抗原肽负载。

一实施例中(1)所述功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株加载抗原的方式为将抗原基因转染到EDC-NTSIGN细胞株中。

一实施例中(2)所述PBMC与EDC-NTSIGN的HLA-A相同。一实施例中(2)所述PBMC与EDC-NTSIGN的HLA-A不同。

一实施例中(2)所述血液来自外周血。一实施例中(2)所述血液来自脐带血。

一实施例中(3)所述PBMC选自PBMC和一实施例中(3)所述PBMC为CD3+T和一实施例中(3)所述PBMC为CD8+T细胞。

一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1。一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1000。

本发明的第八方面提供一种工程化的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)株，所述EDC-NTA株的制备方法包括步骤：(1)采用携带HLA-A0201、HLA-A1101和HLA-A2402基因的一种或多种组合的核苷酸序列的慢病毒颗粒重复感染本发明第六方面所述的EDC-NTSIGN细胞株，(2)分选收集(1)所得细胞中HLA-A组合阳性的细胞；(3)将步骤(1)所得细胞继续培养一段时间。

其中，所述分别携带HLA-A0201、HLA-A1101或HLA-A2402基因的慢病毒颗粒的制备方法包括步骤：分别由包含携带HLA-A0201、HLA-A1101或HLA-A2402基因的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统感染宿主细胞获得，所述宿主细胞为293T细胞。

在一实施例中，所述HLA为HLA-A0201，其中，所述HLA-A0201的核苷酸序列如SEQID No.6所示，在一实施例中，所述HLA为HLA-A1101，所述HLA-A1101(HA-Tag)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，在一实施例中，所述HLA为HLA-A2402，所述HLA-A2402的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。在一实施例中所述HLA为HLA-A0201和HLA-A1101(HA-Tag)的组合；在一实施例中所述HLA为HLA-A0201和HLA-A2402(HA-Tag)的组合；在一实施例中所述HLA为HLA-A1101(HA-Tag)和HLA-A2402(HA-Tag)的组合；在一实施例中所述HLA为HLA-A0201和HLA-A1101(HA-Tag)和HLA-A2402(HA-Tag)的组合。

所得的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201/1101/2402)株同时具有HLA-A0201、HLA-A1101和HLA-A2402这三种在华人中占比最高的MHC I类分子。该细胞可用于给含有这三种MHC I分子之一的细胞进行体外抗原提呈，使大规模靶向特异性CTL的生产成为可能。

本发明的第九方面提供一种新型免疫细胞，其制备方法包括步骤：(1)取本发明第八方面所述方法制备所得的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)株与抗凝血来源的PBMC混合培养；(2)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(3)持续培养一段时间。

一实施例中(1)所述抗凝血来自外周血。一实施例中(1)所述抗凝血来自脐带血。

一实施例中(1)所述PBMC选自PBMC和一实施例中(3)所述PBMC为CD3+T和一实施例中(3)所述PBMC为CD8+T细胞。

一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1。一实施例中(3)所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1000。

本发明的第十方面提供一种抗原特异性多功能树突状细胞株，其制备步骤包括：(1)将抗原基因与IκBα基因组合后连接到慢病毒载体质粒上，(2)用携带(1)所述序列组合的慢病毒感染本发明第八方面所述的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)；(3)步骤(2)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(4)重复2次该步骤(2)和(3)；(5)筛选收集所得细胞中抗原基因阳性的细胞；(6)继续培养一段时间；其中，(其中，(1)所述组合基因的结构选自通式IκBα(1-48aa)-抗原基因-IκBα(281-317aa)、IκBα(1-317aa)-T2A-抗原基因、IκBα(1-48aa)-抗原肽mini基因-IκBα(281-317aa)和IκBα(1-317aa)-T2A-抗原肽mini基因中的一种；(5)所述筛选包括用磁珠或流式细胞术分选或细胞单克隆筛选或抗性筛。

在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂是多聚阳离子化合物聚凝胺。在一实施例中，所述促慢病毒感染试剂是其他促慢病毒感染试剂。

在一实施例中，其中(3)所述筛选方法为磁珠分选，在一实施例中，其中(3)所述筛选方法为流式细胞术分选；在一实施例中，其中(3)所述筛选方法为细胞单克隆筛选；在一实施例中，其中(3)所述筛选方法为抗性筛选。

在一实施例中，所述抗性筛选为puromycin筛选。

在一实施例中，所述puromycin的浓度为5ug/ml。

在一实施例中，所述puromycin的浓度为10ug/ml。

在一实施例中，所述puromycin的浓度为8ug/ml。

在一实施例方式中，(1)所述组合基因的结构为通式IκBα(1-48aa)-抗原基因-IκBα(281-317aa)。

在一实施例方式中，(1)所述组合基因的结构为通式IκBα(1-317aa)-T2A-抗原基因。

在一实施例方式中，(1)所述组合基因的结构为通式IκBα(1-48aa)-抗原肽mini基因-IκBα(281-317aa)。

在一实施例方式中，(1)所述组合基因的结构为通式IκBα(1-317aa)-T2A-抗原肽mini基因。

其中所述抗原基因或抗原肽基因选自包括但不限于Mesothelin、CEA、NYESO-1、AFP、TPA、TPS、EGFR、VEGF、PDGFR、ALK、CA125、CA153、CA199、CA242、CA724、S100、HCG、HCH、B2-MG、MUC1/16、WT1、GD2、GPC3、PRAME、FOLR1、MAGEA3、Her2、Survivin、CD19、CD20、CD22、CD47、CD73、CD117、PD1、PD-L1、BCMA等肿瘤抗原基因或病毒抗原基因的全抗原基因或部分抗原基因。

其中IκBα为经过改造的全新序列，经人工合成后再进行使用，在一实施方式中，所述特异性抗原选自包括Mesothelin、CEA和NYESO1的组。其中，IκBα的核苷酸编码序列如SEQID No.9所示，T2A的核苷酸编码序列如SEQ ID No.10所示。

在一些实施方式中，所述抗原特异性多功能树突细胞包括Mesothelin特异性多功能树突状细胞(EDC-Mesothelin)株、NYESO1特异性多功能树突状细胞(EDC-NYESO1)株和CEA特异性多功能树突状细胞(EDC-CEA)株和其他抗原基因对应的抗原特异性树突状细胞株，所述Mesothelin基因序列如SEQ ID No.11所示，所述CEA基因序列如SEQ ID No.12所示，所述NYESO1基因的序列如SEQ ID No.13所示。所述抗原肽mini基因的氨基酸序列是多个-抗原多肽-AYY-的重复连接序列，所述AYY的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示：GCTTACTAC。

在一具体实施例中，所述特异性抗原为Mesothelin，所述慢病毒颗粒为Mesothelin慢病毒颗粒。

其中，所述Mesothelin慢病毒颗粒由Mesothelin慢病毒载体与病毒转染质粒系统组成混合物感染宿主细胞T293细胞得到。

在一具体实施例中，所述特异性抗原为Mesothelin，特异性多功能树突状细胞(EDC-Mesothelin)株，其中核苷酸序列链接模式如图17所示。

在一具体实施例中，所述特异性抗原为CEA.，所述慢病毒颗粒为CEA慢病毒颗粒。

其中，所述CEA慢病毒颗粒由CEA慢病毒载体与病毒转染质粒系统组成混合物感染宿主细胞T293细胞得到。

在一具体实施例中，所述特异性抗原为CEA，特异性多功能树突状细胞(EDC-CEA)株，其中核苷酸序列链接模式如图18所示。

在一具体实施例，所述特异性抗原为NY-ESO-1，所述慢病毒颗粒为NY-ESO-1慢病毒颗粒。

其中，所述NY-ESO-1慢病毒颗粒由NY-ESO-1慢病毒载体与病毒转染质粒系统组成混合物感染宿主细胞T293细胞得到。

在一具体实施例中，所述特异性抗原为NY-ESO-1，特异性多功能树突状细胞(EDC-NYESO1)株，其中，NY-ESO-1核苷酸序列链接模式如图19所示。

其中，IκBα的核苷酸编码序列如SEQ ID No.9所示，T2A的核苷酸编码序列如SEQID No.10所示，Mesothelin的核苷酸编码序列如SEQ ID No.11所示，CEA的核苷酸编码序列如SEQ ID No.12所示，NY-ESO-1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

其中，所述IκBα为经过改造的全新序列，经人工合成后再进行使用。通过使用IκBα可以促进Mesothelin、CEA、NY-ESO-1在细胞内快速降解，并被MHC I类分子提呈，该细胞株的构建可以用于制备Mesothelin、CEA、NY-ESO-1特异性CTL，为Mesothelin、CEA、NY-ESO-1阳性肿瘤患者的治疗提供一种崭新的选择。

本发明的第十一方面提供一种新型免疫细胞，其制备方法包括步骤：(1)由本发明第十方面所述的抗原特异性多功能树突细胞与血液制备的PBMC混合培养，(2)持续培养一段时间。

在一实施例中，血液为外周血，在一实施例中，血液为脐带血。

在一实施例中，起始细胞为PBMC细胞。

在一实施例中，起始细胞为CD3+T。

在一实施例中，起始细胞为CD8+T。

在一实施例中，所述新型免疫细胞为抗原特异性CTL。

在一实施例中，所述新型免疫细胞为抗原特异性NK细胞。

在一实施例中，所述血液来源的细胞与本发明第十方面所述的抗原特异性多功能树突细胞MHC I类分子匹配。在一实施例中，所述血液来源的细胞为HLA-A0201。

在一实施例中，所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1，在一实施例中，所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1000。在一实施方式中，所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2。其中在一实施方式中培养时长是一周；在一实施方式中培养时长是两周，在一实施方式中培养时长是三周，或在一实施方式中培养时长是其他时长。其中在一实施方式中所述PBMC是CD3+T细胞；在一实施方式中所述PBMC是CD8+T细胞。

其中所述抗原选自Mesothelin、CEA、NYESO-1、AFP、TPA、TPS、EGFR、VEGF、PDGFR、ALK、CA125、CA153、CA199、CA242、CA724、S100、HCG、HCH、β2-MG、MUC1/：16、WT1、GD2、GPC3、PRAME、FOLR1、MAGEA3、Her2、Survivin、CD19、CD20、CD22、CD47、CD73、CD117、PD1、PD-L1、BCMA等肿瘤抗原或病毒抗原中的任意一种或多种抗原的组合。

其中在一实施方式中，所述靶抗原选自Mesothelin、NYESO1和CEA。

在一具体实施例中，所述特异抗原为Mesothelin，制备所得CTL中CD3+CD8+双阳性细胞高到89.57％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达17.10％，CD3-CD56+细胞占比为4.30％，这样可以在患者体内实现对表达Mesothelin特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

在一具体实施例中，所述特异抗原为CEA，制备所得CTL中CD3+CD8+双阳性细胞高到86.86％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达23.85％，CD3-CD56+细胞占比为3.64％，这样可以在患者体内实现对表达CEA特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

在一具体实施例中，所述特异抗原为NY-ESO-1，制备所得CTL中CD3+CD8+双阳性细胞高到89.74％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达14.39％，CD3-CD56+双阳性细胞占比为2.34％，这样可以在患者体内实现对表达NY-ESO-1特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

本发明的第十二方面提供一种多功能NK滋养细胞(EDC-NK)，其制备方法包括步骤：(1)分别采用多种携带特定细胞因子的慢病毒颗粒依次重复感染本发明第五方面所述的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株，(2)步骤(1)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(3)分别筛选收集(2)所得细胞中阳性表达特定细胞因子基因的细胞，(4)将步骤(3)所得细胞继续培养一段时间。

在一实施方式中，所述细胞因子包括4-1BBL、MICA以及IL-15&CD8融合蛋白三种，所述慢病毒颗粒由分别包含携带4-1BBL、MICA、IL-15&CD8 Fusion protein三种基因之一的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统依次感染宿主细胞获得；所述4-1BBL、MICA、信号肽、IL-15和CD8的基因核苷酸序列分别如SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18所示。其中，所述IL-15&CD8 Fusion protein的核苷酸组成模式为-信号肽(87bp)-胞外区(IL-15 Mat-peptide(342b)-Hinge(141bp))-跨膜区(TM(72bp)。其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

