CN113101363B

CN113101363B - 一种环状rna疫苗及其应用

Info

Publication number: CN113101363B
Application number: CN202110368433.2A
Authority: CN
Inventors: 宋尔卫; 苏士成; 朱晓峰; 黄迪; 蔡佩娥
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN113101363A

Abstract

本发明属于生物医药卫生领域，公开了一种环状RNA疫苗及其应用。本发明提供的环状RNA疫苗指的是能编码免疫原性多肽的环状RNA。本发明发明人发现CircRNA作为疫苗在具有强的免疫原性的同时能在不同患者甚至不同肿瘤中表达，在保证有效性的同时具有更广泛的适用性；特别是具有编码功能的circFam53b，并能激活体内的抗肿瘤免疫反应。因此，该环状RNA疫苗能用于制备抗肿瘤应用，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。

Description

一种环状RNA疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物医药卫生领域，具体涉及一种环状RNA疫苗及其应用。

背景技术

疫苗是控制传染病最重要的手段之一。目前，治疗性的肿瘤疫苗也在临床治疗恶性肿瘤中得到了应用。肿瘤疫苗治疗是将肿瘤抗原以疫苗导入患者体内，激活患者自身的免疫系统，诱导机体免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。目前，已经有少数肿瘤疫苗在肿瘤的治疗中起到了良好的效果。肿瘤疫苗是近年来最热点的研究方向之一。

主要的肿瘤疫苗有多肽疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。其中，mRNA因为其可以灵活的合成，具有很好的应用价值。但是，由于体内RNA酶的存在，能很快的降解mRNA疫苗，影响其效果。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种核酸疫苗。该核酸疫苗是可以编码免疫原性多肽的环状RNA，由于环状RNA为封闭环状结构，能够耐受很多RNA的水解，相对与mRNA具有更长的半衰期。这些编码免疫原性多肽的环状RNA可作为一种新的肿瘤疫苗。

本发明的另一目的在于提供上述核酸疫苗的应用。

本发明的再一目的在于提供上述核酸疫苗的体外筛选方法。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种环状RNA疫苗，是能编码免疫原性多肽的环状RNA。

所述的能编码免疫原性多肽的环状RNA优选为circFam53b。

所述的circFam53b包括来源于人的circFam53b或是鼠的circFam53b。

所述的人的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列如下(亦如SEQ ID NO.1所示)：

MSSCRTSWRPLGSKVWTPVEKRRCYSGGSVQRYSNGFSTMQRSSSFSLPSRANVLSSPCDQAGLHHRFGGQPCQGVPGSAPCGQAGDTWSPDLHPVGGGRLDLQRSLSCSHEQFSFVEYCPPSANSTPASTPELARRSSGLSRSRSQPCVLNDKKVGVKRRRPEEVQEQRPSLDLAKMAQKMTDGETWTGNALFRLTNRAPASGNACLKRTAHYGTGRQ。

所述的鼠的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列如下(亦如SEQ ID NO.2所示)：

MSSCRTSWRPLGSKVWTPVEKRRCYSGGSVQRYSNGVSPMQRSSSFSLPARANGLSSPCHQSSLHHRFGGQPCQGAPGSAPCGQAGDSWSPDPHPVGGGRLDLQRSLSCSHEQFSFPEYCPPSANSTPASTPELARRSSGLARSRSQPCVLNDKKIGVKRRRPDEVQEQRPSLDLAKMAQKMTDGETWIENALFRLTSQAPASGNVCLKSVRMAPCGTRRQ。

所述的人的circFam53b的DNA序列如下(亦如SEQ ID NO.3所示)：

AAAATGACAGATGGCGAGACCTGGACAGGAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCACCAGCATCTGGGAATGCCTGCCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGTGACCGCCTGCGCTGTGACCAGTCTGATCAAAGACCTCAGCATCAGCGACCACAACGGGAACCCCTCAGCACCCCCTAGCAAGCGCCAGTGCCGCTCACTGTCCTTCTCCGATGAGATGTCCAGTTGCCGGACATCATGGAGGCCCTTGGGCTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAAAAGAGACGCTGCTACAGCGGGGGCAGCGTCCAGCGCTATTCCAACGGCTTCAGCACCATGCAGAGGAGTTCCAGCTTCAGCCTCCCTTCCCGGGCCAACGTGCTCTCCTCACCCTGCGACCAGGCAGGACTCCACCACCGATTTGGAGGGCAGCCCTGCCAAGGGGTGCCAGGCTCAGCCCCGTGTGGACAGGCAGGTGACACCTGGAGCCCTGACCTGCACCCCGTGGGAGGAGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCACATGAGCAGTTTTCCTTTGTGGAATACTGTCCTCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACACCAGAGCTGGCGAGACGCTCCAGCGGCCTTTCCCGCAGCCGCTCCCAGCCGTGTGTCCTTAACGACAAGAAGGTCGGTGTTAAAAGGCGGCGCCCTGAAGAAGTGCAAGAGCAGAGGCCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAG。

所述的鼠的circFam53b的DNA序列如下(亦如SEQ ID NO.4所示)：

AAAATGACAGATGGCGAGACCTGGATAGAAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAGCCAAGCGCCAGCATCTGGGAATGTCTGCCTGAAAAGTGTCAGGATGGCTCCCTGTGGCACCAGGAGGCAGTGACTGCCTGTGCGGTGACCAGCCTAATCAAAGACCTCAACATAAATGACCACAATGGGAACCCCTCAGCTCCTCCCAGCAAACGCCAGTGCCGGTCACTATCCTTCTCTGATGAGATGTCCAGTTGCCGGACGTCATGGCGGCCCTTGGGGTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAGAAGAGACGATGCTACAGCGGAGGCAGCGTCCAGCGCTACTCCAATGGCGTCAGCCCCATGCAGCGGAGCTCTAGCTTCAGCCTCCCTGCCAGGGCCAATGGGCTCTCTTCACCTTGCCACCAGTCGAGCCTGCACCACCGCTTTGGGGGGCAACCCTGCCAAGGAGCACCAGGCTCAGCCCCCTGTGGACAGGCGGGTGATAGCTGGAGCCCAGACCCACACCCAGTGGGAGGGGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCGCATGAGCAGTTTTCCTTCCCAGAATACTGTCCCCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACGCCAGAGCTGGCAAGACGCTCCAGTGGGCTTGCCCGCAGCCGCTCTCAGCCCTGTGTCCTTAATGACAAGAAGATCGGTGTGAAACGGCGGCGTCCGGATGAAGTGCAGGAGCAAAGACCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAG。

所述的人的circFam53b编码多肽的开放阅读框(ORF)碱基序列如下(亦如SEQ IDNO.5所示)：ATGTCCAGTTGCCGGACATCATGGAGGCCCTTGGGCTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAAAAGAGACGCTGCTACAGCGGGGGCAGCGTCCAGCGCTATTCCAACGGCTTCAGCACCATGCAGAGGAGTTCCAGCTTCAGCCTCCCTTCCCGGGCCAACGTGCTCTCCTCACCCTGCGACCAGGCAGGACTCCACCACCGATTTGGAGGGCAGCCCTGCCAAGGGGTGCCAGGCTCAGCCCCGTGTGGACAGGCAGGTGACACCTGGAGCCCTGACCTGCACCCCGTGGGAGGAGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCACATGAGCAGTTTTCCTTTGTGGAATACTGTCCTCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACACCAGAGCTGGCGAGACGCTCCAGCGGCCTTTCCCGCAGCCGCTCCCAGCCGTGTGTCCTTAACGACAAGAAGGTCGGTGTTAAAAGGCGGCGCCCTGAAGAAGTGCAAGAGCAGAGGCCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGAAAATGACAGATGGCGAGACCTGGACAGGAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCACCAGCATCTGGGAATGCCTGCCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGTGA。