所述IL-15&CD8αFusion protein结构示意图如图25所示。

其中，所述携带细胞因子基因的慢病毒颗粒的制备方法包括步骤：

(1)设计细胞因子编码核苷酸序列及其组成核苷酸片段；

(2)酶切链接构建细胞因子编码核苷酸序列的慢病毒载体；

(3)将细胞因子编码核苷酸序列的慢病毒载体感染宿主细胞，包装得到携带细胞因子编码序列的慢病毒颗粒。

4-1BBL与NK细胞激活性受体4-1BB相互作用可以修复NK细胞反应性，MICA是激活人NK细胞广泛表达的激活性受体NKG2D的配体，IL-15可以促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞，明显上调其NK细胞的比例，且NK细胞亚群分布由CD56dim为主转变成CD56bright细胞为主。成功构建EDC-NK可以为NK细胞的制备提供一种新的选择方案，且该方案的出现可以使NK细胞制备过程中提前用抗原刺激EDC-NK，产生具有抗原特异性的细胞。且可能成为替代目前临床上使用的K562或其他滋养细胞进行NK细胞的生产。

本发明的第十三方面提供了一种即用型多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株。其制备方法选自是将EDC-NK细胞悬液用选自Co60射线辐照、γ射线照射、化学组织细胞固定液固定和其他能够使细胞失去增殖活性的处理方式处理细胞中的一种。

在一实施例中，所述多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的失活方式将细胞用多聚甲醛等组织细胞固定液固定。在一实施例中，所述多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的失活方式是其他能够使细胞失去增殖活性的处理方式处理细胞，但细胞可保持其功能和应用安全性。可作为疫苗或细胞制剂进行临床使用或科研使用。

在一实施例中，所述即用型多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的制备步骤包括：(1)取本发明第九方面所述的多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株制备成细胞悬液；(2)将(1)所获细胞悬液用Co60射线进行照射灭活；(3)将(2)照射后所获细胞使用细胞冻存液进行程序降温至-80℃；(4)将(3)所获细胞保存。

在一实施例中，所述多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株灭活方式为Co60射线；在一实施例中，辐照剂量为Dmin＝19.85kGy。

经过辐照处理后的EDC-NK细胞属于灭活的细胞，不能再进一步增殖，但是保持了原有的胞内结构和表面分子结构，这样就保留了它的抗原提呈能力，不影响它对T细胞和NK细胞的激活能力，更加有利于临床应用的安全性。辐照完的细胞可直接使用，亦可将冻存细胞复苏后使用。

在一实施例中，使用Co60 BFT-II型(2#)辐照装置，采取环装轨道分次照射进行辐照处理，细胞悬液吸收剂量为：Dmin＝19.85kGy。在一实施例中，其中所述细胞灭活方式为其他射线，或在一实施例中，其中所述细胞灭活方式为化学试剂。

本发明的第十四方面提供了一种新型免疫细胞，其制备步骤包括：(1)取本发明第四、六、八、十、十二或第十三方面所述的细胞株与外周血或脐带血来源的PBMC混合培养，其细胞比例可以是细胞株∶PBMC＝1∶1-1∶1000；(2)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(3)步骤(2)所述培养体系中可以加入组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和/或细胞因子，(4)持续培养一段时间。

在一实施方式中，(1)所述的PBMC来源于外周血，或在一实施方式中，(1)所述的PBMC来源于脐带血。在一实施方式中，(1)中其细胞比例是细胞株∶PBMC＝1∶1；在一实施方式中，(1)中其细胞比例是细胞株∶PBMC＝1∶1000。

在一实施方式中，(4)的培养时长选自一周、两周、三周或其他时长。

在一实施例中，激活PBMC制备NK所使用的培养基中添加组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂。其中，在一实施例中，所述抑制剂优选UNC1999；在一实施例中，所述抑制剂优选EPZ005687。

在一实施例中，激活PBMC制备NK所使用的培养基中添加细胞因子。在一实施例中，所述细胞因子优选IL-15、IL-15RA、OK432、CD52中的一种或多种组合。在一实施例中，所述细胞因子为IL-15。在一实施例中，所述细胞因子为IL-15RA。在一实施例中，所述细胞因子为OK432。在一实施例中，所述细胞因子为IL-15和OK432。在一实施例中，所述细胞因子为IL-15和CD52。在一实施例中，所述细胞因子为IL-15、OK432和CD52。

在一实施例中，NK细胞的制备是加入(辐照或未辐照)EDC-NK和多细胞因子刺激PBMC。

在一实施例中，多细胞因子是IL15、IL-15RA、OK432和CD52的任意组合。

在一实施例中，联合细胞因子是IL15、IL-15RA、OK432和CD52。

IL-15是一种调节T细胞和自然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。IL-15可以促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞。IL-15能明显上调其NK细胞的比例，且NK细胞亚群分布由CD56dim为主转变成CD56bright细胞为主。这可能与不同条件下NK细胞IL15R表达状态不同有关。IL-15可通过IL-2Rβ、γ链有效传递活化信号。IL-15和IL-2具有协同刺激NK细胞杀伤功能的作用，这是由于IL-2不能诱导高亲和力受体的表达，当加入IL-15后，促进IL-2高亲和力受体的表达，从而促进NK细胞杀伤功能。CD56bright亚群的增加，将对细胞因子分泌有明显促进作用，而CD56dim亚群的增加，将促进NK细胞的杀伤活性。但是CD56dim和CD56bright亚群在功能上并不是截然分开的。

IL15RA是IL-15的高亲和力受体。IL15RA作为异源三聚体与IL-2受体β和γ亚单位联合启动信号转导。IL-15以高亲和力与IL-15R的α亚单位结合。IL-15也与IL-2受体的β和γ链结合，但不与IL-2受体的α亚单位结合。IL-15在结构和功能上与IL-2相关。这两种细胞因子共享一些受体的亚单位，允许它们相互竞争并负向调节彼此的活动。

OK432是冷冻干燥制成的菌苗，OK432激活的中性粒细胞能够杀死IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。OK432诱导的中性粒细胞对自体癌细胞的杀伤作用通过CD11b/CD18和ICAM-1之间的反应实现的。OK432诱导的单核细胞能够杀死自体癌细胞。OK432刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞甚至对抗NK细胞的癌细胞都显示出活性。

CD52/CDW52是一种小的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖蛋白。它有一个成熟的肽，只包含12个氨基酸，并在人体淋巴细胞上大量表达。CD52/CDW52可能在碳水化合物的运输和定向中起作用。它是补体介导的细胞裂解的一个非常好的靶点。

基因修饰技术手段中，表观遗传是重要的基因修饰方式。表观遗传是指在不改变DNA序列的情况下改变基因的表达从而对机体表型产生影响，是具有遗传性的重要调控方式，包括DNA甲基化、非编码RNA调控、组蛋白修饰、染色质重塑等多种方式。表观遗传在整个生命进程中都发挥着重要的作用，越来越多的研究显示，表观遗传调控不仅参与干细胞发育及组织分化，也同肿瘤、免疫性疾病、代谢性疾病以及神经相关疾病等发展进程密切相关。组蛋白修饰是重要的表观遗传学调控手段之一，包括甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰及泛素化修饰等等，细胞通过组蛋白可逆性的修饰实现对染色质构象的改变和基因表达的调控。

组蛋白的甲基化修饰是重要的组蛋白修饰手段，调控了细胞多种生理和病理进程。PRC2复合物(polycomb repressive complex 2)是调控组蛋白甲基化修饰的重要蛋白复合体。由EZH1、EZH2、Suz12和Eed四个亚基组成，其中EZH2是PRC2复合物的催化核心，可以调控组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化修饰。研究显示，组蛋白甲基化酶EZH2在调控干细胞发育和免疫调节中发挥了重要的作用，EZH2可调控早期B细胞的发育，CD4+Th1和Th2细胞分化的可塑性以及维持调节性T细胞的稳定性。

IL15、IL-15RA、OK432和CD52联合EZH2的小分子抑制剂使用，可以更好的促进NK细胞的激活增殖，提高终产品中NK细胞的纯度，同时改变NK细胞的表观遗传，进而提高对靶细胞的杀伤活力。

在一实施例中，NK细胞的制备是加入(辐照或未辐照)EDC-NK和组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂刺激PBMC。

在一实施例中，NK细胞的制备是加入(辐照或未辐照)EDC-NK和组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和多细胞因子刺激PBMC。

在一实施例中，使用EDC-NK刺激激活PBMC可以得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)，分别占比81.11％和4.45％，培养21天细胞扩增253倍。

在一实施例中，联合细胞因子使用EDC-NK刺激激活PBMC可以得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)，分别占比95.43％和0.86％，培养21天细胞扩增394倍。进一步提高的NK纯度和细胞扩增倍数。

在一实施例中，联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和细胞因子使用EDC-NK刺激激活PBMC可以更好的激活NK(CD3-CD56+)，提高其占比；同时NKG2D+CD56+细胞亚群也随着加入EZH2抑制剂而提高；加入EZH2抑制剂后效应细胞对靶细胞的杀伤能力也明显提高；21天培养培养周期中抑制剂对细胞扩增效率几乎没有影响。

在一实施方式中，(1)所述PMBC与步骤(1)的细胞株具有相同HLA-A；在一实施方式中，(1)所述PMBC与步骤(1)的细胞株具有不同HLA-A。

在一实施方式中，(1)所述细胞株添加比例是细胞株∶PBMC＝1∶1，在一实施方式中，(1)所述细胞株添加比例是细胞株∶PBMC＝1∶1000。

在一实施方式中，混合培养前向(1)所述的细胞株中加载抗原。在一实施方式中，混合培养前向(1)所述的细胞株中不加载抗原。

在一实施方式中，所述加载抗原的方式为抗原肽负载；在一实施方式中，所述加载抗原的方式是将抗原基因转染到细胞株。

附图说明

图1.本发明的NT-2核酸序列片段组成结构图

图2.pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP质粒图谱

图3.质粒pUC57-NT或pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP双酶切后凝胶电泳结果

注：①：DNA Marker；②：pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP进行双酶切；③：pUC57-NT双酶切；

图4.凝胶电泳验证双酶切NT连接载体质粒结果

注：①：DNA Marker；②：pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT进行双酶切；

图5.pCDH-EF1-MCS-T2A-Tdtomato质粒图谱

图6.质粒pUC57-SIGN或pCDH-EF1-MCS-T2A-Tdtomato双酶切后凝胶电泳结果

注：①：DNA Marker；②：pCDH-EF1-MCS-T2A-Tdtomato进行双酶切；③：pUC57-SIGN双酶切；

图7.凝胶电泳验证双酶切SIGN连接载体质粒结果

注：①：DNA Marker；②：pCDH-EF1-MCS-T2A-Tdtomato-SIGN进行双酶切；

图8.单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的流式检测结果

图9.单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株形态

图10.MoDC-NT/M1刺激PBMC制备M1多肽特异性CTL细胞的流式检测结果

图11.携带的NT(NT-1或NT-2)基因的NT树突状细胞(EDC-NT)株的流式检测结果

图12.携带的NT(NT-1或NT-2)基因慢病毒颗粒感染PBMC得到的NT树突状细胞(EDC-NT)株

图13.功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株的流式检测结果

图14.EDC-NT和EDC-NTSIGN细胞激活效应细胞(T、NK)细胞的增殖曲线

图15.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201/1101/2402)株的流式表型

图16.pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro质粒图谱

图17.Mesothelin核酸序列连接结构图

图18.CEA核酸序列连接结构图

图19.NY-ESO-1核酸序列连接结构图

图20.EDC-Mesothelin刺激PBMC制备的Mesothelin特异性CTL的流式分析图

图21.EDC-CEA刺激PBMC制备的CEA特异性CTL的流式分析图

图22.EDC-NYESO1刺激PBMC制备的NY-ESO-1特异性CTL的流式分析图

图23.EDC-Mesothelin刺激产生的特异性CTL细胞杀伤能力分析

A.Western Blot检测Mesothelin在FIB和FIB/A0201/Mesothelin中的表达情况；

B.流式分析HLA-A0201表达情况；

C.EDC-Mesothelin刺激PBMC产生的细胞对FIB/A0201和FIB/A0201/Mesothelin的杀伤活性；

D.添加HLA-A2-blocking antibody分析细胞毒性受到MHC I限制程度。

图24.EDC-NYESO1刺激产生的特异性CTL细胞杀伤能力分析

A.Western Blot检测NY-ESO-1在FIB、A549/NYESO1dim和A549/A0201/NYESO1中的表达情况；

B.流式分析HLA-A0201表达情况；

C.分析EDC-NYESO1刺激PBMC产生的细胞对FIB和A549/A0201/NYESO1的杀伤活性。

图25.IL-15&CD8α融合蛋白结构示意图

图26.4-1BBL、MICA、IL-15&CD8 Fusion protein慢病毒感染NT树突状细胞(EDC-NTSIGN)株所得多功能NK滋养细胞株(EDC-NK)的流式分析图