所述的鼠的circFam53b编码多肽的开放阅读框(ORF)碱基序列如下(亦如SEQ IDNO.6所示)：

ATGTCCAGTTGCCGGACGTCATGGCGGCCCTTGGGGTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAGAAGAGACGATGCTACAGCGGAGGCAGCGTCCAGCGCTACTCCAATGGCGTCAGCCCCATGCAGCGGAGCTCTAGCTTCAGCCTCCCTGCCAGGGCCAATGGGCTCTCTTCACCTTGCCACCAGTCGAGCCTGCACCACCGCTTTGGGGGGCAACCCTGCCAAGGAGCACCAGGCTCAGCCCCCTGTGGACAGGCGGGTGATAGCTGGAGCCCAGACCCACACCCAGTGGGAGGGGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCGCATGAGCAGTTTTCCTTCCCAGAATACTGTCCCCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACGCCAGAGCTGGCAAGACGCTCCAGTGGGCTTGCCCGCAGCCGCTCTCAGCCCTGTGTCCTTAATGACAAGAAGATCGGTGTGAAACGGCGGCGTCCGGATGAAGTGCAGGAGCAAAGACCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGAAAATGACAGATGGCGAGACCTGGATAGAAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAGCCAAGCGCCAGCATCTGGGAATGTCTGCCTGAAAAGTGTCAGGATGGCTCCCTGTGGCACCAGGAGGCAGTGA。

上述环状RNA疫苗可起到以下作用中的一项或多项：

1)激活CD8 T细胞对肿瘤的杀伤活性；

2)刺激CD8 T细胞的效应功能；

3)刺激CD8 T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)；

4)刺激CD8 T细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；

5)刺激CD8 T细胞释放细胞毒颗粒；

6)加入树突状细胞后，树突状细胞激活CD8 T细胞；

7)刺激CD8 T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体(TCR)成簇；

8)过继该circFam53b激活的T细胞可抑制肿瘤生长；

9)可根据核酸序列制作多肽疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

10)可根据核酸序列制作需要mRNA疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

11)可用作制作树突状细胞(DC)疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

12)可用作制作DNA疫苗激活人体抗肿瘤免疫；

13)可作为免疫原激活CD8细胞后测序得到TCR序列用于TCR-T治疗。

所述的肿瘤包括circFam53b过表达或者有circFam53b编码多肽表达的实体瘤和非实体瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺肿瘤、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、贲门癌、乳腺癌、纵膈肿瘤、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、小肠恶性肿瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、皮肤恶性黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等。

所述的环状RNA疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物，包括上述环状RNA疫苗，和/或上述环状RNA疫苗所编码的多肽。

上述环状RNA疫苗的体外筛选方法，包括如下步骤：取肿瘤细胞和正常细胞进行circRNA高通量测序；对高通量测序的结果进行生物信息学分析，通过分析circRNA的测序结果，选择在肿瘤组织中高表达并具有编码功能的circRNA；通过实验确定生物信息学分析的结果，以筛选得到的所编码的多肽具有免疫原性的circRNA，挑选出circRNA制作疫苗，得到可激活患者的抗肿瘤免疫反应的circRNA，为环状RNA疫苗。

所述的circRNA优选为circFam53b。

所述的人的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的鼠的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的人的circFam53b的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的小鼠的circFam53b的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的人的circFam53b编码多肽的开放阅读框(ORF)碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的鼠的circFam53b编码多肽的开放阅读框(ORF)碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的实验包括但不限于以下实验：检测circRNA的编码多肽在组织中是否存在表达，检测circRNA所编码的部分或全部多肽的免疫原性，检测circRNA激活抗肿瘤免疫活性，得到可激活患者的抗肿瘤免疫反应的circRNA。

所述的检测circRNA在细胞或者组织中是否存在表达可采用现有技术进行，方法包括：circRNA高通量测序和荧光定量PCR。

所述的检测circRNA可激活免疫反应，方法包括：酶联免疫斑点实验(elispot)，流式实验检测CD8 T细胞因子，五聚体检测抗原特异性T细胞。

所述的检测circRNA可激活抗肿瘤免疫反应的方法包括：建立移植瘤动物模型后给动物接种circRNA检测肿瘤生长情况；切片和流式观察动物肿瘤中的免疫反应情况。

本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果：

(1)肿瘤疫苗目前被证明在肿瘤治疗中有良好的应用前景。其中，mRNA因为其可以灵活的合成，具有很好的应用价值。但是，由于体内RNA酶的存在，能很快的降解mRNA疫苗，影响其效果。环状RNA为封闭环状结构，能够耐受很多RNA的水解，相对与mRNA具有更长的半衰期。能够解决mRNA作为疫苗半衰期太短，稳定性不足的缺点。

(2)而新抗原疫苗的治疗因为不同个体需要进行单独的测序及个体化的疫苗制作，导致了成本高昂和个体化疫苗制作周期长等不足。本发明发现了具有编码功能的circFam53b，并能激活体内的抗肿瘤免疫反应。CircRNA作为疫苗在具有强的抗肿瘤免疫原性的同时能在不同患者甚至不同肿瘤中表达，在保证有效性的同时具有更广泛的适用性。

(3)在高突变负荷肿瘤的免疫治疗中，来源于突变的肿瘤新抗原被认为是激活抗肿瘤免疫的关键。在低突变负荷的乳腺癌中circRNA编码的抗原可被应用激活抗肿瘤免疫，circRNA疫苗能为低突变负荷肿瘤的免疫治疗提供新的选择。

(4)在动物水平上，建立移植瘤动物模型，过继皮下注射circFam53b可抑制肿瘤的生长，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。

(5)人的circFam53b与鼠的circFam53b高度同源。人的circFam53b编码的多肽与HLA-A2*01有高亲和性。通过elispot实验和流式实验等方法，证明了人的circFam53b可激活免疫反应。CircRNA疫苗在人的抗肿瘤治疗或者其他感染性疾病的治疗中也有价值。

附图说明

图1是检测circRNA编码多肽的结果图；其中，A为分别在小鼠黑色素细胞和黑色素瘤细胞B16F10中检测circFam53的相对表达量，结果显示circFam53在B16F10中高表达；B为通过免疫印迹实验(Western Blot)检测得到带有Flag的过表达circFam53b所编码的多肽；C为通过抗体可检测B16F10中circFam53b所编码的多肽。

图2是目的载体pHBLV-CMV-Circ-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro的结构示意图。

图3是验证circRNA可激活免疫反应的结果图；其中，A为酶联免疫斑点(elispot)实验检测circFam53b的免疫原性；B为流式实验检测circFam53b刺激CD8 T细胞产生细胞因子IFN-γ和TNF-α；C为流式实验检测皮下注射circFam53b分化出抗原特异性CD8 T细胞。

图4是验证circRNA疫苗激活抗肿瘤免疫反应的结果图；其中，A circFam53b疫苗抑制肿瘤的生长；B为流式实验检测circFam53b刺激肿瘤浸润CD8 T细胞产生细胞因子IFN-γ。

图5是验证人circRNA激活T细胞免疫反应的结果图；其中，A为酶联免疫斑点(elispot)实验检测circFam53b电转PBMC后刺激T细胞产生IFN-γ；B为流式实验检测circFam53b电转PBMC后刺激T细胞刺激CD8 T细胞产生细胞因子IFN-γ。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明通过分子水平、细胞水平和动物模型多方面的技术手段可实现，证明circFam53b在肿瘤细胞或组织中表达，证实circFam53b疫苗可以激活免疫反应，并证明circFam53b疫苗在抗肿瘤免疫中的作用及其具体作用机制。

1.证明circFam53b编码多肽的功能：

a.根据circBase、circRNADb等数据库的数据，预测circFam53b的ORF和IRES序列等。

b.构建FLuc-IRES-RLuc双荧光素酶标记的质粒，并在质粒内分别克隆空载、野生型IRES序列和突变型IRES序列。通过双荧光素酶报告实验，证明circFam53b的IRES序列活性强，具有编码蛋白的潜力。

c.制备Flag标记在ORF终止密码前的circFam53b的质粒及空载质粒，并将质粒通过Lipo 3000转染至HEK293T细胞内，48小时后提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot实验，验证Flag所标记的蛋白。

d.转染同样的质粒后，通过Western Bolt实验得到电泳胶，通过考马斯亮蓝染色后，将相应位置的胶条进行质谱检测。通过分析质谱检测的结果，验证circRNA所编码的特异性的肽段是否存在。

e.通过circBase、circRNADb等数据库的数据可以知道circRNA可能编码的多肽的氨基酸序列。制作与该多肽特异性结合的抗体，并通过Western Blot验证这些多肽在肿瘤组织中的表达。

2.CircFam53b作为疫苗激活免疫反应：

a.通过NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与MHC I类分子的亲和性。其预期编码的多肽中的肽段“TWIENALFRL”与C57BL/6小鼠的MHC I类分子的亲和性高。

b.化学合成circFam53b。

c.将20μg circFam53b与40μg阳离子脂质体及200μL PBS混合，于第三天、第六天、第九天和第十二天对小鼠行皮下注射，在最后一次注射后3天，处死小鼠并在无菌条件下取出小鼠脾脏。分离出小鼠原代脾细胞，并种入包埋有INF-γ抗体的elispot试剂盒的培养板内，每孔5×10⁵个细胞。取同源小鼠的骨髓细胞，在加入1％双抗(青霉素和链霉素)和10％(v/v)FBS的RPMI 1640培养基，并通过20ng/mL的GM-CSF诱导，8天后可获得成熟的骨髓来源的树突状细胞。在elispot小孔的脾细胞中按10:1的比例加入树突状细胞，树突状细胞电转10μg circFam53b进行刺激。24小时后弃去上清，PBS清洗5次后加入一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-γ斑点形成情况。

d.取同样处理后的小鼠脾细胞1×10⁶个按10:1的比例与骨髓来源的并电转10μgcircFam53b树突状细胞共培养，加入Brefeldin A处理，抑制细胞因子分泌。5小时后，收集处理过的细胞进行细胞活性抗体，CD3和CD8分子染色，固定后，破膜剂进行破膜，然后分别进行IFN-γ、TNF-α及IL-2的染色。进行流式细胞仪检测，分析脾细胞中CD8+细胞的细胞因子产生情况。

e.同样处理后的小鼠，在最后一次注射后第9天取脾细胞1×10⁶个，进行细胞死活，CD3和CD8抗体表面标记，然后用在Proimmune公司定制的MHC I类分子五聚体进行流式染色，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中五聚体阳性的抗原特异性CD8+T细胞的比例。

3.来源于circFam53b所编码多肽能激活T细胞抗肿瘤免疫：

a.取健康C57BL/6小鼠，7.5×10⁴个B16F10黑色素瘤细胞种入小鼠皮下，建立移植瘤小鼠模型。

b.将小鼠分为6组，分别进行以下处理：第一组，空白对照组不进行任何处理；第二组进行阳离子脂质体皮下注射；第三组皮下注射阳离子脂质体和突变的不能编码的亲本mRNA；第四组皮下注射阳离子脂质体和亲本mRNA；第五组皮下注射阳离子脂质体和不编码的circRNA；第六组皮下注射阳离子脂质体和circFam53b。观察记录小鼠的肿瘤生长情况。

c.将肿瘤组织制作成切片或者细胞悬液并观察T细胞浸润情况。

4.观察circFam53b激活人类T细胞的情况：

a.通过NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与HLA I类分子的亲和性。其预期编码的多肽中的肽段“ALFRLTNRA”与人类的HLA-A2：01分子的亲和性高。

b.化学合成circFam53b。

c.分离出乳腺癌患者的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。PBMC在加入1％双抗(青霉素和链霉素)和10％(v/v)AB血型的人血清的DMEM培养基中培养，并通过50ng/mL的GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(20ng/mL)诱导，6天后加入PBMC电转circFam53b，与培养后的T细胞按1：4的比例(个数/个数)，每3天加入新的电转circFam53b的PBMC，9天后种入包埋有INF-γ抗体的elispot试剂盒的培养板内。24小时后弃去上清，PBS清洗5次后加入一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-γ斑点形成情况。

d.PBMC在加入1％双抗和10％AB血型的人血清的DMEM培养基中培养，并通过50ng/ml的GM-CSF和IL-4(20ng/mL)诱导，6天后加入PBMC电转circFam53b，与培养后的T细胞按1：4的比例(个数/个数)，每3天加入新的电转circFam53b的PBMC，9天后，加入Brefeldin A处理，抑制细胞因子分泌。24小时后，收集处理过的细胞进行CD3、CD8及CD4分子染色固定后，破膜剂进行破膜，然后分别进行IFN-γ、TNF-α及IL-2的染色。进行流式细胞仪检测，分析CD4+、CD8+T细胞的激活情况和细胞因子产生情况。

实施例1证明circFam53b在肿瘤细胞中高表达并编码多肽。

试验方法：

(1)应用Trizol试剂提取C57BL/6小鼠黑色素细胞(购自广东省实验动物中心)和黑色素瘤细胞(小鼠黑色素瘤细胞株B16F10)的RNA并进行高通量测序。分析测序结果，确定目标分子――circFam53b。应用Trizol试剂提取小鼠黑色素细胞和黑色素瘤细胞的RNA，并且进行荧光定量PCR验证circFam53b的表达量，所用引物为上游引物F1和下游引物R1。反应条件为TAKARA TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II荧光定量PCR试剂盒所推荐实验条件。结果如图1A所示，提示circFam53b在B16F10细胞中高表达，明显高于正常黑色素细胞。通过circBase、circRNADb等数据库分析circFam53b是否有ORF和IRES序列。发现circFam53b具有IRES序列及ORF，提示circFam53b具有编码多肽的潜能。

上游引物F1：5’-TGGCACAGAAAATGACAGATGG-3’；

下游引物R1：5’-GGCAGACATTCCCAGATGCT-3’。

(2)证明circFam53b编码多肽的功能：

验证人和鼠的circRNA的IRES序列的活性，构建Luc-IRES-RLuc双荧光素酶标记的质粒，载体为psiCHECK-2，并在质粒内分别克隆空载、人或鼠的野生型IRES序列、人或鼠突变型IRES序列，IRES是克隆到载体psiCHECK-2的Luc与RLuc之间。通过双荧光素酶报告实验，结果显示，人和鼠的野生型质粒RLuc/Luc荧光活性高于空载组及人和鼠突变型，证明circRNA的IRES序列活性强，具有编码蛋白的潜力。

人circRNA的野生型IRES的序列为：

CCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGTGACCGCCTGCGCTGTGACCAGTCTGATCAAAGACCTCAGCATCAGCGACCACAACGGGAACCCCTCAGCACCCCCTAGCAAGCGCCAGTGCCGCTCACTGTCCTTCTCCGA。

人circRNA的突变型IRES的序列为：

CCTGTTTTGGACAGCTTACTATCCTGCCGGGACCCAGTGACCTTTTGCGCTGTGAGGTGTCTGATCGGGGACCTCAGCATCTTTGCACACAACGGGAATTTTTCAGCATTTAACTGCCAGCGCCAGTGCCGCTCATTGTCCTTCTCACG。

鼠circRNA的野生型IRES的序列为：

CCTGAAAAGTGTCAGGATGGCTCCCTGTGGCACCAGGAGGCAGTGACTGCCTGTGCGGTGACCAGCCTAATCAAAGACCTCAACATAAATGACCACAATGGGAACCCCTCAGCTCCTCCCAGCAAACGCCAGTGCCGGTCACTATCCTT。

鼠circRNA的突变型IRES的序列为：

(3)再证明circRNA能否直接编码多肽：

1)制备Flag标记的circRNA的质粒及空载质粒，空载质粒为汉恒生物的pHBLV-CMV-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro，目的载体为：pHBLV-CMV-Circ-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro，如图2所示。

目的载体是通过基因合成公司制备得到，是将直接合成得到目的序列(如下所示)，通过HB infusionTM无缝克隆到XhoI酶切线性化的载体pHBLV-CMV-MCS-EF1-zsgreen-t2a-puro上，得到目的载体。