图27.失活的EDC-NK刺激PBMC三周制备的NK流式分析图

图28.使用EDC-NK刺激激活PBMC制备NK和NKT的细胞总数扩增曲线

图29.EDC-NK联合细胞因子IL-15RA、OK432、CD52刺激PBMC制备的NK流式分析图

图30.EDC-NK联合细胞因子刺激激活PBMC制备NK和NKT的细胞总数扩增曲线

图31.联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂使用EDC-NK刺激PBMC制备的NK培养14天时对靶细胞A549的细胞毒性检测

图32.联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和细胞因子使用EDC-NK刺激PBMC的后细胞总数扩增曲线

具体实施方式

材料和试剂：

下面结合示例性的实验，进一步说明本发明的技术方案。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例

实施例1.NT基因慢病毒载体的构建

NT病毒载体的构建

将全新设计的NT碱基序列进行人工合成，两端分别设置Xba I和BamH I酶切位点，NT可以是NT1，也可以是NT2。序列如下：

NT-1(SEQ ID No.1)：

全新设计的NT碱基序列可以使得其能够很好的在人免疫细胞中高效的转录和翻译，进而充分实现其生物学活性。

NT-2的结构如图1所示，由顺次连接组成为-Tax2(1-3aa)-Tax1(2-255aa)-T2A-Tax1(227-337aa)-结构，

Tax2(1-3aa)(SEQ ID No.2)：Atggcccac

Tax1(2-255aa)(SEQ ID No.3)：

T2A(SEQ ID No.10)：

Tax1(227-337aa)(SEQ ID No.4)：

用于连接NT基因的慢病毒载体质粒为pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP，如图2所示。

分别使用Xba I和BamH I对pUC57-NT和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP进行双酶切，反应体系如下：

注：Plasmid表示pUC57-NT或pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP。

凝胶电泳检测并回收目的片段，紫外凝胶成像如图3所示。

T4 Ligase连接回收的NT和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP片段，反应体系如下：

将连接产物热击转化到trans 1感受态，孵育1h，并涂板过夜培养；挑取单克隆，接种至LB培养液中，过夜培养后进行质粒提取，双酶切验证质粒大小，验证凝胶电泳，紫外凝胶成像图如图4所示。

实施例2.SIGN病毒载体的构建

将全新设计的SIGN基因碱基序列进行人工合成，两端分别设置Xba I和BamH I酶切位点，序列如下：

SIGN(SEQ ID No.5)：

全新设计的SIGN基因碱基序列可以使得其能够很好的在人免疫细胞中高效的转录和翻译，进而充分实现其生物学活性。

用于连接SIGN基因的慢病毒载体质粒为pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato，如图5所示。

分别使用BamH I和EcoR I对pUC57-SIGN和pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato进行双酶切，反应体系如下：

注：Plasmid表示pUC57-SIGN或pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato。

凝胶电泳检测并回收目的片段，紫外凝胶成像图如图6所示。

T4 Ligase连接回收的SIGN和pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato片段，得到pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato-SIGN，反应体系如下：

将连接产物热击转化到trans 1感受态，孵育1h，并涂板过夜培养；挑取单克隆，接种至LB培养液中，过夜培养后进行质粒提取，双酶切验证质粒大小，酶切后的凝胶电泳验证紫外成像图如图7所示。

实施例3.慢病毒制备

转染前一天，消化293T细胞并传代至

细胞培养皿中，培养基为Opti-MEM(+10％FBS)。37℃培养大约18-24h，细胞融合度大约80％。

将pLP1(Gag/Pol)、pLP2(Rev)、pLP/VSVG(VSV-G)以及pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT四种质粒按1∶1∶1∶1质量比混合均匀，调整浓度为4mg/ul。

分别取920ul Opti-MEM培养基和80ul Lipofectamine3000，混合均匀，作为管一待用。

分别取893ul Opti-MEM培养基和27ul质粒混合物，混匀后加入80ul P3000试剂，混合均匀，作为管二待用。

将管一中的混合物，缓慢加入管二中，充分混匀后室温静置5min。

将混合物加入到待转染细胞中，摇匀后放回培养箱，72h后收获上清，即为病毒原液。

依照上述同样的方法制备pCDH-EF1-MCS-T2A-tdTomato-SIGN质粒对应的慢病毒原液。

实施例4.工程化的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的制备

(1)取10份人外周血，每份50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离外周血中的树突状细胞(DC细胞)；

(3)使用1640无血清培养基重悬分离得到的细胞，调整细胞密度3E+6个/ml，加入到细胞培养瓶中，37℃ 5％CO2条件下孵育1.5-2h，弃去悬浮细胞和培养基，使用培养基洗涤2遍，加入完全培养基1640(含10％FBS或5％人AB血清或5％自体血浆)，并加入IL-4(5ng/ml)，GM-CSF(20ng/ml)；

(4)第1、3、5天每天加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)；

(5)第7天加入实施例3制备得到的NT(NT-1或NT-2)慢病毒颗粒，MOI为20，同时加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养一周，并隔天补加IL-4和GM-CSF；

(6)之后加入IL-2(100U/ml)扩增培养一段时间。

(7)加入TNF-a(10ng/ml)、LPS(10ug/ml)【或Poly(I:C)，25ug/ml】继续培养两天，流式分析细胞表型，结果如图8所示，细胞形态如图9所示。

实施例5.工程化的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的制备

除(3)加入IL-4(10ng/ml)，GM-CSF(5ng/ml)，(6)和(4)第1、3、5天每天加入IL-4(20ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)，(5)加入纳米聚合物(5ug/ml)，(6)加入IL-2(200U/ml，)(7)加入TNF-a(5ng/ml)、LPS(20ug/ml)【或Poly(I:C)，10ug/ml】，其余和实施例4相同。

实施例6.工程化的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的制备

除(3)加入IL-4(20ng/ml)，GM-CSF(40ng/ml)，(6)和(4)第1、3、5天每天加入IL-4(5ng/ml)和GM-CSF(40ng/ml)，(5)加入纳米聚合物(20ug/ml)，(6)加入IL-2(200-U/ml，)(7)加入TNF-a(5ng/ml)、LPS(20ug/ml)【或Poly(I:C)，10ug/ml】，其余和实施例4相同。

流式分析结果表明，使用NT-1和NT-2慢病毒的10份细胞均构建成功，实现了细胞扩增。

使用NT-1和NT-2慢病毒可以实现了MoDC-NT细胞的大量扩增，构建的10份细胞均构建成功，细胞构建成功率约为100％，为临床和科研使用提供足够的细胞。

通过该方案制备的单核细胞来源的MoDC-NT细胞具有典型的树突状细胞的表型，且可以实现多次传代增殖，通过该方案制备的细胞具有更高的纯度，同时该细胞也可进行HLA配型使用，可为某些需要大量抗原提呈细胞但又不能长时间等待的人提供较为充足的自体DC细胞进行抗原提呈。

实施例7.M1多肽特异性CTL细胞的制备

单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的制备方法如实施例4。

(1)取生长状态良好的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株制成2E+6cells/ml悬液，加入M1多肽至终浓度50μg/ml，继续培养48h；

(2)取人(与MoDC-NT同HLA-A，HLA-A0201)外周血50ml，含肝素钠；

(3)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于CTL制备，剩余细胞冻存备用；

(4)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将MoDC-NT/M1∶PBMC按1∶10比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为200U/ml(整个培养过程中需补加IL-2至该浓度)混匀后，放入细胞培养箱培养；

(7)继续培养两周，取少量细胞悬液进行流式检测等质控分析。流式细胞检测结果如图10所示。

实施例8.M1多肽特异性CTL细胞的制备

(1)加入M1多肽至终浓度15μg/ml，(2)取人(与MoDC-NT同HLA-A，HLA-A0201)合肝素钠脐血50ml，(3)使用Ficoll分离CD8+T细胞，抗原-MoDC-NT和CD8+T细胞的比例为1∶500，加入IL-2至终浓度为50U/ml，(7)继续培养一周，其余和实施例5相同。

实施例9.M1多肽特异性CTL细胞的制备

(1)加入M1多肽至终浓度25μg/ml，(2)取人(与MoDC-NT同HLA-A，HLA-A0201)含肝素钠脐血50ml，(3)使用Ficoll分离CD3+T细胞，抗原-MoDC-NT和CD3+T细胞的比例为1∶1000，加入IL-2至终浓度为800U/ml，(7)继续培养三周，其余和实施例5相同。

流式检测结果表明，通过使用一定量负载了M1多肽的MoDC-NT刺激MHC匹配的PBMC制备得到的M1特异性CTL，其CD8+阳性细胞占CD3+CD56-细胞的89.57％，同时CD3+CD56+双阳细胞为3.92％，CD3-CD56+双阳细胞占比为1.70％，其中M1Tetramer-GILGFVFTL阳性细胞占CD3+CD8+双阳性细胞的20.73％，说明该方案可以实现特异性抗原提呈，这样可以在患者体内实现对表达M1特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

实施例10.NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备

(1)取10份人外周血，每份50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC；

(3)使用1640培养基(含10％FBS或5％人AB血清或5％自体血浆)重悬PBMC，调整细胞密度为2E+6cells/ml，加入到细胞培养瓶中，加入免疫细胞激动剂PHA至终浓度为5ug/ml，37℃5％CO2条件下培养24h；

(4)第3天向培养上清中加入IL-2至终浓度100U/ml，继续培养4-5天；

(5)第7天加入NT(NT-1或NT-2)慢病毒颗粒，MOI为20，同时加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养1-2周；

(6)收集细胞，并用PBS洗涤2遍，加入Anti-CD3 antibody磁珠，充分孵育2h，进行磁珠分选，去掉CD3+细胞；

(7)将剩余细胞调整细胞密度为2E+6cells/ml，加入到细胞培养瓶中，继续培养2-3个月，流式分析细胞表型。流式细胞分析结果如图11所示。细胞形态如图12所示。

实施例11.NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备

除了(3)中，加入免疫细胞激动剂变为PMA至终浓度为10ug/ml，(4)中IL-2至终浓度500U/ml，(5)中MOI为10，同时加入聚凝胺(20ug/ml)，(6)中收集细胞，并用PBS洗涤2遍后上流式细胞仪筛选去掉CD3+细胞，其余和实施例6相同。

实施例12.NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备

除了(3)中，加入免疫细胞激动剂变为PMA至终浓度为20ug/ml，(4)中IL-2至终浓度200U/ml，(5)中MOI为15，同时加入纳米聚合物(10ug/ml)，(6)中收集细胞，并用PBS洗涤2遍后上流式细胞仪筛选去掉CD3+细胞，其余和实施例6相同。

结果显示，

NT-1碱基序列使得蛋白可以更好的在细胞中进行表达，使EDC-NT细胞株的构建成功率到达90％；使用NT-1慢病毒的10份细胞中，有一份在培养一个月左右的时候细胞不再增殖，逐渐死亡，其余9份均构建成功，细胞构建成功率约为90％。

NT-2氨基酸序列可以实现EDC-NT细胞多次传代扩增的能力，并且细胞株构建成功率很高，构建成功率可到达100％；使用NT-2慢病毒的10份细胞全部构建成功，细胞构建成功率为100％。

通过该方法制备的NT树突状细胞(EDC-NT)株具有典型树突状细胞的表型，且可以实现长时间传代增殖，可以将需求者的EDC-NT提前准备完成，长期液氮存储，当需要的时候复苏后即可(或短暂扩增培养)使用，且为某些需要大量抗原提呈细胞的人无限量提供充足的自体DC细胞进行抗原提呈，且为一次制备终生使用。同时该细胞也可进行HLA配型使用。

实施例13.功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株的制备

(1)取生长状态良好的EDC-NT细胞，加入实施例2和3方法制备得到的SIGN慢病毒颗粒，MOI为20，同时加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养1周；

(2)取部分感染SIGN病毒后的细胞，重复感染SIGN慢病毒两次，MOI为20，同时加入聚凝胺(10ug/ml)，之后继续培养1周；

(3)收集细胞，并用PBS洗涤2遍，加入Anti-CD209 antibody磁珠，充分孵育后，进行磁珠分选，收集CD209+细胞；

(4)将收集到的细胞密度调整为2E+6cells/ml，加入到细胞培养瓶中，继续培养1-2周，流式分析产生的EDC-NTSIGN，结果如图13所示。

实施例14.功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株的制备

除了(1)和(2)中的聚凝胺(10ug/ml)变更为纳米聚合物(20ug/ml)，(3)Anti-CD209 antibody磁珠孵育筛选改为流式细胞仪筛选收集CD209+细胞，其余和实施例13相同。

流式结果表明，

EDC-NT细胞转入SIGN基因制备的EDC-NTSIGN细胞株具有典型的DC表型，可启动DC与幼稚T细胞的相互作用，这种功能通过DC-SIGN结合另外一种细胞配体ICAM-3而实现，该配体在幼稚T细胞表面高水平表达；该细胞株高表达DC-SIGN，可以实现更好的信号传导，有利于激活T细胞和NK细胞，使得DC-CTL的扩增效率提高，抗原特异性CTL同样提高，更大数量的效应细胞，更易满足临床应用，减少患者大量采血带来的痛苦，增加患者治愈的可能性，使临床应用可能性进一步提高。

实施例15.NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株激活效应细胞

(1)取人外周血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于效应细胞制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将EDC-NTSIGN按1∶100比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为500U/ml(整个培养过程中需补加IL-2至该浓度)，混匀后，放入细胞培养箱培养，基础培养液为X VIVO-15+10％FBS；

(4)连续培养细胞三周，取少量细胞悬液进行流式检测等质控分析。细胞增殖曲线如图14所示。

结果表明，相比EDC-NT细胞，EDC-NTSIGN细胞可以更好的激活效应细胞(T细胞、NK细胞)，21天的培养周期，细胞总数提高了33.23％，更大数量的效应细胞，更易满足临床应用，减少患者大量采血带来的痛苦，增加患者治愈的可能性。

实施例16.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201/1101/2402)株的制备

(1)取生长状态良好的EDC-NTSIGN细胞悬液；

(2)同时加入携带HLA-A0201(如SEQ ID No.6所示)、HLA-A1101(如SEQ ID No.7所示)和HLA-A2402(如SEQ ID No.8所示)基因序列的慢病毒颗粒，MOI均为20，并加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养1周；

(3)继续重复步骤(2)两次；

(4)将细胞稀释后分至96孔板进行单克隆细胞筛选，培养后测定流式分析DC，结果过如图15所示。

HLA-A0201(SEQ ID No.6)：

HLA-A1101(HA-Tag)(SEQ ID No.7)：

HLA-A2402(SEQ ID No.8)：

结果表明，多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：DC-A0201/1101/2402)株同时具有HLA-A0201、HLA-A1101和HLA-A2402这三种在华人中占比最高的MHC I类分子，也可以是其他HLA亚型，该细胞可用于给含有对应MHC I分子之一的细胞进行体外抗原提呈，使大规模靶向特异性CTL的生产成为可能。

实施例17.功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201)株的制备

除了(2)加入携带HLA-A0201(如SEQ ID No.6所示)基因序列的慢病毒颗粒，MOI为10，并加入纳米聚合物(20ug/ml)，继续培养2周，(4)筛选方法为用PBS洗涤2遍，加入Anti-HLA-A02 antibody磁珠，充分孵育后，进行磁珠分选，收集EDC-NTA0201细胞；其余和实施例16相同。

实施例18.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A1101)株的制备

除了(2)加入携带HLA-A1101(如SEQ ID No.7所示)基因序列的慢病毒颗粒，MOI为10，并加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养3周，(4)筛选方法为用PBS洗涤2遍，加入anti-tagantibody流式抗体，充分孵育后，上流式细胞仪分选，收集EDC-NTA1101细胞；其余和实施例16相同。

实施例19.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201/1101)株的制备

除了(2)加入分别携带HLA-A0201(如SEQ ID No.6所示)和HLA-A1101(如SEQ IDNo.7所示)基因序列的慢病毒颗粒，其余和实施例16相同。

实施例20.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A0201/2402)株的制备

除了(2)加入分别携带HLA-A0201(如SEQ ID No.6所示)和HLA-A2402(如SEQ IDNo.8所示)基因序列的慢病毒颗粒，其余和实施例16相同。

实施例21.多功能NT树突状细胞(EDC-NTA，即：EDC-NT-A1101/2402)株的制备

除了(2)加入分别携带HLA-A1101(如SEQ ID No.7所示)和HLA-A2402(如SEQ IDNo.8所示)基因序列的慢病毒颗粒，其余和实施例16相同。

实施例22.Mesothelin慢病毒颗粒、CEA慢病毒颗粒和NY-ESO-1慢病毒颗粒的制备

如实施例2和实施例3所示的方法，将全新设计的Mesothelin、CEA、NY-ESO-1碱基序列进行人工合成，通过设计IκBα的全新序列，将新序列与抗原基因经人工合成重组病毒载体，两端分别设置Xba I和BamH I酶切位点，用于连接三种抗原基因的慢病毒载体质粒为pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro，如图16所示。经四质粒系统制备慢病毒。

除了将pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT分别替换为质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-Mesothelin目的抗原、pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-CEA目的抗原、pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-NY-ESO-1目的抗原，其余与实施例3相同。

(1)目的抗原核酸序列结构IκBα(1-48aa)-Mesothelin-IκBα(281-317aa)，除了将pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT替换为质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-IκBα(1-48aa)-Mesothelin-IκBα(281-317aa)，其余与实施例3相同。

(2)目的抗原核酸序列结构IκBα(1-317aa)-T2A-CEA，除了将pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT替换为质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-IκBα(1-317aa)-T2A-CEA，其余与实施例3相同。

(3)目的抗原核酸序列结构IκBα(1-48aa)-NYESO1 mini基因-IκBα(281-317aa)，除了将pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-NT替换为质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-IκBα(1-48aa)-NYESO1-mini基因-IκBα(281-317aa)，其余与实施例3相同。

目的抗原核酸序列结构式为：(1)所述组合基因的结构选自通式IκBα(1-48aa)-抗原基因-IκBα(281-317aa)、IκBα(1-317aa)-T2A-抗原基因、IκBα(1-48aa)-抗原肽mini基因-IκBα(281-317aa)和IκBα(1-317aa)-T2A-抗原肽mini基因中的一种。

Mesothelin、CEA和NY-ESO-1的序列机构式如图17、图18和图19所示。IκBα、Mesothelin、CEA和NY-ESO-1的抗原序列分别如SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示。

IκBα(SEQ ID No.9)：

T2A(SEQ ID No.10)：

Mesothelin(SEQ ID No.11)：

CEA(SEQ ID No.12)：

NY-ESO-1(SEQ ID No.13)：

抗原肽mini基因的氨基酸序列是多个-抗原多肽-AYY-的重复连接序列，所述AYY的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示：GCTTACTAC。

通过设计IκBα的全新序列，将新序列与抗原基因经人工合成后制备慢病毒，将基因转入MoDC-NT或EDC-NT或EDC-NTSIGN，可实现抗原细胞内降解后的抗原提呈。

实施例23.Mesothelin特异性多功能树突状细胞(EDC-Mesothelin)株的制备

(1)取生长状态良好的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)悬液；

(2)同时加入实施例22得到的Mesothelin慢病毒颗粒，MOI均为20，并加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养1周；

(3)继续重复步骤(2)两次；

(4)向细胞培养液中加入puromycin至终浓度为5ug/ml，连续加压培养一周。

(5)撤掉puromycin后，继续扩大培养，备用。

结果表明，通过使用IκBα可以促进Mesothelin在细胞内快速降解，并被MHC I类分子提呈，该细胞株的构建可以用于制备Mesothelin特异性CTL，为Mesothelin阳性肿瘤患者的治疗提供一种崭新的选择。

实施例24.CEA特异性多功能树突状细胞(EDC-CEA)株的制备

(1)取生长状态良好的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)悬液；

(2)同时加入实施例22得到的CEA慢病毒颗粒，MOI均为20，并加入纳米聚合物(20ug/ml)，继续培养2周；

(3)继续重复步骤(2)两次；

(4)向细胞培养液中加入puromycin至终浓度为8ug/ml，连续加压培养一周。

(5)撤掉puromycin后，继续扩大培养，备用。

结果表明，通过使用IκBα可以促进CEA在细胞内快速降解，并被MHC I类分子提呈，该细胞株的构建可以用于制备CEA特异性CTL，为CEA阳性肿瘤患者的治疗提供一种崭新的选择。

实施例25.NY-ESO-1特异性多功能树突状细胞(EDC-NYESO1)株的制备

(1)取生长状态良好的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)悬液；

(2)同时加入实施例22得到的NY-ESO-1慢病毒颗粒，MOI均为20，并加入聚凝胺(20ug/ml)，继续培养1周；

(3)继续重复步骤(2)两次；

(4)向细胞培养液中加入puromycin至终浓度为10ug/ml，连续加压培养一周。

(5)撤掉puromycin后，继续扩大培养，备用。。

结果表明，通过使用IκBα可以促进NY-ESO-1在细胞内快速降解，并被MHC I类分子提呈，该细胞株的构建可以用于制备NY-ESO-1特异性CTL，为NY-ESO-1阳性肿瘤患者的治疗提供一种崭新的选择。

实施例26.EGFR特异性多功能树突状细胞(EDC-EGFR)株的制备

除了(2)NY-ESO-1慢病毒颗粒改为EGFR慢病毒颗粒，其余与实施例25相同。

实施例27.CA153特异性多功能树突状细胞(EDC-CA153)株的制备

除了(2)NY-ESO-1慢病毒颗粒改为CA153慢病毒颗粒，其余与实施例25相同。

实施例28.MAGEA3特异性多功能树突状细胞(EDC-MAGEA3)株的制备

除了(2)NY-ESO-1慢病毒颗粒改为β2-MG慢病毒颗粒，其余与实施例25相同。

实施例29.Mesothelin特异性CTL细胞的制备

(1)取人(HLA-A0201)外周血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离的CD3+T细胞，其中一部分细胞用于CTL制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将CD3+T细胞稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将EDC-Mesothelin按1∶1000比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为200U/ml(整个培养过程中需每天补加IL-2至该浓度)混匀后，放入细胞培养箱培养；