鼠circFam53b的目的序列如下(酶切成环过即为目标circFam53b)：

TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCACCCCCGGCCCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGAAAATGACAGATGGCGAGACCTGGATAGAAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAGCCAAGCGCCAGCATCTGGGAATGTCTGCCTGAAAAGTGTCAGGATGGCTCCCTGTGGCACCAGGAGGCAGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGACTGCCTGTGCGGTGACCAGCCTAATCAAAGACCTCAACATAAATGACCACAATGGGAACCCCTCAGCTCCTCCCAGCAAACGCCAGTGCCGGTCACTATCCTTCTCTGATGAGATGTCCAGTTGCCGGACGTCATGGCGGCCCTTGGGGTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAGAAGAGACGATGCTACAGCGGAGGCAGCGTCCAGCGCTACTCCAATGGCGTCAGCCCCATGCAGCGGAGCTCTAGCTTCAGCCTCCCTGCCAGGGCCAATGGGCTCTCTTCACCTTGCCACCAGTCGAGCCTGCACCACCGCTTTGGGGGGCAACCCTGCCAAGGAGCACCAGGCTCAGCCCCCTGTGGACAGGCGGGTGATAGCTGGAGCCCAGACCCACACCCAGTGGGAGGGGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCGCATGAGCAGTTTTCCTTCCCAGAATACTGTCCCCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACGCCAGAGCTGGCAAGACGCTCCAGTGGGCTTGCCCGCAGCCGCTCTCAGCCCTGTGTCCTTAATGACAAGAAGATCGGTGTGAAACGGCGGCGTCCGGATGAAGTGCAGGAGCAAAGACCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGGTAAGAAGCAAGGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCAGGATCCATCGATACTAGTA。

人circFam53b的目的序列如下：

CCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGAAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCACCCCCGGCCCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGAAAATGACAGATGGCGAGACCTGGACAGGAAATGCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCACCAGCATCTGGGAATGCCTGCCTGAAAAGGACAGCTCACTATGGCACCGGGAGGCAGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGACCGCCTGCGCTGTGACCAGTCTGATCAAAGACCTCAGCATCAGCGACCACAACGGGAACCCCTCAGCACCCCCTAGCAAGCGCCAGTGCCGCTCACTGTCCTTCTCCGATGAGATGTCCAGTTGCCGGACATCATGGAGGCCCTTGGGCTCCAAAGTCTGGACTCCCGTGGAAAAGAGACGCTGCTACAGCGGGGGCAGCGTCCAGCGCTATTCCAACGGCTTCAGCACCATGCAGAGGAGTTCCAGCTTCAGCCTCCCTTCCCGGGCCAACGTGCTCTCCTCACCCTGCGACCAGGCAGGACTCCACCACCGATTTGGAGGGCAGCCCTGCCAAGGGGTGCCAGGCTCAGCCCCGTGTGGACAGGCAGGTGACACCTGGAGCCCTGACCTGCACCCCGTGGGAGGAGGCCGGCTGGACCTGCAGCGGTCCCTCTCTTGCTCACATGAGCAGTTTTCCTTTGTGGAATACTGTCCTCCCTCAGCCAACAGCACACCTGCCTCAACACCAGAGCTGGCGAGACGCTCCAGCGGCCTTTCCCGCAGCCGCTCCCAGCCGTGTGTCCTTAACGACAAGAAGGTCGGTGTTAAAAGGCGGCGCCCTGAAGAAGTGCAAGAGCAGAGGCCTTCTCTAGACCTTGCCAAGATGGCACAGGTAAGAAGCAAGGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCATAGCTTAAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCT。

2)将得到的阳性克隆再进行测序；

3)测序比对结果：

测序结果表明：测序结果与目的序列一致，则获得目的载体。

4)质粒抽提

测序成功之后，根据项目要求安排菌液扩增，进行质粒抽提纯化，质粒抽提的方案按照抽提试剂盒的说明书为准。抽提的质粒需要QC验证合格之后用于转染细胞。

5)将质粒通过Lipo 3000转染至HEK 293T细胞内，48小时后提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot实验，验证Flag所标记的蛋白。Western Blot实验中应用抗Flag标签抗体，证明目标circRNA的ORF具有编码多肽的功能(图1B仅显示鼠circFam53b的表达结果)。通过特异性的抗体，该抗体为定制抗体，免疫原序列为：VQEQRPSLDLAKMAQKMTDGETWTGNALFRLTNRAPASGNACLKRTAHYGTGRQ，抗体为南京金斯瑞生物有限公司制作。提取细胞的蛋白过后，Western Blot实验证明circFam53b所编码的多肽在B16F10细胞中表达明显高于正常黑色素细胞(如图1C所示)。同样，用前述方法，证明了人circFam53b的ORF具有编码多肽的功能；也证明circFam53b所编码的多肽在乳腺癌组织中表达。

本实施例的目的是证明circFam53b的编码能力，并且证明circFam53b所编码的多肽在肿瘤细胞中表达。

实施例2皮下注射circFam53b激活免疫反应。

通过IEDB和NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与MHC I类分子的亲和性。本实验的目的是证明circFam53b可以作为疫苗激活小鼠的免疫反应。

试验方法：

a.为了验证circRNA所编码的多肽能够激活抗肿瘤免疫，化学合成得到小鼠的circFam53b。将小鼠分为6组，分别进行以下处理：第一组，空白对照组注射0.1mol/L、pH7.4的PBS；第二组进行阳离子脂质体(liposome，西安瑞禧生物科技有限公司)皮下注射；第三组皮下注射阳离子脂质体和突变的不能编码的亲本mRNA(简称mut Fam53b mRNA)，是将20μg mut Fam53b mRNA与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第四组皮下注射阳离子脂质体和亲本Fam53b mRNA，是将20μg Fam53b mRNA与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第五组皮下注射阳离子脂质体和不编码的circPrdm5(环状RNA)，是将20μgcircPrdm5与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第六组皮下注射阳离子脂质体和circFam53(环状RNA，是将亲本Fam53b mRNA通过T4 RNA连接酶，再通过RNAse R去除单链线状mRNA，纯化后得到)，是将20μg circFam53b与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合均匀得到。

鼠的mut Fam53b mRNA的序列如下，通过合成得到：

UAAUCCAGUUGCCGGACGUCAUGGCGGCCCUUGGGGUCCAAAGUCUGGACUCCCGUGGAGAAGAGACGAUGCUACAGCGGAGGCAGCGUCCAGCGCUACUCCAAUGGCGUCAGCCCCAUGCAGCGGAGCUCUAGCUUCAGCCUCCCUGCCAGGGCCAAUGGGCUCUCUUCACCUUGCCACCAGUCGAGCCUGCACCACCGCUUUGGGGGGCAACCCUGCCAAGGAGCACCAGGCUCAGCCCCCUGUGGACAGGCGGGUGAUAGCUGGAGCCCAGACCCACACCCAGUGGGAGGGGGCCGGCUGGACCUGCAGCGGUCCCUCUCUUGCUCGCAUGAGCAGUUUUCCUUCCCAGAAUACUGUCCCCCCUCAGCCAACAGCACACCUGCCUCAACGCCAGAGCUGGCAAGACGCUCCAGUGGGCUUGCCCGCAGCCGCUCUCAGCCCUGUGUCCUUAAUGACAAGAAGAUCGGUGUGAAACGGCGGCGUCCGGAUGAAGUGCAGGAGCAAAGACCUUCUCUAGACCUUGCCAAGAUGGCACAG。