(4)细胞培养第7天，按1∶200加EDC-Mesothelin至培养瓶中，继续培养两周，取少量细胞悬液进行流式检测等质控分析。结果如图20所示。

结果表明，通过使用一定量的EDC-Mesothelin刺激MHC I类分子匹配的PBMC制备得到的Mesothelin特异性CTL，其CD3+CD8+双阳性细胞高到89.57％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达17.10％，CD3-CD56+细胞占比为4.30％，这样可以在患者体内实现对表达Mesothelin特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

实施例30.CEA特异性CTL细胞的制备

(1)取人(HLA-A0201)外周血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离的CD8+T细胞，其中一部分细胞用于CTL制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将CD8+T细胞稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将EDC-CEA按1∶100比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为200U/ml(整个培养过程中需每天补加IL-2至该浓度)混匀后，放入细胞培养箱培养；

(4)细胞培养第7天，按1∶200加EDC-CEA至培养瓶中，继续培养一周，取少量细胞悬液进行流式检测等质控分析。结果如图21所示。

结果表明，通过使用一定量的EDC-CEA刺激MHC I类分子匹配的PBMC制备得到的CEA特异性CTL，其CD3+CD8+双阳性细胞高到86.86％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达23.85％，CD3-CD56+细胞占比为3.64％，这样可以在患者体内实现对表达CEA特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

实施例31.NY-ESO-1特异性CTL细胞的制备

(1)取人(HLA-A0201)脐血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于CTL制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将EDC-NYESO1按1∶10比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为200U/ml(整个培养过程中需每天补加IL-2至该浓度)混匀后，放入细胞培养箱培养；

(4)继续培养三周，取少量细胞悬液进行流式检测等质控分析。结果如图22所示。

结果表明，通过使用一定量的EDC-NYESO1刺激MHC I类分子匹配的PBMC制备得到的NY-ESO-1特异性CTL，其CD3+CD8+双阳性细胞高到89.74％，同时CD3+CD56+双阳性细胞占比也可以到达14.39％，CD3-CD56+细胞占比为2.34％，这样可以在患者体内实现对表达NY-ESO-1特异性抗原的肿瘤杀伤的同时，还可以对患者体内其他一些没有该特异性抗原但发生病变的细胞进行杀伤，进而实现提前预防的作用。

可以是PBMC起始，也可以是CD3+T或CD8+T起始。

实施例32.EDC-Mesothelin刺激产生的特异性CTL细胞杀伤能力分析

选择金美泰生物科技河北有限公司提供的人成纤维细胞(FIB)(HLA-A01:01 A33:03)作为阴性对照，并将HLA-A0201通过慢病毒转染至FIB得到FIB/A0201。进一步通过慢病毒将Mesothelin转染至FIB/A0201得到FIB/A0201/Mesothelin，Western Blot检测Mesothelin在FIB和FIB/A0201/Mesothelin中的表达情况结果如图23A所示；流式分析HLA-A0201表达情况图23B所示；并分析EDC-Mesothelin刺激PBMC产生的细胞对FIB/A0201和FIB/A0201/Mesothelin的杀伤活性图23C所示；同时通过添加HLA-A2-blocking antibody分析细胞毒性受到MHC I限制程度，结果如图23D所示。

Wstern blot检测结果显示通过慢病毒转染到FIB细胞内的Mesothelin能够在细胞内的成功表达，而不转染Mesothelin的FIB细胞不表达；流式结果显示通过慢病毒转染到FIB细胞内的HLA-A0201能在细胞内成功表达且能够转运至细胞膜表面；细胞杀伤结果显示EDC-AFPMesothelin刺激PBMC产生的CTL细胞能够特异性杀伤表达Mesothelin抗原的靶细胞；Anti-HLA A2抗体阻断实验显示EDC-Mesothelin刺激PBMC产生的CTL细胞对表达Mesothelin抗原靶细胞的杀伤受MHC I类分子限制。

实施例33.EDC-NYESO1刺激产生的特异性CTL细胞杀伤能力分析

选择金美泰生物科技河北有限公司提供的人成纤维细胞(FIB)(HLA-A01:01 A33:03)作为阴性对照，将HLA-A0201和NY-ESO-1依次通过慢病毒转染至HLA-A0201阴性细胞A549/NYESO1^dim，Western Blot检测NY-ESO-1在FIB、A549/NYESO1^dim和A549/A0201/NYESO1中的表达情况结果如图24A所示；流式分析HLA-A0201表达情况如果24B所示；并分析EDC-NYESO1刺激PBMC产生的细胞对FIB和A549/A0201/NYESO1的杀伤活性如果24C所示。

Wstern blot检测结果显示A549/NYESO1^dim细胞低表达NY-ESO-1，而通过慢病毒转染后A549/NYESO1^dim细胞内的NY-ESO-1表达明显增强，而对照组细胞FIB细胞不表达NY-ESO-1；流式结果显示通过慢病毒转染到A549细胞内的HLA-A0201能在细胞内成功表达且能够转运至细胞膜表面；细胞杀伤结果显示EDC-NYESO1刺激PBMC产生的细胞能在不受MHC I类分子限制的情况下对A459/NYESO1^dim细胞进行有效的杀伤，这主要是其中的NK和NKT在发挥作用；而在解除CTL的MHC I类分子限制并加强A549/NYESO1^dim表达NY-ESO-1特异性抗原的情况下EDC-NYESO1刺激PBMC产生的CTL细胞能够进一步加强对靶细胞的杀伤作用，表现为对A549/A0201/NYESO1更强的杀伤活性。

实施例34.多功能NK滋养细胞株(EDC-NK)的制备

(1)取生长状态良好的NT树突状细胞(EDC-NTSIGN)株悬液；

(2)同时加入4-1BBL(如SEQ ID No.14所示)、MICA(如SEQ ID No.15所示)、IL-15Mat-peptide(如SEQ ID No.17所示)&Hinge/TM CD8(如SEQ ID No.18所示)融合蛋白慢病毒颗粒，(IL-15&CD8α融合蛋白结构如图25所示)，MOI均为20，并加入聚凝胺(10ug/ml)，继续培养1周；

(3)继续重复步骤(2)两次；

(4)将细胞稀释后分至96孔板进行单克隆细胞筛选，培养后测定流式分析DC，结果如图26所示。

4-1BBL(SEQ ID No.14)：

MICA(SEQ ID No.15)：

IL-15&CD8αFusion protein：

信号肽(SEQ ID No.16)：

IL-15Mat-peptide(SEQ ID No.17)：

Hinge/TM CD8(SEQ ID No.18)：

结果表明，EDC-NTSIGN细胞可转入4-1BBL、MICA、IL-15&CD8 Fusion protein基因成功制备EDC-NK细胞，4-1BBL与NK细胞激活性受体4-1BB相互作用可以修复NK细胞反应性，MICA是激活人NK细胞广泛表达的激活性受体NKG2D的配体，IL-15可以促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞，明显上调其NK细胞的比例，且NK细胞亚群分布由CD56dim为主转变成CD56bright细胞为主。成功构建EDC-NK可以为NK细胞的制备提供一种新的选择方案，且该方案的出现可以使NK细胞制备过程中提前用抗原刺激EDC-NK，产生具有抗原特异性的细胞。且可能成为替代目前临床上使用的K562滋养细胞进行NK细胞的生产。

实施例35.多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的失活处理

(1)取生长状态良好的EDC-NK细胞，调整细胞密度为2E+6cells/ml，将细胞悬液放置于细胞培养瓶中；

(2)将细胞悬液交由北京鸿仪四方辐射技术股份有限公司实验室进行辐照处理，使用Co60 BFT-II型(2#)辐照装置，采取环装轨道分次照射进行辐照处理，细胞悬液吸收剂量为：Dmin＝19.85kGy。

(3)检测方法为：GB/T 15053-2008《使用辐射显色薄膜和聚甲基丙烯酸甲酯剂量测量系统测量吸收剂的标准方法》。

(4)取回辐照结束的细胞悬液，离心收集细胞后进行细胞冻存，冻存密度为1E+7个/ml，冻存液为GMP级细胞冻存液，采取程序降温进行冻存。

(5)辐照完的细胞可直接使用，亦可将冻存细胞复苏后使用。

分析，经过辐照处理后的EDC-NK细胞属于灭活的细胞，不能再进一步增殖，但是保持了原有的胞内结构和表面分子结构，这样就保留了它的抗原提呈能力，不影响它对T细胞和NK细胞的激活能力，更加有利于临床应用的安全性。或者将细胞用多聚甲醛等组织细胞固定液固定或者其他能够使细胞失去增殖活性的处理方式处理细胞，但细胞可保持其功能和应用安全性。可作为疫苗或细胞制剂进行临床使用或科研使用。

实施例36.NK细胞的制备

(1)取人外周血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于NK制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将(辐照或未辐照)EDC-NK按1∶50比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为500U/ml(整个培养过程中需每次补液时补加IL-2至该浓度)混匀后，放入细胞培养箱培养，基础培养液为X VIVO-15+10％FBS；

(4)连续培养细胞三周，取少量细胞悬液进行流式检测，结果如图27所示。

使用EDC-NK刺激激活PBMC得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)培养21天细胞扩增曲线如图28所示。

结果表明，EDC-NK可以刺激激活PBMC特异性扩增NK细胞亚群，得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)，分别占比81.11％和4.45％，培养21天细胞扩增253倍，该方法作为一种NK细胞制备的新型方案使用。

实施例37.EDC-NK联合细胞因子进行NK细胞的制备

(1)取和EDC-NK具有相同HLA-A的人外周血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于NK制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将(辐照或未辐照)EDC-NK按1∶50比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为500U/ml(整个培养过程中需每次补液时补加IL-2至该浓度)，加入IL-15RA终浓度为20ng/ml，OK432终浓度0.2KE/ml，CD52终浓度10ug/ml，混匀后，放入细胞培养箱培养，培养7天之后，继续补充只有IL-2的基础培养液，基础培养液为X VIVO-15+10％FBS。

(4)连续培养细胞三周，取少量细胞悬液进行流式检测，结果如图29所示。

联合细胞因子使用EDC-NK刺激激活PBMC可以得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)，培养21天细胞扩增曲线如图30所示。

结果表明，EDC-NK联合细胞因子IL-15RA、OK432、CD52、IL-2刺激激活PBMC特异性扩增NK细胞亚群，得到的NK(CD3-CD56+)和NKT(CD3+CD56+)，分别占比95.43％和0.86％，培养21天细胞扩增394倍。进一步提高的NK纯度和细胞扩增倍数，可作为一种NK细胞制备的新型方案使用。

实施例38.联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂进行NK细胞的制备

(1)取和EDC-NK具有不同HLA-A的人脐带血50ml，含肝素钠；

(2)使用Ficoll分离PBMC，其中一部分细胞用于NK制备，剩余细胞冻存备用；

(3)将PBMC稀释成2E+6cells/ml悬液，接种至细胞培养瓶中，将(辐照或未辐照)EDC-NK按1∶50比例加入培养瓶中，同时加入IL-2至终浓度为500U/ml(整个培养过程中需每次补液时补加IL-2至该浓度)，加入IL-15RA终浓度为20ng/ml，OK432终浓度0.2KE/ml，CD52终浓度10ug/ml；

(4)将细胞分成三组，第一组不加抑制剂；第二组加入EPZ005687终浓度2.5uM；第三组加入UNC1999终浓度2.5uM混匀后，放入细胞培养箱培养，培养7天之后，继续补充只有IL-2的基础培养液，基础培养液为X VIVO-15+10％FBS；

(5)连续培养细胞两周，取少量细胞悬液进行流式检测，培养14天时取样检测细胞针对靶细胞A549的杀伤能力(E∶T＝10∶1)，结果如图31所示。联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂使用EDC-NK刺激PBMC进行NK细胞制备的流式结果如表1所示。联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和细胞因子使用EDC-NK刺激激活PBMC，21天培养周期细胞扩增曲线图如图32所示。

表1.个细胞亚群占母群细胞百分比

结果表明，联合组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和细胞因子使用EDC-NK刺激激活PBMC可以更好的激活NK(CD3-CD56+)，提高其占比；同时NKG2D+CD56+双阳细胞亚群占比也随着加入EZH2抑制剂而提高；加入EZH2抑制剂后效应细胞对靶细胞的杀伤能力也明显提高；21天培养培养周期中抑制剂对细胞扩增效率几乎没有影响。

以上实施例验证结果表明，通过设计新的基因序列、制备慢病毒、感染免疫细胞来获得细胞株，进一步用细胞株或联合细胞因子刺激PBMC，依次获得的单核细胞来源的树突细胞方法(MoDC-NT)株、工程化的NT树突细胞(EDC-NT)、功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株、多功能NT树突状细胞(EDC-NTA细胞)、靶抗原特异性多功能树突状细胞、靶抗原特异性CTL、工程化的多功能NK滋养细胞及NK细胞。本发明的新型免疫细胞制备方法成功制备了多种工程化功能细胞株和免疫细胞。

本发明提供了一种新型免疫细胞的制备方法及其应用，涉及免疫细胞领域，特别涉及DNA分子、含有该DNA分子的病毒载体和细胞的制备、具有抗原提呈能力的细胞改造及应用、具有NK刺激能力的细胞改造及应用。

本发明将哺乳动物外周血中的细胞通过慢病毒进行基因改造，使之成为具有抗原提呈能力和激活扩增自然杀伤细胞能力的细胞。该细胞进一步基因改造后能够实现更好的跨膜转移、抗原提呈和自然杀伤细胞的激活。该细胞经过基因改造后可以通过抗原负载或抗原基因转染的形式提呈抗原信息。该细胞经过基因改造后可以向更多HLA类型的单个核细胞提呈抗原信息。该细胞经过基因改造后可以诱导刺激单个核细胞扩增并分化成自然杀伤细胞，经过辐照或多聚甲醛等组织细胞固定液或细胞灭活剂处理后的失去增殖活力的细胞仍保持有该功能。该细胞经过基因改造后可以刺激单个核细胞扩增并分化成对表达特定抗原信息的细胞具有特异性杀伤功能的细胞毒性T淋巴细胞，该细胞经过基因改造后也可以激活扩增自然杀伤细胞，该细胞经过基因改造后与不同细胞因子共同激活扩增单个核细胞可以得到更大量的自然杀伤细胞，该细胞经过基因改造后在添加组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂的情况下与细胞因子共同激活扩增单个核细胞可以提高效应细胞中自然杀伤细胞占比，可以调控表观遗传改变自然杀伤细胞的受体和配体表达，同时可以提高效应细胞的细胞毒性。本发明制备的具有抗原提呈能力和自然杀伤细胞激活扩增能力的细胞具有多代次扩增能力，可以进行多次基因改造。本发明可以制备针Mesothelin、CEA、NY-ESO-1或其他抗原特异性的抗原提呈细胞、CTL细胞和应用方法。本发明可以大规模制备高纯度高细胞毒性的自然杀伤细胞和应用方法。对这些细胞和使用方法在肿瘤和传染性疾病的预防和治疗方面具有广阔的应用前景。

本发明改善了DC细胞体外生长潜能、提高DC抗原提呈能力和激活CTL、NK细胞能力，极大地促进了细胞免疫治疗医学实践的进步，具有广阔的产业化前景和商业空间。

序列表

<110> 侯利

<120> 一种新型免疫细胞的制备方法及其应用

<130> 210811

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1009

<212> DNA

<213> designed

<400> 1

gctctagaat ggcccacttc cccggcttcg gccagagcct gctgtacggc taccccgtgt 60

acgtgttcgg caactgcgtg caggccgact ggtgccccgt gagcggcggc ctgtgcagca 120

cccgcctgca ccgccacgcc ctgctggcca cctgccccga gcaccagctg acctgggacc 180

ccatcgacgg ccgcgtggtg agcagccccc tgcagtacct gatcccccgc ctgcccagct 240

tccccaccca gcgcaccagc cgcaccctga aggtgctgac cccccccacc acccccgtga 300

gccccaaggt gccccccgcc ttcttccaga gcatgcgcaa gcacaccccc taccgcaacg 360

gctgcctgga gcccaccctg ggcgaccagc tgcccagcct ggccttcccc gagcccggcc 420

tgcgccccca gaacatctac accacctggg gcaagaccgt ggtgtgcctg tacctgtacc 480

agctgagccc ccccatgacc tggcccctga tcccccacgt gatcttctgc cacccccgcc 540

agctgggcgc cttcctgacc aaggtgcccc tgaagcgcct ggaggagctg ctgtacaaga 600

tgttcctgca caccggcgcc gtgatcgtgc tgcccgagga cgacctgccc accaccatgt 660

tccagcccgt gcgcgccccc tgcatccaga ccgcctggtg caccggcctg ctgccctacc 720

acagcatcct gaccaccccc ggcctgatct ggaccttcaa cgacggcagc cccatgatca 780

gcggcccctg ccccaaggcc ggccagccca gcctggtggt gcagagcagc ctgctgatct 840

tcgagaagtt ccagaccaag gccttccacc ccagctacct gctgagccac cagctgatcc 900

agtacagcag cttccacaac ctgcacctgc tgttcgacga gtacaccaac atccccgtga 960

gcatcctgtt caacaaggag gaggccgacg acaacggcga cggatcccg 1009

<210> 2

<211> 9

<212> DNA

<213> designed

<400> 2

atggcccac 9

<210> 3

<211> 762

<212> DNA

<213> designed

<400> 3

ttccccggct tcggccagag cctgctgttc ggctaccccg tgtacgtgtt cggcgactgc 60

gtgcagggcg actggtgccc catcagcggc ggcctgtgca gcgcccgcct gcaccgccac 120

gccctgctgg ccacctgccc cgagcaccag atcacctggg accccatcga cggccgcgtg 180

atcggcagcg ccctgcagtt cctgatcccc cgcctgccca gcttccccac ccagcgcacc 240

agcaagaccc tgaaggtgct gacccccccc atcacccaca ccacccccaa catccccccc 300

agcttcctgc aggccgtgcg caagtacagc cccttccgca acggctacat ggagcccacc 360

ctgggccagc acctgcccac cctgagcttc cccgaccccg gcctgcgccc ccagaacctg 420

tacaccctgt ggggcggcag cgtggtgtgc atgtacctgt accagctgag cccccccatc 480

acctggcccc tgctgcccca cgtggtgttc tgccaccccg gccagctggg cgccttcctg 540

accaacgtgc cctacaagcg catcgaggag ctgctgtaca agatcagcct gaccaccggc 600

gccctgatca tcctgcccga ggactgcctg cccaccaccc tgttccagcc cgtgcgcgcc 660

cccgtgaccc tgaccgcctg gcagcacggc ctgctgccct tccacagcac cctgaccacc 720

cccggcctga tctggacctt caccgacggc acccccatga tc 762

<210> 4

<211> 333

<212> DNA

<213> designed

<400> 4

gcctggcagc acggcctgct gcccttccac agcaccctga ccacccccgg cctgatctgg 60

accttcaccg acggcacccc catgatcagc ggcccctgcc ccaaggacgg ccagcccagc 120

ctggtgctgc agagcagcag cttcatcttc cacaagttcc agaccaaggc ctaccacccc 180

agcttcctgc tgagccacgg cctgatccag tacagcagct tccacaacct gcacctgctg 240

ttcgaggagt acaccaacat ccccatcagc ctgctgttca acgagaagga ggccgacgac 300

aacgaccacg agccccagat cagccccggc gag 333

<210> 5

<211> 1231

<212> DNA

<213> designed

<400> 5

cgggatccat gagcgacagc aaggagcccc gcctgcagca gctgggcctg ctggaggagg 60

agcagctgcg cggcctgggc ttccgccaga cccgcggcta caagagcctg gccggctgcc 120

tgggccacgg ccccctggtg ctgcagctgc tgagcttcac cctgctggcc ggcctgctgg 180

tgcaggtgag caaggtgccc agcagcatca gccaggagca gagccgccag gacgccatct 240

accagaacct gacccagctg aaggccgccg tgggcgagct gagcgagaag agcaagctgc 300

aggagatcta ccaggagctg acccagctga aggccgccgt gggcgagctg cccgagaaga 360

gcaagctgca ggagatctac caggagctga cccgcctgaa ggccgccgtg ggcgagctgc 420

ccgagaagag caagctgcag gagatctacc aggagctgac ctggctgaag gccgccgtgg 480

gcgagctgcc cgagaagagc aagatgcagg agatctacca ggagctgacc cgcctgaagg 540

ccgccgtggg cgagctgccc gagaagagca agcagcagga gatctaccag gagctgaccc 600

gcctgaaggc cgccgtgggc gagctgcccg agaagagcaa gcagcaggag atctaccagg 660

agctgacccg cctgaaggcc gccgtgggcg agctgcccga gaagagcaag cagcaggaga 720

tctaccagga gctgacccag ctgaaggccg ccgtggagcg cctgtgccac ccctgcccct 780

gggagtggac cttcttccag ggcaactgct acttcatgag caacagccag cgcaactggc 840

acgacagcat caccgcctgc aaggaggtgg gcgcccagct ggtggtgatc aagagcgccg 900

aggagcagaa cttcctgcag ctgcagagca gccgcagcaa ccgcttcacc tggatgggcc 960

tgagcgacct gaaccaggag ggcacctggc agtgggtgga cggcagcccc ctgctgccca 1020

gcttcaagca gtactggaac cgcggcgagc ccaacaacgt gggcgaggag gactgcgccg 1080

agttcagcgg caacggctgg aacgacgaca agtgcaacct ggccaagttc tggatctgca 1140

agaagagcgc cgccagctgc agccgcgacg aggagcagtt cctgagcccc gcccccgcca 1200

cccccaaccc cccccccgcc taagaattcc g 1231

<210> 6

<211> 1095

<212> DNA

<213> designed

<400> 6

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60

cagacctggg cgggctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt 240

ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 300

gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccgtccag 360

aggatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac tggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagttg 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcatatga ctcaccacgc tgtctctgac 660

catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900

tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020

ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtg 1095

<210> 7

<211> 1128

<212> DNA

<213> designed

<400> 7

atggccgtca tggcgccccg aaccctcctc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60

cagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttctaca cctccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240

ccggagtatt gggaccagga gacacggaat gtgaaggccc agtcacagac tgaccgagtg 300

gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg acggttctca caccatccag 360

ataatgtatg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcttcc tccgcgggta ccggcaggac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcag ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgcggc ggagcagcag 540

agagcctacc tggagggccg gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660

catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagctg 900

tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgccgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020

ggagggagtt acactcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtgggatc ctatccatat gatgttccag attacgct 1128

<210> 8

<211> 1095

<212> DNA

<213> designed

<400> 8

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60

cagacctggg caggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240

ccggagtatt gggacgagga gacagggaaa gtgaaggccc actcacagac tgaccgagag 300

aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccctccag 360

atgatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcgg ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagcag 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggac gggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660

catgaggcca ctctgagatg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc ttgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtac cttctggaga ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900

tcttcccagc ccaccgtccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaacagctc agatagaaaa 1020

ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtg 1095

<210> 9

<211> 951

<212> DNA

<213> designed

<400> 9

atgttccagg ccgccgagcg cccccaggag tgggccatgg agggcccccg cgacggcctg 60

aagaaggagc gcctgctgga cgaccgccac gacagcggcc tggacagcat gaaggacgag 120

gagtacgagc agatggtgaa ggagctgcag gagatccgcc tggagcccca ggaggtgccc 180

cgcggcagcg agccctggaa gcagcagctg accgaggacg gcgacagctt cctgcacctg 240

gccatcatcc acgaggagaa ggccctgacc atggaggtga tccgccaggt gaagggcgac 300

ctggccttcc tgaacttcca gaacaacctg cagcagaccc ccctgcacct ggccgtgatc 360

accaaccagc ccgagatcgc cgaggccctg ctgggcgccg gctgcgaccc cgagctgcgc 420

gacttccgcg gcaacacccc cctgcacctg gcctgcgagc agggctgcct ggccagcgtg 480

ggcgtgctga cccagagctg caccaccccc cacctgcaca gcatcctgaa ggccaccaac 540

tacaacggcc acacctgcct gcacctggcc agcatccacg gctacctggg catcgtggag 600

ctgctggtga gcctgggcgc cgacgtgaac gcccaggagc cctgcaacgg ccgcaccgcc 660

ctgcacctgg ccgtggacct gcagaacccc gacctggtga gcctgctgct gaagtgcggc 720

gccgacgtga accgcgtgac ctaccagggc tacagcccct accagctgac ctggggccgc 780

cccagcaccc gcatccagca gcagctgggc cagctgaccc tggagaacct gcagatgctg 840

cccgagagcg aggacgagga gagctacgac accgagagcg agttcaccga gttcaccgag 900

gacgagctgc cctacgacga ctgcgtgttc ggcggccagc gcctgaccct g 951

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> designed

<400> 10

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54

<210> 11

<211> 1761

<212> DNA

<213> designed

<400> 11

atgctggctg gagagacagg gcaggaggct gcgcccctgg acggagtcct ggccaaccca 60

cctaacattt ccagcctctc ccctcgccaa ctccttggct tcccgtgtgc ggaggtgtcc 120

ggcctgagca cggagcgtgt ccgggagctg gctgtggcct tggcacagaa gaatgtcaag 180

ctctcaacag agcagctgcg ctgtctggct caccggctct ctgagccccc cgaggacctg 240

gacgccctcc cattggacct gctgctattc ctcaacccag atgcgttctc ggggccccag 300

gcctgcaccc gtttcttctc ccgcatcacg aaggccaatg tggacctgct cccgaggggg 360

gctcccgagc gacagcggct gctgcctgcg gctctggcct gctggggtgt gcgggggtct 420

ctgctgagcg aggctgatgt gcgggctctg ggaggcctgg cttgcgacct gcctgggcgc 480

tttgtggccg agtcggccga agtgctgcta ccccggctgg tgagctgccc gggacccctg 540

gaccaggacc agcaggaggc agccagggcg gctctgcagg gcgggggacc cccctacggc 600

cccccgtcga catggtctgt ctccacgatg gacgctctgc ggggcctgct gcccgtgctg 660

ggccagccca tcatccgcag catcccgcag ggcatcgtgg ccgcgtggcg gcaacgctcc 720

tctcgggacc catcctggcg gcagcctgaa cggaccatcc tccggccgcg gttccggcgg 780

gaagtggaga agacagcctg tccttcaggc aagaaggctc ccgagataga cgagagcctc 840

atcttctaca agaagtggga gctggaagcc tgcgtggatg cggccctgct ggccacccag 900

atggaccgcg tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtcct aaagcataaa 960

ctggatgagc tctacccaca aggttacccc gagtctgtga tccagcacct gggctacctc 1020

ttcctcaaga tgagccctga ggacattcgc aagtggaatg tgacgtccct ggagaccctg 1080

aaggctttgc ttgaagtcaa caaagggcac gaaatgagtc ctcaggtggc caccctgatc 1140

gaccgctttg tgaagggaag gggccagcta gacaaagaca ccctagacac cctgaccgcc 1200

ttctaccctg ggtacctgtg ctccctcagc cccgaggagc tgagctccgt gccccccagc 1260

agcatctggg cggtcaggcc ccaggacctg gacacgtgtg acccaaggca gctggacgtc 1320

ctctatccca aggcccgcct tgctttccag aacatgaacg ggtccgaata cttcgtgaag 1380

atccagtcct tcctgggtgg ggcccccacg gaggatttga aggcgctcag tcagcagaat 1440

gtgagcatgg acttggccac gttcatgaag ctgcggacgg atgcggtgct gccgttgact 1500

gtggctgagg tgcagaaact tctgggaccc cacgtggagg gcctgaaggc ggaggagcgg 1560

caccgcccgg tgcgggactg gatcctacgg cagcggcagg acgacctgga cacgctgggg 1620

ctggggctac agggcggcat ccccaacggc tacctggtcc tagacctcag catgcaagag 1680

gccctctcgg ggacgccctg cctcctagga cctggacctg ttctcaccgt cctggcactg 1740

ctcctagcct ccaccctggc c 1761

<210> 12

<211> 2004

<212> DNA

<213> designed

<400> 12

aagctcacta ttgaatccac gccgttcaat gtcgcagagg ggaaggaggt gcttctactt 60

gtccacaatc tgccccagca tctttttggc tacagctggt acaaaggtga aagagtggat 120

ggcaaccgtc aaattatagg atatgtaata ggaactcaac aagctacccc agggcccgca 180

tacagtggtc gagagataat ataccccaat gcatccctgc tgatccagaa catcatccag 240

aatgacacag gattctacac cctacacgtc ataaagtcag atcttgtgaa tgaagaagca 300

actggccagt tccgggtata cccggagctg cccaagccct ccatctccag caacaactcc 360

aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc ttcacctgtg aacctgagac tcaggacgca 420

acctacctgt ggtgggtaaa caatcagagc ctcccggtca gtcccaggct gcagctgtcc 480

aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat gtcacaagaa atgacacagc aagctacaaa 540

tgtgaaaccc agaacccagt gagtgccagg cgcagtgatt cagtcatcct gaatgtcctc 600

tatggcccgg atgcccccac catttcccct ctaaacacat cttacagatc aggggaaaat 660

ctgaacctct cctgccacgc agcctctaac ccacctgcac agtactcttg gtttgtcaat 720

gggactttcc agcaatccac ccaagagctc tttatcccca acatcactgt gaataatagt 780

ggatcctata cgtgccaagc ccataactca gacactggcc tcaataggac cacagtcacg 840

acgatcacag tctatgcaga gccacccaaa cccttcatca ccagcaacaa ctccaacccc 900

gtggaggatg aggatgctgt agccttaacc tgtgaacctg agattcagaa cacaacctac 960

ctgtggtggg taaataatca gagcctcccg gtcagtccca ggctgcagct gtccaatgac 1020

aacaggaccc tcactctact cagtgtcaca aggaatgatg taggacccta tgagtgtgga 1080

atccagaaca aattaagtgt tgaccacagc gacccagtca tcctgaatgt cctctatggc 1140

ccagacgacc ccaccatttc cccctcatac acctattacc gtccaggggt gaacctcagc 1200

ctctcctgcc atgcagcctc taacccacct gcacagtatt cttggctgat tgatgggaac 1260

atccagcaac acacacaaga gctctttatc tccaacatca ctgagaagaa cagcggactc 1320

tatacctgcc aggccaataa ctcagccagt ggccacagca ggactacagt caagacaatc 1380

acagtctctg cggagctgcc caagccctcc atctccagca acaactccaa acccgtggag 1440

gacaaggatg ctgtggcctt cacctgtgaa cctgaggctc agaacacaac ctacctgtgg 1500

tgggtaaatg gtcagagcct cccagtcagt cccaggctgc agctgtccaa tggcaacagg 1560

accctcactc tattcaatgt cacaagaaat gacgcaagag cctatgtatg tggaatccag 1620

aactcagtga gtgcaaaccg cagtgaccca gtcaccctgg atgtcctcta tgggccggac 1680

acccccatca tttccccccc agactcgtct tacctttcgg gagcgaacct caacctctcc 1740

tgccactcgg cctctaaccc atccccgcag tattcttggc gtatcaatgg gataccgcag 1800

caacacacac aagttctctt tatcgccaaa atcacgccaa ataataacgg gacctatgcc 1860

tgttttgtct ctaacttggc tactggccgc aataattcca tagtcaagag catcacagtc 1920

tctgcatctg gaacttctcc tggtctctca gctggggcca ctgtcggcat catgattgga 1980

gtgctggttg gggttgctct gata 2004

<210> 13

<211> 540

<212> DNA

<213> designed

<400> 13

atgcaggccg aaggccgggg cacagggggt tcgacgggcg atgctgatgg cccaggaggc 60

cctggcattc ctgatggccc agggggcaat gctggcggcc caggagaggc gggtgccacg 120

ggcggcagag gtccccgggg cgcaggggca gcaagggcct cggggccggg aggaggcgcc 180

ccgcggggtc cgcatggcgg cgcggcttca gggctgaatg gatgctgcag atgcggggcc 240

agggggccgg agagccgcct gcttgagttc tacctcgcca tgcctttcgc gacacccatg 300

gaagcagagc tggcccgcag gagcctggcc caggatgccc caccgcttcc cgtgccaggg 360

gtgcttctga aggagttcac tgtgtccggc aacatactga ctatccgact gactgctgca 420

gaccaccgcc aactgcagct ctccatcagc tcctgtctcc agcagctttc cctgttgatg 480

tggatcacgc agtgctttct gcccgtgttt ttggctcagc ctccctcagg gcagaggcgc 540

<210> 14

<211> 762

<212> DNA

<213> designed

<400> 14

atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60

gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120

ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180

tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240

cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300

ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360

acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420

tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480

gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540

ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600

ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660

agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720

acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762

<210> 15

<211> 1164

<212> DNA

<213> designed

<400> 15

atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60

gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtccgg ggatggatct 120

gtgcagtcag ggtttctcgc tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180

aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240

acatgggaca gagagaccag ggacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300

gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360

atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420

ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480

ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540

cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600

ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660

attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720

caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780

aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840

acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900

ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tgctgctgct 960

gctgctgctg ctatttttgt tattattatt ttctacgtct gttgttgtaa gaagaaaaca 1020

tcagctgcag agggtccaga gctcgtgagc ctgcaggtcc tggatcaaca cccagttggg 1080

acgagtgacc acagggatgc cacacagctc ggatttcagc ctctgatgtc agatcttggg 1140

tccactggct ccactgaggg cgcc 1164

<210> 16

<211> 87

<212> DNA

<213> designed

<400> 16

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagct 87

<210> 17

<211> 342

<212> DNA

<213> designed

<400> 17

aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat 60

attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg 120

aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat 180

gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt tgtcttctaa tgggaatgta 240

acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg 300

cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt ct 342

<210> 18

<211> 213

<212> DNA

<213> designed

<400> 18

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 60

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 120

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 180

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tac 213

<210> 19

<211> 9

<212> DNA

<213> designed

<400> 19

gcttactac 9

Claims (14)

1.一种用于制备新型免疫细胞的重组NT基因的慢病毒颗粒，其特征是，所述重组NT基因的慢病毒颗粒由包含携带重组NT基因的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统感染宿主细胞获得，所述重组NT基因由核苷酸序列片段A、核苷酸序列片段B、核苷酸序列片段C和核苷酸序列片D组成，所述重组NT基因的序列选自如SEQ ID No.1所示的NT1和5′到3′的组成为-B-C-D-E-的NT2基因，其中，所述A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述B为编码Tax2基因(1-3aa)，所述C为编码Tax1基因(2-255aa)，所述D为编码T2A基因，所述E为编码Tax1基因(227-337aa)，其中，Tax2(1-3aa)基因序列如SEQ ID No.2所示，Tax1(2-255aa)基因序列如SEQ ID No.3所示，T2A基因如SEQ ID No.10所示，Tax1(227-337aa)基因如SEQ ID No.4所示，所述宿主细胞为293T细胞。