鼠的亲本Fam53b mRNA的序列如下，为线状RNA：

AUGUCCAGUUGCCGGACGUCAUGGCGGCCCUUGGGGUCCAAAGUCUGGACUCCCGUGGAGAAGAGACGAUGCUACAGCGGAGGCAGCGUCCAGCGCUACUCCAAUGGCGUCAGCCCCAUGCAGCGGAGCUCUAGCUUCAGCCUCCCUGCCAGGGCCAAUGGGCUCUCUUCACCUUGCCACCAGUCGAGCCUGCACCACCGCUUUGGGGGGCAACCCUGCCAAGGAGCACCAGGCUCAGCCCCCUGUGGACAGGCGGGUGAUAGCUGGAGCCCAGACCCACACCCAGUGGGAGGGGGCCGGCUGGACCUGCAGCGGUCCCUCUCUUGCUCGCAUGAGCAGUUUUCCUUCCCAGAAUACUGUCCCCCCUCAGCCAACAGCACACCUGCCUCAACGCCAGAGCUGGCAAGACGCUCCAGUGGGCUUGCCCGCAGCCGCUCUCAGCCCUGUGUCCUUAAUGACAAGAAGAUCGGUGUGAAACGGCGGCGUCCGGAUGAAGUGCAGGAGCAAAGACCUUCUCUAGACCUUGCCAAGAUGGCACAG。

不编码的circPrdm5的序列如下，合成后通过T4 RNA连接酶连接再去除单链线状RNA得到的环状RNA：

ACCCACUCCGAGGAGAGACCUUUCCAGUGUGAUGCAUGUAAAGCCUUGUUCCGCACGCCCUUUUCUCUGCAGAGACACCUGUUAAUCCACAACAGUGAGAGGACUUUUAAGUGUCACCACUGUGAUGCCACAUUUAAAAGGAAGGAUACAUUAAACGUUCAUGUCCAGGUGGUCCAUGAAAGACACAAGAAGUACCGAUGUGAGCUGUGCAAUAAGGCCUUUGUCACACCUUCAGUGCUUAGGAGUCAUAAGAAGACACACACAGGAGAAAAGGAGAAAGUCUGCCCAUAUUGUGGCCAGAAAUUUGCCAGCAGUGGGACCCUGAGAGUUCACAUCCGGAGCCACACAGGUGAGCGCCCCUAUCAAUGCCCGUACUGUGAAAAAGGUUUCAGUAAAAAUGACGGACUGAAGAUGCACAUUCGUACUCACACCAGG。

b.步骤a各组别的量为一剂注射剂，每次每只小鼠注射一剂，每个组别设置3只6-8周的体重20g的C57BL/6小鼠于第三天、第六天、第九天和第十二天对小鼠行皮下注射，在最后一次注射后3天，处死小鼠并在无菌条件下取出小鼠脾脏。分离出小鼠原代脾细胞，并种入包埋有INF-r抗体的elispot试剂盒的培养板内，每孔5×10⁵个细胞。取同源小鼠的骨髓细胞，在加入1％双抗和10％FBS的RPMI 1640培养基，并通过20ng/mL的GM-CSF诱导，8天后可获得成熟的骨髓来源的树突状细胞。在elispot小孔的脾细胞中按10:1的比例加入树突状细胞，第一组和第二组加PBS，其余4组按相应小鼠分组每5×10⁴个树突状细胞电转10μgRNA(即第三组转mut Fam53b mRNA、第四组转Fam53b mRNA、第五组转circPrdm5、第六组转circFam53b)，电转的条件为150V、10ms，将电转后的树突细胞加入脾细胞中进行刺激。24小时后弃去上清，PBS清洗5次后加入一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-γ斑点形成情况。一抗、二抗以及TMB显色液均为elispot试剂盒组分。

c.取同样处理后的小鼠脾细胞1×10⁶个按10:1的比例与骨髓来源的树突状细胞共培养，第一组和第二组加PBS，其余4组按相应小鼠分组每1×10⁵树突状细胞电转10μgRNA(即第三组转mut Fam53b mRNA、第四组转Fam53b mRNA、第五组转circPrdm5、第六组转circFam53b)，电转的条件为150V、10ms，将电转后的树突细胞加入脾细胞中，然后加入Brefeldin A(在细胞混合液中的浓度为5μg/mL)处理，抑制细胞因子分泌。5小时后，收集处理过的细胞进行细胞活性抗体，CD3和CD8分子染色，固定后，破膜剂进行破膜，然后分别进行IFN-γ、TNF-α及IL-2的染色。进行流式细胞仪检测，分析脾细胞中CD8+细胞的细胞因子产生情况。

斑点形成情况如图3A所示，第六组circFam53b形成的斑点最多。细胞因子产生情况如图3B所示，第六组circFam53b IFN-γ的量为1.79±0.5％(IFN-γ阳性CD8+T细胞在CD8+T细胞中的百分比)，TNF-α的量为2.21±0.3％(TNF-α阳性CD8+T细胞在CD8+T细胞中的百分比)，远远高于第一组～第五组(IFN-γ的量分别依次为0.09±0.02％、0.11±0.04％、0.15±0.05％、0.14±0.05％、0.11±0.03％；TNF-α的量分别依次为0.11±0.03％、0.15±0.04％、0.19±0.04％、0.21±0.05％)。这说明，circFam53b小鼠来源的circFam53b可以激活小鼠CD8+T细胞的免疫反应，可作为疫苗。

实施例3皮下注射circFam53b可刺激产生抗原特异性T细胞

本实施例的目的是为了检测circFam53b所编码的多肽可刺激产生抗原特异性T细胞。同样上述处理将小鼠分为6组，于第三天、第六天、第九天和第十二天对小鼠行皮下注射，在最后一次注射后第9天取脾细胞1×10⁶个，进行细胞死活鉴定(FIXABLE VIABILITYDYE EF455 UV,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，CD3和CD8抗体表面标记，然后用在Proimmune公司定制的MHC I类分子五聚体进行流式染色，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中五聚体阳性的抗原特异性CD8+T细胞的比例。

图3C表明circFam53b可以刺激产生抗原特异性CD8+T细胞。

实施例4通过皮下注射circFam53b可抑制小鼠肿瘤的生长

本实施例的目的为进一步验证circFam53b所编码的抗原表位激活的T细胞具有抑制肿瘤生长的作用。

A、取36只健康C57BL/6小鼠，7.5×10⁴个B16F10细胞/每只小鼠种入小鼠皮下，建立移植瘤小鼠模型。

B、将小鼠分为6组，分别进行以下处理：第一组，空白对照组注射PBS；第二组进行阳离子脂质体皮下注射(liposome)；第三组皮下注射阳离子脂质体和突变的不能编码的亲本mRNA，是将20μg mut Fam53bmRNA与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第四组皮下注射阳离子脂质体和亲本mRNA，是将20μg Fam53b mRNA与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第五组皮下注射阳离子脂质体和不编码的circPrdm5，是将20μgcircPrdm5与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到；第六组皮下注射阳离子脂质体和circFam53，是将20μg circFam53b与40μg阳离子脂质体混入200μL PBS混合得到。

C、取小鼠体内形成的肿瘤组织，将肿瘤组织制作成单细胞悬液，检测免疫细胞的情况。

结果如图4所示，可见小鼠circFam53b能抑制肿瘤的生长(图4A)，circFam53b刺激肿瘤浸润CD8 T细胞产生细胞因子IFN-γ(图4B)。

实施例5 circFam53b激活人T细胞免疫反应。

通过IEDB和NetMHC网站预测circFam53b所编码的多肽中其特异性的多肽序列与HLAI类分子的亲和性。本实施例的目的是为了验证circFam53b可激活人类T细胞的免疫反应。

试验方法：

通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血(来源于广东省)中的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。磁珠分选得到的PBMC细胞重悬于含1％双抗(青霉素和链霉素)、10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基中，加入适当浓度的GM-CSF(在培养基中的浓度50ng/mL)与IL-4(在培养基中的浓度20ng/mL)，每3天更换细胞因子，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到DC细胞。

磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(在培养基中的浓度20ng/mL)，37℃、CO₂培养箱中培养，得到培养后的T细胞。

每5×10⁴个DC细胞电转10μg合成的人的circFam53b(为环状装RNA，是如下所示的人的线状RNA通过T4 RNA连接酶将首尾连接得到)。在培养6天后的T细胞中，按4：1的比例(T细胞个数/DC细胞个数)每3天加入含新的电转circFam53b的DC，9天后将DC细胞和培养后的T细胞转移到Mabtech公司生产的包被人IFN-γ抗体的IFN-γELISpot 96孔板中共培养，24小时后弃去上清，PBS清洗5次后加入生物素化的检测一抗孵育2小时，PBS清洗5次后加入HRP标记二抗孵育1小时，最后加入TMB显色液，待斑点出现后去离子水冲洗。通过酶联免疫斑点检测仪观察培养板内INF-r斑点形成情况。

该实验中还设置了PBS组、Fam53b mRNA(人的线状RNA)组和CD3-2组：PBS组是空白对照组，即加入等量的溶解RNA的PBS；Fam53b mRNA组是将等量的Fam53b mRNA替换人的circFam53b；CD3-2组为阳性对照组，在培养6天后的T细胞中，按4：1的细胞个数比例(T细胞个数/DC细胞个数)每3天加入DC后于ELISpot板孔中再加入CD3-2，CD3-2每次加入的浓度按说明书浓度加入，其余操作步骤同上。

人的线状RNA序列如下：

AUGUCCAGUUGCCGGACAUCAUGGAGGCCCUUGGGCUCCAAAGUCUGGACUCCCGUGGAAAAGAGACGCUGCUACAGCGGGGGCAGCGUCCAGCGCUAUUCCAACGGCUUCAGCACCAUGCAGAGGAGUUCCAGCUUCAGCCUCCCUUCCCGGGCCAACGUGCUCUCCUCACCCUGCGACCAGGCAGGACUCCACCACCGAUUUGGAGGGCAGCCCUGCCAAGGGGUGCCAGGCUCAGCCCCGUGUGGACAGGCAGGUGACACCUGGAGCCCUGACCUGCACCCCGUGGGAGGAGGCCGGCUGGACCUGCAGCGGUCCCUCUCUUGCUCACAUGAGCAGUUUUCCUUUGUGGAAUACUGUCCUCCCUCAGCCAACAGCACACCUGCCUCAACACCAGAGCUGGCGAGACGCUCCAGCGGCCUUUCCCGCAGCCGCUCCCAGCCGUGUGUCCUUAACGACAAGAAGGUCGGUGUUAAAAGGCGGCGCCCUGAAGAAGUGCAAGAGCAGAGGCCUUCUCUAGACCUUGCCAAGAUGGCACAG。

通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血(来源于广东省)中的PBMC(外周血单个核细胞)及T细胞。磁珠分选得到的PBMC细胞重悬于含1％双抗、10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基中，加入适当浓度的GM-CSF(在培养基中的浓度50ng/mL)与IL-4(在培养基中的浓度20ng/mL)诱导，每3天更换细胞因子，37℃、CO₂培养箱中培养6天，得到DC细胞。磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于含10％v/v AB血型的人血清的DMEM完全培养基中，加入相应浓度的IL-2(在培养基中的浓度20ng/mL)，37℃、CO₂培养箱中培养，得到培养后的T细胞。将DC细胞电转10μg合成的circFam53b后和培养后的T细胞(1×10⁶个)按照1:4的数量比例在24孔板中共培养；每3天更换细胞因子(终浓度为50ng/mL的GM-CSF和20ng/mL的IL-4，以及加入相同数量的电转10μg合成的circFam53b的DC)；9天后接着加入Brefeldin A(在细胞混合液中的浓度5μg/mL)，每孔加入1ml含10％(v/v)AB血型人血清的DMEM完全培养基继续培养6小时，抑制细胞因子的分泌。培养结束后收集细胞，进行细胞死活，CD3和CD8抗体表面标记，然后用赛默飞IC固定液室温固定30分钟，赛默飞破膜剂对细胞膜打孔后加抗IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、抗体标记细胞内相应蛋白，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中相应蛋白如IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的表达水平。该实验中还设置了PBS组、Fam53bmRNA(线状RNA)和PMA组：PBS组是空白对照，PMA组加入0.5μg/ml PMA(豆蔻酰佛波醇乙酯)和1μg/ml ionomycin(离子霉素)，为阳性对照组。

该部分实验结果如图5所示，提示circFam53b可以激活人CD8+T细胞的免疫反应。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种应用以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种环状RNA疫苗及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<223> 人的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Ser Cys Arg Thr Ser Trp Arg Pro Leu Gly Ser Lys Val Trp

1 5 10 15

Thr Pro Val Glu Lys Arg Arg Cys Tyr Ser Gly Gly Ser Val Gln Arg

20 25 30

Tyr Ser Asn Gly Phe Ser Thr Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Ser Leu

35 40 45

Pro Ser Arg Ala Asn Val Leu Ser Ser Pro Cys Asp Gln Ala Gly Leu

50 55 60

His His Arg Phe Gly Gly Gln Pro Cys Gln Gly Val Pro Gly Ser Ala

65 70 75 80

Pro Cys Gly Gln Ala Gly Asp Thr Trp Ser Pro Asp Leu His Pro Val

85 90 95

Gly Gly Gly Arg Leu Asp Leu Gln Arg Ser Leu Ser Cys Ser His Glu

100 105 110

Gln Phe Ser Phe Val Glu Tyr Cys Pro Pro Ser Ala Asn Ser Thr Pro

115 120 125

Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Leu Ser Arg Ser

130 135 140

Arg Ser Gln Pro Cys Val Leu Asn Asp Lys Lys Val Gly Val Lys Arg

145 150 155 160

Arg Arg Pro Glu Glu Val Gln Glu Gln Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala

165 170 175

Lys Met Ala Gln Lys Met Thr Asp Gly Glu Thr Trp Thr Gly Asn Ala

180 185 190

Leu Phe Arg Leu Thr Asn Arg Ala Pro Ala Ser Gly Asn Ala Cys Leu

195 200 205

Lys Arg Thr Ala His Tyr Gly Thr Gly Arg Gln

210 215

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<223> 鼠的circFam53b所编码的多肽的氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Ser Cys Arg Thr Ser Trp Arg Pro Leu Gly Ser Lys Val Trp

1 5 10 15

Thr Pro Val Glu Lys Arg Arg Cys Tyr Ser Gly Gly Ser Val Gln Arg

20 25 30

Tyr Ser Asn Gly Val Ser Pro Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Ser Leu

35 40 45

Pro Ala Arg Ala Asn Gly Leu Ser Ser Pro Cys His Gln Ser Ser Leu

50 55 60

His His Arg Phe Gly Gly Gln Pro Cys Gln Gly Ala Pro Gly Ser Ala

65 70 75 80

Pro Cys Gly Gln Ala Gly Asp Ser Trp Ser Pro Asp Pro His Pro Val

85 90 95

Gly Gly Gly Arg Leu Asp Leu Gln Arg Ser Leu Ser Cys Ser His Glu

100 105 110

Gln Phe Ser Phe Pro Glu Tyr Cys Pro Pro Ser Ala Asn Ser Thr Pro

115 120 125

Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Leu Ala Arg Ser

130 135 140

Arg Ser Gln Pro Cys Val Leu Asn Asp Lys Lys Ile Gly Val Lys Arg

145 150 155 160

Arg Arg Pro Asp Glu Val Gln Glu Gln Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala

165 170 175

Lys Met Ala Gln Lys Met Thr Asp Gly Glu Thr Trp Ile Glu Asn Ala

180 185 190

Leu Phe Arg Leu Thr Ser Gln Ala Pro Ala Ser Gly Asn Val Cys Leu

195 200 205

Lys Ser Val Arg Met Ala Pro Cys Gly Thr Arg Arg Gln

210 215 220

<210> 3

<211> 773

<212> DNA

<223> 人的circFam53b的DNA序列

<400> 3

aaaatgacag atggcgagac ctggacagga aatgccctct tcagattgac caaccgagca 60

ccagcatctg ggaatgcctg cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga 120

ccgcctgcgc tgtgaccagt ctgatcaaag acctcagcat cagcgaccac aacgggaacc 180

cctcagcacc ccctagcaag cgccagtgcc gctcactgtc cttctccgat gagatgtcca 240

gttgccggac atcatggagg cccttgggct ccaaagtctg gactcccgtg gaaaagagac 300

gctgctacag cgggggcagc gtccagcgct attccaacgg cttcagcacc atgcagagga 360

gttccagctt cagcctccct tcccgggcca acgtgctctc ctcaccctgc gaccaggcag 420

gactccacca ccgatttgga gggcagccct gccaaggggt gccaggctca gccccgtgtg 480

gacaggcagg tgacacctgg agccctgacc tgcaccccgt gggaggaggc cggctggacc 540

tgcagcggtc cctctcttgc tcacatgagc agttttcctt tgtggaatac tgtcctccct 600

cagccaacag cacacctgcc tcaacaccag agctggcgag acgctccagc ggcctttccc 660

gcagccgctc ccagccgtgt gtccttaacg acaagaaggt cggtgttaaa aggcggcgcc 720

ctgaagaagt gcaagagcag aggccttctc tagaccttgc caagatggca cag 773

<210> 4

<211> 779

<212> DNA

<223> 鼠的circFam53b的DNA序列

<400> 4

aaaatgacag atggcgagac ctggatagaa aatgccctct tcagattgac cagccaagcg 60

ccagcatctg ggaatgtctg cctgaaaagt gtcaggatgg ctccctgtgg caccaggagg 120

cagtgactgc ctgtgcggtg accagcctaa tcaaagacct caacataaat gaccacaatg 180

ggaacccctc agctcctccc agcaaacgcc agtgccggtc actatccttc tctgatgaga 240

tgtccagttg ccggacgtca tggcggccct tggggtccaa agtctggact cccgtggaga 300

agagacgatg ctacagcgga ggcagcgtcc agcgctactc caatggcgtc agccccatgc 360

agcggagctc tagcttcagc ctccctgcca gggccaatgg gctctcttca ccttgccacc 420

agtcgagcct gcaccaccgc tttggggggc aaccctgcca aggagcacca ggctcagccc 480

cctgtggaca ggcgggtgat agctggagcc cagacccaca cccagtggga gggggccggc 540

tggacctgca gcggtccctc tcttgctcgc atgagcagtt ttccttccca gaatactgtc 600

ccccctcagc caacagcaca cctgcctcaa cgccagagct ggcaagacgc tccagtgggc 660

ttgcccgcag ccgctctcag ccctgtgtcc ttaatgacaa gaagatcggt gtgaaacggc 720

ggcgtccgga tgaagtgcag gagcaaagac cttctctaga ccttgccaag atggcacag 779

<210> 5

<211> 660

<212> DNA

<223> 人的circFam53b编码多肽的开放阅读框

<400> 5

atgtccagtt gccggacatc atggaggccc ttgggctcca aagtctggac tcccgtggaa 60

aagagacgct gctacagcgg gggcagcgtc cagcgctatt ccaacggctt cagcaccatg 120

cagaggagtt ccagcttcag cctcccttcc cgggccaacg tgctctcctc accctgcgac 180

caggcaggac tccaccaccg atttggaggg cagccctgcc aaggggtgcc aggctcagcc 240

ccgtgtggac aggcaggtga cacctggagc cctgacctgc accccgtggg aggaggccgg 300

ctggacctgc agcggtccct ctcttgctca catgagcagt tttcctttgt ggaatactgt 360

cctccctcag ccaacagcac acctgcctca acaccagagc tggcgagacg ctccagcggc 420

ctttcccgca gccgctccca gccgtgtgtc cttaacgaca agaaggtcgg tgttaaaagg 480

cggcgccctg aagaagtgca agagcagagg ccttctctag accttgccaa gatggcacag 540

aaaatgacag atggcgagac ctggacagga aatgccctct tcagattgac caaccgagca 600

ccagcatctg ggaatgcctg cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga 660