2.一种工程化单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株，其特征是，所述单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株的制备方法包括步骤：(1)分离含抗凝剂外周血中单个核细胞(PBMC)；(2)用免疫细胞培养基重悬(1)所得PBMC后接种至细胞培养容器中，在细胞培养容器中37℃5％CO2条件孵育0.5-24小时；(3)去除(2)中悬浮细胞和培养基，使用培养基洗涤，加入含有IL-4和GM-CSF的培养基；(4)分别在第1、3、5天向(3)中加入IL-4和GM-CSF；(5)第7天用权利要求1所述的携带新型NT基因的慢病毒颗粒感染(4)培养后的细胞，同时加入促慢病毒感染试剂；(6)继续培养(5)所得细胞，每两天添加一次IL-4和GM-CSF；(7)继续培养(6)所得细胞一段时间，每天或隔天加入IL-2；(8)向(7)所得细胞中添加TNF-a和选自LPS或Poly(I：C)中的一种，继续培养两天；可选的，其中(5)所述的促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺和纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(6)所述IL-4的浓度为5-20ng/ml，所述GM-CS的浓度为5-40ng/ml；其中(8)所述TNF-a的浓度为5-20ng/ml，所述LPS的浓度为5-20ug/ml，所述Poly(I：C)的浓度为5-50ug/ml。

3.一种抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其特征是，所述抗原特异性CTL的制备方法包括步骤：(1)向权利要求2所述的工程化单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株加载抗原得到加载抗原的单核细胞来源的树突状细胞(抗原-MoDC-NT)株；(2)取含有与所述MoDC-NT具有相同HLA-A的人外周血，分离制备外周血单核细胞(PBMC)；(3)用(1)所得的加载抗原的单核细胞来源的树突状细胞(抗原-MoDC-NT)刺激(2)所得的同HLA-A的PBMC，混合培养；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述单核细胞来源的树突状细胞(MoDC-NT)株加载抗原的方式选自抗原肽负载和将抗原基因转染到树突状细胞(MoDC-NT)株中的一种；其中(2)所述血液来源选自外周血和脐带血中的一种；其中(3)所述PBMC选自PBMC和CD3+T细胞和CD8+T细胞中的一种，所述混合培养细胞比例抗原-MoDC-NT∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(5)所述培养的时长选自一周、两周、三周或其他时长。

4.一种工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株，其特征是，所述NT树突状细胞(EDC-NT)株的制备方法包括步骤：(1)从含抗凝剂人血分离单个核细胞(PBMC)；(2)用含有免疫细胞激动剂的培养基培养(1)所得的细胞；(3)向(2)培养体系中加入IL-2继续培养；(4)采用权利要求1所述的重组NT基因慢病毒颗粒感染(3)培养后的细胞，同时加入促慢病毒感染试剂；(5)用含有血清和IL-2的培养基培养(4)所得细胞；(6)分选去掉(5)所得细胞中CD3+的细胞；(7)将(6)中保留下来的细胞继续用(5)中培养条件继续培养；可选的，其中(2)所述免疫细胞激动剂选自PHA和PMA和其他激动剂中的一种，所述培养时间为24小时；其中(3)所述培养时间为4-5天；其中(4)所述的促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺或纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(5)所述培养时间为1-2周；其中(6)所述分选方法选自磁珠分选和流式细胞术分选中的一种；其中(7)所述培养时间为2-3个月。

5.一种新型免疫细胞，其特征是，所述免疫细胞的制备方法包括步骤：(1)向权利要求4所述NT树突状细胞(EDC-NT)株加载或不加载抗原；(2)取与EDC-NT相同或不同HLA-A的血液制备PBMC；(3)用(1)所得的加载或不加载抗原的NT树突状细胞(EDC-NT)刺激(2)所得的PBMC，混合培养；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述NT树突状细胞(EDC-NT)株加载抗原的方式选自抗原肽负载和将抗原基因转染到NT树突状细胞(EDC-NT)株中的一种；其中(2)所述血液来源选自外周血和脐带血中的一种；其中(3)所述PBMC选自PBMC和CD3+T和CD8+T细胞中的一种，所述混合培养细胞比例为EDC-NT∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(5)所述培养时长选自一周、两周、三周或其他时长。

6.一种工程化功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株，其特征是，所述功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株的制备方法包括步骤：(1)用SIGN慢病毒颗粒重复感染权利要求4所述的工程化NT树突状细胞(EDC-NT)株，所述SIGN基因的慢病毒颗粒由包含携带SIGN基因的慢病毒载体的四质粒病毒包装系统感染宿主细胞获得，所述携带SIGN基因的慢病毒载体中，所述SIGN基因的序列选自如SEQ IDNo.5所示的核酸序列；(2)步骤(1)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(3)分选收集(2)所得细胞中CD209+的细胞；(4)将步骤(3)所得细胞继续培养一段时间；可选的，其中(2)所述的促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺或纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(3)所述分选方法选自磁珠分选和流式细胞术分选中的一种。

7.一种新型免疫细胞，其特征是，所述免疫细胞的制备方法包括步骤：(1)向权利要求6所述的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株加载或不加载抗原；(2)取与EDC-NTSIGN相同或不同HLA-A的血液制备PBMC；(3)用(1)所得的加载或不加载抗原的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株刺激(2)所得的PBMC，混合培养，；(4)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(5)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株加载抗原方式选自抗原肽负载和将抗原基因转染到功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株中的一种；其中(2)所述血液来源选自外周血和脐带血中的一种；其中(3)所述PBMC选自PBMC和CD3+T细胞和CD8+T细胞中的一种，所述混合培养细胞比例是EDC-NTSIGN∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(5)所述培养时长选自一周、两周、三周或其他时长。

8.一种多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)株，其特征是，所述EDC-NTA株的制备方法包括步骤：(1)采用携带选自HLA-A0201或HLA-A1101或HLA-A2402或其他HLA-A或这些HLA-A中的一种或多种组合基因序列的慢病毒颗粒感染权利要求6所得的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株，(2)步骤(1)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(3)分选收集(2)所得细胞中HLA-A组合阳性的细胞；(4)将步骤(3)所得细胞继续培养一段时间；其中(1)所述HLA-A0201的序列如SEQ ID No.6所示，所述HLA-A1101的序列如SEQ ID No.7所示，所述HLA-A2402的序列如SEQ ID No.8所示；可选的，其中(2)所述促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺或纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(3)所述分选方法选自磁珠分选和流式细胞术分选和单克隆细胞筛选中的一种。

9.一种新型免疫细胞，其特征是，所述免疫细胞的制备方法包括步骤：(1)取权利要求8所述方法制备所得的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)株与抗凝血来源的PBMC混合培养；(2)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(3)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述抗凝血选自外周血和脐带血中的一种，所述PBMC选自PBMC和CD3+T细胞和CD8+T细胞中的一种，所述混合培养的细胞比例是EDC-NTA∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(3)所述培养时长选自一周、两周、三周或其他时。

10.一种抗原特异性多功能树突状细胞株，其特征是，所述抗原特异性树突状细胞的制备方法包括步骤：(1)将抗原基因与IκBα基因组合后连接到慢病毒载体质粒上；(2)用携带(1)所述基因组合的慢病毒感染权利要求8所述的多功能NT树突状细胞(EDC-NTA)；(3)步骤(2)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂，重复2次；(4)筛选收集(3)所得细胞中抗原基因阳性的细胞；(5)将步骤(4)所得细胞继续培养一段时间；可选的，其中(1)所述抗原基因与IκBα基因组合可以选自IκBα(1-48aa)-抗原基因-IκBα(281-317aa)和IκBα(1-317aa)-T2A-抗原基因和IκBα(1-48aa)-抗原肽mini基因-IκBα(281-317aa)和IκBα(1-317aa)-T2A-抗原肽mini基因中的一种；所述抗原肽mini基因的氨基酸序列是多个-抗原多肽-AYY-的重复连接序列，所述AYY的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；其中(3)所述促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺或纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(4)所述筛选方法包括用磁珠分选、流式细胞术分选、细胞单克隆筛选或抗性筛选。其中所述抗原基因或抗原肽基因选自包括但不限于Mesothelin、CEA、NYESO-1、AFP、TPA、TPS、EGFR、VEGF、PDGFR、ALK、CA125、CA153、CA199、CA242、CA724、S100、HCG、HCH、β2-MG、MUC1/16、WT1、GD2、GPC3、PRAME、FOLR1、MAGEA3、Her2、Survivin、CD19、CD20、CD22、CD47、CD73、CD117、PD1、PD-L1、BCMA等肿瘤抗原基因或病毒抗原基因的全抗原基因或部分抗原基因，所述抗原特异性多功能树突细胞包括Mesothelin特异性多功能树突状细胞(EDC-Mesothelin)株、NYESO1特异性多功能树突状细胞(EDC-NYESO1)株和CEA特异性多功能树突状细胞(EDC-CEA)株和其他抗原基因对应的抗原特异性树突状细胞株，所述Mesothelin基因序列如SEQ ID No.11所示，所述CEA基因序列如SEQ ID No.12所示，所述NYESO-1基因的序列如SEQ ID No.13所示。所述抗原肽mini基因的氨基酸序列是多个-抗原多肽-AYY-的重复连接序列。

11.一种新型免疫细胞，其特征是，所述免疫细胞的制备方法包括步骤：(1)取权利要求10所述方法制备所得的抗原特异性多功能树突状细胞株与抗凝血中分离的PBMC混合培养；(2)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(3)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述抗原可以是任意一种或多种抗原组合，所述的抗凝血选自外周血和脐带血中的一种，所述PBMC选自PBMC和CD3+T细胞和CD8+T细胞中的一种，所述混合培养的细胞比例是抗原特异性多功能树突状细胞株∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(3)所述培养时长选自一周、两周、三周或其他时。

12.一种多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株，其特征是，所述多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的制备方法包括步骤：(1)分别用4-1BBL、MICA、IL-15&CD8Fusion protein对应的三种慢病毒颗粒多次感染权利要求6所述的功能NTSIGN树突状细胞(EDC-NTSIGN)株；(2)步骤(1)病毒感染同时加入促慢病毒感染试剂；(3)筛选收集(2)所得细胞中阳性表达三种基因4-1BBL+/MICA+/IL-15&CD8 Fusion protein+的细胞；(4)将步骤(3)所得细胞继续培养一段时间；可选的，其中(1)所述4-1BBL、MICA、IL-15和CD8的基因核苷酸序列分别是SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；其中(2)所述促慢病毒感染试剂选自多聚阳离子化合物聚凝胺或纳米聚合物，或其他促慢病毒感染试剂；其中(3)所述筛选方法包括用磁珠分选、流式细胞术分选、细胞单克隆筛选或抗性筛选。

13.一种即用型多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株，其特征是，所述即用型多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株的制备方法包括步骤：(1)取权利要求12所述的多功能NK滋养细胞(EDC-NK)株制备成细胞悬液；(2)将(1)所获细胞悬液用射线进行照射灭活；(3)将(2)照射后所获细胞使用细胞冻存液进行程序降温至-80℃；(4)将(3)所获细胞放入液氮或液氮蒸汽中保存，可选的，其中(2)所述细胞灭活方式选自Co60射线照射和γ射线照射和其他射线照射和化学试剂处理中的一种。

14.一种新型免疫细胞，其特征是，所述新型免疫细胞的制备方法包括步骤：(1)取权利要求4或6或8或10或12或13所述方法制备所得的细胞株与抗凝血来源的PBMC混合培养；(2)所用培养体系是免疫细胞培养基添加IL-2；(3)步骤(2)所述培养体系中加入组蛋白甲基化酶(EZH2)抑制剂和/或细胞因子，(4)持续培养一段时间；可选的，其中(1)所述抗凝血选自外周血和脐带血中的一种，所述混合培养的细胞比例为细胞株∶PBMC＝1∶1-1∶1000；其中(2)所述抑制剂优选UNC1999和EPZ005687，所述细胞因子选自IL-15、IL-15RA、OK432、CD52中的一种或多种组合；其中(4)所述培养时长选自一周、两周、三周或其他时长，可选的，(1)所述制备的PMBC与步骤(1)的细胞株具有相同或不同HLA-A；可选的，混合培养前向(1)所述的细胞株中加载或不加载抗原；其中所述加载抗原的方式选自抗原肽负载或将抗原基因转染到细胞株。

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