<210> 6

<211> 666

<212> DNA

<223> 鼠的circFam53b编码多肽的开放阅读框

<400> 6

atgtccagtt gccggacgtc atggcggccc ttggggtcca aagtctggac tcccgtggag 60

aagagacgat gctacagcgg aggcagcgtc cagcgctact ccaatggcgt cagccccatg 120

cagcggagct ctagcttcag cctccctgcc agggccaatg ggctctcttc accttgccac 180

cagtcgagcc tgcaccaccg ctttgggggg caaccctgcc aaggagcacc aggctcagcc 240

ccctgtggac aggcgggtga tagctggagc ccagacccac acccagtggg agggggccgg 300

ctggacctgc agcggtccct ctcttgctcg catgagcagt tttccttccc agaatactgt 360

cccccctcag ccaacagcac acctgcctca acgccagagc tggcaagacg ctccagtggg 420

cttgcccgca gccgctctca gccctgtgtc cttaatgaca agaagatcgg tgtgaaacgg 480

cggcgtccgg atgaagtgca ggagcaaaga ccttctctag accttgccaa gatggcacag 540

aaaatgacag atggcgagac ctggatagaa aatgccctct tcagattgac cagccaagcg 600

ccagcatctg ggaatgtctg cctgaaaagt gtcaggatgg ctccctgtgg caccaggagg 660

cagtga 666

<210> 7

<211> 149

<212> DNA

<223> 人circRNA的野生型IRES的序列

<400> 7

cctgaaaagg acagctcact atggcaccgg gaggcagtga ccgcctgcgc tgtgaccagt 60

ctgatcaaag acctcagcat cagcgaccac aacgggaacc cctcagcacc ccctagcaag 120

cgccagtgcc gctcactgtc cttctccga 149

<210> 8

<211> 149

<212> DNA

<223> 人circRNA的突变型IRES的序列

<400> 8

cctgttttgg acagcttact atcctgccgg gacccagtga ccttttgcgc tgtgaggtgt 60

ctgatcgggg acctcagcat ctttgcacac aacgggaatt tttcagcatt taactgccag 120

cgccagtgcc gctcattgtc cttctcacg 149

<210> 9

<211> 149

<212> DNA

<223> 鼠circRNA的野生型IRES的序列

<400> 9

cctgaaaagt gtcaggatgg ctccctgtgg caccaggagg cagtgactgc ctgtgcggtg 60

accagcctaa tcaaagacct caacataaat gaccacaatg ggaacccctc agctcctccc 120

agcaaacgcc agtgccggtc actatcctt 149

<210> 10

<211> 149

<212> DNA

<223> 鼠circRNA的突变型IRES的序列

<400> 10

cctgttttgg acagcttact atcctgccgg gacccagtga ccttttgcgc tgtgaggtgt 60

ctgatcgggg acctcagcat ctttgcacac aacgggaatt tttcagcatt taactgccag 120

cgccagtgcc gctcattgtc cttctcacg 149

<210> 11

<211> 1117

<212> DNA

<223> 鼠circFam53b的目的序列

<400> 11

tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 60

aagacaccga ctctactaga ggatctattt ccggtgaatt caaagtgctg agattacagg 120

cgtgagccac cacccccggc ccactttttg taaaggtacg tactaatgac ttttttttta 180

tacttcagaa aatgacagat ggcgagacct ggatagaaaa tgccctcttc agattgacca 240

gccaagcgcc agcatctggg aatgtctgcc tgaaaagtgt caggatggct ccctgtggca 300

ccaggaggca ggactacaag gatgacgatg acaaggatta caaagacgac gatgataagg 360

actataagga tgatgacgac aaatgactgc ctgtgcggtg accagcctaa tcaaagacct 420

caacataaat gaccacaatg ggaacccctc agctcctccc agcaaacgcc agtgccggtc 480

actatccttc tctgatgaga tgtccagttg ccggacgtca tggcggccct tggggtccaa 540

agtctggact cccgtggaga agagacgatg ctacagcgga ggcagcgtcc agcgctactc 600

caatggcgtc agccccatgc agcggagctc tagcttcagc ctccctgcca gggccaatgg 660

gctctcttca ccttgccacc agtcgagcct gcaccaccgc tttggggggc aaccctgcca 720

aggagcacca ggctcagccc cctgtggaca ggcgggtgat agctggagcc cagacccaca 780

cccagtggga gggggccggc tggacctgca gcggtccctc tcttgctcgc atgagcagtt 840

ttccttccca gaatactgtc ccccctcagc caacagcaca cctgcctcaa cgccagagct 900

ggcaagacgc tccagtgggc ttgcccgcag ccgctctcag ccctgtgtcc ttaatgacaa 960

gaagatcggt gtgaaacggc ggcgtccgga tgaagtgcag gagcaaagac cttctctaga 1020

ccttgccaag atggcacagg taagaagcaa ggaaaagaat taggctcggc acggtagctc 1080

acacctgtaa tcccagcagg atccatcgat actagta 1117

<210> 12

<211> 1213

<212> DNA

<223> 人circFam53b的目的序列

<400> 12

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc 60

tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 120

gagacccaag ctggctagaa aagtgctgag attacaggcg tgagccacca cccccggccc 180

actttttgta aaggtacgta ctaatgactt tttttttata cttcagaaaa tgacagatgg 240

cgagacctgg acaggaaatg ccctcttcag attgaccaac cgagcaccag catctgggaa 300

tgcctgcctg aaaaggacag ctcactatgg caccgggagg caggactaca aggatgacga 360

tgacaaggat tacaaagacg acgatgataa ggactataag gatgatgacg acaaatgacc 420

gcctgcgctg tgaccagtct gatcaaagac ctcagcatca gcgaccacaa cgggaacccc 480

tcagcacccc ctagcaagcg ccagtgccgc tcactgtcct tctccgatga gatgtccagt 540

tgccggacat catggaggcc cttgggctcc aaagtctgga ctcccgtgga aaagagacgc 600

tgctacagcg ggggcagcgt ccagcgctat tccaacggct tcagcaccat gcagaggagt 660

tccagcttca gcctcccttc ccgggccaac gtgctctcct caccctgcga ccaggcagga 720

ctccaccacc gatttggagg gcagccctgc caaggggtgc caggctcagc cccgtgtgga 780

caggcaggtg acacctggag ccctgacctg caccccgtgg gaggaggccg gctggacctg 840

cagcggtccc tctcttgctc acatgagcag ttttcctttg tggaatactg tcctccctca 900

gccaacagca cacctgcctc aacaccagag ctggcgagac gctccagcgg cctttcccgc 960

agccgctccc agccgtgtgt ccttaacgac aagaaggtcg gtgttaaaag gcggcgccct 1020

gaagaagtgc aagagcagag gccttctcta gaccttgcca agatggcaca ggtaagaagc 1080

aaggaaaaga attaggctcg gcacggtagc tcacacctgt aatcccagca tagcttaagt 1140

ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1200

ctcccccgtg cct 1213

<210> 13

<211> 540

<212> RNA

<223> 鼠的mut Fam53b mRNA的序列

<400> 13

uaauccaguu gccggacguc auggcggccc uuggggucca aagucuggac ucccguggag 60

aagagacgau gcuacagcgg aggcagcguc cagcgcuacu ccaauggcgu cagccccaug 120

cagcggagcu cuagcuucag ccucccugcc agggccaaug ggcucucuuc accuugccac 180

cagucgagcc ugcaccaccg cuuugggggg caacccugcc aaggagcacc aggcucagcc 240

cccuguggac aggcggguga uagcuggagc ccagacccac acccaguggg agggggccgg 300

cuggaccugc agcggucccu cucuugcucg caugagcagu uuuccuuccc agaauacugu 360

ccccccucag ccaacagcac accugccuca acgccagagc uggcaagacg cuccaguggg 420

cuugcccgca gccgcucuca gcccuguguc cuuaaugaca agaagaucgg ugugaaacgg 480

cggcguccgg augaagugca ggagcaaaga ccuucucuag accuugccaa gauggcacag 540

<210> 14

<211> 540

<212> RNA

<223> 鼠的亲本Fam53b mRNA的序列

<400> 14

auguccaguu gccggacguc auggcggccc uuggggucca aagucuggac ucccguggag 60

aagagacgau gcuacagcgg aggcagcguc cagcgcuacu ccaauggcgu cagccccaug 120

cagcggagcu cuagcuucag ccucccugcc agggccaaug ggcucucuuc accuugccac 180

cagucgagcc ugcaccaccg cuuugggggg caacccugcc aaggagcacc aggcucagcc 240

cccuguggac aggcggguga uagcuggagc ccagacccac acccaguggg agggggccgg 300

cuggaccugc agcggucccu cucuugcucg caugagcagu uuuccuuccc agaauacugu 360

ccccccucag ccaacagcac accugccuca acgccagagc uggcaagacg cuccaguggg 420

cuugcccgca gccgcucuca gcccuguguc cuuaaugaca agaagaucgg ugugaaacgg 480

cggcguccgg augaagugca ggagcaaaga ccuucucuag accuugccaa gauggcacag 540

<210> 15

<211> 435

<212> RNA

<223> 不编码的circPrdm5的序列

<400> 15

acccacuccg aggagagacc uuuccagugu gaugcaugua aagccuuguu ccgcacgccc 60

uuuucucugc agagacaccu guuaauccac aacagugaga ggacuuuuaa gugucaccac 120

ugugaugcca cauuuaaaag gaaggauaca uuaaacguuc auguccaggu gguccaugaa 180

agacacaaga aguaccgaug ugagcugugc aauaaggccu uugucacacc uucagugcuu 240

aggagucaua agaagacaca cacaggagaa aaggagaaag ucugcccaua uuguggccag 300

aaauuugcca gcagugggac ccugagaguu cacauccgga gccacacagg ugagcgcccc 360

uaucaaugcc cguacuguga aaaagguuuc aguaaaaaug acggacugaa gaugcacauu 420

cguacucaca ccagg 435

<210> 16

<211> 540

<212> RNA

<223> 人的线状RNA序列

<400> 16

auguccaguu gccggacauc auggaggccc uugggcucca aagucuggac ucccguggaa 60

aagagacgcu gcuacagcgg gggcagcguc cagcgcuauu ccaacggcuu cagcaccaug 120

cagaggaguu ccagcuucag ccucccuucc cgggccaacg ugcucuccuc acccugcgac 180

caggcaggac uccaccaccg auuuggaggg cagcccugcc aaggggugcc aggcucagcc 240

ccguguggac aggcagguga caccuggagc ccugaccugc accccguggg aggaggccgg 300

cuggaccugc agcggucccu cucuugcuca caugagcagu uuuccuuugu ggaauacugu 360

ccucccucag ccaacagcac accugccuca acaccagagc uggcgagacg cuccagcggc 420

cuuucccgca gccgcuccca gccguguguc cuuaacgaca agaaggucgg uguuaaaagg 480

cggcgcccug aagaagugca agagcagagg ccuucucuag accuugccaa gauggcacag 540

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<223> 上游引物F1

<400> 17

tggcacagaa aatgacagat gg 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<223> 下游引物R1

<400> 18

ggcagacatt cccagatgct 20

<210> 19

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 免疫原序列

<400> 19

Val Gln Glu Gln Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala Lys Met Ala Gln Lys

1 5 10 15

Met Thr Asp Gly Glu Thr Trp Thr Gly Asn Ala Leu Phe Arg Leu Thr

20 25 30

Asn Arg Ala Pro Ala Ser Gly Asn Ala Cys Leu Lys Arg Thr Ala His

35 40 45

Tyr Gly Thr Gly Arg Gln

50

Claims

1.一种编码免疫原性多肽的环状RNA在制备抗肿瘤环状RNA疫苗中的应用，其特征在于：所述的环状RNA所编码的免疫原性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种编码免疫原性多肽的环状RNA在制备抗肿瘤环状RNA疫苗中的应用，其特征在于：编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的免疫原性多肽的环状RNA的序列如SEQ ID NO.3所示；或，

编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的免疫原性多肽的环状RNA的序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种环状RNA所编码的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用；其特征在于：所述环状RNA所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种环状RNA所编码的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用；其特征在于：所述环状RNA的序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。

5.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括环状RNA所编码的多肽；其中，所述环状RNA所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述环状RNA的序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于：

所述肿瘤为有circFam53b编码的多肽表达的实体瘤和非实体瘤；所述circFam53b编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述实体瘤为乳腺癌或黑色素瘤。